RELACOESQUANTITATIVASENTREA ESTRUTURA QUfMICAE A ...
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BIBLIOTECA Faculdade deCiências Farmacêuticas Universidade de São Paulo UNIVERSIDADE DE sAo PAULO FACULDADE DE CIENCIAS FARMACEuTICAS Curso de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos Área de Insumos Farmacêuticos , RELACOESQUANTITATIVAS ENTREA ESTRUTURA QUfMICAE A ATIVIDADEANTIMICROBIANA DE ANÁLOGOSANIFUROXAZIDA LEOBERTO COSIA TAVARES Tese para obtençãodo grau de DOUTOR Orientador: Prafa.Dra.ANTONIATAVARESDOAMARA L " São Paulo 1993 !:g3 3 j.
Transcript of RELACOESQUANTITATIVASENTREA ESTRUTURA QUfMICAE A ...
BIBLIOTECAFaculdadedeCiênciasFarmacêuticas
Universidadede SãoPaulo
UNIVERSIDADE DE sAo PAULOFACULDADE DE CIENCIAS FARMACEuTICAS
Curso de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos
Área de Insumos Farmacêuticos
,
RELACOESQUANTITATIVASENTREA ESTRUTURAQUfMICAE A ATIVIDADEANTIMICROBIANADE
ANÁLOGOSA NIFUROXAZIDA
LEOBERTOCOSIA TAVARES
Tese para obtençãodo grau de
DOUTOR
Orientador:
Prafa.Dra.ANTONIATAVARESDOAMARAL
"
São Paulo
1993
!:g33 j.
LEOBERTOCOSTATAVARES
RELAÇÕES QUANllTA TlVAS ENTRE A ESTRUTURA
oufMICAE A ATMDADE ANllMICROBIANA
DEANÁLOGOSÀ NIFUROXAZlDA
TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR
COMISSÃO JULGADORA
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510 paulo.10de 05 de 1993
Este trabalho é dedicado ao meupall Manuel Tavarea, exemplode força e sabedoria
"O verdadeiro ato dadescoberta nAo consiste emencontrar novas terras, mas simem vê-las com novos olhos. 11
Proust
"Se você pensa que pode ousonha que pode, comece.Ousadia tem genlaJidade,poder emágica. Ouse fazer e o poder lheserá dado. H
Goethe
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y\~
AGRADF!JMfNTa
-À grande força universal que rege todos os dias de minha existência.
-À Profa. Dra. Antonia Tavares do Amaral pela orientação deste trabalho.
- À Faculdade de Ciências Farmacêuticas pela oportunidade e confiança
em mim deposttada.
-À Ieda Yur1ko Sonehara por sua amizade, apoio, sugestOes e pela
editoração deste trabalho.
-À Profa. Dra Teresa Cristina Vessoni Penna pela concessão das instala-
Ciões deseuslaboratóriospara a execuçãodos ensaiosbiológicos.
- À Irene AlexelvnaMashovllle pela amizadee orientaçãodecisiva na
execução dos ensaios microbiológicos.
- Aos estagiários,hoje amigos, Arthur Leme Neto, RosanaBatista dos
Santos,Luclanede Oliveirae CláudiaLéopelaindispensávelcolabora-
Ciãona execuçãodos ensaiosmlcroblológlcos.
- Ao amigo Yoshlnorl Mlyazakl pelo constante apoio e amizade.
-À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo. FAPESP.
pelo apoio concedido.
- À Moema Rodriguesdos Santos pela revisão das referências bibliog-ráficas.
- A todos os amigos que direta ou Indiretamente contrlbufram para a
execução do presente trabalho.
B'BLIOTECAFacWdadede Ciências Farmacêuticas
~de de São PauJo
tNDICE
CAP1T~1P I - APRESENTAÇAO 1
CAPÍTULO 11 -RI!VISÃO DA UTeRATURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . 4
1-AL.GUNSASPECTOSDOSCOMPOSTOS5-NITROFURÂNICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
2- INTRODuçÃOAO QSAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3-PROPRIEDADESFfslCO..QufMICASQUECONDICIONAMAAÇÃODE FÁRMACOS 20
31. PARÂMETROSELETRÔNICOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.,.1-EQUAÇÃODEHAMMElT 2'1
3.1.2-EQUAÇÃODEHAMMETTEXPANDIDA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.,.3-CORREÇÓESDACONSTANTESIGMADEHAMMETT. . . . . . . . . . . . . . 26
3.1.4-0UTROSPARÂMETROSELETRÔNICOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.2-PARÂMETROSHIDROFÓSICOS ,... 29
3.2.1-COEFICIENTEDEPARTIçÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.22-oPARÂMemO"DEHANSCH 35
3.2.3-ACONSTANTE/DEREKKER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
33- PARÂMETROSESTÉRICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.3.1-PARÃMETROSQuiMICOSEFíSICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
33.2-PARÂMETROSGEOMÉTRICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.4-0UTROSPARÃMETROSESTRUTURAlS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.4.1-REFRATIVIDADEMOLAR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.4.2-PARACOR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.4.3-CONECTIVIDADE MOLECULAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
0ARÂMETROSQUEEXPRESSAMAATMDADEBIOlÓGlCA . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 444.1-TIPOSDEENSAIOSBIOlÓGICOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.2-CARACTEAíSTICASDE UMENSAIOBIOlÓGICOIDEAL. . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.3-PARÂMETROSBIOlÓGICOSEMPREGADOSEMES1\JDOSDEQSAR . . . . . . . . . 46
~SARNO PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
6.1.ESTRATÉ()!ASPARAADEFINIÇAo DE SÉRIES DE COMPOSTOS ADEQUADAS
AOESTUDODEQSAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . !1
!5.1.'-INTERCORRELAÇÃODEPARÂMETROS.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . !2
61.2- MÉTODOS DE 011MIZAÇAo DE ATMDADE BIOLOOICA . . . . . . . . . . . . 62
!5.'.3-0MÉTODODE FREE-WlLSON !53
!5.2-MODELOS ESTATÍS11COSUTlUZADOS EM QSAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . !53
!5.2.,- MODELO U NEAR , 54
5,2.2-MODELOPARABÓUCO 66
!5.2.3-MODELO BIUNEAR !56
!5.2.4-AVALlAÇÃODAEFICIÊNCIADOSDlFERENTES MODELOS. . . . . . . . . . !56
CAPt"rULO111- OBJETIVO,JUSTIFICATIVAE PLANODETRABALHO. . . . . . . . . . . . sg
,- OBJETIVO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2-JUSTIFICATIVA.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S1
3-PLANODETRABALHO.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S2
CAPt"rULO IV - PARTEEXPERIMENTAL.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
,- MAiERIAIS S!)
1.1.COMPOSTOSPREPARADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S6
1.2-REAGENTES E SOL VENTES , 66
'.3-MICRORGANISMOEMEIOSDECULTURA """""""""""" se
2-MÉTODOS.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.1. ~ODO DE OBTENÇÃO DE 5-NITRO-2-F'-RFLAIUCENO BENZlDRAZJDAS
X3,X4.X!5-SUBSTmJÍDAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.2.ANAusES FfsICO.QuíMICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
2.~ DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE DEPARTIçÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.4- MhODO DE N\lÁUSE SISTEMÁ11CA DA POSIÇÃO DA BN\O\ DE ABSORÇÃODOGRUPOCARBONILANAAEGIÃODOINFRAVERMELHO .. . . . . . . . . . . . . . 75
2.5-MÉTODODEDETERMINAÇÃODACONCENTRAÇÃOMfNIMANIBITÓRIA . . . . . . . 76
2.6- ANÁUSE DEFE~ESSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8j
3-EXPERIMENTOSREAUZADOS ..,.,...,.".,.."..",."", e1
. 31.PREPAAACÔESEFETUADAS. . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e1
3.1,1. PREPARAÇÃODAs-NITAO~-FURFURIUDENOBENZJDRAZlDA. . . . . . . , e1
3.1.2-PREPARAÇÃODA5-NITRO-2-FURFURIUDENO4-HlDROXt-BENZlDAAZlDA. 82
3.1.3- PREPARAÇÃO DA s-NITAO.2-FURFURIUDENO 4-8ROMO.BENZlDAAZlDA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
3.1.4-PREPARAÇÃODAs-NITAO-2-FURFURIUDENO4-CLORO.BENZlDAAZlDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.1.6-PREPARAÇÃODA6-NITAO-2-FURFURIUDENO4-AMINO-BENZlDAAZlDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~
3.1.6- PREPARAÇÃO DA s-NITAO.2-FURFURIUDENO4-METlL.BENZlDAAZlDA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . as
3.1.7. PREPARAÇÃODA s-NITAO-2-FURFURIUDENO4-METOXl-BENZlDAAZlDA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . as
3.1.8-PREPARAÇÃODA 6-NITAO~-FURFURIUDENO 4-NfTRO-BENZlDRAZlDA. . . 87
3.1.9-PREPARAÇÃODA5-NrrRO-2-FURFURIUDENO4-ETOXl-BENZlDAAZlDA. . . se
3.1.1 o-PREPARAÇÃO DA 5-NITRO-2-FURFURIUDENO 4-ACETlL-BENZlDRAZlDA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . , 89
3.1.11- PREPARAÇÃODA 5-NrrRO-2-FURFURIUDENO4-TRIFLUOROMETIL-BENZJDRAZlDA """""""""""'" 9:)
3.1.12- PREPARAÇÃODA 5-NITRO-2-FURFURJUDENO4-(N,N-DIMETIlAMINO)-BENZlDRAZlDA 91
3.1.13- PREPARAÇÃODA5-NrrRO-2-FURFURIUDENO 4-SULFAMOIL-BENZlD~A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
3.1.14- PREPARAÇÃO DA 5-NrrRO-2-FURFURIUDENO 3,4,5-TRIMETOXl-BENZlDRA2JDA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
3.2-DETERMINAÇÃODOCOEFICIENTEDE PARllçÁO DOS COMPOSTOSOBTIDOS. . . 93
3.3-DETERMINAÇÃOSISTEMÁTICADAFREQUÊNCIADEABSORÇÃODOGRUPOc:ARBONILA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.4-DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MíNIMAINIBITÓRIADOS COMPOSTOS
OB11DOS: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
CAP1'TuLOV - RESULTADOS.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 07
1-COMPOSTOSOBTIDOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
1.1.-5-NITRO-2-FURFURlUDENOBENZlDAAZlDA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
1.2- 5-NrTRO-2~URFURIUDENO 4-HIDROXl-BENZlDRAZlDA . . . . . . . . . . . . . . . . . e9
1.~ 6-NITRO-2-FURFURIUDENO 4-8ROMO-BENZlDRAZlDA . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
1.4-5-NITRO-2-FURFURIUDENO~LORO-BENZlDRAZlDA 101
1.5-6-NITRO-2-FURFURIUDENO4-AMINO-BENZlDRAZlDA. . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
1.6-6-NrTRO-2-FURFURIUDENO4-METlL-BENZlDRAZlDA. . . . . . . . . . . . . . . . . .103
1.7-5-NITRO-2-FURFURIUDENO4-METOXl-BENZlDRAZlDA. . . . . . . . . . . . . . . . .104
1.8- 5-NITRO-2-FURFURIUDENO ~ITRO-BENZlDRAZlDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
1.9- 6-NITRO-2-FURFURIUDENO 4-ETOXl-BENZlDRAZlDA . . . . . . . . . . . . . . . . . .1OS
1.1O-5-NITRO-2-FURFURIUDENO 4-ACETlL-BENZlDRAZlDA . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
1.11- 5-NITRO-2-F~F~IUI:EN04-TRIFWORav1ETIL-BENZla:\AZIDA .100
1.12- 6-NITRO-2-FL.RF~IUDENO~(N.N.QM:TILAMNO)-BENZlDRAZlDA 1(9
1.13- 5-NITRO-2-FLRFLRIU!:eN04-SULFA'v10IL-BENZlCAAZlDA. . . . . . . . . . . . . .110
1.14- 5-NITRO-2-F~F~IUI:EN03,4.S-TRIMETOXI-BENZla:\AZIDA .111
2.COEFICIENTEDEPAR11ÇÃODOSCOMPOSTOSOBi1DOS .112
3-FREQÜÊNCIADEABSORÇÃODOGRUPOCARBONILA .119
4- CONCENTRAÇÃOMíNIMAINIBrrÓRIADOS COMPOSTOS OBTIDOS. . . . . . . . . . . . . . 134, -
CAPITULOVI- OISCUSSAO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .138
1.PREPARAÇÃOEIDENTIFICAÇÃODOSCOMPOSTOS. .139
2-DETERMINAÇÃODEPARÂMETROSESTRUTURAlS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .146
2.1- EFEITOS DE SUBSTlTU/NTES SOBRE A POSiÇÃO DE ABSORÇÃO DO GRUPO
CARBONILADE 5-NrTRO-2-FURFURIUDENO BENZlDRAZlDAS
X3X4.Xs-SUBS11TUfDAS.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .146
2.2- EFEITO DE SUBSTITUINTES SOBRE O COEFICIENTE DE PARTIçÃO DE
6-NITRO-2-FURFURIUDENO BENZlDRAZlDAS X3.x...Xs-SUBsmuíDAS . . . . . . . . .160
3-PARÂMETROBIOLÓGICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .151
4-RELAÇÕESQUANTITATIVASESTRUTURA-ATIVIDADE 162
CAPÍTULOVU- CONCLUSÕES.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .171
~~ r:~SUMMARY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
AEFER!NCIAS BIBtJOO~FICAS 177
INDICE DE TABELAS
TABELA1 Derivado, 5-nitrofur&nioosutilizados em mediolna: estrutura qurmloa,nomeoficial. nomes comerciais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
TABELA2 Atividadefarmaool6gloa e toxJool6gioade alguna oompoatos nitrofurânlooa . . . . . '0
TABELA3 Estrutura e valorta de oonoentraço mínimainibitória,MIC,de análogos
à nifuroxazidafrente a algumas enterobactérias. determinados pelo método de
dllulçAosuoeulvaemtubos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,2
TA8ELA 4 Tipos de ligações químicase respectivas energias envolvidas nas interações
firmaoo-reoeptor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,7TABELA6 Exemplos de aplicação do modelo de HANSCHe FWrrA na descrição das
relaç~.s quantittrtlvu.strutura. aWidad. d. oompostoabiologioamenteativos. . . , 9
TA8ELA e Valores selecionados das constantes s de Hammett em posição pBfB e meta, e
das oonstantes0'1e O'R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
TABELA7 Valores selecionados de constames de grupo de subs1ituintesfreqüentememe
presentes emfármaoos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . :i:!e
TABELA8 Valores selecionados do parâmetro 1f de Hansch relativos a grupos8ubstituintes em 8istemas benzêníoos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3S
TABELA9 Valores selecionados de refratividade molar de grupos subs1:ituintes
freqüentemente presente a em fármaoos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
TABELA10 Faixas de fusão, pesoa moleoulares e fórmulas mrnimasde5-nitro-2.furfurilidenobenzidrazidas X3.X4.XS-eubS'tituídas. . . . . . . . . . . . . . . . es
TABELA 11 Etapas envolvidas na purifioaçãode ~ mLd. 1-ootanol . . . . . . . . . . . . . . . 72
TABELA12 Condições d. registro para determinação aimmirtíca da posição da banda de
absorção do grupo carbonOana região do infra-vermelhoda série de ~itro-2..furfurilidenobenzidrazidas subs1ituídas ,... 7S
TA8ELA 13 Volumes utilizadosna determinação da concentração mínimainibitória:FASE H ... 79
TA8ELA 14 Determinação do coeficiente de partição da ~itro-2.furfurilideno
4-nitro-benzidrazida obtido pelo método ~ ahake.fluk utilizandoo ai~ma
, -octanol!tampAofoafato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1'3
TABELA 1S DeterminaçAo do co~olente de par1içAo da 5-nitro-2.furfurilideno
2-benzidrazida obtido pelo método de shaJce-flask utilizando o sistema
1-octanolltampãofosfato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
TABELA1O Oetermlne.~Aodo ootfloltm. dt pN1i~'o de.5-n1tro-2.furfunlidtno
4-metoxi~.nzidrazida obtido pelo método de shake-flask utilizandoo eistems
, -octanol/tampãofoafato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ."!5
TAI!~LA17 Determinação do coeficiente de partição da 5-nitro-2.furfurilideno4-hidroxi~enzidrazida obtido pelo método de shBke-flask utilizandoo sistema
, -ootMolltampãofo8hrto , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ."6
TABELA18 Determinação do ooeficientede partição da 5-nitro-2.furfurilideno
4-emino-benzldrede. obtido pelo m.todo d. shal«t-flask utilizandoo alateme.
, -octanolltampãofosfeto ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ." 7
TABELA 19 Valores de ooefioiente de par1i~Aode 6-nltro-2.furfurilideno benzidrazidas
Xa.X4.X5-substituídas determinados pelo método de shake-flask utiliZE.l1doo
almme. , -ootMol!Wnpão foahrto. ooefiolentes d. pN'tiçAo oc.louladoa p.lo
CLogP Program e respectivos valores de 1(;de Hansoh , 11e
TABElA 20 Freqüênoie. de absorção do grupo oarbonOa da tX'Iitro-2..furfurilideno
4-nitro~enzidrazida emDMSO na região do infravermelho '20
TABELA21 Freqüênoia d. abaorçAo do grupo oarbonile.de.tX'Iitro-2.furfurilid.no
~romo~enzidrazida emDMSOna regiãodo infravermelho '21
TABELA 22 Freqüênoia de absorção do grupo oarbonile. de. 6-nitro-2..furfurilideno
4-cloro~enzidrazida emDMSO na região do intravermelho . . . . . . . . . . . . . .'22
TABELA 23 Freqüênoia d. absorção do grupo oarbonlle. de. tX'Iitro-2..furfunlideno
benzidrazida em DMSO na região do infravermelho 123
TABELA24 Freqüênoia de absorção do grupo oarbonila da 5-nitro-2..furfurilideno
4-metil~enzidrazidaemDMSOna regiãodo infravermelho 124
TABELA 26 Freqüênoia de absorção do grupo oarbonila da tX'Iitro-2..furfurilideno
4-metoxi~enzjdrazida em DMSO naregiãodoinfravermelho ,2!5
TABELA 2S Freqüência de absorção do grupo carbonila da 5-nitro-2..furfurilideno
4-hidroxi-benzidrazida em DMSO na região do infravermelho '26
TABELA27 Freqüência de absorção do grupo carbonna da 5-nitro-2.furfurilideno
4-amino-benzidrc.zide.emDMSOna reglAodo Infrevermelho '27
TABELA 28 Freqüênoia de absorção do grupo carbonila da 5-nitro-2..furfurilideno
Wtoxi-benzidrazida emOMSO ne.reglAodo infrevermelho '28
TABELA 29 Freqüência de absorção do grupo carbonOa da 5-nitro-2..furfurilideno
4-t'iftuorometil-benzidrazide. em OMSO ne.regiãodo Inhvermelho . . . . . . . . . .,:c9
TABELA 30 Fr.qü.nol~ d. aboorçAo do grupo oarbonll~d~ ~ltro.2~rilid.no
4-(N,N-dimetilamino)-benzidrazida em DM60 na região do jnfravermelho . . . . . .1X>
TABELA31 Fr.qü.nol~ d. aboo~Ao do grupo oarbonlla d~ 6-nltro-2.furlurilldeno
4-8ulfamoil-benzidrazidaem DMSOna região do infravermelho 13'1
TABELA32 Freqü'nol~ d. aboorçAo do grupo oarbonlla d~ 6-nltro-2.furfurilldeno
3,4,!5-trimetoxi-benzidrazidaem DM60 na região do infravermelho 132
TABELA33 Freqüênoias de abso~ão em om-1do grupo oarbonila,vc-o, de
5-nitro-2..furfurilidenobenzidrazidas X3,X4,Xs-substituídasdeterminadas em
aoluçAod. DMSO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .133
TABELA 34 Concentração mínima inibitória, MIC, de 5-nitro-2..furfurilideno benzidrazidas
X3.X4,X5-&ubstiturdas frente a oepa de S. aureus ATCC 25923 determinada pelo
mé1Ddode diluição sucessiva -FASE I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .135
TABELA35 Concentração mínimaInibitória,MIC,d. 5-nltro-2.furfurilid.nobenzldrQldM
X3,X4,X!5-substituídasfrente a cepa de S. Bi.JteUSATCC25923 determinada pelo
mé1Ddode diluiçãosucessiva - FASE 11 136
TABELA 36 Concentração mínima inibitória, MIC, de 5-nitro-2..furfurilidenobenzidrazidas
X3.X4,X5-0ubatituídaa frente a o.pa d. S. 811(008ATCC 25923 dmrmin8da pelo
mé1Ddo de diluição euoessiva - FASE 111 137
TABELA37 Freqüênoia de abeo~ão do grupo oarbonila de 5-nitro-2.furfurilideno
benzldrazidaa X3,X",X5"8uba1itídaadmrrnlnadas em DMSOe valorea de O'pdeHammett . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
TABELA38 Valores de comprimento de onda e de coeficientede extinção molar de
5-nitro-2..furfunlidenobenzidrazidasXs,>c"'Xs-substituídasdeterminadosemtampAofoafatopré~atur8do oom 1oQctenol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .152
pTABELA39Ialores de coeficiente de partição experimental,calculado e estimado e valores
de p caloulado e estimado de &n11ro-2.furfurilidenobenzidrazidas
XaX4.X5-substituídas 156
TABELA40 Potjnola an1imloroblanade 5-nitro-2.furfurilid.nob.nzldrazidM X3,X...Xs-
substituídas frente a cepa de S. auteUsATCC~ determinada com base no
método de dilui9êoeuoeselva 1SO
TABELA 41 ApfJcação do método stepwise aos valores de potência antimicrobiana de
5-n11ro-2.furfurilid.no benzldrazidaa Xs.X",X5-eubatltuídas, em função de
parâmetros estruturais utilizando-se o modelo parabólico. . . . . . . . . . . . . . . 1S6
II
111
II
IIIIII
III
III111
III111
II
II
111
II
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111111
IIIII
IIII
II111
11
II
TABELA 42 Aplloaç60 do mttodo attpwlOt aoa valo,..a dt p0t6nola antimioroblana dt
5-nitro-2.furfurilideno benzidrazidas X3.X"~8ub8tituída8 em função de
parâmetro!. 881ruturai&combinados dois a doi!., utilizando-fse o modelo
parab61100 '67
TABELA DE SfMBOL08
U.V.: ultraviolem
ÂIDiIX:comprimento de onda máximo
E: coeficiente de extinção molar
logP: coeficiente de partição
logPapp: coeficiente de partição aparente
ClogP: coeficiente de partição calculadopelo eLegI' Program
V(cm-l): freqüência de absorção na região do infravennelho em cm-1
Vc=o: freqüência de absorção do grupo carbonila no infravermelho em cm-1
v~=o I média de freqüência de absorção do grupo camonila no infravermelho em cm-1
1J: rendimento
P.F.: ponto de fusão
P.E. : ponto de ebulição
MIC: concentração mínima inibitória
log1f,uMol: potência antimicrobiana
I.V.: infravermelho
RMN-IH: ressonância magnéticaprotônica
RMN-13C: ressonância magnética de camono 13
q: constante de grupo de Hammett
1C:constante de hidrofobicidade de Hansch
MR: refratividade molar
MR4: refratividade molar do substituinte em posição 4.
LMR: somatória dos valores de refratividade molar dos substitintes em posição 3,4 e 5
Pr: paracor
X: conectividade molecular
F : constanteF de Swaine Lupton
R : constante R de Swaine Lupton
f: constante fragmentar de Rekker
n
II1
III
II
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111
1111I1I111
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II
IIII
111
111
111
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111
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CAPiTULO I
-APRESENTAÇAO
111
II1
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II
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I~
II
A introdução de fármacos novos no arsenal terapêutico, além de, I
' d 54s" Pscr mUIto oncrosa tcm atua mcntc pouca pcr&pcctJva e sucesso' -, or esta
razão, a tendência atual na busca de novos fármacos volta-se para as técnicas
de modificação molecular racionalmente dirigidas54,55.72.90.112,que toma como
base compostos com reconhecida atividade farmacológica, visando a identifi-
cação de análogos mais ativos, menos t6xicos ou mais seletivos do que o
com pos to de pa rtida 72.112,
Entre as diversas abordagens descritas na literatura, destaca-se o
estudo das relações quantitativas estrutura-atividade, QSAR, que visa deter-
minar de forma quantitativa a influência de propriedades físico-químicas sobre
a atividade biol6gica em séries de compostos análogos, sendo possível, a partir
disto, o planejamento racional de análogos mais adequados às necessidades da
medicina atuaI5S,72,90,119,
Segundo FRETER33, uma em cada grupo de vinte e cinco substân-
cias aprovadas pelo Food and Drug Admistration, FDA, em 1985, foi obtida
por planejamento racional. Esta proporção, no entanto, tende a diminuir em
razão do próprio desenvolvimento científico, dos altos custos envolvidos na
descoberta de novos fármacos através do emprego de métodos tradicionais e
da necessidade de se identificar fármacos mais eficientes num prazo relativa-
mente curto de tempo.
A antibioticoterapia se apresenta como um,dos procedimentos de
maior suceptibilidade à ineficiência progressiva de seus agentes farmacológi-
cosss, Isto ocorre em função de freqüentes inadequações na indicação e dose
terapêutica18, bem como pela capacidade de desenvolvimento de mecanismos
bioquímicos de resistência bacteriana a estes agentes54,SS,Estes dois fatores
tem determinado a emergência de um grande número de microrganismos
patogênicos resistentes a diversos antibióticos atualmente disponíveis na clí-
nica médica. Assim, a busca de novos agentes antimicrobianos torna-se abso-
lutamente necessária~ uma vez que o tratamento de infecções causadas por
germes com am pIo espectro de resistência tem se tornado cada vez mais difícil.
Neste contexto identifica-se a nifuroxazida (5-nitro-2-furfurilide-
no 4-hidroxi-benzidrazida), que é empregada como agente de segunda ou
terceira escolha no tratamento de infecções intestinais23, Este fármaco, apesar
2
IIII
II1
d~ possuir baixa potência antimicrobianat apresenta algum 8Scaracterísticas de
interesse farmacológico tais como baixa toxicidade2ü.21.81, amplo espectro de
açã013.&O.&6e incapacidade de provocar o desenvolvimento de resistência bac-
teriana5. Além destas característicast a estrutura química da nifuroxazida apre-
senta-se adequada para o estudo e estabelecimento das relações quantitativas
entre a estrutura quím ica e a atividade biol6gica, QSAR, o que. poderá vir a
ampliar as atuais possibilidades de combate a infecções intestinais com alto
nível de resistência, através da proposição de an:ílogos com maior potência
1I
antimicrobiana.
'"lU
Apresenta-se, a seguirt uma revisão bibliográfica dos diversos
aspectos envolvidos n~ste estudo, com o objetivo de fornecer subsídios para
uma melhor compreensão do presente trabalho.
1I
II11Ili'111II111
li'
III
li'
li'
I~111
1IlU
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111
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111
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CAPITU LO 11
I~
REVISÃO DALITERATURA
111111111
II
IIII
II
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IIIIII[I
li
1- ALGUNS ASPECTOS DOS COMPOSTOS &-NITROFURÂNICOS
Desde a introdução da nitrofurazona por DODD e STILLMAN24
em 1944, também reinvidicada por GILLER79, centenas de compostos deriva-
dos do S-nitrofurano foram sintetizados e avaliados quanto à sua atividade
antimicrobiana, observando-se que a maioria dos derivados ativos, agiam tanto
sobre bactérias Oram negativas como sobre Oram positivas e algumas vezes
sobre protozoário,e,s-s,79.
Entre as diversas classes de agentes antimicrobianos atualmente
disponíveis encontram-se os derivados S-nitrofurânicos, cuja utilização em
medidna humana e veterinária remonta há mais de quatro décadastS. Estes
compostos não ocorrem na natureza e se caracterizam, a nível estrutural, pela
presença de um anel furânico substituído na posição S pelo grupo nitro13,8o.
Apesar do grande número de compostos derivados do S-nitrofu-
ran013,86descritos na literatura, apenas alguns são utilizados na prática médica.
Isto se deve ao fato de muitos não apresentarem atividade farmacológica de
interesse e/ou toxicidade compatível com a condição de fármaco6,13,54,80,86.
Entre os derivados S-nitrofurânicos aceitos na medicina atual,
encontram-se a nitrofurantoína, a nitrofurazonat a furazolidonat o nifurtimox,
o nifuratel e a nifuroxazida que são empregados principalmente como antimi-
crobianos de amplo espectroCl.S4,SS.
A furazolidona e a nifuroxazida são empregadas no combate a
infecções do trato gastro-intestinal causadas por bactérias e protozoários,
enquanto que a nitrofurantoína e o nifuratel são em pregados em infecções do
trato urinário causadas principalmente por bactérias Oram negativas ou pro-
tozoários. A nitrofurazona é empregada no tratamento de infecções dermato-
lógicas causadas por bactérias e na prevenção de infecções de áreas ulceradas,
queimadas ou enxertadas. O nifurtimox é utilizado como agente tripanossomi-
cida, sendo uma das poucas opções disponíveis para o tratamento da doença
de ChagastS,S4.
Além do grupo S-nitrofurânico, os compostos udlizados na prática
médica apresentam em comum o grupo azometínico, -C= N-N,ligado ao carbo-
!
-u- u_----
II
no 2 do anel S-nitrofurânico13,80,86.Este grupo por si 16 desempenha atividade
antimicrobiana levando provavelmente, a um sinergismo farmacológico entre
estas duas aub-estruturas'5.
Apresenta-se na tabela 1 as estruturas químicas dos principais
derivados S-nitrofurâniços atualmente utilizados em mediçjna23.S4,ss.
II
6
II
III
II111
II
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II
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II
II
111
II111
II
IIIII
111
111
II
TA.Bm.A 1
Derivado~ !-nitrofurânico~ utilizado~ em medicina'
e5trutura química,nome oficia! e nomes comerciais
R,NJ).-No..
7
R NOME OFICIAL NOME COMERCIAL
Ho-@--i:°Furljden
NIFUROXAZIDA Passifurjl-MucjfurilH
O Furadantina
H"NN/ NITROFURANTOíNA Macrodantina
O)--JUroclidin
OF .
H NÁN-uraClm
NI1ROFURAZONA Furazona2 ,H
Furcxcna
°Ü/FURAZOLlDONA Giarlan
Lambljl
O
O-Macmiror
NIFURATELOmnes
;s J---J
r-\OS N- NIFURTlMOX Lampit2
ARNJS2 em 1952, demonstrou que OJcompostos 5-nitrofurinicos
podem desenvolver resistência bacteriana em testes realizados em laboratório
mas não em condições clínicas.
AVRIL et aUis em 1980, observaram que a administração oral da
nifuroxazida não rondiciona o desenvolvimento de mecanismos de resistência
microbiana causada por transferência de plasmfdeos. Esta propriedade é de
grande importância clínica, uma vez que estas substâncias podem vir a ser
empregadas em infecções causadas por bactérias com alto nível de resistência
aos antibi6ticos atualmente disponíveis sem resultar, no entanto, em amplia-
ção do espectro de resistência das bactérias.
A ação farmacológica dos derivados S-nitrofurânicos resulta de
sua interferência com a degradação de carboidratos via ácido pirúvico54. Isto
ocorre provavelmente através do bloqueio da acetilação da coenzima A, CoA,
impedindo desta forma a produção de energia, de acordo com o esquema
apresentado na figura 154.
- t~ ~ AcldosGraxoso co~ o ,
11 P 2H 11 Cicio doH~-C-C . H3C-C-S-CoA r Cllrato-
'o. AcldoCllico
N/trotn nos OxaJacetato.
Figura 1: In~rferinola de derivado. 6-nltrofurinlo08 na oaaoata
enzlmirtica d. degradaçAo do 6oldoplrúvico
A atividade antimicrobiana dos derivados S-nitrofurinicos parece
estar envolvida com a inibição dos sistemas piruvato desidrogenase, piruvato
descarboxilase, citrato sintetase, malato desidrogenase e glutation8 redutase54.
Estes compostos também têm sido descritos como inibidores de enzimas en-
volvidas com a síntese da parede celular, apesar deste não ser o mecanismo
primário de sua ação6.54.121.
8
1I
HERLJCH e SCHWEJOER49 em 1976, atribuíram o efeito anti-
bacteriano dos derivados 5-nitrofurânicos à sua capacidade de causar lesão no
DNA bacteriano, bem como à inibição do sistema enzimático de reparo dessas
lesóes.
111
o potencial cancerígeno de derivados S-nitrofurânicos foi eviden-
ciado com o trabalho de MORRJS et am'i, que relataram a atividade carcino-
gênica de cinco derivados 5-nitrofurânicos, em ratos tratados com 0,1 - 0,3%
do composto a ser testado em sua dieta. Este trabalho desencadeou uma
considerável quantidade de investigações a respeito das capacidades mutagê-
nica e carcinogênica destes compostos, bem como a respeito do mecanismo
bioquímico responsável por esses efeitos20.21.84.
1I
1IOutros estudos demonstraram que o grupo nitro em posição 5 no
anel furânico é essencial para a atividade antimicrobiana, e que sua redução
aos grupos hidroxilamina, -NHOH, e amina, -NH2' resulta em metabólitos
que causam ruptura cromossômica desencadeando deste modo, a atividade
mutagênica13.17.114.Esta teoria foi confirmada pela observação de mutantes
bacterianos com baixo nível de nitroredutases que se mostraram resistentes ao
efeito mutagênico dos derivados S-nitrofurânicos 77,108.
111
'"
111
1I
A biotransformação do anel S-nitrofurânico ocorre na membrana
celular e envolve a redução do grupo nitro seguido pela hidrólise do grupo
azometínico, resultando em ácido S-nitrofuróico que é excretado por via renal.
Pode também ocorrer cisão do anel furânico com posterior fragmentação,
resultando em metabólitos fisiologicamente assimiláveisl3.80.
BENDER E PAUL' em 1951, verificaram que a concentração da
nitrofurazona diminui quando incubada com alguns tecidos animais tais como
intestinos, fígado, rins, pulmão, baço e coração, sugerindo a degradação do
fármaco com reabsorção dos metabólitos. Mais tarde, estes mesmos autores,
verificaram que compostos derivados do 5-nitrofurano nio sofrem decomposi-
ção no sangue80.
1I
II
1I A utilização dos com postos S-nitrofurânicos varia de acordo com
sua solubilidade em água. A nitrofurantoína, por exemplo, quando administra-
da por via oral é rapidamente absorvida pelo trato gastro-intestinaJ. Em razio
porém da rápida depuração plasmática, a concentração sangüínea não atinge
9
o nível necessáriopara o duempenho de sua atividade antimicrobiana'o. Este
fármaco, por outro lido, por ser muito hidrofílico. se acumula na urina em
concentrações muitaJ vczes superior à sua concentração mínima inibitória13.80.
Esta propriedade determinou sua utilização como agente antimicrobiano em-
pregado preferencialmente no tratamento dc infecçõcs do sbtema urinário.
Diferentemente da nitrofuranto{na, a nifuroxazida ~ utilizada no
tratamento de infecções do trato gastro-intestinal, devendo-se este fato à sua
não absorção em função do seu caráter altamente hidrofóbic062,8..
Apresenta-se na tabela 2 valores de concentração mínima inibitó-
ria e dose letal 50% de alguns derivados do 5-nitrofurano utilizados na prática
médica.
TABELA e
Atividade farmacológica e toxicológica de alguns compo8'tO&ni1rofurânicoa
. BI-OBBlD et a1li.Pbarm. Re8. v.l, p.42-43, 19.5..MIURAet at 'roer- Med.Chem.v.S, p.320-3'l, 1967
o surgimento de sucedâneos mais ativos e menos tóxicos na d~ca-
da de 60 provocou decHnio na utilização da nifuroxazida em medicina humana.
No Brasil, cntretanto, a nifuroxazida ainda ~ cncontrada em duas aprcsentaçõ-
cs para uso humano23 que são comercializadas com os nomes Furtidene e
PauifurU.. Sua utilizaçio em mcdicina veterinária é ainda bastante apreciada.
10
. ..COMPOSTO MIC,"gJm em D (mg/Kg)
S. aUfeus em camundongos
nlfuronzlda 1,6 -
furazolldona 1,9 4.543
nltraturanto1na 3,1 895
nltrofurazonl - 145
DAYAN et alli2O,21em 1985, estudando o efeito gen~tico da nifu-
roxazida in vitro, concluiram que esta substâDcia desempenha atividade muta-
gêDica sobre algumas cepas de 8almonella typhimurium mas não sobre c:.élulas
de mamíferos. Deste modo, foi despertado DOVOinteresse na utilização desse
fármaco, em razão do afastamento da suspeita de lua atividade mutagêDica
sobre o organismo humano.
li
EL-OBEJD et alli29em 1985, determinaram a conceDtraçio míni-
ma iDibitória, MIC, de quatro derivados 5-Ditrofurânicos com estrutura análo-
ga à Difuroxazida, freDte a difereDtes eDterobactérias, observaDdo um amplo
espectro de atividade destes compostos. Embora estes autores Dão teDham se
preocupado em abordar as relações estrutura-atividade dos compostos estuda-
dos, muitas iDformações a respeito da síntese e avaliação quaDtitativa daatividade antimicrobiaDa foram evidenciadas.
111
Apresenta-se Da tabela 3 as estruturas e os valores de concentra-
ção mínima iDibitória obtidos por EI-Obeid e colaboradores29.
111
"liII111II
li
'"II
11
"
TABElA 8 .Ee1rutura e vai ore, de oonoentra90 mrnlma Inibitória, MlC, de an6logo.
. nlfuroxazldafrentea alguma. enterobaotjrlu, determinado.pelo m.todo de dlul960auoe..lw em tubo.
,N~N~R
. EI-Obeid,et a1li.Pharm. Ileso,\1.1,p.42-43, 1985
.. Nifufoxazida
12
MIC(ug/mL)R
S.aureus S. faeea//s E. eoll
:- 1,6 6,2 12,5
H
O
fVN- 3,1 50,0 12,5
O IH
H,.NO 12,5 25,0 25,0, N-
H
O i*HO
1,6 0,8 0,3.N-
H
Em razão das poucas informações disponíveis na literatura a res-
pcito du relações entre a cstrutura química e a atividadc antim icrobiana dc
análogos à nifuroxazida12,29.88,torna-se necessário que se verifique, sob o ponto
de vista quantitativo. as relações entre a estrutura química e a atividade
antimicrobiana, QSAR, nesta série de compostos. Pretende-se, desta forma,
poder identificar quali e quantitativamente as propriedades físico-químicas
que influenciam a atividade analisada. possibilitando, desta forma, o planeja-
mento racional de análogos mais potentes e portanto mais adequado às neces-sidades da medicina moderna.
Diante destes fatos, a nifuroxazida tem se mostrado bastante
adequada ao estudo a nível moJecuJar, uma vez que reúne propriedades de
grande interesse farmacológico tais como baixa toxicidade20.21.62,amplo espec-
tro de açãol2,l3,S4.so.88,razoável poder antimicrobianol2,29.88 e não provoca re-
sistência bacteriana importante2,s.
13
"
2- INTRODUÇÃO AO QSAR
A idéia de que a estrutura química de fármacos pode ser correla-
cionada com a resposta biológica é bastante antiga~.13,112,119.Até cerca de
trinta anos atrás muitos trabalhos na área de relações estrutura-atividade,
SAR, foram descritos90,l1~119e apesar de interessados, OJcientistas não conse-
guiam abordar o aspecto quantitativo dessas relações em função de sua com-
plexidade. Foi somente em 1962, que HANSCH e FUJITA 44propuseram uma
metodologia que se mostra adequada para o estudo quantitativo das relações
entre a estrutura química e a atividade biol6gica, QSAR, determinando desta
forma o surgimento de um novo ramo da ciência.
o conhecimento e aplicação do conceito de QSAR no planejamen-
to de compostos biologicamente ativos, abriu novas perspectivas na pesquisa
de fármacos causando, a princípio, grande otimismo e quase euforia entre os
pesquisadoresl19. Esta idéia, no entanto, rapidamente se desfez, em função do
reconhecimento da complexidade dos sistemas biológicos e da simplicidade do
modelo proposto por HANSCH e FUJITA11~119.
I~
Esta área do conhecimento tem se desenvolvido muito e recente-
mente tem sido utilizada com sucesso tanto na identüicação quali e quan-
titativa das propriedades físico-químicas que condicionam a atividade de
compostos biologicamente ativos, como dando suporte metodológico e teórico
para o planejamento racional de fármacos. Sua importância pode ser avaliada
pelos inúmeros trabalhos e revisões publicados anualmen.
111111
I ~
I11
I11
I~ te 11:n ,!ó,37 ,51,«59,73,109,111,112,113.
I~111
o desenvolvimento de pesquisas nesta área envolve fundamental-
mente o conhecimento de Farmacologia, Química, Bioquímica, Estatística e
Ciências de Computação. Pode, ainda, envolver outras áreas afins como a
Química Orgânica, a Físico-Química, a Microbiologia e a Parasitologia entre
outras, estabelecendo desta forma, o caráter multidisciplinar do estudo das
relações quantitativas entre a estrutura química e a atividade de compostos
biologicamente ativos 73,119.
MARTIN73 observando as etapas envolvidas no planejamento e
execução de trabalhos na área das relações quantitativas entre a estrutura
II
IIIII!I~
li111
I~1IIII~I1I
I11I11
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111
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111
lijIr;
I11
111
I~
química e a atividade biol6gica de compostos químicos. QSAR. prop6s um
diagrama que reúne as divena5 etapas envolvidas neste estudo. Apresenta-se
na figura 2 o referido diagrama.
Sabe-se que a atividade biol6gka de fármacos que apresentam
especificidade54.ss resulta. basicamente. de sua intenção com sítios recepto-
res54.SS,13,112.A resposta biol6gka. por sua vez. depende tanto da presença de
forças de natureza química que se estabelecem nas interações fármaco-recep-
tor como da solubilidade do fármaco. Bsta. por sua vez. condiciona a difusão
do fármaco através dos tecidos biol6gkos até que alcance o seu local de
açãoll.S'-6O, 73./'
Ar, forças de natureza química presentes nas interaçóes fármaco-
receptor sio. em geral. de caráter não covalente. e é graças a esta característica
que a ação dos fármacos é efêmeral1.54.~6o,7!.
Estio relacionadas na tabela 4 os diferentes tipos de ligações
químicas envolvidas nas intenções fármaco-receptor bem como suas respecti-
vas atribuições energéticas112.
B.,) -Iracu\da{!ede ~it,,1~ias ' i\J1Icat
t12:\ler3td1i~ dB ~~[;, J-~dQ)
'5
~ ~
QSAR RelatadoouExperiênciaem SAR
Composto PadráoI /I Possibilidad~
DesiQn dai-' - I SintéticaSerie
.&(J)
Análise daRelacão'
TestesBiolóaicos
PropriedadesFísicas Calculada
Ausência deI Correlação
.
Análise Conformacionalou
Procura deModelo Farmacofórico
IOutliersllSucessonaCorrelação
Predição
TABElA 4
11poad. IIgaç6.. qufmloaa. r.ap.otlvaa .n.rglaa
.nvolvidaa na. Int.raç6.. fárrnaoo-r.o.ptor
.II
A difusão de compostos químicos através de tecidos biológicos
depende fundamentalmente de sua solubilidade no mesmo, uma vez que os I
sistemas biológicos são constituídos de diferentes fases aquosas e orgânicas,
resultando em interferências decisivas na absorção e distribuição de substân-
cias exógenasll.SSo60.13.112.É neccuário, portanto, que estas substâncias pos-
suam um balanço lipo-hidrofilico adequado para que possam desenvolver sua
ação60.112.
HANSCH e FUJITA44,diante destes aspectos, desenvolveram um
modelo matemático que relaciona a atividade decompostos biologicamente
ativos em função de suas pr:'Opriedadesfísico-químicas. Este modelo pode ser
expresso através de uma equação desde que as propriedades físico-químicas
envolvidas na determinação da resposta biol6gica sejam expressas por parâme-
tros adequados.
Apresenta-se na equação 1 uma generalização do modelo propos-
to por HANSCH e FUJITA44 para a quantificação da atividade biol6gica: .
17
INTt:RAÇ6I!S t:NI!RQIA (KJ. mOr')
Ibnlea 20-40
1on-dlpolo 04-17
dlpolo-dlpolo 04-17
IIgaçlo de hidrogênio 04-17
complexo de transferência de carga 04-17
hldrof6ble88 04
van der Waala 02-04
Ili
li!
lil
III
III
,
AB I: / (parametros eletr8nicos) + / (parllmetroj hidro/óbicos) +
/ (parametrOJestéricos ) + R (1)
III em que: AB é a resposta biol6gica do composto;
parâmetroJ eletrônicoJ, hidrofóbicos e estéricos são parâmetrosestruturais que expressam respectivamente as propriedades
hidrofóbica, eletrônica e estérica do com posto;
f expressa as contribuições relativas dos parâmetros eletrônicos,hidrofóbico e estérico;
R é o coeficiente linearIII
II1
Os parâmetros estruturais envolvidos no modelo proposto por
J-JANSCH e FUJJTA44 contribuem, cada uma deles, com uma determinada
parcela para o estabelecimento da resposta biológica, Os fatores eletrônicos
são responsáveis, basicamente, pelas interações de natureza polar que se
estabelecem entre o fármaco e seu receptor; os fatores hidrofóbicos regulam
o transporte do fármaco através dos tecidos biol6gicos e contribuem com
interações hidrofóbicas na interação fármaco-receptor; e os fatores estéricos,
por sua vez, estão relacionados basicamente com o ajuste tridimensional do
fármaco ao seu receptorS4.S5.113.119,
A validade da aplicação do modelo de HANSCH e FUJJTA 44à
vários sistemas, demonstrou que as propriedades físico-químicas são significa-
tivamente importantes no comportamento farmacocinético e farmacodinâmico
de compostos biologicamente ativos60.112.113.Isto resultou em estímulo para a
pesquisa e definição de parâmetros que pudessem representar quantitativa-
mente estas propriedades, bem como na proposição de modelos matemáticos
. mais adequados para a descrição da atividade de compostos biologicamente
ativos em função de suas propriedades físico-químicas.
Apresenta-se na tabela S alguns eXempIos de aplicação do modelo
proposto por HANSCH e FUJITA44 para descrever as relações quantitativas
entre a estrutura química e a atividade de compostos biologicamente ativos"'.
18
Ili
III11'"
11:
TABB:IAG
III
. .Exemplo! de apllcaçio do modelo de HANSCH e FUJITA na deacnçio
das relaçõea quantitativB8 eatrutura -atividade de
compoatos biologicamente ativos
AS = aLogP + b
.HANSOi, C; FUJITA, 'IJ.. Am. Cbem. Soe., v.86, 13.',
p.161~1626, 1964.. HANSOI, C; DUNN, W.J.. J. Pharm. ScL,".61, n.l, p.1-18, 1972
em que: n 6 o n6mero de compostos da 86rie;t 6 o coeficiente de correJaçAo;. ~ o desvio padrão
19
Parlmetro8 b n r 8
blol6glço
..MIC 2-nltt618
0,64:tO,l l,24:tO,7 22 0,91 0,3(5. aureus)
MIC" fenll-
metaçrllato8 O,67xO,l l,34xO,6 10 0,97 0,3
(5. aureus)
MIC" Fen618O,76:tO,l O,49:tO,4 9 0,98 0,1
(5. aureus)
DL**
ba rbltu ratos 0,41:tO,2 2,18:tO,4 12 0,82 0,1
(ca m undongos)
-- - - - -- --- -------
,- PROPRIEDADESFISICO-QUIMICAS QUE CONDICIONAM A AÇÃO DEFÁRMACOS
A atividade de compostos biologicamente ativos depende funda-
mentalmente de suas propriedades físico-químicas, uma vez que este. compos-
tos precisam atravessar os tecidos do sistema biol6gico e alcançar seu(s)
aítio(s) receptor(es) para que possam desempenhar sua ação73.112.
O desencadeamento da atividade biológica, por sua vez, depende
entre outras, de interações de caráter físico-químico que se estabelecem entre
o composto químico e seu(s) receptor(es) específico(5)11.73.112.
Entre as propriedades físico-químicas mais importantes para o
estabelecimento da atividade biol6gica de compostos químicos, citam-se as de
natureza eletrônica, as de natureza hidrofóbica e aI de natureza estéri-
call.73.112,120.Cada uma destas propriedades pode ser representada através de
diversos parâJDetros que expressam quantitativamente a sua influência no
estabelecimento da atividade bioI6gica13,112,113.
Apresenta-se a seguir um estudo dos principais parâmetros físico-
químicos envolvidos na determinação da atividade biológica de compostos
químicos.
3.1-pARÂMEIRa;1lEIRÓNIca;
Desde o estabelecimento da equação de HANSCH44 em 1964,
muitos trabalhos têm reconhecido que os efeitos eletrônicos transmitidos
pelos substituintes muitas vezes influencia a atividade biológica de fárma-.co 59,45.113.O entendimento de sua natureza e a avaliação quantitativa destes
efeitos são de importância fundamental no estabelecimento de relações quan-
titativas entre a estrutura química e a atividade de compostos biologicamente
ativos, QSAR, e envolve necessariamente o conhecimento da equação de
HAMMBTI39.
20
3.1.1-BQUAÇÃO DB HAMMBIT
Desde o início deste ~culo vários pesquisadores40.97.104.U3vêm
teDtaDdo corre1acioDarmatematicameDte a estrutura química de fármaeos com
a atividade biológica por eles produzida. Foi .omeDte, porém, a partir de 1937,
com base em cODhecimeDtosDaárea de físico-química orgâDica, que os avaDço.
De.te cam po passaram a ser realmeDte sigDificativo.7.9.30.39.98.120.
HAMMEIT39 em seu clássico trabalho publicado em 1937, estu-
dou a ionização de ácidos beDz6icos meta oupara-substituídos em água a 2SoC,
observando uma relação linear eDtre os logaritmos da CODstaDtede iODizaçio
do ácido benz6ico substituído, log Kr e da CODstaDtede ionização do ácido
beDzóico Dão substituído, log Ko' Correlação aDáloga também foi observada
na hidr6lise de ésteres benz6icos substituídos nas posiçóes meta e para.
A equação 2 represeDta esta relação que passou a ser coDhecida
como equação de Hammet~.
10gKz =: fK1 + Kl) (2)
em que: ~ é a.constante de ionização do ácido benz6ico p ou m-substitufdo;
Ko é a CODstaDtede iODização do ácido benzóico não substituído;(1é a constante de grupo;
p é CODstaDtede reação
Relações logarítmicas entre constantes de equilíbrio de reações
químicas são conhecidas como relações liDeares de eDergia livre, RLEL, uma
vez que a variação entre a energia padrão de reaçóes é diretamente proporcio-
nal à eDergia livre de ativaçã09.39.102.
A constante ,igma, (1, é ronhecida como CODstaDteele grupo, uma
vez que mede a influência eletrônica de um dado substituinte, inde-
peDdentemente da reação ou da molécula a que ele Citá Iigael07,9,30.104.11S.Vale
salientar que a proposição de HAMME1T39 assume caráter aditivo para estasco Ds ta ntes9.10.39.4S.11S.
21
- - -- - -- -- -- - - n -- - -- -- - -_u - -----
Os valores absolutos de "refletem a grandeza dos efeitos induti-
voa e de ressonância exercidos pelo lubdituinte no centro da reação ou na
propriedade fbico-química medida7.90.10...11'.
Valores positivos de (Jsio observados em substituintes que atraem
elétron., e valores negativos em substituintea que repelem elétrons7.30.119.
O coeficiente angular da equação de Hammett corresponde .
constante rhô, p, que é denominada constante de reação. Sua grandeza mede
a suceptibilidade da reação ou da propriedade medida, ao efeito polar exercido
pelo substituinte e depende da natureza da reação que a definiu7.9..w.113.
Valores positivos de p são observados em reações favorecidas por
grupos que atraem elétrons, e valores negativos em reações favoreci das por
grupos que repelem elétrons7.9.113.120.
3.1.2- EQUAÇÃO DE HAMMETI' EXPANDIDA
A equação de Hammett tem sido revisada, discutida e criticada
por diversos autores9,3o.91.98.101resultando no surgimento de séries de constan-
tes que diferem dos valores de "definidos por Hammett.
TAFT e LEWJS104foram os prime.iros autores a sugerir a possibi-
lidade de se conhecer separadamente as contribuiçóes dos efeitos indutivo e
de ressonância exercidas pelos substituintes em posição meta oupaTa em anéis
benzênicos. Isto foi possível através da aplicação das equações 3 e 4.
O'p = d/ + O'R (3)
dm =d/ + ao'R (4)
em que: O'pe "m são valores da constante O'de Hammett para substituintes emposição paTa e meta respectivamente no anel benzênico;
"I e "R sio as contribuiçóes dos efeitos indutivo e de ressonânciarespectivamente;
a é um fator de correção para o efeito de ressonância a partir daposição meta.
22
A grande vantagem do desmembramento do valor original de
.igma, (f, em .eu. componentes indutivo e de reuonância, representados por
(f. e (fRrespectivamente, é a possibilidade de emprego da equação de Hammett
expandida7.104.10S,113.Desta forma é possível expressar 85 contribuições indivi-
duais dos efeitos indutivo e de ressonância para a velocidade ou posição de
equilíbrio da reação ou para a propriedade medida45,97,
A equação 5 representa a equação de Hammett expan_dLdaconsi-
derando o desmembramento do efeito polar exercido pelo grupo substituinte
em seus componentes indutivo e de ressonância, bem com suas influências
sobre a velocidade ou a posição de equilíbrio da rea~o ou propriedade medi-
da.
log Kx =p/(f/ + PR (fR + log K() (5)
em que: log ~ é a constante de equilíbrio do composto substituído;
log Ko é a constante de equilíbrio do composto não substituído;
PI é o coeficiente angular relativo ao efeito indutivo;
(fI é a contribuição do efeito indutivo;
PR é o coeficiente angular relativo ao efeito de ressonância;
(fRé a contribuição do efeito de ressonância
Esta equação permite calcular isoladamente a suceptibilidade da
reação ou propriedade físico-química medida aos efeitos indutivo é de resso-
nância de substituintes, e tem sido aplicada com êxito a vários sistemas em que
a equação de Hammett original39 não fornece boa correlaçáo1.9.30.4S.98,10S,U3,120,
Na tabela 6 apresentam-se valores selecionados da constante (f de
Hammett em função da posição de grupos substituintes em anéis benzênicos,
bem como lua decomposição nos componentes indutivo e de ressonância',
23
J
iiI.
TABElA 6.-
Valore~nl.cionado~ da~ COnDU\nt.~"d. Hamm.11.mpo&ição
para e meta, e da~ con~tantea", e "A
. HANSCH,C et aniL Chem. Rev., v.91, n.2, 1991.
.. CHARTON, M. Electrical effect substitucnt constants forcorrelation analysis. In: TAF'I; R W. , Progress Jn physicalor&antc chemistl)', v. 13, p. 119-251, 1981.
tValores referentes a posição para em relação ao centro de reação
em que: ap e am são constantes sigma de Hammett referentes àposições para e meta respectivamente;O']e O'Rsão as constantes que medem os efeitos indutivo ede ressonância respectivamente
24
* * ** **tR (7p (7m (7, (7R
N02 0,78 0,71 0,67 0,10
Br 0,23 0,39 0,47 -0,25
CI 0,23 0,37 0,47 -0,25
H 0,00 0,00 0,00 0,00
CH3 -0,17 -0,07 -0,01 -0,16
OCH3 -0,Z7 0,12 0,30 -0,58
OH -0,37 0,12 0,24 -0,62
NH2 -0,66 -0,16 0,17 -0,80
COCH3 0,50 0,38 0,30 0,20
OC2Hf) -0,24 0,10 0,28 -0,57
CFs 0,54 0,43 0,40 0,11
N(CHsh -0,83 -0,16 0,17 -0,88
S02NH2 0,60 0,53 0,46 0,05
3.1.3-CORRBÇÓBS DA CONSTANTE SIOMA DE HAMMETT
Várias correções da constante de grupo de substituintes surgiram
a partir da observação da falta de linearidade encontrada ao se aplicar a
equação de Ham mett em reações específicas 7.9.101.113.Nestes exemplos obser-
vou-se que a maioria dos pontos experimentais se situavam aproximadamente
Jobre uma reta, enquanto que alguns pontos se situavam flagrantemente acima
ou abaixo desta Iinhal0.
A prim eira observação neste sentido ocorreu ao se tentar corre.
lacionar as constantes de ionização de anilônios e fen6is com a constante de
grupo de Hammett40. Com base neste estudo, sugeriu-se a correção dos valores
de sigma de Hammett, para grupos substituintes fortemente a~eptores de
elétrons, em reações cujo centro reacional é rico em elétrons. Criou-se, desta
forma, uma nova coleção de valores de (1de Hammet~.97 denominada sigma
menos, (1:,cujos valores correspondentes aos grupos fortemente aceptores de
elétrons são majores do que aqueles relativos aos valores originais de (1 de
Hammett40.
Contrariamente, observou-se que ao se aplicara equação de Ham-
mett para as constantes de velocidade de solvólise de cloretos de t-cumila
p-substituídos, os pontos correspondentes a grupos fortemente doadores de
elétrons se situavam acima da reta formada pela maioria dos pontos experi-
mentais. Criou-se então, com base nesta observação, uma nova coleção de
valores de (1de Hammett denominada sigma mais, (1+, cujos valores correspon-
dentes a grupos doadores de elétrons são maiores do que seus valores origi-naislO.
Os valores de (1-têm sido aplicados em reações em que o centro
reacional é rico em elétrons, enquanto que os valores de (1+ são aplicados,
geralmente, em reações cujo centro reacional é deficiente em elétrons '.
SWAIN e LUPTON101em 1968, revendo a constante (1de Ham-
mett39, propuseram a decomposição do efeito eletrônico de grupos substituin-
tes nos efeitos de campo e indutivo e no efeito de ressonância. Bstes autores
consideraram o efeito indutivo e de cam po, F, de .field8, combinado linearmen-
te ao efeito de ressonância, R, de .reuonance., equivalentes ao valor da
constante sigma de Hammett39."~.
25
A proposição de SWAJN e LUPTON101 é expreua matematica-
mente pela equação 6.
(1 :::; fF + rR (6)
em que: C1é a constante de grupo de Hammett;
F representa os efeitos indutivo e de campo;
R I'Cpresenta o efeito de l'Cuonância;
f e r são coeficientes empíricos e independentes
O estudo de SWAIN e LUPTON101 foi feito com base em duas
premissas: A primeira considera que o efeito de para-substituintes na ioniza-
ção do ácido biciclo (2,2,2)-octano l-carboxílico resulta inteiramente da ação
de efeitos indutivo e de campo do substituinte, uma vez que o efeito de
ressonância não se transmite através deste sistema. A segunda premissa
considera que o efeito eletrônico transmitido pelo substituinte trimetilamô-
nio, -~(CH3h, não envolve nenhum efeito de ressonância podendo-se, por-
tanto, considerar este efeito como sendo igual a zero. Desta forma, é possível
calcular o valor de R a partir da equação 7.
C1, :::; 0,56F + R (7)
em que: C1pé a constante sigma de Hammett na posição para;F sio os efeitos indutivo e de campo;R é o efeito de ressonância;
0,56 é o valor de p para o sistema de reações utilizadopor Swain e Lupton
HANSCH4s em 1973, reexaminou 01 valores e a abordagem de
SWAJN e LUPTON101e considerou que os mesmos nio estavam corretamente
dimensionados. Este autor propos então a utilização do fator 1,56 corres-
pondente a valor de p para a ionização de ácidos benzóicos em etanol/água
50% p/p a 25°C, redefinindo, desta forma, a equação que calcula os valores de
F eR proposta por Swain e Lupton. A proposição de Hansch pode serresumida
nas equações 8 e 9.
26
F = 1,396um - 0,373up - 0,009 (8)
n = 14 r = 0,992 J = 0,0042
R = up - 0,921F (9)
Apesar de criticados14.4~93.98,os parâmetros eletrônicos propostos
por SWAIN e LUPTON101 têm sido empregados com sucesso em diversos
trabalhos, principalmente aqueles envolvidos com relações quantitativas entre
a estrutura química e a atividade de compostos biologicamente ati-
VOS9.14.4S,13.120.
Apresentam-se na tabela 7 valores corrigidos da constante q de
Hammett de grupos substituintes em posição para em anéis benzênicos9 bem
como os valores de F e R de Swain e Lupton101.
~
TABELA 7
. .Valor.a a.l.olonadoa d. oonatantn d. grupo de eubatitulntta
freqü.nt.mente pr.untn .m fármaooa
. HANSOi, C et allii. Chem Rn., v.91, 0.2, 1991...HANSCH,c., LBO,A.J. Svbstltvent constants ror correlatlon
anaJysis In ehe mlstry and blolo&y,Jobn Wiley, 1979.
em que: R é o grupo substituinte;
°p, op. e op. são constantes de grupo em posição parano anel benzênico;
F e R são as constantes de grupo propostas por Swaine Lupton;
t Valor idêntico 80 valor de (1p
2e
o' op...
R..A op F
N02 0,78 0,79 1,25 0,65 0,13
Br 0,23 0,15 t 0,45 -0,22
CI 0,23 0,11 t 0,42 -0,19
H 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00
CH3 -0,17 -0,31 t 0,01 -0,18
OCH3 -0,27 -0,78 t 0,29 -0,56
OH -0.37 -0.92 t 0,33 -0.70
NH2 -0,66 -1,36 t 0.08 -0,74
COCH3 0,50 0,50 0,83 0,33 0,17
OC2H5 -0,24 -0,82 t 0,26 -0,50
C'3 0,54 0,54 0,68 0,38 0,16
N(CH3)2 -0,83 -1,62 t 0,15 -0,98
..SNH2 0,60 0,60 0,92 0,49 0,11
- - - --- - - - -- -- __n-
3.1.4-oUTROS PARÂMETROS BLBTRÓNICOS
Vários parâmetros eletrônicos podem ser definidos através da
observação de variações em propriedades físico-químicas seDsíveis ao efeito
de grupos substituiDtes de compostos químicos. Parâmetros espectroscópicos
como freqüêDcia de absorção Da região do iDfravermelho, deslocameDtos quí-
micos de RMN-1H e RMN-1SC, bem como coDstantes de ionização e variação
no momento dipolar, são alguns dos parâmetros que podem refletir a influên-
cia eletrônica de grupos substituintes sobre as propriedades de um determina-
do composto químico1.9.105.113.120.
Parâmetros como freqüência de absorção na região do infraver-
melho e deslocameDtos químicos de RMN-1H e RMN-1'c, têm sido emprega-
dos com sucesso como parâmetros estruturais em relações quantitativas entre
a estrutura química e a atividade de compostos biologicameDte ati-
vosl.9.10S.113.120.
Atenção especial é dada aos compostos carboDflicos que apresen-
tam uma banda de absorção característica na região do infravermelho, que se
caracteriza por ter alta intensidade e ser livre de interferência de outras
vibrações além daquelas resultaDtes da incidência dos raios infravermelhos
sobre a ligação c=o.Por outro lado, a natureza terminal deste grupo e seu alto
valor de constante de força, minimizam os efeitos de acoplamento com grupos
vizinhos, enquanto que sua polarizabilidade o toma suceptivel aos efeitos
eletrônicos provenientes de adjacênciasl.1OS. Desta forma, é esperado que
correlações entre o efeito eletrônico de substituintes e a freqüência de absor-
ção do grupo carbonila na região do infravermelho, ocorram em sistemas onde
o efeito eletrônico dos lubstituintes possa se transmitirl,lOS.
Encontram-se na literatura algumas revisóes a respeito do empre-
go de parâmetros espectroscópicos em estudos de relações quantitativas entre
a estrutura química e a atividade de compostos biologicamente ativosl.9.1OS.
3.2-PARÂMEIR~ HID~ÓBI~
A resposta biol6gica produzida por compostos biologicamente
ativos está diretamente relacionada com os mecanismos de absorção, distribui-
ção e atividade intrínsecacso,73.107.113.Os processos de absorção e distribuição
29"
destes compostos são regulados pela sua hidrofobicidade, uma vez que é
neceuário que se dissolvam e atravessem as membranas biológicas que for-
mam os tecidos e sistemas multicompartimentados dos seres vivos, até que
alcancem seus respectivos sítio, de açáo~.~.67.73.107.
Os clássicos trabalhos de OVERTON9 e de MAYER9 juntamente
com as inúmeras correlações encontradas entre a atividade biol6gica e a hidro-
fobicidade de compostos químicos, demonstraram claramente que esta pro-
priedade desempenha papel fundamental na atividade destes compostos nos
sistemas biol6gicos, em bora esta seja apenas uma das várias propriedades
físico-quím icas que, atuando conj untamente, determinam a atividade biológica
potencial destes com postos28.43.47.60.73.107.
É importante reconhecer que a hidrofobicidade de um fármaco
determina a extensão e velocidade de sua absorção e distribuição, a sua capa-
cidade de ligação ao sítio receptor, bem como a sua biotransformação e excre-
çáo28.60.107.O en te ndim ento destas etapas envolve, por um lado, o
conhecimento da estrutura, função e propriedades das membranas biol6gicas
e, por outro, o conhecimento da estrutura e das propriedades físico-químicas
do fármaco tais como tamanho e forma da molécula, seu grau de ionização e
lipossolubilidade relativa de suas formas neutra e ionizada22,6o,l07.
Um dos mais recentes modelos de membrana biológica adotado
em estudos de QSAR é aquele conhecido por mosaico fluido. Este modelo
representa a membrana biológica como sendo constituída por bicamadas con-
tínuas de lipfdeos polares com proteínas dispersas por toda a sua extensão.
Estas membranas apresentam-se como estruturas fluidas, flexíveis, permeáveis
à água e impermeáveis a íons e moléculas muito polares. Apresenta-se na
figura 3 o modelo de mosaico fluido para membranas bio16gicasl06.
Muitos ,fármacos do ácidos ou bases fracas que quando em solu-
ção, apresentam um equilíbrio entre suas formas neutra e ionizada. A forma
neutra é geralmente mais lipossolúvel do que a forma ionizada e se difunde
através das membranas biol6gicas por processo passivo, segundo um gradiente
de concentração e de acordo com seu coeficiente de partição. A forma ionizada
é absorvida por processo ativo e tem sua distribuição condicionada pelo seu.pKa e pelo pH do mei028.6O,107.
~
Figura 3: Modelo de mOflaloofluido propoato para ~p~untar aa membrana. blol6g1oaa
3.2.1- COEFICIENTE DE PARTIÇÃO
o coeficiente de partição de uma determinada espécie química é
definido como sendo a razão entre as concentrações que se estabelecem nas
condições de equilíbrio de uma determinada espé'cie química, quando dissol-
vida em um sistema constituído por uma fase orgânica c uma fase aquo-
sa28,5O,60,13.94,107,123,e está associado à mudança de energia livre provoca da pela, ---substância sobre o équilíbrio termodinâmico do sisterna43,~,107.Esta relação
pode ser expressa através da equação 10.
.. p = Jor,tânical[aquosa] (10)
em que: P é o coeficientc de partição do composto analisado;
[orgânica] é a concentração do composto na fase orgânica nas
condições de equilíbrio;
[aquosa] é a concentraçio da substância Dafase aquosa DascoDdiçõcs
de equilíbrio
O coeficieDte de partição é uma das propriedades físico-quími(.8s
mais amplameDte utilizadas em QSAR22,47,73,107e vários sistemas podem ser
S1
empregados na sua determinaçlo. Entretanto, o.istema utilizado preferencial-
mente para esta finalidade é o sistema t-octanol/água devido à .ua Jemelhança
com sistemas biol6gicos. h principais vantagens do uso do t-octanol como
fase orgânica na determinação do coeficiente de partição do as Jeguin-tes 22.60,107:
- possui ampla capacidade de dissolução frente a diferentes
compostos químicos;
- seu grupo hidroxila, -OH, pode agir tanto como doador como
receptor de elétrons na formação de ligações de hidrogênio;
- embora seja imiscível com a água, o t-octanol tem a capacidade
de dissolver até 2,3 M de água sob condições de equilíbrio;
- as ligações de hidrogênio de uma molécula solvatada não precisam
ser quebradas durante sua transferência da fase orgânica para a
fase aquosa. Deste modo, os coeficientes de partição determina-
dos em l-octanol/água refletem apenas as interações hidrofóbicu;
- não é volátil à temperatura ambiente;
-é adequado para medição direta na região do U.~, em razão de sua
baixa absorção nesta faixa;
- é quimicamente estável e disponível comercialmente.
COLLANDER2 em 1951, observou a existência de uma correlação
entre o coeficiente de partição determinado em l-ocmnol/água com aqueles
determinados em outros sistemas de solventes. Esta correlação, conhecida por
equafão de Collander, é representada pela equação 11:
,
log P,olvenU 2 = Il logP,olv4r'* 1 + b (11)
em que: log Psolvcnte2 é o coeficiente de partição calculado parao novo sistema;
log P80lvente1 é o coeficiente de partição determinadoem l-octanol/água;
a e b sio os coeficientes angular e linear respectivamente
32
A partir de determinações de coeficiente de partição em diferen-
tes .idemas de solventes, LEO e HANSCH6t\CS7,através da aplicação da equa-
ção de Collander, estimantm o coeficiente de partição de um grande número
de compostos químicos para o sistema l-octanol/água. Estes autores observa-
ram excelentes correlações entre sistemas cujo solvente orgânico apresenta
alta polaridade tais como cetona/água, éster/água e álcool/água. Sistemas cujo
solvente orgânico apresenta baixa polaridade como benzeno/água, resultaram
em baixa correlação com o coeficiente de partição determinado no sistema
l-octanol/água.
A classificação de solutos em doadores e receptores de protons na
formação de ligações de hidrogênio resultou na introdução, porSEJLER96, da
Constante Indicadora, IH' A sua utilização possibilitou a obtenção de correla-
ções satisfat6rias entre coeficientes de partição determinados nos sistemas
l-octanol/água e solventes apolares/água60.
Entre os diversos métodos de determinação de coeficientes de
partição, o método de s1uzke-flask'Zl.28.6tJ.73.107é o mais freqüentemente empre-
gado. A maioria dos bancos de dados relativos a coeficientes de partição são
baseados em determinações utilizando-se o sistema l-octanol/água pelo méto-
do de shake-flask41.107.
Em princípio o método de shake-flask é bastante simples e funda-r
menta-se na dissolução de um composto químico em um sistema bifásico
formado por um solvente polar e outro apoIar.
o método de s1uzke-flask é particularmente adequado para subs-
tâncias cujo valor de coeficiente de partição se situa na faixa compreendida
entre 0,0 e 4,022.60.107.A margem de erro de determinações utilizando-se este
método e o sistema l-octanol/água situa-se geralmente entre 5 e 10%107.
Vários fatores afetam a determinação do coeficiente de partição.
Entre eles citam-se a temperatura, o tempo para o estabelecimento do equilí-
brio, a concentraçio do $oluto e sua pureza, o efeito do tampio utilizado e a
relação de volume entre as fases22.107.
Cromatografia em camada delgada, TLC, e cromatografia líquida
de alta eficiência, HPLC, têm sido utilizadas na determinaçio dos parâmetros
33
)
Rf e K' respectivamente2S,53,60,73,100,I07,Estas técnicas t~m sido aplicadas, com
sucesso, na obtenção de coeficientes de partição de com postos com solubilida-
de consideravelmente maior em uma das fases6O,100,107.
o valor Rf se relaciona com o Rm através da equaçio 12 e o Rm
se relaciona com o coeficiente de partição através da equação 13107.
Rm = log [R} + t] (12)
log P = Rm + b (13)
em que: Rm é a distância percorrida em relação a um compostoconsiderado como padrio;
Rf é a razão entre a distância percorrida pelo composto
e a distância percorrida pelo eluente;
log p é o coeficiente de partição do composto analisado;b é coeficiente linear da equação.
o tempo de retenção em cromatografia líquida de alta eficiência,
HPLC, é quantitativamente descrito pelo fator de capacidade, K\ dado pelo
tempo de retenção normalizado1oo.107,ou seja:
K' = (t r - t () )t() (14)
em que: K' é o fator de capacidade;
tr é o tempo de retenção;
to é o tempo de eluiçio do solvente.
Relação entre log K' e log Poct/igua é possível ser observada
aplicando-se a equaçio de Collandet15. Contudo, a hidrofobicidade expressa
em termos de K' é de natureza relativa, uma vez que é necessária a utilização
de compostos de referência com valores conhecidos de log Poct/6suatSO,100,107.
34
Determ inaçáo do coeficiente de partição utilizado ensaios crom8-
tográficos como TLC ou HPLC, permitem um "rto grau de im pureza nó
Joluto, enquanto que o método de shake-flD3k exige substâncias puras para
determinação confiável de seu coeficiente de partição22,2S,10O,107.
3.2.2- O PARÂMETRO 11:DE HANSCH
HANSCH44,analogamente ao parâmetro q de Hammett, definiu
o parâmetro 1l,que representa a contribuição hidrof6bica de um determinado
substituinte, como sendo a relação entre o logaritmo do coeficiente de partição
de um composto substituído e o logaritmo do coeficiente de partição de seu
análogo não substituído. Esta relação pode ser representada pela equação 15,
.7tx = logPx - logPH (15)
em que: 1lx é o parâmetro que reflete a contribuição hidrof6bica
do grupo substituinte, X;
Px é o coeficiente de partição do composto substituído;
PH é o coeficiente de partição do composto não substituído
O parâmetro n de Hansch tem sido largamente utilizado em estu-
dos de QSAR 47,6Q,73,107,113como medida da contribuição hidrof6bica de grupos
substituintes, uma vez que mede a contribuição individual desses grupos para
o coeficiente de partição de uma determinada molécula. A posição do grupo
substituinte influi significativamente no valor da constante de hidrofobiçjdade
n, sendo possível observar-se diferentes valores para um mesmo grupo substi-
tuinte em função de sua posição relativa na molécula41.107.
Valores positivos de 1t de Hansch são encontrados em substituin-
tes com caráter lipofílico, e valores negativos em substituintes com caráter
hidrofílico 41,60,107.
Na tabela 8 apresentam-se valores de 1t de Hansch107para grupo.
substituintes em função de sua posição relativa em anéis benzênicos substituí-
dos.
3!S
TABELA 8
VelIore6 ulecionl'c!o~ do pl'râmetro 1Cde HI'naoh. rell'tivoa
I' grup06 &Ub6titulnte6em ai6tem~ benzénic06
.TAYLOR, P. J. Hydrophobic properties of drugs. In: HANSCH, C,SAMMES, P. G., TAYLOR, J. B. Comprebensive medicinalchemistry: Tbe rational design, mecbanistic study &tberapeutic application of cbemical compounds., Oxford:Pergamon Press, 1990. v.4, p. 241-294.
em que: X ê o grupo substituinte;1I:p,1I:me 11:0são 06 valores de 1Cde Hanscbem posirão .
para, meÚl e ()rt<Jrespectivamente
BIBLIOTECAfaculdade de Ciências FarmacêuticaS
Univeraidadtde São Paulo
36
X np nm no
N02 -0,28 0,11 -
Br 0,86 0,96 0,84-
01 0,71 0,77 0,76'
H 0,00 0,00 0,00
CH3 0,56 0,52 0,84
OCH3 -0,02 0,12 -0,33
OH -0,67 -0,50 -0,41
NH2 -1,23 -0,29 -1,40
coe H3 -0,55 -0,28 -
OC2Hs 0,38 0,62 0,17
CFs 0,88 1,10 1,04
N(CH3h 0,18 0,11 0,16
S02NH2 -1,82 -1,86 -
3.2.3-A CONSTANTE! DE RBKK.BR
A base fundamental de toda a análise de QSAR .e ap6ia na
validade do conceito de aditividade6O.!S7.73,101.Este auume que todas a5 sub-es-
truturas de um composto biologicamente ativo contribuem, de modo aditivo e
sob influência de sua vizinhança, para a hidrofobicidade do composto.
REKKER92 considerando este conceito, observou que a aplicação
do parâmetro 11:de Hansch em sistemas contendo cadeias alifáticas resulta em
falhas no princípio de aditividade92.107.Por esta razão, este autor revendo a
contribuição hidrof6bica de grupos substituintes individuais, 'definiu o parã-
metro de hidrofobicidade f através da equação 16.
log P = L a. f (16)
em que: log P é o coeficiente de partição do composto;
f é a constante fragmentar e expressa a contribuiçãoindividual de c.ada sub-estrutura do composto;
a é a frequência com que um dado fragmento ocorrena estrutura analisada
A diferença fundamental entre os significados de 11:e de f é que 11:
se refere às contribuições relativas à substituição do átomo de hidrogênio por
um substituinte X, enquanto que f se refere às contribuições absolutas de
substituintes e de sub-estruturas para a lipofilicidade da molécula como um
tod068.s3.91.92.Desta forma, para substituintes em sistemas aromáticos os valo-
res de 11:e de f são igualmente empregados, enquanto que para sistemas
alifático$ apenas o emprego dos valores de f são adequado.68.'3.
Assumindo-se que o conceito de aditividade pode ser aplicado e
considerando-se as contribuições individuais de cada gropo substituinte ou
sub-estrutura para o coeficiente de partição de moléculas como um todo, foi
possível o desenvolvimento de métodos matemáticos que permitem a previsão
do valor do coeficiente de partição. Estes métodos apresentam excelente
concordância com valores experimentai,64,73,107.Discordâncias ocorrem, entre-
tanto, em compostos que apresentam anéis aromáticos Justapostos ou hetcro-
~
dclicos e em compostos iônicos6o. Entre os diversos programas dispon{veil
comercialmente para esta finalidade, encontram-Ie atualmente, vários aplica-
tivos que fornecem resultados de forma rápida e precisa6O,64,107.
3.3- PARÂMEIR~ 1:51fKJ~
o estudo do aspecto tridimensional de (.()mpostos biologicamente
ativos, bem como de seus receptores no sistema biológi(.() é muitas vezes
decisivo para a compreensão dos mecanismos envolvidos no estabelecimento
da atividade biológica desempenhada por estes compostos72,99,l1S.
o conceito atual da teoria de ação de fármacos, que se baseia no
princípio de ajuste entre o fármaco e seu receptor considera, entre outras
propriedades, a flexibilidade presente em biomacromolécula.99. Assim, o as-
pecto tridimensional de compostos biologicamente ativos governa os prin-
cípio. de reconhecimento e discriminação molecular, sendo a
estereoseletividade um aspecto importante nesta abordagem 72,99,US.l1S.
Vários parâmetros podem expressar o efeito estérico de um grupo
substituinte ou de compostos biologicamente ativos. De acordo com a proprie-
dade que expressam, estes parâmetros podem ser classificados em parâmetros
químicos, físicos e geométricos 72,99,115.
Os parâmetros químicos são obtidos a partir da observação de
influências do efeito estérico sobre uma determinada reação padrão, enquanto
que os parâmetros físicos são obtidos a partir da observação do efeito estérico
sobre as distâncias intramoleculares. Os parâmetros geométricos por sua vez.
resultam da caracterização da molécula como objeto tridimensional a partir do
qual, dimensões padrão podem .er calculadas41.12.99.
3.3.1- PARÂMBTROS QUfMICOS E FfslCOS
A primeira tentativa para a obtençio de um parâmetro estérico
que pudesse ser utilizado em estudos de QSAR, foi feita por TAFT1o3.Esteautor considerou a hidrólise ácida de acetatos a-substituídos como modelo de
reação para a definição do parâmetro Es. Este parâmetro foi entio definido
como sendo a relação logarftimica entre as constantes de hidrólise dos corres-
pondentes análogos substituído e não substituido72.
38
A utilizaçio do parâmetro E$ de Taft como parâmetro estérico.
tem sido criticada uma vez que outros fatores tam bém influenciam as reações
de hidr6Jise tomadas como padrão72.99.119.11S.AJém disso, este parâmetro não
pode ser determinado para uma série de grupos substituintes, considerando-se
as limitações impostas pela natureza e modelo da reação padrão utilizada para
lU a definiçio 12,99.
Outro parâmetro estérico utilizado é o volume de van der Waals,
Vw, que está relacionado com o relevo de uma determinada estrutura ou
sub-estrutura molecular. Este parâmetro pode ser definido como sendo o
volume impenetrável por outra molécula. obedecendo a lei da ação das mas-
SUl. É importante reconhecer que as coordenadas tridimencionais que defi-
nem uma determinada região de uma molécula, podem ser alteradas em função
do estado físico da mesma, resultando. portanto. em restrição no emprego
deste parâmetro em estudos de QSAR72.99.
O peso molecular, PM, embora relacionado indiretamente com o
volume da molécula, não exprime convenientemente seu o perfil tridimensio-
nal sendo, apesar disto, também empregado como parâmetro estérico em
estudos de QSAR 12,99.113.
3.3.2- PARÂMBTROS OEOMÉTRlCOS
Os parâmetros geométricos se constituem como uma classe de
descritores estruturais que se baseiam no raio de van der Waals, rW!Este, por
sua vez, é definido como sendo a distância na qual a repulsão entre as nuvens
eletrônicas de dois átomos ou grupos de átomos próximos, contrabalançam as
forças de atração presentes entre eles99. Assim, o aspecto tridimensional de
moléculas envolve tanto a geometria como a distribuição eletrônica das mes-mas.
o raio de van der Waals de grupos substituintes monoatômicos,
como os átomos de halogênio, pode ser facilmente determinado através da
técnica de difração de raio X."Por outro lado, a determinação de rw para grupos
substituintes poliatômicos é complexa, resultando em dificuldade na utilização
deste parâmetro em análise de correlação, mormente em estudos de
QSAR 72.99.115.
39
Uma possível solução para este problema foi proposta por VER-
LoOpl1S que desenvolveu um conjunto de parâmetros mais adequado para
expressar o aspecto tridimensional de grupos substituintes ou de sub-estrutu-
raso Estes parâmetros. denominados esterimol. foram obtidos através da medi-
da do tamanho do substituinte. considerando cinco diferentes direções. Estas
distâncias foram calculadas com a ajuda de um programa de computador
chamado Sterimol Program. que simula o modelo tridimensional de estruturas
ou sub-estruturas moleculares99.115.116.
o padrão direcional proposto por VERLOOP na obtenção dos
parâmetros esterimol está representado esquematicamente na figura 4.
Figura 4: PadFão direcional proposto por VERLOOPna determinação dos
parâmetro8 esterimol B,; B2; B3 e B4
Encontram-se descritos na literatura extensas com pilações de pa-
râmetros estruturais relacionados com o efeito estérico41.99.115.116.
3.4-0UIRa; PARÃM!IRa; ESl1IDIURAJS
Vários outros parâmetros estruturais são descritos na literatu-
Í'a26.41.6S.73.82,99.Entre eles podemos citar a Refratividade Molar. MR. o Paracor,
Pr, e a Conectividade Molecular,x. Estes parâmetros até recentemente pouco
empregados, são atualmente encontrados com freqüência em estudo de
QSAR 26.41.42,48,73.99.
.o
3.4.1-REFRATIVIDADE MOLAR
o parámetro de rdratividade mol&rt MRt expresu uma proprie-
dade físic.o-química de caráter constitutiva e aditiva sendo portanto, extrema-
mente dependente da estrutura do composto químico26.41.65,99.Com base nesta
propriedade, os valores de MR relativos a sub-estruturas moleculares podem
ser determ inados experimentaJmente99.
o parâmetro de refratividade molar é obtido experimentalmente
através do em prego da relação de Lorentz-Lorenz41,99 descrita na equação 17.
2MR = n - 1 X PM
n2+2 d (17)
em que: n é o índice de refração do composto a 20°C;
d é a sua densidade a 20QC;
PM é o peso molecular do composto
DUNN em 197726, sugeriu a existência de uma relação entre o
valor de MR e a c.onformação tridimensional da estrutura molecular de fárma-
c.os. Assim, a refratividade molar estaria diretamente relacionada com o ajuste
da molécula do fármaco a seu sítio receptor.
Por outro lado, o valor de MR de um determinado grupo substi-
tuinte pode ser relacionado também com a sua IipofiJicidade expressa através
da constante n; de Hansch65,99.Esta relação resulta em correspondência de
valores altamente significativa, uma vez que ambos dependem, em certa exten-
são, do volume molar, PM/d, do substituinte. Assim sendo, os valores de MR
também podem expressar o caráterlipofílico de grupos substituintes e depende
diretamente dos substituintes envolvidos, sendo possível haver colinearidade
ou ortogonalidade entre eles.
Vários estudos na área de QSAR têm utilizado os valores de MR
em análise de regressões multiparamétricas na interpretação da .interação
fárm aco-receptor42.48,99.
41
Encontram-se descritos na tabela 9 valores de refratividade molar
de grupos substituintes comumente presentes em séries de compostos utiliza-das em estudos de QSAR9~.
TABKLt\ 9
Valor.o ultoionadoo d. ,-.frativldad. molar dt grupoo
8ubotltulntto 1r.qü.nt.m.nw preunwo .m 1ármaooo
em que: X é o grupo 8ubstitYinte e.MR é a refratividade molar
3.3.2- PARACOR
o Paracor, Pr, assim como a refratividade molar, é uma proprie-
dade constitutiva e aditiva de compostos químicos41.99e está diretamente
relacionado com a estrutura tridimensional dos mesmos.
Os valores de Paracor podem ser determinados experimentalmen-
te e é definido através da equação 1899.
p, =r 1/4 x PMd (18)
em que: r é a tensão superficial em dyn.cm -1 ;
PM é o peso molecular do composto;
d é a densidade do composto a 20°C
42
X MR X MR
N02 0,736 NH2 0,542
Br 0,888 coe H3 1.118
CI 0,603 OC2He 1,247
H 0,103 Cfl3 0,502
CH3 0.565 N(CH3h 1.555
OCH3 0,787 SO:zNH2 1,228
OH 0.285 - -
Desde que a tensão superficial, r Y., para a maioria dos com postos
orgânicos náo varia consideravelmente99, o Paracor, Pr, pode ser considerado
como uma medida do volume molar, PM/d, corrigido41.
HANSCH e LE041 demonstraram que para uma grande variedade
de compostos químicos, existe uma correspondência significativa entre os
valores de MR e os valores de Pr. Esta correlação pode ser expressa através da
equação 19.
MR :: 1,30 Pr - 2,76 (19)
n:: 75 s ==0,288 r:: 0,966
Os parâmetros MR e Pr, quase perfeitamente colineares, forne-
~m correlações semelhantes quando empregados num mesmo conjunto de
dados99.
3.4.3- CONECTIVIDADEMOLECULAR
A conectividade molecular, X, é um parâmetro que descreve a
estrutura molecular em termos topol6gicos e se baseia na relação entre o grau
de ramificação de compostos químicos e seu coeficiente de partiçâo60.13.82.98.107.
A determinação do índi~ de conectividade moIecular,x, de com-
postos químicos é feito através da dissecção da estrutura molecular em sub-
estruturas, tendo cada uma delas sua contribuição determinada através de
métodos matemáticos auxiliados por computador60.13.82.107.
A conectividade molecular, X, por ser um parâmetro artificial e
empírko, apresenta grande probabilidade de estabelecer correlações com
parâmetros relacionados com o caráter hidrof6bico de compostos químicos
bem como com os parâmetros de rdratividade molar e paracor41.60.6S.13.82.98,107.
As boas correlações existentes entre a conectividade molecular e
o coeficiente de partiç.áo82 e a conectividade molecular e a refratividade
molar6S demonstram que este parâmetro pode representar adequadamente o
caráter de hidrofobicidade de grupos substituintes bem como as interaçôes-
polares intramoleculares41.6O,99.107.
43
4-PARÂMETROS QUE EXPRESSAM A ATIVIDADE BIOLÓGICA
A qualidade das relações lineares de energia livre está diretamen-
te relacionada com a natureza e preciJão dos parâmetros físico-químicos con-
siderados 10.72,Em linhas gerais, pode-se dizer que em estudos de QSAR o
significado estatístico das correlações obtidas, será tanto maior quanto mais
precisas e exatas forem as medidas de atividade biológica, uma vez que os
parâmetros físico-químicos, em geral, podem ser medidos com alto grau de
precisão 72,75,
Os parâmetros biológicos expressam, geralmente, a atividade de
compostos biologicamente ativos em termos de potência 10.71.72.124,Esta, por sua
vez, pode ser definida como sendo o inverso da dose ou concentração necessá-
ria para a obtenção de uma determinada resposta biológica. Desta forma,
quanto menor for a dose necessária para a obtenção de determinada resposta
biológica, maior será a potência do composto analisado11.72,124,
A estimativa da potência de compostos biologicamente ativos é
obtida através de ensaios biológicos, cuja aplicação se estende desde a seleção
de novos compostos químicos de interesse terapêutico até a avaliação de sua
eficácia, incluindo a análise de toxicidade. Os ensaios biológicos também são
empregados na garantia de qualidade de compostos químicos de atividade
bioló gica com provada S2,71,
41- TIra; IE ENSAIOSBIa..ÓGlCQ;
Os diversos tipos de ensaios biológicos descritos na literatura
podem ser classificados em ensaios qualitativos, ensaios quantais e ensaios
quantitativos 71.12.124.
Os ensaios qualitativos visam à seleção e identificação de substân-
cias químicas dotadas de alguma atividade biológica de interesse em misturas
ou em extratos de tecidos vegetais ou animais. A importância deste tipo de
ensaio biol6gico está vinculada à pesquisa de novos compostos químicos que
possam despertar algum interesse farmacológico, bem como à identificação de
contaminantes biologicamente ativos em formulações farmacêuticas52,71.12.124,
"
Os ensaios quantais baseiam-se no aparecimento ou não de uma
determinada resposta em sistemas biológicos tratados com um composto bio-
logicamente ativo sem, no entanto, quantificar o deito observado. Por outro
lado, é possível determ inar a dose mínima do composto analisado que desen-
cadeia este deito. Exemplos típicos da aplicação desta espécie de ensaio são
as determ inações de dose eficaz 50%, EDso, dose letal 50%, DLso e concen-
tração mínim a inibitória, MICS2.70.71.72.7S.1~.
O em prego de ensaios quantitativos visa a medida do deito ou
resposta desencadeada por um determinado composto biologicamente ativo
frente a uma dose previamente estabelecida do mesmo, sendo a resposta
biológica proporcional à dose utilizadaS2,72.
Observa-se nas curvas dose-resposta neste tipo de ensaio que
apenas a faixa situada entre 20 e 80% do deito máximo é função linear do
logaritmo da dose, uma vez que o perfil desta curva apresenta aspecto sigmói-
de. Apesar desta limitação, curvas dose-resposta são aceitas para finalidades
práticas dentro dos limites desta faixa71,124.
4.2- CARACIERÍsnCAS DE UM IN}AlO BIOLÓGICO100AL
O planejamento de ensaios biológicos visando à determinação da
potência de compostos biologicamente ativos se baseia, geralmente, na análise
de curvas que representam uma determinada resposta padrão em função de
diferentes doses do compost070.71.72,7S,124.Ensaios biológicos fundamentados na
observação de uma determinada resposta biológica frente a uma única dose
podem resultar em erros, como por exemplo a observação de inatividade do
composto analisado na dose planejada72. Este problema ocorre quando a dose
está abaixo do limiar necessário para o desencadeamento da resposta biológi-
ca. Percebe-se, portanto, que vários compostos podem desencadear a resposta
biológica máxima, mas podem diferir drasticamente em termos de potên-cia 71.72.124.
Na figura 5 está representado um exemplo hipotético das relações
entre a dose e a resposta biológica de três diferentes compostos, onde se
observa que o composto A é mais potente que o composto C e este é mais
potente que o composto 872.
45
3.00
2.00
'=-----------B
A
....li)ZOAoCI)....o:
oO 5.0 10.0
DOSE15.0 20.0
FIGURA~: Curvas dose-resposta hipotéticas de três diferentes compostos biologicamen-
te ativos em que: a curva A representa um composto com resposta máxima igual a 2,0 e
meia resposta máxima igual a O,~; a curva B representa um composto com reSpo8ta máxi-
ma igual a 4,0 e meia resposta máxima igual a e,o; a curva C representa um composto
com resposta máxima igual a 3,0 e meia resposta máxima igual a , ,O
A potência de compostos biologicamente ativos tam bém pode ser
determinada através do estabelecimento de curvas tempo-resposta72,7S. Esta
análise é particularmente adequada para a avaliação da atividade de compostos
administrados por via oral, onde o tempo necessário para o desencadeamento
da resposta biológica varia para cada análogo do composto padrão, ou ainda
para compostos com tempos de duração de ação diferenciados71,72,124.
Neste tipo de ~nsaio, cada análogo é administrado em várias doses
e a resposta biológica é observada em diferentes intervalos de tempo. Cons-
trói-se então, com estes..dados e para cada dose administrada, uma curva da
resposta em função do tempo e se calcula a área sob a curva. A seguir,
':Onstrói-se um gráfico considerando os valores das áreas iob as curvas em
função do logaritmo das respectivas doses. A potência relativa dos vários
análogos passa a ser, portanto, o inverso da dose necessária para produzir umadeterminada área 71,72,7Stl24. .
.s
A utilizaçio de curvas tempo-resposta na determinaçio da potên-
cia de rompostos biologicamente ativos tem a vantagem de fornecer uma
medida do efeito total desempenhado pelo composto analisado72.
Na figura 6 está representado um exemplo hipotético de curvas
tempo-resposta de dois fármacos distintos e genéricos. Suas potências são
distintas, embora seus efeitos totais sejam iguais, ou seja, a área sob a curva A
é igual a área sob a curva 872.
ooo..JIX)Z
Zo1=<I:a:~zwuzou
0-o TIME _DO
FIGURA6: Curvaa tempo.,..apoata de fármaooa hipotétioos e gentricos
cujoa efeitos totais te igualam
4.3-pARÂME!Ra;Bla..ÓGlca; EMPRE~ EM~ DE~
Os parâmetros bio16gicos empregados em estudos de QSAR exige
a quantificação da dose ou efeito desencadeado por um romposto biologica-
mentt ativo'2.7S. '.
Com relação à dose, encontram-se na literatura, com freqüência,
e~tudos envolvendo a potência de rompostos biologicamente ativos, expressa
através do logaritmo do inverso da concentração molar34.7O,71.72.",10gl/C.
Entre os parâmetros biol6gicos mais freqüentemente utilizados
. em estudos de QSAR, encontram-se a dose eficaz 50%, DEso, a dose letal 50%,
DLso, e a Concentraç§o Mínima Inibit6ria, MIC34.72,7S.
~7
A dose eficaz 50%, DEso, é definida como sendo a concentração
necessária para produzir 50% do efeito máximo de5encadeado por um rompos-
to biologicamente ativo7O,71.124.
A dose letal 50%, DLSO' é definida como sendo a concentração
necessária de um determinado composto biologicamente ativo para causar a
morte de 50% da população tratada 70.71.124.
Aconcentraçáo mínima inibit6ria, MIC, é um parâmetro adaptado
para avaliar a potência antimicrobiana de compostos químicos, e é definido
como sendo a mais baixa concentração de determinado composto químico
capaz de inibir ou interrom per o crescimento de um determinado microrganis-mo 70.71.124.
Em estudos de QSAR também é freqüente avaliar a potência de
com postos biologicamente ativos através de ensaios quantitativos, ou seja,
através da determinação de curvas dose-resposta ou curvas tempo-resposta.
Este procedimento é particularmente freqüente quando se deseja obter in-
formações a respeito do perfil farmacodinâmico dos compostos pesquisa-dos 34.70.71. 72,75.124,
4S
1- QSAR NO PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS
AI. interaçóesde um f'rmaro rom seu(s) receptor(es) podem. em
princípio. se~m descritas em termos das energias envolvidu nesta(s) intera-
çáQ(óes). A atividade biológica estará. assim. associada Asmudanças de ener-
gia livre que ocorrem nos processos de absorção. distribuiç-ão e
biotransformação ou à própria interação fármaco-receptor'4. A ~sposta bio-
lógica pode ser expressa, portanto. como uma função complexa envolvendo as
características estruturais de um determinado fármaco e de sua concentração
no sítio receptor34.14.
o estabeJecimento de relações quantitativas entre a estrutura e a
atividade, assume que a atividade biológica possa ser relacionada com a mu-
dança de energia livre. AG, envolvida na interaçáo f'rmaco - receptor4. Essa
mudança pode ser decomposta em termos independentes e aditivos relaciona-
dos com as variações de energia livre associadas às propriedades físico-quími-
cas de um determinado composto biologicamente ativo34.74.
Em uma Jérie de compostos análogos interagindo com um deter-
minado sistema biológico, as variaçóes de energia livre envolvidas podem ser
expressas através da equação 2034:
lJAG = lJ(AGe) + 6(AG") + lJ(AG') + R (20)
em que: AG é a variação de energia livre;
lJ é a contribuição de cada termo;
AGe, AGiae AGs são as variações de energia livre
associadas às propriedades físico-químicas que
influenciam a atividade biológica;R é uma constante
Segundo o modelo proposto por HANSCH44, os termos da equa-
ção 20 podem ser expressos por parâmetros que medem a innuência de cada
uma das propriedades físico-químicas envolvidas na determinação da atividade
biológica, por exemplo:
49
AB 8: p<1 + cn + ti& (21)
em que: AB é a atividade biológica;
C1é a constante de grupo substituinte de Ham mett;n é a constante de hidrofobicidade de Hansch;
Es é a constante estérica de Taft;
P. c. e d expressam a contribuição individual de cada
propriedade físico.;química para a atividade biológica.
Aequação 21 pode ser simples ou multiparamétrica e cada um dos
termos pode ser linear ou quadrático. devendo-se sem pre evitar a utilização
de parâmetros colineares34.6O,'9.
o planejamento racional e adequado de variações na estrutura de
um composto biologicamente ativo, pode resultar em derivados com maior
interesse terapêutico, &ejapor apresentar maior atividade, menor toxicidade
ou ainda por adquirir características farmacotecnicamente mais adequa-das 74.89.
A definição de uma série adequada ao estudo de QS~ envolve
a identificação de um composto que possua apenas algumas das propriedades
biológicas esperadas para um melhor desempenho biológico4.74.89.A otimiza-
ção das propriedades biológicas deste composto, denominado composto pa-
drão, é alcançada a partir de estudos sistemáticos. Estes envolvem o
planejamento estratégico da série de análogos, síntese e avaliação quantitativa
das propriedades físico-químicas e atividade biológica34.89.
A análise das correlações quantitativas estrutura-atividade em
uma série de compostos análogos permite, dentro de ~rtos limites, a previsão
da atividade biológica de análogos ainda não disponíveis, através da interpo-
lação ou extrapolação de valores na correlação obtida. Previsões interpolativas
são freqüentemente utilizadas Da avaliação da eficiêDcia do modelo proposto
pela correlação, deDtro dos limites de confiança estatísticos3.4,34,74,76.
o estudo das relaçõcs quantitativas eDtre a estrutura química e a
atividade biológica, QSAR, em séries adequadamente planejadas, é . única
metodologia atualmente disponívelque permite uma previsão quantitativa da
50
~
atividade biol6gica de análogos a um composto padrio, permitindo, portanto,
o planejamento racional de novos análogos a partir de equações com valor
preditivo confiável".S".89.
A decisão de continuar ou interromper o programa de síntese em
um estudo de QSAR, pode ser auxiliada pela análise da equação obtida 8 partir
de dados parciais. Assim, a introdução de novos análogos na série pode ser
interrompida quando, por exemplo, o composto de maior atividade já se en-
contra incluído entre os análogos testados".34.1".89.
o valor preditivo das correlações obtidas em estudos de QSAR
somente é válido para as estruturas similares aos componentes da série anali-
sada e dentro da faixa de valores dos parâmetros físico-químicos utilizados na
definição da correlação34,16.74,89,9s.
5.1- E5TRA1ÉGIASPARAA IEFINIÇÃO ~ SÉRIES~ COM>OSTOS AOOQUADASAO
ESIUOO DEQ)AR
Segundo MARTIN74 a série ideal de análogos derivados. de um
composto padrão não é aquela constituída, necessariamente, pelo menor nú-
mero de compostos, mas aquela que possa assegurar que o composto mais ativo
da série esteja incluído ou seja sugerido pela análise. Por outro lado, o não
estabelecimento de uma relação de energia livre com os dados obtidos, sugere
que a série não foi bem delineada ou que outros parâmetros devem ser consi-dera dos "1 "S9.
Várias estratégias de planejamento e otimização de séries para o
estudo de QSAR são descritas na Iiteratura16.19.S7.89.110.Entre elas, destacam-se
os métodos que operam por batelada e os métodos que operam por etapas.
Os métodos que operam por batelada são baseados no planeja-
mento de um pequeno número de análogos que são sintetizados e analisados
conjuntamente. Os métodos que operam por etapas, por outro lado, envolvem
a síntese e análise seqüenciada de cada análogo que, por sua vez, orienta o
planejamento do próximo composto a ser analisad074.89,
Descrevem-se a seguir, as principais estratégias utilizadas na de-
finição de séries adequadas ao estudo de QSAR.
!'I
S.l.l-INTERCORRELAÇÃO DE PARÂMETROS
o di&grama de CRAIG16 foi uma-das primeiras estratégias plane-
jadas para a escolha racional dos substituintes que devem compor uma série
de análogos adequada para o estudo de QSAR. Este método está fundamenta-
do na análise da intercorrelação de parâmetros e se baseia na construção de
diagramas que relaciona, numa distribuição cartesia~na, os parâmetros estrutu-
rais de grupos substituintes.
Na escolha dos substituintes pelo método de CRAIG16, deve-se
evitar a interdependência ou colinearidade entre parâmetros evitando, assim,
a obtenção de correlações não significativas 74,89.
O diagrama de CRAIG16 é freqüentemente utilizado e fundamen-
ta muitas das mais avançados técnicas de planejamento de séries adequadas ao
estudo de QSAR 89.
5.1.2- MÉTODOSDE OTIMIZAÇÃODE ATIVIDADEBIOLÓOICA
Estes são métodos que operam por etapas e se baseiam na escolha
seqüenciada dos compostos integrantes da série, em função da atividade bio-
lógica de cada análogo. Entre os principais métodos de otimização de atividade
biológica citam-se o esquema de TOPL]~SllO e o método seqüendal sim plex19.
5.1.2.1- O esquema d~ TOPLISS '
Esta estratégia toma como base a influência dos parâmetros (7de
Hammett40 e n; de Hansch44, que representam, respectivamente, a influência
das propriedades eletrônica e hidrofóbica de cada substituinte sobre a ativida-
de biológica observada. Ela é representada esquematicamente na forma de
duas árvores de decisão, que se aplicam respectivamente à substituiçáo aromá-
tica e à substituição alifática110.
A metodologia de escolha de substituintes proposta por TOP.
LISS110é baseada em esquemas empíricos que operam por etapas. Neste
método cada análogo é sintetizado e testado orientando a escolha do próximo
composto, através da comparação entre as atividades biológicas dos dois últi-
mos compostos te,tados.
52
Este método tem a vantagem de náo exigir determ inações quanti-
tativar>da atividade biológica dor>composto analir>ados.
5.1.2.2- O método seqüencial simplex
O método seqüencial simplex, proposto por DARVAS19,também
conhecido como técnica de otimização multidimensional74.89, consiste na pro-
posição de análogos mais potentes através da construção de diagramas empre-
gando-se a estratégia seqüencial simplex19.89.Nesta técnica considera-se os
parâmetros estruturais responsáveis pela atividade biológica sem, no entanto,
haver necessidade de quantificar suas contribuições relativas19.89.
'-
A escolha inicial dos compostos a serem testados é feita arbitra-
riamente desde que, tanto as respectivas atividades biológicas como os valores
dos parâmetros estruturais envolvidos, sejam suficientemente diferentes entre
si19.89.É sugerido, entretanto, pelo pr6prio autor do método que, quando
possível, a construção do diagrama seja iniciada com os análogos não substi-
tuído, 4-clóro substituído e 4-acetil substituído. Este método opera por etapas
e aceita llvaliações semi-quantitativa da atividade biológica19.74.89.
5.1.3- O MÉTODO DE FREE-WILSON
Este método relaciona a estrutura de compostos químicos com sua
atividade biológica sem considerar, no entanto, as contribuições de cada parâ-
metro físico-químico de cada composto ou substituinte envolvido na análise
para a atividade biológica. Este parte do princípio de que numa série de
compostos, modificados em mais de uma posição, o efeito de um mesmo
substituinte sobre a atividade biológica, deve ser diferente em função da
posição que ocupa na moléculaS7.74.89.
O método de FREE-WILSON32 é adaptado para séries de compos-
tos polissubstituídos, onde cada substituinte ocorre mais de uma vez em cada
posição analisadaS7.74.89.
5.2- MXELClS l5TA1ÍS11CQ; lJIlUZ.t\In) EMQ)AR
Vários modelos estatísticos podem descrever as relações quanti-
tativas estrutura-atividade. Entre eles destacam-se os modelos de regressão
linear _e-nãoHlte~normaJmente aplicados à proposição de Hansch34.tIO.74.
53
-- -- - - - - - - -- -- -- - - -- ---
Estes modelos permitem identificar a equaçio que melhor expres-
sa a atividade biológica em uma determ inad~ série de anáI08o,4,34,8O,74.
A contribuição de cada parâmetro estrutural envolvido na deter-
minação da atividade de compostos biologicamente ativos, pode ser analisada
através dos coeficieDtes de regressão da equação obtida'4,60.
Os parâmetros estatísticos obtidos, por outro lado, informam a
respeito da validade da equação obtida76,9S.Entre eles destacam-se o coeficien-
te de correlação, r, o desvio padrão, s, e o valor de F. Este indica com que
probabilidade a equação está representando uma correlação verdadeira entre
os resultados. O Dível de coDfiaDça, CL, é também freqüeDtemeDte utilizado
Da verificação da validade da equ-açáo3.34,74,76.9S.
5.2.1- MODELO LINEAR
O modelo de Hansch44, também conhecido por modelo extrater-
modinâmico34,74, considera a atividade biológica como sendo expressa pela
somat6ria das contribuições individuais de parâmetros físico-químicos que
expressam os efeitos hidrofóbico, eletrônico e estérico dos substituintes. Este
modelo é representado pela equação 22.
log(Vc) = ale + pD + c& + R (22)
em que: 10g(l/c) é a resposta biol6gica do composto;
n representa o efeito hidrofóbico;
D representa o efeito eletrônico;
Es representa o efeito estérico;
a, p, c medem a influência de cada parâmetro sobre
a resposta biológica;
C é a concentraçio utilizada no ensaio biológico;R é uma constante
Os parâmetros utilizados na equação de Hansch devem ser inde-
pendentes34,74. Por outro lado, sua validade deve ser justificada através de
testes estatísticos tais como o teste t de Studen~S ou o teste f16, além dos
requisitos impostos pelo próprio sistema biológico.
S4
Sabe-se que a atividade biológica n50 aumenta infinitamente com
o aumcnto da bidrofobicidadc dc compostos quím icos4.34.tIOe quc em sérics
homólogas, com dcrivados aprescntando grande variação de JipofiJiddadc, a
atividade biológica, tendo atingido o seu máximo, sofre um rápido decaimento
com o aumcnto do número de átomos de carbono nOI hom6logos34, Por esta
razão, o modelo linear de Hansch44 apresenta limitações em relaç50 a sua
aplicabilidade em diferentes sistcmas biol6gicosS.4,6O,89,
5.2.2- MODELO PARABÓUCO
o primeiro modelo matemático que descreve a dependência não
linear da atividade biol6gica em função dos parâmetros físico-químicos foi
também proposto por HANSCH44, Baseando-se no conceito de absorção e
distribuição de compostos no sistema biológico75, HANSCH propos que a
atividade biológica pode ser expressa em função do quadrado do termo que
representa o efeito hidrofóbico destes compostos34,
De forma genérica, o modelo parabólico de HANSCH44 pode ser
representado pela equação 23,
log(t/c) =IJ;/- + bn + p<1+ eM + R (23)
em que: log (t/c) é a resposta biológica do composto;
1t é parâmetro de hidrofobicidade de Hansch;
q é a constante de grupo substituinte de Hammett;
Es é o parâmetro estérico de Taft;
a, b, p, c medem as contribuições de cada parâmetro
para a resposta biol6gica;
C é a concentração utilizada no teste biológico;R é uma constante
o modelo parabólico não foi somente o primeiro mas é também,to mais utilizado e mais simples modelo ~~9 line-M\que descreve a atividade
biológica em função de propriedades físico-químicas de compostos biologica-
mente ativos".:M.74.Observou-sess,18, entretanto, que as partes ascendente e
descendente das curvas obtidas, se assemelham ao modelo linearde Hansch44,
55
Embora pequeno, o afastamento entre a curva te6rita e os pontos experimen-
tais, motivou a proposição de um novo modelo na tentativa de de.crever mais
adequadamente as relações quantitativas entre a estrutura química e a ativida-
de de compostos biologicamente ativos58.111
5.2.3- MODELOBILlNEAR
o modelo bilinear, proposto por KUBINYlss, está fundamentado
na probabilidade de compostos biologicamente ativos encontrarem seu sítio
de ação, considerando-se um sistema multicompartimentad034.58,59.60.61.
Este modelo consiste numa melhoria do modelo parabólico pro-
posto por Hansch44, que resultou em melhor ajuste da curva teórica aos dados
experimentais, pela exclusão das discrepâncias entre os modelos parabólico eIinear34.S8,S9.
o modelo biJinear 6 representado pela equação 24.
10g(l/c) =alogP - blog(fJP + 1) + jK1 + cEs + R (24)
em que: log( l/c) é a potência biológica dos análogos;
10gP representa o efeito hidrofóbico;
fJ 6 a relação entre os volumes das fases orgânica e aquosa;
q representa o efeito eletrônico;
Es representa o efeito est6rico;
a, b, p, c medem a contribuição de cada parâmetro para aatividade biológica;
R é uma constante
Uma das limitaçóes do modelo bilinear 6 a necessidade de se
obter uma quantificação precisa dos dados biológicos, o que nem sempre é
factivel34,S9.7s.Por outro lado, a aplicação deste modelo necessita de cálculos
iterativos que são mais complexo. do que a análilC de regrenão do modelo
parabólicoS9.
5.2.4- AVALIAÇÃO DA BPla13NOA DOS DIPERENTES MODBLOS
KUBINYJS6aplicou os diferente. modelos estatísticos propostos
para descrever as interações fármaco-sistema biológico, aos dados de atividade
""!6
___n - -- - -- U_u-- -- _n -- - - - ---- u- -- - - - - - n - - - - - - - . --
anrj.histamínka. determinados por FUNCK34 de uma série bom610ga de éste-
res. resultando nas equações 25, 26 e 27. A análise dedas equações demonstra
um crescente ajuste da curva teórica aos dados experimentais em relação aos
modelos linear. parab6lico e bilinear respectivamente.
modelo linear:
log (I/c) = 0.467(:1:0.23 ) 10gP - 0.31
n == 11 r == 0,843 s = 0,540 F == 20,53 (25)
modelo parab6lico:
log (fie) = -0,189 (:tO,09) 10gP2 + 1,566(:tO,56)10gP - 1,438
n = 11 r = 0,958 s = 0,298 F = 44,46 (26)
modelo bilinear.
log (fie) = 0,852(:t 0,12 )logP - 2,257 (:I:0,55)log(,8P + 1) - 0,963
n = 11 r = 0,990 s = 0,160 F = 109,96 (27)
Análise semelbante& foi feita para os dados de atividade antimi-
crobiana de análogos N,N-dimetilbenzilamônia sobre S.aureus34, obtendo-se
. as equaçóes 28 e 29, comprovando-se mais uma vez uma melbor adaptação do
modelo bilinear em relação ao modelo parab6lico, na definição de relações
quantitativas estrutura-atividade.
modelo parabólico:
log (I/M.'~ = -o,21(:t 0,1) 10gP2 + 0,90 (:I:O,t)logP + 4,80 (:t 0,1)
n = 12 r = 0,979 s = 0,158 F = Dãofornecido (28)
ri7
Il
ii'i
'II
II1llilIIi,
Illil
IIlI
11111
lil,111
11111
I""11111
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"'.''I"
1111
1111
1111
I
l'li!
('
I""
I'"
II
modelo bilinear.
log (I/mc) = 1,05(:t 0,2)logP - 1,51 (:t 0,2)log(fJP + 1) - 4,76
D = 12 r c: 0,993 s = 1,000 F = Dãofornecido (29)
EDCODtram -se na literatura vários ou tros exemplos simila-
res34.59.6O,61.89que comprovam uma melhor apJicabilidade do modelo biJiDear
Da descrição de relações quantitativas estrutura-atividade, QSAR.
111
111
lill
II11
ee
,CAPITULO 111
OBJETIVO, JUSTIFICATIVA
E PLANO DE TRABALHO
1- OBJETIVO
Este trabalho tem como objetivo a sínteset determinação da ativi-
dade antimicrobiana e quantificação da influência de grupos substituintes
sobre as propriedades hidrof6bica, eletrônica e de polarizabiJidade de análo-
gos à nifuroxazida (5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas X3)(4,xS-substituí-
das), visando o estabelecimento das relações quantitativas entre a estrutura
química e a atividade antimicrobianat QSAR, nesta série de compostos possi-
bilitandot desta format a proposição de análogos farmacologicamente supe-
riores ao com posto de partida.
00
r
2- JUSTIFICATIVA
o crescente desenvolvimento de resistência bacteriana aos anti-
microbianos atualmente disponíveis leva a uma igualmente crescente neceui-
dade e busca de novos antimicrobianos, resultando muitas vezes em
substâncias que além da atividade biológica desejada apresentam altos níveis
de toxicidade ou baixa potência, o que restringe ou impede sua apUcação na
clínica médica. Por outro lado, a descoberta e introdução de um fármaco novo
no arsenal terapeutico é muito onerosa e cada vez menos freqüenteS4,55.
Por esta razão, a tendência atual da busca de novos fármacos está
fundamentada na modificação molecular de estruturas já consagradas pelo uso,
visando identificar análogos farmacologicamente superiores ao fármaco origi-
na 154,69,74,109,112.
Entre as diversas técnicas de modificação molecular atualmente
disponíveis, encontra-se o estudo das relações quantitativas entre a estrutura
química e a atividade biológica, QSAR, como uma das técnicas mais freqüen-
temente utilizadas.
Neste contexto, a nifuroxazida (S-nitro-2-furfurilideno 4-hidroxi-
benzidrazida), fármaco atualmente utilizado como antimicrobiano de segunda
escolha no combate a infecções do trato gastro-intestinal, se mostra adequado
ao estudo de modificação molecular, uma vez que apresenta razoável atividade
antimicrobiana12.29,88,não é absorvida pelo trato gastro-intestinal conseqüen-
temente não desempenha ação t6xica2O,21,62,possui amplo espectro de
açãol2.13.54.8O,88e não provoca desenvolvimento de resistência bacteriana2.s.
Importa salientar que o estabelecimento das relações quantitati-
vas entre a estrutura química e a atividade biológica em uma série de compos-
tos análogos, permite identificar quali e quantitativamente as propriedades
físico-químicas que influenciam a atividade biol6gica considerada permitindo,
desta forma, o planejamento racional de análogos mais potentes e/ou menos
tóxicos do que o composto de partida com economia de tempo e investimentos.
61
rI
,- PLANO DE TRABALHO
Visando o estabelecimento das relações quantitativas entre a es-
trutura química e a atividade biológica, QSAR, em análogos à nifuroxazida
(S-nitro-2-furfurilideno 4-hidroxi-benzidrazida) planejou-se, neste trabalho, a
síntese de análogos X3,x.,xs-substituídos, a determinação quantitativa de
suas atividades antimicrobianu e a avaliação da influência destes substituiDtes
sobre as propriedades físico-químicas dos análogos e conseqüentemente sobre
suas atividades antimicrobianas.
A definição do padrão de substituição na estrutura da nifuro~azi-
da foi feita com base em dados da Iiteratura8,13,23,84,que dão conta de que' tanto
o grupo Ditrofurâniro como o grupo azometíDico, são elementos estruturais
que contribuem decisivamente para o estabelecimento da atividade aDtimicro-
I biaDa, se constituindo como grupo farmacofórico desta classe de agentes anti-
microbianos, tolerando, portanto, pouca ou nenhuma alteração estrutural.
Desta forma, optou-se pela variação dos substituintes nas posiçõespa7a e meta
no anel benzênico, visando alterar as características farmacocinéticas dos
aDálogos por interferêDcia em suas propriedades físico-químicas.
o espectro de variação de substituintes foi planejado com base Da
intercorrelação dos parâmetros q e 11:de Craii6, representando as proprieda-
des eletrônica e hidrofóbica de substituintes respectivamente, visando a obten-
ção de uma série de análogos adequada ao estabelecimento das relações
quantitativas entre a estrutura química e a atividade biológica.
A rota de síntese dos análogos foi baseada em métodos descritos
na literatura6,12,13,29,80,com adaptações para a proteção de grupos substituintes
vulDeráveis aos meios reacionais das diversas etapas do procedimento.
o estudo das propriedades físico-químicas dos aDálogos eDvolvi-
dos neste trabalho, se deteve na avaliação quali e quantitativa de parâmetros
relacioDados com as propriedades eletrôDicas e hidrofóbica dos grupos substi-tuintes.
Determinou-se a freqüência de absorção do grupo carbonila na
região do 1.~, como medida experimeDtal da influência eletrônica dos difereD-
tes grupos substituintes estudados sobre a polaridade dos análogos obtidos.
82
A medida da influência do efeito hidrof6bico de grupos substi-
tuinte,. sobre a lipofilicidade dos análogos, foi feita através da determinação
de seus coeficientes de partição empregando-se o método de shake-flask22 e
utilizando-se o sistema l-octanol/tampão fosfatol07.
Com relação ao parâmetro de atividade biológica, optou-se pela
determinaçáo da concentraçáo mínima inibitória, MIC, dos análogos obtidos,
empregando-se o método de diluição sucessiva em tuboS118.
A análise das relações quantitativas entre a estrutura química e a
atividade biológica, QSAR, na série de compostos estudados neste trabalho,
foi feita aplicando-se os modelos matemáticos disponíveis para esta finalida-
de44.SS.S9.6o.61,aos parâmetros estruturais e de atividade biológica obtidos.
63
T"
,CAPITULO IV
PARTEEXPERIMENTAL
,- MATERIAIS
1.1-C'CMU)JC6 PREPARA[X1;
Para a realização do presente trabalho, prepararam-se quatorze
5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidu X3,X4,XS-substituídas, em que X3 e
Xs = H e X4 = N02; Br; Cl; H; ais; OOls; OH; NH2; COCHs; °C:2H,; CFs;N(CHsh; S02NH2 e, X3,X4'XS =(OCH3h. Utilizou-se também o c1oranfenicol
como padrão de referência para a determinação da atividade antimicrobiana.
A estrutura química dos compostos acima referidos está repre-
sentada na figura 7.
X4
o~
N-N ~N02
FIGURA 7: ~NITROFURFUR'LlDENO BENZIDRAZlDAS
X3.X4,X!5-SUBSTITUíDAS
Estão apresentados na tabela 10 as faixas de fusão, pesos molecu-
lares e f6rmulas mínimas dos compostos preparados no presente trabalho.
8!5
'»\BELA 10
Faixa d. fuoio. pnoo mol.oular.o - fórmulao mrnlmaoc:t.
5-nl1ro-2-furfurllld.nob_nzldrazldaa x3.x~1x5-euba1lturdaa
- wIores nio descritos na literatura
. valores Dão corrigidos
.. BL-OBBID et.alii., Pharm.Re8., 1:42-43, 1985
86
.R'.,"
",6RM ULAR"..
X:a x.. X. RM..C .C MOLeC ULAR
H N02 H 237-239 238 30..21 Cl:zHsN-406
H Br H 240-242 239-240 33'.17 C12HeN3Ú-4Br
H a H 225-2T1 - 293,66 C12HsN3Ú4C1
H H H 214-216 220 259.22 Cl:zH9N3Ú-4
H 013 H 233-235 - 273,25 C13Hl1N30..
H 0013 H 237.239 - 289,26 C13HllN30S
H OH H 277-279 265-270 275.21 C12H9N3Ús
H NH2 H 280-283 283 274,23 C12HloN..O..
H COOb H 228-231 - 301.25 C14HuN30S
H OC2Hs H 229-230 - 303.27 C14HlsN304
H CF3 'H 199-201 - 327;n C13HeN304F3
H N(Ob)2 H 257-2S9 - 302,29 Cl-4Hl<4N..O-4
H SO:zNH2 H 270-272 - 338,23 C12HloN-40
OGi! OOb OCH3 236-237 - 349,30 ClSHlsN307
--- - - --_u_----
1.1,. REAGENIFS E SOLVENIES
1.2.1-ÁCIDOS BENZÓICOSX3rX4,xs-SUBSTITUfDOS:rea8entes Merck ou AI-
drich com grau de pureza P.A, com exceção do ácido 4-bromo-benz6ico que
foi preparado a partir da oxidação do 4-bromo-tolueno por método descrito na
Iiteratura117.
1.2.2- S-NITRO-2-FURFURlLlDENODIACETATO:reagente Merck com grau de
pu reza P.A.
1.2.3- HIDRATODE HIDRAZINA 35%(v'v):reagente de grau técnico de marca
Quiminasa, utilizado sem tratamento prévio.
1.2.4- MBTANOL:reagente de marca Nuclear com grau de pureza P.A; quan-
do utilizado nas preparações dos ésteres metílicos, foi purificado por destila-
ção em coluna de fracionamento e seco com sulfato de sódio anidro117.
1.2.5- DIMETlLFORMAMIDA, DIMETILSULF6X1DO,ÁaDo SULFÚRlro, ÁC-
DO ACÉTICO,BTANOL.FOSFATOMONOBÁSICODBS6DIO. FOSFATOBIBÁSICODB
SÓDIO E CLORETODE SÓDIO: reagentes Merck com grau de pureza P.A utiliza-
dos sem tratamento prévio.
1.2.6- DIMETlLSULFÓXIDO-d6solvente deuterado Merck, grau espectrosc6-
pico 99,9% de D, contendo 1% de TMS.
1.2.7-DIMBTlLSULF6XIDO GRAU BSPBCTROSCÓPICO.99,99f,: 'o I v e n te
Merck, mantido sobre peneira molecular 4A previamente ativada87.
1.2.8- CLORANFBNICOL:composto utilizado como antimicrobiano de refe-
rência. Este foi obtido no laboratório de Química Farmacêutica da FCF/USPe
analisado segundo metodologia descrita na quarta ediço da Farmacopéia Bra-sileira.
1.2.9-1-0CTANOL:solvente Merck, com grau de pureza P.A., utilizado após
tratamento com hidróxido de ,ódio e ácido sulfúrico2'2.
ff1
f"
1.~ MJCRORGANlSM::>E MElC6 DECUL11JRA
1.3.1- MICRORGANISMO:SUJphylococcus aureus, cep& ATCC 25923.
1.3.2- ÁGAR DESIDRATADO PARA MÉTODOS PADRONIZADOS (Biobrás): dis-
solvido e esterilizado segundo especificações de rótulo.
1.3.3- SOLUÇÁO SALINA PEPTONADA 0.1%(m/v)
CIo reto de sódio 0,85%
Peptona de carne (Biobrás) 0,1%
Água destilada. . . q.s.p. 100 mL
1.3.4-BACTOTRYPTIC SOYBROTH,1'5B:meio de cultura Difco, dissolvido e
esterilizado segundo especificações de rótulo.
se
2- MÉTODOS
21- MÉ1ODODE OBlENÇÃO DE ~NI1RO-2-FURFURlUDENOBENZlDRAZlDAS
XY'+Xs-SUBSII'IUfDAS
A preparação destes compostos envolveu três diferentes etapas
que se descrevem a seguir.
2.1.1- PREPARAÇÃODE BENZOATOSDE METILA A PARTIR DE ÁODOS BEN-
ZÓICOSX3>X.Xs-SUBSTITU(DOS;Em balão adaptado a condenndor de refluxo
protegido com tubo de cloreto de cálcio, manteve-se sob refluxo por quatro
horas o correspondente ácido benzóico X3,X4,XS-substituído, metanol previa-
mente tratado117 em excesso e ácido sulfúrico concentrado em quantidades
catalíticas. Destilou-se o excesso de metanol, obtendo-se sólido que foi filtra-
do em funil de Büchner sob pressão reduzida. O sólido obtido foi lavado com
pequenas porções de água destilada gelada e seco em dessecador contendo
sílica gel e pentóxido de fósforo.
2.1.2- PREPARAÇÃO DE HIDRAZJDAS DE ÁODOS BENZÓICOS X3>X4>XS-SUBS-
TlTU(DOS;Em balão de três bocas adaptado a condensador de refluxo e termô-
metro, aqueceu-se hidrato de hidrazina 35% (v/v) até 60°C utilizando-se manta
de aquecimento. Sob agitação magnética adicionou-se o benzoato de metila
X3,X4,XS-substituido em pequenas porções. A seguir, elevou-se a temperatura
até a ocorrência de refluxo, mantendo-se esta condição até completa dissolu-
ção do sólido. Com constante agitação manual, resfrion-se a solução em banho
de gelo, observando-se a formação de sólido que foi filtrado em funil de
Büchner sob pressão reduzida. Este foi seco em dessecador contendo sitica gel
e pentóxido de fósforo.
2.1.3-PREPARAÇAo DE S-NITRO-2-FURFURILIDENO BENZIDRAZIDAS
X3>X4>XS-SUBSTITI.J(DAS:Em balão de fundo redondo adaptado a condensador
de refluxo, adicionou-se S-nitro-2-furfurilideno diacetato à mistura de água
destilada, ácido sulfúrico concentrado, ácido acético e etanol na proporçio
8:7:8:20, respectivamente. Aqueceu-" a reação até a temperatura de refluxo
e, lentamente, adicionou-se com agitação constante a correspondente benzi-
drazida X3,X.,Xs-substituída, em proporção equimolar. Observou-se, em pou-
88
1
005 minutos, 8 formação de s6lido que foi filtrado em funil de Bücbner sob
pressão reduzida. O sólido recolhido foi lavado com água destilada e recrista-lizado de mistura DMF lágua. Os cristais assim obtidos foram lavados com
várias po~õe' de água destilada, filtrados e secos em dessecador contendo
sílica gel e pentóxido de fósforo.
22- ANÁLISESÁSlco.QUfMCJ.S
2.2.1-FAIXADE FUsAo: As determinações das faixas de fusão dos compos-
tos obtidos foram executadas em tubo capilar usando-se aparelho de marca
Quimis, utilizando óleo de silicone como banho de aquecimento. Os valores
das faixas de fusão foram confirmados em placa, usando-se aparelho tipo
Kõfler modelo 40 da Thomas Sdentific. As faixas de fusão não foram corrigi-
das.
2.2.2-ANÁLISEELEMENTAR:As análises elementares de Carbono, Hidro-
gênio e Nitrogênio foram executadas em aparelho Elemental Analyser 2400
CHN, Perkin-Elmer, no Laboratório de Análise Elementar do Instituto de
Química da USP.
2.2.3-ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO"DO INFRAVERMELHO,I.'Y.: OS espectros
no l.V. utilizados para identificação dos compostos foram registra dos em es-
pectrofotômetro F.1:J.R. 510, Nicolet, ou em F.1:J.R. 1750, Perkin-Elmer. As
amostras foram analisadas no estado sólido, em pastilhas de KBr.
2.2.4-ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA PROTÓNICA,
RMN-1H: OS espectros de RMN-1H foram obtidos em espectrômetro AC 200,
Bruker, no Laboratório de Análise Instrumental do Instituto de Química da
USP, utilizando-se DMSO-d6 com 1% de TMS oomo padrão de referência
interna.
2.2.5- ESPECTROSCOPIADE RESSONÂNCIAMAGNÉTICADE CARBONO13,
RMN-13COS espectros de RMN-1SC foram obtidos em espectrômetro AC 200,
Bruker, no Laboratório de Análise Instrumental do Instituto de Química da
USP, utilizando-se DMSO-d6 com 1% de TMS oomo padrão de referência
interna. A análise dos espectros foi feita de acordo com a numeração espedfi-
cada a seguir:
70
"X4
o .
~I ~8 8
, e 7 oN-N=C0 / N02I I
H H
23- DEIERMNAÇÃO 00 COEFJOENIE DE PAKI1ÇÁO
A determinação dos coeficientes de partição de S-nitro-2-furfuri-
lideno benzidrazidas X3,X4,XS.substituídas foi feita empregando-Je o método
de shake-flask72, utilizando-se para partição o sistema l-octanol/tampáo foda-
to pH = 1,24.
A concentração da espécie particionada, para cada composto, foi
determinada na fase aquosa através de método espectro foto métrico.
o cálculo da relação de volumes envolvida na execução da técnica
de shake-flask foi feito com base nos valores teóricos de logP de cada compos-
to. Estes foram calculados através do emprego do CLogP Program (Pomona
College)l07 pelo Prof. Dr. Hugo Kubinyi, da BASF-Ludwigshafen, Alemanha,
e cedidos para a execução do presente trabalho.
2.3.1- PURIFICAÇÃODO1-0CIANOL:Em funil de separação, para cada 300
mL de l-octanol P.A, Merck, procedeu-se à seqüência de tratamento apresen-tada na tabela 11.
71
'D\BELA 11
Etapa8 envolvidas na purificaçãode ~o mL d. 1-octanol
8
égua bidestilada desgaseificada..repetiç6es executadas at6 pH = 7,0
7:2
APA SOlUÇÃO D! LAVAG!M N° DE T!MPO (mln.)
N°801. utilizada vol. utilizado
LAVAGENSagltaçto repou8o
.1 H20 bid 60mL 3 S 30
2 NaOH 1,0 M 60mL 5 5 30
3 H20 bid 60mL 3 5 30
4 H2S041,O M 60mL S S 60
s H2Ü bid 60mL 3 S 30
6 KHC031,O M 60mL..
30D S
7 H20 bid8 60mL 3 S 30
-- -- -- ~ -- - ------- -- ---------
Ap6s o tratamento, secou-se o l-octanoJ com sulfato de ma&n6sio
aoidro, deixando-o em repouso e protegido da luz por 24 horas. Decorrido cite
período, destilou-se cuidadosamente o mesmo, recolhendo-.e 8 fração que
destilou a 96-98°C , sob pressão de 18 mm de Hg. Obteve-se 240 mL de
l-octanol puro. A análise de pureza foi determinada espectrofotometricamen-
te.
2.3.2- PREPARAÇÃODE TAMPÁOFOSFATOCOM pH = 7.2.:A preparação da
solução aquosa de tampão fosfato foi obtida pesando-se 2,00&de KH~O.. 18
,40g de K:zHP04e 81,82g de NaCl.O volume da solução foi ajustado para 1,00
litro com água bidestiJada desgaseificada.
O pH da solução obtida foi determinado em potenciômetro Me-
trohom, modelo B-536, e ajustado para 7,24 com solução aquosa de NaOH 0,1
M. A solução-estoque foi mantida em geladeira. A utilização desta solução foi
precedida de aquecimento a 25°C em banho termostatizado e diluída na pro-
porção 1:10 com água bidestilada desgaseificada.
2.3.3- PRÉ-SATURAÇÃODOSSOLVENTBS:A pré-saturação dos solventes foi
feita mantendo-se o 1-octanol e a solução tampão, na proporção 1:20 respec-
tivamente, sob agitação magnética por 8 horas em banho a 250C Decorrido
este tempo, manteve-se o sistema em repouso por 15 minutos. Separaram-se
as fases orgânica e aquosa que foram então submetidas à centrifugação a 4.000
rpm, por 30 minutos, a 25,0 :t 0,5OC.O 1-octanol pré-saturado com solução
aquosa do tampão, 1-octanol ps~ e tampão fosfato pré-saturado com 1-octanol,
tampão PIO, foram mantidos a 25,Ooc.
2.3.4- DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO
2.3.4.1- Determinação do comprimento de onda,Ã..., e coeficiente
de extinção molar, s: Estes foram determinados para cada composto, a partir
da solução do mesmo em tampão fosfato pso, com pH ajustado para 7,24 a
25,0°C.
2.3.4.2- Faixa de concentração utilizada: A faixa de concentração
utilizada para as determinações do comprimento de onda e do coeficiente de
extinção molar foi aquela situada entre 1,Oxl0-s e 7,Ox10-~, em tampão
fosfato pso, com pH = 7,24 a 25,OOC.
73
2.3.5.DETERMINAÇÃO DO COEPIQENTE DE PARTIÇÃOPELO MÉTODO DE
SHAKE-FLASK'Z1;Para cada composto a ser analisado, preparou-se uma solução
1.0x 10-2 M. em DMSO. e a partir desta, prepararam-se três soluções de partida
diluídas em tampão fodato pso pH = 7,24, nas concentraçóes de 3,Ox 10.s,
4,5 x 1O-s e 6,Ox 10-sM.
Pú concentrações das soluções obtidas foram determinadas atra-
vés de suas absorções inicial, Ai' e tinal, Ai'
Volumes calculados'Z1 de 1-octanol pst e amostra em tampão pso
foram transferidos para tubos de ensaio e mantidos sob agitação magnética em
banho termostatizado a 25,OOe por 30 minutos.
Após a partição do soluto, os sistemas foram mantidos em repouso
por S minutos. Pú fases aquosas foram recolhidas com o auxílio de pipeta de
Pasteur e submetidas à centrifugação a 4.000 rpm por 30 minutos a 25,0 :t
0,5°e. Em seguida, determinaram-se as concentrações da amostra através dos
correspondentes Ar.e E. A estabilidade de cada composto analisado foi verifi-
cada através da determinação da variação da absorbância da solução aquosa,
~, determinada no início do experimento, ti' e a absorbância da mesma solu-
ção, A.e,determinada no seu final, tf' Esta solução foi mantida durante todo o
experim ento em banho termostatizado a 25,0°C.
o valor do coeficiente de partição experimental, Papp' foi calcu-lado através da equação 30.
p - Ai -A VilJ'P- fx~A
'f Voet (30)
em que: Papp é o coeficiente de partição aparente calculadoa partir do valor de CLogP;
Ai é a absorbância da solução inicial;
Af é a absorbância da solução final;
Vaq é o volume da solução-tampão pso;Voct é o volume de 1-octanol pst
74
I
24- M?rooo DEANÁUSESIS11MÁ11CADA~IÇÃD DABANDA00 ~ÇÃD DOGRUPOCARBONJI.ANAREGIÃO00 INFRAVERMIliD
Para a determinação sistemática da posiçlo da banda de absorção
do grupo carbonila na região do infravermelho dos compostos estudados neste
trabalho, utilizou-se espectrofotômetro Shimadzu, modelo JR-470, operando
nas condições descritas na tabela 12.
'm.BKLA. 12
Condiçêea de regiatro para de1ermlnaç60 aia1emátioa
da poalç60 da banda de abaorç60 do grupo carbonlla
na reglAo do Infra-vermelho da aérie de ~nJtro-
2.furfurllldeno b.nzidrazldaa aubatltufdaa
Os espectros foram obtidos em solução de DMSO nas concentra-
ções de 0,04 e 0,08 M, usando-se um par de celas casadas de cloreto de sódio,
com 0,05 mm de caminho 6ptico contendo as soluções da amostra e do solvente,
respectivamente. Os valores de frequências foram calibrados a partir do regis-
tro da banda em 1601,4 cm-1 de filme de poliestireno com 0,05 mm de espes-Jura.
Para cada concentração utilizada, registrou-se por quatro vezes o
espectro na região entre 1750 e 1550 cm-1.A determinação da distAncia entre
a banda de absorção da carbonila e a banda de referência, foi feita traçando-se
as bissetrizes dos Angulos form ados pelas retas traça das pelas laterais das
78
I!XPANSÃODA ABCISSA lX
EXPANSÃO DA ORDeNADA lX
VElOC IDADE DE VARREDURA MÉDIA
MODO DI! VARRI!DURA NORMAL
CONTROLE DE FENDA AUTO-3
ORDENADA 9f>T
I-
bandas. Estas medidas foram feitas utilizando-se paqufmetro de marca Mitu-
toyio, com divisões de até 1/50 mm, obtendo-se leitura com incerteza de :t 0,04
cm. Para cada uma das distâncias repetiram-se as leituras por três vezes.
As freqüências de absorção dos grupos carbonila, em cm-\ foram
calculadas utilizando-se um fator de conversão. Este foi obtido medindo-se as
distâncias, em centímetros, entre as posições das bandas em 1601,4 e 1801,6
cm-1; 1028,0 e 906,7 cm-1 e, 1028,0 e 1154,3 cm-1 de filme de poliestireno
registrado nas mesmas condições de experimento descritas na tabela 12.
o fator de conversão, F, foi obtido aplicando-se regra de três à
média aritmética das três medidas tomadas com paquímetro.
o valor da freqüência de absorção do grupo carbonila, vc- o' em
cm-1, foi obtido aplicando-se a equação 31.
Vo:o = [L .F ] + 1601,4 (31)
em que:vc= o é a posição da banda de absorção do grupo carbonila
do composto analisado, em cm-1;
L é a distância entre as bandas de absorção da carbonilae de referência, em cm;
F é o fator de conversão, em cm-l/cm.
A média das leituras efetuadas nas duas diferentes concentrações
foi considerada como sendo uma estimativa do valor real da freqüência de
absorção do grupo carbonila, na região do infravermelho.
A precisão de cada medida executada foi avaliada pelo seU desvio
padrão, s. A exatidão da medida, porém, está relacionada com o erro sistemá-
tico de :t1,5 cm -1, de acordo çom as especificações do aparelho.
25- Mmxx>DE IEERMNAÇÃO DA<:."rnCENIRAÇÃOMfmM INIBITÓRIA
A determinação da concentração mínima inibitória para cada
composto obtido neste trabalho foi feita em três fases. Na primeira fase
utilizou-se o método clássiço de diluição sucessiva descrito na Iiteratura118.
Para a segunda e terceira fases adaptou-se a técnica com o objetivo de aumen-
76
tar a sensibilidade do mitodo de análise. S~rão descritos preliminarmente os
pro(cdimentos comuns às fases I, 11e 111.
2.5.1- PREPARAÇAoDE MEIOS DE CULTURA:OS mdos de cultura utilizados
neste trabftlho, ágar para métodos padronizados e caldo nutritivo TSB, forftm
preparados seguindo-se as especificações indicadas no rótulo. A esterilização
dos meios foi feita em autocJave a 121°C, durante 30 minutos. Solução salina
peptonada 0,1 %(m/v) foi preparada adicionando-se 0,1 %(m/v) de peptona de
carne à solução fisiológica.
2.5.2- PREPARAÇAoDO INÓCULO:A partir de cinco tubos com culturas jo-
vens de 24 horas de Staphylococcus aurew ATCC 25923 em ágar inclinado,
proc-edeu-se à lavagem das colônias com porções de 2,0 mL de caldo nutritivo
TSB para cada tubo. Recolheu-se a suspensão em frasco contendo contas de
vidro de 3,0 mm de diâmetro e barra magnética medindo 9x22 mm. Manteve-
se a suspensão sob agitação magnética por 30 minutos. Transferiu-se 1,0 mL
desta suspensão para frasco contendo 9,0 mL de caldo nutritivo TSB, contas de
vidro e barra magnética, o que forneceu suspensão com 1/10 da concentração
de microrganismos da suspensão original. Manteve-se esta suspensão sob agi-
tação magnética por 15 minutos. Repetiu-se est~ operação a fim de obter
suspensões de 1,Ox10-2 ; 1,Ox 10-3 ; 1,Oxl0-4; 1,Oxl0-5 e 1,Ox 10-6 microrga-
nismos/mL, em relação à suspensão original.
2.5.3- CONTAGEMDO NÚMERODE CÉLULASVIÁVEIS:Considerando-se
que cada colônia resulta da multiplicação de um único microrganismo, a con-
tagem de colônias desenvolvidas numa placa de Petri reflete a população
microbiana viável do in6cu10118.Com base nisto, procedeu-se à diluição seria-
da, c.omo descrito no item anterior, de modo a c.onseguir na placa de Petri um
número de colônias entre 30 e 300. Dentro destes limites de variação a conta-
gem é precisa, uma vez que se visualiza cada colônia individualmente.
A viabilidade de células sobreviventes foi determinada pelo mé-
todo padrão de contagem por semeadura em profundidade118.
2.5.4-MÉTODO DE DILUIÇÃO SUCESSIVA -FASEI: Para cada composto a ser
testado, utilizaram-se duas séries de 12 tubos de ensaio medindo 1Sx1S0 mm.
Estes foram esterilizados e numerados de 1 a 12. Para cada tubo foi transferido
77
_u - - _n__--- - u - --- --------_u - - _u.
1.0 mL de caldo nutritivo TSB. com exceção do tubo 1. Nos tubos 1 e 2 foram
colocados }.O mL de soJuçio antim icrobiana 0.9x 1O-~ em DMSO. Após
hornogeneizaç.ão do tubo 2, pipetou-se 1,0 mL desta solução e transferiu-se
para o tubo 3. Esta operação foi repetida sucessivamente até o tubo 11.
usando-se sempre uma nova pipeta a cada diJuição. Adicionou-se em todos os
tubos 1,0 mL do in6culo com exceção do tubo 11. Homogeneizaram-se todos
os tubos e incubaram-se a 33OC.
Leituras de inibi~ão/crescimento microbiano foram executadas
ap6s 18, 24 e 48 horas, observando-se a cada leitura o controle de esterilidade
da solução-teste, tubo 11, e o controle de crescimento microbiano, tubo 12.
Havendo ação do composto analisado sobre o microrganismo. os
tubos iniciais apresent&r-se-ão límpidos. O primeiro tubo que apresentar tur-
vação ou outro indício de crescimento microbiano. demonstrará que a concen-
tração do antimicrobiano contida neste tubo não foi suficiente para inibir o
crescimento bacteriano. Desta forma, considera-se a concentração de antimi-
crobiano do tubo imediatamente anterior como sendo a concentração mínima
inibitória.
2.5.5- MÉTODODEDILUIÇÃOSUCESSIVA- FASE11:Considerando-se que a
metodologia descrita na fase] utiliza fator 2 de diJuição, ou seja, cada tubo
possui duas vezes a concentração do antimicrobiano do tubo subseqüente,
verifica-se a presença de faixa bastante ampla entre as concentrações de tubos
vizinhos. Por esta razão, planejou-se uma determinação mais precisa da faixa
onde se situa a concentração mínima inibitória de cada composto. Descreve-se,
a seguir, a metodologia desenvolvida para execução da fase 11.
Partiu-se de solução 1,8xI0-3M do antimicrobiano em DMSO, a
fim de obter solução 1,8xI0-4M. Esta diluição foi feita medindo-se 1,0 mL da
solução-m ãe e diluindo-se 1:1 (vlv) em DMSO. A solução resultante foi diluída
em 8,0 mL de caldo nutritivo TSB.
Fixou-se o volume final da solução desejada em 12,5 mL e a
concentração em duas vezes o valor da concentração mínima inibitória obtida
na fase J. Desta forma, o volume da solução 1,8xI0-4M a ser diluída para 12,5
mL em caldo nutritivo TSB variou de acordo com a concentração mínima
inibitória obtida na fase) para cada composto.
78
Para cada substância analisada na fase J. utHizaram-seduu s~ries
de quatro tubos esterilizados e numerados, com concentrações intermediárias
situadas na faixa de concentração mínim a inibitória obtida na fue J.
As concentrações de antimicrobiano planejadas para execução da
fase]J foram obtidas utilizando-se a relação de volumes descrita na tabela 13.
'D\BELA 18
Volumes utilizado8 n8 determinação da
concentração mínima inibitória
- FASE 11 -
A execução da fase II foi feita utilizando-se pipetador automático
Transferpette digital, Merck, com capacidade de 200 a 1000pL, com ponteiras
descarmveis de poJipropileno.
Os tubos preparados foram homogeneizados e incubados a 33°C.
Leituras de inibição/crescimento microbiano foram feitas após 18, 24 e 48horas.
O controle de contaminação foi feito atrav~s de microscopia em
lâminas coradas pelo método de coloração diferencial de Gram118.
2.5.6-MÉTODO DE DILUIÇÃO SUCESSIVA -FASE 111:
Considerando-se que os valores de concentração mínima inibit6-
ria na fase J] para compostos pouco ativos apresentam intervalos maiores entre
79
TUBO IN6c ULO AMOSTRA TSB VOLUME FINAL
N° mL mL mL mL
1 1.0 0.9 0.1 2.0
2 1,0 0.8 0.2 2.0
3 1.0 0,7 0.3 2.0
4 1.0 0,6 0.4 2.0
----------
a~ concentrações de tubos vizinbos, planejou-se a fase J]J com o objetivo de
aumentar a precisão do método.
Ametodologia desenvolvida para a execução da fase]]J foi basea-
da naquela desenvo)vida para a fase IJ, com as adaptações que se descrevem a
seguir.
Partiu-se da solução 1,8xI0-4M do antimicrobiano descrita no
item anterior, a fim de obter, para cada composto, so)ução com duas vezes o
valor da concentração mínima inibitória obtida na fase n.
o número de tubos a ser interpolado entre os extremos da faixa
onde se situa a concentração mínima inibit6ria na fase JI, foi estabelecido em
função do intervalo desej ado entre concentrações de tubos vizinhos.
Os volumes de solução de antimicrobiano e de meio de cultura a
serem utilizados foram calculados a partir da concentração planejada para cada
tubo.
Os volumes calculados consideraram até centésimos de mL. Por
esta razão utilizou-se o pipetador automático descrito na fase 11e micro-serin-
ga Hamilton, SGE, com capacidade para até 100 pL.
Os tubos preparados foram bomogeneizados e incubados a 33°C.
Leituras de inibição/crescimento microbiano foram feitas com 18, 24 e 48
boras.
Controles de crescimento positivo e negativo acompanharam cada
teste executado. O controle de contaminação foi feito através de microscopia
em lâminas coradas pelo método de coloração diferencial de Gram118.
26- ANÁUSE DE REGRI5SlD
As análises de regressão apresentadas no presente trabalho foram
executadas em computador AT-286, utilizando programas desenvolvidos e gen-
tilmente cedidos pelo Prof. Dr. Hugo Kubinyi, da BASF-Ludwigshafen, Ale-manha.
80
