Relatório Bioquímica Analítica - Versão Final

7/17/2019 Relatório Bioquímica Analítica - Versão Final

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Isolamento, purifcação e caracterização do citocromo c de uma estirpe deSaccharomyces cerevisiae

1

Bioquímica Analítica

Isolamento, purifcação e caracterização

do citocromoc de uma estirpe deSaccharomyces cerevisiae

Ana Pereira, n.º 24112 pereira.anacatarina!"mail.com#Ana $uarte, n.º 2%&12 analuisa'1('pa!)otmail.com#

*íntia *arreira, n.º 24+( c'catarinacarreira!)otmail.com#*l-udia *aleiro, n.º 2%%1% cl-udia.caleiro!)otmail.com#

$/ora 0elo, n.º 2&&4 princesa'canuca1(!)otmail.com#

Turno P%, Grupo 1

Licenciatura em Bioquímica




2

esumo

o presente tra/al)o e3perimental procedeuse ao isolamento,purifcação e caracterização do citocromo c de uma estirpe Saccharomycescerevisiae, tendose o/tido 1+,(4( m" de citocromo c, de peso molecular12,2 5$a. A quantidade total de proteína o/tida no 6ltimo passo depurifcação 7oi 2+,89& m". : rendimento do 6ltimo passo de purifcação 7oi14,(; e o coefciente de pureza 7oi +,(&8. : n6mero de )emos o/tido 7oi1,2.

$e modo a proceder ao isolamento do citocromo c, 7oi necess-rio lisaras clulas atra<s da suspensão de 7ermento de padeiro, pre<iamentedes7eito, em acetato de etilo e cloreto de s=dio. Posteriormente, de modo apurifcar o citocromo c, e7ectuouse uma cromato"rafa em batch, adicionouse sul7ato de am=nio para precipitar as proteínas contaminantes saltingout # e, para fnalizar, e7ectuouse uma cromato"rafa >P?*. Ap=s acromato"rafa em batch, e7ectuouse uma di-lise e 7oi retirada uma

pequena amostra para an-lise espectrosc=pica, assim como, ap=s aprecipitação com sul7ato de am=nio.Posteriormente, recorreuse ao mtodo de ?o@r para determinar a

quantidade total de proteína e 7oram e7ectuadas uma electro7orese em "elde poliacrilamida em condiçes desnaturantes, para determinar o pesomolecular do citocromo c, e uma electro7orese em "el de poliacrilamidacorado para detecção de )emos. $e modo a determinar o conte6do em)emos por molcula de proteína, recorreuse ao mtodo da piridina)emocromo.




%

Introdução

:s citocromos são )emoproteínas, ou seCa, contDm um "rupoprosttico desi"nado por "rupo )emo que consiste num -tomo de 7erro nocentro de um anel de porfrina. : -tomo de 7erro tem um n6mero decoordenação 9. :s quatro li"andos do plano equatorial são -tomos de azotodo anel de porfrina e as posiçes de coordenação a3iais são asse"uradaspor resíduos laterais de amino-cidos da cadeia polipeptídica da proteína. Aquinta posição de coordenação ocupada por um resíduo de )istidina e a

se3ta posição preenc)ida por uma metionina. : 7erro )mico possui spin/ai3o e o estado de o3idação do 7erro <aria entre o estado reduzido Ee 2F# eo estado o3idado Ee%F#.

:s citocromos distin"uemse pelo tipo de )emo, natureza da cadeiapolipeptídica e propriedades espectrosc=picas. $as quatro classes distintasde citocromos a, b, c e d#, apenas 7oi estudado o citocromo c.

: citocromo c distin"uese dos restantes por possuir um "rupo )emoli"ado co<alentemente G cadeia polipeptídica atra<s de uma li"ação tiotercom dois resíduos de cisteína da sequDncia de amino-cidos e por ser umaproteína sol6<el.

Figura 1 Estrutura tridimensional do citocromo c.

Figura 2 Estado de spin do ferro hémico do citocromo c.




4

: citocromo c um componente essencial da cadeia respirat=riamitocondrial, actuando como transportador electr=nico entre os comple3osIII e IH. A sua estrutura tridimensional 7oi determinada por cristalo"rafa deraios, re<elando a presença de uma re"ião rica em lisinas com car"apositi<a a <alores de p> fsiol="ico. A proteína pode ser 7acilmente o/tida nasua 7orma pura e mantmse est-<el em solução, sendo resistente Gdesnaturação e a alteraçes da sua estrutura tridimensional nati<a emcondiçes ad<ersas de p>, temperatura e 7orça i=nica.

: citocromo c encontrase di<idido em quatro classesJ9KL

• *lasse I M Inclui o citocromo c sol6<el e de spin /ai3o dasmitocNndrias e /actrias. Possui o sítio de li"ação do "rupo )emo

Cunto do terminal da )istidina e o se3to li"ando Cunto do *terminalde uma metionina.

• *lasse II M Inclui o citocromo c de spin alto. Apresenta o sítio deli"ação do "rupo )emo 7ec)ado para o terminal da )istidina.

• *lasse III M *ompreende os <-rios citocromos com "rupo )emo de

/ai3o potencial redo3. :s "rupos )micos do tipo c não são estruturale 7uncionalmente equi<alentes e apresentam potenciais redo3di7erentes, <ariando entre + e 4++ mH.

• *lasse IH M :ri"inalmente criada de modo a conter proteínascomple3as que possuem "rupos prostticos para alm do )emo c.

o presente tra/al)o e3perimental procedeuse ao isolamento docitocromo c de uma estirpe Saccharomyces cerevisiae. : citocromo c deSccharomyces cerevisiae constituído por uma cadeia polipeptídica com1+4 resíduos de amino-cidos e tem um peso molecular de cerca de 12,95$aJ&K.

*omo re7erido anteriormente, o estado de o3idação do 7erro )mico<aria entre o estado reduzido Ee2F# e o estado o3idado Ee%F#. Atra<s dean-lise espectrosc=pica, possí<el <erifcar se o 7erro se encontra no estadoreduzido ou o3idado. : citocromo c no estado o3idado apresenta uma /andaintensa de a/sorção no espectro de OHHis de<ido G presença do "rupo)emo, denominada /anda oret e detectada a cerca de 41+ nm, assimcomo um conCunto de /andas menos intensas na re"ião &&+9++ nm,denominadas /andas Q. A redução do citocromo c acompan)ada pelodes<io da /anda oret para 42+ nm e pelo aumento de intensidade do picode a/sorção da 7orma reduzida do citocromo c a cerca de &&+ nm. A /andade a/sorção a 28+ nm de<ese G presença de proteínas com cadeias lateraisarom-ticas.

Figura 3 Espectros de asor!"o do citocromo c no estado o#idado $% esquerda& edo citocromo c no estado redu'ido $% direita&.




&

esultados

:s resultados o/tidos permitem <erifcar a efciDncia das di<ersastcnicas utilizadas no isolamento, purifcação e caracterização do citocromoc. *omo tal, ap=s cada passo de purifcação 7oi retirada uma alíquota paraposterior an-lise espectrosc=pica da sua pureza. A alíquota 1 corresponde Gamostra retirada ap=s a cromato"rafa em batch, a alíquota 2 corresponde G

amostra retirada ap=s a precipitação com sul7ato de am=nio e a 7racção Bcorresponde G 7racção mais pura o/tida ap=s a cromato"rafa >P?*.

Ap=s a cromato"rafa em batch e di-lise do eluído, o/te<ese umaamostra de coloração a<ermel)ada, com <olume total de %4 ml e G qual 7oiretirada uma alíquota de 1 ml para posterior estudo espectrosc=pico.




9

2++.+ 4++.+ 9++.+ 8++.+

+.+++

1.+++

2.+++

%.+++

4.+++

(sor)*ncia das formas o#idada e redu'ida + (líquota 1

Eorma o3idada Eorma reduzida

,omprimento de onda $nm&

(sor)*ncia $u(&

Gr-co 1 (n-lise espectrosc/pica da alíquota 10 correspondente % amostra otidaap/s cromatograa em batch.

$a mesma 7orma, ap=s a precipitação das proteínas contaminantescom sul7ato de am=nio >4#2:4#, centri7u"ação e di-lise do so/renadante,o/te<ese uma amostra com <olume total de 1+2 ml e G qual 7oi retiradauma alíquota de 1 ml para posterior estudo espectrosc=pico.

2++.+ 4++.+ 9++.+ 8++.+

+.+++

1.+++

2.+++

%.+++

4.+++

(sor)*ncia das formas o#idada e redu'ida + (líquota 2



(sor)*ncia $u(&

Gr-co 2 (n-lise espectrosc/pica da alíquota 20 correspondente % amostra otidaap/s precipita!"o com sulfato de am/nio.

Ap=s a cromato"rafa >P?*, 7oram o/tidas 1( 7racçes. R possí<elidentifcar a presença de citocromo c, nas di<ersas 7racçes, atra<s dacoloração <ermel)a, característica da proteína.




(

Atra<s dos <alores de a/sor<Sncia a &&+ nm, a &(+ nm e a 28+ nm, possí<el determinar o coefciente de pureza1# que corresponde, no 7undo,G razão entre a quantidade de citocromo c e a quantidade total de proteína.: <alor de a/sor<Sncia a &&+ nm corresponde G a/sor<Sncia do citocromo ce o <alor de a/sor<Sncia a 28+ nm corresponde G a/sor<Sncia de proteínascom cadeias laterais arom-ticas. : <alor de a/sor<Sncia a &(+ nm utilizado como /ranco.

1#

|¿280nm|

|¿550nm|−|¿570 nm|

¿¿

Coeficiente de pureza=¿

Taela 1 alores de asor)*ncia dos tuos a 2 nm e 41 nm0 no estado o#idado0e a 55 nm e 56 nm0 no estado redu'ido0 ra'"o entre as asor)*ncias a 41 nm ea 2 nm e coeciente de pure'a.

Tu/o

Eorma :3idada Eorma eduzida |¿280nm||¿410nm|¿

¿

*oefcientede

pureza

A/or<Sncia28+nm

A/sor<Sncia41+nm

A/sor<Sncia&&+nm

A/sor<Sncia&(+nm

% +,+%1 +,+2 +,+18 +,++% 2,8& +,9(&& +,19( +,9+ +,19% +,++2 4,142 +,98( +,+42 +,181 +,+48 +,++4 4,2(+ 1,+1 +,+(9 +,%14 +,+81 +,++& 4,12 1,++211 +,+(+ +,2&+ +,+92 +,++% %,&& +,84&1% +,+%1 +,1%2 +,+4+ +,++9 4,2+9 1,+89

1& +,%19 +,( +,1(+ +,++1 2,&%+ +,&4%1( +,292 +,%&8 +,+4+ +,++9 1,%9& +,1(8

+ 1+ 2++.&

+.&

1.&

2.&

%.&

4.&

+.+

+.2+.4

+.9

+.8

1.+

1.2

(417(2 e ,oeciente de pure'a

A41+UA28+ *oefciente de pureza

Tuos

(417(2 ,oeciente de pure'a

Gr-co 3 8epresenta!"o gr-ca da ra'"o entre as asor)*ncias a 41 nm e a 2nm e do coeciente de pure'a0 determinados para cada tuo.




8

: c-lculo da razão de pureza tem como o/Cecti<o estimar a purezadas <-rias 7racçes o/tidas e escol)er as mais puras, ou seCa, as 7racçesque tDm um coefciente de pureza superior a 1.

*onsiderando os resultados o/tidos, possí<el considerar as 7racçes( a 1% puras, uma <ez que apresentam um coefciente de pureza superior a1, G e3cepção da 7racção 11. *omo tal, Cuntaramse as 7racçes mais puras,ou seCa, as 7racçes ( a 1%, tal como re7erido anteriormente, e o/te<ese a7racção B com <olume total de %4 ml.

2++.+ 4++.+ 9++.+ 8++.+

+.+++

1.+++

2.+++

%.+++

4.+++

(sor)*ncia das formas o#idada e redu'ida + Frac!"o B



(sor)*ncia $u(&

Gr-co 4 (n-lise espectrosc/pica da frac!"o B0 correspondente % amostra otidaap/s cromatograa 9:L,.

Taela 2 Banda ;oret e andas < do citocromo c e respecti)os )alores deasor)*ncia0 no estado nati)o e no estado redu'ido.

AmostraEorma ati<a Eorma eduzida

λ nm# A/sor<Sncia λ nm# A/sor<Sncia

Alíquota 1414 +,&+% 41& +,&&%&2+ +,+9% &2+ +,+9&4 +,1++ &4 +,118

Alíquota 2411 +,92 41& +,(48&2+ +,+(& &2+ +,+4

&4 +,+8 &4 +,194Eracção B

411 +,%+& 41& +,%&&21 +,+%8 &2+ +,+4%&4 +,+&2 &4 +,+(%

$e modo an-lo"o ao e7ectuado para as di<ersas 7racçes o/tidasap=s cromato"rafa >P?*, possí<el determinar o coefciente de purezapara as amostras o/tidas ap=s cada passo de isolamento e purifcação docitocromo c.

Taela 3 alores de asor)*ncia da alíquota 10 da alíquota 2 e da frac!"o B a 2nm0 no estado o#idado0 e a 55 nm e 56 nm0 no estado redu'ido e coeciente de

pure'a.

Amostra Eorma Eorma eduzida *oefciente




:3idadade purezaA/or<Sncia28+

nm

A/or<Sncia&&+

nm

A/or<Sncia&(+

nm

Alíquota 1 +,%1( +,11& +,++8 +,%%8Alíquota 2 +,248 +,1&8 +,+1+ +,&(

Eracção B +,+(1 +,+(% +,++& +,&8A relação entre os <alores de a/sor<Sncia o/tidos a &&+ nm para cada

uma das 7racçes recol)idas e a concentração de citocromo c dada pela

lei de ?am/ertBeer. $e acordo com a lei de ?am/ertBeer, A=bc , em que

ε representa o coefciente de e3tinção molar, / representa o percurso =pticoe c representa a concentração.

A concentração de citocromo c determinada considerando ocoefciente de e3tinção molar do citocromo c reduzido a &&+ nm,apro3imadamente, 2,1 m01cm1J1K, o percurso =ptico i"ual a 1 cm e orespecti<o 7actor de diluição.

A quantidade total de citocromo c, em m", determinadaconsiderando o peso molecular do citocromo c, apro3imadamente, 12,95$aJ&K.

Taela 4 <uantidade de citocromo c e rendimento otidos em cada uma dasfrac!=es recolhidas ao longo da purica!"o.

Passo depurifcaç

ão

Amostra

Eactorde

diluição

*oncentração decitocromo c 0#

Holume ml#

Quantidadede

citocromo c

mol#

Quantidadede

citocromo c

m"#

endimento;#

*romato"rafa

*0*&2

Alíquota 1 1+

%,&2×1+& %4

1,%44×1+9 19,%+ 1++

Precipitação com>4#2:

4

Alíquota 2 2

1,+89×1+& 1+2

1,1+8×1+9 1%,&9 82,4

>P?*Eracçã

o B 1+2,&+×1

+&%4

8,&2×1+(

1+,(4( 9%,&

>etermina!"o da proteína pelo método de Lo?r@

e"uidamente, possí<el determinar a concentração total deproteína atra<s do mtodo de ?o@r e, deste modo, a<eri"uar a efciDnciados <-rios passos de purifcação. Para o e7eito, traçada uma recta padrãopara uma solução de citocromo c de coração de ca<alo de concentração+,&49 m"Uml.

Taela 5 alores de asor)*ncia a A nm $u(& e concentra!"o nal de padr"o$mg7ml& necess-rios para constru!"o da recta padr"o. s )alores assinalados a)ermelho n"o foram considerados para a constru!"o da recta padr"o0 de modo aoptimi'ar o )alor de 8 e diminuir o erro associado.

Vnsaio Holume depadrão Wl#

Holume de>2: Wl#

A/sor<Sncia9

8+ nm uA#*oncentraçã

o fnal de




1+

padrãom"Uml#

1 + 2++ +,+8 +1 + 2++ +,+(8 +2 2+ 18+ +,1&+ +,+&49

2 2+ 18+ +,19( +,+&49% 4+ 19+ +,2%8 +,1+2% 4+ 19+ +,29+ +,1+24 9+ 14+ +,%%8 +,19%84 9+ 14+ +,%%1 +,19%8& 8+ 12+ +,488 +,2184& 8+ 12+ +,&+1 +,2184

+ +.+& +.1 +.1& +.2 +.2& +.%+.+++

+.1++

+.2++

+.%++

+.4++

+.&++

+.9++

+.(++

73# X 1.(83 F +.+(Y X +.8

8ecta de calira!"o + Cétodo de Lo?r@

,oncentra!"o $mg7ml&

(sor)*ncia $u(&

Gr-co 5 8ecta padr"o para uma solu!"o de citocromo c de cora!"o de ca)alo deconcentra!"o 054A mg7ml tra!ada para determina!"o da concentra!"o total deproteína pelo método de Lo?r@. ponto assinalado a )ermelho n"o foiconsiderado para a constru!"o da recta padr"o0 de modo a optimi'ar o )alor de 8 ediminuir o erro associado.

*onsiderando a equação da recta o/tida e os <alores de a/sor<Snciao/tidos para as alíquotas e para a 7racção B, possí<el determinar aquantidade total de proteína, em m"Uml, em cada uma das 7racçes

recol)idas ao lon"o da purifcação.

Taela A alores de asor)*ncia a A nm $u(& e concentra!"o total de proteína naalíquota 1 $mg7ml&. olumes de alíquota 1 a usar na determina!"o de proteínatotal atra)és do método de Lo?r@D 1 l0 2 l0 3 l e 4 l. s )alores assinalados a)ermelho n"o foram considerados para a determina!"o da concentra!"o total deproteína na alíquota 10 de modo a optimi'ar os c-lculos e diminuir o erroassociado.

Holume dealíquota 1

Wl#

A/sor<Sncia9

8+nm uA#Eactor dediluição

*oncentração total de

proteína na

alíquota 1m"Uml#


proteína naalíquota 1

mdia#m"Uml#




11

1 +,119 2+ &,4%&

4,194

1 +,+& 2+ %,+822 +,1&+ 1+ 4,92%2 +,1& 1+ &,12(% +,19% 2+L% %,&98

% +,1%4 2+L% 2,4844 +,189 & %,%2+4 +,21+ & %,2

Taela 6 alores de asor)*ncia a A nm $u(& e concentra!"o total de proteína naalíquota 2 $mg7ml&. olumes de alíquota 2 a usar na determina!"o de proteínatotal atra)és do método de Lo?r@D 6 l0 14 l0 21 l e 2 l. s )alores assinaladosa )ermelho n"o foram considerados para a determina!"o da concentra!"o total deproteína na alíquota 20 de modo a optimi'ar os c-lculos e diminuir o erroassociado.


Wl#A/sor<Sncia9

8+nm uA# Eactor dediluição


proteína naalíquota 2m"Uml#


proteína naalíquota 2mdia#m"Uml#

( +,1+4 1++L( +,22

+,&8(

( +,+(9 1++L( +,+9814 +,1%8 1++L( +,&9414 +,12& 1++L( +,49+21 +,18& 2++L21 +,92(21 +,18% 2++L21 +,91928 +,22 &+L( +,949

28 +,21 &+L( +,9+9Taela alores de asor)*ncia a A nm $u(& e concentra!"o total de proteína nafrac!"o B $mg7ml&. olumes de frac!"o B a usar na determina!"o de proteína totalatra)és do método de Lo?r@D 1 l0 2 l0 25 l e 3 l. s )alores assinalados a)ermelho n"o foram considerados para a determina!"o da concentra!"o total deproteína na frac!"o B0 de modo a optimi'ar os c-lculos e diminuir o erro associado.


Wl#

A/sor<Sncia9

8+nm uA#Eactor dediluição


proteína na7racção Bm"Uml#


proteína na7racção Bmdia#

m"Uml#1+ +,114 2+ +,&21

+,914

1+ +,12& 2+ +,9442+ +,18( 1+ +,9(+2+ +,181 1+ +,9%92& +,1(+ 8 +,4&2& +,222 8 +,9%%+ +,21 2+L% +,&99%+ +,21 2+L% +,&99

Taela Taela de purica!"o. <uantidade total de proteína0 coeciente de pure'ae rendimento0 em cada uma das frac!=es recolhidas ao longo da purica!"o.

Passo de Amostra *oncentr Holume Quantida *oefcie endime




12

purifcação

ação deproteínam"Uml#

ml#de de

proteínam"#

nte depureza nto ;#

*romato"rafa

*0*&2

Alíquota1 4,194 %4 141,&(4 +,%%8 1++

Precipitação com>4#2:

4

Alíquota2 +,&8( 1+2 &,8&& +,&( 42,%

>P?*Eracção

B +,914 %4 2+,89& +,(&8 14,(

Electroforese em gel de poliacrilamida em condi!=esdesnaturantes $;>;+:(GE&

Ap=s a electro7orese em "el de poliacrilamida 1&;# em condiçes

desnaturantes, corado com *oomassie Blue 2&+, possí<el determinar opeso molecular do citocromo c.

Figura 4 Gel de poliacrilamida $15& em condi!=es desnaturantes0 corado com,oomassie Blue 8+25. Lane 1D citocromo c padr"oH lane 2D proteínas padr"oH lane

3D alíquota 1H lane 4D amostra pura $frac!"o B&.

A o/ser<ação do "el o/tido por electro7orese em "el de poliacrilamidapermite in7erir so/re a mo/ilidade relati<a 7 # das proteínas padrãoZ amo/ilidade relati<a defnese como sendo a razão entre a distSnciapercorrida pela proteína e a distSncia percorrida pela 7rente do sol<ente. :<alor de 7 permite identifcar proteínas por comparação com padres.

A percenta"em de acrilamida no "el 1&;, ou seCa, a "ama demassas moleculares que o "el permite resol<er em $PA[V &(+ 5$a.*onsequentemente, não 7oram considerados os <alores de 7 e do lo"aritmo

da massa molecular da proteína de maior massa molecular.




1%

Taela 1 Coilidade relati)a e logaritmo da massa molecular das proteínaspadr"o. ( dist*ncia percorrida pela frente do sol)ente é 502 cm. s )aloresassinalados a )ermelho n"o foram considerados para a constru!"o da rectapadr"o.

Proteínas

padrão

$istSncia

percorridacm#

0o/ilidade

relati<a 7 #

0assa

molecular$a#

?o"aritmo da

massamolecular0osin +,% +,+&8 18844 &,2

β[alactosidas

e+,( +,1%& 11&(++ &,+9%

BA 1,%& +,29+ 9(4% 4,89:<al/umin 2,+& +,%4 &%&41 4,(2*ar/onic

An)drase 2,9 +,&++ %(1%4 4,&(+

o/ean TrpsinIn)i/itor

% +,&(( 21%4 4,494

?sozme %,& +,9(% 1&4+ 4,21Aprotinin 4,& +,89& 9+& %,8%

R possí<el <erifcar que e3iste uma relação linear entre o lo"aritmo damassa molecular e a mo/ilidade relati<a. Vsta relação usada paradeterminar a massa molecular do citocromo c utilizando uma recta decali/ração construída a partir de um conCunto de proteínas padrão de massamolecular con)ecida.

+ +.1 +.2 +.% +.4 +.& +.9 +.( +.8 +., 1

%.&

4

4.&

&

&.&

73# X 1.983 F &.%8

Y X +.,8

Logaritmo da massa molecular em fun!"o da moilidade relati)a $8f& para as proteínas padr"o + ,olora!"o com ('ul ,oomassie

8f

Log CC

Gr-co A 8ecta de calira!"o construída a partir de um conIunto de proteínaspadr"o de massa molecular conhecida. Logaritmo da massa molecular em fun!"oda moilidade relati)a. ponto assinalado a )ermelho n"o foi considerado para aconstru!"o da recta padr"o.

Taela 11 >etermina!"o da massa molecular do citocromo c.

Eracção $istSnciapercorrida

0o/ilidaderelati<a 7 #

0assamolecular

?o"aritmo damassa




14

cm# $a# molecularImpura

Alíquota 1# %,& +,(9+ 129(, 4,1+%Pura Eracção

B# 4 +,(9 12214,8 4,+8(

Electroforese em gel de poliacrilamida corado para detec!"ode hemos

Figura 5 Gel de poliacrilamida corado para detec!"o de hemos. Lane 1D citocromo c

padr"oH lane 2D proteínas padr"oH lane 3D alíquota 1H lane 4D amostra pura $frac!"oB&.

>etermina!"o do conteJdo em hemos

$e modo a determinar o conte6do em )emos por molcula deproteína, recorreuse ao mtodo da piridina )emocromo.

: n6mero de )emos por molcula de proteína determinado com/ase na a/sor<Sncia a &&+ nm de uma solução, reduzida com ditionito des=dio, contendo citocromo c, a:> e piridina e no coefciente de e3tinçãomolar para o )emo do tipo c 2,1 m01cm1#.

Taela 12 alores de asor)*ncia a 55 nm de uma solu!"o0 redu'ida com ditionito

de s/dio0 contendo citocromo c0 Ka9 e piridina e concentra!"o de hemos $mg7ml&.

?eitura

Eormaeduzida

Eactor dediluição

*oncentração de)emosm0#

*oncentração de)emosmdia#

m0#

*oncentração de)emosm"Uml#

A/or<Sncia&&+nm uA#

1 +,+4+ 4+ +,+&&+,+9% +,(12 +,+&+ 4+ +,+9

% +,+4( 4+ +,+9&

$eterminação do n6mero de )emos por molcula de proteína, usandouma amostra da 7racção mais pura de citocromoL




1&

Número de hemos por molécula de proteína= Concentração de hemos

Concentração de proteína

Número de hemos por molécula de proteína=0,791

0,614

Número de hemos por molécula de proteína=1,29

$iscussão

: "r-fco de espectroscopia OHUHis permite <erifcar os di7erentescomprimentos de onda a que a amostra a/sor<e, quer na 7orma o3idadaquer na 7orma reduzida. Vm todos os espectros o/tidos possí<el o/ser<arele<ada a/sor<Sncia a 28+ nm, característica de anis arom-ticos deproteínas, um pico a 42+ nm, re7erente ao "rupo )emo /anda de oret# eum outro a &&+ nm, específco de uma /anda menos intensa denominada/anda Q. A /anda de oret apresenta um m-3imo de a/sor<Sncia a 41+ nm

na 7orma o3idada, que deslocada para 42+ nm na 7orma reduzida.




19

Analisando o "r-fco 1 e a ta/ela 2, re7erentes G primeira alíquota, possí<el <erifcar que os comprimentos de onda em estudo sãopraticamente os mesmos para a 7orma o3idada e para a 7orma reduzida eque o espectro de am/as as 7ormas se encontra parcialmente so/reposto, oque permite concluir que, pro<a<elmente, a alíquota 1 na 7orma nati<a seencontra relati<amente reduzida, uma <ez que não 7oram <erifcadasalteraçes si"nifcati<as na presença de ditionito de s=dio.

elati<amente G ta/ela 2 e aos espectros da alíquota 2 "r-fco 2# eda 7racção B "r-fco 4# possí<el in7erir quanto G presença de citocromo cno estado o3idado e consequente passa"em ao estado reduzido, uma <ezque a /anda de oret na 7orma nati<a apresenta um m-3imo de a/sor<Snciaa 411 nm e quando reduzido so7re um des<io para <alores decomprimento de onda superiores, 41&nm.

Quando o citocromo c se encontra na 7orma reduzida possí<elo/ser<ar duas /andas Q, uma a &&+ nm característica das 7ormas o3idadae reduzida# e outra a &2+ nm característica da 7orma reduzida#. Assim, poran-lise conCunta de "r-fcos 1, 2 e 4 e da ta/ela 2, possí<el <erifcar que

as a/sor<Sncias a &2+ nm no estado nati<o e na 7orma reduzida nãoapresentam alteraçes si"nifcati<as, sendo possí<el concluir que a 7ormanati<a não se encontra totalmente o3idada.

Por comparação entre am/as as alíquotas e a 7racção B, <erifcaseque a 7racção B apresenta um deslocamento da /anda oret entre a 7ormanati<a e a 7orma reduzida e que a &2+ nm a 7orma o3idada apresenta umaa/sor<Sncia muito in7erior G de am/as as alíquotas, resultado indicador deque a 7racção B na 7orma nati<a apresenta uma maior quantidade decitocromo c.

Analisando o "el de poliacrilamida $# na presença de βmercaptoetanol f"ura &#, pode o/ser<arse, relati<amente ao poço %, uma/anda com arrastamento que corresponde G alíquota 1 e, no poço 4, uma/anda sem arrastamento que corresponde G 7racção B. : arrastamento<erifcado na alíquota 1 de<ese G presença de contaminantes,nomeadamente, outras proteínas. :s resultados o/tidos indicam queocorreu purifcação da alíquota 1 para a amostra B.

Atra<s da equação da recta o/tida no "r-fco 9, possí<el calcularos pesos moleculares das /andas o/ser<adas. Para a alíquota 1, 7oi o/tidauma massa molecular de 129(, $a, enquanto que para a 7racção B 7oio/tida uma massa molecular de 12214,8 $a, sendo esperado para ocitocromo c puro um peso molecular de 12,9 5$a, para o caso da espcieSaccharomyces cerevisiae.

Analisando os resultados o/tidos ap=s os di<ersos passos de

purifcação e7ectuados, possí<el concluir que a 7racção B a mais pura, noentanto, não a que apresenta uma massa molecular mais pr=3ima daesperada, uma <ez que o poço não se encontra direito, in\uenciando, destemodo, a determinação do peso molecular. Atra<s destes resultados,<erifcase uma "rande pro3imidade entre os resultados o/tidos e osesperados, sendo possí<el concluir que se conse"uiu purifcar o citocromo cde uma maneira efcaz.

A partir do "el corado para )emos podemos <er uma /anda com um"rande arrastamento no poço % e duas /andas no poço 4. Oma <ez que ocitocromo c na ausDncia de /mercaptoetanol tem tendDncia a ori"inardímeros, podemos <erifcar essa 7ormação com as duas /andas presentesno poço 4. Quanto G lar"a no poço % pode ser e3plicada

Analisando a ta/ela de purifcação ta/ela #, <erifcase que aconcentração de proteína e, consequentemente, a quantidade de proteína,




1(

diminui G medida que a purifcação decorre, o que C- era esperado, uma <ezque a purifcação utilizada de modo a e3cluir todas as proteínase3cedentes. : coefciente de pureza <ai aumentando, o que si"nifca que seest- a conse"uir purifcar a proteína pretendida, neste caso, o citocromo c.: coefciente de pureza o/tido 7oi +,(&8, si"nifcado de que a proteínapode não estar totalmente pura. o entanto, s= possí<el ter a certeza se ocitocromo c est- puro ou não, ao ser realizada uma electro7orese. Aelectro7orese e7ectuada permite in7erir quanto G pureza e concluir que aamostra se encontra praticamente pura, pois o arrastamento diminui/astante 7ace aos resultados o/tidos para as primeiras alíquotas. Quanto aorendimento, possí<el <erifcar que este diminui si"nifcati<amente, o que a/solutamente espect-<el, de<ido G presença de uma "rande quantidade deoutras proteínas inicialmente o rendimento inicial 7oi 42,%; e no 6ltimopasso de purifcação 7oi 14,(;#. [rande parte dessas proteínas 7orameliminadas e pro<-<el que se ten)a perdido al"um citocromo c ao lon"oda purifcação, de modo "arantir que se o/teria a proteína pura no fnal.

: coefciente de pureza permite, tam/m, a<aliar qual o passo de

purifcação mais efciente ao lon"o da purifcação, e, neste caso, possí<el<erifcar que 7oi a cromato"rafa por >P?*, pois 7oi onde )ou<e maior ta3ade purifcação em mel)or rendimento.

Vm relação ao n6mero de )emos, calculado atra<s da razão entre aconcentração de )emos e a concentração de proteína, <erifcase que seo/te<e 1,2 )emos, ou seCa, 1 )emo por molcula de citocromo c.




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*onclusão




1

Bi/lio"rafa

J1K 0oura I., Pereira A.Z ]Isolamento, purifcação e caracterização do

citocromo c de uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae^Z BioquímicaAnalítica I, Ano lecti<o 2++U2+1+

J2K 0oura I., Pereira A.Z ]Acetatos de Bioquímica Analítica^Z Eaculdade de*iDncias e Tecnolo"ia M Oni<ersidade o<a de ?is/oa

J%K Ber", _. 0., Tmocz5o, _. ?. e trer, ?.Z Bioc)emistr, & t). Vd. InternationalVdition. .̀ >. Ereeman and *ompan. e@ or5. 2++2

J4K `ilson, b., `al5er, _.Z Principles and Tec)niques o7 Bioc)emistr and0olecular Biolo", &t) Vd. 2++&

J&K )ttpLUU@@@.si"maaldric).comUli7escienceUmeta/olomicsUenzmee3plorerUlearnin"centerUctoc)romec.)tml

J9K )ttpLUUmetallo.scripps.eduUP:0IVU*T*.)tml

J(K )ttpLUU@@@%./iorad.com ]Protein tandards 7or Blottin"^

Relatório Bioquímica Analítica - Versão Final

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