Relatório - Hidrólise do amido

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA SETOR DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE DEPARTAMENTO DE CINCIAS FARMACUTICAS

GESSICA DE QUADROS FERREIRA JENNIFER LORENA FERREIRA JOSIANE APARECIDA SCHEMBERGER KAROLINE IANUXAUSKAS STRUMINSKI MARYANA ALBINO CLAVERO

HIDRLISE ENZIMTICA DO AMIDO HIDRLISE CIDA DO AMIDO

PONTA GROSSA 2011

GESSICA DE QUADROS FERREIRA JENNIFER LORENA FERREIRA JOSIANE APARECIDA SCHEMBERGER KAROLINE IANUXAUSKAS STRUMINSKI MARYANA ALBINO CLAVERO

HIDRLISE ENZIMTICA DO AMIDO HIDRLISE CIDA DO AMIDO Trabalho acadmico apresentado disciplina de Bioqumica para obteno de nota parcial referente ao segundo semestre. Professora: Juliana Inaba.

PONTA GROSSA 2011

OBJETIVO Avaliar o perfil de hidrlise enzimtica do amido. Objetivo especfico: Comparar a hidrlise cida com a enzimtica. INTRODUO O amido O amido um poliolosdio homogneo constitudo essencialmente de por resduos de glicose unidos por ligaes alfa-1,4 (amilose e amilopectina)e alfa-1,6 (amilopectina). A amilose reagindo com o iodo forma uma colorao azul e a amilopectina forma uma colorao vermelho-castanho. A Amilase A amilase uma enzima produzida pelo pncreas e pelas glndulas salivares, que atua na digesto do amido e do glicognio. Clinicamente sua analise um indicador til no diagnstico de pancreatites e paratiroides. Os valores de amilase no sangue estaro aumentados na presena de pancratite aguda e crnica; caxumba; lcera pptica perfurada; intoxicao por lcool; insuficincia renal; colecistite agua; Aids; obstruo do ducto biliar ou pancretico;hepatite; cirrose; queimaduras severas. Amilase Salivar A digesto dos alimentos iniciada na boca, onde se verifica, essencialmente, a mastigao, havendo a quebra das grandes partculas alimentares em outras de menores dimenses que vo em seguida ser deglutidas. Ao mesmo tempo em que o alimento mastigado d-se a mistura deste com a secreo proveniente na sua maior parte, dos trs pares de glndulas salivares - partidas, submaxilares ou mandibulares e sublinguais - embora haja ainda a contribuio de pequenas glndulas orais. As glndulas salivares exibem dois tipos de secreo proteica: serosa e mucosa. A primeira corresponde secreo de vrias enzimas, como a -amilase salivar, tambm frequentemente designada por amlase ou ptialina, lpase, fosfatases cidas e insuficincia heptica; toxemia gestacional;

alcalinas e andrase carbnica. O segundo tipo de secreo no exclusiva deste tipo de glndulas, sendo produzida em toda a extenso do tubo digestivo, j que o muco funciona como lubrificante e protetor da superfcie epitelial contra a abraso, escoriao, enzimas e outros produtos existentes no interior do tubo digestivo, permitindo tambm o fcil deslizamento do alimento. A amilase familiar sintetizada ao nvel das glndulas partidas A produo de saliva contnua, sendo incrementada por estmulos provenientes das reas do sistema nervoso central associadas ao apetite, nomeadamente, em resposta a estmulos do sistema nervoso parassimptico. Na presena de alimento ou de um sinal indicador da possibilidade de haver ingesto de alimento (por exemplo, o cheiro ou a imagem), a secreo pode aumentar mais de 40 vezes. Por dia, a produo total de saliva ronda os 1,5 L. A amilase salivar uma enzima que atua provocando a hidrlise do amido, um polissacardeo muito abundante na alimentao, estando presente, sobretudo, em alimentos de origem vegetal, nos quais constitui a principal substncia de armazenamento. Em termos funcionais, esta enzima uma (1-4) glicosidase,

provocando a quebra da molcula de amido em dissacardeos, nomeadamente, maltose, a qual, posteriormente, ser simplificada a unidades de glicose, um monossacardeo, por enzimas especficas no duodeno. A glicose o principal substrato energtico das clulas. A amilase salivar apenas atua em situaes de pH prximo da neutralidade, motivo pelo qual o pH da boca varia entre os 6 e os 7,4. A sua ao prolonga-se mesmo no decurso do processo de deglutio, at a chegada ao estmago, onde inativada pelo pH cido do suco gstrico. Mau grado a ao da - amilase, a ao enzimtica na cavidade bucal tem pouca expresso no processo digestivo, devido ao pouco tempo de contacto entre as enzimas presentes na saliva e o alimento neste local. Uma mastigao lenta e persistente permite uma degradao mais efetiva do amido na boca, permitindo um aproveitamento mais eficaz deste nutriente. O amido no digerido pela amilase salivar apenas ser transformado, posteriormente, ao nvel do duodeno, por ao da amilase pancretica.

A hidrlise O amido, por tratamento, com cidos fortes e em temperatura elevada, pode ser convertido completamente em molculas de glicose. O cido a quente hidrolisa tanto as ligaes -1,4, como as -1,6. medida que a hidrlise progride, a reao com o iodo vai desaparecendo e o poder redutor do hidrolisado vai aumentando, pois estamos convertendo um composto noredutor e que reage fortemente com o iodo (amido) no seu constituinte essencial, que no reage com o iodo e francamente redutor (glicose). A hidrlise enzimtica A hidrlise enzimtica do amido pelo -amilase, por mais exaustiva que seja no converte todo o amido a molculas de glicose. Sendo uma enzima que ataca somente as ligaes -1,4 no interior da molcula, a sua ao sobre a amilose produz molculas de maltose, de maltotriose e poucas molculas de glicose. Na amilopectina, ela ataca as mesmas ligaes -1,4, sendo inativa em relao s ligaes -1,6. As amilodextrinas liberadas logo aps o incio da hidrlise enzimtica do amido reagem com o iodo dando uma cor azul. As dextrinas tendo menor peso molecular (e bastantes ramificaes) reagem com o iodo dando uma cor avermelhada e sendo, por isto chamadas de eritodextrinas. medida em que a hidrlise progride, as eritodextrinas vo sendo desdobradas em unidades menores, ainda contendo ramificaes (ligaes -1,6), que so chamadas de acrodextrinas por no produzirem um composto corado com o iodo. Prosseguindo a hidrlise pela -amilase, poderamos reduzir as dextrinas at o tamanho de oligolosdios contendo ligaes -1,6 e algumas molculas de isomaltose, um diolosdio com ligao -1,6. A hidrlise pela -amilase, portanto, transforma o amido ( no redutor e com a reao azul com o iodo), progressivamente com acrodextrinas ( com baixo poder redutor e no corveis pelo iodo ) e em glicose, maltose, isomaltose e oligolosdios redutores que tambm no desenvolvem colorao com iodo. No nosso organismo, a -amilase pode ser encontrada principalmente na saliva e no suco pancretico, ocorrendo tambm, em menores propores, na urina e no soro sanguineo. Praticamente toda a -amilase encontrada no soro e

na urina tem origem pancretica. A -amilase pancretica uma metaloenzima com peso molecular de aproximadamente 45.000 e que contm clcio. A presena de Ca++ essencial no somente para a atividade da enzima, mas tambm protege a sua estrutura peptdica contra a digesto proteoltica. A -amilase ativada por ons cloreto e tem um pH timo de ao em torno de 6,7, sendo inativada em pH cido ( abaixo de 4 ). Com o Aquecimento a enzima sofre desnaturao e perde sua atividade.

MATERIAIS - tubos de ensaio - pipetas - gua destilada - soluo de amido 1% - soluo de HC concentrado - soluo tampo - soluo de Lugol - reagente DNS - banho Maria - espectofotmetro

PROCEDIMENTOS Para a hidrlise cida, primeiramente numeraram-se os tubos de ensaio para posterior identificao dos reagentes utilizados e da quantidade de tempo para fervura. Em outro tubo adicionou-se 5 mL de soluo de amido a 1% e o incubou durante 5 minutos 37 C. Concomitantemente coletou-se saliva e foi preparada uma soluo diluda (1:10) contendo 1 mL de saliva, para 9 mL de soluo tampo. Ao tubo submetido ao aquecimento, adicionou-se 0,2 mL da soluo de saliva, mantendo a agitao. Desta mistura, nos tempos de 0, 2, 5, 10, 15 e 20 minutos, foram coletados 0,4 mL sendo 0,2 para o teste do iodo e 0,2 para o teste do DNS. Aos tubos de teste para o iodo adicionou-se ainda 3 gotas de Lugol e 10 mL de gua. Enquanto para o teste de DNS pipetou-se 1,3 mL de gua e 1 mL de DNS. Logo em seguida, submeteram-se os tubos a aquecimento de 100 C

durante 5 minutos. Depois de resfriado, adicionou-se 7,5 ml de gua e fez-se a leitura a 540 nm. Na hidrlise enzimtica, fez-se os mesmos procedimentos. Porm, ao tubo de ensaio foi adicionado 0,2 mL de HC concentrado, ao invs da soluo de saliva diluda.

RESULTADOS E DISCUSSO Experimento 1: Para dar-se incio ao experimento foi incubada a soluo de amido a uma temperatura em torno de 37 C, para que esta ficasse com uma temperatura relativamente aproximada ao do corpo humano, e assim fazendo com que a enzima (amilase salivar) estivesse com seu melhor desempenho. Preparamos tambm uma soluo salivar diluda (1:10). Enquanto a soluo de amido se estabilizava, preparou-se os tubos de 1 a 5 para o teste de Lugol, e de 6 a 10 para o teste do DNS. Aps 5 minutos passados comeou-se a adicionar a soluo de amido nos tubos nos tempos de 0, 2, 5, 10,15 e 20 minutos, e obteve-se o seguinte resultado visual em degrad, como mostra as figuras a seguir:

Figura 1: Teste do Iodo (Lugol) Fonte: Elaborao prpria

Figura 2: Teste do DNS. Fonte: Elaborao prpria.

Baseado nesses resultados (figura 1) pode observar que com a adio de Lugol resulta na formao de um complexo de colorao azul escuro, fato pelo qual h interao do iodo com a estrutura hlice do amido. Sendo que est colorao vai do azul escuro at o amarelo claro pelo tempo de incubao do amido, mesmo esta reao sendo irreversvel o amido pode no se recompor, nos dando ento a colorao amarelo claro. J com a adio do DNS (figura 2) as amostras reagiram conforme o tempo em que o amido ficou incubado e posteriormente ao aquecimento com a enzima, mostrando que quanto mais tempo o amido fique junto a enzima, esta exposta ao calor mais o amido divide-se em acares menores. Mas, lembrando de que esta exposio do amido junto enzima no pode ser por muito tempo, pois a enzima pode desnaturar e perder a sua funo, no dando o resultado esperado. Abaixo est demonstrado o resultado desta reao pela espectrofotometria:

Grfico 1: Curva de calibrao absorbncia versus tempo de incubao do amido e sua diviso em acares menores..

0.45 0.4 0.35

y = 0.0151x + 0.1236 R = 0.9579

Absorbncia

0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 5 10 15 20 25 Series1 Linear (Series1)

Tempo

Experimento 2: Para dar-se incio ao experimento incubou-se a soluo de amido a uma temperatura em torno de 100 C e adicionou-se a esta soluo de cido clordrico, e por este ser um cido forte em uma temperatura elevada tende a fazer a converso completa das molculas de amido em glucose. Sendo que o cido a quente hidrolisa tanto as ligaes -1,4 quanto as -1,6. medida que esta soluo (amido + cido) foi ficando incubada obtevese o seguinte resultado visual, como mostram as figuras a seguir:

Figura 3: Teste do Iodo (Lugol) Fonte: Elaborao prpria

Figura 4: Teste do DNS Fonte: 1Elaborao prpria

Pode-se observar na figura 3 que medida que a hidrlise progride, a reao entre o amido e o iodo (teste do Lugol) vai desaparecendo, j a partir do tubo 2, e no tubo 4 no se tem mais essa interao, mostrando que o amido foi convertido em glucose sendo que este no reage com o iodo. E na figura 4 observou-se que no teste DNS s amostras reagiram conforme o tempo em que o amido ficou incubado, mostrando que quanto mais tempo o amido fica incubado na presena do cido mais ele convertido em glucose. Abaixo est demonstrado o resultado desta reao pela

espectrofotometria:

Grfico 2: Curva de calibrao absorbncia versus tempo de incubao do amido em presena do cido clordrico..

1.4 1.2

Absorbncia

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20 25 Hidrlise cida Linear (Hidrlise cida)

Tempo

Com os dois experimentos e a observao dos seus resultados obtevese o seguinte grfico:Grfico 3: Comparao entre a hidrlise enzimtica e cida..

1.2 1 Absorbncia 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20 Tempo (minutos) 25 Hidrlise enzimtica Hidrlise cida

Comparando tambm as concentraes obtidas atravs da equao y = 0,0151x + 0,1236 podemos constatar com estes resultados que a hidrlise mais rpida e mais eficiente a cida, mas tem que se levar em considerao

que esta hidrlise ocorre em temperaturas mais elevadas. Abaixo esto demonstradas as concentraes de glucose em cada tubo:Tabela 1: Concentrao de glucose na hidrlise enzimtica.

Tempo (min.) 0 2 5 10 15 20

Absorbncia 0,09 0,153 0,234 0,296 0,34 0,414

Concentrao (mg %) 0 1,94 7,31 11,42 14,33 19,23

Tabela 2: Concentrao de glucose na hidrlise cida.

Tempo (min.) 0 2 5 10 15 20

Absorbncia 0,287 0,399 0,659 0,873 0,965 1,07

Concentrao (mg %) 10,82 18,24 35,46 49,63 55,72 62,67

CONCLUSO Pode-se concluir que o tempo em que o amido sofre aquecimento interferido no processo de hidrlise. Tal fato foi provado com os reagentes Lugol e DNS, qual quanto mais a colorao fique escura no primeiro h mais amido livre e quanto mais escuro no segundo, mais glucose tem; portanto houve mais amido livre quanto menor a temperatura para o Lugol e mais monossacardeo, glucose, quando a temperatura aumentava para o DNS. Esses resultados foram comprovados na hidrlise enzimtica, com amilase salivar, e com a cida, com cido clordrico concentrado; porm observou-se maior eficincia na cida por ser mais agressivo e tambm faz-lo em temperatura elevada.

Referncias A amilase. Disponivel em: . Acesso em 24 agosto. 2011. Amilase salivar. In Infopdia [Em linha]. Porto: Porto Editora, 2003-2011. [Consult. 2011-08-25]. Disponvel em: . Remio J. O. dos R. et al. Bioqumica Guia de Aulas Prticas. 1 Ed. Porto Alegre: Edipucrs.

Alunas:

GESSICA DE QUADROS FERREIRA _______________________________________________________________

JENNIFER LORENA FERREIRA _______________________________________________________________

JOSIANE APARECIDA SCHEMBERGER _______________________________________________________________

KAROLINE IANUXAUSKAS STRUMINSKI _______________________________________________________________

MARYANA ALBINO CLAVERO _______________________________________________________________

Organizadora: Karoline Ianuxauskas Struminski Data da prtica: 23/08/2011 30/08/2011