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ntre as preocupações do pesquisador que trabalha comrecursos genéticos está a introdução do máximo possí-vel de acessos e, ao mesmo tempo, o impedimento da

UNIDADES DO IAC

Equiperesponsável pelas

quarentenasO Instituto Agronômico

implementou a Comissão deQuarentena, do Sistema de

Introdução e Quarentena dePlantas, conforme o D.O.E.,

Seção I, São Paulo,98(238), de 21 de

dezembro de 1988, ePortaria DG-15.

A composição atual destacomissão é a seguinte:

Fungos: Sérgio Almeida deMoraes e Christina

Dudienas; Patologia desementes: Margarida

Fumiko Ito e MariaAparecida de SouzaTanaka; Bactérias:

Valdemar Atílio MalavoltaJúnior e Mauro Hideo

Sugimori; Nematóides:Rubens Rodolfo

Albuquerque Lordello e AnaInês L. Lordello; Vírus:

Valdir Atsushi Yuki. e HugoKuniyuki; Insetos: André

Luiz Lourenção e JoséPolese Soares Novo;Quarentena: Renato

Ferraz de Arruda Veiga eWilson Barbosa; Teste

Eliza e PCR: José AlbertoCaram de Souza Dias e

Aiko Enok Sawasaki.

Atribuições dacomissão internade quarentenado IAC

São atribuições daComissão:

a) abertura, inspeção eliberação de materialintroduzido;

b) incineração eexpurgo, paraembalagens egermoplasma de transitoproibido ou restrito;

c) inspeções rotineirasno quarentenário;

d) fixação do prazo dequarentena;

e) manutenção doarquivo de acesso,liberação e destino domaterial recebido erespectivas atas. Quandonecessário, sãoconsultadospesquisadoresfitotecnistas do IAC,assim como especialistasde instituiçõescongêneres.

Eentrada de novas pragas. O Instituto Agronômico – IAC–vem enfrentando esse desafio desde sua criação, principal-mente, pelo trabalho de pesquisadores abnegados como CarlosArnaldo Krug, que trabalhou nessa área de 1928 a 1934,Alcides Carvalho, de 1934 a 1950, Luiz Aristêo Nucci, de1950 a 1958 e Emílio Bruno Germek, de 1958 a 1981.

Hoje, com seu Complexo Quarentenário, o IAC vem re-alizando quarentenas dentro de uma moderna estrutura, base-ada em modelos quarentenários internacionais. Localizado a22º54’S e 47º05’W, em altitude de 674 m, com área total de782 m2, em Campinas (SP), vem mantendo um fichário con-tendo dados de passaporte de cada acesso e uma “sementeca”com amostras dos acessos introduzidos na instituição. Suasdependências constam de oito salas para quarentena, sala deabertura de volumes e estruturas de apoio em conservação invitro, conservação de sementes a frio e conservação in vivo.

Esse Quarentenário segue a legislação fitossanitária bra-sileira, a qual atende às “Normas e ProcedimentosQuarentenários de Intercâmbio Internacional de Vegetais eSolo”, constantes da Portaria nº 148 de 15 de junho de 1992.O IAC submeteu-se a inspeções do Ministério da Agricultu-ra, Pecuária e Abastecimento (MAPA), após as quais, de acor-do com a Portaria nº 56 de 11 de maio de 1998, DO nº 91 de15 de maio de 1998, passou a ser credenciado, por prazoindeterminado, para realizar quarentena de vegetais e solo.Logo a seguir, submeteu-se às inspeções da Comissão Técni-ca Nacional de Biossegurança – CTNBio , ficando qualifica-do para efetivar quarentenas de transgênicos desde 4 de se-tembro de 1998, da qual recebeu o Certificado de Qualidadee Biossegurança número 0065/98.

Como presta serviços tanto para o público interno comoexterno, quer seja na inspeção, quarentena e liberação de ma-terial isento de patógenos exóticos, conta com o apoio im-prescindível de uma Comissão Interna de Quarentena, a qualé composta por pesquisadores dos Centros de Pesquisa e De-senvolvimento de Fitossanidade, de Ecofisiologia e Biofísicae de Recursos Genéticos Vegetais, contando também com oapoio dos melhoristas dos Centros de Análise e PesquisaTecnológica do Agronegócio do Café, de Grãos e Fibras e deHorticultura, bem como dos Centros Avançados de PesquisaTecnológica do Agronegócio de Cana, de Citros e de Frutas.

QUARENTENÁRIODE PLANTAS NO INSTITUTO AGRONÔMICO

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Metodologia utilizadapela comissão na detecção de pragas

Abertura de volumesA abertura de volumes é efetuada logo

na chegada do material ao ComplexoQuarentenário do IAC, em sala especialmen-te construída para se evitar o escape de inse-tos. Nessa sala realiza-se uma inspeção pre-liminar onde é verificado o estado geral dogermoplasma, abrindo-se os volumes cuida-dosamente e examinado-os por meio deestéreo-microscópio. Em uma primeira ava-liação, utilizando-se de um Formulário deExame Fitossanitário, descreve-se o estadogeral da amostra por intermédio do qual de-terminam-se as prioridades de examesfitossanitários a serem efetivadas. Toda aembalagem original é trocada e a antiga équeimada, autoclavada ou expurgada. Apósesse trabalho, ainda na sala de abertura, éexecutada a inspeção pelos especialistas ementomologia, em patologia de sementes ou emmicologia. Examinados os materiais eefetuadas as medidas sanitárias sugeridas pe-los especialistas, procede-se o expurgo comFosfina, por 72 horas e, a seguir, executa-seo plantio no Complexo Quarentenário. Amos-tras do material podem ser enviadas para oslaboratórios de nematologia e patologia de se-mentes. A partir daí, prossegue-se com as ins-peções durante o desenvolvimento das plan-tas, com as inspeções de vírus e fungos.

Patologia de sementesSegundo as pesquisadoras Margarida

Fumiko Ito e Maria Aparecida de Souza Tanaka,para a patologia de sementes é utilizado o mé-todo do papel de filtro (“blotter test”) onde assementes são distribuídas, em número variável(dependendo do tamanho da amostra),eqüidistantes entre si, sobre três folhas de papelde filtro ou papel mata-borrão, previamenteumedecidas em água destilada e esterilizada econtidas em recipientes como placas de Petriou caixas Gerbox. A escolha do recipiente de-pende do tamanho da semente. Por exemplo,para sementes de soja, feijão ou milho, utili-zam-se placas de Petri de 9 cm de diâmetro,com 10 sementes por placa. Para sementes me-nores, pode-se colocar maior número de semen-tes por placa, tomando-se o cuidado de mantercerta distância entre as mesmas, para evitar con-taminações de uma semente para outra e inter-ferência nos resultados. Para sementes maio-res e mais altas, as caixas Gerbox são maisindicadas.

Após isso, o as sementes são incubadaspor sete ou oito dias à temperatura de 20-22ºC, sob fotoperíodo de 12 horas, utilizan-do-se luz fluorescente de 40 watts, tendo esteúltimo procedimento a finalidade de induzira esporulação. A avaliação consiste na iden-tificação dos fungos sobre as sementes e é rea-lizada após a incubação, examinando-se, indi-vidualmente, todas as sementes em estéreo-mi-croscópio, com aumento de cinqüenta vezes.Quando necessário, a identificação do patógenoé complementada pelo exame de lâminas emmicroscópio composto.

Outro método, é o plaqueamento emAgar, que consiste na colocação das semen-tes em placas de Petri contendo meio de BDA(batata 20 g, dextrose 20 g, Agar 15-17 g, águadestilada 1.000 ml), eqüidistantes entre si emantendo distância suficiente para não ha-ver contaminação. Para esse procedimentoutiliza-se a câmara de fluxo laminar e o nú-mero de sementes por placa é variável, emfunção do tamanho da semente. Antes doplaqueamento, as sementes são submetidas aum pré-tratamento com solução de hipocloritode sódio a 1%, que tem por finalidade aassepsia superficial, para evitar o crescimen-to de saprófitas contaminantes. A incubaçãoé realizada nas mesmas condições descritaspara o método do papel de filtro.

A identificação dos fungos é feita pelaobservação das colônias formadas sobre assementes ou no meio de cultura, em tornodelas, baseando-se em características comoforma, tamanho, coloração. A identificaçãodos patógenos é complementada pelo exameem lâminas ao microscópio, das estruturasfúngicas. Esse método é recomendado quan-do se suspeita da presença de patógenos paraos quais o teste em papel de filtro não favo-rece o crescimento de estruturas típicas, quepermitam a identificação precisa.

MicologiaSegundo os pesquisadores Maria Angé-

lica Pizinatto e Sérgio Almeida de Moraes, aanálise micológica pode ser realizada poridentificação direta com estereomicroscópioótico, no caso de a planta hospedeira apre-sentar sintomas (lesões) com esporos do fun-go quarentenário. Quando ocorre a ausênciade esporos do fungo, esse tecido vegetal é co-locado em câmara úmida, constituída de cai-xa gerbox contendo papel de filtro umedeci-do com água esterilizada, incubado por 24-48 h e posteriormente também é identificadocom a ajuda de estereomicroscópio ou micros-cópio ótico. Pode-se, também, isolar o fun-go da planta hospedeira efetuando-se o cortedo tecido infectado na zona de transição sa-

dio/doente da planta hospedeira, proce-dendo-se à desinfecção do tecido com ál-cool seguida de imersão em solução dehipoclorito de sódio a 1%, por 1,5 minu-tos, sendo o tecido cortado em pedaços ecolocado em placas de Petri contendo meiode cultura BDA (Batata Dextrose Ágar) efinalmente incubado em câmara com con-trole de temperatura, por 4-7 dias.

O isolamento de fungos em resíduos desolo ou substratos diversos (turfa, vermiculitaetc.) é realizado pesando-se 1 g do material,que é a seguir colocado em tubo de ensaiocom 9 ml de água destilada esterilizada e agi-tado-se por 1 minuto. A diluição é feita emsérie com plaqueamento em meio de cultura(meio de Martim e BDA) com 0,1 ml da sus-pensão por placa (3 placas por diluição) e in-cubação em câmara com controle de tempe-ratura, por 4-7 dias. A avaliação é efetivadapela contagem do número de colônias e iden-tificação genérica ou específica.

EntomologiaSegundo os pesquisadores André Luiz

Lourenção e José Poleze Soares Novo, emplantas vivas (enraizadas e materialpropagativo), o procedimento é o de realizar-se o exame direto na planta com lupa e reti-rada de estruturas (folhas, ramos, flores, fru-tos, raízes) para exame em laboratório usan-do-se microscópio estereoscópio. Todo omaterial suspeito será mantido isolado emgaiolas, placas de Petri ou outro recipienteadequado a esse fim até a possível eclosão delarvas ou emergência de adultos.

Para sementes e grãos efetua-se o exa-me direto sob microscópio estereoscópio emanutenção de amostras em recipientes ade-quados para observação de possível emergên-cia de insetos, ácaros ou outros artrópodos.

Em substratos utilizados para plantio efe-tiva-se o exame direto sob microscópioestereoscópio e manutenção de amostras emrecipientes adequados para observação depossível emergência de insetos, ácaros ououtros artrópodos.

Os procedimentos para identificação deorganismos detectados seguem o preparo,onde o organismo detectado será preparado/conservado de acordo com as técnicas preco-nizadas ao grupo ou ao estágio de desenvol-vimento (larva, pupa, adulto etc) e a identifi-cação, onde o organismo será enviado a es-pecialista do grupo para correta identificação.

Plantas daninhasSegundo os pesquisadores Robert

Deuber e Maria do Carmo de Salvo SoaresNovo, para plantas daninhas a observação éefetuada inicialmente com lupas de mesa, emamostras tomadas de todos os recipientes (sa-cos, pacotes, caixas etc.) e colocadas em pla-cas de vidro. Em caso de dúvida quanto àpresença de propágulos nas amostras exami-nadas, o material é colocado para germinar,em substratos adequados, para a verificaçãoda possível contaminação.

Quarentena de Heliconia

Quarentena de Grama

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Os lotes de sementes introduzidos, namaioria das vezes, vêm limpos e livres de im-purezas, mas mesmo assim passam pelo ser-viço de inspeção. Para evitar a introdução, olote de sementes necessita ser analisado qua-litativamente. É feito o exame de pureza paraverificar a presença de sementes nocivas econtaminantes e caso sejam detectadas pro-cede-se à identificação taxonômica. Para esteúltimo item deve-se observar a forma, o ta-manho, a coloração, a textura e a superfíciedo tegumento ou pericarpo assim como a pre-sença ou ausência de aristas das sementes.

Plântulas são geralmente identificadaspor meio de Manuais. Plantas inteirasaderidas podem ser identificadas utilizandochaves dicotômicas. Quando se tratar de es-taca é necessário observar se há algumaplântula ou estrutura vegetal estranha à espé-cie. Nas plântulas deve-se observar a formada raiz, se é produtor de bulbo ou de tubércu-lo e as características fenotípicas das hastes.

VírologiaSegundo os pesquisadores Valdir

Atsushi Yuki, Hugo Kuniyuki, José AlbertoCaram de Souza Dias e Haiko Enok Sawazaki,a detecção de vírus é feita de acordo com osseguintes métodos: (a) estudo da sintoma-tologia, baseada na observação das reaçõesdas plantas sob inspeção, das plântulas de-las originadas, das plantas indicadoras devírus e nas comparações com as descritasna literatura especializada, incluindo o cír-culo de hospedeiras; (b) teste detransmissibilidade, efetuada medianteinoculação mecânica para plantas testes her-báceas comumente empregadas em virologiavegetal para detecção de vírus ou por união

de tecidos. A aplicabilidade des-ses métodos depende exclusiva-mente das característicasvegetativas de cada espécie ve-getal, das propriedades intrínse-cas dos vírus quanto a transmi-ssibilidade e da maior ou menorcapacidade de as plantas exibi-rem sintomas à infecção por ví-rus; (c) o teste Eliza é aplicadoquando existe a sorologia paraos fungos que se deseja detec-tar e o teste de PCR para quandoexista a necessidade de se com-plementar as informações dasobservações sintomatológicas.

BacteriologiaSegundo os pesquisadores Mauro

Hideo Sugimori e Oswaldo Paradela Filho, ametodologia utilizada para essa finalidade, éfeita com a realização da coleta do materialsuspeito, em seguida esse material émacerado e semeado em meios de culturaespecíficos para ocorrer o crescimento e de-senvolvimento da bactéria. Da bactéria iso-lada e purificada faz-se a sua taxonomia pormeio de vários testes bioquímicos, fisiológi-cos e sorológicos. Realizados os testes co-nhecidos e rotineiros, determina-se opatógeno quanto ao gênero e espécie.

NematologiaSegundo os pesquisadores Rubens

Rodolfo A. Lordello e Ana Inês LucenaLordello, para nematóides, caso as amos-tras não forem processadas logo após acoleta na introdução, elas devem ser esto-cadas em geladeira de 10o a 5o C.

Na extração de formas livres no solo,o método mais amplamente utilizado é o mé-todo de centrifugação, que combina openeiramento e flotação centrífuga. Esse mé-todo tem a vantagem de permitir a extraçãode estágios ativos e não móveis, sendo con-seqüentemente mais eficiente. O método defunil de Baermann e suas modificações sãoamplamente utilizados com o inconvenientede extrair apenas nematóides com boa mobi-lidade. Para nematóides grandes do tipo dosgêneros Longidorus e Xiphinema, o métodode peneiramento e catação individual é o maisindicado.

Na extração de cistos, no caso deHeterodera e Globodera, a amostra deve serparcial ou totalmente seca ao ar. Isso podeser feito espalhando-se a terra em bandejasou, se os sacos forem porosos, as amostraspodem ser deixadas em local onde haja ven-tilação constante. A seguir as amostras, com100 cm3, devem ser destorroadas e peneira-das (peneira de 24 e 60 mesh) e o materialretido na peneira 60 é examinado em micros-cópio estereoscópico, sobre discos de papelde filtro branco.

A extração de nematóide, em estacasenraizadas, pode ser uma extração direta ondepequenas porções de tecidos são examinadasutilizando-se um estereomicroscópio. Na ex-tração de formas ativas e móveis as técnicasmais utilizadas são as de extração deBaermann e incubação de Young, embora osmétodos de maceração-peneiramento oucentrifugação, trituração em liquidificador epeneiramento sejam os mais eficientes, poisremovem os nematóides independentementeda sua atividade. Em extração de formas se-dentárias utiliza-se a lavagem direta em pe-neiras largas (32 mesh) e estreitas (325 mesh)concomitantemente e, quando necessário, ou-tros métodos tais como maceração epeneiramento, maceração e flotação centrí-fuga, são utilizados.

Renato Ferraz de Arruda Veiga, WilsonBarbosa, Antonio Fernando CaetanoTombolato, Antonio Alberto Costa,Romeu Benatti JúniorPesquisador científico. IAC, Jardim Botânico.fone: (19) 3241-5188 ramais 427 e 330endereço eletrônico: veiga@iac.sp.gov.br

Quarentenas realizadas no IAC, de 2000 a 2003, com país de origem, cultura introduzida e número de acessos por ano, em Campinas (SP)

Fachada do Quarentenário

R e s u l t a d o sCom este trabalho o IAC tem colaborado significativamente com a defesa

fitossanitária brasileira, evitando-se assim a introdução de pragas exóticas na agri-cultura do país. Desde a sua criação, a Comissão de Quarentena do IAC já inspe-cionou 432 acessos, em sistema de quarentenário (Quadro abaixo).