Rafael Peres Estudo da presença, da função e das vias ... · trabalhos nos mais diversos filos,...

Rafael Peres

Estudo da presença, da função e das vias de produção da melatonina em invertebrados.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.

São Paulo2013

Rafael Peres

Estudo da presença, da função e das vias de produção da melatonina em invertebrados.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.

Fisiologia Humana

Orientador: Professor Dr. José Cipolla-NetoCo-Orientador: Professor Antonio Carlos Marques

Versão Original

São Paulo2013

DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

reprodução não autorizada pelo autor

Peres, Rafael. Estudo da presença, da função e das vias de produção da melatonina

em invertebrados./ Rafael Peres. -- São Paulo, 2013.

Orientador: José Cipolla Neto. Co-Orientador: Antônio Carlos Marques

Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Fisiologia e Biofísica. Área de concentração: Fisiologia Humana. Linha de pesquisa: Fisiologia da glândula pineal.

Versão do título para o inglês: Melatonin in invertebrates: presence, functions and production pathways.

Descritores: 1. Melatonina 2. Invertebrados 3. Cronobiologia 4. Genes relógio I. Cipolla Neto, José II. Marques, Antonio Carlos, III. Universidade de São Paulo. Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Humana IV. Título.

ICB/SBIB59/2013

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOINSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

Candidato(a): Rafael Peres.

Título da Dissertação: Estudo da presença, da função e das vias de produção da melatonina em invertebrados

Orientador(a): José Cipolla Neto.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado,

em sessão pública realizada a .............../................./.................,

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................ Nome: ................................................................................................... Instituição: .............................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................ Nome: ................................................................................................... Instituição: ............................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ........................................................................................... Nome: ................................................................................................... Instituição: .............................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................ Nome: ................................................................................................... Instituição: .............................................................................................

Presidente: Assinatura: ............................................................................................ Nome: .................................................................................................. Instituição: .............................................................................................

À minha mãe, por sempre me

apoiar, pela educação, por seu amor, incentivo e

compreensão. E à Samuel Kai Mana David

por ter sempre estado ao meu lado, em todos os

momentos.

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao meu orientador, professor José Cipolla-Neto e ao meu

co-orientador, professor Antonio Carlos Marques, pela preciosa ajuda no

desenvolver do projetos, tanto me dando suporte nas dificuldades experimentais

quanto em me prover de idéias sobre a discussão dos resultados. Ao professor

Mark Martindale, da Universidade do Hawaii, por ter me recebido tão bem para

meu estágio de doutorado, me dando total suporte em todos os momentos. Mais

do que um excelente orientador, se tornou um grande amigo.

Agradecimento especial as técnica de laboratório, Julieta Helena

Scialfa (ICB) e Sabrina Baroni (IB), pela ajuda na realização experimentos e aos

técnicos do Cebimar pela ajuda na coleta dos animais.

Á professora Solange Castro Afeche, por ter me possibilitado realizar

diversos experimentos em seu laboratório, com total suporte, e por ter ajudado na

discussão de resultados.

À todos os colegas de laboratório pela ajuda, apoio e amizade.

Aos colegas de laboratório da Universidade do Hawaii, que me

receberam muito bem, me fazendo sentir em casa. Não teria conseguido nada

sem vocês!

Agradecimento mais que especial à minha mãe, pelo apoio nas horas

difíceis e pelo apoio na realização do intercâmbio.

WAE AKU I KA LANI

(Deixe o céu fazer as escolhas,

seja confiante, não há nada a temer.)

Provérbio havaiano

RESUMO

Peres R. Estudo da presença, da função e das vias de produção da melatonina em invertebrados. [tese (Doutorado em Ciências)]. Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, São Paulo; 2013.

A melatonina é o principal hormônio produzido pela glândula pineal dos

vertebrados. Tal produção é regulada com precisão pelo ciclo dia-noite. Desta maneira,

funciona como um sinal para o organismo como um todo, informando, pela sua

presença ou ausência, se é dia ou noite no ambiente externo. A primeira descrição do

indol em invertebrados ocorreu em 1984, no grilo Locusta migratoria. Seguiram-se

trabalhos nos mais diversos filos, mas alguns grupos de fundamental importância, seja

pela sua riqueza de espécies, seja pelo seu posicionamento filogenético, como Cnidaria,

Ctenophora, Annelida, e Echinodermata nunca foram investigados quanto à presença

deste hormônio. O presente estudo foi capaz de mostrar a presença da melatonina em

espécies destes filos, bem como a presença da via de produção clássica da substância,

com ensaios de atividade para as enzimas e demonstração da presença dos

correspondentes genes no genoma das espécies. Fomos também capazes de realizar

ensaios que mostraram que a melatonina possui papel na regulação do ritmo circadiano

destas espécies.

Palavras chave: Melatonina. Invertebrados. Cronobiologia. Genes relógio.

ABSTRACTPeres R. Melatonin in invertebrates: presence, functions and production pathways. [Thesis (Doctor in Science)]. Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, São Paulo; 2013.

The primary hormone of the vertebrate pineal gland, melatonin, an indole, was

first described as a circadian and seasonal pacemaker that allows the animal to predict

and prepare for changes in their environment. However, many articles have recently

been published expanding the importance of melatonin, including new sites of

production, such as the retina and gastrointestinal system, as well as its function in non-

vertebrate organisms. The presence of melatonin in invertebrates was first reported in

the eyes of the locust Locusta migratoria. However, groups of importance like Cnidaria,

Ctenophora, Annelida, and Echinodermata have never been investigated about the

presence of melatonin. Our study shows the presence of the indol, and also the presence

of the enzymes of the classical melatonin pathway. This is showed not only by the

presence of the genes of those enzymes in the genome of the species, but also by the

activity of the enzymes. We also show potential actions of the melatonin in modulating

the behavior of the species.

Keywords: Melatonin. Invertebrates. Chronobiology. Clock genes.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA................................15

1.1 A glândula pineal dos vertebrados..............................................................15

1.2 A molécula de melatonina............................................................................16

1.3 Melatonina em não vertebrados..................................................................18

1.4 Clock genes....................................................................................................21

1.5 Justificativa...................................................................................................23

2 OBJETIVOS..................................................................................................25

3 MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................26

3.1 Material biológico.........................................................................................26

3.2 Coleta de material e experimentos in vivo..................................................27

3.3 Aferição da presença de melatonina por HPLC..........................................30

3.4 Aferição da presença de melatonina por Elisa (Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay).....................................................................................31

3.5 Extração de DNA dos tecidos das espécies.................................................32

3.6 Extração de RNA dos tecidos das espécies (Bolinopsis vitrea, Olindias

sambaquiensis, Nematostella vectensis e Phragmatopoma lapidosa)...............33

3.7 Extração de RNA dos tecidos de Echinaster brasiliensis.......................34

3.8 Obtenção de cDNA.......................................................................................34

3.9 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para identificação de isoformas

dos genes.............................................................................................................35

3.10 Seqüenciamento dos fragmentos amplificados........................................35

3.11 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Real Time para identificação

de padrões de expressão gênica.........................................................................36

3.12 Análise Radiométrica da Atividade da Triptofano Hidroxilase (TPH)..39

3.13 Análise radiométrica da atividade da aril-alquil-N-acetiltransferase

(AANAT)..............................................................................................................40

3.14 Análise radiométrica da atividade da Hidroxindole-O-metiltransferase

(HIOMT).............................................................................................................41

3.15 Análise de expressão global por experimento de Microarranjo.............42

3.16 Análise Estatística.......................................................................................43

4 RESULTADOS...............................................................................................44

4.1 Bolinopsis vitrea............................................................................................44

4.1.1 Dosagens de melatonina.......................................................................................44

4.1.2 Averiguação da presença dos genes da via de produção de melatonina e

genes relógio....................................................................................................................45

4.1.3 Averiguação da atividade da enzima Triptofano hidroxilase.................................47

4.1.4 Averiguação da atividade da enzima aril-aquil-N-acetiltransferase......................47

4.1.5 Experimentos com adição de melatonina aos aquários..........................................49

4.2 Lychnorhiza lucerna.....................................................................................49

4.2.1 Dosagens de melatonina......................................................................................49

4.3 Olindias sambaquiensis................................................................................50

4.3.1 Dosagens de melatonina.........................................................................................50

4.3.2 Averiguação da presença dos genes relacionados à via de produção de melatonina

e genes relógio ..............................................................................................................53

4.3.3 Análise da expressão de enzimas da via de produção de melatonina e genes

relógio ............................................................................................................................54


4.3.5 Averiguação da atividade da enzima aril-aquil-N-acetiltransferase....................59

4.3.6 Experimentos com adição de melatonina aos aquários.........................................60

4.4 Nematostella vectensis..................................................................................61

4.4.1 Dosagens de melatonina........................................................................................61


e genes relógio...............................................................................................................62


relógio ............................................................................................................................63

4.4.4 Averiguação da atividade das enzimas Triptofano hidroxilase e

Hidroxindole-O-metiltransferase....................................................................................67

4.4.5 Análise da expressão gênica global por microarranjo..........................................68

4.5 Phragmatopoma lapidosa................................................................................71

4.5.1 Averiguação da presença de melatonina...............................................................71

4.5.2 Averiguação da presença de isoformas dos genes da via de produção de

melatonina e genes relógio .............................................................................................74


4.5.4 Averiguação da atividade da enzima Aril-aquil-N-acetiltransferase.....................76

4.6 Echinaster brasiliensis..................................................................................77

4.6.1 Averiguação da presença de melatonina...............................................................77


melatonina e genes relógio .............................................................................................80


relógio .............................................................................................................................82

4.6.4 Averiguação da atividade da enzima Triptofano hidroxilase..................................87

4.6.5 Ensaio da atividade da Aril-aquil-N-acetiltransferase ..............................................87

4.6.6 Experimentos com adição de melatonina aos aquários........................................88

5 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO..................................................................89

REFERÊNCIAS.............................................................................................99

ANEXO 1: Quadro comparativo das espécies...............................................105

ANEXO 2: Alinhamentos.................................................................................107

ANEXO 3: Resultados do Microarranjo em Nematostella vectensis............117

1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA

1.1 A glândula pineal dos vertebrados

A glândula pineal está presente em todos os vertebrados conhecidos e se

origina embriologicamente de uma evaginação do III ventrículo e, no cérebro adulto,

constitui, junto com os núcleos habenulares, a maior parte do epitálamo (1). Nos

vertebrados não mamíferos (lampreias, peixes cartilaginosos, peixes ósseos, anfíbios,

“répteis” e aves), o órgão pineal é diretamente fotossensível. Na evolução dos

mamíferos, porém, a glândula pineal perdeu sua capacidade fotorreceptiva, passando a

estar sob o controle do sistema nervoso central, notadamente do simpático cervical.

Assim, as influências do ciclo de iluminação ambiental passam a se dar de forma

indireta, através de projeções da retina para estruturas diencefálicas e destas para os

neurônios pré-ganglionares, que podem, por meio da inervação simpática periférica,

atingir a glândula pineal (2, 3).

Desta maneira, verificamos que a evolução do principal tipo celular da

glândula pineal, o pinealócito, corrobora o monofiletismo dos mamíferos por apresentar

nestes características únicas, como a perda gradual da função receptora de luz e um

aumento da função neuroendócrina, presente em todos os vertebrados (4, 5).

A função hormonal da glândula é regulada pelo ciclo dia-noite. Na maior parte

das espécies, a glândula secreta seu hormônio, a melatonina, no período de escuro, ou

seja, pela noite. Desta maneira, os reflexos da variação da duração da noite, tão

característicos das estações do ano, serão diretamente percebidos no metabolismo da

15

glândula. Deste modo, as noites mais longas do inverno irão ocasionar uma produção de

melatonina por um maior período, o oposto ocorrendo nas noites mais curtas do verão

(6, 7). Portanto, é evidente a função fisiológica da glândula pineal: sinalizar para o meio

interno, pela presença e ausência diária da melatonina na circulação e nos diversos

líquidos corpóreos, se é noite ou dia no meio exterior e, por meio da duração do seu

perfil secretório noturno, qual é a estação do ano. Em função desse papel de

temporizador do meio interno (diário, sazonal e ontogenético), espera-se, portanto, que

a glândula pineal, principalmente por meio da secreção da melatonina, esteja envolvida

na regulação das mais diversas funções fundamentais para a sobrevivência do indivíduo

e da espécie: regulação endócrina em geral e metabólica e reprodutiva, em particular;

regulação do ciclo atividade-repouso, em particular do sono e da vigília; regulação do

sistema imunológico, regulação cardiovascular, entre outras (7). Existem outros locais

de síntese da melatonina, tais como retina(8) e sistema gastrintestinal(9), entretanto

acredita-se que a melatonina sintetizada nestas regiões tem maior importância na

modulação de fenômenos locais(10).

1.2 A molécula de melatonina

A melatonina (N-acetil 5-metoxitriptamina) é uma indolamina. O processo de

produção de melatonina se inicia quando o aminoácido triptofano é transformado em 5-

hidroxi triptofano (5HTP), pela enzima triptofano 5-hidroxilase (TPH). Após isso, uma

descarboxilase de ácidos aromáticos inespecífica transforma o 5HTP em serotonina. A

serotonina secretada tem um papel na própria pineal, atuando através dos seus

16

receptores do tipo 5-HT2, e aumentando a síntese de melatonina induzida por

noradrenalina (11, 12). A serotonina é N-acetilada pela aril-alquil-N-acetiltransferase

(AANAT) produzindo N-acetil serotonina (NAS). A AANAT é a enzima passo-limitante

da síntese de melatonina, pois ela apresenta um aumento de 100 vezes na sua atividade

no período noturno, deslocando o metabolismo da serotonina para a produção de N-

acetilserotonina e, em seguida, melatonina (13). A AANAT é uma enzima instável e a

manutenção de sua atividade depende de muitos fatores. Quando cessa a estimulação

simpática, ou se administram antagonistas adrenérgicos, ou ainda submete-se um animal

a uma fotoestimulação no meio da noite, a atividade da AANAT cai com uma meia vida

de aproximadamente 3 minutos (14-16). O passo final da produção ocorre quando a

enzima hidroxindole-O-metiltransferase (HIOMT) converte a NAS em melatonina10. A

atividade da HIOMT no período noturno apresenta um aumento de 1,5 vez, enquanto o

seu RNAm tem um aumento de 2 vezes (17, 18).

As características químicas da molécula da melatonina, pela presença dos

grupamentos metoxi no carbono 5, e do grupamento acil ligado ao nitrogênio do grupo

amina, são de anfifilicidade. Ou seja, ela tem a propriedade de difundir-se, com igual

capacidade tanto em meios hidrofílicos quanto lipofílicos7. Dessa forma, a melatonina,

uma vez produzida na glândula pineal, é imediatamente secretada e pode ser encontrada

em todos os compartimentos do organismo. Além disso, os carbonos 2 e 3 do anel

pirrólico, possuem uma alta capacidade de doar elétrons. Isso confere a melatonina uma

alta capacidade antioxidante (19).

17

1.3 Melatonina em não vertebrados

Apesar de existirem muitas referências da importância da melatonina em

diversos aspectos da biologia dos vertebrados, somente desde meados dos 1980s esta

importância expandiu-se também para os grupos taxonômicos não-vertebrados. Em

1984, Vivien-Roels e colaboradores publicaram o primeiro estudo da presença de

melatonina no gafanhoto Locusta migratoria, ou mais especificamente caracterizaram

indol em seus olhos compostos (20). O trabalho também mostrava que a melatonina

presente nos olhos compostos apresentava um ritmo circadiano de concentração, com

um pico de produção durante a noite, o que levou-os a sugerir uma via de transdução de

sinal luminoso presente em todos os organismos vivos.

AApós estes trabalhos, seguiram-se outros de diferentes autores, mostrando a

presença do hormônio nos mais diversos grupos, inclusive algumas vezes propondo

possíveis funções. No protista dinoflagelado Lingulodinium polyedrum, por exemplo,

foram verificados picos noturnos do indol, e a melatonina seria capaz de induzir

encistamento em resposta a um decréscimo da temperatura, independentemente do

fotoperíodo (21, 22). A presença de melatonina com um pico noturno foi verificada

também em outros Protistas, como Euglena (23), algas verdes (24), vermes

platelmintes (25) e insetos como a mosca Drosophila melanogaster (26). Os estudos

com Drosophila aprofundaram-se na investigação das vias de biossíntese do hormônio.

Hintermann e colaboradores (27, 28) foram os primeiros a purificar e clonar uma

sequência da AANAT neste inseto, a qual se mostrou capaz de acetilar dopamina,

triptamina e o precursor imediato da melatonina, a serotonina. Esses mesmos trabalhos

18

mostram experimentos de hibridização in situ do RNA mensageiro da AANAT,

revelando a transcrição do gene no cérebro, no cordão ventral e no intestino. Entretanto,

o grupo não foi capaz de verificar uma correlação entre a oscilação circadiana da

melatonina e a expressão do gene da AANAT. Em 2000, uma segunda forma da

AANAT, que compartilha 30% de identidade com a AANAT previamente descrita e

com expressão circadiana semelhante, foi clonada (29).

Em alguns organismos, a melatonina está presente em vários tecidos, porém

com diferentes padrões do pico de produção. No ensífero Gryllus bimaculatus há picos

noturnos no cérebro e nos olhos compostos, e picos diurnos nos apêndices locomotores,

antenas e órgão ovopositor (30). No molusco gastrópode Aplysia californica a situação

é semelhante, com pico noturno de melatonina no cérebro e pico diurno no olho (31),

estrutura na qual a melatonina parece ter um papel fotoprotetor (22).

Outro caso interessante é o do camarão Macrobrachium rosenbergii. Esta

espécie apresenta melatonina em seu corpo e o indol mostrou-se capaz de antagonizar a

ação do hormônio concentrador de pigmentos (32) – a melatonina em grande

concentração escurece o tegumento do crustáceo, e em baixa concentração clareia (33).

Contudo, a característica mais marcante da melatonina nesta espécie é o dimorfismo

sexual estudado por Withachumnarnkul e colaboradores (34). Em outra espécie de

camarão, Penaeus monodon, a diferença entre machos e fêmeas não foi constatada, mas

foi encontrado que altas concentrações da enzima AANAT contrastam com baixas

concentrações de melatonina, provavelmente devido ao baixo nível da enzima

hidroxindole-O-metiltransferase (35).

A melatonina possui ainda relações com a ecologia de determinados grupos.

Por exemplo, o verme nematódeo Caenorhabitis elegans alimenta-se

19

predominantemente de bactérias, notadamente Escherichia coli. Observou-se sincronia

nos picos de melatonina de C. elegans e suas E. coli predadas, o que deixa a questão se

o nematódeo é capaz de sintetizar sua melatonina ou a obtém da alimentação (36). Da

mesma maneira, talvez as bactérias Escherichia coli presentes no intestino humano

possam contribuir, ao menos em parte, para a melatonina presente neste órgão, em uma

relação de simbiose.

A melatonina foi até mesmo verificada em plantas angiospermas, tendo sido

demonstrada em folhas, flores e sementes (33), sem uma função específica ainda

conhecida. Em Chenopodium rubrum, a melatonina parece influenciar a floração (37,

38). Alguns pesquisadores acreditam que o indol possa agir em sinergia com o

hormônio vegetal auxina, promovendo o crescimento (39).

A presença da molécula em grupos tão distantes filogeneticamente indica um

surgimento evolutivo precoce, com funções diferentes nos organismos que a possuem.

Porém, as características anfifílicas da melatonina e sua capacidade de neutralizar

radicais livres devem ter sido suas primeiras funções na escala evolutiva (33). Porém,

embora possua ampla abrangência taxonômica, estudos abordando o uso da melatonina

ou as enzimas de sua via de produção como caracteres filogenéticos são escassos. As

referências existentes mostram que a sequência da AANAT presente em não-

vertebrados é homóloga àquela presente em vertebrados, ou em cordados como o

anfioxo (Cephalochordata). O gene da AANAT, presente em anfioxos, algas verdes,

fungos e bactérias, é similar e sem íntrons (40). Coon e Klein defendem a hipótese de

transferência horizontal do gene da AANAT de uma bactéria ancestral para fungos,

algas verdes e cordados, de maneira independente. Os autores, contudo, ignoraram

sequências da AANAT descritas para metazoários invertebrados, deixando um hiato na

20

história evolutiva da sequência da enzima, no seu uso e suas relações com a ecologia e

biologia dos mais diferentes, e abundantes, táxons de invertebrados.

1.4 Clock genes

Nos vertebrados, uma das funções primordiais da melatonina é de um

mecanismo de saída do relógio biológico localizado nos núcleos supraquiasmáticos

(NSQ) no cérebro. O relógio do núcleo supraquiasmático é mantido pelas oscilações na

transcrição de um conjunto de genes relógio (clock, bmal, cry1 e cry 2, period, entre

outros) que controlam a produção de melatonina ao sinalizarem para a glândula pineal

(41, 42). A melatonina liberada pela glândula pineal, por sua vez, sinaliza as mudanças

no fotoperíodo para o resto do corpo. Além disso, a melatonina pode agir como um

mecanismo de entrada no relógio, sinalizando para o núcleo supraquiasmático (43).

Ainda que os genes relógio tenham sido estudados mais profundamente em

invertebrados, seu mecanismo foi descrito pela primeira vez em um invertebrado, na

mosca das frutas Drosophila melanogaster (44). Nesta espécie, a transcrição do gene

period era induzida quando o nível da proteína PERIOD estava reduzido. Tratava-se do

primeiro dado a indicar uma alça de retroalimentação. Dez anos após a identificação do

gene period, um segundo gene, timeless, foi descoberto, com um mecanismo de

retroalimentação negativo (45, 46). O gene frequency (frq) foi identificado no fungo

Neurospora (47) , mostrando-se como um mecanismo central do relógio nesta espécie,

no qual a proteína FREQUENCY negativamente regulava sua transcrição, resultando

em oscilações circadianas da quantidade do transcrito de frq. Estas descobertas

estabeleceram o conceito que oscilações nas funções celulares eram resultados de um

21

processo de transcrição/tradução rítmica de um conjunto de genes relógio, que duraria

aproximadamente 24 horas, e que este mecanismo estaria presente em diversas espécies.

Atualmente, já é de conhecimento comum que vários dos genes relógio são

compartilhados entre animais distantes na árvore filogenética, com estudos mostrando

sua similaridade entre os dois grupos do clado bilateria (deuterostômios e protostômios)

(48). O modelo clássico do relógio nestes sistemas é baseado em duas alças

regulatórias: uma positiva, dirigida pela expressão dos fatores de transcrição bHLH-

PAS CLOCK e CYCLE (Bmal/Mop3 em mamíferos) que se heterodimerizam para

regular genes alvos que possuam sequências com o motivo E-box, e uma alça negativa,

onde proteínas que têm sua expressão aumentada por CLOCK e CYCLE (como period

e criptocromos) levam a supressão de sua própria transcrição (48, 49). As pesquisas

têm mostrado que, enquanto a alça positiva é bem conservada, há variações na alça

negativa em várias espécies, notadamente em insetos (50, 51). Até recentemente, não

era claro se genes similares possuíam funções similares em animais que houvessem

divergido muito cedo na evolução. Alguns genes relógio foram identificados no cnidário

Anthozoa Nematostella vectensis, incluindo um gene similar a timeout (um parálogo de

timeless), três criptocromos e ortólogos dos genes clock e cycle que seriam capazes de

se heterodimerizar (52). Apesar destas similaridades, não há trabalhos que mostrem se

há outros mecanismos do relógio circadiano conservados nos invertebrados,

particularmente o papel de hormônios capazes de reiniciar o relógio.

22

1.5 Justificativa

Apesar da existência de diversos trabalhos sobre a presença de melatonina em

invertebrados, há diversas frentes de pesquisa ainda não abordadas neste campo de

estudo. Grupos de fundamental importância, seja pela sua riqueza de espécies, seja pelo

seu posicionamento filogenético, tais como Cnidaria, Ctenophora, Annelida, e

Echinodermata, nunca foram investigados quanto à presença deste hormônio.

Baseado neste cenário, investigamos inicialmente a presença de melatonina

nestes grupos, a partir de estudos em Bolinopsis vitrea (Ctenophora), Olindias

sambaquiensis, Lychnorhiza lucerna. e Nematostella vectensis (Cnidaria),

Phragmatopoma lapidosa. (Annelida) e Echinaster brasiliensis (Echinodermata). Após

a confirmação da existência de melatonina, realizamos uma análise comparada do

padrão de produção da melatonina nas espécies estudadas, identificando a existência de

ritmos circadianos e eventuais influências na biologia e ecologia dos animais.

A sistematização e aprofundamento da investigação permitiu responder a

diversas questões relacionadas à evolução e ecologia dos grupos. Uma vez

caracterizada, passamos a uma análise molecular da melatonina, buscando identificar as

vias de produção envolvidas em sua síntese nas diferentes espécies por meio de ensaios

de RT-PCR. Esta busca foi realizada em torno das três enzimas clássicas da via de

produção já descrita (triptofano 5-hidroxilase, aril-alquil-N-acetiltransferase,

hidroxindole-O-metiltransferase), com o uso de reação em cadeia da polimerase de

baixa estringência com uso de ‘primers’ baseados nas sequências mais conservadas

23

entre as espécies em que já foram descritos. Também foi realizado o sequenciamento

dos amplificados encontrados.

Este projeto foi pioneiro em áreas pouco investigadas. Por um lado, em níveis

evolutivos menos inclusivos, padrões comportamentais consagrados de algumas

espécies, como a migração vertical de cnidários hidrozoários, finalmente contaram com

uma explicação fisiológica. Por outro lado, como exemplo em níveis supraespecíficos, a

identificação das enzimas e o sequenciamento dos genes da via de produção de

melatonina e seu uso em inferências filogenéticas, como uma fonte de dados

inexplorada, é uma nova frente que se abre na investigação da evolução em nível de

grandes grupos. Por fim, associando-se as duas frentes (ecologia/biologia e filogenia), a

análise filogenética de sequências das enzimas da via de produção de melatonina em

diversos invertebrados poderá possibilitar uma compreensão sobre o sinal filogenético

destas moléculas e sua expressão relacionada aos diferentes hábitos comportamentais

das espécies.

24

2 OBJETIVOS

2.1. Analisar a presença e padrão de produção de melatonina em invertebrados

Dentro deste objetivo investigamos a presença do hormônio melatonina nos

invertebrados analisados, além dos eventuais padrões circadianos relacionados a sua

síntese.

2.2. Analisar a presença de enzimas da via de produção clássica de

melatonina

Verificamos a presença de enzimas responsáveis pela via clássica de produção

de melatonina (triptofano 5-hidroxilase, aril-alquil-N-acetiltransferase, hidroxindole-O-

metiltransferase), e sua eventual expressão circadiana. Também realizamos ensaios de

atividade enzimática para a triptofano 5-hidroxilase e aril-alquil-N-acetiltransferase.

2.3. Analisar a presença de genes relógio

Verificamos a presença de genes relógio (clock, bmal, cry1, cry 2, per1 e per2)

comumente descritos para invertebrados, mas ainda não analisados nas espécies de estudo.

2.4. Estudar o papel da melatonina na sincronização dos genes relógio

Diante dos dados da literatura sobre padrões de transcrição dos genes relógio em

Nematostella vectensis, e da facilidade de manter estes animais em cultura no

laboratório, realizamos experimentos para verificar a capacidade da melatonina de agir

sincronizando os genes relógio nas espécies deste estudo.

25

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material biológico

As espécies a serem estudadas foram selecionadas com base nos critérios de

disponibilidade, abundância, posição taxonômica, particularidades de sua biologia,

posicionamento filogenético de seu grande grupo, não haver confirmação da existência de

melatonina. Todas as espécies estudadas são marinhas, o que está relacionado à grande

diversidade de filos exclusivamente marinhos ou com a maioria das espécies neste

ambiente. As coletas foram realizadas no Centro de Biologia Marinha da Universidade de

São Paulo, localizado em São Sebastião. As espécies selecionadas foram as seguintes.

• Bolinopsis vitrea (Ctenophora, Lobata, Bolinopsidae) – espécie holoplanctônica,

filtradora de micro- e mesozooplâncton. O filo Ctenophora foi sugerido como

clado basal de Triploblastia (i.e., animais com três tecidos embrionários,

incluindo a mesoderme), embora sua posição, mesmo em relação aos Cnidaria,

seja ainda incerta.

• Olindias sambaquiensis (Cnidaria, Hydrozoa, Olindiasidae) – espécie

meroplanctônica com estágio de pólipo pouco desenvolvido, tem biologia

complexa, apresentando migração vertical, aparentemente circadiana. O filo

Cnidaria é um dos grupos mais basais de Metazoa, porem ainda com

posicionamento incerto, em especial em relação aos Ctenophora. Faz parte dos

Eumetazoa por apresentar gastrulação e tecidos verdadeiros.

26

• Lychnorhiza lucerna (Cnidaria, Scyphozoa, Lychnorhizidae) Espécie de biologia

complexa, tem estágio de pólipo com 4 tentáculos e estágio de medusa, o qual

foi usado neste estudo. As medusas podem alcançar 45 centímetros de diâmetro.

• Nematostella vectensis (Cnidaria, Anthozoa, Edwardsiidae) – espécie que

apresenta apenas pólipo bentônico e sedentário na maior parte do tempo,

movendo-se ocasionalmente. É um modelo para estudos de evolução e

desenvolvimento, facilmente mantido em aquário.

• Phragmatopoma lapidosa (Annelida, Polychaeta, Sabelariidae) – espécie

bentônica e tubícola que forma bancos na zona entremarés com larva trocófora.

Constitui um representante dos Annelida, incluídos no clado Lophotrochozoa,

um dos dois grandes grupos incluídos em Protostomia (em contraposição à

Ecdysozoa).

• Echinaster brasiliensis (Echinodermata, Asteroidea, Echinasteridae) espécie com

adulto bentônico e larva planctônica. Os Echinodermata constituem um dos

grupos incluídos em Deuterotosmia.

3.2 Coleta de material e experimentos in vivo

As coletas foram realizadas no Centro de Biologia Marinha da Universidade de

São Paulo, em São Sebastião (23º49’39.52’’S 45º26’26.15”O). As estrelas-do-mar

Echinaster brasiliensis foram coletadas por meio de mergulho livre. Espécimes das

medusas Olindias sambaquiensis e Lychnorhiza lucerna foram coletadas por meio de

arrasto de fundo. Espécimes do ctenóforo Bolinopsis vitrea foram coletados com uma rede

de plâncton em arrastos oblíquos desde o fundo até a superfície. O anelídeo

27

Phragmatopoma lapidosa foram coletados retirando-se uma parcela de seus tubos e bancos

do entremarés.

Após a coleta, os animais foram transferidos para aquários com água marinha

captada diretamente do canal de São Sebastião, sendo uma espécie por aquário. Os

experimentos foram iniciados às 17 horas, com pontos de coleta de tecido de 3 em 3 horas.

Em cada ponto eram usados entre quatro e seis animais de cada espécie por experimento

(exata quantidade em cada experimento está contida nos gráficos nos resultados). Das

medusas Olindias sambaquiensis e Lychnorhiza lucerna foram retirados pedaços do bordo

da umbrela, por conterem mais tecido e menos água. Da estrela-do-mar foi cortado um

braço e retirados pedaços do ceco gonadal. Para o ctenóforo Bolinopsis vitrea, dada as

pequenas dimensões dos animais coletados, os espécimes foram seccionados finamente e

separamos frações para cada um dos experimentos. Para Phragmatopoma lapidosa, os

indivíduos foram retirados de seus tubos com a ajuda de uma pinça e separados para os

experimentos subsequentes. Para este espécie, usamos indivíduos inteiros nas dosagens,

sendo selecionados apenas indivíduos que ainda estivessem vivos (se movendo

ativamente) e com tamanho entre 1 e 1,5 centímetro. Em todas as espécies, as amostras

eram guardadas em tubos de criogenia e congelados em nitrogênio líquido. Os aquários

foram mantidos em uma sala com janelas amplas, e a iluminação desta foi mantida apenas

com luz solar. Os momentos de nascer e pôr do Sol foram devidamente anotados em cada

experimento. Para experimentos com animais em livre curso, estes eram mantidos em

escuro constante por 24 horas antes dos sacrifícios.

Os exemplares de Nematostella vectensis foram tomados de culturas no laboratório

de Mark Martindale (Universidade do Havaí), onde os experimentos foram realizados. Eles

foram mantidos em um regime de luz 12:12, ligando as luzes às 7 horas, com iluminação

28

por lâmpadas fluorescentes de espectro completo, com intensidade luminosa de

aproximadamente 3600 lux. Os animais eram mantidos em recipientes de vidro com 1/3 de

água salgada em uma incubadora à 17 °C. A água era trocada todos os dias e os animais

eram alimentados com larvas de artêmias frescas a cada dois dias. Para os experimentos, os

animais eram sacrificados a cada 4 horas, durante 24 horas. Os animais inteiros eram

macerados e porções eram separadas para cada experimento. Para cada ponto, em cada

bloco experimental, foram usados 5 animais. Um segundo grupo de indivíduos foi mantido

em escuro constante por 20 dias sob as mesmas condições. Para um segundo experimento,

mantivemos animais em escuro constante por 24h, 48h e 96h após a estada em regime de

claro-escuro, com as mesmas condições.

Para os tratamentos de melatonina em Nematostella, animais previamente mantidos

em escuro constante por 5 dias receberam melatonina (Sigma Chemical Co., St. Louis,

MO, USA) nos 15 dias subsequentes de escuro constante. Melatonina foi administrada

na concentração de 1 µM, no momento da transição subjetiva para a noite (ZT = 12).

Após 12 horas de incubação, os animais eram “lavados” em uma primeira cuba com

água salgada e depois passados para novas cubas.

Para os experimentos de avaliação comportamental, realizado com Bolinopsis

vitrea, Olindias sambaquiensis e Echinaster brasiliensis, os exemplares eram mantidos

em aquários isolados, e após 24 horas de aclimatação, recebiam uma adição de

melatonina na água (1 µM) às 15 horas. Sua atividade foi monitorada pelas 24 horas

seguintes, comparando com exemplares sem adição de melatonina porém com as

mesmas condições ambientais.

29

3.3 Aferição da presença de melatonina por HPLC

Para este experimento, os animais selecionados foram sacrificados em oito pontos

igualmente distribuídos ao longo do dia (sacrifícios de 3 em 3 horas). Um pedaço de tecido

foi retirado e a melatonina dosada por cromatografia líquida de alta precisão acoplada a um

detector eletroquímico.

O sistema cromatográfico é composto por bomba Dionex Ultimate 3000RS

operada isocraticamente, coluna Acclain C18 (partícula esférica de 2,2 µm, 2,1 x100 mm) e

detector eletroquímico ESA Coulochem III operado em modo DC e controlado por um

programa computacional através de interface (Chromeleon) programável.

Os tecidos foram sonicados (Microson XL 2005, Heat System Inc., Farmingdale,

N.Y., USA), individualmente, com 120 µl de ácido perclórico 0,1 M acrescido de 0,02% de

EDTA e 0,02% de metabissulfito de sódio, por 10 segundos, sendo posteriormente

centrifugados por 2 minutos a 12000 rpm, a 5° C (Eppendorf 5804R Centrifuge, Brinkman

Instruments Inc., Westburg, N.Y., USA).

O sistema cromatográfico foi operado isocraticamente com fluxo de 120 µl/min e

potencial de oxidação de +700 mV e célula guarda em +750 mv, usando-se, como fase

móvel, uma solução contendo tampão acetato de sódio 0,1M, ácido cítrico 0,1M, EDTA

0,15mM e metanol 32%. O sistema de cromatografia foi operado no modo isocrático, com

sensibilidade de 10 nanoamperes.

O estoque dos padrões de melatonina (1 mM) foi preparado em uma solução de

HCL 0,1M acrescido de EDTA 0,02% e metabissulfito de sódio 0,02%, em alíquotas em

tubos de microcentrífuga e mantidos em congelador a –85 º C. A alíquota foi diluída em

30

uma solução de perclórico 0,1M, EDTA 0,02% e metabissulfito de sódio 0,02%, para

obtenção das concentrações necessárias à análise.

Curvas de calibração com 5 concentrações diferentes e conhecidas (0,435 a 6,96

ng/20ul) foram utilizadas para a quantificação da melatonina presente nas amostras. As

curvas de calibração foram obtidas através do programa Chromeleon v6.8 pela relação das

concentrações de cada padrão com as áreas dos picos correspondentes dos cromatogramas.

A identificação da melatonina das amostras se deu pela comparação do seu tempo de

retenção com aqueles dos padrões conhecidos.

3.4 Aferição da presença de melatonina por Elisa (Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay)

Para as amostras de Nematostella vectensis, os níveis de melatonina foram

medidos usando-se de um kit Elisa (IBL International, Hamburg, Germany). O ensaio é

baseado no princípio de competição. Tecidos de N. vectensis tiveram a melatonina

extraída em 0,6ml de ácido perclórico 0,6%. Para normalizar os ensaios, 2 µl de cada

amostra foram usados para medição de proteína total, usando um espectrofotômetro

(NanoDrop 1000, Thermo Scientific) e medindo a absorbância da luz à 280 nm. As

amostras foram à seguir passadas através de uma coluna de purificação de carbono 18,

extraídas com metanol, evaporadas e reconstituídas com água. Cada amostra foi

adicionada à um poço da placa que continha o anticorpo para melatonina. Uma

quantidade desconhecida do antígeno (melatonina) presente na amostra e uma

concentração conhecida de antígeno marcado competiam pelos sítios dos anticorpos nos

poços. Após uma incubação de duas horas, os poços eram lavados para parar a reação.

31

O substrato da reação era adicionado e a concentração de antígeno medida como a

proporção inversa da densidade ótica medida no fotômetro. Padrões de melatonina de

concentração conhecida foram usados para construir uma curva de calibração com a

qual foi calculada a quantidade do hormônio presente nas amostras. A sensibilidade do

ensaio era ao redor de 3 pg/ml. A especificidade do kit é próxima à 100% (manual do

kit). Um teste adicionando concentrações conhecidas de melatonina à amostras de N.

vectensis nos mostrou que a taxa de recuperação era de aproximadamente 85%.

3.5 Extração de DNA dos tecidos das espécies

Para a extração do DNA total dos tecidos, foi utilizado o reagente Trizol

(Invitrogen, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. Inicialmente, o

tecido foi disperso com um homogeneizador até completa solubilização. Em seguida a

mistura foi incubada por 5 minutos à temperatura ambiente, acrescida de 0,2 ml de

clorofórmio (LABSYNTH, São Paulo, Brasil) por ml de Trizol para desproteinização.

A fase intermediária foi separada por centrifugação (12.000 rpm, 15 min, 4o C, -

centrifuga Eppendorf 5804R Centrifuge, Hamburg, Germany) e o DNA contido foi

precipitado com álcool etílico (LABSYNTH, São Paulo, Brasil), centrifugado (2000g, 5

min, 4o C), lavado com citrato de sódio, lavado novamente com etanol 75% e dissolvido

com hidróxido de sódio 8 mM. O DNA obtido foi quantificado por espectrofotometria

(Nanodrop 2000c Thermoscientific Instruments Inc/USA) nos comprimentos de onda

de 260 e 280 nm.

32

3.6 Extração de RNA dos tecidos das espécies (Bolinopsis vitrea, Olindias

sambaquiensis, Nematostella vectensis e Phragmatopoma lapidosa)

Para a extração do RNA total dos tecidos, foram usadas duas técnicas

diferentes. Para as espécies Bolinopsis vitrea, Olindias sambaquiensis, Nematostella

vectensis e Phragmatopoma lapidosa, utilizamos o reagente Trizol (Invitrogen, EUA),

de acordo com as recomendações do fabricante. Inicialmente, o tecido foi disperso com

um homogeneizador Polytron PTMR2100 (Kinematica AG, Switzerland) até a completa

solubilização. Em seguida a mistura foi incubada por 10 minutos à temperatura

ambiente, acrescida de 0,2 ml de clorofórmio (LABSYNTH, São Paulo, Brasil) para

desproteinização. O sobrenadante foi separado por centrifugação (12.000 rpm, 15

minutos, 4 oC, - centrifuga Eppendorf 5804R Centrifuge, Hamburg, Germany) e o RNA

contido na fase aquosa foi precipitado com isopropanol (LABSYNTH, São Paulo,

Brasil), centrifugado (12000 rpm 25 minutos, 4 oC), lavado com etanol 75%

(LABSYNTH, São Paulo, Brasil) e dissolvido com H2O desionizada previamente

tratada com DEPC (dietilpirocarbonato). O RNA obtido foi quantificado por

espectrofotometria (Nanodrop 2000c Thermoscientific Instruments Inc/USA) nos

comprimentos de onda de 260 e 280 nm. Após quantificação, as amostras foram

submetidas à eletroforese em gel de agarose desnaturante a 1,4%, para análise da

integridade do RNA. Somente os RNAs íntegros foram utilizados nos experimentos

subsequentes.

33

3.7 Extração de RNA dos tecidos de Echinaster brasiliensis

Para as amostras de Echinaster brasiliensis, utilizamos um kit específico para

extração de RNA (RNAqueous 4PCR – Ambion, Texas, EUA), segundo as instruções

do fabricante. Resumidamente, o tecido foi disperso na solução de lise com a ajuda de

um homogeneizador, acrescentou-se igual volume de uma solução de etanol 64%,

passou-se a amostra por uma coluna de separação, lavou-se com uma sequência de

tampões e finalmente eluiu-se o RNA com uma solução específica também contida no

kit. A quantificação e a qualificação do RNA foi feita da mesma maneira que com as

amostras das outras espécies.

3.8 Obtenção de cDNA

Uma amostra de 5 µg de cada RNA (2 ug no caso das amostras que possuíam

menor concentração de RNA) foi submetida à reação de transcrição reversa com

‘primers’ aleatórios. Para tal foi adicionado a cada amostra tampão da enzima (50 mM

de Tris-HCl pH 8,3, 75 mM de KCl, 3 mM de MgCl2), DTT (10 mM), mistura de

dNTPs (0,5mM cada), ‘primers’ aleatórios (150ng), inibidor de RNAse (40U) e a

enzima SuperScript III (200U; Invitrogen, EUA), em volume final de 20ul. As reações

foram incubadas no termociclador MyGene™ Series Gradient (LongGene®, China) por

5 minutos à 70 oC, seguida de 10 minutos à 25 oC, com aquecimento para 42 ºC por 75

minutos e 70 ºC por 15 minutos para desnaturação da enzima. As amostras de cDNA

foram armazenadas à -20 ºC. Antes das reações de PCR, as amostras foram

requantificadas por espectrofotometria (Nanodrop 2000c Thermoscientific Instruments

34

Inc/USA) nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm e diluídas para uma

concentração de 300 ng/µl de DNA.

3.9 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para identificação de isoformas

dos genes

A partir dos DNAs obtidos foram realizadas as reações em cadeia da

polimerase para amplificação de cada gene. Os ensaios de PCR foram realizados no

termociclador MyGene™ Series Gradient (LongGene®, China) usando GoTaq® DNA

Polymerase (Promega, USA) e 10 pmol de cada primer em 100 µL de master mix. As

reações de PCR foram feitas em duplicata. Para comparar os fragmentos, as reações

foram acompanhadas de controles positivos (cDNA obtido da glândula pineal de ratos)

para comparar o tamanho dos amplificados. O cDNA que foi utilizado faz parte de um

conjunto de amostras de cDNA já existente no laboratório, que foi obtida durante o

projeto “O papel da melatonina no controle do metabolismo energético: interações

hormonais, ações centrais e periféricas: (papel, obesidade, diabetes e envelhecimento)”,

certificado 79/04/CEEA, datado de 16.12.04. O controle negativo foi feito com água ao

invés de material genético.

3.10 Seqüenciamento dos fragmentos amplificados

Os produtos de PCR dos genes de interesse foram separados em gel de agarose

2%. A purificação foi feita a partir das bandas de gel que continham os amplificados e

35

que foram depositadas na parte superior de uma ponteira de 200 µl com filtro. A

ponteira foi colocada no interior de um tubo de 1,5 ml e os tubos foram então

centrifugados a 6000 rpm por 6 minutos (centrífuga Eppendorf 5417R Centrifuge,

Hamburg, Germany). O purificado ficava depositado no tubo. O DNA purificado foi

submetido à marcação fluorescente por PCR, em reações independentes para as fitas

‘forward’ e ‘reverse’, utilizando o reagente Big Dye® Terminator v3.1 (Applied

Biosystems). Após precipitação, os produtos dessas reações foram enviados ao Serviço

de Sequenciamento do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP,

onde ambas fitas de DNA de cada amostra foram sequenciadas utilizando um

equipamento ABI PRISM® 3100 (Hitachi). As sequências foram alinhadas e usadas

para construir o amplificado utilizando o programa ChromasPro (Technelysium Pty,

USA).

3.11 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Real Time para identificação

de padrões de expressão gênica

A análise semi-quantitativa da expressão gênica foi realizada através da técnica

de PCR em tempo real utilizando o aparelho 7500 Real-Time PCR System® (Applied

Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA). Os ensaios foram realizados em duplicata

utilizando 2 µL de cDNA (600 ng) previamente sintetizado, adicionado à mistura da

reação contendo 12,5 µL de Power SYBR® Green (Applied Biosystems, Foster City,

California, EUA), 8,5 µL de água MilliQ e 400 nM dos primers específicos para cada

gene.

Os parâmetros de amplificação foram os seguintes: 1) etapa inicial de ativação

da enzima a 50 °C por 1 minuto e 95 °C por 10 minutos, 2) 40 ciclos que incluíram a

36

desnaturação a 95 °C por 15 segundos; o anelamento dos ‘primers’ em temperatura

específica para cada ‘primer’ por 30 segundos e a extensão a 72 °C por 30 segundos 3)

1 ciclo para análise do ‘melting’ que consistiu em 95 °C por 15 segundos; 60 °C por 1

minuto e posterior aumento gradativo da temperatura para 95 °C para obtenção das

curvas de ‘melting’.

O limiar para desconsideração do ruído na fluorescência de cada amostra foi

determinado automaticamente pelo software 7500 versão 2.0.3 (Applied Biosystems,

Foster City, Califórnia, EUA), que também determinou as curvas de ‘melting’. As

amostras foram comparadas a partir dos valores de delta CT.

Os primers para as reações de real time foram desenhados para cada uma das

espécies, a partir dos sequenciamentos obtidos. Foram eles:

Para Olindias sambaquiensis: :

• RPL37a fwd: CCA GCG ACC ATG AAA GCA TT

• RPL37a reverse: CCT AAC CTG CCT TCC AAA CTT G

• TPH fwd: CGTCTCCTCTGAAGCTCCAATG

• TPH reverse: CAGACACCTGCCACGAACTCT

• Cry1 fwd: CAG CAA ACT AAC CCA CTA AAG CAA

• Cry1 reverse: TGC GTC CCT TCC TGA CTT G

• Cry 2 fwd:GCT ACT GAG GAT CTT TTG GAC ATG T

• Cry2 reverse: ATC TGT GTG TAG AAT GAA CGG TTC TT

• Bmal fwd:CATACGGTGCAAGTATACAAGACACC

• Bmal reverse: GCTTCCCAAGAGGCTCATGAT

• Clock fwd:TCCATTTTTCTCAAGAGGGTAGCC

• Clock reverse: ACGCTAACAACCAACATCTTGGC

• Per 2 fwd:CCTCCACCCTTGACCACTGT

• Per 2 reverse: CTGGCTTCGTTACTTTATGAAAGGT

37

Para Echinaster brasilienses

• RPL37a fwd:TGCTGCCGGCACTATGG

• RPL37a reverse: ATGTATCTAACCAATCGGCTTGTG

• TPH fwd:GTTAGCCTTTCGTTGGAGACGG

• TPH reverse: GCTACTTCACAACCAGTTCCACC

• AANAT fwd:TCGATGAACGTGACTGGCTTT

• AANAT reverse: ATCGTTTGCCCTGGAAGGAT

• Cry1 fwd:ACCCACTAAAGCAAGGAAGAAGCT

• Cry 1 reverse: CTGTGCGTCCTCTTCCTGACT

• Cry 2 fwd:TGCCTAGTGCTGGAGGAAGGT

• Cry 2 reverse:TTAAAACCTTCTCCCTATTCTGACG

• Bmal fwd:TCTCCAGGAGGCAAGAAGATTC

• Bmal reverse: CCTGAGCTCTGCCCTGGTAGT

• Clock fwd:GTCTCCGTCTGTGCCTGCTG

• Clock reverse: GTCACCGCAGTCAATGCAGA

• Per 2A fwd:CAAGCCACTCAGTGCAATGG

• Per 2A reverse: TTCCCTGAACATTATCCCGTTAA

• Per 2B fwd:GACGTCTGGCCATGTTTAAGAAG

• Per 2B reverse: TGCTTTCCCCGAGACACTATG

Para Nematostella vectensis:

• Clock fwd:TCGGCTCCCCGAGTCTAGCG

• Clock reverse:GCATCGCGGCGAACCCAGTA

• Cycle fwd:TGTCTCGTGGCCGTCGGAAG

• Cycle reverse:GGCGACATCCGGTCGGGAAAA

• Timeout fwd:GTGCCTTCGCAGGTGGGACG

• Timeout reverse:GGCTTTCGTTGTCCGACTCGCT

• Cry1a fwd:GCGGCATGGCAAGACAGGCT

• Cry1a reverse:CACCCAATGGACTGCCGGGC

38

• Cry1b fwd:TCGGACCGGACCATGCTGACA-

• Cry1b reverse:TCGTCGCAAAGCTTCGGGCT

• Cry2 fwd:AGCTCGCCGTAAAAGGGCGG

• Cry2 reverse:ATATAAGCGCCTGCACCCGCG

• TPH fwd:AAAAACTCGCCACGCTCTACTGG

• TPH reverse:CGGTCAAGCAATACTGTAACTCCCC

• HIOMT fwd:CGAGATTTGATTGCGTTCACCG

• HIOMT reverse:AAAACAGCCAGTTCCTCCTCCAAG

• Proteína ribossomal P0 fwd:GGCTTCGTCTTCACCAAGGAGGAG-

• Proteína ribossomal P0 reverse:CCAGCAGGGACAAACACATCAATA

3.12 Análise Radiométrica da Atividade da Triptofano Hidroxilase (TPH)

O método baseia-se na quantificação do [3H]-5-hidroxitriptofano, que é o

produto da reação catalisada pela enzima Triptofano Hidroxilase (TPH) e que tem como

precursor o [3H] triptofano.

Cada amostra foi sonicada (Microson XL 2005, Heat System Inc.,

Farmingdale, NY, USA) em 0,2% de Triton X-100 em tampão fosfato de sódio (2 mM,

pH 7, 40 ). A cada amostra foram acrescentados: HEPES (0,5M, pH 7), catalase (1 mg/

ml), triptofano (2 mM), dietiltreitol (1 M), Fe(NH4)2 (SO4)2 (1 mM), 6-MPH4 (20 mM),

de modo a obter-se, respectivamente, as seguintes concentrações finais: 50 mM, 100

mg/ml, 50 µM, 5 mM, 10 µM, 500 µM; e 1 µl de [3H]triptofano (1 mCi/ml –

previamente seco com nitrogênio). O material foi incubado em banho úmido

(Microprocessed Controlled Water Baths, Polyscience, Niles, Illinois, USA) a 37 C por

10 minutos. Em seguida, foi acrescentada uma solução de carvão ativado (7,5% em 1 M

39

HCl, 500 µl) para interromper a reação. As amostras foram centrifugadas (Eppendorf

5804R Centrifuge, Hamburg, Germany) por 2 minutos a 6797 g (2 vezes). Em seguida,

200 µl do sobrenadante foram transferidos para tubos de cintilação, e foi acrescentado o

líquido de cintilação (Optiphase HiSafe 3, PerkinElmer, Inc, Massachusetts, USA) para

amostras aquosas para contagem da radioatividade em contador β (LS 6500 Liquid

Scintillation Counter, Beckman Coulter Inc., CA, USA).

3.13 Análise radiométrica da atividade da aril-alquil-N-acetiltransferase

(AANAT)

O método baseia-se na quantificação da N-[3H] acetiltriptamina que é o

produto da reação da [3H] acetil-coenzima A ([3H] acetil CoA) e da triptamina, como

uma indicação da atividade da enzima AANAT. O produto marcado é extraído em

clorofórmio e medida a radioatividade (53, 54). Para isso, foram adicionados aos tubos

de microcentrífuga contendo uma amostra, 25 µl de triptamina (40 mM), 25 µl de [3H]

acetilCoA (2 mM) e 50 µl de tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH= 6,8), a 4 ºC. As

amostras foram sonicadas, aplicando-se 1 pulso de 30 segundos , de modo a romper os

tecidos. As amostras foram incubadas, em banho seco a 37 ºC, por 20 minutos. Em

seguida, acrescentou-se 1 ml de clorofórmio saturado com água a cada uma das

amostras, e o produto foi extraído agitando-se os tubos durante 1 minuto. Para a

separação completa das fases aquosas e lipossolúveis as amostras foram centrifugadas

por 40 segundos , a 14000rpm.

A fase aquosa foi removida e acrescentados 200 µl do tampão. Novamente as

amostras foram agitadas, centrifugadas e as fases aquosas foram novamente removidas.

500 µl do clorofórmio contendo o produto da reação (3H-N-acetiltriptamina) foram

40

transferidos para os tubos de contagem e evaporados até que as amostras ficassem

completamente secas. O líquido de cintilação foi, então, acrescentado e a radioatividade

medida em contador beta.

3.14 Análise radiométrica da atividade da Hidroxindole-O-metiltransferase

(HIOMT)

Os substratos utilizados para a avaliação da atividade da enzima HIOMT foram

14[C]-S-adenosil-L-metionina e N-acetilserotonina. O produto (14[C] melatonina) foi

extraído em clorofórmio e medida a sua radioatividade (55).

As amostras foram sonicadas separadamente em tampão fosfato de sódio (0,05

M, pH=7,9, 50 μL) e, em seguida, acrescentados 150 µL de uma solução contendo 14C-

S-adenosil-L-metionina (atividade 43,8 mCi) e N-acetilserotonina (1 mM). As amostras

foram incubadas em banho seco por 30 minutos a 37 °C. Após 30 minutos as amostras

foram mantidas no gelo e acrescentados 200 µL de tampão borato de sódio (12,5 mM,

pH=10) e 1 mL de clorofórmio saturado em água, de modo a interromper a reação. Os

tubos foram agitados por 15 segundos e centrifugados a 13000 rpm (centrífuga

Eppendorf, Mod. 5804R) por 5 minutos a 4 °C. A fase aquosa foi aspirada e dispensada

e novamente acrescentados 200 µL de tampão borato de sódio. Os tubos foram agitados,

centrifugados e novamente retirada a fase aquosa. 600 µL do clorofórmio foram

transferidos para tubos de contagem e após a total evaporação do clorofórmio, foi

acrescentado o líquido de cintilação para amostras não-aquosas (Optiphase Hisafe-

PerkinElmer) e contada a radioatividade em contador β (Beckman – LS 6500),

incluindo os brancos e totais.

41

3.15 Análise de expressão global por experimento de Microarranjo

Para este experimento foram feitos 3 grupos experimentais. Um grupo de

animais adultos em regime claro-escuro (12:12); um segundo grupo de animais

mantidos em escuro constante durante 20 dias (previamente no regime de claro:escuro)

e finalmente um terceiro grupo que consistia em animais tratados com melatonina. Neste

grupo os animais eram previamente mantidos em escuro constante por 5 dias e a seguir

recebiam melatonina 0.1 µM no momento da transição subjetiva para a noite (ZT = 12).

Este tratamento foi feito durante os 15 dias subsequentes, mantendo os animais em

escuro constante. Ao final do protocolo destes três grupos, os animais foram

sacrificados em 2 pontos do dia (ZT6 e ZT18) e o RNA extraído como previamente

descrito. Foram utilizados 3 animais por tratamento, para cada tempo

experimental.

Para a realização dos experimentos de microarranjo, 10 µg de RNA total foram

utilizados para síntese de cDNA cadeia dupla usando um kit específico (Superscript III

double-stranded cDNA synthesis kit - Invitrogen, EUA). Seguiu-se o protocolo de

marcação de uma cor com 1 µg do cDNA previamente obtido (One color DNA labeling

kit - Nimblegen, Islândia). O DNA marcado foi hibridizado em um ‘array’ para o

genoma completo, desenvolvido para o laboratório pela empresa Roche Nimblegen

(Islândia). O ‘array’ foi lido com um scanner GenePix Personal 4100a por meio do

programa GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) e analisado com

o programa Nimblescan (Nimblegen). Os níveis de expressão gênica foram

normalizados no programa de acordo com referencias prévias (56, 57). A comparação

dos dados do microarranjo de quanto variava a expressão de cada gene dentro de cada

42

tratamento para os pontos temporais ZT6 e ZT18 considerou como válidas apenas as

alterações maiores que 10 vezes na expressão.

3.16 Análise Estatística

As análises estatísticas, escolhidas de acordo com o desenho experimental,

foram realizadas utilizando-se o programa computacional Prism v 5.01 (GraphPad

Software Inc., San Diego, CA, USA). Nos casos em que se fez necessário estudar a

ritmicidade diária dos parâmetros fisiológicos, isso era feito, em primeiro lugar, pela

aplicação da análise de variância à série temporal considerando como fator o horário do

dia. Se essa análise fosse significativa (p <0,5) aplicávamos, a seguir, para a análise dos

parâmetros rítmicos, o método do Cosinor. Esse método permite o ajuste de uma curva

cossenoidal aos dados utilizando o método dos quadrados mínimos e testa a presença ou

não de um ritmo verificando, estatisticamente, avaliando se a amplitude da curva

ajustada é diferente ou não de zero. Com a aplicação deste modelo é possível obter,

ainda, 3 parâmetros matemáticos da curva ajustada que caracterizam o ritmo estudado:

mesor (nível médio de oscilação), amplitude (distância entre o mesor e os pontos de

mínimo ou de máximo) e acrofase (instante em que ocorre a amplitude máxima). A

comparação desses parâmetros (feita com teste t ou análise de variância, conforme

requerido) entre os diferentes grupos experimentais permite detectar eventuais

diferenças na ritmicidade provocadas pelos tratamentos.

43

4 RESULTADOS

Os resultados serão apresentados por espécie. No Anexo 1 deste exemplar

encontra-se um quadro comparativo das espécies.

4.1 Bolinopsis vitrea

4.1.1 Dosagens de melatonina:

A melatonina pôde ser dosada em todos os pontos, apresentando picos no

cromatograma no mesmo tempo de retenção que os padrões de melatonina. Pelo fato de

termos utilizado frações dos animais, os dados foram normalizados pela quantificação

posterior da proteína total das amostras.

Como pode ser visto na Figura 1, a melatonina apresentou um padrão de

produção com diferença entre os pontos, com maior concentração no período entre o

fim da tarde e o começo da noite, mas com pontos diferentes um dos outros (Anova de

uma via, p< 0,05).

Figura 1 - Dosagem de melatonina nos diversos pontos do dia em Bolinopsis vitrea.

Cada ponto é uma média de cinco indivíduos. Sol nascendo as 6:15 da manhã e se pondo às

17:48 da tarde.

Bolinopsis vitrea

5 8 11 14 17 20 23 52

0

10

20

30

40

50

Horário

Mel

aton

ina

pg/m

gpr

oteí

na

44

Houve ritmo diário (24h) para a produção de melatonina (Figura 2, teste de

cosinor), com pico de produção às 18:05 da noite, ou seja, logo após o escurecer, e a

produção média foi de 27,2 picogramas de melatonina por miligrama de proteína total.

Figura 2 - Curva ajustada ao perfil diário de melatonina em Bolinopsis vitrea.

Gráfico obtido após aplicação do método do cosinor. A linha horizontal representa o mesor

(nível médio de produção do hormônio), e a vertical com seta, a acrofase (horário do pico de produção do hormônio) e a amplitude. Cada ponto do gráfico é uma média de cinco indivíduos.

4.1.2 Averiguação da presença dos genes da via de produção de melatonina e genes

relógio

A averiguação da presença de isoformas dos genes das enzimas da via de

produção de melatonina e genes relógio resultou na amplificação do gene constitutivo

RPL37a, das enzimas da via de produção de melatonina Triptofano Hidroxilase (TPH) e

Bolinopsis vitrea

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

10

20

30

40

50

Horário

Mel

aton

ina

pg/m

gpr

oteí

na

45

Aril-aquil-N-acetiltransferase (AANAT) e os genes relógio Cry1, Clock e Per1. Os seis

genes puderam ser sequenciados. Porém, o gene para a terceira enzima da via de

produção de melatonina, a Hidroxi-indol-oxi-metil-transferase, não apresentou uma

isoforma, mesmo variando a concentração do magnésio e com temperaturas ainda mais

baixas de ligação.

O gene do RPL37a apresentou 95% de bases em comum com o mesmo gene

descrito para Rattus norvegicus, porém com muitos gaps. Houve menor similaridade em

relação à Mus musculus, porém menos gaps, além de similaridades com outras espécies.

O gene para a Triptofano Hidroxilase apresentou similaridade com as

sequências descritas de Rattus morvergicus, Mus musculus, Sus scrofa, entre outras.

Como no caso de RPL37a, houve muitos gaps na sequência, similar ao observado para

Cry1.

A sequência para o gene da AANAT apresentou similaridades com mamíferos

(Rattus morvergicus, Mus musculus), peixes (Solea senegalensis) e, inclusive, uma

sequência não identificada de algas verdes Volvox carteri.

O caso do gene clock apresentou similaridade com genes diferentes do

esperado, como a NADH desidrogenase da bactéria Saccharopolyspora erythraea, o

receptor para fator de crescimento de fibroblastos de humanos, o gene para via de

biossíntese de canamicina na bactéria Streptomyces kanamyceticu, além de sequências

ainda não identificadas em diversas espécies. Situação similar ocorreu com o gene

Per2, com similaridade apenas com sequências ainda não identificadas de diversas

espécies.

Todos estes alinhamentos constam no anexo 2 deste exemplar.

46

4.1.3 Averiguação da atividade da enzima Triptofano hidroxilase

Houve atividade da Triptofano Hidroxilase em todas as amostras, concentrada

nos pontos entre 14h e 2h da manhã (Figura 3), o que coincide com a dosagem de

melatonina (coeficiente r de Pearson =0,8190; p <0,05). Os pontos foram

estatisticamente diferentes entre si (p < 0,01; Anova de uma via).

Figura 3- Atividade da enzima Triptofano hidroxilase em Bolinopsis vitrea.

Atividade TPH Bolinopsis vitrea

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

10

20

30

40

50

60

Horários

pico

mol

es/1

00m

g pr

otei

n/ho

ur

Cada ponto representa a média de três indivíduos.

4.1.4 Averiguação da atividade da enzima aril-aquil-N-acetiltransferase

Há atividade da AANAT com um ritmo correlacionado ao da produção da

melatonina (r de Pearson = 0,9489; p < 0,05), com pico no ponto das 20 horas (Figura

4). Há diferença entre os pontos ao longo do dia (p < 0,01; Anova de uma via).

47

Figura 4-Atividade da enzima AANAT nos exemplares de Bolinopsis vitrea.

Cada ponto representa a média de três indivíduos.

4.1.5 Experimentos com adição de melatonina aos aquários

Dos sete animais tratados com melatonina, cinco apresentaram atividade

intensificada entre 30 e 45 minutos após a adição do hormônio, nadando ativamente em

direção a superfície dos tanques, enquanto os animais não tratados (n= 5) permaneceram na

base de seus respectivos aquários.

Atividade AANAT Bolinopsis vitrea

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0102030405060708090

100

Horários

pico

mol

es/1

00m

g pr

otei

n/ho

ur

48

4.2 Lychnorhiza lucerna

4.2.1 Dosagens de melatonina

Os resultados do perfil de melatonina corrigido pela quantidade de proteína

(Figura 5) mostram um pico diurno de melatonina no ponto das 14 horas. Os pontos

eram estatisticamente diferentes entre si (p<0,05; teste Anova de uma via), mas o teste

cosinor não foi aplicável a estes dados.

Figura 5- Dosagem de melatonina em Lychnorhiza lucerna.

Cada ponto é uma média de seis indivíduos. Sol nascendo as 6:15 da manhã e se pondo às 5:48

da tarde.

Não foi possível extrair DNA ou RNA das amostras de Lychnorhiza lucerna e,

portanto, não há dados sobre a presença das enzimas da via de produção de melatonina

ou genes relógio. Como não conseguimos coletar espécimes de L. lucerna novamente,

não foi possível realizar experimentos de escuro constante ou de atividade enzimática.

Lychnorhiza lucerna

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

5

10

15

20

25

30

35

Horário da coleta

pg/m

g pr

oteí

na

49

4.3 Olindias sambaquiensis


Os cromatogramas de O. sambaquiensis apresentaram diversos picos, mas a

região próxima ao tempo de retenção do hormônio estava relativamente limpa e com

picos no mesmo tempo que o controle.

Os exemplares de Olindias sambaquiensis apresentaram um pico de produção de

melatonina no ponto das 23 horas, e concentrações mais reduzidas nos pontos do dia

(Figura 6). Os pontos eram estatisticamente diferentes entre si (p<0,05; Anova de uma

via), e a oscilação da produção do hormônio apresentou um ritmo de 24 horas (cosinor),

com pico de produção (acrofase) às 23 horas e 34 minutos (Figura 7).

Figura 6- Dosagem de melatonina em Olindias sambaquiensis.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

050

100150200250300350400450500550600650

Horários

Mel

aton

ina

pg/m

gpr

otei

na

Olindias sambaquiensis

Cada ponto é uma média de seis indivíduos. Sol nascendo as 6:15 da manhã e se pondo às 17:48 da tarde.

50

Figura 7- Curva ajustada do perfil de melatonina em O. sambaquiensis.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

050

100150200250300350400450500550600650

Horários

Mel

aton

in p

g/m

gpr

otei

n

Olindias sambaquiensis Cosinor

Curva obtida após aplicação do método do cosinor. Cada ponto do gráfico é uma média de seis indivíduos.

Os experimentos com os animais em livre curso resultam em uma curva

(Figura 8) que mostra um pico de produção próximo ao observado para os animais em

regime de luz convencional, porém com um valor máximo de produção aparentemente

reduzido. Os pontos eram estatisticamente diferentes entre si (p<0,05; Anova de uma

via), e a oscilação da produção do hormônio apresentou um ritmo de 24 horas (cosinor),

mesmo sem a presença da luz, confirmando que se trata da manifestação de um ritmo

endógeno (Figura 9). A análise das variáveis do cosinor demonstrou que, de fato, o nível

médio de produção do hormônio (mesor) está significantemente reduzido nos animais

mantidos em escuro constante, bem como a amplitude do pico. O horário do pico de

produção de melatonina também é estatisticamente diferente entre os grupos (teste T),

ainda que essa diferença seja pequena (Tabela 1).

51

Figura 8- Dosagem de melatonina em Olindias sambaquiensis.

Dosagem realizada com animais em regime de escuro constante. Cada ponto é uma média de seis indivíduos.

Figura 9- Curva ajustada do perfil diário de produção de melatonina em Olindias sambaquiensis.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0255075

100125150175200225250

Time points

Mel

aton

in p

g/m

gpr

otei

n

Olindias sambaquiensis Cosinor

Curva obtida com animais em regime de escuro constante, após aplicação do método do cosinor. Cada ponto do gráfico é uma média de 6 indivíduos.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

50

100

150

200

250

Horários

Mel

aton

in p

g/m

gpr

otei

n

Olindias sambaquiensis

52

Tabela 1- Parâmetros do teste cosinor com relação a quantidade de melatonina em Olindias sambaquiensis.

Parâmetro AcrofaseAcrofase MesorMesor AmplitudeAmplitudeRegime de luz LD DD LD DD LD DD

Melatonina 23,58±0,31 22,36±1,1* 342,93±25,3 73,08±17,1* 156,43±34,4 85,86±25,6*

A acrofase representa o horário de pico de produção do hormônio, o mesor a oscilação média e a amplitude a diferença entre o mesor e o ponto de máximo. “LD” = “claro e escuro” (ou seja, regime de luz convencional); “DD” = “escuro-escuro” (ou seja, regime de luz de escuro constante); * = estatisticamente diferente do LD com valor de p< 0.05 – teste t.


e genes relógio.

Obtivemos fragmentos para o gene constitutivo RPL37a, para a enzima da via

de produção de melatonina Triptofano Hidroxilase (TPH) e para os genes relógio Cry1,

Cry2, Per 1, Per 2 Clock e Bmal (ver Anexo 2 para alinhamentos afins).

A sequência do gene constitutivo RPL37a apresentou similaridade com diversas

sequências do GenBank, mas em todos os casos cobrindo poucas bases. Houve

similaridade alta com uma proteína hipotética descrita no fungo Fusarium fujikuroi e

com sequências de RNA mensageiro sem função conhecida do molusco Crepidula

fornicata, em duas regiões diferentes.

A sequência obtida para a Triptofano Hidroxilase apresentou similaridade com

outra TPH de Rattus norvegicus, mas com vários gaps. Também houve similaridade

com gaps em relação a sequências de outros mamíferos, como javali (Sus scrofa), sagui

(Callithrix jacchus) e Homo sapiens, aves (Taeniopygia guttata), anfíbios (Xenopus

tropicalis) e peixes (Takifugu rubripes). O mesmo foi observado para o gene Cry1.

53

O gene Cry2 apresentou similaridade com sequências ainda não descritas de

peixes (Danio rerio) e fungos (Trichophyton verrucosum, Penicillium marneffei).

A sequência de Bmal pareou com diversos pontos do genoma da bactéria

Salmonella enterica e suas “subespécies”. Também houve o pareamento com regiões de

Homo sapiens e Rattus norvegicus, ainda não identificadas. A única similaridade com

outra sequência de Bmal foi com o hamster sírio (Mesocricetus auratus). O mesmo

ocorreu para a isoforma encontrada para Clock, com similaridade para diversas

sequências sem função conhecida, de vários táxons como “répteis” (Anolis

carolinensis), artrópodes (Pediculus humanus), peixes (Danio rerio), entre outros.

A sequência de Per2 seguiu o padrão de Bmal e Clock, com similaridade com

sequências ainda não identificadas em táxons diversos, viz. insetos (Bombus insularis),

nemátode (Caenorhabditis remanei) e algas (Phaeodactylum tricornutum).


relógio.

Após a determinação das sequências das isoformas dos genes RPL37a, TPH,

Cry1, Cry2, Bmal, Clock e Per2 e desenho de seus ‘primers’ específicos, obtivemos os

resultados de ensaios de expressão gênica por PCR real time (Figura 10). O gene TPH

mostrou uma tendência a maior expressão no pontos do período noturno, especialmente

23 e 2h, coincidindo com o padrão observado na produção de melatonina.

54

Figura 10- Expressão de triptofano-hidroxilase (TPH) em Olindias sambaquiensis

Amostras da umbrela, curva normalizada pelo gene constitutivo RPL37a . Cada ponto representa a média de quatro amostras.

A isoforma do gene relógio Cry1 apresentou uma curva de expressão com

aumento pronunciado no início da noite, seguida por queda (Figura 11). Os pontos

foram diferentes entre si (p<0,01, Anova de uma via). Um padrão similar foi observado

para o gene Cry2, exceto pelo fato que o aumento na transcrição inicia-se no fim do

período claro e é sustentado por algumas horas (Figura 12). Igulamente, os pontos

foram diferentes entre si (p<0,05, Anova de uma via).

TPH

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Horários

2ˆ-DCt

55

Figura 11- Expressão do gene relógio Cry1 em Olindias sambaquiensis

Amostras da umbrela, curva normalizada pelo gene constitutivo RPL37a . Cada ponto

representa a média de quatro amostras. Figura 12- Expressão do gene relógio Cry2 em Olindias sambaquiensis

Cry2

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.000

0.025

0.050

0.075

Horários

2ˆ-DCt


A isoforma do gene Clock apresentou uma variação bem marcada ao longo do

dia, com expressão pronunciada nos pontos do período claro (Figura 13). O teste

Anova de uma via confirmou a variação na expressão, com valor de p menor que 0,01.

Cry1

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.0000

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

0.0005

0.0006

0.0007

Horários

2ˆ-DCt

56

Figura 13-Expressão do gene relógio Clock em Olindias sambaquiensis.

Amostras da umbrela, curva normalizada pelo gene constitutivo RPL37a . Cada ponto representa a média de quatro amostras. O gene Bmal mostrou expressão marcada no entardecer, com pico no ponto

das 17 horas (Figura 14) e variação entre as amostras (p< 0,05, Anova de uma via).

Figura 14- Expressão do gene relógio Bmal em Olindias sambaquiensis


Clock

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

Horários

2ˆ-DCt

Bmal

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0.007

Horários

2ˆ-DCt

57

A isoforma do gene Per2 tem tendência a maior expressão no fim do dia, por

volta das 17 horas (Figura 15), com variação na expressão (p< 0,01, Anova de uma via).

Figura 15- Expressão do gene relógio Per 2 em Olindias sambaquiensis



Houve atividade da Triptofano Hidroxilase em todas as amostras, concentrada

nos pontos entre 17h e 2h da manhã (Figura 16). Esse dado coincide com a dosagem de

melatonina (coeficiente r de Pearson=0,7990; p<0,05), e os pontos eram

estatisticamente diferentes entre si (p<0,01, Anova de uma via).

Per 2

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.00000.00010.00020.00030.00040.00050.00060.00070.00080.0009

Horários

2ˆ-D

Ct

58

Figura 16- Atividade da enzima Triptofano hidroxilase em Olindias sambaquiensis.

Amostras da umbrela. Cada ponto representa a média de quatro amostras.

4.3.5 Averiguação da atividade da enzima aril-aquil-N-acetiltransferase

O experimento mostrou a existência de atividade da AANAT com ritmo que

se correlaciona ao da produção da melatonina (coeficiente r de Pearson=0,9296;

p<0,05) (Figura 17), e diferença entre os pontos ao longo do dia (p<0,01, Anova de uma

via).

Figura 17- Atividade da aril-aquil-N-acetiltransferase em Olindias sabaquiensis

Amostras da umbrela . Cada ponto representa a média de quatro amostras.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

100

200

300

400

Horários

pico

mol

es/1

00m

g pr

otei

n/ho

ur

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

100

200

300

400

Horários

pico

mol

es/1

00m

g pr

otei

n/ho

ur

59


Todos os 15 exemplares tratados com melatonina apresentaram atividade

intensificada entre 15 e 30 minutos após a adição da solução à água, em comparação aos 12

animais não tratados. Enquanto os animais sem tratamento na água permaneceram com

uma movimentação restrita na base de seus respectivos aquários, os que receberam o indol

tiveram atividade motora intensificada, migrando para próximo da superfície da água.

60

4.4 Nematostella vectensis


Para as dosagens em Nematostella vectensis, homogenizamos os organismos

inteiros e procedemos à extração de melatonina. Os exemplares de Nematostella

vectensis apresentaram um pico de produção de melatonina no período claro (Figura 18,

em cinza), com os pontos estatisticamente diferentes entre si (P<0,05, Anova de uma

via), e indicação de oscilação da produção do hormônio em um ritmo de 24 horas (teste

cosinor), com pico de produção (acrofase) às 11 horas e 40 minutos (Figura 19).

Figura 18- Dosagem de melatonina em Nematostella vectensis.

Cada ponto é uma média de cinco indivíduos. “LD” mostra os dados dos animais mantidos em

regime de luz 12 horas de claro e 12 horas de escuro, e “DD”mostra os animais mantidos em

escuro constante durante 20 dias antes do experimento. Tempo dividido em ZTs.

0 4 8 12 16 20 24

2

3

4

5

6

7

8DDLD

**

*

Horários (ZT)

Mel

aton

ina

pg/m

g pr

oteí

na

61

Figura 19- Curva ajustada do perfil de melatonina em Nematostella vectensis

Curva obtida após aplicação do método do cosinor. Cada ponto do gráfico é uma média de cinco indivíduos.

A curva obtida para os experimentos de livre curso (Figura 18, em preto)

mostra um padrão de produção próximo ao observado para os animais em regime de luz

convencional, porém com redução na maior parte dos valores (teste Anova de duas

vias). Havia variação entre os pontos (P<0,05, Anova de uma via), mas a melatonina

não apresentava mais um ritmo circadiano (teste cosinor).


e genes relógio.

Na literatura já estavam descritas isoformas dos genes relógio para N.

vectensis (52). Diante disso, nossa busca se concentrou em torno das enzimas da via de

produção de melatonina. Usando a biblioteca de EST para Nematostella (Joint Genome

Institute Nematostella genome browser, http://genome.jgi-pdf.org/Nemve1),

0 4 8 12 16 20 24

3

4

5

6

7

Horários (ZT)

Mel

aton

ina

pg/m

g pr

otei

na

62

http://genome.jgi-pdf.org/Nemve1

http://genome.jgi-pdf.org/Nemve1

identificamos candidatos para a primeira e última enzima da via de produção de

melatonina - Triptofano Hidroxilase (TPH - número de acesso XM_001623795.1) e

hidroxindole-O-metiltransferase (HIOMT - número de acesso XM_001627179.1).

Ambos os genes apresentaram alta similaridade com sequências previamente descritas

em outras espécies.


relógio.

A expressão do gene TPH varia pouco nos exemplares de N. vectensis em

regime de claro-escuro, com aumento moderado antes da transição para o período

escuro (Figura 20a, em cinza), correlacionado com o padrão de melatonina. Os animais

em escuro constante, porém, mostraram um padrão diferente, com expressão maior nos

ZTs 12 e 16 (Figura 20a, em preto). Há diferença entre os regimes de luz em quatro

pontos (ZTs 0, 12, 16 e 20) (Anova de duas vias), com padrão de expressão

significantemente diferente (F=161,35, p value <0,001). A correlação positiva entre a

expressão de TPH e a quantidade de melatonina para animais em claro escuro

(r=0,8714, p value =0,0053, teste de correlação de Person) mas não para aqueles em

escuro constante (r value=0,2857, p value=0,2673).

A expressão do gene para a HIOMT aumenta no início do período claro e reduz

nos pontos do escuro (Figura 20b, em cinza). Este padrão se correlaciona com o padrão

observado de produção de melatonina se considerado um adiantamento de 3 horas

(correlação de Person r value=0.6963, p=0.042 ). Para os animais em escuro constante a

63

expressão do gene também é quase constante, com um pico no ZT 12 (Figure 20b, em

preto).

Figura 20- Expressão relativa de RNAm em Nematostella vectensis.

Curvas para a)Triptofano-hidroxilase (TPH) e b) hidroxindole-O-metiltransferase (HIOMT) em indivíduos de Nematostella vectenis mantidos em regime de claro-escuro -LD (12:12h) ou escuro constante - DD, normalizado pelo gene para a proteína ribossomal P0. Cada ponto representa cinco indivíduos. * estatisticamente de claro-escuro com p< 0,05.

0 4 8 12 16 20 24

0.0000

0.0025

0.0050

0.0075

0.0100

0.0125

0.0150

0.0175

DDLD

** * *

Horários (ZT)

2^dC

T

0 4 8 12 16 20 24

0.00000.00250.00500.00750.01000.01250.01500.01750.0200

LDDD

*

*

Horários (ZT)

2^dC

T

a)

b)

64

Para os genes relógio, a expressão de NvClock mostra-se aumentada nos pontos

correspondentes ao dia, ritmo este perdido nos animais em escuro constante, e o

tratamento de melatonina não foi capaz de reverter este quadro (Figura 21a). Os pontos

eram estatisticamente diferentes entre si apenas nos animais em claro escuro (p=0,0046,

Anova de uma via; cosinor igualmente válido para os mesmos animais, Figura 22a).

O gene NvCycle não teve seu ritmo substancialmente alterado pela mudança no

regime de luz ou pelo tratamento com melatonina (Figura 21b). Os pontos foram

diferentes entre si em todos os tratamentos (p<0.0001 para claro-escuro; p=0.0003 para

escuro constante, p=0.0021 para tratados com melatonina; Anova de uma via) e houve

ritmo circadiano mantido (cosinor; Figura 22b).

Os genes da alça negativa foram mais afetados pelo regime de escuro

constante. Para NvTimeout (Figura 21c), NvCry1a (Figura 21d), NvCry1b (Figura 21 e),

NvCry2 (Figura 21f) tiveram pontos estatisticamente diferentes entre si (p<0,05, Anova

de uma via) para os animais em regime de claro escuro e para aqueles em escuro

constante com tratamento de melatonina, mas não para os em escuro constante sem

tratamento. O escuro constante aboliu o ritmo circadiano de transcrição destes genes

para os animais em regime de claro escuro, mas o tratamento com melatonina foi capaz

de restabelece-lo para os animais em escuro constante com tratamento de melatonina

(cosinor; Figura 22 c-f).

65

Figura 21- Expressão de Clock Genes em Nematostella vectensis

Expressão relativa do RNA mensageiro para (a) Clock, (b) Cycle, (c) Timeout, (d) Cry1a, (e) Cry1b e (f) Cry2 em indivíduos de Nematostella vectenis mantidos em regime de claro-escuro-LD (12:12h), escuro constante-DD ou escuro constante com suplementação de melatonina (1µM), normalizado pelo gene para a proteína ribossômica P0. Cada ponto representa cinco indivíduos. * p< 0,05.

66

Figura 22- Expressão de Clock Genes em Nematostella vectensis

Curvas cosinor da expressão relativa do RNA mensageiro para (a) Clock, (b) Cycle, (c) Timeout, (d) Cry1a, (e) Cry1b e (f) Cry2 em indivíduos de Nematostella vectenis mantidos em regime de claro-escuro-LD (12:12h), escuro constante-DD ou escuro constante com suplementação de melatonina (1µM), normalizado pelo gene para a proteína ribossômica P0. Cada ponto representa cinco indivíduos.

67

4.4.4 Averiguação da atividade das enzimas Triptofano hidroxilase e Hidroxindole-O-

metiltransferase

A validação das medições de melatonina em Nematostella vectensis com

ensaios de atividade para as enzimas Triptofano Hidroxilase e Hidroxindole-O-

metiltransferase demonstraram atividades das enzimas para as amostras dos ZTs 8 e 20.

Valores maiores de atividade foram observados no ZT8, o mesmo ponto do pico de

produção de melatonina. A atividade da Triptofano Hidroxilase foi de 78,935±7.32

picomoles/200mg de proteína por hora no ZT8 e 58,964±4,73 picomoles/200mg de

proteína por hora no ZT20 (média de 5 amostras para ambos os ensaios). A

Hidroxindole-O-metiltransferase teve atividade medida de 91,705±0,795 picomoles/

200mg de proteína por hora no ZT8 e 43,505±0,987 picomoles/200mg de proteína por

hora no ZT20 (média de 4 amostras para ambos os ensaios).

4.4.5 Análise da expressão gênica global por microarranjo

A comparação dos dados do microarranjo de quanto variava a expressão de

cada gene dentro de cada tratamento para os pontos temporais ZT6 e ZT18 considerou

como válidas apenas as alterações maiores que 10 vezes na expressão. Considerando

24020 pontos do microarranjo, 287 genes apresentaram uma alteração na expressão de

ao menos 10 vezes na comparação do ZT18 ao ZT6 para os animais em claro-escuro;

nos animais em escuro constante foram 582 genes; e nos animais em escuro constante

com suplementação de melatonina foram 3619 genes. Tais análises foram baseadas em

3 diferentes lâminas de ‘ array’ para cada tratamento para cada ponto temporal. Todas

68

possíveis combinações entre os regimes de claro-escuro, escuro constante e escuro

constante com melatonina foram realizadas na busca dos genes que variavam nos

animais (Figura 23), e genes foram identificados por Blast da sequência de cada gene

(anexo 3).

Na análise quantitativa, 35 dos 24020 genes sempre variam entre os dois pontos

analisados, independente do tratamento. A identificação destes 35 genes demonstrou

genes fundamentais ao funcionamento normal das células, tais como o genes para uma

proteína constituinte do ribossomo 60s, para uma subunidade de uma ATPase, para

proteínas extracelulares de membrana, entre outras.

Dos 287 genes que oscilam em claro-escuro, 184 perdem esta variação quando

os animais são mantidos em escuro constante, mas a recuperam se melatonina é

adicionada à água dos animais. Neste grupo foram identificados genes cujas proteínas

atuam na manutenção da fisiologia normal da célula, tais como Histona H2B, proteína

p62 do aparato mitótico e proteína 5 de morte celular programada. Mas também

aparecem genes para proteínas que agem como enzimas, modulando diversos eventos

na resposta celular e, desta maneira, na fisiologia do animal como um todo. Dentre elas

destacamos: Proteína 14-3-3; Sub-unidade reguladora da proteína fosfatase 1; Proteína

da família da O-metiltransferase; Proteína chaperonina (heat shock) 10; Proteína

supressora 1 do fator de sinalização RAS. Ainda entre os genes que apresentaram

variação em regime claro-escuro e escuro constante com adição de melatonina,

encontravam-se também alguns para componentes da cadeia de respiração celular, como

Succinato desidrogenase; Glutationa transferase; NADH desidrogenase; Citocromo C

oxidase.

69

57 genes somente variam quando da presença da oscilação claro-escuro,

perdendo tal ritmo em escuro constante, e não o recuperando com a suplementação com

melatonina. Dentre estes destacam-se genes para enzimas envolvidas em sinalização

celular, como proteínas similar à Ras e à enzima N-acetiltransferase 5, e componentes

para ciclo celular, tais como proteína especificadora da morte celular 2 e ciclina B3.

Dos 287 genes que variam quando os animais estão em claro-escuro, 12 mantêm

tal oscilação se os animais são passados para o regime de escuro constante, mas o

tratamento com melatonina abole esta variação na expressão. Dentre estes estão genes

para a proteína cálcio-calmodulina dependente de cinase IV e o precursor da Ficolina 2.

Figura 23- Dados oriundos do experimento de Microarranjo

Conjunto de genes que variaram ao menos 10 vezes ao longo dos dois pontos analisados no experimento de microarranjo, nos animais em claro-escuro, escuro constante ou escuro constante com suplementação de melatonina (0.1 µM).

70

4.5 Phragmatopoma lapidosa

4.5.1 Averiguação da presença de melatonina

A dosagem de melatonina mostrou a presença do hormônio em todos os pontos

do dia analisados, com um pico de produção no início da manhã, no ponto das oito

horas (Figura 24). Os pontos eram estatisticamente diferentes entre si (p<0,001, Anova

de uma via) e esta variação entre os pontos obedecia um ritmo de 24 horas (cosinor,

Figura 25).

Figura 24- Dosagem de melatonina em Phragmatopoma lapidosa.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

25

50

75

100

125

150

Horários

Mel

aton

ina

ng/m

g de

pro

teín

a

Cada ponto é uma média de seis indivíduos. Sol nascendo as 6:15 da manhã e se pondo às 17:48 da tarde.

71

Figura 25- Curva ajustada de melatonina em Phragmatopoma lapidosa

5 8 11 14 17 20 23 2 5

25

35

45

55

65

75

85

95

Horários

Mel

aton

ina

ng/m

g pr

oteí

na

Curva obtida após aplicação do método do cosinor. Cada ponto do gráfico é uma média de seis indivíduos. Sol nascendo as 6:15 da manhã e se pondo às 17:48 da tarde.

Experimentos com animais em livre curso mostraram a presença de melatonina

em todos os pontos de sacrifício, mas com um pico aparente no ponto das 11 horas da

manhã e baixas concentrações à partir das 17 horas (Figura 26). Novamente os pontos

eram estatisticamente diferentes entre si (p<0,005, Anova de uma via) e seguiam a um

ritmo de 24 horas (cosinor, p<0,005), e ficou evidente a diferença de horário do pico de

produção de melatonina, que ficou em 10 horas e 22 minutos (Figura 27). Contudo, a

curva dos animais em escuro constante foi similar a dos animais em regime de

iluminação natural, indicando que a melatonina seria mesmo a manifestação do relógio

endógeno.

72

Figura 26- Dosagem de melatonina em Phragmatopoma lapidosa

Cada ponto é uma média de seis indivíduos. Animais em livre curso (escuro constante).

Figura 27- Curva ajustada de melatonina em Phragmatopoma lapidosa

Animais em regime de escuro constante, após aplicação do método do cosinor. Cada ponto do gráfico é uma média de seis indivíduos.

Houve uma diferença estatística entre os momentos de pico de produção de

melatonina em relação aos animais em regime normal de luz e escuro constante

(cosinor, Tabela 2). O valor médio de produção de melatonina (mesor) e a amplitude de

produção também foram significantemente menores nos animais sobre escuro constante.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

10

20

30

40

50

Horários

Mel

aton

ina

ng/

mg

prot

eína

5 8 11 14 17 20 23 2 5

10

15

20

25

30

35

Horários

Mel

aton

ina

(ng/

mg

prot

eína

73

Tabela 2- Parâmetros do teste cosinor com relação a quantidade de melatonina em Phragmatopoma lapidosa.

Parâmetro AcrofaseAcrofase MesorMesor AmplitudeAmplitudeRegime de luz LD DD LD DD LD DD

Melatonina 7,26±1,0 10,2±1,01* 59,7±6,02 23,3±2,18* 31,3±8,9 11,5±3,12*

A acrofase representa o horário de pico de produção do hormônio, o mesor a oscilação média e a amplitude a diferença entre o mesor e o ponto de máximo. “LD” significa “claro e escuro”, ou seja, regime de luz convencional, e “DD” significa “escuro-escuro”, ou seja, regime de luz de escuro constante. *estatisticamente diferente do LD com valor de p< 0.01 – teste t.


melatonina e genes relógio.

Foram obtidas sequências para o gene constitutivo RPL37a, para a enzima da

via de produção de melatonina Triptofano Hidroxilase e para os genes relógio Clock,

Bmal, Cry1 e Per1 (Anexo 2)

A isoforma do gene RPL37a apresentou no blast similaridade com sequências

ainda sem produto conhecido de insetos (Exoneura robust), bactérias (Clostridium

phytofermentans, Alkaliphilus metalliredigens), protistas (Schistosoma mansoni) e

mamíferos (Mus musculus, Mustela putorius), entre outras espécies. Houve similaridade

com apenas uma sequência descrita para RPL37a, a de cavalos (Equus caballus).

A isoforma do gene para a Triptofano Hidroxilase apresentou alta similaridade,

com alguns gaps, com a mesma sequência em ratos (Rattus norvegicus), hamsters

(Mesocricetus auratus) e outros vertebrados, além de vermes (Caenorhabditis elegans).

A sequência obtida para o gene Bmal apresentou similaridade apenas com

sequências ainda sem função definida, de diversas espécies. O mesmo foi observado pra

Cry1 e Per1.

74

A isoforma obtida para o gene Clock apresentou alta similaridade com a

sequência descrita em ratos, mas com alta porcentagem de gaps, o mesmo tendo

acontecido para a sequência descrita em camundongos e em outros vertebrados.



Houve atividade da Triptofano Hidroxilase apenas nos pontos da noite e das

17h (bastante reduzido neste), sendo o pico de atividade no ponto das 2 horas da manhã

(Figura 28). Este padrão difere do observado para a dosagem de melatonina. Os pontos

eram estatisticamente diferentes entre si (p<0,005, Anova de uma via).

Figura 28- Atividade da Triptofano hidroxilase em Phragmatopoma lapidosa

Cada ponto representa a média de cinco indivíduos.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

100

200

300

400

500

Horários

Picomoles/animal/

hora

75

4.5.4 Averiguação da atividade da enzima Aril-aquil-N-acetiltransferase

Embora não tenhamos conseguido sequenciar uma isoforma para a Aril-aquil-

N-acetiltransferase, verificamos a havia atividade desta enzima, a qual esteve ativa em

todos os pontos amostrados, com pico aparente na amostra das 23h (Figura 29). Os

pontos eram estatisticamente diferentes entre si (p<0,005, Anova de uma via).

Novamente, o padrão da atividade discerniu do observado para a produção de

melatonina.

Figura 29- Atividade da enzima AANAT em Phragmatopoma lapidosa.

Cada ponto representa a média de 3 amostras.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

20

40

60

80

100

Horários

Picomoles/animal/

hora

76

4.6 Echinaster brasiliensis

4.6.1 Averiguação da presença de melatonina

A dosagem de melatonina mostrou a presença do hormônio, especialmente nos

pontos da noite (Figura 30). Os pontos eram estatisticamente diferentes entre si (p<0,01,

Anova de uma via), com ritmo relacionado ao período de 24 horas (p<0,005, Cosinor,

Figura 31) e pico de produção da melatonina um pouco depois das 21 horas.

O experimentos com os animais em livre curso resultaram em uma curva similar àquela

resultante em animais em regime de luz normal, com maior concentração de melatonina

nos pontos da noite subjetiva e pico aparentemente próximo as 21 horas (Figura 32). Os

pontos eram estatisticamente diferentes entre si (p<0,05, Anova de uma via), com ritmo

de 24 horas (p<0,05, cosinor, Figura 33). A curva dos animais em escuro constante foi

similar à dos animais em regime de iluminação natural, indicando que a melatonina

seria mesmo a manifestação do relógio endógeno.

Figura 30- Dosagem de melatonina em Echinaster brasiliensis.

Cada ponto é uma média de 6 indivíduos. Sol nascendo as 6:15 da manhã e se pondo às 17:48 da tarde.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

Horários

Mel

aton

ina

(ng/

mg)

77

Figura 31- Curva ajustada da produção de melatonina em Echinaster brasiliensis

Curva obtida após aplicação do método do cosinor. Cada ponto do gráfico é uma média de 6 indivíduos.

Figura 32- Dosagem de melatonina em Echinaster brasilienses

5 8 11 14 17 20 23 2 5

02468

10121416

Horários

Mel

aton

ina

(ng/

mg)

Animais em regime de escuro constante. Cada ponto é uma média de 6 indivíduos.

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

Horários

Mel

aton

ina

(ng/

mg)

78

Figura 33- Curva ajustada de melatonina em Echinaster brasiliensis

Animais em regime de escuro constante, após aplicação do método do cosinor. Cada ponto do gráfico é uma média de 6 indivíduos.

A comparação dos dados obtidos nos animais em regime de luz natural e em

escuro constante (Tabela 3) mostrou que o nível médio de produção de melatonina

(mesor) é estatisticamente maior nos animais em livre curso em relação àqueles em

regime normal de luz (teste T). O pico de produção do hormônio também foi

estatisticamente diferente, ainda que em pequena escala.

Tabela 3- Parâmetros do teste cosinor em Echinaster brasiliensisParâmetro AcrofaseAcrofase MesorMesor AmplitudeAmplitude

Regime de luz LD DD LD DD LD DDMelatonina 21,3±0,82 20,5±0,77* 4,79±0,5 8,09±0,45* 3,2±0,73 2,97±0,66

Dados da produção de melatonina. A acrofase representa o horário de pico de produção do hormônio, o mesor a oscilação média e a amplitude a diferença entre o mesor e o ponto de máximo. “LD” significa “claro e escuro”, ou seja, regime de luz convencional, e “DD”significa “escuro-escuro”, ou seja, regime de luz de escuro constante. * estatisticamente diferente do LD com valor de p< 0.05 – teste t.

5 8 11 14 17 20 23 26 29

456789

101112

Horários

Mel

aton

ina

(ng/

mg)

79


melatonina e genes relógio

Foram obtidas isoformas para os genes Triptofano Hidroxilase e Aril-aquil N-

acetil-transferase, da via de produção de melatonina; Cry1, Cry2, Clock, Bmal e Per2

dos genes relógio; e do gene ribossomal RPL37a.

A isoforma obtida para o gene RPL37a apresentou alta similaridade, em

diversas regiões, com genes ainda sem função conhecida em outras espécies do filo

Echinodermata (e.g., Patiria miniata, Asterina pectinifera), Mollusca (e.g., Crepidula

fornicata) e Arthropoda (e.g., Eulaema nigrita, Apis florea).

A isoforma encontrada para o gene TPH apresentou alta similaridade com uma

uma proteína hipotética descrita em fungos (Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus) e

também com sequências de diversos genes que funcionam como fatores de transcrição

em mamíferos (Mus musculus).

A sequência obtida para a AANAT apresenta similaridade com sequências do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em mamíferos em regiões distintas

(Macaca fascicularis, Macaca nemestrina e Macaca mulatta) e com a sequência da

NADH desidrogenase em salamandras (Plethodon caddoensis), em mais de um ponto

do amplificado.

A isoforma encontrada para Cry1 apresentou uma similaridade muito alta com

a sequência descrita para camundongos (Mus musculus), ente outros mamíferos (Canis

familiaris, Oryctolagus cuniculus, Spalax judaei, Homo sapiens, Bos taurus).

O alinhamento da isoforma encontrada para o Cry2 mostrou alta similaridade

com uma proteína hipotética em protista (Trichomonas vaginalis) e com partes do

80

genoma de protistas da família tripanossomídeos (Leishmania donovani e Leishmania

infantum). Caso similar foi observado para o gene Clock.

A sequência obtida para o gene Bmal apresentou alta similaridade com a

sequência descrita para Rattus norvegicus e Mus musculus, ainda que com muitos gaps.

e em outros mamíferos (Phodopus sungorus , Homo sapiens, entre outros).

A isoforma de Per2 apresentou similaridade com sequências descritas para

Per2 em Rattus norvegicus e Mus musculus. Uma banda secundária, de maior tamanho,

apresentou homologia alta com sequências sem função definida para o cnidário

Acropora millepora, em camundongos (Mus musculus) ratos (Rattus norvegicus) e em

peixes (Danio rerio).



relógio

A isoforma encontrada para a enzima Triptofano Hidroxilase apresentou uma

expressão maior nos pontos da noite, com um aparente pico no ponto das 17 horas

(Figura 34), padrão semelhante ao observado na produção de melatonina, sendo que os

pontos eram diferentes entre si (p<0,001, Anova de uma via).

81

Figura 34- Expressão da enzima Triptofano-hidroxilase em Echinaster brasiliensis

Amostras do ceco gonadal de Echinaster brasilienses. Dados normalizados pelo gene constitutivo RPL37a . Cada ponto representa a média de quatro amostras.

Um padrão similar foi observado na expressão da isoforma da AANAT, com

expressão baixa durante os pontos do dia, crescente nos pontos da noite, pico as 22

horas (Figura 35). Os pontos eram diferentes entre si (p<0,001, Anova de uma via) e a

curva remete à de melatonina (correlação de Pearson, r= 0,633; p< 0,05).

Figura 35- Expressão da enzima AANAT em Echinaster brasilienses


TPH

5 8 11 14 17 20 23 2 5

1.251.501.752.002.252.502.753.003.25

Horários

2^dCT

AANAT

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

50

100

150

200

250

300

350

Horários

2^dCT

82

As isoformas encontradas para os genes Bmal e Clock apresentaram curvas de

expressão semelhantes, com pico ao redor das 22 horas (Figuras 36 e 37). Em ambas, os

pontos eram estatisticamente diferentes (p<0,001, Anova de uma via).

Figura 36- Expressão da isoforma do gene relógio Bmal em Echinaster brasilienses


Figura 37- Expressão do gene relógio Clock em Echinaster brasilienses

Clock

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Horários

2^dCT


Bmal

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

Horários

2^dCT

83

Os genes Cry1 e Cry2 apresentaram um padrão bastante estável, com apenas

um pico de expressão no ponto das 2 horas (Figuras 38 e 39). Os pontos eram

estatisticamente diferentes para ambos os genes (p<0,001, Anova de uma via).

Figura 38- Expressão do gene relógio Cry1 em Echinaster brasilienses


Figura 39- Expressão do gene relógio Cry2 em Echinaster brasilienses


Cry 1

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.45

Horários

2^dC

T

Cry 2

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

5

10

15

20

25

Horários

2^dC

T

84

As duas isoformas encontradas para o gene Per2 apresentaram padrão de

expressão semelhante, concentrada nos pontos da noite, com pico no ponto das 2 horas

da manhã. Enquanto para a primeira isoforma (Per2A, Figura 40) a expressão é quase

constante durante todo o período, apresentando apenas o pico das 2 horas, na segunda

isoforma (Per2B, Figura 41), a expressão tem o pico das 2 horas e vai decaindo cada

vez mais até o menor ponto as 23 horas. Os pontos eram estatisticamente diferentes

(p<0,001, Anova de uma via) para ambos os genes.

Figura 40- Expressão do gene relógio Per 2 em Echinaster brasilienses


Per 2 A

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0

5

10

15

20

25

Horários

2^dC

T

85

Figura 41- Expressão do gene relógio Per 2 em Echinaster brasilienses

Per 2 B

5 8 11 14 17 20 23 2 5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

Horários

2^dC

T



Pudemos verificar a existência de atividade da Triptofano Hidroxilase em todas

as amostras, mas concentrada nos pontos da noite, especialmente nos pontos de 20, 23 e

2 horas (Figura 42), o que coincide com a dosagem de melatonina. Os pontos eram

estatisticamente diferentes entre si (p<0,001, Anova de uma via).

86

Figura 42- Atividade da enzima TPH em Echinaster brasiliensis.

Amostras do ceco gonadal de Echinaster brasilienses. Cada ponto representa a média de quatro

amostras.

4.6.5 Ensaio da atividade da aril-aquil-N-acetiltransferase

O experimento mostrou não apenas a existência de atividade da AANAT, como

um ritmo próximo ao da produção da melatonina, com pico no ponto das 20 horas

(Figura 43), enquanto o do hormônio era às 23 horas. Há diferença entre os pontos ao

longo do dia (p<0,001, Anova de uma via).

2 5 8 11 14 17 20 23 2

050

100150200250300350400450500550

Time points

Pic

omol

es/2

00m

g pr

oteí

na/h

ora

87

Figura 43- Atividade da enzima AANAT em Echinaster brasiliensis.

Amostras do ceco gonadal de Echinaster brasilienses. Cada ponto representa a média de quatro

amostras.


Todos os 10 exemplares de Echinaster brasiliensis tratados com melatonina

apresentaram atividade intensificada dos pés ambulacrais entre 15 e 30 minutos após a

adição de melatonina à água, em comparação com os 8 animais não tratados. Não foi

possível verificar alterações consideráveis com relação ao posicionamento dos indivíduos

no aquário.

2 5 8 11 14 17 20 23 2

0

100

200

300

400

500

600

700

Time points

pico

mol

es/2

00m

g pr

otei

n/ho

ur

88

5 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

O presente estudo foi capaz de mostrar indícios da maquinaria circadiana em

filos pouco estudados, demonstrando a presença de melatonina, sua via de produção,

possíveis funções e também a presença da maquinaria dos genes relógio. Os resultados

obtidos são inéditos na literatura e ajudarão na construção do conhecimento da biologia

de tais grupos.

As espécies com as quais aqui trabalhamos, por mais que pareçam carecer de

relação entre si, são representantes de filos nos quais nunca havia sido investigada a

produção de melatonina, ou careciam de mais estudos. Isso torna nossas dosagens de

maior relevância. Algumas da espécies, como Bolinopsis vitrea, representante do filo

Ctenophora, por si só tem uma fisiologia pouco conhecida, o que torna todos os dados

gerados importantes para conhecer mais sobre elas.

As dosagens de melatonina renderam dados com 4 padrões diferentes: picos de

produção no início da noite (Bolinopsis vitrea), meio da noite (Olindias sambaquiensis

e Echinaster brasilienses), início do dia (Phragmatopoma lapidosa) e meio do dia

(Lychnorhiza lucerna e Nematostella vectensis). São padrões muito diversos, porém já

observados na literatura.

Picos de melatonina na noite já foram observados em protistas (23), algas verdes

(58) e alguns invertebrados (e.g., planárias (25) e insetos como a Drosophila (26)), além de

vertebrados. Neste caso, a melatonina poderia estar preparando os indivíduos para a

atividade ou para o repouso. Nos casos aqui observados, estamos tratando de três animais

de filos distintos, mas com hábitos alimentares similares. Bolinopsis vitrea, Olindias

sambaquiensis e Echinaster brasilienses são todas espécies carnívoras. Para as duas

89

primeiras é bastante claro, mesmo quando em aquário, se tratarem de espécies com ritmos

de atividade-repouso bem definidos. Durante o dia, elas se encontravam na base do aquário,

com movimentos em baixa frequência. Contudo, durante a noite, nadavam ativamente. As

coletas destas espécies já indicavam este padrão. Somente fomos capazes de encontrar

espécimes de Bolinopsis vitrea e Olindias sambaquiensis no arrasto de fundo durante o dia,

sendo que à noite as espécies se encontravam mais próximas à superfície. Para Echinaster

brasilienses, não foi tão simples observar um padrão. Comportamentos circadianos já foram

observados em equinodermos da classe Ophiuroidea (59) e também na classe Asteroidea

(60). Acredita-se que este padrão seja presente em todo o filo, relacionado a fatores

abióticos (e.g. marés (60),) e bióticos (e.g., alimentação e predação (59)). Pudemos

observar em aquário uma maior movimentação dos exemplares de Echinaster durante a

noite, especialmente uma maior atividade dos pés ambulacrais. Podemos supor que nestas

espécies a melatonina está agindo para sinalizar a todos os tecidos do corpo que o animal se

encontra no período noturno. Tal marcação circadiana é fundamental, para manter o nicho

ecológico dos animais. O fato observado nas dosagens de melatonina em animais em livre

curso (que pudemos realizar apenas em Olindias sambaquiensis e Echinaster brasilienses),

de que os padrões de produção eram mantidos, corrobora o fato de que nestes animais a

melatonina é a manifestação do relógio biológico destas espécies. Outro fato que corrobora

o papel da melatonina nestas espécies é o experimento que realizamos em que era realizada

a aplicação de melatonina (1 µM) nos aquários com espécies individualizadas de Bolinopsis

vitrea, Olindias sambaquiensis e Echinaster brasilienses durante o dia, às 15h. Todas as

espécies apresentaram atividade intensificada entre 15 e 45 minutos após a adição de

melatonina à água, sendo que Bolinopsis vitrea e Olindias sambaquiensis saíram da base

do aquário e passaram a nadar ativamente próximo a superfície da água.

90

A produção de melatonina nos pontos do claro, observada em Lychnorhiza

lucerna, Nematostella vectensis e em Phragmatopoma lapidosa já foi descrita em algumas

espécies, como nos apêndices locomotores do grilo Gryllus bimaculatus (30) e no olho do

molusco gastrópode Aplysia californica (31). Estas três espécies apresentam hábitos muito

distintos. Enquanto Lychnorhiza lucerna caça ativamente, e provavelmente apresenta

migração vertical, como outros Scyphozoa (61), Nematostella vectensis é uma espécie

sedentária a maior parte do tempo, e Phragmatopoma lapidosa é uma espécie bentônica,

que depende muito do regime de marés. Parece impossível generalizar uma função da

melatonina nestas espécies. Entretanto, devemos imaginar que a função básica do

hormônio, que é combater radicais livres de oxigênio e/ou nitrogênio, deve ser um

ponto chave para estas espécies. Estes radicais livres são produto não apenas de fontes

endógenas, como o metabolismo, mas também de exógenas, como metais pesados e/ou

de transição, poluição e radiação ultravioleta. Melatonina se mostrou capaz de reduzir a

concentração de espécies reativas de oxigênio no crustáceo Neohelice granulata quando

este era exposto à radiação ultravioleta (62). No ácaro, Tetranychus urticae, a atividade

da enzima AANAT e a concentração de melatonina foram elevadas em resposta à alta

exposição a radiação ultravioleta (63). De volta as espécies abordadas neste trabalho,

Nematostella vectensis vive em região de baixa profundidade, onde pode sofrer com

grande exposição à radiação ultravioleta (64), de modo que a melatonina poderia vir a

exercer a função de antioxidante. Phragmatopoma poderia depender da melatonina da

mesma forma, por viver no costão e por diversas vezes ter de lidar com forte radiação

solar.

No caso de Phragmatopoma lapidosa, algumas considerações devem ser feitas.

Os recifes habitados por vermes constituem a base de uma elaborada e estável

91

comunidade marinha que inclui crustáceos, moluscos, esponjas, briozoários e peixes

(65). Pesquisas recentes na absorção de melatonina através da alimentação em C.

elegans (36) e em vertebrados (33), indicam a ocorrência de trocas interespecíficas da

molécula, tanto em regime de simbiose quanto através de níveis tróficos (33), incluindo

aí o papel de microorganismos e fungos ricos em melatonina que estão na cadeia

alimentar de microcrustáceos e peixes (33). Indivíduos de Phragmatopoma são

predados por crustáceos, gastrópodes e peixes, constituindo a base da cadeia alimentar

de espécies que vivem nestes recifes ou próximos destes (65, 66). Desta forma,

poderíamos esperar uma interação interespecífica da molécula entre as espécies,

indicando que o conteúdo de melatonna no corpo dos predadores de Phragmatopoma

poderia ter origem não apenas na produção local mas também vir da ingestão destes

anelídeos.

O padrão de produção de melatonina observado em Nematostella vectensis,

com ritmicidade circadiana e pico diurno, merece algumas considerações. Mechawar e

Anctil (67) haviam previamente descrito a presença de melatonina em Cnidaria, no

Anthozoa colonial Renilla köllikeri, mas eles não detectaram um padrão circadiano de

produção do indol, o que é interessante dado que o hormônio funciona como um

marcador circadiano e sazonal nos Bilateria (33, 58). Entretanto, uma diferença

considerável entre aquele trabalho e o aqui apresentado é que Mechawar and Anctil

utilizaram-se de luz vermelha no momento de dissecar as colônias para coletar tecido

para os pontos da noite, enquanto nós realizamos as coletas sem qualquer luz auxiliar. A

produção de melatonina é conhecida por ser extremamente sensível à luz (14, 68), então

é possível que mesmo uma exposição curta à luminosidade possa ter alterado a

produção de melatonina. Outros autores utilizaram-se de exposição à luz vermelha mas

92

ainda foram capazes de ver ritmos de melatonina em um modelo animal diferente (31),

então não é claro porque Nematostella apresenta um padrão diferente de Renilla. Outra

possibilidade é que a melatonina por si só possa ter sido degradada pela luz vermelha

(69).

Os resultados dos sequenciamentos trouxeram dados interessantes. Verificamos

que a seqüência para a enzima Triptofano Hidroxilase é bastante conservada nas cinco

espécies investigadas. Isso provavelmente é um reflexo de como essa enzima deve ser

importante no metabolismo de todos estes animais, de modo que uma pressão evolutiva

deve ter agido evitando grandes alterações na sequencia com o passar do tempo. A

triptofano hidroxilase é importante não apenas na síntese de melatonina, como também

de outros metabólitos que funcionam como mensageiros químicos, que devem ser

conservados ao longo das espécies. A sequencia para a AANAT, entretanto, só pode ser

identificada em Bolinopsis vitrea e Echinaster brasiliensis, e da HIOMT, apenas em

Nematostella vectensis. Provavelmente tais seqüências foram muito modificadas no

curso da evolução, mas ainda devem se encontrar presentes, já que pudemos verificar

atividade destas enzimas.

Um dado muito interessante que obtivemos dos sequenciamentos foi sobre os

genes relógio Cry1 e Cry2, que se mostraram muito conservados, em Olindias,

Nematostella vectensis e em Echinaster, o que indica que a maquinaria do relógio

provavelmente é muito importante para tais espécies. Esse resultado aumentou nosso

interesse pelos genes relógio nestas espécies, o que não fugiu do escopo original do

projeto, uma vez que nosso objetivo era investigar os mecanismos moleculares e

fisiológicos da ritmicidade nas espécies que estamos trabalhando. Nossos resultados

mostram que a maquinaria do relógio deve envolver os componentes classicamente

93

descritos, uma vez que identificamos possíveis genes homólogos para Clock, Bmal, Per

1 e Per 2, sendo que o Bmal, assim como Cry1 e Cry2 se mostrou muito similar a

seqüências previamente descritas para esse gene.

O fato de as isoformas para genes relógio em Olindias sambaquiensis e

Echinaster brasilienses apresentarem expressão com variação ao longo do dia é apenas

uma primeira evidência de que talvez venham mesmo a serem genes responsáveis pela

ritmicidade nestas espécies. Estudos mais aprofundados, investigando sua sequencia

completa de bases e o impacto do bloqueio de sua expressão na ritmicidade circadiana

seriam necessários para confirmar seu papel.

Os dados de expressão gênica em Olindias sambaquiensis, Nematostella

vectenis e Echinaster brasilienses vieram a nos mostrar que as isoformas de triptofano

hidroxilase eram expressas em tais espécies, de maneira bastante similar à produção de

melatonina (Olindias e Nematostella) ou com um aparente adiantamento (Echinaster). É

preciso frisar que aqui estamos tratando da expressão do gene, que após render o RNA

mensageiro, ainda teria de ter este traduzido para a proteína para esta ter atividade.

Desta maneira, o fato do gene para a isoforma da triptofano hidroxilase não apresentar

exatamente o mesmo padrão de produção da melatonina não é uma incongruência. Os

dados de atividade das enzimas viriam a ser cruciais para confirmar o papel da via

clássica de produção de melatonina nestas espécies. Em Nematostella vectenis

verificamos também a expressão da hidroxindole-O-metiltransferase, última enzima da

via de produção de melatonina, correlacionado ao padrão de síntese do indol.

Em Nematostella vectensis já haviam dados sobre a expressão dos genes

relógio (52), mostrando inclusive a capacidade de Clock e Cycle de formar dímeros.

Entretanto, ainda eram necessários mais estudos sobre seu mecanismo de regulação e

94

sua resposta à regimes de escuro constante. Nossos resultados mostram que 4 dias de

escuro constante são suficientes para abolir a expressão circadiana de todos os genes

relógio que analisamos, com apenas 24 horas sendo suficientes para o fator central

NvClock. Os dados de outros Anthozoas mostram um padrão similar, com perda de

ritmicidade dos genes relógio em 24 horas (Acropora millepora) (70) ou 72 horas

(Favia fragum) (71). Juntos, estes dados indicam que perda da ritmicidade na

transcrição dos genes relógio quando dos animais em escuro constante pode ser uma

característica de cnidários, em oposição à descrição clássica em bilateria, onde os

animais são capazes de manter a ritmicidade naquela condição (72-75).

Nossa hipótese de que melatonina seria capaz de re-sincronizar os genes

relógio nos exemplares de Nematostella vectensis em escuro constante foi baseada em

estudos anteriores com mamíferos que observaram esta capacidade do hormônio (76,

77). Nós observamos que a adição de 1 µM de melatonina teve a mesma capacidade em

Nematostella, corroborando nossa hipótese de que a interação entre melatonina e a

maquinaria dos genes relógio surgiu bastante cedo na evolução dos Metazoa. Em

mamíferos, um curto tratamento de melatonina (2 horas) não é capaz de alterar a

expressão destes genes (78). Em conjunto, nossos resultados e os dados da literatura

indicam que anêmonas em escuro constante, que possuem um menor período com

melatonina, perdem a ritmicidade dos genes relógio, mas uma exposição artificial de 12

horas ao hormônio faz com que a expressão de tais genes seja re-sincronizada.

O experimento de microarranjo em Nematostella vectensis trouxe mais dados

que demonstram a capacidade da melatonina de ser uma gente sincronizador nesta

espécie. Dos 287 genes que oscilaram ao longo dos pontos analisados em animais em

escuro constante, 183 perdiam tal variação quando os animais eram mantidos em escuro

95

constante, mas recuperaram o ritmo nos animais suplementados com melatonina.

Aparecem neste grupo genes para proteínas que agem como enzimas, modulando

diversos eventos na resposta celular, e desta maneira, na fisiologia do animal como um

todo, tais como proteína 14-3-3, chaperonina 10, uma o-metiltransferase, entre outras.

Podemos inferir que as alterações fisiológicas nos animais quando da passagem para o

regime de escuro constante, como supressão da produção de gametas, podem vir a ser

decorrentes da alteração da transcrição destes genes.

Também foi possível verificar que dos 24020 genes analisados, 35 deles

mantém uma oscilação na expressão independente do regime de luz ou da adição de

melatonina. Provavelmente se tratavam de genes intimamente relacionados a

ritmicidade desta espécie, cuja perda da oscilação poderia ocasionar problemas ao

indivíduo. De fato, a análise qualitativa nos mostrou que aí se encontravam genes para

uma proteína constituinte do ribossomo 60s, para uma sub-unidade de uma ATPase, e

genes para proteínas extracelulares de membrana Também verificamos que por mais a

melatonina pareça um potente agente sincronizador em Nematostella, 57 genes que

variam em regime de claro-escuro perdem essa ritmicidade em escuro constante e tal

capacidade não é recuperada com a adição do indol. Outro dado que deve ser levado em

conta são os 12 genes com variação circadiana que aparecem em comum entre os

regimes de claro-escuro e escuro constante. São genes cuja adição de melatonina teria

inibido a transcrição. Dentro deste grupo encontra-se o gene para uma proteína cinase

dependente de cálcio calmodulina, cuja alteração na transcrição poderia ter grande

impacto na sinalização celular. A quantidade de genes cuja adição de melatonina foi

capaz de induzir alterações no padrão de expressão (3219) mostra o potencial do

96

hormônio como regulador da transcrição. Entre estes encontram-se genes para enzimas

enzimas e para a RNA polimerase, o que teria um grande impacto na fisiologia celular.

Fomos capazes de realizar ensaios de atividade enzimática para Triptofano

Hidroxilase e Aril-aquil-N-acetiltransferase e m B o l i n o p s i s v i t r e a , O l i n d i a s

sambaquiensis, Phragmatopoma lapidosa e em Echinaster brasiliensis, e para as

enzimas Triptofano Hidroxilase e Hidroxindole-O-metiltransferase em Nematostella

vectensis. Em Bolinopsis vitrea, Olindias sambaquiensis e em Echinaster brasiliensis

ambas enzimas (TPH e AANAT) mostraram padrões de atividade que se

correlacionavam ao observado para a produção de melatonina (teste de correlação de

Pearson). Isso nos leva a supor que a via de produção de melatonina nos invertebrados é

provavelmente a mesma descrita em vertebrados , ainda que faltem ensaios sobre a

atividade da última enzima da via, a HIOMT, nestas espécies.

Para Phragmatopoma lapidosa, antes mesmo de realizar os testes de

correlação, já podíamos inferir que os padrões não se relacionavam diretamente. Tanto a

triptofano hidroxilase quanto a aril-aquil-N-acetiltransferase apresentam um pico de

atividade no ponto das 2 horas da manhã, enquanto a dosagem de melatonina acusou

maior concentração no início do período claro. De fato, o teste de correlação de pearson

não indicou relação nem para a TPH (coeficiente r de Pearson igual a 0,023; valor de p

de 0,4735) nem para a AANAT (coeficiente r de Pearson igual a -0,2996; valor de p de

0,2325). Podemos imaginar que nesta espécie a última enzima da via de produção de

melatonina, a hidroxindole-O-metiltransferase (HIOMT), deve estar tendo um papel

fundamental. No ponto das duas horas da manhã, a máxima atividade da triptofano

hidroxilase e da aril-aquil-N-acetiltransferase deve estar gerando grandes quantidades

de N-acetil serotonina, que devido a uma baixa concentração/atividade da HIOMT, não

97

estaria sendo convertida em melatonina. Ensaios de atividade da HIOMT se fazem

necessários para confirmar esta hipótese.

Em Nematostella vectensis, fomos capazes de detectar a atividade das enzimas

TPH e HIOMT. O teste ANOVA de uma via mostrou que a atividade diferia entre os

dois pontos do dia analisados para ambas as enzimas (p < 0,001), indicando uma

dependência temporal na atividade. Ambas enzimas tiveram maior atividade no ponto

com maior quantidade de melatonina, evidência da correlação entre a atividade das

enzimas e a produção de melatonina. Fomos os primeiros a mostrar atividade destas

enzimas nos filos nos quais trabalhamos, mas existem dados na literatura sobre

moluscos (79) e artrópodes (35, 80-82), o que reforça nossos dados.

Em conclusão, pudemos verificar a presença de melatonina, com produção

circadiana e com sinais de ser um marcador endógeno da ritmicidade circadiana em 4

filos onde nunca tal averiguação havia sido realizada: Ctenophora, Cnidaria, Annelida e

Echinodermata. Mais do que isso, nossos dados indicam que a via de produção de

melatonina é a mesma nas cinco espécies dos quatro filos analisados com base em

dados gênicos e de atividade das enzimas. Isso comprova a tese de que a melatonina é

uma molécula ubíqua nos seres vivos, uma vez que em todos os animais em que foi

investiga, ela esteve presente.

Também fomos capazes de demonstrar a presença de isoformas de genes

relógio nestes filos, pela primeira vez na literatura, o que abre a possibilidades de

investigar como tais genes funcionam nestas espécies, modulando sua ritmicidade, tanto

em fenômenos comportamentais, como na própria produção de melatonina.

98

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104

Anexo 1: Quadro comparativo das espécies analisadas neste exemplar.

105

Bolin

opsi

s vitr

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chno

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106

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Anexo 2: AlinhamentosAnexo 2.1: Alinhamentos das sequencias obtidas para isoformas dos genes da via de produção de melatonina, genes constitutivos e genes relógio em Bolinopsis vitrea

RPL37a:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences 14,763,360 sequences; 35,108,553,521 total lettersQuery Length=301

Score ESequences producing significant alignments: (Bits) Value

ref|NM_001100994.1| Rattus norvegicus ribosomal protein L37a ... 443 4e-121ref|NM_009084.4| Mus musculus ribosomal protein L37a (Rpl37a)... 374 2e-100gb|HQ326676.1| Heterocephalus glaber 60S ribosomal protein L3... 329 6e-87 gb|HQ326675.1| Fukomys anselli 60S ribosomal protein L37a mRN... 325 7e-86 dbj|AK346581.1| Sus scrofa mRNA, clone:MLN010015A03, expresse... 325 7e-86 ref|XM_002749767.1| PREDICTED: Callithrix jacchus 60S ribosom... 311 2e-81 ref|NM_000998.4| Homo sapiens ribosomal protein L37a (RPL37A)... 311 2e-81 ref|NM_001132041.1| Pongo abelii ribosomal protein L37a (RPL3... 311 2e-81 ref|NM_001035008.1| Bos taurus ribosomal protein L37a (RPL37A... 307 2e-80 ref|XM_001085048.2| PREDICTED: Macaca mulatta ribosomal prote... 306 7e-80 gb|BC082239.1| Homo sapiens ribosomal protein L37a, mRNA (cDN... 306 7e-80

TPH:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences 14,763,360 sequences; 35,108,553,521 total letters

Query Length=232 Score ESequences producing significant alignments: (Bits) Value

ref|NM_001100634.2| Rattus norvegicus tryptophan hydroxylase ... 311 1e-81ref|NM_009414.2| Mus musculus tryptophan hydroxylase 1 (Tph1)... 257 2e-65gb|AY034600.1| Mesocricetus auratus tryptophane hydroxylase m... 250 3e-63ref|NM_004179.2| Homo sapiens tryptophan hydroxylase 1 (TPH1)... 215 7e-53gb|EU796672.1| Gorilla gorilla tryptophan hydroxylase 1 (TPH1... 134 2e-28gb|EU796671.1| Pan troglodytes tryptophan hydroxylase 1 (TPH1... 134 2e-28gb|EU796673.1| Pongo pygmaeus tryptophan hydroxylase 1 (TPH1)... 129 8e-27gb|EU796670.1| Pan paniscus tryptophan hydroxylase 1 (TPH1) g... 129 8e-27gb|GU290195.1| Clarias gariepinus tryptophan hydroxylase mRNA... 111 2e-21gb|BC059550.1| Danio rerio tryptophan hydroxylase 1 (tryptoph... 107 3e-20ref|NM_178306.2| Danio rerio tryptophan hydroxylase 1 (trypto... 107 3e-20ref|NM_001081783.1| Equus caballus tryptophan hydroxylase 2 (... 105 9e-20gb|BC154120.1| Danio rerio tryptophan hydroxylase 1b, mRNA (c... 102 1e-18gb|EU796675.1| Pan paniscus tryptophan hydroxylase 1 (TPH1) g... 84.2 3e-13gb|EU796678.1| Pongo pygmaeus tryptophan hydroxylase 1 (TPH1)... 78.8 1e-11gb|EF490969.1| Carassius auratus tryptophan hydroxylase 1 (TR... 78.8 1e-11

AANAT:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters

Query length=238 Score ESequences producing significant alignments: (Bits) Value

ref|NM_012818.2| Rattus norvegicus arylalkylamine N-acetyltra... 188 1e-44

107

gb|AF004108.1|AF004108 Mus musculus arylalkylamine N-acetyltr... 167 3e-38gb|AF317891.1| Arvicanthis niloticus arylalkylamine-N-acetyl-... 152 7e-34gb|AF092100.1|AF092100 Mesocricetus auratus arylalkylamine N-... 104 3e-19gb|DQ018371.1| Psammomys obesus arylalkylamine N-acetyltransf... 91.5 2e-15gb|FJ809749.1| Octodon degus arylalkylamine N-acetyltransfera... 84.2 3e-13gb|DQ864375.1| Bos grunniens arylalkylamine-N-acetyltransfera... 71.6 2e-09ref|NM_177509.2| Bos taurus arylalkylamine N-acetyltransferas... 71.6 2e-09ref|NM_001009461.1| Ovis aries aralkylamine N-acetyltransfera... 68.0 2e-08gb|GQ340971.1| Solea senegalensis arylalkylamine N-acetyltran... 46.4 0.080ref|NM_001124180.1| Oncorhynchus mykiss retinal arylalkylamin... 41.0 3.4

Clock: Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


emb|AM420293.1| Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 complete... 46.4 0.094gb|CP002217.1| Burkholderia sp. CCGE1003 chromosome 1, comple... 44.6 0.33 emb|FP103042.2| Methylobacterium extorquens DM4 str. DM4 chro... 42.8 1.1 gb|EU332842.1| Homo sapiens fibroblast growth factor receptor... 42.8 1.1 gb|CP000769.1| Anaeromyxobacter sp. Fw109-5, complete genome 42.8 1.1 gb|AC018921.22| Homo sapiens 12 BAC RP11-956E11 (Roswell Park... 42.8 1.1 emb|AJ582817.3| Streptomyces kanamyceticus kanamycin biosynth... 42.8 1.1 gb|U91327.1|HSU91327 Human chromosome 12p15 BAC clone CIT987S... 42.8 1.1 dbj|AP010968.1| Kitasatospora setae KM-6054 DNA, complete genome 41.0 4.0 gb|CP002299.1| Frankia sp. EuI1c, complete genome 41.0 4.0

Cry1:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 14,763,360 sequences; 35,108,553,521 total letters


ref|NM_198750.2| Rattus norvegicus cryptochrome 1 (photolyase... 316 3e-83ref|NM_007771.3| Mus musculus cryptochrome 1 (photolyase-like... 221 2e-54ref|XM_857660.1| PREDICTED: Canis familiaris similar to crypt... 170 3e-39ref|XM_002711421.1| PREDICTED: Oryctolagus cuniculus cryptoch... 165 1e-37emb|AJ606298.1| Spalax judaei mRNA for sCRY1 protein 163 4e-37ref|NM_004075.3| Homo sapiens cryptochrome 1 (photolyase-like... 147 3e-32ref|XM_002823690.1| PREDICTED: Pongo abelii cryptochrome 1 (p... 145 1e-31ref|NM_001105415.1| Bos taurus cryptochrome 1 (photolyase-lik... 140 4e-30dbj|AB074458.1| Macaca fascicularis mRNA for cryptochrome 1, ... 138 1e-29ref|NM_001129735.1| Ovis aries cryptochrome 1 (photolyase-lik... 136 5e-29gb|AY585716.1| Erithacus rubecula cryptochrome-1a (CRY1a) mRN... 86.0 8e-14emb|AJ632120.1| Sylvia borin mRNA for cryptochrome 1 (cry1 gene) 82.4 1e-12

Per 1:

Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


gb|AC192469.4| Pan troglodytes BAC clone CH251-585B11 from ch... 44.6 0.38 emb|FQ311473.1| Sporisorium reilianum SRZ2 chromosome 8 compl... 42.8 1.3 gb|CP000304.1| Pseudomonas stutzeri A1501, complete genome 42.8 1.3

108

gb|EF192032.2| Parajulis poecilepterus mitochondrion, complet... 41.0 4.6 emb|FP929114.1| Leptosphaeria maculans v23.1.3 lm_SuperContig... 41.0 4.6 emb|FN357311.1| Schistosoma mansoni genome sequence supercont... 41.0 4.6 gb|AC207212.4| Pongo abelii BAC clone CH276-345C12 from chrom... 41.0 4.6

Anexo 2.2:Alinhamentos das sequencias obtidas para isoformas dos genes da via de produção de melatonina, genes constitutivos e genes relógio em Olindias sambaquiensis:RPL37a:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


ref|NM_001108801.1| Rattus norvegicus ribosomal protein L37a ... 41.0 5.9 emb|AM471589.2| Vitis vinifera contig VV78X171785.6, whole ge... 41.0 5.9 gb|EF013665.1| Aenictogiton sp. ZAM02 wingless (wnt-1) gene, ... 41.0 5.9 ref|NM_001100994.1| Rattus norvegicus ribosomal protein L37a ... 41.0 5.9 gb|AC147633.3| Mus musculus BAC clone RP23-302B3 from chromos... 41.0 5.9 gb|AC108947.5| Mus musculus BAC clone RP23-140A11 from chromo... 41.0 5.9 gb|AC021582.13| Homo sapiens chromosome 9, clone RP11-687K5, ... 41.0 5.9

TPH:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters

Query length=217 Score ESequences producing significant alignments: (Bits) Valueref|NM_001100634.2| Rattus norvegicus tryptophan hydroxylase ... 347 2e-92ref|NM_009414.2| Mus musculus tryptophan hydroxylase 1 (Tph1)... 293 3e-76gb|AY034600.1| Mesocricetus auratus tryptophane hydroxylase m... 289 4e-75ref|NM_004179.2| Homo sapiens tryptophan hydroxylase 1 (TPH1)... 257 2e-65emb|X52836.1| Human mRNA for tryptophan hydroxylase (EC 1.14.... 257 2e-65ref|NM_001082272.1| Oryctolagus cuniculus tryptophan hydroxyl... 253 3e-64gb|EU796672.1| Gorilla gorilla tryptophan hydroxylase 1 (TPH1... 165 1e-37

Clock:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters

Query length=331 Score ESequences producing significant alignments: (Bits) Valuetpg|BK006916.1| TPA: TPA_inf: Anolis carolinensis protocadher... 46.4 0.12 ref|XM_002431950.1| Pediculus humanus corporis reverse transc... 44.6 0.40 emb|AM450666.2| Vitis vinifera contig VV78X065233.8, whole ge... 44.6 0.40 emb|CT028004.1| Poplar cDNA sequences 44.6 0.40 emb|FN357438.1| Schistosoma mansoni genome sequence supercont... 41.0 4.9 gb|AC235736.1| Glycine max strain Williams 82 clone GM_WBa002... 41.0 4.9 gb|AC210650.1| Populus trichocarpa clone POP004-K01, complete... 41.0 4.9 ref|XM_001525998.1| Lodderomyces elongisporus NRRL YB-4239 hy... 41.0 4.9 dbj|AB019259.1| Rattus norvegicus clock mRNA for CLOCK-S, spl... 41.0 4.9 ref|NM_021856.1| Rattus norvegicus clock homolog (mouse) (Clo... 41.0 4.9

Bmal:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


109

emb|CU633160.8| Zebrafish DNA sequence from clone CH73-22F16 ... 42.8 0.74 ref|NM_007489.3| Mus musculus aryl hydrocarbon receptor nucle... 42.8 0.74 ref|NM_024362.2| Rattus norvegicus aryl hydrocarbon receptor ... 42.8 0.74 gb|CP000026.1| Salmonella enterica subsp. enterica serovar Pa... 42.8 0.74 dbj|AB012600.1| Rattus norvegicus mRNA for BMAL1b, complete cds 42.8 0.74 dbj|AB014494.1| Mus musculus mRNA for Arnt3, complete cds 42.8 0.74 ref|XM_001095316.2| PREDICTED: Macaca mulatta aryl hydrocarbo... 41.0 2.6 gb|EF015894.1| Homo sapiens aryl hydrocarbon receptor nuclear... 41.0 2.6 dbj|D89722.1| Homo sapiens mRNA for BMAL1a, complete cds 41.0 2.6 dbj|AB000814.1| Homo sapiens mRNA for BMAL1f, partial cds 41.0 2.6

Cry 1:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters

Query length=233


ref|NM_198750.2| Rattus norvegicus cryptochrome 1 (photolyase... 390 2e-105ref|NM_007771.3| Mus musculus cryptochrome 1 (photolyase-like... 264 2e-67 emb|AJ606298.1| Spalax judaei mRNA for sCRY1 protein 217 2e-53 ref|NM_004075.3| Homo sapiens cryptochrome 1 (photolyase-like... 201 2e-48 ref|NM_001194159.1| Macaca mulatta cryptochrome 1 (photolyase... 192 8e-46 dref|NM_001105415.1| Bos taurus cryptochrome 1 (photolyase-lik... 190 3e-45 ref|NM_001129735.1| Ovis aries cryptochrome 1 (photolyase-lik... 181 2e-42 emb|AJ632120.1| Sylvia borin mRNA for cryptochrome 1 (cry1 gene) 100 4e-18 ref|NM_204245.1| Gallus gallus cryptochrome 1 (photolyase-lik... 96.9 5e-17 gb|AC169125.2| Medicago truncatula chromosome 7 BAC clone mth... 51.8 0.002 gb|CP000744.1| Pseudomonas aeruginosa PA7, complete genome 44.6 0.27 gb|AC104331.2| Homo sapiens chromosome 3 clone RP11-543A18, c... 42.8 0.95 gb|AY049033.1| Xenopus laevis cryptochrome 1 mRNA, complete cds 42.8 0.95



emb|CR456635.10| Zebrafish DNA sequence from clone DKEY-1M3 i... 46.4 0.12

ref|XM_003022415.1| Trichophyton verrucosum HKI 0517 hypothet... 42.8 1.4 ref|XM_003011916.1| Arthroderma benhamiae CBS 112371 hypothet... 42.8 1.4 ref|NM_001129736.1| Ovis aries cryptochrome 2 (photolyase-lik... 41.0 4.9 gb|BC166416.1| Rattus norvegicus cryptochrome 2 (photolyase-l... 41.0 4.9 gb|AC187502.3| MACACA MULATTA BAC clone CH250-44H12 from chro... 41.0 4.9 ref|NM_133405.1| Rattus norvegicus cryptochrome 2 (photolyase... 41.0 4.9

Per 2:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences)15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


gb|JI053551.1| TSA: Bombus insularis Contig9102.Boin mRNA seq... 41.0 4.0 ref|XM_003096656.1| Caenorhabditis remanei hypothetical prote... 41.0 4.0 gb|EZ982046.1| TSA: Spodoptera littoralis CL1Contig741.Spli m... 41.0 4.0 emb|FN357435.1| Schistosoma mansoni genome sequence supercont... 41.0 4.0 ref|XM_002179067.1| Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1 pre... 41.0 4.0

110

gb|AC231668.1| Solanum tuberosum chromosome 11 clone RH067L08... 41.0 4.0 gb|AC009424.2|AC009424 Homo sapiens, clone RP11-45E1, complet... 41.0 4.0

Anexo 2.3:Alinhamentos das sequencias obtidas para isoformas dos genes da via de produção de melatonina, genes constitutivos e genes relógio em Echinaster brasiliensis:RPL37a:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


gb|HP122905.1| TSA: Patiria miniata isotig18143.Pminagast mRN... 107 7e-20gb|EZ555044.1| TSA: Crepidula fornicata 14941.Cfedg, mRNA seq... 50.0 0.017gb|HP950875.1| TSA: Eulaema nigrita Contig20806.Euni mRNA seq... 44.6 0.73 gb|HP837696.1| TSA: Apis florea Contig16364.Apfl mRNA sequence 44.6 0.73 gb|CP001429.2| Blattabacterium sp. (Periplaneta americana) st... 44.6 0.73 ref|XM_002428027.1| Pediculus humanus corporis hypothetical p... 44.6 0.73 emb|CT573359.10| Zebrafish DNA sequence from clone DKEY-106J3... 44.6 0.73 emb|AM451674.2| Vitis vinifera contig VV78X108231.5, whole ge... 44.6 0.73 gb|EZ563307.1| TSA: Crepidula fornicata 23205.Cfedg, mRNA seq... 42.8 2.6 gb|AE014188.3| Plasmodium falciparum 3D7 chromosome 12, compl... 42.8 2.6 gb|AC140358.2| Mus musculus BAC clone RP24-234L7 from 3, comp... 42.8 2.6

TPH:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,

GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total lettersQuery length=196 Score ESequences producing significant alignments: (Bits) Value

emb|X53501.1| Rat mRNA for tryptophan hydroxylase (EC 1.14.16.4) 42.8 0.77 gb|AF289664.1|AF289664 Mus musculus CYLN2, RFC2, WBSCR15, and... 41.0 2.7 gb|AC166938.5| Mus musculus BAC clone RP23-85H24 from chromos... 41.0 2.7 gb|EZ409885.1| TSA: Jatropha curcas Contig2604, mRNA sequence 39.2 9.4 gb|AC186170.1| Ornithorhynchus anatinus chromosome UNK clone ... 39.2 9.4 gb|AC122274.4| Mus musculus BAC clone RP23-228J3 from 14, com... 39.2 9.4 emb|CR545462.25| Zebrafish DNA sequence from clone DKEYP-88F5... 39.2 9.4 gb|AC099860.13| Mus musculus chromosome 1, clone RP23-5C23, c... 39.2 9.4

AANAT:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,


gb|GQ131771.1| Macaca fascicularis isolate Nc00097 MHC class ... 46.4 0.13 gb|FJ267029.1| Plethodon caddoensis voucher DBS 1005 NADH deh... 46.4 0.13 emb|AM295870.1| Macaca fascicularis partial mRNA for MHC clas... 46.4 0.13 gb|FJ236925.1| Macaca mulatta clone T08A-99Pct-Ctg1 MHC class... 44.6 0.46 gb|AC241602.2| Chlorocebus aethiops BAC clone CH252-146I12 fr... 44.6 0.46

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a De acordo com:International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to Biomedical Journal: sample references. Available from: http://www.icmje.org [2007 May 22].

http://www.icmje.org



gb|AF020687.1|AF020687 Saguinus oedipus MHC class I antigen S... 44.6 0.46 gb|HQ113963.1| Macaca fascicularis MHC class I antigen (Mafa-... 42.8 1.6 ref|NG_009778.1| Homo sapiens lecithin-cholesterol acyltransf... 42.8 1.6 dbj|AB444917.1| Macaca mulatta Mamu-A mRNA for MHC class I an... 42.8 1.6 gb|DQ995125.1| Plethodon metcalfi voucher RH 76539 NADH dehyd... 42.8 1.6 gb|EF112536.1| Macaca mulatta MHC class I antigen (Mamu-A) ge... 42.8 1.6

Clock:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


emb|FP565814.1| Salinibacter ruber M8 chromosome, complete ge... 42.8 1.7 ref|NR_026907.1| Mus musculus Williams Beuren syndrome chromo... 42.8 1.7 gb|AC013714.8| Homo sapiens chromosome , clone RP11-22P4, com... 42.8 1.7 dbj|AK017044.1| Mus musculus adult male testis cDNA, RIKEN fu... 42.8 1.7 emb|FN357374.1| Schistosoma mansoni genome sequence supercont... 41.0 6.1 ref|XM_001441987.1| Paramecium tetraurelia hypothetical prote... 41.0 6.1 ref|XM_746628.1| Aspergillus fumigatus Af293 nucleoporin SONB... 41.0 6.1 gb|AF286884.4| Homo sapiens chromosome 8 clone RP11-597D18 ma... 41.0 6.1 .1 emb|Y09854.1| Ryegrass mosaic virus, complete genome 41.0 6.1

Bmal:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


dbj|AB012600.1| Rattus norvegicus mRNA for BMAL1b, complete cds 587 2e-164dbj|AB012601.1| Mus musculus mRNA for BMAL1b', complete cds 518 7e-144gb|AY316534.1| Phodopus sungorus Bmal1 protein (Bmal1) mRNA, ... 504 2e-139gb|AF070917.1|AF070917 Mesocricetus auratus bHLH-PAS transcri... 500 2e-138dbj|D89722.1| Homo sapiens mRNA for BMAL1a, complete cds 477 2e-131gb|AF205219.1|AF205219 Gallus gallus clock protein (BMAL1) mR... 322 1e-84 gb|AY150849.1| Tyto alba BMAL1 (Bmal1) mRNA, partial cds 304 3e-79 dbj|AB086232.1| Mus musculus genes for BMAL1b', BMAL1b, BMAL1... 178 3e-41 dbj|AB199911.1| Hyla japonica mRNA for BMAL-1, complete cds 159 8e-36 ggb|DQ841151.1| Lutzomyia longipalpis cycle (bmal1) mRNA, comp... 66.2 1e-07

Cry 1:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


gb|AF156986.1|AF156986 Mus musculus cryptochrome 1 (Cry1) mRN... 291 1e-75 ref|XM_857660.1| PREDICTED: Canis familiaris similar to crypt... 250 4e-63 ref|XM_002711421.1| PREDICTED: Oryctolagus cuniculus cryptoch... 246 4e-62 emb|AJ606298.1| Spalax judaei mRNA for sCRY1 protein 241 2e-60 ref|XM_002927658.1| PREDICTED: Ailuropoda melanoleuca cryptoc... 237 2e-59 ref|NM_004075.3| Homo sapiens cryptochrome 1 (photolyase-like... 221 2e-54 dbj|AB074458.1| Macaca fascicularis mRNA for cryptochrome 1, ... 212 9e-52 ref|NM_001105415.1| Bos taurus cryptochrome 1 (photolyase-lik... 210 3e-51 ref|NM_001129735.1| Ovis aries cryptochrome 1 (photolyase-lik... 206 4e-50 gb|EF015898.1| Homo sapiens photolyase-like cryptochrome 1 (C... 123 4e-25 emb|AJ632120.1| Sylvia borin mRNA for cryptochrome 1 (cry1 gene) 114 2e-22 ref|NM_204245.1| Gallus gallus cryptochrome 1 (photolyase-lik... 111 2e-21

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gb|DQ376040.1| Podarcis sicula cryptochrome 1 (CRY1) mRNA, co... 96.9 5e-17 gb|AY049033.1| Xenopus laevis cryptochrome 1 mRNA, complete cds 57.2 4e-05 ref|XM_001466503.1| Leishmania infantum hypothetical protein ... 41.0 3.3 gb|AC007192.1|AC007192 Homo sapiens chromosome 19, cosmid R27... 41.0 3.3 dbj|AB011133.1| Homo sapiens mRNA for KIAA0561 protein, parti... 41.0 3.3


Query length=239 Score E

Sequences producing significant alignments: (Bits) Value

ref|XM_001319614.1| Trichomonas vaginalis G3 hypothetical pro... 46.4 0.080emb|FR799610.1| Leishmania donovani BPK282A1 complete genome,... 42.8 0.98 emb|FR796455.1| Leishmania infantum JPCM5 genome chromosome 23 42.8 0.98 emb|FQ211347.1| Rattus norvegicus TL0ABA12YH06 mRNA sequence 42.8 0.98 ref|NM_001129736.1| Ovis aries cryptochrome 2 (photolyase-lik... 42.8 0.98 gb|BC166416.1| Rattus norvegicus cryptochrome 2 (photolyase-l... 42.8 0.98 ref|XM_002592136.1| Branchiostoma floridae hypothetical prote... 41.0 3.4 ref|XM_001780539.1| Physcomitrella patens subsp. patens predi... 41.0 3.4 emb|AM479387.1| Vitis vinifera contig VV78X031251.3, whole ge... 41.0 3.4 gb|AC096909.10| Rattus norvegicus 8 BAC CH230-88B13 (Children... 41.0 3.4

Per 2 a:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


ref|NM_031678.1| Rattus norvegicus period homolog 2 (Drosophi... 42.8 1.5 gb|EZ727036.1| TSA: Arachis hypogaea CL1Contig6052.Arhy mRNA ... 41.0 5.3 gb|BC167236.1| Synthetic construct Mus musculus clone IMAGE:1... 41.0 5.3 ref|XM_001805748.1| Phaeosphaeria nodorum SN15 hypothetical p... 41.0 5.3 ref|NM_011066.3| Mus musculus period homolog 2 (Drosophila) (... 41.0 5.3 dbj|AK122253.1| Mus musculus mRNA for mKIAA0347 protein 41.0 5.3 gb|AF035830.1|AF035830 Mus musculus PERIOD 2 (Per2) mRNA, com... 41.0 5.3

Per 2 b:Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters

Query length=616


ref|NM_001039025.2| Rattus norvegicus talin 1 (Tln1), mRNA 46.4 0.23 gb|BC100262.1| Rattus norvegicus talin 1, mRNA (cDNA clone MG... 46.4 0.23 gb|FJ185172.1| Callorhinchus milii prosapip1 (prosapip1), Ubo... 44.6 0.79 emb|FP101909.6| Zebrafish DNA sequence from clone CH73-137I19... 44.6 0.79 gb|AC189306.2| Brassica rapa subsp. pekinensis clone KBrB032C... 44.6 0.79 gb|AC131039.7| Mus musculus chromosome 1, clone RP23-274I23, ... 44.6 0.79 emb|AL669931.9| Mouse DNA sequence from clone RP23-31D18 on c... 44.6 0.79 dbj|AP012052.1| Microbacterium testaceum StLB037 DNA, complet... 42.8 2.8 gb|CP002383.1| Shewanella baltica OS678, complete genome 42.8 2.8 dbj|AP009153.1| Gemmatimonas aurantiaca T-27 DNA, complete ge... 42.8 2.8 gb|CP001252.1| Shewanella baltica OS223, complete genome 42.8 2.8 emb|CU611034.5| Mouse DNA sequence from clone RP24-176O7 on c... 42.8 2.8 emb|CR391965.9| Zebrafish DNA sequence from clone CH211-124O1... 42.8 2.8

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gb|CP000891.1| Shewanella baltica OS195, complete genome 42.8 2.8 gb|AC154497.2| Mus musculus BAC clone RP24-112C15 from chromo... 42.8 2.8 emb|AL928630.15| Mouse DNA sequence from clone RP23-33P17 on ... 42.8 2.8 emb|CR391414.1| Gallus gallus finished cDNA, clone ChEST654l15 42.8 2.8

Anexo 2.4:Alinhamentos das sequencias obtidas para isoformas dos genes da via de produção de melatonina, genes constitutivos e genes relógio em Phragmatopoma lapidosa:RPL37aDatabase: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


gb|HP904114.1| TSA: Exoneura robusta Contig10563.Exro mRNA se... 42.8 1.2 gb|EU369761.1| Carica papaya male Y chromosme BAC clone DM62K... 42.8 1.2 gb|CP000885.1| Clostridium phytofermentans ISDg, complete genome 42.8 1.2 gb|CP000724.1| Alkaliphilus metalliredigens QYMF, complete ge... 42.8 1.2 gb|AC126264.3| Mus musculus BAC clone RP23-376F13 from chromo... 42.8 1.2 gb|CP000053.1| Rickettsia felis URRWXCal2, complete genome 42.8 1.2 gb|EZ488175.1| TSA: Mustela putorius furo Ferret_c31736, comp... 41.0 4.1 gb|AC238780.1| Phlebotomus papatasi BAC clone PLPAAEX-20H12 f... 41.0 4.1 emb|FN357476.1| Schistosoma mansoni genome sequence supercont... 41.0 4.1 gb|CP001186.1| Bacillus cereus G9842, complete genome 41.0 4.1 gb|CP000440.1| Burkholderia ambifaria AMMD chromosome 1, comp... 41.0 4.1 gb|AC079386.23| Homo sapiens 12 BAC RP11-12K13 (Roswell Park ... 41.0 4.1 emb|AL713921.15| Mouse DNA sequence from clone RP23-475A8 on ... 41.0 4.1

TPHDatabase: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


ref|NM_001100634.2| Rattus norvegicus tryptophan hydroxylase ... 349 4e-93ref|NM_009414.2| Mus musculus tryptophan hydroxylase 1 (Tph1)... 300 2e-78gb|AY034600.1| Mesocricetus auratus tryptophane hydroxylase m... 289 4e-75ref|NM_001197191.1| Canis lupus familiaris tryptophan hydroxy... 255 7e-65ref|NM_001099955.1| Oryctolagus cuniculus tryptophan hydroxyl... 250 3e-63ref|NM_204956.1| Gallus gallus secretion regulating guanine n... 208 1e-50gb|EU796671.1| Pan troglodytes tryptophan hydroxylase 1 (TPH1... 161 1e-36ref|NM_001032676.1| Takifugu rubripes non-neuronal tryptophan... 152 7e-34gb|DQ334747.1| Acanthopagrus schlegelii tryptophan hydroxylas... 118 1e-23

ClockDatabase: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


dbj|AB019259.1| Rattus norvegicus clock mRNA for CLOCK-S, spl... 345 9e-92gb|AF000998.1|MMAF000998 Mus musculus CLOCK (Clock) mRNA, com... 300 3e-78emb|AJ318059.1| Spalax judaei mRNA for clock protein 282 9e-73gb|BC126159.1| Homo sapiens clock homolog (mouse), mRNA (cDNA... 246 6e-62ref|NM_001130932.1| Ovis aries clock homolog (mouse) (CLOCK),... 214 4e-52

114

ref|XM_002688257.1| PREDICTED: Bos taurus clock-like (LOC1003... 205 2e-49gb|AF097457.1|HSCLOCK16 Homo sapiens clock (CLOCK) gene, exon 20 174 3e-40gb|AF246959.1| Gallus gallus CLOCK (CLOCK) mRNA, complete cds 141 2e-30dbj|AB029889.1| Coturnix coturnix japonica qClock mRNA for ci... 136 8e-29

BmalDatabase: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


gb|HP228673.1| TSA: Placobranchus ocellatus 64829.Plocadult m... 51.8 0.003gb|AC022024.7| Homo sapiens chromosome 10 clone RP11-432B10, ... 50.0 0.012gb|CP000499.1| Pichia stipitis CBS 6054 chromosome 5, complet... 46.4 0.14 gb|AC121290.6| Mus musculus chromosome 16, clone RP23-84N4, c... 46.4 0.14 dbj|AB023042.1| Arabidopsis thaliana genomic DNA, chromosome ... 44.6 0.49 gb|AC243204.4| Rattus norvegicus Y Chr BAC RNECO-149P10 (Ampl... 42.8 1.7 gb|AC120404.25| Mus musculus chromosome 6, clone RP24-405O23,... 42.8 1.7 gb|AC079799.7| Homo sapiens BAC clone RP11-665O4 from 7, comp... 42.8 1.7 gb|AC146759.29| Medicago truncatula clone mth2-173e19, comple... 42.8 1.7 gb|CP000993.1| Borrelia recurrentis A1, complete genome 41.0 6.0 ref|XM_001453585.1| Paramecium tetraurelia hypothetical prote... 41.0 6.0 emb|AM447534.1| Vitis vinifera contig VV78X062970.18, whole g... 41.0 6.0

Cry1Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 15,639,775 sequences; 36,185,985,577 total letters


gb|AC206442.3| Pongo abelii BAC clone CH276-275I9 from chromo... 46.4 0.16 gb|AC197623.5| Rhesus Macaque BAC CH250-509F3 () complete seq... 46.4 0.16 emb|AL136524.24| Human DNA sequence from clone RP11-78L19 on ... 46.4 0.16 gb|AC121113.13| Mus musculus chromosome 1, clone RP23-53N22, ... 44.6 0.54 gb|AC005368.1| Homo sapiens chromosome 5, BAC clone 194j18 (L... 41.0 6.6 emb|CR933577.9| Zebrafish DNA sequence from clone CH211-243G1... 41.0 6.6 emb|CR858779.1| Pongo abelii mRNA; cDNA DKFZp469P0239 (from c... 41.0 6.6 gb|AC007357.2|F3F19 Arabidopsis thaliana chromosome 1 BAC F3F... 41.0 6.6

Per1Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,


dbj|BA000019.2| Nostoc sp. PCC 7120 DNA, complete genome 44.6 0.61 ref|XM_003107623.1| Caenorhabditis remanei hypothetical prote... 41.0 7.4 gb|EZ958505.1| TSA: Bemisia tabaci BT_Q_ZJU_Singletons166335 ... 41.0 7.4 ref|XM_001456537.1| Paramecium tetraurelia hypothetical prote... 41.0 7.4 gb|CP000117.1| Anabaena variabilis ATCC 29413, complete genome 41.0 7.4 gb|AC122520.2| Mus musculus BAC clone RP24-470M22 from 6, com... 41.0 7.4 gb|AC004257.1|AC004257 Homo sapiens chromosome 19, cosmid R33... 41.0 7.4 gb|AC134843.4| Mus musculus BAC clone RP24-388C21 from 3, com... 41.0 7.4

115

Anexo 3: Resultados do Microarranjo em Nematostella vectensis3.1: Genes com variação de ao menos 10x ao longo do dia nos regimes claro-

escuro, escuro constante e escuro constante com suplementação de melatonina

116

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3.2: Genes com variação de ao menos 10x ao longo do dia nos regimes claro-escuro e escuro constante.

117

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3.3: Genes com variação de ao menos 10x ao longo do dia nos regime claro-escuro.

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3.4: Genes com variação de ao menos 10x ao longo do dia nos regimes escuro constante e escuro constante com suplementação de melatonina

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152

3.5: Genes com variação de ao menos 10x ao longo do dia nos regimes claro- escuro e escuro constante com suplementação de melatonina

125

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127

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3.6: Genes com variação de ao menos 10x ao longo do dia no regime de escuro constante com suplementação de melatonina (apenas os 20 genes com maior variação)

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Rafael Peres Estudo da presença, da função e das vias ... · trabalhos nos mais diversos filos,...

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