UNIDADE IX HORMNIOS E REGULADORES DE CRESCIMENTO

HORMNIOS E REGULADORES DE CRESCIMENTO

PARTE I - INFORMAES GERAIS 1. INTRODUO As plantas so organismos multicelulares complexos, necessitando para o seu desenvolvimento ordenado um eficiente meio de comunicao entre os rgos, tecidos e clulas via simplasto e/ou apoplasto. Para coordenar suas atividades, as clulas da planta devem ser capazes de se comunicar, frequentemente, a diferentes distncias (entre rgos, por exemplo). Os principais meios de comunicao intercelular so os hormnios, mensageiros qumicos primrios que carregam a informao entre clulas e, desta forma, coordenam o seu crescimento e desenvolvimento. Estudos realizados durante o ltimo sculo tm mostrado que o desenvolvimento da planta regulado por cinco principais classes de hormnios: auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e cido abscsico (Figura 1). Molculas receptoras especficas correspondentes para cada um dos hormnios de planta, esto presentes nas clulas alvo (onde o hormnio vai atuar) e a ligao hormnio-receptor parece desencadear as respostas. Dentre estas classes de hormnios, algumas promovem enquanto outras inibem vrios aspectos do desenvolvimento da planta, podendo as mesmas atuar sozinhas ou em conjunto (balano hormonal).

Figura 1 Estrutura dos cinco hormnios clssicos de plantas (Kende & Zeevaart, 1997). 215

2. CONCEITOS DE HORMNIO E DE REGULADORES DE CRESCIMENTO De acordo com a maioria dos fisiologistas de plantas, o Hormnio de planta (tambm chamado de Fitohormnio) um composto orgnico sintetizado em uma parte da planta e translocado para outra parte, onde, em baixa concentrao, causa uma resposta fisiolgica (promoo ou inibio). Para esclarecer esse conceito precisamos fazer as seguintes consideraes. Como os hormnios devem ser sintetizados pelas plantas, nutrientes inorgnicos (como Ca2+ e K+) que causam importantes respostas nas plantas, no so considerados hormnios; A definio tambm estabelece que o hormnio deve ser translocado na planta. No entanto, isso no significa que o hormnio no possa causar alguma resposta na clula onde ele produzido; Os hormnios so geralmente efetivos em concentraes em torno de 1,0 M. Muitas outras substncias orgnicas sintetizadas pelas plantas, como sacarose, aminocidos, cidos orgnicos, vitaminas, etc., no se incluem no conceito de hormnio, pois so encontradas em elevadas concentraes nas plantas (1,0 a 50 mM). O termo Regulador de Crescimento normalmente empregado para compostos naturais (fitohormnio e substncias naturais de crescimento) ou sintticos (hormnio sinttico e regulador sinttico) que exibem atividade no controle do crescimento e desenvolvimento da planta. 3. IDENTIFICAO DE HORMNIOS Os mtodos utilizados para identificar os hormnios podem ser agrupados em trs categorias: Bioensaios, Anlise Instrumental e Imunoensaios. a) Bioensaios A atividade biolgica de hormnios ou de extratos de plantas comumente testada pela aplicao deles a sistemas vegetais em que se conhece a resposta para aquela classe particular de hormnio. Esses testes so conhecidos como Bioensaios. Portanto bioensaio a medida do efeito de uma substncia biologicamente ativa, conhecida ou no, em material vivo, cuja resposta conhecida e proporcional concentrao. Por dcadas, os bioensaios foram os principais meios, se no os nicos, para obteno de informaes quantitativas e qualitativas cerca dos hormnios. Para que um bioensaio seja til ele precisa atender trs principais critrios: O sistema deve responder especificamente quele hormnio ou classe de hormnio. A resposta deve ser verificada em baixas concentraes do hormnio A magnitude da resposta deve oferecer um relacionamento quantitativo com a concentrao do hormnio O bioensaio precisa ser escolhido de acordo com a substncia que est sendo estudada. Assim, se estivermos estudando giberelinas, precisamos utilizar um teste especfico para 216

giberelinas. Alm disso, toda vez que um extrato vegetal testado, deve-se montar uma curva-padro com doses conhecidas da substncia padro (por exemplo, cido giberlico). A figura 2 ilustra um bioensaio tpico que relaciona a concentrao de auxina (AIA cido indol actico) com o crescimento de segmentos de caule de ervilha. Note que o crescimento aumenta com o aumento da concentrao de AIA, atingindo um timo. Concentraes acima do timo resultam na reduo da taxa de crescimento, ou seja, se a concentrao de auxina for muito alta pode ocorrer inibio do crescimento. Quando este teste usado para determinar a quantidade de auxinas em um extrato vegetal, deve-se trabalhar na faixa em que a resposta linear (observe no grfico que o crescimento linear quando as concentraes esto na faixa de zero a 0,1 mg L-1 de AIA).

Figura 2 Bioensaio relacionando a concentrao de auxinas com o crescimento no escuro de sees de caules de ervilha (Hopkins, 2000) Alguns outros exemplos de bioensaios: o teste da curvatura do colepilo (auxinas), o teste do milho ano (giberelinas), o teste de preservao da clorofila (citocininas), o teste do fechamento estomtico (cido abscsico), estiolamento de plantas de ervilha (etileno), etc. Para maiores detalhes consulte o livro do FERRI (1985). O uso de bioensaios para testar a atividade de hormnios continua sendo, ainda, uma alternativa vivel. No entanto, os avanos na anlise instrumental e na imunoqumica tm substitudo quase totalmente os bioensaios na anlise de rotina. b) Anlise Instrumental Na segunda metade do Sculo XX, o desenvolvimento da qumica analtica e da anlise instrumental permitiu aos investigadores obter maiores avanos na pesquisa com hormnios de planta. Para se ter uma idia, at o final da dcada de 1950 no havia tcnicas seguras para quantificar o hormnio gasoso, etileno. Tcnicas fsico-qumicas, tais como HPLC (cromatografia lquida de alta performance) e cromatografia gasosa em conjunto com a espectrometria de massa (GC MS), tm tornado possvel a anlise quantitativa de hormnios (inclusive do etileno) com velocidade, sensibilidade e preciso (Consultar Davies, 1988).

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c) Imunoensaios Outra tcnica que tem ganhado considervel importncia para a anlise de hormnio o imunoensaio, incluindo Radioimunoensaio e o teste ELISA. Imunoensaios, disponveis para os quatro grupos de hormnios no gasosos (auxinas, giberelinas, citocininas e cido abscsico), empregam anticorpos (produzidos em animais, como ratos) que reagem com o hormnio (antgeno). A quantificao pode ser feita pela diferena na radioatividade do precipitado entre um controle e a amostra desconhecida (Radioimunoensaio). No caso do teste ELISA, uma enzima, a fosfatase alcalina, ligada ao anticorpo e, a reao da enzima usada para quantificar o imunoprecipitado (Consultar Davies, 1988). OBS: Os mtodos de quantificao de hormnios, principalmente os mais modernos, requerem extrao com solventes especficos e uma purificao parcial.

4. MECANISMO GERAL DE AO DOS HORMNIOS A seqncia de eventos iniciada pelos hormnios pode geralmente ser apresentada em trs estgios (Figura 3): a percepo do sinal; a via de transduo e amplificao do sinal; e a resposta final.

Figura 3 Um modelo para a ao de hormnios de plantas (Hopkins, 2000) 218

a) A percepo do sinal O Sinal a que nos referimos pode ser alguma mudana no ambiente (alterao na umidade do solo, na temperatura do ar, na concentrao de ons, respostas luz, etc.) ou no desenvolvimento da planta (germinao ou dormncia, passagem do desenvolvimento vegetativo para o reprodutivo, formao de sementes e frutos, senescncia, queda de folhas, amadurecimento de frutos, etc.). Estes sinais podem induzir a produo de hormnios. A percepo do sinal envolve a reao do hormnio com o receptor. O hormnio de planta pode difundir-se de clula para clula atravs do simplasto ou do apoplasto. Em cada evento a clula destinada a responder ao hormnio, conhecida como clula alvo, deve ser capaz de detectar a presena do hormnio, o que feito atravs de receptores. A deteco acompanhada pela interao entre o hormnio e o receptor celular, o qual especfico para o hormnio e caracterstico da clula alvo. Estes receptores so glicoprotenas que se ligam reversivelmente com o hormnio. A formao do complexo ativo hormnio-receptor, completa o estgio de percepo do sinal. b) Transduo e Amplificao do Sinal Nesse estgio, o complexo ativo hormnio-receptor inicia uma cascata de eventos bioqumicos/moleculares que finalmente levam resposta final. Nesse ponto, importante distinguir duas classes de mensageiros. O hormnio considerado um Mensageiro Primrio por que ele identifica e inicia a mensagem original na superfcie celular. Outras molculas de sinalizao (Ca2+, Inositol trifosfato IP3, AMP cclico, etc.) so considerados Mensageiros Secundrios. Estes mensageiros secundrios providenciam a amplificao do sinal original (identificado pelo hormnio), iniciando, assim, uma ou mais vias de transduo de sinal. Um exemplo: a raiz percebe a reduo na umidade no solo (SINAL) produzindo o hormnio cido abscsico - ABA (mensageiro primrio). ABA translocado para as folhas, onde altera a concentrao de mensageiros secundrios (Ca2+ e IP3) no citosol das clulas-guardas. Esses mensageiros secundrios vo amplificar o sinal, atravs de trs vias especficas, as quais produzem o fechamento estomtico (Resposta Final). c) A Resposta Final A resposta de cada clula para sinais identificados pelos hormnios, depende de dois principais fatores: (1) seu programa de desenvolvimento, isto , os tipos de genes que esto sendo expressos no tempo de exposio ao sinal; (2) a concentrao de outras molculas de sinalizao (mensageiros secundrios). Dependendo da velocidade da resposta, as vias de transduo de sinal podem provocar ou no alteraes na expresso gnica. Em alguns casos, a resposta envolve alterao na atividade de enzimas pr-existentes ou na abertura de canais de ons. Em outros casos, a resposta envolve a ativao ou inibio de fatores de transcrio, os quais alteram a expresso gnica. Os resultados mais recentes sobre o modo de ao dos hormnios, inclusive para respostas especficas, sero descritas posteriormente. 219

PARTE II - INFORMAES ESPECFICAS SOBRE AS PRINCIPAIS CLASSES DE HORMNIOS 1. AUXINAS: HORMNIO DO CRESCIMENTO 1.1A Descoberta Os estudos desenvolvidos por Went (1926) demonstraram inequivocamente que a curvatura do colepilo (folhas modificadas que cobrem a parte area de gramneas na fase inicial do estabelecimento da plntula) e, consequentemente, o seu crescimento, em resposta luz, era influenciado por uma substncia qumica produzida no pice do coleptilo (Figura 4). Essa substncia era transportada lateralmente para o lado sombreado, onde ocorria o maior crescimento. Essa substncia se enquadrava perfeitamente no conceito de hormnio, visto que ela era produzida em um local e transportada em mnimas quantidades para o seu stio de ao. Visto que essa substncia promovia o alongamento do tecido do coleptilo, F. Klg e outros denominaram o composto de Went de AUXINA (do grego, auxein que significa crescer, to increase, to growth).

Curvature (degrees)

20 15 10 5 0 0,1 0,2 0,3 0,4 IAA Concentration (mg L-1)

Figura 4 Estudos realizados por Went, demonstrando a relao entre a curvatura do coleptilo e a concentrao de AIA no lado sombreado (Hopkins, 1998). Na dcada de 1930 dois grupos de pesquisadores (F. Klg e A. J. Haagen-Smith na Holanda e K. V. Thimann nos Estados Unidos) identificaram a auxina como sendo o cido Indol-3-Actico (AIA). Posteriormente, outras auxinas naturais foram descobertas (cido Fenil-Actico e cido 4-Cl Indol-3-Actico), porm, o AIA de longe a mais abundante e 220

mais relevante do ponto de vista fisiolgico (Figura 5). Em face da estrutura relativamente simples do AIA (IAA na figura), os laboratrios foram capazes de sintetizar vrias molculas com atividade de auxina, as quais so conhecidas como auxinas sintticas (cido Indol-3Proplico AIP ou IPA; cido Naftaleno Actico ANA ou NAA; cido 2,4 diclorofenoxiactico 2,4 D, dentre outros).

A

B

Figura 5 Estruturas de auxinas naturais (A) e de algumas auxinas sintticas (B) (Taiz & Zeiger, 1998). A definio inicial de auxina inclua todas as substncias naturais e sintticas que estimulavam o alongamento em coleptilos e sees de caules. No entanto, sabe-se hoje que as auxinas afetam muitos outros processos na planta. Em face disso, Cleland (1996) recomendou a seguinte definio para auxinas: Um composto que tem um espectro de atividades biolgicas similar, porm, no necessariamente, idntico quele do AIA. Isto inclui a habilidade para: Induzir o alongamento em coleptilos isolados ou sees de caules; Induzir diviso celular em tecidos de callus na presena de citocininas; Promover a formao de razes laterais em superfcies cortadas de caules; Induzir o crescimento de frutos partenocrpicos; Induzir a produo de etileno. Embora a estrutura das auxinas ativas sejam quimicamente diversas, uma comparao destas em pH neutro revela que todas as estruturas possuem uma carga negativa forte no grupo carboxlico (da cadeia de carbono) e uma carga positiva fraca na estrutura do anel. Estas cargas so sempre separadas por uma distncia de 0,5 nm, independente do tipo de auxina (Figura 6). Esta separao de carga pode ser um requerimento estrutural essencial para que a molcula tenha atividade de auxina.

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Figura 6 Formas dissociadas de auxinas naturais e sintticas, mostrando a separao de cargas nas molculas (Taiz & Zeiger, 1998). Alguns compostos sintticos, por exemplo, o cido -(p-clorofenoxi) Isobutrico (PCIB), atuam inibindo substancialmente os efeitos das auxinas. Estes compostos so conhecidos como ANTIAUXINAS e, quando aplicados planta, podem competir com o AIA pelos stios de ligao dos receptores especficos, inibindo a ao normal da auxina. Esta inibio pode ser corrigida pela adio de AIA em excesso, indicando que auxinas e antiauxinas competem pelos stios de ligao aos receptores. 1.2 Ocorrncia e Metabolismo do AIA. O AIA de ocorrncia bastante ampla no reino vegetal. Ela ocorre principalmente em rgos que esto crescendo ativamente, tais como meristemas apicais da parte area, folhas jovens e frutos em desenvolvimento e so os stios primrios da sntese de AIA. Embora o AIA possa ser produzido, tambm, em folhas maduras e nos pices radiculares, o nvel de produo nesses tecidos usualmente baixo. O AIA estruturalmente relacionado ao aminocido triptofano e estudos iniciais sobre a biossntese de AIA foram focalizados tendo o triptofano como o provvel precursor. A partir desses estudos, quatro vias de sntese de AIA dependentes de triptofano foram identificadas em plantas e bactrias. Destas, a via do cido Indol-3-Pirvico (IPA) , provavelmente, a mais comum nos vegetais. Esta via envolve a desaminao do triptofano para formar o IPA, o 222

qual sofre descaboxilao, produzindo o Indol-3-Acetaldedo. Este finalmente oxidado por uma desidrogenase especfica, produzindo o AIA (Figura 7).

Figura 7 Biossntese de AIA a partir do triptofano (Taiz & Zeiger, 1998). Em adio a estas vias dependentes de triptofano, estudos com mutantes tm evidenciado que as plantas podem, tambm, sintetizar AIA por uma via independente do triptofano. Um desses estudos foi conduzido com um mutante de milho (orp), o qual apresenta mutaes nos genes que codificam as subunidades da enzima que catalisa a etapa final da biossntese de triptofano, a sintase do triptofano. O mutante orp requer aplicao exgena de triptofano para sobreviver. No entanto, o mutante incapaz de converter triptofano em AIA, mesmo quando o triptofano oferecido em altas concentraes. A despeito do bloqueio da biossntese de triptofano, o mutante orp contm um montante de AIA que cerca de 50 vezes maior do que o da planta tipo selvagem (que no sofreu mutao e, portanto sintetiza o triptofano normalmente). Essa uma clara evidncia para a existncia de vias de biossntese de AIA independentes do triptofano. Estudos posteriores com mutantes de Arabidopsis e de tomate (que tambm eram incapazes de sintetizar triptofano) estabeleceram que o ponto de ramificao para a biossntese de AIA (sem passar pelo triptofano) o Indol ou seu precursor, Indol-3-Glicerol Fosfato. 223

Embora o AIA na forma livre seja a forma biologicamente ativa do hormnio, a maioria de auxinas em plantas encontrada na forma conjugada, em um estado covalentemente ligada. Estas auxinas conjugadas tm sido identificadas em todas as plantas superiores e so geralmente inativas. O AIA forma conjugados com compostos de baixa massa molecular (glicose, mio-inositol e amidas) e de alta massa molecular (glicoprotenas). Como j comentamos anteriormente, a maior concentrao de auxinas livre nas plantas encontrada nos meristemas apicais da parte area, folhas jovens e frutos em desenvolvimento, visto que eles so os stios primrios da sntese de auxinas. No entanto, como a auxina amplamente distribuda na planta, o metabolismo do AIA conjugado pode contribuir na regulao dos nveis de auxina livre. Por exemplo, durante a germinao de sementes de milho, o conjugado AIA-mio-inositol translocado do endosperma para o coleptilo, via floema, e, parte do AIA livre produzido no coleptilo pode derivar da hidrlise desse AIA conjugado. Como a biossntese, a degradao enzimtica de AIA parece envolver mais de uma via. Uma dessas vias pode envolver a oxidao do AIA por enzimas peroxidases, produzindo o 3metilenooxidol, via descarboxilao. No entanto, um processo de oxidao, sem que ocorra descaboxilao, parece ser a principal via de degradao do AIA, a qual produz o cido Oxidol-3-Actico. Assim, o pool de AIA no citosol metabolisado, tanto via conjugao como pelo catabolismo puramente oxidativo (sem descarboxilao). O pool de AIA nos cloroplastos protegido desses processos, sendo regulado pela quantidade de AIA no citosol, com o qual ele est em equilbrio. 1.3 Transporte de AIA H mais de 50 anos foi descoberto que, em sees de coleptilos isolados, o AIA movese preferencialmente do pice para a base (basipetalmente). Esse tipo de transporte tem sido chamado de TRANSPORTE POLAR BASPETO. A auxina o nico fitohormnio que transportado desta forma. Visto que o pice da parte area serve como a principal fonte de auxina para a planta inteira, o transporte polar contribui para a formao de um gradiente decrescente de auxina da parte area para as razes. Esse gradiente longitudinal de auxina parece controlar alguns processos na planta, incluindo o alongamento do caule, a dominncia apical, a cicatrizao de ferimentos e a senescncia de folhas. A elucidao do mecanismo quimiosmtico para o transporte de solutos na dcada de 1960 (Mitchel), permitiu a criao de um modelo para explicar o transporte polar de auxinas (Figura 8). A primeira etapa no transporte polar o influxo da auxina (1). Esta absoro pode ser passiva ou ativa. Essa dupla possibilidade depende fortemente do pH do apoplasto. A forma no dissociada do AIA (AIAH), na qual o grupo carboxlico est protonado, lipoflica e difunde-se livremente atravs da bicamada lipdica. Visto que a H+-ATPase da membrana plasmtica mantm normalmente a soluo na parede celular (apoplasto) com pH em torno de 5,0, cerca de metade das molculas de AIA (que tem pKa = 4,75) no apoplasto poder estar na forma no dissociada e, portanto, poder difundir-se passivamente para dentro da clula, a favor do seu gradiente de concentrao. O restante da auxina na forma dissociada (AIA-) absorvida ativamente, via um transporte ativo secundrio (cotransporte), mediado por um simporte AIA-1 /2 H+. Uma vez que auxina entra no citosol, o qual tem um pH em torno de 7,2, quase todo o AIA poder estar na forma dissociada (AIA-1). Esse AIA dissociado deixa a clula, efluxo (2), via um carreador que utiliza a diferena de potencial de membrana que negativo dentro da clula. Uma feio crucial desse modelo que o efluxo de AIA-1 ocorre preferencialmente na membrana basal de cada clula, onde o carreador de efluxo de AIA parece estar localizado. 224

De acordo com esse modelo, a repetio da absoro (influxo) de AIA na parte apical da clula (1) e a preferencial sada (efluxo) na base de cada clula (2), garante a ocorrncia do transporte polar.

Figura 8 Modelo quimiosmtico para o transporte polar de auxinas (Taiz & Zeiger, 1998). Por outro lado, o AIA que sintetizado nas folhas maduras parece ser transportado para o resto da planta, via floema. Nesse transporte, a auxina pode mover-se em diferentes direes e em velocidades muito maiores do que aquelas observadas no transporte polar. Algumas evidncias sugerem que o transporte de auxinas a longa distncia via floema importante para controlar alguns processos, como a diviso nas clulas do cmbio vascular e a formao de razes laterais. Em algumas situaes, o AIA na forma conjugada parece ser transportado via floema, para as regies de crescimento. Do exposto acima, v-se que o nvel de AIA livre no citosol determinado por alguns processos interconectados (Figura 9). A soma total desses processos em um dado local na planta determina a quantidade de AIA livre disponvel para a clula.

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Tryptophan-dependent biosynthesis

Tryptophan-independent biosynthesis

IAATransport

Conjugation

Compartimentation in chloroplast

Oxidation Descarboxylation

Figura 9 Fatores que influenciam os nveis de AIA livre (representada pelo cido indol actico - AIA ou IAA) em clulas de plantas (Taiz & Zeiger, 1998).

1.4 Papel Fisiolgico

a)Alongamento celular O constante suprimento de auxinas para a regio subapical do caule ou do coleptilo requerido para o continuado alongamento das clulas. A relao entre auxinas e o controle do crescimento em alongamento da raiz tem sido bem mais difcil de demonstrar. Originalmente foi proposto que respostas de razes e da parte area s auxinas eram similares, exceto que a concentrao tima de auxina muito menor nas razes. Assim, o crescimento da raiz seria fortemente inibido pela auxina em concentraes que promovem alongamento em caules e em coleptilos. Esta inibio do crescimento pode estar associada ao estmulo na sntese de etileno, pelas altas concentraes de auxinas. Para entendermos o papel das auxinas no alongamento celular, devemos inicialmente recordar que a expanso da clula vegetal ocorre de acordo com a seguinte equao: Taxa de Crescimento = m (p Y) Em que: m = extensibilidade da parede celular; p = potencial de turgescncia; e Y = potencial de turgescncia limite para que ocorra o crescimento. Primeiramente, para que ocorra o crescimento, a clula deve absorver gua atravs da membrana plasmtica, o que impulsionado pelo gradiente de potencial hdrico (o potencial hdrico no interior da clula menor que no meio externo ou no apoplasto). A entrada de gua

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na clula produz um aumento no potencial de turgescncia, que atua sobre a parede celular. Quando o valor de p supera a presso limite (Y), a parede se distende e a clula cresce. Alternativamente, alteraes nos valores de m (extensibilidade da parede celular) podem alterar os valores de Y. Clulas com paredes mais extensveis crescem com maior facilidade. Muitas evidncias indicam que a auxina causa um aumento na extensibilidade da parede (m), ou seja, na presena de auxina a parede celular se distende mais facilmente e, consequentemente, a clula se expande. A hiptese aceita para explicar o efeito da auxina no alongamento celular conhecida como HIPTESE DO CRESCIMENTO CIDO. Esta hiptese estabelece que a auxina causa um aumento no efluxo de H+, com conseqente queda no pH do apoplasto. Isto ativa inicialmente as expansinas (grupo de protenas) que atuam quebrando a spontes de hidrognio das ligaes cruzadas entre as microfibrilas de celulose e as hemiceluloses. Aps, outras enzimas so ativadas (hidrolases, pectinases, celulases e hemicelulases) que podem atuar sobre os componentes da parede celular, provocando seu afrouxamento e aumentando sua extensibilidade. De acordo com essa hiptese, a auxina poderia aumentar a taxa de efluxo de H+ atravs da membrana plasmtica agindo sobre os seguintes processos: aumentando a atividade da H+ATPase ou aumentando a sntese da H+-ATPase. Evidncias para ambos os mecanismos tm sido obtidas (Figura 10).

Figura 10 - Modelo atual de extruso de H+ induzido pelo AIA. Em muitas plantas, os dois mecanismos podem ocorrer. Independente de como o bombeamento de H+ seja aumentado, o afrouxamento da parede induzido pela acidez mediado pelas expansinas. (Taiz & Zeiger, 1998) importante destacar que a acidificao da parede celular no a nica maneira pela qual a auxina induz o alongamento de clulas de plantas. A auxina deve afetar outros importantes processos relacionados ao crescimento celular, tais como, absoro e produo de solutos osmticos, alm de controlar o crescimento e a manuteno da estrutura da parede 227

celular. A absoro de solutos, como j vimos, depende, em grande parte, da atividade da H+ATPase, a qual induzida pela auxina. A auxina tambm aumenta a atividade de certas enzimas envolvidas na biossntese de polissacardeos. Esses polissacardeos podem ser utilizados na sntese de novos materiais da parede celular, contribuindo para a continuao do crescimento celular. b) Tropismo e Nastismos O poder de movimento geralmente visto como uma caracterstica animal, no associado s plantas. O movimento em plantas superiores no envolve locomoo como nos animais e tambm no muito rpido. Em plantas o movimento geralmente lento, porm o fator chave que determina a orientao da planta no espao. So reconhecidas duas categorias principais de movimento em plantas: Movimento de Crescimento - so irreversveis e resultam do crescimento diferencial dentro de um rgo; Movimentos por variao de Turgescncia - so reversveis, resultando de mudanas de volume de certas clulas, mais freqentemente associadas a um rgo especial, o pulvino. Dentro destas duas categorias, podemos distinguir entre NASTISMOS E TROPISMOS. NASTISMOS As respostas nsticas no apresentam uma direo vetorial em relao ao estmulo. A direcionalidade das respostas nsticas determinada ou depende apenas dos tecidos. Movimentos Nsticos associados ao crescimento diferencial: Epinastia a curvatura para baixo de um rgo, comumente pecolos e folhas, cujos pices so inclinados para baixo. No se trata de uma resposta gravidade, porm, parece estar associada distribuio diferencial de auxinas entre o lado superior e o inferior do pecolo, o que produz o crescimento diferencial. Epinastia uma resposta comum ao hormnio etileno ou concentraes elevadas de auxinas. Isto ser mais bem discutido quando falarmos sobre o etileno. Hiponastia a curvatura de rgo, principalmente folhas, para cima. Sua ocorrncia bem menos comum do que a epinastia e parece ser induzida pela giberelinas. Movimentos Nsticos associados s mudanas na turgescncia das clulas: Nictinsticos (do grego nyctos = noite + nastos = fechar) So mais tpicos de folhas que apresentam uma posio diferente na noite, em relao quela observada durante o dia. Tipicamente, folhas e fololos permanecem na posio horizontal, ou abertos, durante o dia e assumem uma posio mais vertical, ou fechada, durante a noite. Este movimentos nictnsticos dependem de mudanas reversveis de turgescncia nas clulas do pulvino. Estes movimentos nictinsticos parecem estar sob o controle do fitocromo (veremos isto na Unidade X) Sismonsticos Um limitado nmero de leguminosas que possuem pulvino e exibem movimento nictinstico, tambm exibem uma resposta a estmulos mecnicos. Este 228

fenmeno conhecido como Sismonastia. Visto que respostas sismonsticas respondem ao toque, elas so algumas vezes consideradas como respostas tigmonsticas (movimento em respostas ao toque, que envolve mudana de turgescncia de clulas). No entanto, respostas sismonsticas respondem a uma variedade de estmulos incluindo, ventos, ferimentos, chuvas, calor intenso, etc. A resposta final, ou seja, o movimento da folha, envolve, tambm, mudanas na turgescncia das clulas do pulvino. O melhor exemplo de resposta sismonstica encontrado em um arbusto tropical, a espcie Mimosa pudica (Figura 11). A vantagem de tal mecanismo no clara. Alguns tm sugerido que, visto que estas plantas crescem em ambientes ridos ou semi-ridos, onde constantemente so expostas a ventos secos, o enrolamento da folha pode significar uma reduo nas perdas de gua. Outros sugerem que este mecanismo seria uma proteo contra herbvoros ou insetos. Apesar destas incertezas, uma coisa certa: a resposta muito rpida. Quando o pulvino estimulado diretamente (por exemplo, atravs de um toque), o movimento comea em menos de um segundo.

Figura 11 O movimento sismonstico de plantas de Mimosa pudica (Hopkins, 2000). TROPISMOS As respostas trpicas, ao contrrio das respostas nsticas, esto diretamente associadas a um estmulo, isto , elas apresentam uma direo vetorial em relao ao estmulo. A resposta pode ocorrer na mesma direo, na direo oposta ou em ngulos especficos em relao ao estmulo. As respostas trpicas que apresentaremos a seguir parecem estar relacionadas com a redistribuio lateral de auxinas. 229

TIGMOTROPISMO Um tipo de tropismo o Tigmotropismo, ou crescimento em resposta a um toque. O tigmotropismo permite o crescimento de razes em torno de rochas e tambm responsvel pela habilidade da parte area de plantas trepadeiras para se desenvolver em torno de estruturas de suporte. FOTOTROPISMO Fototropismo, ou crescimento em relao luz, expresso em toda a parte area e em algumas razes. Ele assegura que as folhas podero ser supridas com a luz do sol e, portanto, sero capazes de realizar a fotossntese. De acordo com o clssico modelo Cholodny Went para o fototropismo, os pices de coleptilos de gramneas teriam trs funes especializadas: Produo de AIA livre; Percepo do estmulo de luz unilateral. Uma Flavoprotena (FMN) parece ser o fotossensor do fototropismo (ela percebe a luz azul) fototropina; Transporte lateral de AIA em resposta ao estmulo fototrpico. Assim, em resposta ao estmulo direcional da luz, a auxina produzida no pice, ao invs de ser transportada basipetalmente (do pice para a base), transportada lateralmente para o lado sombreado. Uma vez que a auxina alcana o lado sombreado, ela transportada basipetalmente para a zona de alongamento, onde ela estimula o crescimento da clula. A acelerao do crescimento no lado sombreado e a diminuio do crescimento no lado iluminado (Figura 12), conhecido como crescimento diferencial, produz a curvatura em direo luz (ver Figura 4).

Figura 12 O crescimento dos lados sombreado (shaded side) e iluminado (irradiated side) de coleptilos (Taiz & Zeiger, 1998). 230

GRAVITROPISMO Gravitropismo, crescimento em reposta gravidade, capacita a raiz para crescer para dentro do solo e a parte area para crescer para cima, contra a ao da gravidade, sendo isto especialmente crtico durante os estdios iniciais de germinao e de desenvolvimento da plntula. Este alinhamento da planta conhecido como Ortogravitrpico. A raiz primria que cresce para o centro da terra, exibe Gravitropismo Positivo. A parte area que cresce para cima, contra a ao da gravidade, exibe Gravitropismo Negativo. Alguns rgos, tais como estoles, rizomas e alguns ramos laterais, os quais crescem formando um ngulo reto em relao fora da gravidade, so denominados de Diagravitrpicos. rgos orientados em ngulos intermedirios (0 a 90o) em relao fora da gravidade so denominados Plagiogravitrpicos. Ramos e razes laterais so geralmente Plagiogravitrpicos (Figura 13).

(negative orthogravitropic)

(plagiogravitropic) (diagravitropic)

Figura 13 Diagrama ilustrando as respostas gravitrpicas de razes e de partes areas (Hopkins, 2000). OBS: Algumas razes de plantas de mangue apresentam gravitropismo negativo. Estas razes so conhecidas como pneumatforos, as quais servem para trocas gasosas nestes ambientes alagados. Na parte area (gravitropismo negativo), a bainha amilfera (camada de clulas que circunda o tecido vascular de caules e ramos) parece perceber o estmulo da gravidade. Nas razes (gravitropismo positivo), os sensores da gravidade so amiloplastos (compartimentos 231

celulares ricos em amido), que nesse caso so conhecidos como Estatlitos. Esses grandes amiloplastos (estatlitos) so localizados nos estatcitos, no cilindro central ou na coifa da raiz. Em uma raiz colocada na posio horizontal, os estatolitos sedimentam, por ao da gravidade, no lado inferior das clulas da coifa e dirigem o transporte polar de auxina para o lado inferior da coifa (Figura 14). A maioria da auxina na coifa ento transportada basipetalmente (do pice da raiz para a base) no lado inferior da raiz. A alta concentrao de auxinas no lado inferior da raiz inibe o crescimento neste lado, enquanto o decrscimo na concentrao de auxina no lado superior estimula o crescimento neste lado. Como resultado desse crescimento diferencial, a raiz curva para baixo.

Figura 14 Um modelo para a redistribuio de auxinas durante o gravitropismo em razes de milho (Taiz & Zeiger, 1998). c) Dominncia apical Na maioria das plantas superiores, o crescimento da gema apical inibe o crescimento das gemas axilares, um fenmeno conhecido como Dominncia Apical. H mais de 60 anos foi mostrado que o AIA poderia substituir a gema apical, mantendo a inibio do crescimento das gemas laterais. Este e outros resultados levaram hiptese de que o crescimento das gemas laterais seria inibido pela auxina transportada basipetalmente desde a gema apical. No entanto, ao contrrio do que se poderia esperar, a retirada do pice e concomitante quebra da 232

dominncia apical foi acompanhada de aumento na concentrao de auxinas nas gemas laterais. Este resultado indica que a dominncia apical no seria um efeito direto da auxina na inibio do crescimento da gema lateral. Alguns resultados mostram que outros hormnios parecem estar envolvidos com a dominncia apical. Por exemplo, boa correlao entre o nvel de citocininas e o crescimento de gemas laterais tem sido verificada. A retirada do pice aumenta o acmulo de citocininas na gema axilar e aplicao de auxinas na regio apical decapitada, reduz esse acmulo. Assim, a auxina parece tornar o pice da parte area um forte dreno para a citocinina proveniente das razes, e isto poderia ser um fator envolvido na dominncia apical. Alm disso, remoo do pice provoca reduo nos nveis de cido abscsico ABA (um inibidor do crescimento da parte area) nas gema laterais. Assim, altos nveis de AIA na regio apical da parte area podem atuar mantendo altos nveis de ABA nas gemas laterais, inibindo o crescimento de tais gemas e favorecendo a dominncia apical. d) Formao de razes laterais e adventcias Embora o alongamento da raiz seja inibido por concentraes de auxinas maiores que 10-8 M, a iniciao de razes laterais e adventcias estimulada por altos nveis de auxinas. Com base em alguns estudos, os pesquisadores acreditam que o AIA requerido para, pelo menos, duas etapas na formao de razes laterais: AIA transportado no floema requerido para iniciar a diviso celular nas clulas do cmbio vascular; Alm disso, o AIA requerido para promover a diviso celular e a manuteno da viabilidade celular nas razes laterais em desenvolvimento. Do ponto de vista prtico, solues de auxinas podem ser utilizadas para induzir a formao de razes adventcias em pedaos de caules e de folhas. Como veremos quando estudarmos as CITOCININAS, a formao de razes e de parte area em cultura de tecidos depende da relao auxinas/citocininas. e)Absciso foliar A queda de folhas, flores e frutos de plantas vivas conhecida como ABSCISO. A absciso ocorre em uma regio conhecida como ZONA DE ABSCISO, localizada prxima base do pecolo, pedicelo ou pednculo. O AIA conhecido como retardante do processo de absciso nos estgios iniciais e como promotor nos estgios finais. Os nveis de auxinas so altos nas folhas jovens, decrescem progressivamente com a maturao da folha e so relativamente baixos nas folhas senescentes. Durante os estgios iniciais de absciso foliar, aplicao de AIA inibe a queda. No entanto, aplicao de auxinas nos estgios posteriores aceleram o processo de absciso. Esta acelerao na absciso parece estar associada induo na biossntese de etileno pelo AIA, sendo o etileno o agente ativo que promove a queda de folhas. Veremos isso com mais detalhes quando estudarmos o ETILENO. f) Desenvolvimento de frutos Vrias evidncias sugerem que a auxina est envolvida na regulao do desenvolvimento do fruto. A auxina produzida no plen, no endosperma e no embrio de 233

sementes em desenvolvimento. Acredita-se que o estmulo inicial para o desenvolvimento do fruto resulta da polinizao. Havendo sucesso na polinizao, inicia-se o crescimento do vulo, um processo conhecido como Estabelecimento do Fruto. Aps a fertilizao, o crescimento do fruto pode depender da auxina produzida nas sementes em desenvolvimento. Em algumas espcies, frutos sem sementes podem ser produzidos naturalmente ou pode-se induzir a produo desses frutos nessas espcies pelo tratamento de flores no polinizadas com auxinas. Esta produo de frutos sem sementes conhecida como Partenocarpia. A Auxina parece induzir primariamente o estabelecimento do fruto. O desenvolvimento do fruto parece envolver, tambm, outros hormnios. Por exemplo, o etileno pode influenciar o desenvolvimento de muitos frutos e, alguns efeitos da auxina na frutificao podem ser mediados pela promoo da sntese de etileno. As auxinas tambm participam na regulao do desenvolvimento de gemas florais e, juntamente com as citocininas, induzem a diferenciao vascular. d) Usos comerciais de auxinas sintticas As auxinas sintticas tm sido usadas amplamente na agricultura e na horticultura h mais de 50 anos. As utilidades iniciais incluam: enraizamento de pedaos de caules para propagao vegetativa de plantas; promoo do florescimento em abacaxi; preveno da queda de flores e de frutos; induo da formao de frutos partenocrpicos; etc. Hoje, adicionalmente, auxinas so amplamente usadas como herbicidas (2,4 D , Dicamba). Em geral, as auxinas sintticas so mais eficientes do que as auxinas naturais por que elas so metabolizadas pelas plantas em uma menor taxa do que as auxinas naturais. 1.5 Mecanismo de Ao A despeito da diversidade dos efeitos das auxinas sobre o desenvolvimento da planta, os eventos primrios parecem ser similares em todos os casos, como mostrado anteriormente (Figura 3): percepo do sinal (formao do complexo auxina-receptor); transduo e amplificao do sinal (mensageiros secundrios); e finalmente a resposta final. Estudos recentes tm mostrado que uma protena ABP1 (auxin binding protein) uma forte candidata a ser o receptor para a auxina. Este receptor ABP1 tem sido encontrado primariamente no lmen do retculo endoplasmtico, porm, acredita-se que ele seja ativo na superfcie celular. Isto , ele seria sintetizado no retculo e depois transportado para a membrana plasmtica, onde seria ativo. Estudos das vias de transduo e amplificao de sinais envolvidas na ao de auxinas na promoo da diviso celular tm implicado AMP cclico como um possvel intermedirio na via de sinalizao. Outros possveis sinais intermedirios envolvidos nas respostas dependentes de auxinas incluem o Ca2+ citoslico e o pH intracelular. Estas informaes indicam que a ligao auxina-receptor (envolvida na percepo do sinal) altera as concentraes de AMP cclico e de Ca2+ citoslico e o pH intracelular. Estes mensageiros secundrios amplificam o sinal original, afetando a atividade de enzimas ou a prpria expresso gnica. Acredita-se que as respostas s auxinas envolve tanto mudanas na atividade de protenas (enzimas, canais de ons, etc.) como na expresso gnica. Por exemplo, o efluxo de H+ induzidos por auxinas parece depender da direta ativao da H+-ATPase e do aumento na sntese do mRNA que codifica esta protena da membrana plasmtica.

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ESTUDO DIRIGIDO No 08 UNIDADE: HORMNIOS E REGULADORES DE CRESCIMENTO ASSUNTO: INFORMAES GERAIS E AUXINAS 1 Cite as cinco principais classes de hormnios vegetais. Comente sobre suas estruturas qumicas. 2 Quais os conceitos de hormnios e de reguladores de crescimento? 3 Cite os mtodos para identificar e quantificar os hormnios de planta. 4 Descreva o mecanismo geral de ao dos hormnios. 5 Quais as principais auxinas naturais e sintticas? 6 Quais o requerimento estrutural essencial para que um composto tenha atividade auxnica (segundo as pesquisas atuais)? 7 Descreva a biossntese do cido indol actico (AIA) a partir do triptofano e comente as pesquisas que mostram que o AIA pode ser formado por via independente do triptofano. 8 Qual o efeito de auxinas nos seguintes processos: Crescimento de caules e de razes Induo de razes laterais Dominncia apical Desenvolvimento de frutos 9 O que voc entende por tropismo e nastismo? Cite os principais tipos de respostas trpicas e nsticas. 10 Explique o papel das auxinas no fototropismo. 11 Explique o papel das auxinas no gravitropismo

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2. GIBERELINAS: REGULADORES DA ALTURA DAS PLANTAS 2.1 A Descoberta Na dcada de 1930, cientistas japoneses obtiveram cristais impuros de dois compostos ativos do fungo Giberella fujikuroi, o qual causava uma doena em plantas de arroz caracterizada pelo crescimento excessivo do talo, responsvel pelo acamamento e consequentete eliminao da produo de sementes. A estes compostos foi dado o nome de giberelina A e B. Na dcada de 1950, pesquisadores norte-americanos e ingleses elucidaram a estrutura do material purificado do fungo, o qual foi nomeado de cido giberlico (GA3). No entanto, somente no final da dcada de 1950 que Jake McMillan, na Inglaterra, conclusivamente identificou uma giberelina em uma planta superior. A medida que as giberelinas de fungos e de plantas foram sendo caracterizadas, elas foram numeradas como giberelina GAX, sendo o X o nmero de ordem de descobrimento (a primeira que foi descoberta recebeu o nome de GA1, a segunda de GA2, e assim por diante). Assim, o nmero da giberelina simplesmente um meio para evitar o caos na nomenclatura de giberelinas, no significando nenhuma similaridade qumica ou relacionamento metablico. Atualmente, cerca de 125 giberelinas so conhecidas, as quais tm estrutura baseada no esqueleto ent-giberelano. Algumas giberelinas possuem 20 tomos de carbono enquanto outras possuem 19 tomos de carbono, tendo estas ltimas perdido um carbono durante a sua formao. Algumas caractersticas, como a localizao de um grupo hidroxila na molcula e sua estereoqumica, tm forte ligao com sua atividade metablica. Por exemplo, hidroxilao na configurao no carbono dois, sempre elimina a atividade biolgica. Tambm, a despeito do grande nmero de giberelinas presentes em plantas, anlises genticas tm demonstrado que somente umas poucas so biologicamente ativas como hormnio. Todas as outras servem como precursores ou representam formas inativadas. As giberelinas so associadas, mais freqentemente, com a promoo do crescimento do caule e a aplicao de GAs em plantas intactas pode induzir um marcante aumento na altura da planta. Como poder ser visto as GAs executam importantes papis em uma variedade de fenmenos fisiolgicos. 2.2 Ocorrncia, Metabolismo e Transporte As giberelinas (GAs) so amplamente distribudas no reino vegetal. Elas esto presentes em toda a planta, podendo ser detectadas em folhas, caules, sementes, embries e plens. As giberelinas constituem uma grande famlia de cidos diterpnicos e so sintetizadas por um ramo da via dos terpenides. Um terpenide um composto feito pela juno de unidades de 5 carbonos, o isopreno: H3C H2C Giberelinas so diterpenides tetracclicos formados por quatro unidades isoprenides. A unidade biolgica ativa de isopreno o Isopentenil Difosfato (IPP). O IPP utilizado para a biossntese de terpenides formado atravs de duas vias distintas: uma via dependente do cido Mevalnico, que ocorre no citosol e est envolvida primariamente na biossntese de 236 C CH CH2

esteris; a outra via que independente do cido mevalnico, localizada nos plastdios e leva sntese de carotenides e compostos relacionados. No plastdio, o IPP sintetizado a partir de piruvato e de 3-fosfoglicerato e no do cido mevalnico. Visto que as etapas iniciais da biossntese de GAs ocorrem nos proplastdios, o IPP usado na sua biossntese pode ser derivado da via independente do cido mevalnico. Independente da origem do IPP, as prximas etapas so comuns s vias citoslica e plastdial da biossntese de terpenos: as unidades de isopreno (IPP) so adicionadas sucessivamente para produzir Geranil-Difosfato (10 tomos de carbono), Farnesil-Difosfato (15 tomos de carbono) e Geranil-Geranil-Difosfato (20 tomos de carbono). A biossntese de GAs ocorre a partir do composto de 20 tomos de carbono (geranilgeranil-difosfato) em uma via com trs estgios diferentes, cada um deles residindo em um diferente compartimento celular (Figura 15): Estgio 1 Reao de Ciclizao Nesse estgio, o composto de 20 tomos de carbono, Geranil-Geranil-Difosfato, sofre uma reao de ciclizao para formar o ent-caureno (Figura 14). Esta, na realidade, a primeira etapa que especfica para formao de GAs. A converso se processa em duas etapas catalisadas por duas enzimas localizadas nos prplastdios de tecidos meristemticos da parte area. Estas enzimas no esto presentes em cloroplastos maduros. Compostos tais como AMO-1618, Cicocel e Fosfon D, so inibidores especficos desse estgio da biossntese de GAs. Estgio 2 Oxidao do ent-caureno para formar o GA12-aldedo No segundo estgio da biossntese de GAs, um grupo metil do ent-caureno oxidado para cido carboxlico (CH3 CH2OH CHO COOH). Em seguida, o anel B de seis tomos de carbono, muda sua conformao ficando, ento, com cinco carbonos para formar o GA12-aldedo (Figura 14). Esta a primeira giberelina formada em todas as plantas, sendo, desta forma, a precursora de todas as GAs. Todas as enzimas envolvidas nesse estgio so monooxigenases que utilizam o citocromo P450 em suas reaes. Esta monooxigenases esto localizadas no retculo endoplasmtico (RE), sugerindo que o substrato (ent-caureno) transportado do pr-plastdio para o RE, onde ele convertido para GA12-aldedo. Compostos como o Paclobutrazol e outros inibidores do citocromo P450 inibem especificamente esse estgio da biossntese de GAs. Estgio 3 Formao das outras GAs a partir da GA12 Na primeira etapa desse estgio, GA12-aldedo oxidado para GA12 (o grupo CHO oxidado para COOH), a primeira giberelina formada nesse estgio (Figura 14). Esta reao pode ser catalisada por uma monooxigenase no RE ou por dioxigenases solveis no citosol. Todas as etapas subsequentes so catalisadas por dioxigenases solveis no citosol. Estas enzimas requerem -cetoglutarato e O2 como co-substratos e elas usam Fe2+ e ascorbato como cofatores. Nas reaes subsequentes, duas mudanas qumicas ocorrem na maioria das plantas: (1) A hidroxilao do carbono 13 ou 3; (2) A sucessiva oxidao do carbono 20 (CH3 CH2OH CHO COOH), seguida pela perda deste carbono como CO2. A hidroxilao do carbono 13 converte a GA12 para GA53. A GA53 , ento, convertida para GA19 pela sucessiva oxidao do carbono 20 ((CH3 CH2OH CHO COOH), seguida pela perda do carbono 20 como CO2 para formar a GA20. A GA20 , ento, convertida para a forma biologicamente ativa, GA1, pela hidroxilao do carbono 3 (enzima 3237

hidroxilase). Finalmente, a hidroxilao do carbono 2, inativa a GA1, produzindo a GA8. Esta hidroxilao pode ocorrer diretamente na GA20, produzindo a GA29.Stage 1: Cyclization reactions Location:Proplastids Enzymes: Cyclases Inhibitors:Quartenary ammonium and phosphonium compounds; AMO-1618, Cycocel, Phosphon D

Stage 2: Oxidations to form GA12-aldehyde Location:Endoplasmic reticulum Enzymes: P 450 monooxygenases Inhibitors: N- heterocyclics: Paclobutrazol, Tetcyclacis, Uniconazole

Stage 3: Formation of all other GAs from GA12-aldehyde Location: Cytosol Enzymes: Dioxygenases Inhibitors: Cyclohexanetriones

Figura 15 Os trs estgios da biossntese de giberelinas (Taiz & Zeiger, 1998) 238

Inibidores desse terceiro estgio interferem com as enzimas que utilizam o cetoglutarato como co-substrato. Um desse inibidores, o composto pr-hexadiona (BX 112) especialmente til, pois inibe especificamente a 3-hidroxilase, a enzima que converte a forma inativa, GA20, para a forma ativa, GA1. Diversas observaes tm confirmado que, dentre as muitas giberelinas (cerca de 125), a GA1 a forma ativa que controla o crescimento do caule. No entanto, h possibilidade que outras poucas GAs tenham tambm participaes nesse controle. Por exemplo, a GA3, a qual difere da GA1 somente por ter uma dupla ligao, relativamente rara nas plantas, porm, parece ser capaz de substituir a GA1 em muitos bioensaios. Outras giberelinas, como a GA4, tm mostrado atividade em Arabidopsis e Curcubitceae, por exemplo. As giberelinas executam um importante papel na mediao dos efeitos de estmulos ambientais sobre o desenvolvimento da planta. Fatores ambientais, como fotoperodo e temperatura, podem alterar os nveis de giberelinas ativas, afetando etapas especficas nas suas biossnteses. Em adio, evidncias recentes indicam que GAs podem regular sua prpria biossntese (Feedback). Quando as plantas que requerem dias longos para crescer e florescer, so transferidas para dias curtos, alteraes no metabolismo de GAs so observadas. Por exemplo, plantas de espinafre (Spinacea oleracea) mantidas sob dias curtos (SD short days) permanecem na forma de roseta (Figura 15) e, paralelamente, os nveis de GAs ativas so muito baixos. Em resposta ao aumento do comprimento do dia (LD long days), observa-se, aps 12 dias, um aumento considervel nos nveis de giberelinas ativas e, aps 14 dias, a parte area destas plantas comea a alongar. Aplicao exgena de giberelinas ativas em plantas mantidas em dias curtos (SD + GA3), pode tambm promover o crescimento da parte area, indicando que a giberelina substitui o estmulo ambiental (dias longos).

Figura 16 Crescimento da parte area de plantas de espinafre mantidas em dias curtos (SD), em dias curtos e tratadas com GA3 (SD + GA3) e em dias longos (LD) (Taiz & Zeiger, 1998). 239

Trabalhos com plantas de ervilha indicam que as GAs ocorrem primariamente nas folhas jovens, gemas ativas e entrens da parte area da planta. Estes stios parecem ser, tambm, os locais de sntese da GAs. Na realidade, as GAs sintetizadas na parte area podem ser transportadas para o resto da planta, via floema. De fato, as etapas iniciais da biossntese de GAs podem ocorrer em um tecido e a converso para a forma ativa, em outro. Cloroplastos maduros, por exemplo, no podem realizar as reaes do estgio 1 da biossntese de GAs. Assim, clulas do mesofilo de folhas maduras (que contm cloroplastos maduros) so tambm incapazes de realizar as reaes do estgio 1, embora elas sejam capazes de realizar as reaes do estgio 3. Estas diferenas sugerem que intermedirios da biossntese de GAs podem ser transportados dos tecidos meristemticos da parte area para as folhas verdes, onde so convertidas para formas ativas de GAs. As giberelinas tm sido identificadas, tambm, em exsudatos do xilema e extratos de razes, sugerindo que as razes podem, tambm, sintetizar GAs. No entanto, evidncias conclusivas para a sntese de GAs pela razes ainda esto faltando. Muitas sementes e frutos em desenvolvimento mostram, tambm, altos nveis de giberelinas. Na realidade, o nvel de giberelinas ativas decresce para valores prximos de zero nas sementes maduras. Por outro lado, estas sementes maduras contm GA12-aldedo, precursora de todas as GAs, a qual pode ser convertida para as formas ativas de GAs, durante os estgios iniciais de germinao. Uma variedade de glicosdeos de giberelinas formada pela ligao covalente entre a GA e um monossacardeo. Estas GAs conjugadas ocorrem particularmente em algumas sementes. O acar usualmente a glucose que pode se ligar a giberelina via o grupo carboxlico (formando um ster) ou via um grupo hidroxila (formando um ter de glucosil). De fato, quando GAs so aplicadas s plantas, uma certa proporo torna-se glicosilada (conjugada). A conjugao pode, todavia, representar outra forma de inativao das giberelinas. Por outro lado, Glicosdeos de giberelinas aplicados s plantas podem ser metabolizados para formar GAs livres. Neste caso, os conjugados constituem uma fonte de estoque de GAs. Os vrios fatores que regulam o nvel de giberelinas ativas na planta so sumariados na figura abaixo (Figura 17).

Figura 17 Os processos que regulam o nvel de giberelinas nos tecidos de plantas (Taiz & Zeiger, 1998). A sntese da giberelina ativa, GA1, promovida por fatores ambientais, tais como frio e dias longos, e ela pode inibir a sua prpria sntese via feedback (Figura 16). O nvel de GA ativa 240

pode ser reduzido pelo catabolismo (inativao) ou pela conjugao com acares. Em alguns casos, a GA ativa pode ser gerada pela liberao a partir da forma conjugada. Finalmente, o transporte de GAs (ou precursores de GAs) para o tecido (ou desde o tecido), pode tambm afetar o nvel da giberelina ativa, GA1.

2.3 Papel Fisiolgico a) Iniciao floral e determinao do sexo As GAs podem substituir dias longos ou frio, que so fatores requeridos por muitas plantas, especialmente as de hbito de crescimento em roseta, para a promoo do florescimento. Assim, as GAs podem substituir os estmulos ambientais para o florescimento em algumas espcies. As flores de angiospermas consistem, usualmente, de quatro partes (verticlos): spalas, ptalas, estames e pistilo. Quando as partes feminina (pistilo) e masculina (estame) so encontradas na mesma flor, ela denominada hermafrodita ou perfeita. Certas espcies, no entanto, produzem flores unissexuais ou imperfeitas. O processo no qual as flores unissexuais so formadas denominado de determinao do sexo. Em plantas monicas, tais como pepino e milho, flores macho e fmea so encontradas na mesma planta. J nas plantas diicas, como espinafre e Cannabis sativa, estas flores esto em indivduos separados. O processo de determinao do sexo geneticamente regulado, porm pode sofrer influncia de fatores ambientais, tais como fotoperodo, temperatura e estado nutricional e, estes efeitos ambientais podem ser mediados pelas GAs. Em milho, por exemplo, flores masculinas so restritas ao pendo e as femininas s espigas. No entanto, exposio destas plantas a dias curtos ou frio durante a noite aumenta o nvel de GA endgena e, simultaneamente, isto causa a feminilizao das folhas do pendo. Essa formao de flores unissexuais depende do aborto de uma das partes no estdio inicial de desenvolvimento. Assim, o papel primrio da GA na determinao do sexo em milho, parece ser a supresso do desenvolvimento do estame. No entanto, as giberelinas parecem interagir com outros hormnios (por exemplo, o etileno), na regulao da determinao do sexo. b) Crescimento do caule A aplicao de GAs promove o crescimento internodal em um grande nmero de espcies vegetais. Os estmulos mais evidentes so vistos em variedades ans ou de hbito de crescimento em roseta, bem como em membros de Gramnea. Aplicao exgena de GA3 causa um aumento to drstico no crescimento do caule de variedades ans que elas tornam-se semelhantes s variedades de crescimento normal (Figura 18). Acompanhando o alongamento do caule ocorre um decrscimo na espessura do caule, um decrscimo no tamanho da folha e as folhas ficam com colorao verde-claro. Um ponto interessante que as giberelinas produzem grandes efeitos em plantas intactas e muito pouco em segmentos. De modo contrrio, as auxinas produzem seus efeitos principalmente em segmentos (pedaos de caules, folhas, etc.).

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Figura 18 Efeito da aplicao de giberelinas sobre o crescimento do milho normal e de um mutante ano (Taiz & Zeiger, 1998). O interessante que, embora o crescimento do caule possa ser dramaticamente aumentado pelas GAs, elas tm pouco ou nenhum efeito sobre o crescimento das razes. Acredita-se, nesse caso, que a via de transduo de sinal requerida para induzir o crescimento associado s giberelinas, no seja expressa nas razes. Alm disso, o caule pode tornar-se um forte dreno por nutrientes da planta. c) Transio da fase juvenil para a adulta Muitas plantas perenes no florescem at que elas alcancem um certo estdio de maturidade. Os estdios juvenil e maduro destas plantas possuem, freqentemente, diferentes formas de folhas. Aplicao de GAs parece regular a mudana de juvenil para adulto e vice242

versa, dependendo da espcie. Em algumas conferas, aplicao de uma mistura de GA4 + GA7 promove a passagem do estdio juvenil para o maduro. Em Hedera helix, aplicao de GA3 promove a passagem do estdio maduro para o juvenil. d) Estabelecimento do fruto Aplicaes de giberelinas podem favorecer o estabelecimento do fruto (crescimento inicial do fruto seguindo a polinizao) e o crescimento de alguns frutos, particularmente nos casos em que a auxina no parece afetar. O estmulo do estabelecimento do fruto pelas giberelinas tem sido observado em ma. e) Germinao de sementes A germinao de sementes pode requerer GAs em algumas etapas: Ativao do crescimento do embrio; Hidrlise e mobilizao de reservas do endosperma (ver mecanismo de ao); Quebra de dormncia em algumas espcies. f) Aplicao comercial de GAs e de inibidores da sua sntese Produo de Frutos O principal uso de giberelinas (relacionado com a produo de frutos) para aumentar o comprimento da haste do cacho de videiras. Quando essa haste muito curta, os cachos so muito compactos e o crescimento dos frutos restringido. As giberelinas estimulam o crescimento da haste e, consequentemente, favorecem o crescimento dos frutos (mais espao); Alm disso, aplicao de uma mistura de Benziladenina (uma citocinina) e GAs (GA4 + GA7) provoca o alongamento do fruto de ma, melhorando a sua forma; Em frutos de Citrus, aplicao de giberelinas provoca o retardamento da senescncia. Produo de Cerveja Durante a produo de malte a partir de sementes de cevada, giberelinas podem ser usadas para acelerar a hidrlise de reservas da semente, pela induo da produo de enzimas hidrolticas na camada de aleurona (ver mecanismo de ao). Aumento na produo de cana-de-acar Nessa espcie, a sacarose armazenada no vacolo central das clulas do parnquima internodal. A aplicao de GA (pulverizao) estimula o alongamento do entren e isto resulta em maior produo de biomassa da cana e, tambm, de acares. Alguns resultados mostraram que aplicao de giberelinas pode promover um aumento de 50 toneladas por hectare na produo de biomassa total e de 5 toneladas na produo de acar. Inibidores da Sntese de GA Os compostos conhecidos como retardantes de crescimento, fazem parte de um grupo de biorreguladores que modificam o crescimento e desenvolvimento das plantas, sem, contudo, induzir efeitos fitotxicos ou de m formao. Quando utilizados em dosagens adequadas, os retardantes de crescimento modificam a arquitetura da planta, inibindo o crescimento do pice caulinar, reduzindo o crescimento em altura, alm de intensificar a pigmentao verde das folhas e aumentar o 243

crescimento radicular. Essas alteraes levam modificao da relao raiz/parte area em favor do crescimento das razes. Os retardantes de crescimento tm aplicaes bastantes prticas em termos agronmicos, bem como no melhoramento gentico, podendo, por exemplo, ser utilizados na reduo do acamamento de plantas, na reduo do crescimento de rvores, na tolerncia a estresses ambientais e na induo do florescimento. Diversos retardantes de crescimento que tm sido utilizados comercialmente atuam inibindo, de algum modo, a sntese de giberelinas (Ancimidol, Paclobutrazol, fosfon D, etc.). O paclobutrazol bem como os demais triazis interagem com o citocromo P - 450. A interao faz com que essas protenas transportadoras de eltrons, que catalisa diversas reaes oxidativas do metabolismo vegetal, seja inativada, interrompendo diversas rotas metablicas, especialmente o metabolismo dos terpenides (como as giberelinas). O paclobutrazol bloqueia, especificamente, as reaes de oxidao entre o ent-caureno e o cido ent-caurenico (ver Figura 15, estgio 2 da biossntese de giberelinas). A aplicao do paclobutrazol reduz drasticamente o alongamento do caule e a pulverizao com GA3 reverte tal efeito (Figura 19) De acordo com dados tcnicos da ICI (Imperial Chemical Industries), o paclobutrazol pode ser aplicado em injees no tronco de rvores e arbustos, diretamente no solo ou por meio de pulverizaes diretas nas folhas. Esta ltima forma permite que o paclobutrazol atinja diretamente os meristemas apicais e entrens, reduzindo o crescimento da planta. Quando aplicado no solo, o paclobutrazol absorvido pelas razes e, via corrente xilemtica, transportado para a parte area das plantas.

Crescimento Total (cm)

50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0,00 0,10 0,25 0,50

Sem GA3 Com GA3

1,00

Paclobutrazol (ug/vaso)

Figura 19 Efeitos do paclobutrazol e do GA3 sobre o crescimento da parte area de girassol OBS: O paclobutrazol tem sido utilizado para promover o florescimento em mangueira.

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2.4 Mecanismo de Ao a) Promoo do crescimento do caule As giberelinas so molculas extremamente ativas no alongamento do caule. Em plantas de arroz e alface, as respostas para GA3 podem ser vistas em nveis muito baixos (10-10 g). Para as giberelinas serem ativas em to baixas concentraes, mecanismos eficientes para amplificar o sinal hormonal devem estar presentes nas clulas alvo. De acordo com o modelo inicial (Figura 3), estas respostas devem envolver: formao do complexo giberelina-receptor; ativao de uma ou mais vias de transduo e amplificao de sinal; e a resposta final (crescimento). Os estudos tm mostrado que a aplicao de giberelinas provoca aumento no tamanho da clula e no nmero de clulas, indicando que as giberelinas atuam tanto na expanso da clula como na diviso celular. De modo semelhante s auxinas, as GAs parecem favorecer o alongamento celular alterando as propriedades da parede celular. Porm, diferente das auxinas, nenhuma acidificao do apoplasto tem sido estimulada por ao das GAs, indicando que o mecanismo de crescimento induzido pelas GAs diferente do crescimento cido induzido pelas auxinas. Estudos recentes, realizados em muitos tecidos vegetais, revelaram a existncia de uma correlao positiva entre o crescimento estimulado pelas GAs e a atividade da enzima Xiloglucana Endotransglicosilase (XET). A XET hidrolisa xiloglucana e parece causar um rearranjamento molecular na matriz da parede celular que poderia promover o afrouxamento da parede, favorecendo o crescimento. Vale salientar que o crescimento induzido pelas auxinas no est associado ao aumento na atividade da XET. Isto indica que o efeito parece ser especfico para giberelinas.

b) Mobilizao de reservas do endosperma durante a germinao Certos gros (os conhecidos cariopses de cereais, como milho, trigo, cevada, sorgo, etc.), podem ser divididos em trs partes: o tegumento, o embrio diplide e o endosperma triplide. O embrio se associa a um rgo especializado para a absoro, o Escutelo. J o endosperma amilceo tipicamente no vivo na maturidade e consiste de clulas ricas em grnulos de amido. Este tecido circundado pela Camada de Aleurona, uma camada de clulas citolgica e bioquimicamente distintas das clulas do endosperma. Esta camada de clulas vivas contm corpos proticos e oleossomos. Durante a germinao e o estgio inicial de crescimento da plntula, amido e protenas so degradados por uma srie de enzimas hidrolticas, produzindo acares solveis, aminocidos e outros produtos, os quais so transportados para o eixo embrionrio em crescimento (Figura 20). Uma das principais enzimas responsveis pela degradao do amido a -amilase. A camada de aleurona o principal stio de sntese desta enzima hidroltica. Estudos realizados na dcada de 1960 mostraram que a secreo de enzimas hidrolticas pela camada de aleurona, dependia da presena do embrio. O embrio produzia uma substncia difusvel que estimulava a produo de -amilase na camada de aleurona. Posteriormente foi descoberto que a GA3 poderia substituir o embrio no estmulo da degradao de amido. Estes e outros estudos levaram concluso que a substncia produzida pelo embrio que estimulava a funo digestiva da camada de aleurona, seria a giberelina (Figura 20). 245

Figura 20 A estrutura da semente de cevada e as funes dos vrios tecidos durante a germinao (Taiz & Zeiger, 1998).: (1) As giberelinas so sintetizadas no embrio etransportadas para o endosperma; (2) No endosperma as giberelinas se difundem para a camada de aleurona; (3) A camada de aleurona induzida para sintetizar e secretar amilase e outras enzimas hidrolticas; (4) Amido e outros compostos so degradados para substncias solveis de baixa massa molecular (acares, aminocidos, etc.); (5) Finalmente, estas substncias solveis so transportadas para o eixo embrionrio em crescimento

A induo da enzima -amilase nas clulas da camada de aleurona de gros de cereais (durante a germinao), pelas giberelinas, est agora bem elucidada (Figura 21). A giberelina produzida no embrio transportada para a camada de aleurona. O receptor da giberelina est localizado na membrana plasmtica das clulas da camada de aleurona (1). O complexo GAReceptor interage com uma protena G heterotrimrica (2), iniciando duas vias de transduo de sinal: Uma das vias envolve GMP-cclico (3) e resulta na produo de uma molcula de sinalizao (4) que inativa um repressor GAI (5). A inativao deste repressor permite a expresso do gen MYB (6). Isto leva produo de uma protena regulatria (GA MYB), a qual retorna para o ncleo (7) e liga-se a uma seqncia regulatria do gen da -amilase (8), de modo que a transcrio do gen (9) e a sntese da enzima -amilase (10), so estimuladas. A outra via envolve alteraes nos nveis de Ca2+ e a formao do complexo regulatrio Ca-Calmodulina (11). Esta via parece estimular a secreo da enzima amilase para o endosperma (12). OBS: MYBs so fatores de transcrio que regulam o crescimento e desenvolvimento da planta. 246

Figura 21 Mecanismo de ao das giberelinas na produo e secreo da enzima amilase, durante o processo de germinao. Observe a numerao na figura e compare com o que est escrito no texto (Taiz & Zeiger, 1998).

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ESTUDO DIRIGIDO No 09 UNIDADE: HORMNIOS E REGULADORES DE CRESCIMENTO ASSUNTO: GIBERELINAS 1 Como ocorreu a descoberta das giberelinas? Quantas giberelinas so conhecidas atualmente e quais as que so ativas nas plantas? 2 Qual a distribuio de giberelinas nas plantas? E quais as regies de sntese? 3 Quais os locais na clula onde ocorrem os trs estgios da biossntese de giberelinas? 4 Qual a modificao qumica que inativa a GA1? 5 Como e por onde as giberelinas so translocadas na planta? 6 O que so substncias retardantes de crescimento? O que elas podem causar na planta? 7 Qual o efeito das giberelinas nos seguintes processos: Determinao do sexo Crescimento do caule e de razes Germinao de sementes

8 Aplicao de auxinas e giberelinas estimula a diviso e a expanso celular. Qual a diferena bsica entre o crescimento induzido por auxinas e por giberelinas? 9 Explique o mecanismo de ao de giberelinas durante a germinao de sementes de cereais.

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3. CITOCININAS: REGULADORES DA DIVISO CELULAR 3.1 Descoberta, Identificao e Propriedades Muitos estudos tm mostrado que as citocininas controlam vrios aspectos do desenvolvimento vegetal, incluindo: diviso celular, retardamento da senescncia de folhas, atravs da mobilizao de nutrientes, dominncia apical, quebra de dormncia de gemas, desenvolvimento de flores, etc. Dentre estes, o controle da diviso celular de considervel significncia para o crescimento e desenvolvimento da planta e foi graas a este efeito que se identificou esta classe de fitohormnios. Nas dcadas de 1940 e 1950, Folke Skoog testou muitas substncias que tinham habilidade para iniciar e promover a proliferao de clulas de fumo em cultura de tecidos. Ele tinha observado que a adenina (base nitrogenada que participa da molcula de DNA) tinha um efeito promotor da diviso celular, o que o levou a testar a hiptese de que o DNA poderia estimular a diviso. Aps um difcil e demorado fracionamento do DNA tratado com calor, Skoog e colaboradores identificaram uma pequena molcula que, na presena de auxinas, estimulava a proliferao de clulas em cultura de tecidos. Esta molcula foi denominada de cinetina, uma molcula derivada da adenina (Figura 22).

Figura 22 A estrutura qumica da adenina e de cinco derivados da adenina que apresentam atividade de citocinina. Cinetina e BAP (ou BA) so citocininas sintticas. Zeatina, dihidrozeatina e isopentenil adenina so citocininas naturais (Hopkins, 2000).

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A cinetina no um hormnio de plantas de ocorrncia natural e, tambm, no constituinte da molcula de DNA. No entanto, alguns anos aps a descoberta da cinetina, pesquisadores demonstraram que extrato de endosperma imaturo de milho continha uma substncia que causava os mesmos efeitos biolgicos da cinetina. Esta molcula foi identificada como 6-(4-hidroxi-3metilbut-2-enilamino) purina, e recebeu o nome de Zeatina. A estrutura molecular da zeatina similar da cinetina (Figura 21). Ambas so derivadas da adenina (aminopurina). No entanto, elas possuem diferentes cadeias laterais que se encontram ligadas ao nitrognio 6 da adenina. Devido a cadeia lateral da zeatina ter uma dupla ligao, ela pode existir nas configuraes cis e trans. A zeatina natural, que ocorre nas plantas superiores, a que apresenta configurao trans, embora as duas formas possuam atividade biolgica. A atividade de uma isomerase tem sido demonstrada em tecidos de plantas, de modo que a cis-zeatina, quando aplicada a tecidos, pode ser convertida para a forma trans. Outras citocininas de ocorrncia natural so a Dihidrozeatina e a Isopentenil Adenina. As citocinas naturais (zeatina, dihidrozeatina e isopentenil adenina) podem ser encontradas na forma livre, como ribosdeo (uma molcula de ribose ligada ao nitrognio 9 da adenina), como ribotdeo (a ribose ligada ao N-9 esterificada com cido fosfrico) ou como glicosdeo (uma molcula de glicose ligada ao N-7 ou N-9 da adenina ou ainda, ao oxignio da zeatina ou dihidrozeatina). As citocininas so definidas como compostos que possuem atividades similares quelas da trans-zeatina. Estas atividades incluem: Induzir a diviso celular em callus, na presena de auxinas; Promover a formao de parte area ou razes em cultura de tecidos, quando aplicada em proporo adequada com auxinas; Retardar a senescncia de folhas; Promover a expanso de cotildones em dicotiledneas; Muitos compostos qumicos tm sido sintetizados e testados em relao sua capacidade de atuar como citocininas. Anlises destes compostos permitiram estabelecer alguns requerimentos estruturais para a atividade. Em geral, todos os compostos ativos como citocininas possuem uma cadeia lateral ligada ao N-6 da adenina e todas as citocininas naturais so derivadas da adenina. As molculas de cinetina e benziladenina (BA) so exemplos de citocininas sintticas que possuem a cadeia lateral ligada ao N-6 da adenina (Figura 21). As nicas excees a esta generalizao so certos derivados da difeniluria. Estes compostos possuem fraca atividade de citocininas e no possuem a cadeia lateral referida anteriormente. No curso da determinao do requerimento estrutural para a atividade de citocinina, os investigadores encontraram algumas molculas que agiam como antagonistas da citocinina (Figura 23). Estes compostos resultam de modificaes qumicas no anel da purina e parecem bloquear a atividade de citocininas pela competio com o seu receptor. Este efeito pode ser sobrepujado pela adio de mais citocininas.

Figura 23 Estrutura de um composto sinttico que atua como antagonista das citocininas. Note as modificaes no anel da adenina (Taiz & Zeiger, 1998). 250

3.2 Ocorrncia, Metabolismo e Transporte As cadeias laterais das citocininas naturais so quimicamente relacionadas com as estruturas de pigmentos carotenides, dos hormnios giberelinas e cido abscsico e de alguns compostos de defesa de plantas conhecidos como fitoalexinas. Todos esses compostos so formados, pelo menos em parte, atravs da juno de unidades de isopreno. H3C H2C A estrutura do isopreno similar da cadeia lateral da zeatina e de outras citocininas. Os precursores para a formao das unidades de isopreno so o cido mevalnico ou o piruvato + 3-fosfoglicerato, dependendo da via envolvida. Estes precursores produzem a unidade biolgica de isopreno, ou seja, o Isopentenil-Difosfato (IPP). Na primeira etapa da biossntese de citocininas, uma enzima conhecida como transferase do isopentenil (IPT) catalisa a transferncia do grupo isopentenil do IPP para o AMP, ADP E ATP. O produto da reao o ribotdeo isopentenil adenina (a citocinina isopentenil adenina contendo uma ribose e um, dois ou trs grupos fosfato). Este conjugado , em seguida, convertido para trans-zeatina ou para outras citocininas naturais, dihidrozeatina e isopentenil adenina (Figura 24). C CH CH2

Figura 24 Esquema mostrando as etapas da biossntese de citocininas (Taiz & Zeiger, 1998). 251

Os meristemas apicais das razes so os principais stios de sntese de citocininas livres na planta. As citocininas sintetizadas nas razes parecem que so transportadas para a parte area via xilema. Algumas evidncias confirmam este tipo de transporte: Quando a parte area cortada prximo superfcie do solo, a seiva do xilema pode continuar fluindo na regio do corte. Este exsudato do xilema contm citocininas; Se o solo mantido mido, o fluxo do xilema na regio cortada pode continuar por alguns dias. Alguns resultados mostram que, mesmo nesse caso, o contedo de citocininas no exsudato no diminui, indicando que a mesma est sendo sintetizada nas razes; Alm disso, alguns fatores ambientais que afetam o funcionamento das razes, como estresse hdrico e salino, reduzem o contedo de citocininas no exsudato do xilema. necessrio destacar, no entanto, que as citocininas no so sintetizadas exclusivamente nas razes. Sementes em desenvolvimento e folhas jovens, tambm sintetizam citocininas. Porm, a produo de citocininas na parte area parece ser distribuda na prpria parte area, via floema, enquanto a citocinina produzida nas razes distribuda para toda planta via xilema. Essas citocininas no exsudato do xilema esto principalmente na forma de ribosdeo de zeatina. Uma vez nas folhas, uma parte desses nucleosdeos convertida para a forma livre (trans-zeatina) ou para a forma de glicosdeos. Muitas das diferentes formas qumicas de citocininas so rapidamente interconvertidas pelos tecidos vegetais. As citocininas quando aplicadas na forma livre, podem ser convertidas para seus respectivos nucleotdeos ou glicosdeos e vice versa. Estas citocininas conjugadas podem ser consideradas formas de estoque de citocinina em um estado metabolicamente inativo. Por exemplo, em algumas sementes dormentes so encontrados altos nveis de glicosdeos (forma inativa) e baixos nveis de citocinina livre (forma ativa). De modo contrrio, durante o processo de germinao dessas sementes, observa-se uma ntida queda nos nveis de glicosdeos e aumento nos nveis de citocininas livres. Assim, possvel que algumas glicosidases (enzimas) atuem na liberao de citocininas livres (como a transzeatina) a partir das citocininas conjugadas (observe na Figura 24 que as passagens das formas conjugadas para as formas de citocininas livres, so reversveis). Alm da conjugao, as citocinas livres podem ser catabolisadas, produzindo compostos inativos. Em muitos tecidos de plantas, por exemplo, foi encontrada a enzima citocinina oxidase, a qual degrada zeatina, ribotdeo de zeatina e isopentenil adenina, produzindo adenina e seus derivados (Figura 25). Esta enzima inativa o hormnio e pode ser importante na regulao ou limitao dos efeitos das citocininas.

Figura 25 Oxidao da isopentenil adenina pela citocinina oxidase (Hopkins, 2000).

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A figura 26 mostra os diversos fatores que controlam os nveis de citocinas na forma ativa. Lembre-se que as formas ativas das citocininas naturais so: trans-zeatina, dihidrozeatina e isopentenil adenina. BIOSSNTESE IPT TRANSPORTE (principalmente de Conjugados) CITOCININAS LIVRES CONJUGAO - Ribosdeo - Ribotdeo Oxidase da citocinina - Glicosdeo

CATABOLISMO Figura 26 Fatores que controlam os nveis de citocininas livres.

3.3 Papel Fisiolgico Os hormnios vegetais raramente, ou nunca, trabalham isoladamente. Mesmo nos casos em que a resposta se d pela aplicao de um nico hormnio, o tecido pode conter hormnios endgenos que contribuem para a resposta final. Em alguns casos a resposta est associada a dois ou mais hormnios, ou um hormnio pode induzir a sntese de um outro. Estas observaes indicam que a resposta final est quase sempre associada ao Balano Hormonal. Independente dessa viso, as citocininas podem estimular ou inibir uma variedade de processos fisiolgicos e aspectos do desenvolvimento da planta. Muitos dos processos regulados pelas citocininas tm sido revelados em plantas transgnicas que superexpressam essa classe de hormnio. Estas plantas superprodutoras de citocininas exibem algumas caractersticas que indicam o papel executado pelas citocininas na fisiologia e no desenvolvimento da planta. Algumas caractersticas dessas plantas so: O meristema apical da parte area produz maior quantidade de folhas; As folhas so mais ricas em clorofila e, como conseqncia, so mais verdes; Retardamento da senescncia; Reduo ntida na dominncia apical; Em casos extremos pode ocorrer encurtamento dos entrens e reduo na taxa de crescimento das razes.

A seguir sero descritos alguns papis fisiolgicos atribudos, pelo menos em parte, s citocininas:

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a) A relao auxina/citocinina regula a morfognese em cultura de tecidos De modo geral, na ausncia de citocinina praticamente no se observa a ocorrncia de diviso celular (Figura 27A). Altos nveis de auxina em relao aos de citocinina promovem a formao de razes (Figura 27B), enquanto altos nveis de citocinina em relao aos de auxina estimulam a formao da parte area (Figura 27D). Uma relao intermediria favorece o crescimento do tecido no diferenciado, comumente referido como callus (Figura 27C).

Figura 27 A relao auxina/citocininas regulam o crescimento e a formao de rgos em cultivo de callus de fumo (Taiz & Zeiger, 1998).

Muitos pesquisadores tm usado, tambm, a gentica molecular para investigar o significado da relao auxina/citocinina na regulao da morfognese. Eles utilizaram a bactria Agrobacterium tumefasciens, a qual infecta os tecidos de plantas e provoca a formao de tumores. Os genes do plamdio da bactria foram, em seguida, incorporados ao genoma da clula hospedeira (da planta), produzindo novas clulas geneticamente modificadas (mutantes ou transgnicos). Nestes estudos, foram obtidos trs mutantes: um mutante provocava a formao de tumores com anormal proliferao de razes (tmr); outro provocava a formao de tumores com anormal proliferao de parte area (tms); e o terceiro provocava a formao de tumores no diferenciados, conhecidos como galhas (crown gall) (Figura 28). No mutante tms foi observada a inativao de dois gens necessrios para a biossntese de AIA, o que proporcionou uma baixa relao auxina/citocinina e, como conseqncia, a anormal proliferao de parte area. No mutante tmr, ao contrrio, encontrouse mutaes no gen requerido para a biossntese de zeatina. Este mutante, portanto, apresentou alta relao auxina/citocinina, o que justifica a anormal proliferao de razes. O terceiro mutante superexpressava a sntese de auxinas e de citocininas, o que justifica a formao de callus (neste caso, o ciclo celular acelerado e nenhuma clula se diferencia). Estes resultados demonstraram a importncia da relao auxina/citocinina na regulao da morfognese.

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Figura 28 Galhas produzidas sobre o caule de plantas de Bryophyllum. O tumor conseqncia da infeco com Agrobacterium tumefasciens. As clulas da planta hospedeira foram geneticamente modificadas, isto , os gens que causam a superproduo de auxinas e citocininas foram incorporados no genoma da clula hospedeira (Hopkins, 2000).

b) Citocinina e auxina regulam o ciclo celular em plantas As citocininas foram descobertas devido sua capacidade para estimular a diviso celular em tecidos supridos com um nvel adequado de auxinas. Evidncias experimentais sugerem que tanto a auxina como a citocinina participam na regulao do ciclo celular e elas atuam controlando a atividade de quinases dependentes de ciclina. As protenas quinases dependentes de ciclina (CDKs) so enzimas que regulam o ciclo celular em eucariotos. A expresso do gen que codifica a principal CDK, a CDC2 (Cell Division Cycle, 2), regulada pela auxina. No entanto, a CDK induzida pela auxina enzimaticamente inativa e altos nveis dessa enzima no so suficientes para que ocorra a diviso celular. A citocinina parece ativar uma protena ciclina tipo G1, a qual se liga CDK e produz um complexo ativo (CDK-G1). A ativao da CDK, ento, permite a realizao do ciclo celular e, consequentemente, a diviso da clula. Em mutantes que superexpressam a biossntese de citocininas e de auxinas, o ciclo celular acelerado e pode ocorrer a formao de callus.

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c) Quebra da dominncia apical e induo do crescimento de gemas (ver auxinas e ABA) Na maioria das plantas superiores, o crescimento da gema apical inibe o crescimento das gemas laterais, um fenmeno conhecido como Dominncia Apical. Plantas com forte dominncia apical, tais como milho, tm um nico eixo de crescimento com poucas ramificaes laterais. Em contraste, muitas gemas laterais crescem em muitos arbustos. Embora a dominncia apical possa ser determinada primariamente pelas auxinas, estudos fisiolgicos indicam que citocininas executam um papel importante em iniciar o crescimento de gemas laterais. Por exemplo, aplicao direta de citocininas em gemas axilares de muitas espcies, estimula a diviso celular e o crescimento da gema. O fentipo de mutantes superprodutores de citocininas consistente com o papel desta classe de hormnios na dominncia apical. Por exemplo, plantas de fumo e de Arabidopsis do tipo selvagem (no mutante) mostram forte dominncia apical durante o crescimento, enquanto que nos mutantes superprodutores de citocininas as gemas laterais crescem vigorosamente e competem com o pice da parte area por nutrientes (Figura 29). Consequentemente, as plantas mutantes mostram-se bastante ramificadas.

A

B

Figura 29 Figura comparando um mutante de Arabidopsis superprodutor de citocininas (B) com um tipo selvagem (A). O mutante mostra reduzida dominncia apical, resultante do desenvolvimento de muitas inflorescncias (Taiz & Zeiger, 1998). Apesar desses estudos bastante esclarecedores, relacionados aos papis das auxinas (ver auxinas) e das citocininas no controle da dominncia apical, outros estudos ainda so necessrios. Acredita-se que outros sinais, promotores ou inibidores, podem estar envolvidos no desenvolvimento das gemas laterais e, portanto, no controle da dominncia apical. d) Retardamento da senescncia de folhas e mobilizao de nutrientes Folhas destacadas de plantas lentamente perdem clorofila, RNA, lipdios e protenas, mesmo que elas sejam mantidas midas e providas de nutrientes minerais. Estas mudanas tambm ocorrem normalmente nas folhas de plantas, constituindo-se na fase final da vida das 256

folhas. Este processo de envelhecimento programado que leva morte recebe o nome de senescncia. Este processo parece estar sob o controle das citocininas. O tratamento de folhas isoladas de muitas espcies com citocininas retarda o processo de senescncia. Este efeito pode ser marcante, particularmente quando a citocinina aplicada diretamente sobre a planta intacta. Os efeitos podem tambm ser localizado dentro de uma mesma folha, se a aplicao for feita de forma localizada (aplicando-se citocinina apenas em uma das metades da folha, observa-se o retardamento da senescncia somente na regio tratada). Embora evidncias sugiram que folhas jovens podem produzir citocininas, as folhas maduras no podem. As folhas maduras dependem da citocinina proveniente das razes, via xilema. A produo de citocininas nas razes e o seu transporte para a parte area podem ser influenciados por fatores ambientais e pelo prprio estdio de desenvolvimento da planta. Por exemplo, estresses hdrico e salino afetam a produo de citocininas nas razes e aceleram a senescncia de folhas. J em folhas de soja, a senescncia iniciada pela maturao da semente, um fenmeno conhecido como Senescncia Monocrpica. Esta senescncia pode ser retardada pela remoo da semente no incio do seu desenvolvimento. Neste caso, a retirada da semente controla o transporte de citocininas das razes para as folhas. As citocininas envolvidas no retardamento da senescncia so primariamente os ribosdios de zeatina e de dihidrozeatina, os quais so transportados das razes para as folhas pela corrente transpiratria (via xilema). Nas folhas, essas formas conjugadas so convertidas para as formas livres, que so ativas. As evidncias mais convincentes sobre os papis das citocininas no controle da senescncia tm sido obtidas com a utilizao de transgnicos (Figura 30). Por exemplo, a senescncia de folhas retardada em plantas transgnicas de fumo que possuem um gen que controla a biossntese de citocininas.

Figura 30 Retardamento na senescncia em transgnicos que regulam a biossntese de citocininas nas folhas maduras (esquerda). O gentipo que no autoregula a produo de citocininas nas folhas ( direita) apresenta-se em fase avanada de senescncia (Taiz & Zeiger, 1998). 257

O mecanismo pelo qual as citocininas so capazes de retardar a senescncia no claro, porm, algumas evidncias indicam que as citocininas exercem importante papel na mobilizao de nutrientes. As citocininas influenciam o movimento de nutrientes (orgnicos e inorgnicos) de outras partes da planta para as folhas, um fenmeno conhecido como mobilizao de nutrientes induzido pelas citocininas. A participao das citocininas na mobilizao de nutrientes tem sido revelada quando nutrientes marcados radioativamente so fornecidos s plantas, aps o tratamento de uma folha ou parte dela com citocininas (Figura 31). As plantas so, posteriormente, autorradiografadas para verificar a mobilizao dos nutrientes. Os resultados destes estudos mostram que os nutrientes so preferencialmente transportados para os tecidos tratados com citocininas, onde eles se acumulam.

Figura 31 Diagrama de um experimento clssico, desenvolvido por K. Mothes, mostrando o papel das citocininas na mobilizao de nutrientes. A aplicao de composto marcado radioativamente foi feita na rea indicada pela mancha preta. A radioatividade se acumula no lado tratado com a citocinina sinttica, cinetina. Note que no controle a distribuio da radioatividade ocorre de maneira uniforme atravs das nervuras (Taiz & Zeiger, 1998) Como sabemos, os nutrientes so translocados via floema, do stio de produo (fonte) para o stio de utilizao (dreno). Assim, possvel que a citocinina provoque alguma alterao no relacionamento fonte-dreno. Algumas linhas de evidncias tambm mostram que as citocininas estimulam o metabolismo nas reas tratadas, ou seja, as citocininas aumentam a atividade do dreno e consequentemente, a fora do dreno (ver partio de assimilados, na Unidade VI). Lembre-se: Fora do dreno = tamanho do dreno x atividade do dreno

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e) Maturao de cloroplastos Embora a maioria das sementes de plantas possam germinar no escuro, a morfologia das plntulas crescendo no escuro muito diferente daquelas que crescem na luz. As plantas no escuro so estioladas, tendo hipoctilo e entrens alongados, cotildones e folhas no expandidos, e cloroplastos no maturos. Ao invs de maturar como cloroplastos, os proplastdios de plntulas crescendo no escuro desenvolvem-se em etioplastos. Nos etioplastos, a membrana interna forma um trelia compacta e altamente regular, conhecido como corpo prolamelar. Os etioplastos tambm possuem alguns carotenides, sendo esta a razo para a colorao amarelada das plantas estioladas. Porm, os etioplastos no possuem clorofila nem as enzimas e as protenas estruturais requeridas para a formao da maquinaria fotossinttica. Quando as plantas germinam na luz, os cloroplastos maturam diretamente dos proplastdios presentes no embrio, porm, etioplastos podem tambm gerar cloroplastos quando as plantas estiolados so iluminadas. Quando as folhas estioladas so tratadas com citocininas, antes de serem iluminadas, elas formam cloroplastos com extenso sistema de membrana interna e com maiores taxas de biossntese de clorofila e de enzimas fotossintticas. Tambm, plntulas de Arabidopsis (no mutantes) germinando no escuro e na presena de citocininas, desenvolvem caractersticas de plntulas que germinam na luz (Figura 32).Cytokinin (M) 0 3 15 30 60 75

Figura 32 O efeito de citocininas sobre plntulas de Arabidopsis crescendo no escuro (Taiz & Zeiger, 1998). 259

As caractersticas das plantas tratadas com citocininas e mostradas na figura 32 so: Encurtamento do caule; Expanso dos cotildones; Iniciao de folhas no meristema apical; E, tambm, se observa parcial desenvolvimento dos cloroplastos, incluindo a sntese de algumas enzimas da fotossntese. Estes resultados indicam que as citocininas participam da regulao da sntese de pigmentos e de protenas associadas com o processo fotossinttico, juntamente com outros fatores ambientais, tais como luz e nutrio.

f) Outros efeitos relacionados s citocininas As citocininas podem promover ou inibir a expanso celular. A promoo da expanso celular pelas citocininas mais claramente demonstrada nos cotildones de algumas dicotiledneas que possuem folhas cotiledonares. De modo contrrio, as citocininas podem inibir o alongamento celular em caules e razes. Neste caso, provvel que a inibio do alongamento do caule pelas citocininas, esteja associada produo do hormnio gasoso etileno (Figura 33).

Figuras 33 Citocininas estimulam a produo de etileno e reduo no cresci