Relatório G5
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DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES CINÉTICAS DA
INVERTASE EM CÉLULAS LIVRES E IMOBILIZADAS EM
ALGINATO
Alunos:
Ana Miranda, nº25264
Ângela Marques, nº24141
Cláudia Lima, nº25267
28 Março 2014
Alunos:
MESTRADO EM BIOENGENHARIA
LABORATÓRIOS DE BIOPROCESSOS
MÓDULO 1
DOCENTE: LÍGIA RODRIGUES
Universidade do Minho
Escola de Engenharia
Trabalho prático 1
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
1
Índice
Sumário ............................................................................................................................. 2
Introdução ........................................................................................................................ 3
Cinética Enzimática ...................................................................................................... 4
Influência da temperatura e do pH na actividade enzimática ................................... 6
Imobilização de enzimas .............................................................................................. 8
Material e Métodos ........................................................................................................ 11
Resultados e Discussão ................................................................................................... 13
Conclusão........................................................................................................................ 21
Bibliografia ...................................................................................................................... 22
Anexos ............................................................................................................................ 23
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
2
Sumário
Diversas abordagens são usadas no estudo do mecanismo de acção de enzimas, mas a
abordagem principal é determinar a taxa da reacção enzimática.
Neste trabalho experimental o objectivo era estudar a cinética da enzima invertase da
Saccharomyces cerevisiae, livre e imobilizada em esferas de alginato de sódio, ou seja,
determinar o valor da velocidade máxima (máxima velocidade a que a enzima degrada
o substrato) e determinar o valor do Km que é uma medida da afinidade enzimática
para o substrato (essa afinidade é igual a 1/km). Se Km for elevado a afinidade é baixa.
A invertase é uma enzima que catalisa a degradação da sacarose em glucose e frutose
(Sacarose + H2O → Glucose + Frutose).
Inicialmente, recorreu-se ao método de DNS que, através de uma reta de calibração,
permite calcular a concentração de açúcar invertido e observar como esta afeta a
atividade enzimática. Obteve-se a absorvância e a concentração dos açúcares
redutores (tendo-se feito cinco ensaios), de seguida calculou-se a velocidade de reação
para cada concentração inicial de sacarose. Posteriormente colocaram-se estes
resultados num gráfico (velocidade de reação x concentração de sacarose), obtendo-se
uma curva de Michaelis-Menten. Esta curva é descrita pela equação que leva o mesmo
nome.
Este trabalho teve também como obejctivo verificar a existencia de limitações á
transferencia de massa interna e determinar os factores de eficiência, assim como a
difusividade da sacarose no gel de alginato. Por último averiguou-se o efeito do
diâmetro das esferas nos parametros cinéticos e nas limitações difusionais internas.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
3
Introdução
A Biotecnologia é atualmente considerada uma alternativa útil aos processos
tecnológicos convencionais nos campos analítico e industrial. Isto porque, ao contrário
da catálise química, os sistemas biológicos têm a vantagem de conseguir conversões
de químicos complexos sob condições ambientais moderadas com elevada
especificidade e eficiência. Sistemas biológicos ajudam a obter uma maior eficiência do
processo, um aumento da capacidade fabril e aumento da rentabilidade dos produtos.
Apesar destas vantagens, o uso de enzimas em aplicações industriais tem sido limitada
por diversos fatores, principalmente pelo seu custo elevado, estabilidade e
quantidades reduzidas disponíveis.
Com o desenvolvimento desta área, fortaleceu-se a ideia de que dentro dos seres
vivos, existem substâncias capazes de catalisar de modo muito específico
determinadas reacções químicas. Uma enzima é um catalisador biológico, que mesmo
em baixas concentrações aumenta a velocidade da reacção. As enzimas diminuem a
energia de activação sem afetarem o equilíbrio da reacção.
Alguns microrganismos são capazes de produzir diversas enzimas de interesse
industrial. Dentro desses microrganismos a levedura Saccharomyces cerevisiae,
popularmente conhecida como fermento de panificação, produz a enzima invertase. A
invertase (β-fructofuranosidade) é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose em
açúcar invertido invertido, isto é, numa mistura equimolar dos seus dois monómeros
constituintes: glicose e frutose (fig 1).
O seu substrato preferencial é a sacarose porém, também, pode hidrolisar ramonose e
estaquiose.
Figura 1 - Hidrolise da sacarose catalisada pela invertase. A glicose e a frutose
são açúcares redutores.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
4
A invertase está classificada na família GH32 de glicosídeos hidrolases, e encontra-se
presente nos animais, mas também em plantas superiores, fungos e bactérias.
Leveduras (Saccharomyces sp.) produzem diferentes tipos de invertases:
intracelulares, ligadas à parede, e, mais raramente, extracelulares. As enzimas ligadas à
parede apresentam uma grande fração glicídica através da qual acredita-se que se
liguem a mananas da parede celular. A temperatura ótima de atuação é 55 ˚C para
soluções diluídas de sacarose e de 65 ˚C a 70 ˚C para soluções com concentração
superior a 10%. Soluções acima de 20% de sacarose apresentam taxas decrescentes de
hidrólise em virtude da reduzida disponibilidade de água no meio reacional.
Tabela 1 - Algumas das propriedades das invertases da Saccharomyces cerevisiae .
Fonte: Brenda
Existem actualmente várias aplicações desta enzima, principalmente na indústria
alimentar, pois a frutose é mais doce que a sacarose (cerca de 40%) e não cristaliza tão
facilmente melhorando a textura de doces e gelados.
Cinética Enzimática
A cinética enzimática estuda a acção das enzimas, a sua actividade catalítica e seu
estudo é feito in vitro. Para esses estudos podem ser usados, como fonte de enzima,
preparações que a contenham em estado mais ou menos purificado, no entanto,
quanto mais purificada estiver a preparação enzimática mais fácil será o seu estudo
cinético.
Enzima Livre Enzima Imobilizada
Km [mM] 41.2 7.43
pH ótimo 4.6 4.6
Temperatura ˚C 45 65
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
5
K1
K2
K3
Foram Leonor Michaelis e Maud Menten, quem primeiro estudou estas relações,
apresentando em 1913 um estudo quantitativo das variações da velocidade de uma
reação de acordo com o aumento da concentração de substrato na mesma (Fig.2).
Figura 2 – Gráfico que relaciona a velocidade da reação coma a concentração de
substrato
Assim, através da equação:
Em que E é a enzima, S o substrato e E-S o complexo enzima-substrato.
Do estudo desta reacção surge a constante de Michaelis:
[[ ][ ]
[ ]]
Em que é uma constante de equilíbrio para a dissociação do complexo E-S, onde [E] é a
concentração de enzima livre, [S] a concentração de substrato e [E-S] a concentração
de enzima que se ligou ao substrato. Substituindo na expressão de
[ ] [ ] [ ]
,fica:
[ ] [ ] [ ]
[ ]
[ ][ ]
[ ] [ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
6
A velocidade da reacção é directamente proporcional à concentração de enzima
ligada, significava que v=k [E- S] e Vmáx= k [E0] (E0 é a concentração total de enzima
ligada ao substrato, e velocidade máxima corresponde a do momento em que todas as
enzimas estão ligadas ao substrato) e, portanto,
[ ]
[ ] , que substituindo na expressão de Km fica
[ ]
[ [ ]
Esta equação, denominada Equação de Michaelis Menten permite não só obter o valor
de Vmax como também de Km (valores estes compreendidos entre 10-8 M e 10-2 M).
Esta constante permite medir a afinidade da enzima para o substrato, que é igual a
1/Km, ou seja, se a afinidade for elevada Km é baixo, sendo necessária uma baixa
concentração de substrato para se atingir a velocidade máxima.
Mais uma vez, obtendo um gráfico que relacione a velocidade da reacção com a
concentração de substrato, deduz-se que:
, entao [ ]
Por outras palavras Km é igual à concentração de substrato para qual a velocidade é
igual a metade da velocidade máxima.
Influência da temperatura e do pH na actividade enzimática
A velocidade da reacção enzimática é condicionada por diversos factores, entre os
quais o pH e a temperatura do meio em que se dá a reacção.
O efeito da temperatura na velocidade das reações enzimáticas pode ser mutio
complexo, uma vez que a temperatura pode afetar vários parâmetros da reação, como
por exemplo a estabilidade da enzima, a velocidade da transformação do complexo ES,
a afinidade entre o substrato e a enzima, a ionização de grupos importantes na catálise
e a afinidade de ativadores e inibidores para a enzima.
A temperatura exerce dois efeitos antagónicos sobre um sistema enzimático, ou seja,
ao aumentarmos a temperatura aumentamos a constante de equilíbrio, e por
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
7
conseguinte a velocidade da reacção. No entanto, a partir de um determinado valor de
temperatura a proteína enzimática começa a desnaturar, diminuindo a sua actividade.
Verifica-se então que existe uma temperatura óptima para qual a reacção tem
velocidade máxima, e corresponde a um compromisso entre a temperatura que
favorece a reacção e a temperatura de desnaturação da enzima.
Figura 3 - Efeito da temperatura na actividade enzimática.
Por outro lado temos o pH do meio, o qual influencia directamente a reacção
enzimática. Assim, pH extremos (básicos ou ácidos) modificam irreversivelmente a
estrutura da enzima, desnaturando-a ou modificando a ligação entre apoenzima (parte
não proteica do enzima equivalente aos cofactores orgânicos) e coenzima (parte
proteica da enzima). O pH influencia também o estado de ionização do substrato e dos
aminoácidos do centro activo em geral.
Figura 4 - Efeito do pH na actividade enzimática.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
8
Imobilização de enzimas
A imobilização pode ser definida como o movimento não independente das células ou
enzimas na parte aquosa dos sistemas, por estarem alojadas dentro ou na superfície
de um agente imobilizador.
O uso de sistemas com células imobilizadas tem sido considerado como uma
alternativa viável para se aumentar a produtividade em razão das elevadas densidades
celulares normalmente obtidas.
As enzimas têm, intrinsecamente, excelentes propriedades, como: atividade,
seletividade e especificidade. Estas características permitem o desenho de processos
de síntese de produtos muito complexos em condições ecossustentadas. Mas, apesar
do elevado potencial de aplicação das enzimas, é necessário serem otimizadas, de
modo a cumprirem suas funções biológicas com eficácia e eficiência. A catálise de
reações em processos metabólicos complexos pode ser regulada em vários níveis e,
assim, algumas reações passam a ter as características para serem aplicadas em
processos industriais.
O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com
atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo, em comparação à
sua forma livre. Idealmente, a enzima imobilizada deverá exibir uma atividade
catalítica superior. Além disso, não deverão ocorrer alterações estruturais, bem como
modificações no centro ativo. A imobilização pode inibir ou aumentar a atividade e a
estabilidade da enzima, porém não existe uma regra que prediga a manutenção destes
parâmetros após o processo de imobilização.
Devido ao custo relativamente alto da invertase, o processo enzimático é mais caro do
que a hidrólise ácida. Para reduzir o custo do produto final, a aplicação de invertase
imobilizada tem sido considerada uma solução adequada. Esta enzima imobilizada tem
muitas vantagens, porque pode ser reutilizada várias vezes permanecendo ativa. Os
processos industriais convencionais envolvem a incubação da mistura desta enzima
assim como do seu substrato. Após a conclusão de cada conjunto de reações, o
produto formado é recuperado por desnaturação enzima. Neste processo ocorre a
perda dos centros ativos da enzima e enzima não pode ser reutilizada. A imobilização
protege a actividade da enzima de condições desfavoráveis, como pH, temperatura,
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
9
solventes orgânicos e/ou compostos inibidores presentes no meio de fermentação,
promove a separação e recuperação da enzima. A aplicação da invertase imobilizada
proporciona uma considerável redução nos custos operacionais.
Na seleção de um suporte para uma determinada aplicação, devem ser analisadas as
suas propriedades físicas e químicas.
Muitos estudos foram centrados sobre o suporte para a imobilização da invertase em
diferentes matrizes, como álcool polivinílico (Agkol et al . de 2001), poliacrilamida
(Abdellah et al , 1992; Mansour e Dawoud , 2003) , quitosano e dietilaminoetilcelulose
(Abdellah et al . , 1992) .
A imobilização pode ocorrer através da adsorção (física ou iónica) ou da ligação da
enzima a um material insolúvel, pelo uso de um reagente multifuncional através de
ligações cruzadas, confinamento em matrizes formadas por géis poliméricos ou
encapsulação através de uma membrana polimérica. A Figura 5 apresenta
esquematicamente a classificação dos métodos utilizados para imobilização das
enzimas.
Figura 5 - Classificação dos métodos de imobilização de enzimas. (Fonte:
VECCHIA et al., 2004).
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
10
A imobilização por meio de aprisionamento em matrizes porosas, como o alginato,
normalmente envolve a sintetização da matriz porosa em torno do biocatalizador a ser
utilizado. Os poros da matriz formada são menores que as células contidas no seu
interior. Este método tem sido extensivamente estudado para a imobilização de
células viáveis, devido à possibilidade de uso de polímeros hifrofílicos.
O alginato é um polissacarídeo linear extraído de cadeias de algas marinhas. Devido à
sua natureza hidrofílica, à sua não-toxicidade, alta estabilidade mecânica, elevada
porosidade de substracto e difusão de produtos, e sobretudo, à sua simplicidade de
requisitos processuais para a imobilização, o alginato tem a propriedade de tornar a
enzima mais estável.
Esta propriedade do alginato torna-o como um dos suportes mais utilizados na
imobilização da inertase.
Como principais desvantagens são citadas: o pequeno volume disponível para a
contenção das células imobilizadas, a perda de células para o meio de fermentação e a
instabilidade dos suportes normalmente utilizados, que limita a utilização dos
agregados por longos períodos.
Figura 6 – Encapsulamento da invertase em esferas de alginato
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
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Material e Métodos
Para conseguir determinar as constantes cinéticas da invertase em células livres,
inicialmente, foi preparada a suspensão de Saccharomyces cerevisiae. Para tal, foi
colocado num gobelé, 0,4 g de Saccharomyces cerevisiae dissolvido em 20 ml de
tampão acetato pH 4,5.
De seguida, foram preparadas cinco soluções de sacarose num tampão acetato de pH
4,5 contendo 1% de cloreto de cálcio, em cinco balões volumétricos de 50 ml,
contendo 10, 20, 50, 100 e 150 g/L. A cada uma destas, por ordem crescente de
concentração, procedeu-se à execução do ensaio. Para isso, foi colocada a solução no
reator, previamente termostatizado a 44,5°C. Retirou-se uma amostra de 0,1 ml
correspondente ao tempo inicial e colocou-se num eppendorf, adicionando-se de
imediato 0,1 ml de DNS. Mantendo o reator sob agitação, foram adicionados 0,5 ml de
suspensão de células, correspondendo ao início da contagem.
A partir deste momento, foi retirado 0,1 ml a cada minuto até perfazer 5 minutos.
Cada uma destas amostras pipetadas, foram colocadas em cinco eppendorfs diferentes
e acrescentou-se 0,1 ml de DNS. Procedeu-se à preparação de um branco com 0,1 ml
de tampão de acetato pH 4,5 e 0,1 ml de DNS. Estas sete amostras foram mergulhadas
num banho de água a 100 °C durante 5 minutos e de seguida arrefecidas em água à
temperatura ambiente. Foi acrescentado 1 ml de água destilada, a cada uma destas.
Por fim, foi pipetado, de cada uma, 0,2 ml em triplicado para a microplaca e, utilizando
540 nm, foi lida a absorvância.
Para a elaboração da curva de calibração, procedeu-se à preparação das soluções de
glucose em balões volumétricos de 100 ml com concentrações de 0,05, 0,1, 0,2, 0,4,
0,6, 0,8, 1, 2, 3, 4 e 5 g/L. A estas, foram retirados 0,1 ml para 11 eppendorfs diferentes
e adicionou-se 0,1 ml de reagente DNS. Ainda foi preparado um eppendorf com 0,1 ml
de água destilada e 0,1 ml do reagente, denominado branco. Estes, foram
mergulhados no banho de água a 100 °C durante 5 minutos, arrefecidos em água à
temperatura ambiente e adicionado 1 ml de água destilada. Retirou-se de cada um 0,2
ml para uma microplaca em triplicado e foi lida a absorvância a 540 nm. A partir destes
valores procedeu-se à elaboração da curva de calibração (Figura 1 dos anexos).
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
12
Para a elaboração do ensaio com células imobilizadas, preparou-se 100 ml de solução
de cloreto de cálcio a 2% (p/v) e uma matriz líquida com 1g de alginato de sódio e 45
ml de água destilada. Usando a placa de aquecimento com agitação, aqueceu-se a
matriz liquida, para dissolver o alginato e adicionou-se 2,5 ml de suspensão de células.
Utilizando uma seringa, adicionou-se gota a gota 100 ml da solução de cloreto de
cálcio mantendo-a durante 15 minutos na matriz, para completar a gelificação. Lavou-
se as esferas numa solução de tampão acetato pH 4,5 a 1% (p/v) e secou-se em papel
de filtro. Procedeu-se à pesagem de todas as esferas e dividiu-se em cinco porções
iguais, das quais também se procedeu à pesagem. Ainda foi determinado o diâmetro
médio das mesmas.
Foram preparadas cinco soluções de sacarose num tampão acetato de pH 4,5, em
cinco balões volumétricos de 50 ml, contendo 10, 20, 50, 100 e 150 g/L. A cada uma
destas, por ordem crescente de concentração, procedeu-se ao à execução do ensaio.
Para tal, foi colocada a solução no reator, previamente termostatizado a 43,5°C.
Retirou-se uma amostra de 0,1 ml correspondente ao tempo inicial e colocou-se num
eppendorf, adicionando de imediato 0,1 ml de DNS. Com o meio sob agitação
adicionou-se 0,5 ml de suspensão celular e uma porção de esferas, contendo a enzima
imobilizada. A partir deste momento, retirou-se 0,1 ml a cada 3 minutos até perfazer
um total de 15 minutos de reacção e colocou-se cada uma destas amostras em cinco
eppendorfs com 0,1 ml de DNS. Ainda foi preparada uma solução de branco com 0,1
ml de tampão de acetato pH 4,5 e 0,1 ml de DNS. Estas sete amostras foram
mergulhadas num banho de água a 100°C durante 5 minutos, arrefecidas em água à
temperatura ambiente e adicionado 1 ml de água destilada. Por fim, retirou-se 0,2 ml
de cada eppendorf em triplicado e colocou-se numa microplaca para ler a absorvância
a 540 nm.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
13
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
2,000
0 50 100 150 200 250 300 350
CO
NC
ENTR
AÇ
ÃO
DE
GLU
CO
SE (
G/L
)
TEMPO (S)
10 g/L 20 g/L 50 g/L 100 g/L 150 g/L
Resultados e Discussão
Os dados obtidos experimentalmente foram utilizados para a determinação dos
parâmetros a estudar e comparar neste estudo.
Foi construída uma reta de calibração para possibilitar o doseamento dos açucares
redutores na reação da invertase, pelo método de DNS. Através dos valores de
absorvância medidos, para cada ensaio em triplicado, foi calculada a concentração de
glucose, com recurso à equação da reta de calibração. Através de regressões lineares,
para as diferentes concentrações de substrato, com concentração de glucose em
função do tempo, obtiveram-se os valores de velocidade (V0) respetivos a cada ensaio.
Em anexo encontram-se as tabelas com os parâmetros calculados, assim como os
respectivos erros associados. A partir dos valores de V0 foi possível calcular os
parâmetros alvo deste estudo, utilizando a equação e ajuste não linear de Michaelis-
Menten.
- Comparação da concentração de glucose em função do tempo, nos diferentes
ensaios das duas vias catalíticas, livre e imobilizada:
As figuras seguintes (Fig 7 e Fig 8), representam graficamente a variação da
concentração de glucose em função do tempo, para cada ensaio em diferente
concentração de substrato.
Figura 7 - Representação gráfica da variação da concentração de glucose em
função do tempo, em enzima livre.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
14
-0,100
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 50 100 150 200 250 300 350
CO
NC
ENTR
AÇ
ÃO
DE
GLU
CO
SE (
G/L
)
TEMPO (S)
10 g/L 20 g/L 50 g/L 100 g/L 150 g/L
Figura 8 - Representação gráfica da variação da concentração de glucose em
função do tempo, em enzima imobilizada.
Verificou-se nos ensaios com a enzima livre uma variação irregular dos resultados uma
vez que ao longo de cada ensaio não há um aumento e estabilização da produção de
glucose. Estes valores reflectem todos os erros associados a pesagens, medições e
diluições. O facto de a reacção ter continuado por mais tempo nos ependorfs devido a
uma possível açao reduzida do reagente de DNS assim com a temperatura dos banhos
não estar no valor pretendido (100ºC), contribuiu também para o aumento deste erro.
Relativamente aos ensaios com a enzima imobilizada verifica-se também valores
bastante discrepantes, justificados pelos erros já referidos. No entanto é possível
perceber que à medida que se aumentou a concentração de substrato, de ensaio para
ensaio, há um aumento de produção de glucose. Apoiando desta forma a teoria
estudada.
Uma vez que os restantes parâmetros em estudo foram calculados com base nestes
dados, os erros associados às concentrações propagam-se para as constantes cinéticas.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
15
- Determinação e comparação das constantes cinéticas da invertase da S. cerevisiae
na sua forma livre e imobilizada
De acordo com os estudos realizados em torno da cinética enzimática, o aumento da
concentração de substrato leva a um aumento da velocidade da reação até atingir o
ponto de saturação. Isto é, quando a concentração do substrato é muito elevada todas
as moléculas da enzima estarão ligadas a moléculas de substrato, enzima saturada,
neste ponto a enzima funcionará no máximo da sua velocidade.
Os valores de velocidade máxima, de Km e de K2 encontram-se na tabela ?, para o
biocatalizador livre e imobilizado. Os gráficos utilizados para obtenção destes valores
encontram-se em anexo.
Biocatalizador livre Biocatalizador imobilizado
Vmáx (g/L.s) 0,0038 ± 0,0046 0,0020 ± 0,0011
Km (g/L) 10 ± 56,1771 20 ± 39,9942
K2 (s-1) 0,002 ± 0,0110 0,010 ± 0,0207
Segundo os resultados apresentados na tabela 2, verifica-se que o valor de velocidade
máxima da enzima imobilizada é inferior ao valor para a enzima livre. Esta diminuição
poderá estar relacionada com vários aspectos, tais como instabilidade do suporte que
leva a alterações no microambiente dentro do suporte, desprendimento de enzima do
suporte, ou mesmo perda de enzima no manuseamento das esferas de alginato,
resistência mecânica devido a ligações entre o alginato e o sódio, assim com a
diminuição da acessibilidade do substrato para o centro ativo da enzima imobilizada.
Do ponto de vista prático, Km fornece indicações sobre a eficiência com que a enzima
“trabalha” com dado substrato. Um Km pequeno indica que, para igual concentração
Tabela 2 - Constantes cinéticas para biocatalizador livre e imobilizado, com os
respectivos erros associados
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
16
de substrato, a enzima é capaz de catalisar a transformação desse substrato a maior
velocidade do que quando o Km é grande.
Quando comparados os Km entre a experiência com a enzima livre e imobilizada,
verifica-se um valor de Km superior para a enzima imobilizada. Esta variação explica-se
pelo facto de que quando a enzima se encontra imobilizada existem limitações à
transferência do substrato, assim o substrato apresenta maior “dificuldade” em chegar
ao centro ativo e desta forma o valor de Km aumenta.
Uma vez que a enzima e o substrato usado para as duas vias catalíticas são o mesmo
então, esta constante deveria manter-se. Contudo, devido às contrapartidas
adjacentes ao processo de imobilização (alteração do microambiente dentro do
suporte, limitações difusionais, etc.), o valor de Km aumenta o que significa que a
enzima atinge metade da velocidade máxima com concentrações maiores de
substrato, relativamente à enzima livre.
Verifica-se ainda que o erro associado aos valores de Km é bastante elevado,
revelando que os valores calculados podem variar entre um largo espectro. A
justificação para este elevado valor de erro está na propagação de erros ao longo de
todos os cálculos efectuados. O Km foi obtido através do ajuste não linear das
velocidades iniciais, ajuste esse que só por si tem um erro associado. Para além disso o
erro já se propaga desde os cálculos iniciais para obter essas velocidades, começando
nos erros associados à preparação e diluição das soluções utilizadas, depois à obtenção
da concentração por meio da equação da reta de calibração e ainda à obtenção das
velocidades por meio de regressões lineares.
O K2 corresponde à constante catalítica, revelando o “poder” catalítico da enzima em
estudo. Analisando os resultados obtidos para este parâmetro e comparando o
biocatalizador livre com imobilizado, verifica-se um aumento no biocatalizador
imobilizado. Este aumento reflecte o facto de a enzima, na forma imobilizada
apresentar maior estabilidade. Contudo esta estabilidade não se reflecte nas restantes
constantes pois estes ensaios foram realizados num curto espaço de tempo e não foi
possível simular as condições ideias a este processo.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
17
De um modo geral verifica-se que todos os valores estão afectados de erros e os
principais motivos para essas discrepâncias são:
a utilização da levedura proveniente de um fermento de padeiro, torna esta
rica em impurezas que terão interferido no seu desempenho, podendo ter
causado obstrução nos poros da matriz;
a impossibilidade de garantir que ao termostatizar a 45ºC a solução de sacarose
estivesse exactamente a 45ºC, visto que o sistema é partilhado por dois grupos
o que pode originar pequenas oscilações de temperatura, assim como a
impossibilidade de garantir que o banho de água estivesse a 100ºC;
o próprio facto de a agitação do reator não ser constante durante tempos
diferentes e entre ensaios pode influenciar o resultado;
a possível formação de agregados mais ou menos maiores na suspensão de
levedura, uma vez que a agitação antes de a colocar no reator não era
controlada nem uniforme ;
mau manuseamento do material em especial das pipetas. Podem surgir erros
ao pipetar e ao transferir para o recipiente;
o facto de ser impossível cumprir escrupulosamente com os tempos
estipulados no protocolo;
aproximações no tratamento dos resultados;
erros de leitura no espectrofotómetro;
o facto de terem sido desprezados vários pontos no traçado das rectas cujo
declive dá a velocidade. A escolha dos pontos pode não ter sido a mais
correcta. Como as velocidades foram utilizadas na determinação das
constantes cinéticas, ocorreu a propagação de erros.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
18
- Determinação da atividade específica da invertase para as duas formas
biocatalíticas em estudo
As enzimas possuem normalmente uma alta especificidade em relação às reações que
catalisam e aos substratos que estão envolvidos nessas reações. Como foi utilizada a
mesma enzima e o mesmo substrato nas duas vias catalíticas, estabeleceu-se no
seguinte gráfico a comparação da atividade específica entre a enzima livre e
imobilizada.
A actividade específica da invertase é maior quando usada na forma livre em relação à
imobilizada em esferas de alginato. Uma vez que a atividade específica é diretamente
proporcional à velocidade inicial, verifica-se que na enzima imobilizada, a velocidade é
menor, logo a sua actividade específica é também menor.
0,00E+00
5,00E-04
1,00E-03
1,50E-03
2,00E-03
2,50E-03
3,00E-03
3,50E-03
0 20 40 60 80 100 120 140 160
ATI
VID
AD
E ES
PEC
ÍFIC
A (
S-1
)
[S] (G/L)
enzima livre enzima imobilizada
Figura 9 - Representação gráfica da atividade específica da enzima livre e
imobilizada.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
19
- Determinação dos fatores de eficiência, da difusividade de sacarose no gel de
alginato e efeito do diametro das esferas nas limitações difusionais internas
Um dos problemas associados à transferencia de massa é a resistência do sustrato, ou
seja, o sustrato tem dificuldade em difundir-se na matriz de gel.
Ao mesmo tempo, existe uma resistencia difusional das moléculas do produto
formado, que por vezes pode acumular-se próximo do centro do gel, causando a
inibição da enzima por acumulação do produto.
Assim, idealmente, a rede da matriz deve ser espessa o suficiente para que a passagem
do substrato e produto para fora e dentro das esferas ocorra com o menor
impedimento possível.
Uma vez que o fator de eficiência estabelece uma comparação entre a velocidade da
enzima imobilizada relativamente à livre, não é possivel analisar com rigor este
parâmetro, visto que, existem vários erros associados à determinação das velocidades.
Teoricamente o fator de eficiência deve ser maior para maiores concentrações de
substrato. Apesar da variação dos valores obtidos, de um mode geral, observa-se um
aumento significativo do fator de eficiencia entre o primeiro ensaio, 10 g/L, e o último,
150 g/L.
Relativamente à difusividade efetiva, constatou-se um aumento deste parâmetro,
justificado pelo aumento da concentração de substrato do meio. Todavia, registaram-
10 g/L 20 g/L 50 g/L 100 g/L 150 g/L
Fator de
eficiência
Ƞ
0,550 ± 0,559
0,241 ± 0,211
0,500 ± 0,509
0,438 ± 0,297
0,810 ± 0,548
Difusividade
efetiva
Def (cm2/s)
4,75E-08 ± 8,95E-08
2,11E-08 ± 3,98E-08
1,90E-07 ± 3,58E-07
1,22E-07 ± 2,29E-07
7,60E-07 ± 1,43E-06
Tabela 3 - Fator de eficiência e difusividade da sacarose e m alginato, para cada ensaio a
diferentes concentrações de sacarose
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
20
se valores um pouco discordantes deste aumento associados mais uma vez aos erros já
anteriormente mencionados.
A difusividade efetiva do substrato depende da porosidade interna do suporte e da
tortuosidade. Portanto, o aumento do diâmetro das esferas causa um aumento da
tortuosidade, que por sua vez leva à diminuição da difusividade efetiva do substrato.
O diâmetro das esferas utilizado nesta experiência era significativamente elevado
(≈5mm). Isto explica os baixos valores obtidos para a difusividade.
Em simultâneo, foi realizada a mesma experiência com diferentes diametros de
esferas. De um modo geral, os resultados obtidos para a difusividade efetiva nessas
experiências, apoiam as afirmaçoes anteriores, isto é, para diâmetros inferiores a 5mm
a difusividade efetiva apresenta valores superiores.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
21
Conclusão
Após a discusão dos resultados obtidos, averigou-se que: o fermento de padeiro
uitilizado para este experimento, continha enzima com baixa atividade catalítica, o que
influenciou à partida todos os resultados; A imobilização tem efeito significativo nas
constantes cinéticas da enzima, Vmáx, Km e K2; O fator de eficiência aumenta quando
a velocidade da enzima imobilizada aumenta em relação à livre, que por sua vez
aumenta com um aumento do substrato; As limitações à transferência de massa
interna dependem da difusividade do substrato na matriz, podendo ser compensadas
pelo o aumento da concentração de substrato no meio; O diâmetro das esferas de
alginato está diretamente relacionado com a difusividade efetiva do substrato na
matriz.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
22
Bibliografia
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[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
23
Anexos
- Figura 1
y = 0,2623x + 0,0092 R² = 0,9966
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
0 1 2 3 4 5 6
Ab
sorv
ânci
as
54
0n
m
Concentração de glucose (g/L)
erro associado à reta de calibração ± 0,0138
Figura 1 – representação gráfica da reta de calibração dos açucares redutores.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
24
concentração de substrato (g/L) 10 ± 0,1206 20 ± 0,1224 50 ± 0,6353 100 ± 0,7310 150 ± 0,6264
0,089 0,082 0,084 0,085 0,072
0,092 0,083 0,083 0,084 0,072
0,094 0,08 0,081 0,088 0,073
media abs - branco 0,036 0,026 0,027 0,030 0,016
desvio padrão 0,003 0,002 0,002 0,002 0,001
fator diluição s. d. s.d s.d s.d s.d
0,036 0,026 0,027 0,030 0,016
concentração de glucose (g/L) 0,101 0,063 0,067 0,078 0,027
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,11 0,12 0,105 0,097 0,091
0,107 0,12 0,095 0,098 0,091
0,11 0,114 0,094 0,101 0,093
media abs - branco 0,053 0,062 0,042 0,043 0,036
desvio padrão 0,002 0,003 0,006 0,002 0,001
fator diluição s. d. s.d s.d s.d s.d
0,053 0,062 0,042 0,043 0,036
concentração de glucose (g/L) 0,167 0,201 0,125 0,128 0,101
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,134 0,121 0,114 0,125 0,11
0,11 0,122 0,117 0,125 0,104
0,118 0,12 0,118 0,124 0,104
media abs - branco 0,065 0,065 0,060 0,069 0,050
desvio padrão 0,012 0,001 0,002 0,001 0,003
fator diluição s.d s.d s.d 1/2 1/2
0,065 0,065 0,060 0,137 0,100
concentração de glucose (g/L) 0,211 0,213 0,195 0,488 0,346
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,108 0,105 0,123 0,127 0,111
0,11 0,107 0,128 0,126 0,113
0,112 0,113 0,125 0,126 0,113
media abs - branco 0,054 0,052 0,069 0,070 0,056
desvio padrão 0,002 0,004 0,003 0,001 0,001
fator diluição 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2
0,108 0,105 0,139 0,141 0,113
concentração de glucose (g/L) 0,377 0,364 0,494 0,501 0,394
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,128 0,102 0,087 0,15 0,084
0,126 0,258 0,086 0,147 0,082
0,127 0,254 0,087 0,146 0,078
media abs - branco 0,071 0,149 0,031 0,092 0,025
desvio padrão 0,001 0,089 0,001 0,002 0,003
fator diluição 1/2 1/2 1/5 1/5 1/5
0,142 0,297 0,153 0,458 0,127
concentração de glucose (g/L) 0,506 1,098 0,549 1,712 0,448
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,127 0,1 0,098 0,113 0,091
0,107 0,102 0,099 0,111 0,093
0,115 0,27 0,098 0,112 0,094
media abs - branco 0,060 0,101 0,042 0,056 0,037
desvio padrão 0,010 0,098 0,001 0,001 0,002
fator diluição 1/5 1/5 1/10 1/5 1/5
0,302 0,507 0,423 0,280 0,183
concentração de glucose (g/L) 1,115 1,897 1,579 1,032 0,664
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
T
E
M
P
O
3
T
E
M
P
O
4
T
E
M
P
O
5
T
E
M
P
O
0
T
E
M
P
O
1
T
E
M
P
O
2
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
Tabela 1 – valores de absorvância obtidos e valores de concentração de glucose
calculados para os diferentes ensaios, com as crescentes concent rações de sacarose,
em enzima livre
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
25
conc substrato (g/l) 10 20 50 100 150
0,117 0,086 0,097 0,101 0,084
0,129 0,086 0,093 0,103 0,087
0,135 0,086 0,091 0,104 0,086
media abs - branco 0,045 0,004 0,012 0,021 0,004
desvio padrão 0,009 0,000 0,003 0,002 0,002
concentração de glucose (g/L) 0,136 -0,020 0,009 0,044 -0,021
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,087 0,080 0,102 0,113 0,128
0,094 0,080 0,104 0,113 0,121
0,095 0,080 0,095 0,114 0,126
media abs - branco 0,010 -0,002 0,018 0,031 0,043
desvio padrão 0,004 0,000 0,005 0,001 0,004
concentração de glucose (g/L) 0,003 -0,043 0,035 0,084 0,129
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,084 0,114 0,12 0,112 0,131
0,086 0,117 0,125 0,111 0,134
0,085 0,116 0,122 0,115 0,133
media abs - branco 0,003 0,034 0,040 0,031 0,051
desvio padrão 0,001 0,002 0,003 0,002 0,002
concentração de glucose (g/L) -0,024 0,093 0,119 0,082 0,158
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,093 0,107 0,139 0,15 0,164
0,093 0,109 0,138 0,158 0,167
0,094 0,107 0,149 0,156 0,163
media abs - branco 0,011 0,026 0,060 0,073 0,083
desvio padrão 0,001 0,001 0,006 0,004 0,002
concentração de glucose (g/L) 0,008 0,063 0,194 0,242 0,280
0,125 0,148 0,149 0,167 0,172
0,124 0,147 0,148 0,168 0,171
0,121 0,148 0,147 0,165 0,171
media abs - branco 0,041 0,066 0,066 0,085 0,089
desvio padrão 0,002 0,001 0,001 0,002 0,001
concentração de glucose (g/L) 0,123 0,215 0,217 0,288 0,306
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,132 0,175 0,189 0,228 0,222
0,133 0,174 0,189 0,221 0,228
0,129 0,176 0,192 0,221 0,224
media abs - branco 0,049 0,093 0,108 0,141 0,143
desvio padrão 0,002 0,001 0,002 0,004 0,003
concentração de glucose (g/L) 0,153 0,319 0,377 0,504 0,509
erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
T
E
M
P
O
0
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
T
E
M
P
O
1
T
E
M
P
O
2
T
E
M
P
O
3
T
E
M
P
O
4
T
E
M
P
O
5
Tabela 2 – valores de absorvância obtidos e valores de concentração de glucose
calculados para os diferentes ensaios, com as crescentes concentrações de sacarose ,
em enzima imobilizada
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
26
- Figura 2
A
B
C
D
y = 0,002x + 0,0196 R² = 0,9585
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 100 200 300 400
con
cen
traç
ão d
e g
luco
se (
g/L)
tempo (s)
10 g/l y = 0,0058x - 0,0573
R² = 0,9435
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
0 100 200 300 400
con
cen
traç
ão d
e g
luco
se (
g/L)
tempo (s)
20 g/l
y = 0,0026x - 0,0522 R² = 0,9171
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 100 200 300 400
con
cen
traç
ão d
e g
luco
se (
g/L)
tempo (s)
50 g/l
y = 0,0032x + 0,019 R² = 0,95
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 100 200 300 400
con
cen
traç
ão d
e g
luco
se (
g/L)
tempo (s)
100 g/l
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
27
E
Tabela 3: valores de V0, com respectivos erros associados, relativos a cada concentração de substrato, para a enzima na forma livre
[S] (g/L) V0 (g/L.s) variância
10 0,0020 ± 0,0013
20 0,0058 ± 0,0043
50 0,0026 ± 0,0024
100 0,0032 ± 0,0014
150 0,0021 ± 0,0006
- Figura 3
A
B
y = 0,0021x + 0,0025 R² = 0,9784
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 100 200 300 400
con
cen
traç
ão d
e g
luco
se (
g/L)
tempo (s)
150 g/l
y = 0,0011x - 0,1605 R² = 0,9374
-0,2
-0,15
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0 100 200 300 400
con
cen
traç
ão d
e g
luco
se (
g/L)
tempo (s)
10 g/L
y = 0,0014x - 0,1076 R² = 0,9775
-0,150
-0,100
-0,050
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 100 200 300 400
con
cen
traç
ão d
e g
luco
se (
g/L)
tempo (s)
20 g/L
Figura 2 – representação gráfica das retas de calibração das concentrações de glucose em
função do tempo, para cada ensaio a diferentes concentrações de sacarose (A, B, C, D e E),
para a enzima na forma livre.
[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]
28
C
D
E
Tabela 4: valores de V0, com respectivos erros associados, relativos a cada concentração de substrato, para a enzima na forma imobilizada
[S] (g/L) V0 (g/L.s) variância
10 0,0011 ± 0,0009
20 0,0014 ± 0,0006
50 0,0013 ± 0,0006
100 0,0014 ± 0,0007
150 0,0017 ± 0,0011
y = 0,0013x - 0,0189 R² = 0,9796
-0,050
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0 100 200 300 400
con
cen
traç
ão d
e g
luco
se (
g/L)
tempo (s)
50 g/L
y = 0,0014x + 0,0116 R² = 0,9227
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 100 200 300 400
con
cen
traç
ão d
e g
luco
se (
g/L)
tempo (s)
100 g/L
y = 0,0017x - 0,0134 R² = 0,9806
-0,100
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 100 200 300 400
con
cen
traç
ão d
e g
luco
se (
g/L)
tempo (s)
150 g/L
Figura 3 – representação gráfica das retas de calibração das concentrações de glucose em
função do tempo, para cada ensaio a diferentes concentrações de sacarose (A, B, C, D e E),
para a enzima na forma imobilizada.