UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS

RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA -

UTILIZAÇAO DA COLORIMETRIA NA DETERMINACAO DE PROTEINAS

Manaus – AM

Junho /2013

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ANA CAMILA DOS SANTOS SOUSA 21205148

LETÍCIA COUTINHO 21201255

RAYSSA LAMANIERE 21203555

RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA -

UTILIZAÇAO DA COLORIMETRIA NA DETERMINACAO DE PROTEINAS

Relatório solicitado pela professora Ila Maria, para obtenção de notas parciais para o 3º período.

Manaus – AM

Junho / 2013

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO __________________________________________________ 4

1.1 Método de biureto ____________________________________________ 4

1.2 Método de Kjeldhal (1880) ______________________________________ 4

1.3 Método turbidimétrico _________________________________________ 4

1.4 Método de Folin – Ciocalteau (1969)______________________________ 5

1.5 Método de Lowry (1951) _______________________________________ 5

1.6 Método de Bradford (1976) ____________________________________ 5

2 OBJETIVOS ___________________________________________________ 5

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES _____________________________________ 6

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ________________________________________ 8

5 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ___________________________________ 9

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1 INTRODUÇÃO

A colorimetria visa determinar a concentração de uma substância, em

condições bem definidas, pela medida da absorção de luz, tomando como referência a

absorção da substância numa concentração conhecida. A principal vantagem desse

método é de proporcionar um meio simples para determinar pequenas quantidades

de substâncias.

Entre os métodos colorimétricos destaca-se a espectrofotometria, um processo

analítico sensível, rápido, e cujos resultados são mais precisos, comumente utilizado na

determinação da concentração de constituintes biológicos.

1.1 Método do biureto:

Peptídeos reagem com o biureto em solução alcalina e em presença de solução

de sulfato de cobre diluída, formando um composto de cor púrpura-violeta. A cor

deve-se à ligação do átomo de Cu a quatro átomos de N das cadeias peptídicas. Este

método é simples para a quantificação da proteína total, mas requer de 20 a 40 mg de

proteínas.

1.2 Método de Kjeldhal (1880):

Consiste na queima total do material orgânico das amostras pela adição de

ácidos oxidantes fortes, sob temperaturas relativamente elevadas. Após completa

transformação dos compostos nitrogenados em sais de amônio, a mistura é

fortemente alcalinizada com NaOH, sendo a amônia recolhida com um volume

conhecido de ácido bórico (NH4H2BO3) e titulada com ácido clorídrico (HCl). A

quantidade calculada de nitrogênio encontrada por essa titulação é multiplicada por

um fator médio de 6,25 para fornecer a quantidade de proteína total presente na

amostra.

1.3 Método turbidimétrico:

Baseia-se na precipitação de proteínas em presença de um ácido. É o mais

rápido, levando em torno de 10-15 minutos. Porém nem todas as proteínas precipitam

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da mesma forma em presença de ácidos e substâncias como ácidos nucléicos também

podem precipitar.

1.4 Método de Folin – Ciocalteau (1969):

Este método é uma modificação do método de biureto, onde o cobre em meio

alcalino reage com a proteína formando um complexo (reação de Piotrowsky ou

biureto). Este complexo apresenta aminoácidos fenólicos que reduz o reagente de

Folin-Ciocalteau, dando uma cor azul. A intensidade da cor é máxima em pH 10 e é

medida espectrofotométricamente a 660 nm, após 30-120 minutos.

Trata-se de um método muito sensível, podendo analisar amostras de 5 mg de

proteínas, mas a amostra não pode ter a presença de fenóis.

1.5 Método de Lowry (1951):

Este método utiliza o soro humano diluído entre 100 a 1000 vezes, como

padrão. Em baixas concentrações a leitura é efetuada a 750 nm. Sua utilização é

sugerida como forma de eliminar fontes de erro pela desnaturação superficial que

ocorre com o BSA.

1.6 Método de Bradford (1976):

O método é baseado na ligação da proteína ao corante. O corante utilizado é o

Coomassie Brilliant Blue G-250, onde este reagente existe em duas formas coloridas

diferentes, vermelha e azul. A forma vermelha do reagente é convertida em azul após

a ligação do corante com a proteína, esta coloração ocorre em dois minutos após o

reagente ser adicionado e é estável por até uma hora (Bradford, 1976).

2 OBJETIVOS

• Determinação da curva padrão de uma solução de albumina bovina, utilizando

o método colorimétrico do Biureto.

• Determinar o teor de proteínas da clara do ovo.

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3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir do método do Biureto para a determinação da curva padrão, foi

utilizada uma solução de albumina bovina a 6% para o preparo das seguintes soluções

padrões de uso:

Concentração das Soluções Padrão de Uso

(%)

Volume das Soluções Padrão – Estoque de

Albumina 6% (L)

Volume de Água (L)

1% 50 L 250 L2% 100 L 200 L3% 150 L 150 L4% 200 L 100 L5% 250 L 50L6% 300 L 0 L

Posteriormente foram adicionados 100 L da solução padrão e 5 ml do reativo

de Biureto às soluções preparadas para determinar o teor de proteína nas mesmas.

Após a homogeneização e repouso, tais soluções foram analisadas em

espectrofotômetro a 550 nm. Foram observadas as seguintes absorbâncias:

A partir desses resultados, foi possível construir um gráfico com a curva padrão

da proteína:

Concentração Padrão de Albumina Absorbância

1% 0,0462% 0,13% 0,1544% 0,2065% 0,2666% 0,309

7

0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7%0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

f(x) = 5.32857142857143 x − 0.00633333333333336R² = 0.998876169480152

Curva Padrão da Proteína

Concentração da Solução Padrão (%)

Abso

rbân

cia (n

m)

Como observado, quanto maior a concentração de albumina bovina maior a

absorbância registrada pelo espectrofotômetro.

A clara do ovo foi diluída em solução de NaCl 0,9% na proporção de 1:3,

devido a globulina, uma proteína encontrada na clara do ovo, não ser solúvel em água

e somente em solução salina.

Logo em seguida, o aparelho foi zerado e a análise da amostra foi realizada,

utilizando 5 mL de Reativo de Biureto e 100µL da solução da clara do ovo diluída em

solução salina, e a leitura gerada foi de 0,178 nm.

Para a determinação do teor de proteínas da amostra (clara do ovo), utilizou-se

a equação de regressão obtida através da curva-padrão de proteína:

y = 5,46x – 0,0094

Onde y é a absorbância e x a concentração de proteína.

0.178 = 5,46x – 0,0094

5,46x = 0,178 + 0,0094

5,46x = 0,18748

X = 0,1874 / 5,46

X= 0,03%

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Com esse resultado baixo de teor protéico, segundo Burton foi possível

analisar que a alimentação da ave em questão era pouco enriquecida, ou que a ave

não era jovem.

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O método do biureto é bastante eficiente quando se deseja encontrar a

concentração de uma amostra de proteína. Com o auxílio de um espectrofotômetro e a

aplicação da lei de Lambert-Beer, observando a absorbância, e tendo outras soluções

para ser possível a produção da curva padrão da proteína ou possuir o coeficiente de

extinção molar (também chamado de coeficiente de absorção molar) que é constante

a um dado comprimento de onda.

Podemos afirmar, a partir da prática, que, levando-se em conta o mesmo

comprimento de onda e o mesmo comprimento da cubeta, a absorbância é

diretamente proporcional a concentração.

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5 REFERENCIAS BILIOGRÁFICAS

MAGALHÃES JR., J. L.. Correlação e regressão nas calculadoras – HP 12C e

Casio fx 82 TL/ML. Universidade Salgado de Oliveira. s.d.. Disponível em:

<http://netknow.mat.br/atividades/CorreRegresCalc.pdf> Acesso em: 19 de março de

2012.