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Replicação do DNA
Bibliografia:
Genes VII - Benjamin Lewin
Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha
Lenhinger Principles of Biochemistry (3a. Ed.)
Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da Silva
Instituto de Química- USP
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Replicação do DNA
O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA.
A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases
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A replicação do DNA é semi-conservativa
Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958
Cultivo em meio14NH4Cl
Cultivo em meio15NH4Cl
Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de CsCl
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A replicação é bidirecional
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A replicação do cromossomo circular
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Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação
Replicon:
1. Origem + Término
2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular
3. O genoma de uma célula procariótica constitue um único replicon
4. Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente
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A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado
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O genoma bacteriano circular constitue um único replicon
A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min
Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)
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Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação
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O genoma eucariótico constitue vários replicons
A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min
Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes
Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática
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Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas
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Fita contínua (líder)
Fita descontínua
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Polimerases de DNA: As enzimas que sintetizam DNA
A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3´OH da cadeia em crescimento. O precursor da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato
Sentido da síntese sempre é 5’ 3’
A replicação é um processo extremamente fiel. As DNA-polimerases tem atividade revisora
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Desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato (precursor)
Fita sendo polimerizada
Fita molde
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As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado
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Pareamento de basescorreto
incorreto
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Atividade revisora 3’ 5’ garante a fidelidade da replicação
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Modelo da estrutura das DNA-polimerases
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Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas
Pol IPolII PolIIIPolimerização 5’ 3’ + + +Exonuclease 3’ 5’ + + +Exonuclease 5’ 3’ + - -
Número de subunidades 1 4 10Tamanho em kDa 103 90 ~900
Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000
Processividade 3-200 1500 500000(nt adicionados antesda dissociação do molde)
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DNA-polimerase III é uma holoenzima de mais de 10 cadeias de estrutura dimérica
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A subunidade Beta da DNA-polimerase III envolve o duplex das fitas-filhas
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OriC do cromossomo de E.coli
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Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coliDnaA Reconhece a origem e abre a dupla
fita em sítios específicos
DnaB (helicase) Desenrola o DNA
DnaC Auxilia a ligação de DnaB na origem
HU Proteína do tipo histona que estimula a iniciação
Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA
Single strand binding (SSB)
Liga a fita simples de DNA
RNA polimerase Facilita a ação da DnaA
DNA girase Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita
Dam Metilase Metila as sequências GATC na OriC
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A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA
Fita contínua
Fita descontínua
Síntese da Fita descontínua
Síntese da Fita Contínua
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Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua
A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA
A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas
A DNA ligase sela as quebras
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A DNA ligase sela as quebras
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Mecanismo de ação da DNA ligase
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Proteínas presentes na forquilha de Replicação de E.coli
SSB Liga a fita simples de DNA
DnaB (helicase) Desenrola o DNA
Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA
DNA Polimerase III
Sintese da fita nova
DNA Polimerase I Preenche as lacunas e excisa os primers
DNA Ligase Liga os fragmentos
DNA girase Superenrolamento
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Síntese das fitas contínua e descontínua é independente
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O complexo de replicação
A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha
Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas
O primossomo afasta uma das fitas molde
Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas
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Forquilha sentido horário
Forquilha sentido antihorário
Terminação Terminação
Forquilha sentido horário
Forquilha sentido antihorário
Terminação Terminação
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Duplicação dos cromossomos
Separação dos cromossomos e divisão celular