Relatorio Prática-FINAL
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RELATÓRIO DE PRÁTICAS: PRODUÇÃO DE ASPARAGINASE POR EXPRESSÃO HETERÓLOGA DO GENE ASP3 DE Saccharomyces cerevisiae em Pichia pastoris BIOCONVERSÃO MICROBIANA DO LIMONENO POR Yarrowia lipolytica. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA INSTITUTO DE QUÍMICA TECNOLOGIA ENZIMÁTICA APLICADA A FÁRMACOS
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RELATOacuteRIO DE PRAacuteTICAS PRODUCcedilAtildeO DE ASPARAGINASE POR EXPRESSAtildeO HETEROacuteLOGA DO GENE ASP3 DE
Saccharomyces cerevisiae em Pichia pastoris
BIOCONVERSAtildeO MICROBIANA DO LIMONENO POR Yarrowia lipolytica
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM BIOQUIacuteMICA
INSTITUTO DE QUIacuteMICA
TECNOLOGIA ENZIMAacuteTICA APLICADA A FAacuteRMACOS
Introduccedilatildeo
A L-asparaginase (L-asparagina amino hidrolase EC3511) responde pela cataacutelise hidroliacutetica da L-asparagina em aacutecido L-aspaacutertico e amocircnia como ilustrado pela figura a seguir
Introduccedilatildeo
Leucemia Linfoblaacutestica Aguda (LLA)
CEacuteLULAS NORMAIS VERSUS CEacuteLULAS TUMORAIS
L- Asparagina
Uso da levedura de Pichia pastoris - Produccedilatildeo de proteiacutenas recombinantes
- Promotores eficientes fortemente regulados
- Forte tendecircncia ao crescimento aeroacutebico (Cregg et al 2009)
- Atinge altas densidades celulares
- Modificaccedilotildees poacutes traducionais
- Organismo metilotroacutefico
- GRAS (Generally Recognized As Safe)
Expressatildeo de beta glucanases de Alicyclobacillus sp (Bai et al 2010) em Pichia pastoris dentre outras
Expressatildeo heteroacuteloga de lipase de Aspergillus tamarii (Yurimoto et al 2009)
Introduccedilatildeo
Objetivos
Produccedilatildeo recombinante de asparaginase II de
Saccharomyces cerevisiae em Pichia pastoris (expressatildeo
heteroacuteloga)
Pichia pastoris Inoacuteculo
Total consumo da fonte de carbono (Glicerol)
Produccedilatildeo de asparaginaseII
Induccedilatildeo com metanol
Crescimento
Teste de atividade
MATERIAL E MEacuteTODOS
Quantificaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de Glicerol
MATERIAL E MEacuteTODOS
Amostra (mL)
Branco Amostra (mL)
Branco Asparagina (mL)
Asparagina 01M 05 --- 05
Hidroxilamina 1M 05 --- 05
Suspensatildeo de ceacutelulas 40 40 --- Tampatildeo Fosfato
20mM --- 10 40
Quantificaccedilatildeo da atividade da enzima asparaginase
A seguir tem-se um esquema das reaccedilotildees enzimaacuteticas que levam a asparagina ateacute o complexo Fe hidroxamato composto que absorve no comprimento de onda de 500nm
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash Crescimento celular
Incubaccedilatildeo (h) Massa celular Glicerol
g (peso seco de ceacutelula)L (gL)
0 --- 1000
19 037
24 059 1000
48 225 576
72 323 000
Tempo 24 (h) Tempo 72 (h)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Dosagem da Atividade da Asparaginase
Amostra Massa celular
Dosagem de
asparaginase ΔAbs
Induccedilatildeo
(h)
g (peso seco de
ceacutelula)L t=0 t=30min
t=0 323 - - -
t=4 331 0 0 0
t=24 339 0131 0438 0307
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
BIBLIOGRAFIA
Aghaiypour K Wlodawer A Lubkowski J (2001) Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase Biochemistry 40(19)5655-64 Bai Y Wang J Zhang Z Shi P Luo H Huang H Luo C Yao B(2010) Expression of an extremely acidic beta-14-glucanase from thermoacidophilic Alicyclobacillus sp A4 in Pichia pastoris is improved by truncating the gene sequence Microb Cell Fact 14933 Bihong Shi Liqing Zeng Haolei Song Qiaoqin Shi and Songgang Wu (2010) Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris Int J Mol Sci 2010 Jun 311(6)2373-82 Clavell LA Gelber RD Cohen HJ Hitchcock-Bryan S Cassady JR Tarbell NJ Blattner SR Tantravahi R Leavitt P Sallan SE (1986) Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia N Engl J Med 315(11)657-63 Cregg JM Tolstorukov I Kusari A Sunga J Madden K Chappell T (2009)Expression in the yeast Pichia pastoris Methods Enzymol 463169-89
BIBLIOGRAFIA
El-Bessoumy AA Sarhan M Mansour J (2004) Production isolation and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation J Biochem Mol Biol 37(4)387-93 Ertel IJ Nesbit ME Hammond D Weiner J Sather H (1979) Effective dose of L-asparaginase for induction of remission in previously treated children with acute lymphocytic leukemia a report from Childrens Cancer Study Group Cancer Res 39(10)3893-6 Haskell CM Canellos GP Leventhal BG Carbone PP Block JB Serpick AA Selawry OS (1969) L-asparaginase therapeutic and toxic effects in patients with neoplastic disease N Engl J Med 281(19)1028-34 Jaffe N Traggis D Das L Moloney WC Hann HW Kim BS Nair R (1971) L-asparaginase in the treatment of neoplastic diseases in childrenCancer Res 31(7)942-9 Kearney SL Dahlberg SE Levy DE Voss SD Sallan SE Silverman LB (2009) Clinical course and outcome in children with acute lymphoblastic leukemia and asparaginase-associated pancreatitis Pediatr Blood Cancer 53(2)162-7
BIBLIOGRAFIA
Kwon YM Chung HS Moon C Yockman J Park YJ Gitlin SD David AE Yang VC (2009) L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) J Control Release139(3)182-9 Epub Losa Friacuteas V Martiacuten-Sacristaacuten Martiacuten B Diacuteaz Conejo R Ramos Corral R Velasco Arribas MR (2010) Transient hyperlipidemia secondary to treatment with asparaginase and prednisone An Pediatr (Barc) 72(1)85-7 Epub 2009 Oct 30 Tallal L Tan C Oettgen H Wollner N McCarthy M Helson L Burchenal J Karnofsky D Murphy ML (1970) E coli L-asparaginase in the treatment of leukemia and solid tumors in 131 children Cancer 25(2)306-20 Yurimoto H (2009) Molecular basis of methanol-inducible gene expression and its application in the methylotrophic yeast Candida boidinii Biosci Biotechnol Biochem 73(4)793-800
Introduccedilatildeo
A L-asparaginase (L-asparagina amino hidrolase EC3511) responde pela cataacutelise hidroliacutetica da L-asparagina em aacutecido L-aspaacutertico e amocircnia como ilustrado pela figura a seguir
Introduccedilatildeo
Leucemia Linfoblaacutestica Aguda (LLA)
CEacuteLULAS NORMAIS VERSUS CEacuteLULAS TUMORAIS
L- Asparagina
Uso da levedura de Pichia pastoris - Produccedilatildeo de proteiacutenas recombinantes
- Promotores eficientes fortemente regulados
- Forte tendecircncia ao crescimento aeroacutebico (Cregg et al 2009)
- Atinge altas densidades celulares
- Modificaccedilotildees poacutes traducionais
- Organismo metilotroacutefico
- GRAS (Generally Recognized As Safe)
Expressatildeo de beta glucanases de Alicyclobacillus sp (Bai et al 2010) em Pichia pastoris dentre outras
Expressatildeo heteroacuteloga de lipase de Aspergillus tamarii (Yurimoto et al 2009)
Introduccedilatildeo
Objetivos
Produccedilatildeo recombinante de asparaginase II de
Saccharomyces cerevisiae em Pichia pastoris (expressatildeo
heteroacuteloga)
Pichia pastoris Inoacuteculo
Total consumo da fonte de carbono (Glicerol)
Produccedilatildeo de asparaginaseII
Induccedilatildeo com metanol
Crescimento
Teste de atividade
MATERIAL E MEacuteTODOS
Quantificaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de Glicerol
MATERIAL E MEacuteTODOS
Amostra (mL)
Branco Amostra (mL)
Branco Asparagina (mL)
Asparagina 01M 05 --- 05
Hidroxilamina 1M 05 --- 05
Suspensatildeo de ceacutelulas 40 40 --- Tampatildeo Fosfato
20mM --- 10 40
Quantificaccedilatildeo da atividade da enzima asparaginase
A seguir tem-se um esquema das reaccedilotildees enzimaacuteticas que levam a asparagina ateacute o complexo Fe hidroxamato composto que absorve no comprimento de onda de 500nm
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash Crescimento celular
Incubaccedilatildeo (h) Massa celular Glicerol
g (peso seco de ceacutelula)L (gL)
0 --- 1000
19 037
24 059 1000
48 225 576
72 323 000
Tempo 24 (h) Tempo 72 (h)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Dosagem da Atividade da Asparaginase
Amostra Massa celular
Dosagem de
asparaginase ΔAbs
Induccedilatildeo
(h)
g (peso seco de
ceacutelula)L t=0 t=30min
t=0 323 - - -
t=4 331 0 0 0
t=24 339 0131 0438 0307
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
BIBLIOGRAFIA
Aghaiypour K Wlodawer A Lubkowski J (2001) Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase Biochemistry 40(19)5655-64 Bai Y Wang J Zhang Z Shi P Luo H Huang H Luo C Yao B(2010) Expression of an extremely acidic beta-14-glucanase from thermoacidophilic Alicyclobacillus sp A4 in Pichia pastoris is improved by truncating the gene sequence Microb Cell Fact 14933 Bihong Shi Liqing Zeng Haolei Song Qiaoqin Shi and Songgang Wu (2010) Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris Int J Mol Sci 2010 Jun 311(6)2373-82 Clavell LA Gelber RD Cohen HJ Hitchcock-Bryan S Cassady JR Tarbell NJ Blattner SR Tantravahi R Leavitt P Sallan SE (1986) Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia N Engl J Med 315(11)657-63 Cregg JM Tolstorukov I Kusari A Sunga J Madden K Chappell T (2009)Expression in the yeast Pichia pastoris Methods Enzymol 463169-89
BIBLIOGRAFIA
El-Bessoumy AA Sarhan M Mansour J (2004) Production isolation and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation J Biochem Mol Biol 37(4)387-93 Ertel IJ Nesbit ME Hammond D Weiner J Sather H (1979) Effective dose of L-asparaginase for induction of remission in previously treated children with acute lymphocytic leukemia a report from Childrens Cancer Study Group Cancer Res 39(10)3893-6 Haskell CM Canellos GP Leventhal BG Carbone PP Block JB Serpick AA Selawry OS (1969) L-asparaginase therapeutic and toxic effects in patients with neoplastic disease N Engl J Med 281(19)1028-34 Jaffe N Traggis D Das L Moloney WC Hann HW Kim BS Nair R (1971) L-asparaginase in the treatment of neoplastic diseases in childrenCancer Res 31(7)942-9 Kearney SL Dahlberg SE Levy DE Voss SD Sallan SE Silverman LB (2009) Clinical course and outcome in children with acute lymphoblastic leukemia and asparaginase-associated pancreatitis Pediatr Blood Cancer 53(2)162-7
BIBLIOGRAFIA
Kwon YM Chung HS Moon C Yockman J Park YJ Gitlin SD David AE Yang VC (2009) L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) J Control Release139(3)182-9 Epub Losa Friacuteas V Martiacuten-Sacristaacuten Martiacuten B Diacuteaz Conejo R Ramos Corral R Velasco Arribas MR (2010) Transient hyperlipidemia secondary to treatment with asparaginase and prednisone An Pediatr (Barc) 72(1)85-7 Epub 2009 Oct 30 Tallal L Tan C Oettgen H Wollner N McCarthy M Helson L Burchenal J Karnofsky D Murphy ML (1970) E coli L-asparaginase in the treatment of leukemia and solid tumors in 131 children Cancer 25(2)306-20 Yurimoto H (2009) Molecular basis of methanol-inducible gene expression and its application in the methylotrophic yeast Candida boidinii Biosci Biotechnol Biochem 73(4)793-800
Introduccedilatildeo
Leucemia Linfoblaacutestica Aguda (LLA)
CEacuteLULAS NORMAIS VERSUS CEacuteLULAS TUMORAIS
L- Asparagina
Uso da levedura de Pichia pastoris - Produccedilatildeo de proteiacutenas recombinantes
- Promotores eficientes fortemente regulados
- Forte tendecircncia ao crescimento aeroacutebico (Cregg et al 2009)
- Atinge altas densidades celulares
- Modificaccedilotildees poacutes traducionais
- Organismo metilotroacutefico
- GRAS (Generally Recognized As Safe)
Expressatildeo de beta glucanases de Alicyclobacillus sp (Bai et al 2010) em Pichia pastoris dentre outras
Expressatildeo heteroacuteloga de lipase de Aspergillus tamarii (Yurimoto et al 2009)
Introduccedilatildeo
Objetivos
Produccedilatildeo recombinante de asparaginase II de
Saccharomyces cerevisiae em Pichia pastoris (expressatildeo
heteroacuteloga)
Pichia pastoris Inoacuteculo
Total consumo da fonte de carbono (Glicerol)
Produccedilatildeo de asparaginaseII
Induccedilatildeo com metanol
Crescimento
Teste de atividade
MATERIAL E MEacuteTODOS
Quantificaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de Glicerol
MATERIAL E MEacuteTODOS
Amostra (mL)
Branco Amostra (mL)
Branco Asparagina (mL)
Asparagina 01M 05 --- 05
Hidroxilamina 1M 05 --- 05
Suspensatildeo de ceacutelulas 40 40 --- Tampatildeo Fosfato
20mM --- 10 40
Quantificaccedilatildeo da atividade da enzima asparaginase
A seguir tem-se um esquema das reaccedilotildees enzimaacuteticas que levam a asparagina ateacute o complexo Fe hidroxamato composto que absorve no comprimento de onda de 500nm
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash Crescimento celular
Incubaccedilatildeo (h) Massa celular Glicerol
g (peso seco de ceacutelula)L (gL)
0 --- 1000
19 037
24 059 1000
48 225 576
72 323 000
Tempo 24 (h) Tempo 72 (h)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Dosagem da Atividade da Asparaginase
Amostra Massa celular
Dosagem de
asparaginase ΔAbs
Induccedilatildeo
(h)
g (peso seco de
ceacutelula)L t=0 t=30min
t=0 323 - - -
t=4 331 0 0 0
t=24 339 0131 0438 0307
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
BIBLIOGRAFIA
Aghaiypour K Wlodawer A Lubkowski J (2001) Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase Biochemistry 40(19)5655-64 Bai Y Wang J Zhang Z Shi P Luo H Huang H Luo C Yao B(2010) Expression of an extremely acidic beta-14-glucanase from thermoacidophilic Alicyclobacillus sp A4 in Pichia pastoris is improved by truncating the gene sequence Microb Cell Fact 14933 Bihong Shi Liqing Zeng Haolei Song Qiaoqin Shi and Songgang Wu (2010) Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris Int J Mol Sci 2010 Jun 311(6)2373-82 Clavell LA Gelber RD Cohen HJ Hitchcock-Bryan S Cassady JR Tarbell NJ Blattner SR Tantravahi R Leavitt P Sallan SE (1986) Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia N Engl J Med 315(11)657-63 Cregg JM Tolstorukov I Kusari A Sunga J Madden K Chappell T (2009)Expression in the yeast Pichia pastoris Methods Enzymol 463169-89
BIBLIOGRAFIA
El-Bessoumy AA Sarhan M Mansour J (2004) Production isolation and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation J Biochem Mol Biol 37(4)387-93 Ertel IJ Nesbit ME Hammond D Weiner J Sather H (1979) Effective dose of L-asparaginase for induction of remission in previously treated children with acute lymphocytic leukemia a report from Childrens Cancer Study Group Cancer Res 39(10)3893-6 Haskell CM Canellos GP Leventhal BG Carbone PP Block JB Serpick AA Selawry OS (1969) L-asparaginase therapeutic and toxic effects in patients with neoplastic disease N Engl J Med 281(19)1028-34 Jaffe N Traggis D Das L Moloney WC Hann HW Kim BS Nair R (1971) L-asparaginase in the treatment of neoplastic diseases in childrenCancer Res 31(7)942-9 Kearney SL Dahlberg SE Levy DE Voss SD Sallan SE Silverman LB (2009) Clinical course and outcome in children with acute lymphoblastic leukemia and asparaginase-associated pancreatitis Pediatr Blood Cancer 53(2)162-7
BIBLIOGRAFIA
Kwon YM Chung HS Moon C Yockman J Park YJ Gitlin SD David AE Yang VC (2009) L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) J Control Release139(3)182-9 Epub Losa Friacuteas V Martiacuten-Sacristaacuten Martiacuten B Diacuteaz Conejo R Ramos Corral R Velasco Arribas MR (2010) Transient hyperlipidemia secondary to treatment with asparaginase and prednisone An Pediatr (Barc) 72(1)85-7 Epub 2009 Oct 30 Tallal L Tan C Oettgen H Wollner N McCarthy M Helson L Burchenal J Karnofsky D Murphy ML (1970) E coli L-asparaginase in the treatment of leukemia and solid tumors in 131 children Cancer 25(2)306-20 Yurimoto H (2009) Molecular basis of methanol-inducible gene expression and its application in the methylotrophic yeast Candida boidinii Biosci Biotechnol Biochem 73(4)793-800
Uso da levedura de Pichia pastoris - Produccedilatildeo de proteiacutenas recombinantes
- Promotores eficientes fortemente regulados
- Forte tendecircncia ao crescimento aeroacutebico (Cregg et al 2009)
- Atinge altas densidades celulares
- Modificaccedilotildees poacutes traducionais
- Organismo metilotroacutefico
- GRAS (Generally Recognized As Safe)
Expressatildeo de beta glucanases de Alicyclobacillus sp (Bai et al 2010) em Pichia pastoris dentre outras
Expressatildeo heteroacuteloga de lipase de Aspergillus tamarii (Yurimoto et al 2009)
Introduccedilatildeo
Objetivos
Produccedilatildeo recombinante de asparaginase II de
Saccharomyces cerevisiae em Pichia pastoris (expressatildeo
heteroacuteloga)
Pichia pastoris Inoacuteculo
Total consumo da fonte de carbono (Glicerol)
Produccedilatildeo de asparaginaseII
Induccedilatildeo com metanol
Crescimento
Teste de atividade
MATERIAL E MEacuteTODOS
Quantificaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de Glicerol
MATERIAL E MEacuteTODOS
Amostra (mL)
Branco Amostra (mL)
Branco Asparagina (mL)
Asparagina 01M 05 --- 05
Hidroxilamina 1M 05 --- 05
Suspensatildeo de ceacutelulas 40 40 --- Tampatildeo Fosfato
20mM --- 10 40
Quantificaccedilatildeo da atividade da enzima asparaginase
A seguir tem-se um esquema das reaccedilotildees enzimaacuteticas que levam a asparagina ateacute o complexo Fe hidroxamato composto que absorve no comprimento de onda de 500nm
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash Crescimento celular
Incubaccedilatildeo (h) Massa celular Glicerol
g (peso seco de ceacutelula)L (gL)
0 --- 1000
19 037
24 059 1000
48 225 576
72 323 000
Tempo 24 (h) Tempo 72 (h)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Dosagem da Atividade da Asparaginase
Amostra Massa celular
Dosagem de
asparaginase ΔAbs
Induccedilatildeo
(h)
g (peso seco de
ceacutelula)L t=0 t=30min
t=0 323 - - -
t=4 331 0 0 0
t=24 339 0131 0438 0307
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
BIBLIOGRAFIA
Aghaiypour K Wlodawer A Lubkowski J (2001) Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase Biochemistry 40(19)5655-64 Bai Y Wang J Zhang Z Shi P Luo H Huang H Luo C Yao B(2010) Expression of an extremely acidic beta-14-glucanase from thermoacidophilic Alicyclobacillus sp A4 in Pichia pastoris is improved by truncating the gene sequence Microb Cell Fact 14933 Bihong Shi Liqing Zeng Haolei Song Qiaoqin Shi and Songgang Wu (2010) Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris Int J Mol Sci 2010 Jun 311(6)2373-82 Clavell LA Gelber RD Cohen HJ Hitchcock-Bryan S Cassady JR Tarbell NJ Blattner SR Tantravahi R Leavitt P Sallan SE (1986) Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia N Engl J Med 315(11)657-63 Cregg JM Tolstorukov I Kusari A Sunga J Madden K Chappell T (2009)Expression in the yeast Pichia pastoris Methods Enzymol 463169-89
BIBLIOGRAFIA
El-Bessoumy AA Sarhan M Mansour J (2004) Production isolation and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation J Biochem Mol Biol 37(4)387-93 Ertel IJ Nesbit ME Hammond D Weiner J Sather H (1979) Effective dose of L-asparaginase for induction of remission in previously treated children with acute lymphocytic leukemia a report from Childrens Cancer Study Group Cancer Res 39(10)3893-6 Haskell CM Canellos GP Leventhal BG Carbone PP Block JB Serpick AA Selawry OS (1969) L-asparaginase therapeutic and toxic effects in patients with neoplastic disease N Engl J Med 281(19)1028-34 Jaffe N Traggis D Das L Moloney WC Hann HW Kim BS Nair R (1971) L-asparaginase in the treatment of neoplastic diseases in childrenCancer Res 31(7)942-9 Kearney SL Dahlberg SE Levy DE Voss SD Sallan SE Silverman LB (2009) Clinical course and outcome in children with acute lymphoblastic leukemia and asparaginase-associated pancreatitis Pediatr Blood Cancer 53(2)162-7
BIBLIOGRAFIA
Kwon YM Chung HS Moon C Yockman J Park YJ Gitlin SD David AE Yang VC (2009) L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) J Control Release139(3)182-9 Epub Losa Friacuteas V Martiacuten-Sacristaacuten Martiacuten B Diacuteaz Conejo R Ramos Corral R Velasco Arribas MR (2010) Transient hyperlipidemia secondary to treatment with asparaginase and prednisone An Pediatr (Barc) 72(1)85-7 Epub 2009 Oct 30 Tallal L Tan C Oettgen H Wollner N McCarthy M Helson L Burchenal J Karnofsky D Murphy ML (1970) E coli L-asparaginase in the treatment of leukemia and solid tumors in 131 children Cancer 25(2)306-20 Yurimoto H (2009) Molecular basis of methanol-inducible gene expression and its application in the methylotrophic yeast Candida boidinii Biosci Biotechnol Biochem 73(4)793-800
Objetivos
Produccedilatildeo recombinante de asparaginase II de
Saccharomyces cerevisiae em Pichia pastoris (expressatildeo
heteroacuteloga)
Pichia pastoris Inoacuteculo
Total consumo da fonte de carbono (Glicerol)
Produccedilatildeo de asparaginaseII
Induccedilatildeo com metanol
Crescimento
Teste de atividade
MATERIAL E MEacuteTODOS
Quantificaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de Glicerol
MATERIAL E MEacuteTODOS
Amostra (mL)
Branco Amostra (mL)
Branco Asparagina (mL)
Asparagina 01M 05 --- 05
Hidroxilamina 1M 05 --- 05
Suspensatildeo de ceacutelulas 40 40 --- Tampatildeo Fosfato
20mM --- 10 40
Quantificaccedilatildeo da atividade da enzima asparaginase
A seguir tem-se um esquema das reaccedilotildees enzimaacuteticas que levam a asparagina ateacute o complexo Fe hidroxamato composto que absorve no comprimento de onda de 500nm
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash Crescimento celular
Incubaccedilatildeo (h) Massa celular Glicerol
g (peso seco de ceacutelula)L (gL)
0 --- 1000
19 037
24 059 1000
48 225 576
72 323 000
Tempo 24 (h) Tempo 72 (h)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Dosagem da Atividade da Asparaginase
Amostra Massa celular
Dosagem de
asparaginase ΔAbs
Induccedilatildeo
(h)
g (peso seco de
ceacutelula)L t=0 t=30min
t=0 323 - - -
t=4 331 0 0 0
t=24 339 0131 0438 0307
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
BIBLIOGRAFIA
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Pichia pastoris Inoacuteculo
Total consumo da fonte de carbono (Glicerol)
Produccedilatildeo de asparaginaseII
Induccedilatildeo com metanol
Crescimento
Teste de atividade
MATERIAL E MEacuteTODOS
Quantificaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de Glicerol
MATERIAL E MEacuteTODOS
Amostra (mL)
Branco Amostra (mL)
Branco Asparagina (mL)
Asparagina 01M 05 --- 05
Hidroxilamina 1M 05 --- 05
Suspensatildeo de ceacutelulas 40 40 --- Tampatildeo Fosfato
20mM --- 10 40
Quantificaccedilatildeo da atividade da enzima asparaginase
A seguir tem-se um esquema das reaccedilotildees enzimaacuteticas que levam a asparagina ateacute o complexo Fe hidroxamato composto que absorve no comprimento de onda de 500nm
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash Crescimento celular
Incubaccedilatildeo (h) Massa celular Glicerol
g (peso seco de ceacutelula)L (gL)
0 --- 1000
19 037
24 059 1000
48 225 576
72 323 000
Tempo 24 (h) Tempo 72 (h)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Dosagem da Atividade da Asparaginase
Amostra Massa celular
Dosagem de
asparaginase ΔAbs
Induccedilatildeo
(h)
g (peso seco de
ceacutelula)L t=0 t=30min
t=0 323 - - -
t=4 331 0 0 0
t=24 339 0131 0438 0307
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
BIBLIOGRAFIA
Aghaiypour K Wlodawer A Lubkowski J (2001) Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase Biochemistry 40(19)5655-64 Bai Y Wang J Zhang Z Shi P Luo H Huang H Luo C Yao B(2010) Expression of an extremely acidic beta-14-glucanase from thermoacidophilic Alicyclobacillus sp A4 in Pichia pastoris is improved by truncating the gene sequence Microb Cell Fact 14933 Bihong Shi Liqing Zeng Haolei Song Qiaoqin Shi and Songgang Wu (2010) Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris Int J Mol Sci 2010 Jun 311(6)2373-82 Clavell LA Gelber RD Cohen HJ Hitchcock-Bryan S Cassady JR Tarbell NJ Blattner SR Tantravahi R Leavitt P Sallan SE (1986) Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia N Engl J Med 315(11)657-63 Cregg JM Tolstorukov I Kusari A Sunga J Madden K Chappell T (2009)Expression in the yeast Pichia pastoris Methods Enzymol 463169-89
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MATERIAL E MEacuteTODOS
Quantificaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de Glicerol
MATERIAL E MEacuteTODOS
Amostra (mL)
Branco Amostra (mL)
Branco Asparagina (mL)
Asparagina 01M 05 --- 05
Hidroxilamina 1M 05 --- 05
Suspensatildeo de ceacutelulas 40 40 --- Tampatildeo Fosfato
20mM --- 10 40
Quantificaccedilatildeo da atividade da enzima asparaginase
A seguir tem-se um esquema das reaccedilotildees enzimaacuteticas que levam a asparagina ateacute o complexo Fe hidroxamato composto que absorve no comprimento de onda de 500nm
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash Crescimento celular
Incubaccedilatildeo (h) Massa celular Glicerol
g (peso seco de ceacutelula)L (gL)
0 --- 1000
19 037
24 059 1000
48 225 576
72 323 000
Tempo 24 (h) Tempo 72 (h)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Dosagem da Atividade da Asparaginase
Amostra Massa celular
Dosagem de
asparaginase ΔAbs
Induccedilatildeo
(h)
g (peso seco de
ceacutelula)L t=0 t=30min
t=0 323 - - -
t=4 331 0 0 0
t=24 339 0131 0438 0307
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
BIBLIOGRAFIA
Aghaiypour K Wlodawer A Lubkowski J (2001) Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase Biochemistry 40(19)5655-64 Bai Y Wang J Zhang Z Shi P Luo H Huang H Luo C Yao B(2010) Expression of an extremely acidic beta-14-glucanase from thermoacidophilic Alicyclobacillus sp A4 in Pichia pastoris is improved by truncating the gene sequence Microb Cell Fact 14933 Bihong Shi Liqing Zeng Haolei Song Qiaoqin Shi and Songgang Wu (2010) Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris Int J Mol Sci 2010 Jun 311(6)2373-82 Clavell LA Gelber RD Cohen HJ Hitchcock-Bryan S Cassady JR Tarbell NJ Blattner SR Tantravahi R Leavitt P Sallan SE (1986) Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia N Engl J Med 315(11)657-63 Cregg JM Tolstorukov I Kusari A Sunga J Madden K Chappell T (2009)Expression in the yeast Pichia pastoris Methods Enzymol 463169-89
BIBLIOGRAFIA
El-Bessoumy AA Sarhan M Mansour J (2004) Production isolation and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation J Biochem Mol Biol 37(4)387-93 Ertel IJ Nesbit ME Hammond D Weiner J Sather H (1979) Effective dose of L-asparaginase for induction of remission in previously treated children with acute lymphocytic leukemia a report from Childrens Cancer Study Group Cancer Res 39(10)3893-6 Haskell CM Canellos GP Leventhal BG Carbone PP Block JB Serpick AA Selawry OS (1969) L-asparaginase therapeutic and toxic effects in patients with neoplastic disease N Engl J Med 281(19)1028-34 Jaffe N Traggis D Das L Moloney WC Hann HW Kim BS Nair R (1971) L-asparaginase in the treatment of neoplastic diseases in childrenCancer Res 31(7)942-9 Kearney SL Dahlberg SE Levy DE Voss SD Sallan SE Silverman LB (2009) Clinical course and outcome in children with acute lymphoblastic leukemia and asparaginase-associated pancreatitis Pediatr Blood Cancer 53(2)162-7
BIBLIOGRAFIA
Kwon YM Chung HS Moon C Yockman J Park YJ Gitlin SD David AE Yang VC (2009) L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) J Control Release139(3)182-9 Epub Losa Friacuteas V Martiacuten-Sacristaacuten Martiacuten B Diacuteaz Conejo R Ramos Corral R Velasco Arribas MR (2010) Transient hyperlipidemia secondary to treatment with asparaginase and prednisone An Pediatr (Barc) 72(1)85-7 Epub 2009 Oct 30 Tallal L Tan C Oettgen H Wollner N McCarthy M Helson L Burchenal J Karnofsky D Murphy ML (1970) E coli L-asparaginase in the treatment of leukemia and solid tumors in 131 children Cancer 25(2)306-20 Yurimoto H (2009) Molecular basis of methanol-inducible gene expression and its application in the methylotrophic yeast Candida boidinii Biosci Biotechnol Biochem 73(4)793-800
MATERIAL E MEacuteTODOS
Amostra (mL)
Branco Amostra (mL)
Branco Asparagina (mL)
Asparagina 01M 05 --- 05
Hidroxilamina 1M 05 --- 05
Suspensatildeo de ceacutelulas 40 40 --- Tampatildeo Fosfato
20mM --- 10 40
Quantificaccedilatildeo da atividade da enzima asparaginase
A seguir tem-se um esquema das reaccedilotildees enzimaacuteticas que levam a asparagina ateacute o complexo Fe hidroxamato composto que absorve no comprimento de onda de 500nm
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash Crescimento celular
Incubaccedilatildeo (h) Massa celular Glicerol
g (peso seco de ceacutelula)L (gL)
0 --- 1000
19 037
24 059 1000
48 225 576
72 323 000
Tempo 24 (h) Tempo 72 (h)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Dosagem da Atividade da Asparaginase
Amostra Massa celular
Dosagem de
asparaginase ΔAbs
Induccedilatildeo
(h)
g (peso seco de
ceacutelula)L t=0 t=30min
t=0 323 - - -
t=4 331 0 0 0
t=24 339 0131 0438 0307
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
BIBLIOGRAFIA
Aghaiypour K Wlodawer A Lubkowski J (2001) Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase Biochemistry 40(19)5655-64 Bai Y Wang J Zhang Z Shi P Luo H Huang H Luo C Yao B(2010) Expression of an extremely acidic beta-14-glucanase from thermoacidophilic Alicyclobacillus sp A4 in Pichia pastoris is improved by truncating the gene sequence Microb Cell Fact 14933 Bihong Shi Liqing Zeng Haolei Song Qiaoqin Shi and Songgang Wu (2010) Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris Int J Mol Sci 2010 Jun 311(6)2373-82 Clavell LA Gelber RD Cohen HJ Hitchcock-Bryan S Cassady JR Tarbell NJ Blattner SR Tantravahi R Leavitt P Sallan SE (1986) Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia N Engl J Med 315(11)657-63 Cregg JM Tolstorukov I Kusari A Sunga J Madden K Chappell T (2009)Expression in the yeast Pichia pastoris Methods Enzymol 463169-89
BIBLIOGRAFIA
El-Bessoumy AA Sarhan M Mansour J (2004) Production isolation and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation J Biochem Mol Biol 37(4)387-93 Ertel IJ Nesbit ME Hammond D Weiner J Sather H (1979) Effective dose of L-asparaginase for induction of remission in previously treated children with acute lymphocytic leukemia a report from Childrens Cancer Study Group Cancer Res 39(10)3893-6 Haskell CM Canellos GP Leventhal BG Carbone PP Block JB Serpick AA Selawry OS (1969) L-asparaginase therapeutic and toxic effects in patients with neoplastic disease N Engl J Med 281(19)1028-34 Jaffe N Traggis D Das L Moloney WC Hann HW Kim BS Nair R (1971) L-asparaginase in the treatment of neoplastic diseases in childrenCancer Res 31(7)942-9 Kearney SL Dahlberg SE Levy DE Voss SD Sallan SE Silverman LB (2009) Clinical course and outcome in children with acute lymphoblastic leukemia and asparaginase-associated pancreatitis Pediatr Blood Cancer 53(2)162-7
BIBLIOGRAFIA
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RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash Crescimento celular
Incubaccedilatildeo (h) Massa celular Glicerol
g (peso seco de ceacutelula)L (gL)
0 --- 1000
19 037
24 059 1000
48 225 576
72 323 000
Tempo 24 (h) Tempo 72 (h)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Dosagem da Atividade da Asparaginase
Amostra Massa celular
Dosagem de
asparaginase ΔAbs
Induccedilatildeo
(h)
g (peso seco de
ceacutelula)L t=0 t=30min
t=0 323 - - -
t=4 331 0 0 0
t=24 339 0131 0438 0307
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
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RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Dosagem da Atividade da Asparaginase
Amostra Massa celular
Dosagem de
asparaginase ΔAbs
Induccedilatildeo
(h)
g (peso seco de
ceacutelula)L t=0 t=30min
t=0 323 - - -
t=4 331 0 0 0
t=24 339 0131 0438 0307
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
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RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Uma unidade enzimaacutetica (U) corresponde a quantidade de enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de 1mmol de produto por minuto sob condiccedilotildees especiacuteficas sabendo-se que a absortividade molar do complexo Fe hidroxamato dosado agrave 500nm eacute de 950
Absorvacircncia Absortividade molar = M ou nordm molesL 0307950 = 323 x 10-4 M ou 323 micromolL
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
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RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Para um volume de 5mL Nordm moles = (323 micromolL X 5)1000 = 1615 micromol ( em 30 minutos de reaccedilatildeo) Considerando-se a reaccedilatildeo enzimaacutetica em velocidade inicial Nordm moles min = 1615 30 = 0054 micromolmin Em 4mL de suspensatildeo celular 0054 micromolmin volume de suspensatildeo celular = 00135 micromol(min x mL) UL 00135 micromol min X mL X 1000 = 135 micromol min X L = 1346 UL UL X h 135 micromol min X L X 60 = 8075 micromol h X L = 8075 U L X h Massa celular Massa celular = DO (600nm) X fator (peso seco de ceacutelula) = 047 x 026 = 0122gL Ug de peso seco de ceacutelula (1346 UL ) (0122gL)= 11032Ug
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
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Aghaiypour K Wlodawer A Lubkowski J (2001) Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase Biochemistry 40(19)5655-64 Bai Y Wang J Zhang Z Shi P Luo H Huang H Luo C Yao B(2010) Expression of an extremely acidic beta-14-glucanase from thermoacidophilic Alicyclobacillus sp A4 in Pichia pastoris is improved by truncating the gene sequence Microb Cell Fact 14933 Bihong Shi Liqing Zeng Haolei Song Qiaoqin Shi and Songgang Wu (2010) Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris Int J Mol Sci 2010 Jun 311(6)2373-82 Clavell LA Gelber RD Cohen HJ Hitchcock-Bryan S Cassady JR Tarbell NJ Blattner SR Tantravahi R Leavitt P Sallan SE (1986) Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia N Engl J Med 315(11)657-63 Cregg JM Tolstorukov I Kusari A Sunga J Madden K Chappell T (2009)Expression in the yeast Pichia pastoris Methods Enzymol 463169-89
BIBLIOGRAFIA
El-Bessoumy AA Sarhan M Mansour J (2004) Production isolation and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation J Biochem Mol Biol 37(4)387-93 Ertel IJ Nesbit ME Hammond D Weiner J Sather H (1979) Effective dose of L-asparaginase for induction of remission in previously treated children with acute lymphocytic leukemia a report from Childrens Cancer Study Group Cancer Res 39(10)3893-6 Haskell CM Canellos GP Leventhal BG Carbone PP Block JB Serpick AA Selawry OS (1969) L-asparaginase therapeutic and toxic effects in patients with neoplastic disease N Engl J Med 281(19)1028-34 Jaffe N Traggis D Das L Moloney WC Hann HW Kim BS Nair R (1971) L-asparaginase in the treatment of neoplastic diseases in childrenCancer Res 31(7)942-9 Kearney SL Dahlberg SE Levy DE Voss SD Sallan SE Silverman LB (2009) Clinical course and outcome in children with acute lymphoblastic leukemia and asparaginase-associated pancreatitis Pediatr Blood Cancer 53(2)162-7
BIBLIOGRAFIA
Kwon YM Chung HS Moon C Yockman J Park YJ Gitlin SD David AE Yang VC (2009) L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) J Control Release139(3)182-9 Epub Losa Friacuteas V Martiacuten-Sacristaacuten Martiacuten B Diacuteaz Conejo R Ramos Corral R Velasco Arribas MR (2010) Transient hyperlipidemia secondary to treatment with asparaginase and prednisone An Pediatr (Barc) 72(1)85-7 Epub 2009 Oct 30 Tallal L Tan C Oettgen H Wollner N McCarthy M Helson L Burchenal J Karnofsky D Murphy ML (1970) E coli L-asparaginase in the treatment of leukemia and solid tumors in 131 children Cancer 25(2)306-20 Yurimoto H (2009) Molecular basis of methanol-inducible gene expression and its application in the methylotrophic yeast Candida boidinii Biosci Biotechnol Biochem 73(4)793-800
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO ndash ndash Induccedilatildeo da expressatildeo da enzima recombinante
Depois de feitos os caacutelculos e todas as dosagens obtiveram-se os resultados mostrados na tabela a seguir
Curva de Induccedilatildeo da Expressatildeo da Asparaginase
Induccedilatildeo
(h)
pH
meio
Massa celular Asparaginase
g (peso seco de
ceacutelula)L
Ug (peso seco de
ceacutelula)
0 60 323 0
24 55 331 0
48 45 339 397
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
BIBLIOGRAFIA
Aghaiypour K Wlodawer A Lubkowski J (2001) Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase Biochemistry 40(19)5655-64 Bai Y Wang J Zhang Z Shi P Luo H Huang H Luo C Yao B(2010) Expression of an extremely acidic beta-14-glucanase from thermoacidophilic Alicyclobacillus sp A4 in Pichia pastoris is improved by truncating the gene sequence Microb Cell Fact 14933 Bihong Shi Liqing Zeng Haolei Song Qiaoqin Shi and Songgang Wu (2010) Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris Int J Mol Sci 2010 Jun 311(6)2373-82 Clavell LA Gelber RD Cohen HJ Hitchcock-Bryan S Cassady JR Tarbell NJ Blattner SR Tantravahi R Leavitt P Sallan SE (1986) Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia N Engl J Med 315(11)657-63 Cregg JM Tolstorukov I Kusari A Sunga J Madden K Chappell T (2009)Expression in the yeast Pichia pastoris Methods Enzymol 463169-89
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El-Bessoumy AA Sarhan M Mansour J (2004) Production isolation and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation J Biochem Mol Biol 37(4)387-93 Ertel IJ Nesbit ME Hammond D Weiner J Sather H (1979) Effective dose of L-asparaginase for induction of remission in previously treated children with acute lymphocytic leukemia a report from Childrens Cancer Study Group Cancer Res 39(10)3893-6 Haskell CM Canellos GP Leventhal BG Carbone PP Block JB Serpick AA Selawry OS (1969) L-asparaginase therapeutic and toxic effects in patients with neoplastic disease N Engl J Med 281(19)1028-34 Jaffe N Traggis D Das L Moloney WC Hann HW Kim BS Nair R (1971) L-asparaginase in the treatment of neoplastic diseases in childrenCancer Res 31(7)942-9 Kearney SL Dahlberg SE Levy DE Voss SD Sallan SE Silverman LB (2009) Clinical course and outcome in children with acute lymphoblastic leukemia and asparaginase-associated pancreatitis Pediatr Blood Cancer 53(2)162-7
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Kwon YM Chung HS Moon C Yockman J Park YJ Gitlin SD David AE Yang VC (2009) L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) J Control Release139(3)182-9 Epub Losa Friacuteas V Martiacuten-Sacristaacuten Martiacuten B Diacuteaz Conejo R Ramos Corral R Velasco Arribas MR (2010) Transient hyperlipidemia secondary to treatment with asparaginase and prednisone An Pediatr (Barc) 72(1)85-7 Epub 2009 Oct 30 Tallal L Tan C Oettgen H Wollner N McCarthy M Helson L Burchenal J Karnofsky D Murphy ML (1970) E coli L-asparaginase in the treatment of leukemia and solid tumors in 131 children Cancer 25(2)306-20 Yurimoto H (2009) Molecular basis of methanol-inducible gene expression and its application in the methylotrophic yeast Candida boidinii Biosci Biotechnol Biochem 73(4)793-800
CONCLUSAtildeO
- A concentraccedilatildeo da biomassa da levedura P pastoris encontrada foi de
323g(peso seco de ceacutelulas)L valor obtido apoacutes o consumo total do glicerol em 72h - A expressatildeo da enzima foi detectada 48h apoacutes a induccedilatildeo com metanol - A produccedilatildeo da asparaginase por expressatildeo heteroacuteloga do gene ASP3 foi de 11032Ug (peso seco de ceacutelula)
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