Relatório Final de Estágio - Arthur Lima 2-1

Instituto Federal do Rio de Janeiro

Campus Rio de Janeiro

Relatório Técnico de Estágio

Nome: Arthur Lima e Silva

Curso: Biotecnologia

Conclusão do curso: 2011/ 2 (semestre)

Data do Seminário: 2012 /1 (semestre)

Rio de Janeiro2012

Valorização de resíduos obtidos na produção de biocombustíveis pela produção fúngica de complexos multienzimáticos

Empresa/Instituição: Fundação COPPETEC

Endereço: Rua Moniz Aragão

no: 360 complemento: Bloco 1

Bairro: Ilha do fundão / Cidade Universitária Cidade: Rio de Janeiro

CEP: 21941- 972 UF: RJ

Setor (es) da empresa/instituição:

Laboratório de Biotecnologia Microbiana – LaBiM

Responsável da Empresa/Instituição pelo Estágio: Denise Maria Guimarães Freire

Cargo: Professor pesquisador

Professor Orientador no IFRJ: Leila Pontes

Matrícula: 1152476

ii

Sumário

I. Introdução --------------------------------------------------- p.1

II. Objetivo ------------------------------------------------------ p.3

III. Material e Métodos -------------------------------------p.3

IV. Resultados -------------------------------------------------- p.9

IV. Discussão --------------------------------------------------- p.24

VI. Considerações Finais ------------------------------------ p.25

VII. Bibliografia --------------------------------------------------p.25

iii

1. Introdução

O uso do biodiesel como combustível vem se tornando uma alternativa cada vez mais

atraente devido seus benefícios ambientais e pelo fato de ser originado de recursos

renováveis. O custo do biodiesel é a principal dificuldade da comercialização do produto. Óleos

das mais diversas procedências são utilizados como matérias-primas. A transesterificação é o

processo realizado com mais frequência para a produção de biodiesel. Consiste em uma

reação química entre óleos vegetais, tais como o de mamona, dendê, girassol, babaçu,

amendoim, pinhão manso e soja, bem como gorduras animais, com etanol ou metanol. Durante

a obtenção dos óleos vegetais, são obtidos co-produtos, como tortas e farelos, que podem

agregar valor à cadeia de produção do biocombustível.

Na tentativa da valorização de co-produtos, inocula-se esporos de fungos filamentosos

em diversas tortas de oleaginosas, promovendo assim fermentações em estado sólido (FES).

Enzimas degradadoras de matéria-prima podem então ser produzidas. Os microorganismos

são os mais importantes produtores enzimáticos. Os fungos filamentosos Aspergillus são

organismos de importância considerável para muitas indústrias biotecnológicas. Muitas

espécies de Aspergillus, tais como A. awamori e A. oryzae são utilizadas para a produção

enzimática. Essas espécies produzem grande variedade de enzimas extracelulares, nas quais,

amilases e proteases possuem grande importância industrial.

iv

Os fungos A. awamori IOC-3914 e A oryzae 30103 são capazes de produzir um

complexo multienzimático contendo pelo menos cinco diferentes grupos de enzimas: endo- e

exoamilases, proteases, xilanases e celulases, usando torta de babaçu, farelo de soja, torta de

mamona, dentre outros substratos. O complexo amilolítico representa um dos mais importantes

grupos de enzimas industriais atualmente. Ele atua na hidrólise de resíduos e apresenta

inúmeras aplicações na indústria alimentícia, têxtil, de bioetanol, dentre outras. Esse complexo

é composto por um grupo de enzimas que atuam sinergicamente na quebra de amilose

(unidades de glicose unidas linearmente)e amilopectina (homopolímero de glicose com

ligações lineares e ramificações) em glicose.

Trabalhos mais recentes têm mostrado que tortas residuais obtidas na extração de

óleos vegetais são excelentes substratos para a produção de complexos multienzimáticos por

fermentações no estado sólido. Além disso, essas tortas residuais podem ser hidrolisadas pelo

complexo amilolítico, liberando glicose, e pelas hidrolases acessórias, incluindo celulases,

xilanases e proteases.

Tendo em vista os interesses econômicos e ambientais, a produção enzimática

utilizando resíduos agroindustriais apresenta muitas vantagens sobre as demais matérias-

primas. No Brasil, uma matéria-prima residual abundante é a torta de babaçu., que é originada

no processo de obtenção do óleo de babaçu para a indústria de biocombustíveis.

v

2. Objetivos

Reaproveitar resíduos vegetais obtidos na cadeia de produção do biodiesel utilizando-

os como matérias-primas para fermentações no estado sólido com fungos do gênero

Aspergillus. Dessas fermentações, obtém-se um extrato multienzimático que pode ser utilizado

para hidrolisar, em baixas temperaturas, as mesmas matérias-primas e originar

monossacarídeos e aminoácidos fundamentais para a produção de meios de cultura, síntese

de etanol, biopolímeros, dentre outros. Esse trabalho visa também a investigação do potencial

fúngico de produção de amilases e outras hidrolases em fermentações no estado sólido de

baixos custos utilizando diferentes resíduos agroindustriais gerados no Brasil.

3. Material e Métodos

3.1 Resíduos utilizados (Provenientes da Petrobras Biocombustíveis)

- Torta de babaçu

- Farinha de babaçu

- Casca de soja

- Farelo de soja

Os resíduos foram moídos, peneirados, pesados em becher de 50 mL (2,5g) e

autoclavados, originando biorreatores em escala laboratorial (bécher + resíduo)

- Moinho

- Peneira. Marca: Granutest/Tyler 14

- Balança analítica. Marca: Gahaka BK 2000

- Autoclave. Marca: Tripoli

3.2 Preparo do pré-inóculo

- Água estéril

- Placa de Petri com Aspergillus awamori IOC-3914 e Aspergillus oryzae 30103 mantidos em

ágar Batata-Dextrose (PDA) a 30ºC por 7 dias

- Pipeta automática P1000. Marca: LabMate

- Fluxo laminar Vertical. Marca: Quimis 216F21R

vi

- Tubos Falcon

- Vortex. Marca: Biomatic 00/09/03

- Câmara de Neubauer. Marca: Bolco germany/ Bright line

- Microscópio óptico. Marca: Zeiss Axioskop 40

- Meio malte 35g/L. Marca: Himedia RM004B-500G

- Shaker. Marca: New Brunswick Scientific/ Innova 42R

- Tubo tipo eppendorf

Sob condições estéreis, em fluxo laminar, pipetou-se 4 mL de água estéril sobre o

fungo crescido em placa de Petri. Com o tip da pipeta, raspou-se o fungo do ágar. Esse

procedimento foi repetido quatro vezes. Após a raspagem, recolheu-se o líquido em tubo

falcon e em tubo eppendorf. Armazenou-se o tubo falcon em geladeira. Sob condições não-

estéreis, dilui-se o conteúdo do tubo eppendorf e realizou-se a contagem de esporos em

câmara de Neubauer. A contagem foi efetuada em relação a cinco quadrantes da câmara

superior e cinco quadrantes da câmara inferior. Multiplicou-se a média da contagem dos dez

quadrantes por 25, pela diluição realizada e por 104, encontrando-se número de células por

mL contidos na solução. Em seguida, dividiu-se a quantidade inicial de células por mL

desejada (2,25x107) pela encontrada, obtendo-se o volume a inocular, em µL. Inoculou-se o

volume calculado em meio malte 35 g/L, que foi incubado em shaker por 28 horas a

30ºC/200rpm (pré-inóculo).

3.3 Inóculo

-Fluxo laminar Vertical . Marca: Quimis 216F21R

- Pipeta automática P10.000. Marca: LabMate

- Câmara climática. Marca: Nova Ética 420/CLD-300

Para obter-se uma umidade final de 62%, pipetou-se 4,1mL do pré-inóculo nos

biorreatores em escala laboratorial, sob condições estéreis, homogeneizou-se o sistema e

incubou-se os mesmos em câmara climática a 30ºC e 90% de umidade. Para obter-se uma

umidade final de 57%, pipetou-se 3,3mL do pré-inóculo nos biorreatores em escala

laboratorial, sob condições estéreis, homogeneizou-se o sistema e incubou-se os mesmos

em câmara climática a 30ºC e 90% de umidade. Para cada análise, utilizou-se dois

biorreatores em escala laboratorial no intuito de tornar os resultados mais confiáveis.

vii

3.4 Extração

- Água destilada

- Erlenmeyer 250 mL

- Bastão de vidro

- Centrífuga. Marca: Jouan A14N1.11174614

- Shaker. Marca: New Brunswick Scientific/ Innova 42R

- Pipeta automática P1000. Marca: LabMate

- Tubo tipo eppendorf

Transferiu-se o conteúdo fermentado do biorreator em escala laboratorial para um

erlenmeyer de 250 mL juntamente com 25 mL de água destilada (10 mL de água por grama

de matéria-prima). Masserou-se o conteúdo com bastão de vidro e incubou-se o erlenmeyer

em shaker por 30 minutos a 37ºC/200rpm. Posteriormente, pipetou-se 3,0 mL do conteúdo

do erlenmeyer para dois tubos eppendorf. Centrifugou-se os tubos por 10 minutos/10.000

rpm. Recolheu-se os sobrenadantes em um terceiro tubo. Rotulou-se e armazenou-se em

geladeira para serem dosadas as atividades enzimáticas.

3.5 Análises

3.5.1 Teor de água

- Equipamento: AquaLab – Series 3TE

- Recipientes plásticos circulares

- Água destilada

- Balança analítica. Marca: Gahaka BK 2000

Introduziu-se, no equipamento, um recipiente plástico circular contendo apenas água

destilada com a finalidade de calibrar o mesmo. Posteriormente, pesou-se 0,5 grama do

conteúdo fermentado do biorreator em escala laboratorial em recipiente plástico circular ,

antes do procedimento de extração, e introduziu-se o mesmo no equipamento. Após o

tempo necessário, é informado no visor o teor de água do material.

viii

3.5.2 pH

- pHâmetro . Marca: Mettler Toledo – Seven Easy

Após o procedimento de extração, introduziu-se no erlenmeyer o eletrodo do

pHâmetro. Após o tempo necessário, é informado no visor do equipamento o pH do material.

3.5.3 Atividade Exoamilolítica

- Banho 40ºC. Marca: Kacil BM-02

- Banho 100ºC . Marca: Novatecnica NT248

- Espectrofotômetro. Marca: Biospectro SP-22

- Cubetas de poliestireno

- Pipetas p20,100,1.000. Marca: Eppendorf

- Tips para pipeta

- Presilhas para eppendorf. Marca: Sigma – Aldrich

- Solução de amido 1%. Marca: Vetec

- Reativo de GOD-POD. Marca: Katal

Em uma estante, colocou-se 4 eppendorfs para cada amostra, sendo 1 branco e 3

réplicas. Adicionou-se 10µL da amostra em todos os eppendorfs. Posteriormente, adicionou-se

90 µL da solução de amido 1,0% somente nas triplicatas em seguida levou-se ao banho-maria

à 40ºC por 15 minutos. Em seguida, inativou-se as enzimas levando-as ao banho-maria à

100ºC durante 5 minutos (usou-se presilhas nas tampas dos eppendorfs para eles não abrirem

durante a incubação). Ao retirar deste banho-maria, adicionou-se 90µL de solução de amido

1%, apenas nos brancos de cada tempo e adicionou-se 1mL do reativo de GOD-POD em todos

eppendorfs. Feito isto, levou-se ao banho de 40ºC por 10 minutos para que o reativo

enzimático possa interagir com a reação para então fazer a leitura. A leitura foi feita em cubeta

de poliestireno a 505 nanômetros (nm) no espectrofotômetro.

ix

3.5.4 Atividade Celulolítica






- Tips para pipeta


- Solução de carboxi-metil celulose (CMC). Marca: Sigma

- Reativo de GOD-POD. Marca: Katal


réplicas. Adicionou-se 10µL da amostra em todos os eppendorfs. Posteriormente, adicionou-se

90 µL da solução de CMC somente nas triplicatas em seguida levou-se ao banho-maria à 40ºC

por 10 minutos. Em seguida, inativou-se as enzimas levando-as ao banho-maria à 100ºC

durante 5 minutos (usou-se presilhas nas tampas dos eppendorfs para eles não abrirem

durante a incubação). Ao retirar deste banho-maria, adicionou-se 90µL de solução de CMC,

apenas nos brancos de cada tempo e adicionou-se 1mL do reativo de GOD-POD em todos

eppendorfs. Feito isto, levou-se ao banho de 40ºC por 10 minutos para que o reativo

enzimático possa interagir com a reação para então fazer a leitura. A leitura foi feita em cubeta

de poliestireno a 505 nanômetros (nm) no espectrofotômetro.

3.5.5 Atividade Proteolítica




- Pipetas p100,1.000. Marca: Eppendorf

- Tips para pipeta

- Solução de azocaseína 5g/L pH=5,0

- Solução de HCl 1M

x


réplicas. Adicionou-se 50µL da amostra em todos os eppendorfs. Para os brancos das

amostras, adicionou-se 1mL da solução de HCL 1M. Em seguida, levou-se ao banho-maria à

40ºC, adicionou-se 90µL da solução de azocaseína em cada tubo e incubou-se até completar

5 minutos de reação. Em seguida, inativou-se as enzimas adicionando 1mL da solução de

HCL 1M nas triplicatas. Centrifugar as amostras por 5 minutos a 10000 rpm. A leitura foi feita

em cubeta de poliestireno a 345 nanômetros (nm) no espectrofotômetro.

3.5.6 Atividade Xilanolítica






- Tips para pipeta


- Reagente DNS

- Água mili-Q

- Solução de xilana 10g/L


réplicas. Adicionou-se 10µL da amostra em todos os eppendorfs. Adicionou-se 300µL de DNS

nos tubos referentes aos brancos. Em seguida, levou-se ao banho-maria à 40ºC e adicionou-se

90µL da solução de xilana 1,0% nos eppendorfs a cada 10 segundos até completar 5 minutos

de reação. Em seguida, inativou-se as enzimas adicionando 300µL do reagente DNS apenas

nas triplicatas a cada 10 segundos e levando-os, posteriormente, ao banho-maria à 100ºC

durante 5 minutos. Ao retirar deste banho, adicionou-se 1mL de água mili-Q em cada tubo. A

leitura foi feita em cubeta de poliestireno a 540nanômetros (nm) no espectrofotômetro.

xi

4. Resultados

4.1 Torta de babaçu suplementada com farinha de babaçu (50%):

4.1.1 Cálculo da contagem de esporos

4.1.1.1 Aspergillus oryzae

Média da contagem: 75,2 esporos Diluição: 1x (sem diluição) Volume de líquido entre a câmara e

a lamínula: 25 µL Fator de correção volumétrico: 104

Quantidade inicial desejada de esporos/mL : 2,25 x 107

Cálculo (esporos/mL) : 75,2 x 25 x 1 x 104 = 1,88 x 107

Cálculo volume a inocular no meio malte (µL): 2,25x107 /1,88x107 = 1.196 µL

4.1.1.2 Aspergillus awamori

Média da contagem: 170 esporos Diluição: 2x Volume de líquido entre a câmara e



Cálculo (esporos/mL) : 170 x 25 x 2 x 104 = 8,50 x 107

Cálculo volume a inocular no meio malte (µL): 2,25x107 /8,5x107 = 265 µL

4.1.2 Cálculo atividade exoamilolítica:

Cálculo:

Uxg-1 = (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido

inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada)

N° esporos 84

N° esporos 85

N° esporos 89

N° esporos 54

N° esporos 64

N° esporos 176

N° esporos 157

N° esporos 167

N° esporos 161

N° esporos 189

xii


Amostra Tempo (h)

Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades

T.Babaçu 24 1 0,061 0,028 0,083 1,01 0,46 1,37T.Babaçu 24 1 0,014 0,007 0 0,23 0,12 0,00 0,53T.Babaçu 48 5

0,131 0,123 0,132 10,01 9,4010,0

9T.Babaçu 48 5

0,137 0,12 0,156 10,47 9,1711,9

2 10,18T.Babaçu 72 10

0,099 0,085 0,08 16,32 14,0113,1

9T.Babaçu 72 10

0,1 0,096 0,1 16,48 15,8216,4

8 15,38T.Babaçu 96 10

0,121 0,106 0,105 19,94 17,4717,3

1T.Babaçu 96 10

0,148 0,133 0,102 24,39 21,9216,8

1 19,64T.Babaçu 120 10

0,094 0,101 0,096 15,49 16,6515,8

2T.Babaçu 120 5

0,275 0,284 0,253 21,02 21,7119,3

4 18,34


Amostra Tempo (h)


T.Babaçu 24 1 0,126 0,132 0,13 2,08 2,18 2,14T.Babaçu 24

1 0,238 0,273 0,226 3,92 4,50 3,72 3,09T.Babaçu 48 20 0,124 0,125 0,127 40,88 41,21 41,86T.Babaçu 48 10 0,074 0,08 0,084 12,20 13,19 13,85 27,20T.Babaçu 72 50 0,118 0,121 0,113 97,25 99,72 93,12T.Babaçu 72 30 0,135 0,138 0,148 66,75 68,24 73,18 83,04T.Babaçu 96 50 0,136 0,115 0,105 112,08 94,77 86,53T.Babaçu 96

30 0,293 0,318 0,323 144,88 157,24159,7

1 125,87T.Babaçu 120

50 0,151 0,154 0,15 124,44 126,91123,6

2T.Babaçu 120 10 0,058 0,072 0,062 8,87 11,01 9,48 67,39

xiii

0 24 48 72 96 120 1440

20

40

60

80

100

120

140

Atividade Amilolítica

A. awamori

A. oryzae

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

4.1.3 Cálculo atividade Celulolítica

Cálculo:

Uxg-1 = (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido

inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada)


Amostra Tempo (h)


T.Babaçu 24 1 0,018 0,012 0,005 0,45 0,30 0,12 0,33T.Babaçu 24 1 0,038 0 0,008 0,94 0,00 0,20T.Babaçu 48 1 0,023 0,009 0,018 0,57 0,22 0,45 0,27T.Babaçu 48 1 0 0,014 0,001 0,00 0,35 0,02T.Babaçu 72 1 0,001 0,027 0,002 0,02 0,67 0,05 0,39T.Babaçu 72 1 0,012 0,023 0,03 0,30 0,57 0,74T.Babaçu 96 1 0,051 0,063 0,064 1,26 1,56 1,58 1,32T.Babaçu 96 1 0,05 0,073 0,02 1,24 1,81 0,49T.Babaçu 120 1 0,043 0,028 0,028 1,06 0,69 0,69 1,15T.Babaçu 120 1 0,046 0,07 0,063 1,14 1,73 1,56


Amostra Tempo (h)


T.Babaçu 24 1 0,005 0,027 0,04 0,12 0,67 1,01 1,88T.Babaçu 24 1 0,1 0,141 0,14 2,47 3,49 3,51T.Babaçu 48 1 0,006 0,026 0,03 0,15 0,64 0,84 0,33T.Babaçu 48 1 0 0,003 0,01 0,00 0,07 0,27T.Babaçu 72 1 0,184 0,27 0,24 4,55 6,68 6,01 6,08T.Babaçu 72 2 0,116 0,136 0,14 5,74 6,73 6,73

xiv

T.Babaçu 96 2 0,169 0,181 0,17 8,36 8,96 8,36 6,94T.Babaçu 96 2 0,102 0,1 0,12 5,05 4,95 5,94T.Babaçu 120 2 0,154 0,161 0,18 7,62 7,97 9,11 5,27T.Babaçu 120 1 0,08 0,082 0,12 1,98 2,03 2,92

0 24 48 72 96 12002468

Atividade celulolítica

A.awamoriA.oryzae

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

4.1.4 Cálculo atividade proteolítica

Cálculo:

Concentração de FAN (Nitrogênio livre) = (Fator da curva padrão x diluição x absorbância)

Uxg-1 = média [FAN] x (Vol. de líquido inoculado/ Massa de matéria-prima pesada)/ Tempo de

reação


Amostra Tempo (h)

Diluição Abs 1

Abs 2

Concentração de FAN Média FAN

Média das Atividades

T.Babaçu 24 100 0,522 0,54 396,3 410,0 401,5 140,9T.Babaçu 24 100 0,508 0,545 385,7 413,8T.Babaçu 48 250 0,4 0,403 759,3 765,0 770,2 281,6T.Babaçu 48 250 0,39 0,43 740,3 816,2T.Babaçu 72 300 0,42 0,473 956,7 1077,4 999,4 365,9T.Babaçu 72 300 0,429 0,433 977,2 986,3T.Babaçu 96 400 0,257 0,25 780,6 759,3 747,9 271,2T.Babaçu 96 400 0,237 0,241 719,8 732,0T.Babaçu 120 500 0,232 0,235 880,8 892,2 889,3 320,1T.Babaçu 120 500 0,208 0,262 789,7 994,7


Amostra Tempo (h)

Diluição Abs 1

Abs 2

Concentração de FAN Média FAN

Média das Atividades

T.Babaçu 24 20 0,262 0,288 39,8 43,7 41,8 1,3T.Babaçu 24 20 0,268 0,282 40,7 42,8T.Babaçu 48 150 0,354 0,36 403,2 410,0 394,1 136,2T.Babaçu 48 150 0,329 0,341 374,7 388,4T.Babaçu 72 200 0,648 0,684 984,0 1038,7 1011,4 371,8T.Babaçu 72 200 0,678 0,654 1029,6 993,2

xv

T.Babaçu 96 400 0,26 0,246 789,7 747,1 764,6 281,8T.Babaçu 96 400 0,246 0,255 747,1 774,5T.Babaçu 120 500 0,197 0,207 747,9 785,9 767,8 281,9T.Babaçu 120 500 0,191 0,214 725,1 812,4

0 24 48 72 96 1200

50100150200250300350400 Atividade proteolítica

A.awamoriA.oryzae

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

4.1.5 Cálculo atividade xilanolítica

Cálculo:

(Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada)


Amostra Tempo (h)


T.Babaçu 24 1 0,005 0,019 0,024 0,62 2,35 2,97 4,57T.Babaçu 24 1 0,061 0,065 0,048 7,54 8,03 5,93T.Babaçu 48 1 0,045 0,044 0,044 5,56 5,44 5,44 5,21T.Babaçu 48 1 0,042 0,038 0,04 5,19 4,70 4,94T.Babaçu 72 1 0,047 0,041 0,038 5,81 5,07 4,70 6,61T.Babaçu 72 1 0,069 0,056 0,07 8,53 6,92 8,65T.Babaçu 96 1 0,055 0,031 0,046 6,80 3,83 5,68 5,70T.Babaçu 96 1 0,044 0,057 0,044 5,44 7,04 5,44T.Babaçu 120 1 0,021 0,026 0,015 2,59 3,21 1,85 4,16T.Babaçu 120 1 0,028 0,063 0,049 3,46 7,78 6,05


Amostra Tempo (h)


T.Babaçu 24 1 0,023 0,029 0,036 2,84 3,58 4,45 4,53T.Babaçu 24 1 0,04 0,042 0,05 4,94 5,19 6,18T.Babaçu 48

1 0,069 0,107 0,09 8,53 13,2211,1

2 8,96T.Babaçu 48 1 0,052 0,063 0,054 6,43 7,78 6,67T.Babaçu 72 3 0,134 0,145 0,142 49,68 53,75 52,6 40,96

xvi

4T.Babaçu 72

3 0,119 0,005 0,118 44,11 1,8543,7

4T.Babaçu 96

1 0,267 0,257 0,295 32,99 31,7636,4

5 31,41T.Babaçu 96

1 0,237 0,249 0,22 29,29 30,7727,1

9T.Babaçu 120

1 0,156 0,169 0,176 19,28 20,8821,7

5 18,27T.Babaçu 120

1 0,111 0,129 0,146 13,72 15,9418,0

4

4.2 Farelo de Soja

4.2.1 Cálculo da contagem de esporos (A.awamori)

Média da contagem: 102,9 esporos Diluição: 2x Volume de líquido entre a câmara e




Cálculo volume a inocular no meio malte (µL): 2,25x107 /25,725x107 = 87,5 µL

4.2.2 Cálculo atividade exoamilolítica

Cálculo:(Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada)

Amostra Tempo (h)


Farelo de Soja

245 0,066 0,122 0,110 4,91 9,07 8,18 7,50

Farelo 24 5 0,096 0,105 0,106 7,14 7,81 7,88

N° esporos 114

N° esporos 104

N° esporos 97

N° esporos 115

N° esporos 84

xvii

de SojaFarelo de Soja

485 0,185 0,191 0,170 13,75 14,20 12,64 12,50

Farelo de Soja

485 0,152 0,153 0,158 11,30 11,37 11,74

Farelo de Soja

721 0,369 0,368 0,337 5,49 5,47 5,01 4,84

Farelo de Soja

721 0,293 0,288 0,300 4,36 4,28 4,46

Farelo de Soja

961 0,290 0,307 0,306 4,31 4,56 4,55 4,45

Farelo de Soja

961 0,310 0,303 0,281 4,61 4,50 4,18

Farelo de Soja

1201 0,368 0,336 0,350 5,47 5,00 5,20 4,90

Farelo de Soja

1201 0,320 0,294 0,308 4,76 4,37 4,58

0 24 48 72 96 12002468

101214 Atividade exoamilolítica

A.awa...

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

4.2.3 Cálculo atividade Celulolítica

Cálculo:


Amostra

Tempo (h)


Farelo de Soja

241 0,007 0,005 0,013 0,16 0,12 0,15 1,04

Farelo de Soja

241 0,086 0,041 0,088 1,92 1,94 1,96

Farelo de Soja

481 0,020 0,062 0,012 0,45 0,30 0,27 0,42

Farelo de Soja

481 0,024 0,021 0,016 0,54 0,47 0,50

Farelo de Soja

721 0,070 0,070 0,000 1,56 1,56 1,55 1,36

xviii

Farelo de Soja

721 0,033 0,135 0,079 0,74 1,00 1,76

Farelo de Soja

961 0,036 0,096 0,033 0,80 0,77 0,74 1,89

Farelo de Soja

961 0,139 0,149 0,116 3,10 3,32 2,59

Farelo de Soja

1201 0,006 0,058 0,070 1,39 1,29 1,56 2,33

Farelo de Soja

1201 0,081 0,173 0,128 3,00 3,86 2,85

4.2.4 Cálculo atividade Proteolítica

Cálculo:


Amostra

Tempo (h)


Farelo de Soja

241 0,275 0,279 0,284 20,75 21,06 21,43 17,43

Farelo de Soja

241 0,180 0,183 0,185 13,58 13,81 13,96

Farelo de Soja

481 0,108 0,103 0,100 8,15 7,77 7,55 9,30

Farelo de Soja

481 0,100 0,162 0,143 11,0 12,23 10,79

Farelo de Soja

721 0,118 0,136 0,129 8,91 10,26 9,74 11,77

Farelo de Soja

721 0,177 0,184 0,192 13,36 13,89 14,49

Farelo de Soja

961 0,116 0,115 0,128 8,75 8,68 9,66 10,45

Farelo de Soja

961 0,152 0,155 0,165 11,47 11,70 12,45

Farelo 120 1 0,170 0,185 0,172 12,83 13,96 12,98 14,73

0 24 48 72 96 1200

1

2

3

Atividade celulolítica

A.awa...

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

xix

de SojaFarelo

de Soja120

1 0,232 0,212 0,200 17,51 16,00 15,09

0 24 48 72 96 1200

5

10

15

20

Atividade Proteolítica

A.awamori

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

4.2.5 Cálculo atividade Xilanolítica

Cálculo:


Amostra

Tempo (h)


Farelo de Soja

241 0,130 0,155 0,119 15,62 18,63 14,30 10,95

Farelo de Soja

241 0,050 0,043 0,094 6,01 5,17 6,00

Farelo de Soja

481 0,085 0,058 0,121 10,21 13,00 14,54 8,93

Farelo de Soja

481 0,045 0,045 0,065 5,41 5,41 5,00

Farelo de Soja

721 0,140 0,079 0,089 10,00 9,49 10,70 8,15

Farelo de Soja

721 0,048 0,058 0,082 5,77 6,97 6,00

Farelo de Soja

961 0,011 0,003 0,007 1,32 1,00 0,84 1,17

Farelo de Soja

961 0,014 0,010 0,008 1,68 1,20 0,96

Farelo de Soja

1201 0,000 0,026 0,001 0,00 0,11 0,12 1,20

Farelo 120 1 0,020 0,021 0,017 2,40 2,52 2,04

xx

de Soja

0 24 48 72 96 1200

5

10

15

Atividade xilanolítica

A.awam...

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

4.2.6 Teor de água e pH

Amostra Tempo (h) Teor de água Média Teor pH Média pHFarelo de Soja

00,989 0,989 6,63 6,63

Farelo de Soja

240,972 0,9735 7,41 7,42

Farelo de Soja

240,975 7,43

Farelo de Soja

480,957 0,965 6,94 7,125

Farelo de Soja

480,973 7,31

Farelo de Soja

720,966 0,953 7,6 7,31

Farelo de Soja

720,94 7,02

Farelo de Soja

960,955 0,9435 7,45 7,465

Farelo de Soja

960,932 7,48

Farelo de Soja

1200,849 0,845 6,78 7,015

Farelo de Soja

1200,841 7,25

4.3 Casca de soja

4.3.1 Cálculo da contagem de esporos

N° esporos 35

N° esporos 33

xxi

Média da contagem: 36,2 esporos Diluição: 10x Volume de líquido entre a câmara e a

lamínula: 25 µL Fator de correção volumétrico: 104



Cálculo volume a inocular no meio malte (µL): 2,25x107 /9,05x107 = 249 µL

0 24 48 72 96 12056789

pH

Farelo de sojaTorta de mamona

Tempo(h)

N° esporos 36

N° esporos 45

N° esporos 32

0 24 48 72 96 1200

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2 Teor de água

Farelo de ...

Tempo (h)

xxii

4.3.2 Cálculo da atividade Exoamilolítica

Cálculo:


Amostra

Tempo (h)


Casca de Soja

241 0,135 0,148 0,136 2,01 2,20 2,02 1,71

Casca de Soja

241 0,090 0,092 0,091 1,34 1,37 1,35

Casca de Soja

481 0,292 0,294 0,284 4,34 4,37 4,22 4,28

Casca de Soja

481 0,272 0,300 0,286 4,04 4,46 4,25

Casca de Soja

722 0,196 0,193 0,215 5,83 5,74 6,39 5,20

Casca de Soja

722 0,146 0,144 0,155 4,34 4,28 4,61

Casca de Soja

962 0,222 0,230 0,245 6,60 6,84 7,28 6,48

Casca de Soja

962 0,211 0,206 0,193 6,27 6,13 5,74

Casca de Soja

1202 0,245 0,227 0,270 7,28 6,75 8,03 6,81

Casca de Soja

1202 0,199 0,220 0,214 5,92 6,54 6,36

0 24 48 72 96 1200

2

4

6

8

Atividade Exoamilolítica

A.awa...

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

4.3.2 Cálculo da atividade Celulolítica

xxiii

Cálculo:


Amostra

Tempo (h)


Casca de Soja

241 0,014 0,008 0,007 0,31 0,18 0,16 0,22

Casca de Soja

241 0,013 0,008 0,008 0,29 0,18 0,18

Casca de Soja

481 0,010 0,003 0,005 0,22 0,07 0,11 0,10

Casca de Soja

481 0,001 0,003 0,004 0,02 0,07 0,09

Casca de Soja

721 0,015 0,022 0,026 0,33 0,49 0,58 0,34

Casca de Soja

721 0,016 0,002 0,011 0,36 0,04 0,25

Casca de Soja

961 0,027 0,015 0,019 0,60 0,33 0,42 0,49

Casca de Soja

961 0,025 0,024 0,021 0,56 0,54 0,47

Casca de Soja

1201 0,034 0,023 0,040 0,76 0,51 0,89 0,56

Casca de Soja

1201 0,017 0,019 0,017 0,38 0,42 0,38

0 24 48 72 96 1200

0.2

0.4

0.6

Atividade Celulolítica

A.awamori

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

4.3.3 Cálculo da atividade Proteolítica

Cálculo:

xxiv


Amostra

Tempo (h)


Casca de Soja

241 0,265 0,324 0,318 12,00 14,67 14,40 13,22

Casca de Soja

241 0,266 0,285 0,294 12,04 12,90 13,31

Casca de Soja

481 0,140 0,149 0,162 6,34 6,75 7,34 7,06

Casca de Soja

481 0,167 0,159 0,158 7,56 7,20 7,15

Casca de Soja

721 0,169 0,164 0,174 7,65 7,43 7,88 7,49

Casca de Soja

721 0,166 0,158 0,162 7,52 7,15 7,34

Casca de Soja

961 0,159 0,151 0,150 7,20 6,84 6,79 7,03

Casca de Soja

961 0,162 0,160 0,150 7,34 7,24 6,79

Casca de Soja

1201 0,135 0,145 0,155 6,11 6,57 7,02 6,59

Casca de Soja

1201 0,151 0,145 0,142 6,84 6,57 6,43

0 24 48 72 96 1200

5

10

15

Atividade Proteolítica

A.awa...

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

4.3.4 Cálculo da atividade Xilanolítica

Cálculo


xxv

Amostra

Tempo (h)


Casca de Soja

241 0,068 0,045 0,072 8,17 5,41 8,65 4,39

Casca de Soja

241 0,012 0,003 0,019 1,44 0,36 2,28

Casca de Soja

481 0,031 0,032 0,021 3,73 3,85 2,52 9,31

Casca de Soja

481 0,114 0,128 0,139 13,70 15,38 16,70

Casca de Soja

721 0,183 0,191 0,208 21,99 22,95 25,00 18,11

Casca de Soja

721 0,111 0,090 0,121 13,34 10,82 14,54

Casca de Soja

961 0,313 0,336 0,346 37,61 40,38 41,58 29,68

Casca de Soja

961 0,150 0,129 0,208 18,03 15,50 25,00

Casca de Soja

1201 0,252 0,230 0,245 30,28 27,64 29,44 23,35

Casca de Soja

1201 0,136 0,140 0,163 16,34 16,82 19,59

0 24 48 72 96 1200

10203040

Atividade Xilanolítica

A.awa...

Tempo (h)

Ati

vid

ade

(U/g

)

4.3.5 Teor de água e pH

Amostra Tempo (h) Teor de água Média Teor pH Média pHCasca de Soja

00,976 0,976 5,78 5,78

Casca de Soja

240,981 0,981 6,91 7,01

Casca de Soja

240,98 7,1

Casca de Soja

480,979 0,973 6,46 6,45

Casca de 48 0,967 6,44

xxvi

SojaCasca de Soja

720,956 0,956 5,58 5,70

Casca de Soja

720,956 5,81

Casca de Soja

960,869 0,849 4,98 4,98

Casca de Soja

960,828 4,98

Casca de Soja

1200,841 0,841 4,66 4,65

Casca de Soja

1200,841 4,64

5.

5. Discussão

A contagem de esporos para Aspergillus oryzae indicou 1,88 x 107 esporos/mL. Já a

contagem de esporos para Aspergillus awamori indicou 8,50 x 107 esporos/mL, o que significa

que o A.awamori esporula melhor que o A.oryzae quando em ágar PDA (Dextrose-Batata) por

7 dias a 30ºC.

Quanto as atividades, o A.awamori apresentou maior produção exoamilolítica: 125,87

U/g após 96 horas de crescimento, enquanto o A.oryzae apresentou menor produção: 19,64

U/g após 96 horas de crescimento. A.awamori apresentou maior produção celulolítica: 6,94 U/g

após 96 horas de crescimento, enquanto o A.oryzae apresentou menor produção: 1,32 U/g

após 96 horas de crescimento. A.awamori apresentou maior produção proteolítica: 371,8 U/g


após 72 horas de crescimento. A.awamori apresentou maior produção xilanolítica: 40,96 U/g


após 72 horas de crescimento.

Com isso, fica evidente que o A.awamori teve melhor desempenho em produção

enzimática, em torta de babaçu suplementada, em relação ao A.oryzae. Devido seu

desempenho, o A.awamori foi o único fungo a ser testado em farelo de soja e casca de soja.

0 24 48 72 96 1200.75

0.80.85

0.90.95

1

Teor de água

Casca de Sojacasca de mamona

Tempo (h)

0 24 48 72 96 1200

2

4

6

8

pH

Casca de SojaCasca de Mamona

Tempo (h)

xxvii

Esses testes são importantes para caracterizar as matérias-primas e mostrar em qual delas o

fungo realiza maiores produções enzimáticas.

Em farelo de soja, o A.awamori apresentou pico de produção exoamilolítica de 12,50

U/g após 48 horas de crescimento, pico de produção celulolítica de 2,33 U/g após 120 horas de

crescimento, pico de produção proteolítica de 17,43 U/g após 24 horas de crescimento e pico

de atividade xilanolítica de 10,95 U/g após 24 horas de crescimento. O teor de água, ao longo

do crescimento, se mostrou constante, em torno de 0,9. O pH se mostrou neutro ao longo de

todo o crescimento.

Em casca de soja, o A.awamori apresentou pico de produção exoamilolítica de 6,81 U/g

após 120 horas de crescimento, pico de produção celulolítica de 0,56 U/g após 120 horas de

crescimento, pico de produção proteolítica de 13,22 U/g após 24 horas de crescimento e pico

de atividade xilanolítica de 29,68 U/g após 96 horas de crescimento. O teor de água, ao longo

do crescimento, se mostrou estável, em torno de 0,9. Já o pH oscilou, fato que pode se dar

pela dinâmica de produção de proteases, que leva a produção e consumo de aminoácidos pelo

fungo.

Ao correlacionarmos as matérias-primas, o farelo de soja mostrou induzir melhor a

produção enzimática em geral, em relação a casca de soja. No entanto, a torta de babaçu

suplementada com farinha de babaçu mostrou ser um substrato muito mais rico e indutor de

produção enzimática pelo fungo A.awamori.

6. Considerações Finais

O Aspergillus awamori esporula melhor e realiza maior produção enzimática em relação

ao Aspergillus oryzae. É, portanto, o fungo mais interessante para essa pesquisa. A torta de

babaçu mostrou ser uma matéria-prima mais rica em nutrientes, induzindo melhor a produção

de amilases e enzimas acessórias, como celulases, proteases e xilanases. Dessa forma, a

fermentação no estado sólido do fungo Aspergillus awamori em torta de babaçu suplementada

com farinha de babaçu origina um extrato multienzimático rico e de grande interesse para a

pesquisa. Esse extrato poderá ser concentrado por liofilização ou filtração para posteriormente,

hidrolisar as mesmas matérias-primas e originar monossacarídeos e aminoácidos, que são de

grande interesse para a produção de etanol, meios de cultura, biopolímeros, dentre outros.

7. Bibliografia

Castro, A.M., Andrea, T.V., Castilho, L.R., Freire, D.M.G.: Use of mesophilic fungal amylases produced by solid-state fermentation in the cold hydrolysis of raw babassu cake starch. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1612–1625 (2010)

xxviii

Castro, A.M., Carvalho, D.F., Freire, D.M.G., Castilho, L.R.: Economic analysis of the production of amylases and other hydrolases by Aspergillus awamori in solid-state fermentation of babassu cake. Enzyme Res. 2010. Article ID 576872. doi: 10.4061/2010/576872

Castro, A.M., Pereira Jr, N.: Production, properties and applica- tion of cellulases in the hydrolysis of agroindustrial residues. Quim. Nova 33, 181–188 (2010)

R. Banerjee, B.C. Bhattacharya, Evolutionary operation (EVOP) as a tool of optimization for solid-state fermentation, Bio- chem. Eng. J. 13 (2003) 149–155.

Hayashida, S. and P. Q. Flor (1981) Raw starch-digestive glucoamylase productivity of protease-less mutant from Aspergillus awamori var. kawachi. Agric. Biol. Chem. 45: 2675-2681.

xxix

Relatório Final de Estágio - Arthur Lima 2-1

Documents

Transcript of Relatório Final de Estágio - Arthur Lima 2-1