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REPLICAÇÃO DO DNA

Prof. Msc. Ronaldo CelerinoCentro Acadêmico de Vitória

Universidade Federal de Pernambuco

Genética Humana

Complementaridade das fitas – replicação – cada filamento pode servir como molde para síntese de um nova cadeia;

Especificidade do emparelhamento de bases – apenas uma sequência pode ser especificada por cada molde;

Replicação semiconservativa – cada fita original de nucleotídeo permanece intacta (conservada);

Implicações do Dupla Hélice na Replicação do DNA

Modelos de Replicação

Replicação Conservativa

Molécula de DNA inteira serve como molde para uma molécula totalmente nova;

Molécula original – completamente conservada durante a replicação;


Replicação Dispersiva

Quebra em fragmentos – modelos – síntese de novos fragmentos de DNA;

Remontagem de duas moléculas de DNA completas;

DNA resultante – intercalamento de DNA velho e novo;

Nenhuma molécula original é conservada;


Replicação Semiconservativa

Duas fitas de nucleotídeos se afastam e cada uma serve como molde para uma nova molécula de DNA

Qual dos três modelos?

Isótopos – 14N e 15N;

Cultura de E. coli – meio contendo 15N;

Muitas gerações - 15N – incorporado nas purinas e pirimidinas;

Amostra – cultivo em meio contendo 14N

Distinção – centrifugação em alta velocidade – formação de gradiente de densidade;

Experimentos de Meselson e Stahl

Experimentos de Meselson e Stahl

Replicação em Tetha

Replicação bidirecional

Replicação do Ciclo Rolante

Células eucarióticas - muitas moléculas de DNA – muitas origens de replicação;

Velocidade - 500 a 5000 nucleotídeos por minuto para cada forquilha;

Diversas bolhas de replicação – fusão – formação de suas moléculas de DNA idênticas;

Replicação Linear

Replicação: Procariotos x Eucariotos

Um molde de DNA de fita simples;

Substratos para montagem da nova cadeia de nucleotídeo;

Enzimas e proteínas que “lêem” o molde e reuni os substratos na molécula de DNA;

Requerimentos da Replicação

Síntese de uma Nova Fita de DNA

DNA polimerase – adiciona nucleotídeos apenas ao terminal 3’ da cadeia crescente;

Nova cadeia de DNA sempre cresce na mesma direção (5’ → 3’);

Uma fita fica exposta na direção 5’ → 3’ e a outra na 3’ → 5’;

Direção da Replicação


Fita exposta na direção 3’ → 5’ – nova fita sintetizada continuamente na direção 5’ → 3’ – fita leading;

Fita exposta na direção 5’ → 3’ – síntese de pequenos fragmentos (fragmentos de Okazaki) – replicação descontínua – fita lagging;

Fragmentos de Okazaki – 100 a 200 nucleotídeos

Replicação bidirecional – duas forquilhas;

Requerimentos da Replicação

Iniciação

Deselicoidização

Extensão

Término

Etapas da Replicação

Iniciação

Cromossomo circular – única origem de replicação (oriC);

Ligação de proteínas iniciadoras – pequeno corte – abertura – ligação da helicase;

Replicação do DNA Bacteriano

Deselicoidização:

DNA helicase – quebra as pontes de hidrogênio;

Helicase liga-se a fita lagging em cada forquilha e se move na direção 5’→3;

Proteínas de ligação a fita simples (SSB) – estabilidade da fita simples de DNA;

DNA girase (topoisomerase) – reduz a torção da cadeia – reduzindo a super-helicoidização


Primers (iniciadores):

Enzima Primase – síntese de trechos de nucleotídeos de RNA (10 – 12 nucleotídeos) – contendo 3’-OH – ligação da DNA polimerase;

Primers de RNA – devem ser removidas e substituídos por DNA;

Primase forma um complexo com a helicase;


Abertura – adição de primer – extensão da cadeia polinucleotídica pela DNA polimerase;

Diversas DNA polimerases;

Extensão

Sintetiza qualquer sequência especificada pela cadeia molde;

Síntese na direção 5’→3’ – adição de nucleotídeos no grupo 3’-OH;

Utiliza dNTPs para sintetizar novos DNA;

Requer primer para iniciar a síntese;

Catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre o grupo fosfato e o 3’-OH;

Fitas sintetizadas – complementares e antiparaleas;

Estão associadas com outras proteínas;

Características das Enzimas DNA Polimerase

DNA ligase – reparação dos cortes na cadeia ;

DNA ligase – catalisa a formação da ligação fosfodiéster sem adicionar outros nucleotídeos na cadeia;

DNA Ligase

Enzimas Atuantes na Replicação

COMPONENTE FUNÇÃO

Proteína Iniciadora Ligam-se a origem e separam os filamentos do DNA para iniciar a replicação

DNA helicase Desenrola o DNA na forquilha de replicação

PLU Ligam-se ao DNA unifilamentar e impede a formação de estruturas secundárias

DNA girase Move-se á frente da forquilha de replicação, liberando a torção que se acumula devido a deselicoidização na forquilha de replicação

DNA primase Sintetiza um primer curto de RNA par dar um grupo 3´-OH para ligação de nucleotídeos de DNA

DNA polimerase III Alonga um novo filamento de nucleotídeos a partir do grupo 3´-OH dado pelo primer

DNA polimerase I Remove os primers de RNA e substitui por DNA

DNA ligase Une os fragmentos de Okazaki fechando os cortes no açucar-fosfato do DNA recém sintetizado

Duas unidades de DNA polimerase III - presentes, uma para cada fita;

O molde da cadeia lagging – forma um loop – DNA polimerase III move-se ao longo da fita no sentido 5’→3’

Forquilha de Replicação

Requesitos:

Helicase para abertura do DNA;

Proteínas de ligação a fita simples – manutenção da separação;

Girase – remoção das torções a frente;

Primase – síntese de primers com 3’-OH;

DNA polimerase – Síntese das fitas leading e lagging;

Forquilha de Replicação

Algumas moléculas – encontro de duas forquilhas de replicação;

Sequências específicas – bloqueiam replicação;

Proteína de terminação (Tus em E. coli) – liga-se a sequência – bloqueia a helicase;

Terminação

Taxa de erro celular – 1 por bilhão de nucleotídeo;

Erros pela DNA polimerase – 1 por 100 mil nucleotídeos – proofreading (revisão) – atividade exonuclease 3’-5’ - correção do erro;

Reparo de mau pareamento (mismatch repar) –deformidades na estrutura secundária do DNA – reconhecimento enzimático – excisão do par de nucleotídeos;

Correção de erros depois da replicação

Habilidade de distinção da fita velha da nova - metilação (–CH3) ;

Fidelidade da Replicação do DNA

Fidelidade da Replicação do DNA

Múltiplas origens de replicação em seus cromossomos;

Mais tipos de DNA polimerase, com diferente funções;

Montagem dos nucleossomos imediatamente após replicação:

nucleossomos são quebrados no decorrer da replicação e depois remontados a partir de uma mistura aleatória de histonas novas e antigas

Replicação em Eucariotos

DNA eucariótico contém muitas origens de replicação;

Em cada origem – um complexo de multiproteinas de reconhecimento de origem – se liga e inicia o desenrolamento do DNA;

Origens em Eucarióticos

DNA Polimerase dos Eucariotos

Existem ao menos 13 diferentes

DNA polimerases em células

eucarióticas.

Telômeros - Fita lagging – retirada de primers – gap - ausência de 3’-OH encurtamento;

Presença de muitas cópias de pequenas sequências repetidas;

Telomerase – enzima que adiciona repetições e permite a extensão;

Replicação das Pontas Cromossômicas

Replicação das Pontas Cromossômicas

Sempre semiconservativa;

Início – sequência chamada origem;

Síntese de DNA é iniciada por pequenos segmentos de RNA – primers;

Extensão no sentido 5’→3’

O novo DNA é sintetizado de dNTPs; na polimerização do DNA, dois fosfatos são clivados dos dNTPs e o nucleotídeo resultante é adicionado ao grupo 3’-OH da cadeia crescente;

Continua na fita leading e descontinua na fita lagging;

Novos nucleotídeos são complementares e antiparalelos ao seu molde;

Ocorre em taxas muito elevadas e com muita precisão;

Regras Básica da Replicação

[email protected]

Material didático:http://ronaldocelerinogenetica.blogspot.com

Obrigado!!!

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