REDE PREMiUM DE EQUIPAMENTOS MULTIUSUÁRIOS … · como nos ensaios de migração celular (16h –...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Medicina

REDE PREMiUM DE EQUIPAMENTOS MULTIUSUÁRIOS COMPLEXO HC-FMUSP/LIMs

NÚCLEO DE MICROSCOPIA CONFOCAL

Tutorial do Microscópio de Fluorescência Comum Sistema AxioVision 4.8

Elaborado por Ana Lúcia Garippo

Revisado por Luciana Pescatore Alves

2012

COMO USAR ESTE TUTORIAL Este tutorial foi preparado para auxiliar na aquisição de imagens, permitindo fácil acesso às ferramentas do Sistema AxioVision 4.8 e informações básicas sobre

operação do equipamento.

De acordo com o material e qualidade da amostra ou as necessidades específicas de cada usuário, novas rotinas serão implantadas e ampliadas para que possamos adequar o sistema como um todo. O Sistema AxioVision suporta várias câmeras, aqui temos duas AxioCam MR e HR, cada qual com suas qualidades e especificidades. Informações complementares estão disponíveis no guia AxioVision (Carl Zeiss).

FMUSP © 2012

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

Av Dr Arnaldo 455 São Paulo - SP Telefone: (11) 3061.7000 (11) 2661.5957 E-Mail: [email protected] www.premium.fm.usp.br

Editorado por Josué Moreira de Souza SDC - Serviço de Documentação Científica FMUSP

Sumário

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 1

1.1 Avisos prévios ......................................................................................... 1

1.2 Recursos do Sistema AxioVision ............................................................ 2

2. MÉTODO - AxioVision ....................................................................................... 3

2.1 Acionar ou Instalar todos os Componentes e o Sistema AxioVision ....... 3

2.2 Ligue a HBO (somente se for usar a fluorescência!) .............................. 3

3. O SISTEMA AxioVision 4.8 ............................................................................... 6

3.1 Posicionar a amostra no suporte ............................................................ 6

3.2 Aquisição das Imagens ........................................................................... 7

3.3 Barra de Ferramentas do AxioVision ...................................................... 8

3.3.1 ToolBar – Workarea ..................................................................... 8

4. SELECIONAR A CÂMERA (HR OU MR) .......................................................... 9

5. INÍCIO DA AQUISIÇÃO “LIVE” ....................................................................... 10

5.1 Ferramentas do LIVE ............................................................................ 10

5.2 Escala da Imagem no LIVE ................................................................... 12

5.3 Aquisição da Imagem – Luz Transmitida - AxioCam MR ...................... 12

5.4 Imagem amarelada - Ajuste de cor “picking” ......................................... 13

5.5 Determinar o Balanço de Branco .......................................................... 14

5.6 Imagens não Uniformes – Variações na Luminosidade Correção de Sombra ................................................................................................. 14

6. PROPRIEDADES DA IMAGEM ...................................................................... 15

6.1 Tamanho da imagem a ser Adquirida Informações já existentes .......... 16

6.2 Nomear Imagens e Arquivos ................................................................. 17

6.3 Nomear O SEU EXPERIMENTO .......................................................... 17

7. MULTICANAIS (MULTICHANNEL AQUISITION) ........................................... 18

7.1 Duplicar e Remover Canais .................................................................. 19

Modo Câmera ....................................................................................... 20 Modo Fixo ............................................................................................. 20

7.2 Dois ou Mais Marcadores ..................................................................... 22

7.3 Salvar a Imagem ................................................................................... 23

7.4 Multidimensional Aquisition – Z-Stack e Time Lapse ............................ 24

7.5 GALERIAS - Avaliar a espessura e co-localização de proteínas em amostras 3D/Tempo.............................................................................. 26

7.6 Time Lapse - Multiwell Acquisition ........................................................ 27

8. IMPORTAR E EXPORTAR EXPERIMENTOS ................................................ 28

9. MARK AND FIND ............................................................................................ 29

9.1 Selecionar o tamanho do suporte para lâmina, placa de petri ou placa de 12/24 wells ....................................................................................... 29

9.2 Setar os poços - Canto inferior direito e superior esquerdo no microscópio. .......................................................................................... 29

9.3 Calibrar Novas Placas – Sem a Incubadora ........................................ 30

9.4 Centralizar o poço e foco ...................................................................... 32

9.5 Mark and Find - Macro da Placa já Existente ........................................ 33

9.6 Iniciar a Calibração – Não Colocar a Incubadora! ................................. 35

9.6.1 Multwell Acquisition .................................................................... 36 9.6.2 Iniciar a Setagem........................................................................ 38 9.6.3 Mark and Find ............................................................................ 39

9.7 SETAR 3 WELL e finalizar com SET na imagem LIVE ........................ 40

9.8 Escolher campo e foco (X, Y, Z) ........................................................... 41

10. FINAL DO EXPERIMENTO – ARQUIVOS GERADOS ................................... 43

10.1 Gerar um arquivo e exportar imagens................................................... 45

10.2 Salvar as Imagens em (*.AVI) ............................................................... 46

10.3 Exportar imagens .................................................................................. 47

11. DETALHES DAS AMOSTRAS ........................................................................ 48

12. SAIR DO SISTEMA ......................................................................................... 49

13. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................ 50

Introdução - 1 -

1. INTRODUÇÃO 1.1 Avisos prévios

O equipamento será liberado para uso somente aos usuários treinados e habilitados. O uso inadequado deste equipamento poderá gerar sérios riscos aos usuários, pois a base é motorizada, o usuário corre o risco de prender os dedos e há superfícies quentes. Os danos por uso inadequado não serão cobertos pela empresa Carl Zeiss. É VEDADO quaisquer alterações nas configurações realizadas sem autorização dos responsáveis e além das necessárias e citadas neste tutorial. Todo e qualquer dano ou prejuízo, periférico ou não, no microscópio, e seus complementos, câmeras, computador, adicionais do computador, sistemas de CO2, temperatura, HBO e MTB, será de responsabilidade do usuário. Em caso de alguma dúvida técnica ou algum problema operacional não citado neste manual, entre em contato IMEDIATAMENTE com o responsável técnico ou um dos coordenadores do Núcleo de Microscopia Confocal. Este equipamento está instalado no 9o. Andar do Bloco II do INCOR. Não temos gerador neste andar. O equipamento conta com o recurso de um pequeno nobreak. Assim, em caso de queda de energia, é fundamental desligar corretamente todos os componentes e sair do sistema. Em eventual aviso de queda de energia ou fatores climáticos adversos (relâmpagos, raios e trovões), não ligue, ou então desligue o equipamento o mais rápido possível !

Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM - 2 -

1.2 Recursos do Sistema AxioVision

1.2.1. Análise de amostras fixadas ou de células in vivo;

1.2.2. Multicanais: aquisição de imagem monocromática ou dois ou mais

marcadores (6);

1.2.3. Galerias - Z-stack: uma série da imagem adquirida em diferentes

planos focais;

1.2.4. Intervalos - Time-Lapse: obtenção de fotos em ciclos com intervalos

(segundo, minuto ou horas) pré-definidos.

1.2.5. Sobreposição - MosaiX: uma série da imagem adquirida em detalhe

de sobreposição (Merge);

1.2.6. Posições definidas - Mark and Find – uma série da imagem adquirida

em uma posição ou mais posições predefinidas em uma placa,

1.2.7. Multidimensional - Combinar : Z-stack, Time Lapse e Multichannel;

1.2.8. Representação e análise tridimensional das amostras – “movie”.

Método - AxioVision - 3 -

2. MÉTODO - AxioVision

2.1 Acionar ou Instalar todos os Componentes e o Sistema AxioVision

2.1.1. Verifique se sua placa está seca externamente e bem fechada (com fita adesiva).

2.1.2. Verifique se o noBreak está ligado (somente a luz verde). Caso a vermelha esteja acesa, isto significa que houve queda ou oscilação de energia, neste caso: desligue o noBreak na parte posterior do rack e volte a ligá-lo.

2.2 Ligue a HBO (somente se for usar a fluorescência!)

HBO

1. Antes de iniciar a aquisição de imagens: Ligue a HBO para que se estabilize a temperatura. O intervalo para re-ligagem desta lâmpada é de 30 minutos, para total resfriamento. O desrespeito a este intervalo pode ocasionar estouro na lente por aquecimento.

2. Ao final do uso, anote o horário de desligamento da HBO assim como o valor do contador da HBO para que o próximo usuário saiba o horário que foi desligado e para possibilitar o controle de troca da mesma.

3. Durante a troca de lâmpada, evite tocar no bulbo da lâmpada ou na superfície quente.

4. A lâmpada de mercúrio HBO tem duração média entre 200 e 300 h (Osram: HBO 100W/2 and HBO 103W/2; Ushio: USH-102D).

5. Antes de trocar a lâmpada, desconecte da energia e espere por 15 minutes para o resfriamento total.

2.2.1. Ligue o Microscópio Axiovert 200M; 2.2.2. A Câmera MRc será acionada automaticamente (prioridade para

experimentos in vivo); 2.2.3. Ligue o Controle Remoto da Platina (SMC 2009); 2.2.4. Encaixe o cabo da Câmera HRm 2.2.5. Ligue o Controle de Temperatura (experimentos in vivo) 2.2.6. Ligue o Controle do CO2 (experimentos in vivo) 2.2.7. Ligue a CPU 2.2.8. Entre com a sua senha da Rede PREMiUM


Parte I – Acessórios do Microscópio de Fluorescência Comum

HBO 100

Acesso à fluorescência

SMC 2009

Acesso à platina motorizada

Platina

Foco Motorizado

Joinstick controle XY

Suportes

Método - AxioVision - 5 -

Parte II – Acessórios do Microscópio de Fluorescência Comum Ensaios in vivo

Controle de Temperatura Fluxo CH2 ON 37,0 Placa CH1 37 37,0 E–Trava a leitura no ponto ideal

Controle de CO2 – 1 BAR SET POINT 5 – VENT 2 – HEAT 2

FECHAR A SAIDA DE CO2 E DESPLUGAR QUANDO ESTIVER FORA DE USO!

Drives - Piezo Z-Stage Acessório de Aquecimento para placas de 12 wells ou 24 wells.

Incubadora para distribuição uniforme de CO2.

Sistema de Aquisição in vivo montado.

Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM

- 6 -

3. O SISTEMA AxioVision 4.8

O Sistema AxioVision contém um pacote denominado MTB 2004 que

simplifica e unifica o software do microscópio AxioVert 200M e os seus

acessórios.

3.1 Posicionar a amostra no suporte

1. Delicadamente, levante o braço do microscópio.

2. Encaixe o suporte adquedado a lâmina ou a placa.

3. Delicadamente, volte o braço do microscópio à posição, na direção do condensador.

4. Ajuste a objetiva, focalize a área de interesse.

O Sistema AxioVision 4.8 - 7 -

3.2 Aquisição das Imagens

ANTES da captura das imagens de qualquer experimento, FAÇA uma avaliação qualitativa da amostra e os ajustes dos Controles Branco e Negativo.

3.2.1. A presença de agentes contaminantes na amostra evidencia a

necessidade urgente de cuidados na sala de cultura ou no preparo

de reagentes.

3.2.2. O Controle Branco (somente o marcador nuclear Dapi, Hoechst ou

PI) nos auxiliará a identificar toda a autofluorescência da amostra.

Zeramos esta autofluorescência em parâmetros elevados (i.e, o

tempo máximo sem auto-marcação).

3.2.3. O Controle Negativo (SEM os anticorpos primários, mas COM todos

os secundários) tem a finalidade de identificar qualquer marcação

inespecífica devida às ligações cruzadas entre anticorpos (espécies

de origem), ou reatividade entre amostras e anticorpos. Partindo dos

parâmetros do BRANCO, zeramos novamente com parâmetros

elevados.

Qualquer experimento que der seguimento à análise sem controles está

fora dos critérios de avaliação. Os dados gerados são superficiais, fora dos

critérios técnicos e sem valor científico.

Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM

- 8 -

3.3 Barra de Ferramentas do AxioVision

3.3.1 ToolBar – Workarea

Na ocular, visualize os controles. Ajustar o campo

e foco; escolher o aumento; avaliar a qualidade

do material; verificar a presença de agentes

contaminantes e restrições técnicas.

Selecionar a Câmera (HR ou MR) - 9 -

4. SELECIONAR A CÂMERA (HR OU MR)

AxioCam HRm – Possui alta resolução, velocidade e tamanho na aquisição da

imagens, 13 megapixel de cor em cada canal. A versão Monocromática é

específica para amostras fluorescentes. Assim, as amostras com histoquímica ou

imunohistoquímica adquiridas aparecerão em escala de cinza.

AxioCam MRc – É altamente sensível para captura de imagens em alta velocidade e

dados em tempo real. Conveniente para longos períodos de aquisição de imagens,

como nos ensaios de migração celular (16h – 24h). As amostras fluorescentes

poderão ser adquiridas, também com boa resolução, exceto quando há baixa

expressão proteica ou excesso de meio de cultura (desta forma quando possível

utilizar meio de cultura sem Phenol-red). Lembrando que o longo período de

exposição à luz reduz a fluorescência.

Na barra de ferramentas direcionar o porcentual para captura no LIVE no microscópio

e para a ocular (80% e 20%, respectivamente).


5. INÍCIO DA AQUISIÇÃO “LIVE”

5.1 Ferramentas do LIVE

Capturar a imagem desejada.

Velocidade --(Slow, Middle, Fast). SLOW -- Para melhor resolução de captura da imagem.

Gera os valores de exposição para ambas câmeras, simultaneamente.

Para a AxioCam HR, gera um balanço com o fundo branco da amostra.

Amplia o contraste da amostra. Melhor sinal adquirido. NÃO É O MELHOR!

Ajusta o Mínimo e Máximo linear da amostra.

Para desfazer as alterações, clique em LINEAR. Retorna aos padrões anteriores.

Ícone Gama para a melhor aquisição da imagem no LIVE. O valor do gama é em torno de 0,45. Para ajustar brilho e contraste click em MIN/MAX.

Amplifica o sinal, e consequentemente ruídos da aquisição.

Abre uma janela de diálogo com as propriedades da amostra.

Clicar em LIVE na barra de ferramentas para que a imagem passe da câmera para a tela do microscópio.


Aparecerá um gráfico com os índices de brilho, contraste e gama da imagem.

(Brilho)


5.2 Escala da Imagem no LIVE

Escalas – Automático (aquisição em pixel)

Opte pelo ajuste por objetiva, assim as barras de referencias serão ajustadas.

5.3 Aquisição da Imagem – Luz Transmitida - AxioCam MR


5.4 Imagem amarelada - Ajuste de cor “picking”

B/W ( Black and White) ou RGB – Red/ Green/ Blue

Tamanho do frame


5.5 Determinar o Balanço de Branco

Procure uma região sem cor na amostra Click em interative.

Mova o mouse para a amostra e esta assumirá os novos comandos.

Em seguida, Click em uma área que deveria ser branca (ou de baixa intensidade de cor).

5.6 Imagens não Uniformes – Variações na Luminosidade

Correção de Sombra

Mova o microscópio para uma parte clara da amostra.

Click GENERAL em Shading Corretion – Enable.

As imagens serão corrigidas automaticamente e uniformemente.

Propriedades da Imagem - 15 -

6. PROPRIEDADES DA IMAGEM Podemos ajustar contraste e brilho no display da imagem, principalmente

quando as imagens adquiridas pela AxioCam estão com muita intensidade.

O histograma mostra cada pixel a cada cor e nível de intensidade (RGB).

Selecione em Propriedades e selecione a tabela no quadro.


6.1 Tamanho da imagem a ser Adquirida Informações já existentes

Click em Frame no painel de controle da câmera.

Setar a resolução para 1300x1030 e click no ícone

Esta resolução é suficiente para todos os requisitos diários.

Aumentando o frame, diminuímos automaticamente a resolução.

File

Open image option (para adquirir formatos já existentes)

Capture uma imagem e click em Info View na janela do botão da imagem.

Propriedades da Imagem - 17 -

6.2 Nomear Imagens e Arquivos

6.3 Nomear O SEU EXPERIMENTO

Na barra de tarefas – TOOL – Options – Naming – Categoria – Single Aquisition. Nomeie o ensaio. Neste caso: Experiment. As imagens a serem adquiridas assumirão uma seqüência numeral. Faça os ajustes necessários na aquisição e click em SAVE. Click em Load para procurar um ensaio anterior e OK. Escolher na Lista. Click em ReUSE e START para executar.


7. MULTICANAIS (MULTICHANNEL AQUISITION)

Multichannel acquisition

Escolha o Canal

DURING ACQUISITION Setar o Canal e a Objetiva

AFTER ACQUISITION

OK

Multicanais (Multichannel Aquisition) - 19 -

7.1 Duplicar e Remover Canais

Duplicar o Canal quantas vezes for necessário para atender todos os fluoroforos

do seu experimento.


Modo Câmera Modo Fixo

LIVE

Exposure

Measure

Previous da imagem INDIVIDUAL

Verificar a intensidade - OK

Start

LIVE

Exposure

SNAP

Previous da imagem

Verificar a intensidade - OK

Start – todos os canais.


Modo Câmera Modo Fixo

Remover Canais.

START Co- Aquisição dos Canais Automaticamente. Varrerá todos os canais.

RESULTADO


7.2 Dois ou Mais Marcadores 7.2.1 MEASURE – EXPOSURE -- Para melhor verificação do foco e

intensidade dos fluoróforos. Habilite um CANAL por vez para que possa configura-los adequadamente. Inicie pelos controles BRANCO E NEGATIVO.

7.2.2 Reduza a intensidade do Porcentual de Excitação, sempre que

possível. Quanto menor, menor o ruído e melhor a resolução da imagem.


7.3 Salvar a Imagem

Click em Salvar ou Salvar como no menu do Arquivo.

Crie uma nova pasta na área INICIAR – Usuário – Imagens – (1.

Usuários) e salve seus arquivos (formato ZVI).

As imagens podem ser salvas também em Tagged Image File (*.tif); em

Microsoft Windows Bitmap (*.bmp) ou como um arquivo JPEG (*.jpg)

Para gerar um filme: (*.AVI) – -- Movie

Salvando e Arquivando Imagens


7.4 Multidimensional Aquisition – Z-Stack e Time Lapse

Durante a aquisição calibrar sempre com intensidade de luz 6.8 (Frontal

do microscópio).

Shutter Closed

Fixed

Selecionar a Câmera MR – Porta Frontal


Dois ou mais Canais em Galeria (Z-Stack)


7.5 Galerias - Avaliar a espessura e co-localização de proteínas em amostras 3D/Tempo

1) Localizar o centro da amostra Focalize a imagem e click em CENTER. Decida qual o intervalo e quantas fatias deseja. Por exemplo, uma amostra com espessamento de 7µm, podemos fatiá-la com intervalos de 0.5 µm, assim o centro da amostra será a oitava fatia, sendo 7 acima e 7 abaixo.

Ou 2) Início e fim da amostra Neste método, indicamos usando o microscópio o inicio e o fim da amostra e clicamos em START e STOP, respectivamente.


7.6 Time Lapse - Multiwell Acquisition

Neste exemplo, queremos 10 fotos do mesmo campo, a cada 15 segundos (ou seja, 10 ciclos com intervalo de 15 segundos).

A duração total do experimento será de 135 segundos, iniciando no tempo t=0.

Podemos simplesmente definir qual intervalo e duração total do experimento que queremos e automaticamente o software calculará quantos ciclos serão necessários.

OBS.: Fique atento ao número de campos escolhidos para aquisição de imagens, pois o tempo necessário para fotografar todos os campos não pode exceder o tempo de intervalos estabelecido entre as fotos.


8. IMPORTAR E EXPORTAR EXPERIMENTOS

Mark and Find - 29 -

9. MARK AND FIND 9.1 Selecionar o tamanho do suporte para lâmina, placa de petri ou

placa de 12/24 wells 9.2 Setar os poços - Canto inferior direito e superior esquerdo no

microscópio.

o A placa está invertida quando colocada na platina.


9.3 Calibrar Novas Placas – SEM A INCUBADORA

Toda vez que ligar ou re-inicar o computador!

NEW


CONFIRMAR E SELECIONAR – OK

CONFIRMAR E SELECIONAR – OK


9.4 Centralizar o poço e foco

LIVE Exposure SNAP


9.5 Mark and Find - Macro da Placa já Existente


9.6 Iniciar a Calibração – NÃO COLOCAR A INCUBADORA!

Open de well

plate calibration

Click em

NÃO.


9.6.1 MULTIWELL ACQUISITION Escolher o tipo de Placa na lista


Clicar em NÃO


9.6.2 INICIAR A SETAGEM -- SEMPRE INICIAR EM : -- SET ZERO POSITION

AUTO


9.6.3 MARK AND FIND Clicar SET ZERO position -- AUTO CALIBRATION – SET POSITION – SET

Clicar SET ZERO position --

AUTO

CALIBRATION – SET POSITION – SET


9.7 SETAR 3 WELL e finalizar com SET na imagem LIVE 9.7.1 COLOCAR A INCUBADORA SOBRE A PLACA, ENCAIXAR E

ABRIR O TUBO DE CO2 E VERIFICAR A TEMPERATURA!


9.8 Escolher campo e foco (X, Y, Z)


9.8.1 Alterar o campo (x,y) ou profundidade (z)

Final do Experimento – Arquivos Gerados - 43 -

10. FINAL DO EXPERIMENTO – ARQUIVOS GERADOS


10.1 Gerar um arquivo e exportar imagens


10.2 Salvar as Imagens em (*.AVI)


10.3 Exportar imagens

- Abri-las no Software ZEN, instalado no Desktop

- Exportar – Movie – (*. AVI)

- O Image J possibilita a análise e quantificação.

Import -- Manual Tracking (pluging)


11. DETALHES (anotar tempo real da aquisição de imagens)

Sair do Sistema - 49 -

12. SAIR DO SISTEMA

12.1. Salvar seus arquivos em um PEN-DRIVE. Por gentileza passe um anti-virus antes de conectar seu pen-drive. Zele pelo equipamento do qual você precisa para sua pesquisa e colabore com a pesquisa dos outros.

12.2. SAIR do Sistema AxioVision 4.8. 12.3. Desligar o PC. 12.4. Deixar as objetivas abaixo da posição de foco e sempre na menor. 12.5. Desligar todos os componentes do Microscópio e Acessórios. 12.6. Anotar o horário da HBO no caderno de controle e desligá-la. 12.7. Quando usar óleo de imersão, limpe as objetivas para remover todo

o óleo, primeiro com lenço de papel e depois, com lenço de papel e álcool.

12.8. Desligar o cilindro de CO2 e o de Nitrogênio (o último usado quando

há necessidade de balancear a mesa). 12.9. Cobrir o microscópio.


13. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A implantação do Núcleo de Microscopia Confocal na Rede PREMiUM do

Complexo HC-FMUSP/ LIMs nos possibilita avaliação de amostras biológicas que

até então os recursos em microscopia comum, de varredura ou eletrônica não

atendiam em requisitos específicos: múltiplas marcações e avaliação de amostras

in vivo, em seus eventos bioquímicos. A interpretação criteriosa destas amostras

gera um imenso leque de possibilidades nas pesquisas até então realizadas em

nossa Instituição, colocando-nos em um patamar mais elevado nos critérios

internacionais para publicações.

A implantação da Rede de Multiusuários nos impele ao exercício da

solidariedade, da formação de parcerias produtivas e responsabilidades com esta

Instituição de ensino. Além da formação de pesquisadores com credibilidade e

respaldo intelectual, estamos formando seres humanos conscientes da parcela

que lhes cabe no progresso cientifico e social em âmbito mundial.

Que o amor à ciência fecunde nossas almas de generosidade e

conseqüentemente o sucesso virá a todos, pois impossível dizer que caminhamos

sozinhos, há ao nosso lado uma equipe de profissionais que nos dão sustentação,

aparam arestas e orientam nossos resultados para sua ampla publicação.

Sucesso a todos!

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