UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA

ENGENHARIA AGRONÔMICA

RELATÓRIO

PREPARO DE MEIO DE CULTURA E ISOLAMENTO DE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS

DISCIPLINA: FITOPATOLOGIA

MINISTRANTE: Prof. JOSÉ EVANDO AGUIAR BESERRA Jr.

BRUNO ARCANJO SILVA

TERESINA, JULHO/2014.

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------------------------------3

OBJETIVO DA PRÁTICA ------------------------------------------------------------------------------------5

METODOLOGIA------------------------------------------------------------------------------------------------5

RESULTADOS E DISCUSSÃO -----------------------------------------------------------------------------7

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS-----------------------------------------------------------------------8

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Introdução

Em todo o mundo, os fungos são os fitopatógenos mais importantes, pois eles causam a

maioria das doenças de plantas que prejudicam a agricultura. Fungos fitopatogênicos, são

responsáveis por perdas consideráveis em culturas economicamente importantes, além de estar

associados à indução do apodrecimento de frutas e verduras pós-colheita, diminuindo o conteúdo

nutricional e aproveitamento destes alimentos.

Os fungos fitopatogênicos são identificados, em sua maioria, pelos sintomas que

provocam e pelos sinais presentes no hospedeiro, que são facilmente observados em campo, tais

como manchas foliares, podridões, ramos secos, exsudações, entre outros. Os fungos causam

sintomas locais ou genéricos em seus hospedeiros e tais sintomas podem ocorrer

separadamente, ou em sequência. Em geral, os fungos causam necrose de tecidos da planta e

frequentemente causam a redução do crescimento (nanismo)de órgãos ou da planta inteira.

O isolamento de fungos fitopatogênicos consiste na sua obtenção em cultura pura a partir

de tecidos doentes do hospedeiro, solo ou de qualquer outro substrato. A obtenção do patógeno

em cultura pura é essencial em estudos de morfologia, taxonomia, reprodução e fisiologia,

bem como em testes de patogenicidade, resistência genética de plantas e sensibilidade a

fungicidas.

A obtenção de um organismo em cultura pura não significa que ele seja o agente causal da

doença. Para provar que um dado organismo é o agente capaz de causar uma doença, é essencial

seguir rigorosamente as seguintes regras do Postulado de Koch: associação constante do

organismo com a doença; isolamento do organismo em cultura pura; inoculação da cultura

isolada em plantas sadias, reprodução dos sintomas e sinais típicos da doença e por fim,

reisolamento do mesmo organismo inoculado.

Diferentes técnicas de isolamento são usadas conforme a natureza do órgão doente, o

substrato e o estádio de desenvolvimento do patógeno (vegetativo ou reprodutivo), bem

como a critério do operador. Todavia, os métodos básicos de isolamento são o direto e o

indireto.

O isolamento direto consiste na transferência, com o auxílio de um estilete, de

estruturas do patógeno (esporos, hifas, rizomorfos, ou escleródios) diretamente do órgão infectado

ou de outro substrato para o meio de cultura. O isolamento direto tem diversas vantagens, pois, por

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meio, deste pode-se obter o organismo puro, isento de contaminações de microrganismos

saprófitas associados ao tecido infectado, sendo possível saber exatamente qual organismo

está sendo transferido para o meio e podem-se estabelecer comparações entre as estruturas

do organismo formadas na superfície do hospedeiro e em cultura.

A técnica de isolamento indireto consiste na transferência, para o meio de cultura, de

porções infectadas de tecido do hospedeiro ou amostras de solo e sementes infestadas. Os métodos

de isolamento indireto variam com o tipo de órgão ou tecido infectado (órgãos lenhosos ou

carnosos, não-lenhosos ou não-carnosos) ou substrato de onde o organismo é recuperado.

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Objetivo

Realizar o preparo de meio de cultura, este sendo o BDA.

Armazenar corretamente o meio de cultura.

Distribuir o meio de cultura em placas de petri para o isolamento indireto do fungo

Colletotrichum gloeosporioides, causador da Antracnose do cajueiro, a partir de folha de

caju infectada.

Metodologia

Autoclave Erlemeyer com BDA

Pesou-se o meio de cultura (20g) e em seguida, transferiu-se o mesmo para um Erlemeyer de

500 ml. Adicionou-se 250 ml de água destilada e fechou-se a boca do frasco com tampão (chumaço

de algodão + papel alumínio). Autoclavou-se a 121°C por 20 minutos. Após decorridos os 20

minutos, esperou-se a temperatura baixar, retirou-se os frascos e armazenou-se os mesmo.

Para o isolamento do fungo, transferiu-se o meio de cultura para placas de petri, pegou-se

folhas de cajueiro com antracnose, lavou-se as folhas bem com água e sabão para eliminar

patógenos indesejáveis na superfície foliar, lavou-se bem as mãos e antes de começar o isolamento,

esterilizaram-se as mãos com álcool, dentro de uma Capela de fluxo laminar, para evitar

contaminação do ambiente, foram retirados três fragmentos da folha de cajueiro com antracnose,

com o auxilio de uma lâmina esterilizada através de uma chama, sendo que estes fragmentos são

retirados de locais bem próximos à infecção, pois se for retirado do local infectado, a chance de

isolar o fungo desejado é muito pouca, pois lá se encontram outros fungos, sendo estes saprófitas,

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com o auxilio de uma pinça, também esterilizada através da chama, colocou-se os três fragmentos

em solução de etanol 70% durante 1 minuto, retirou-se as mesmas do etanol e colocou-as em

solução de hipoclorito de sódio 1% durante 1 minuto, logo após colocou-se os fragmentos

mergulhados em água esterilizada durante 1 minuto, esterilizou-se novamente a pinça para poder

retirar um pedaço de papel filtro estéril do local onde se encontrava armazenado, feito isso, retirou-

se os fragmentos da água e colocou-se os mesmo em cima do papel filtro para retirada do excesso

de água. Feito isso, pegou-se a placa de petri com meio de cultura, e plaqueou-se os fragmentos.

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Resultados e Discussão

Fungo crescendo em meio de cultura. Lâmina preparada para observação de esporos e identificação do fungo.

Decorridos nove dias desde o cultivo do material em meio de cultura, era notável o

crescimento de um fungo, assim sendo, foram retiradas amostras desse fungo para, análise me

microscópio, para identificação do mesmo, através do tipo de esporo. A lâmina foi preparada com,

material do fungo que cresceu no meio de cultura, e para corar, utilizou-se o corante azul de aman,

levou-se a lâmina ao microscópio, e observou-se amostra.

Esporos de Colletotrichum gloeosporioides. Esporos observados da amostra do fungo que cresceu em meio de cultura.

Após observar a lâmina, e comparar os esporos visualizados com os esporos de

Colletotrichum gloeosporioides, chegou-se a conclusão que eram os mesmo esporos, portanto, o

fungo isolado em meio de cultura era o Colletotrichum gloeosporioides.

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Referências Bibliográficas

SILVA, Luciana Ferreira da. CAPACIDADE DE DETERIORAÇÃO DE CEPAS DE

Eucalyptus spp. POR FUNGOS XILÓFAGOS. 2011. 77 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de

Ciências Florestais, Universidade Federal do Espírito Santo, JerÔnimo Monteiro - Es, 2011.

EMBRAPA. Antracnose. Disponível em:

<http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Caju/CultivodoCajueiro/

doencas.htm>. Acesso em: 30 jul. 2014.

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