QSAR 2D/3D E DOCAGEM DE INIBIDORES DA ENZIMA DYRK1A … · docagem molecular utilizando o programa...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE QUÍMICA

FELIPE DIAS LEAL

QSAR 2D/3D E DOCAGEM DE INIBIDORES DA ENZIMA

DYRK1A COMO POTENCIAIS FÁRMACOS CONTRA A

DOENÇA DE ALZHEIMER

RIO DE JANEIRO 2015

Felipe Dias Leal

QSAR 2D/3D E DOCAGEM DE INIBIDORES DA ENZIMA DYRK1A COMO POTENCIAIS FÁRMACOS CONTRA A DOENÇA DE ALZHEIMER

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.

Orientadores: Profa. Dra. Magaly Girão Albuquerque Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues

Rio de Janeiro 2015

L435 Leal, Felipe Dias.

QSAR 2D/3D e docagem de inibidores da enzima DYRK1A como potenciais fármacos contra a doença de Alzheimer / Felipe Dias Leal – Rio de Janeiro : UFRJ, 2015.

159 f.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Química, 2015.

Orientadores: Magaly Girão Albuquerque e Carlos Rangel Rodrigues

1. QSAR 2D/3D. 2. Docagem molecular. 3. Doença de Alzheimer. 4. 6-arilquinazolina-4-aminas. 5. Química medicinal. I. Albuquerque, Magaly Girão.II. Rodrigues, Carlos Rangel. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Química. IV. Título.

CDD 615

AGRADECIMENTOS

Definitivamente, não somos nada sozinhos. Quando me recordo dos anos de

doutorado, percebo quanta gente contribuiu para que eu pudesse apresentar esta tese.

São tantas pessoas que até me preocupa não lembrar todas.

Primeiramente, agradeço a Deus, meu Senhor e Salvador. Só a permissão Dele

fez com que isto fosse possível. Espero ser capaz de retornar aos meus irmãos na

sociedade os frutos desta titulação, pois sei que Ele conta com isso.

Em seguida, aos meus pais, Luis Fernando e Alda Maria, os primeiros

incentivadores da minha carreira acadêmica e meus mestres, tanto da vida como da

arte de ensinar. À minha esposa, Ana Carolina, que tanto me apoiou e que

compreendeu minhas ausências em função da dedicação que um curso de doutorado

exige. Aos meus avós, Luiz e Alda (in memoriam), que tanto zelo tiveram comigo

durante este período e, também, à minha irmã, Fernanda. Realmente, nenhuma palavra

poderá expressar minha gratidão. Meu amor por cada um de vocês será eterno.

À minha orientadora, Magaly, primeiramente, por aceitar o desafio de orientar um

aluno oriundo de outro laboratório, já com quatro anos de doutorado e tendo que

recomeçar uma tese do zero e também por me ensinar o que é ser um orientador de

verdade. Este belíssimo exemplo levo comigo como um dos principais aprendizados

deste curso. Estendo este agradecimento ao meu co-orientador, Prof. Carlos e à Profa.

Helena, pelas contribuições dadas ao meu trabalho.

Às minhas chefes da Farmácia Universitária, Professoras Rita e Elisabete, e do

INTO, Cláudia e Zilda, pela flexibilização de horários que me permitiram desempenhar

essa difícil tarefa de trabalhar e concluir uma pós-graduação de excelência.

Ao Prof. Ricardo Bicca e aos colegas de LabMMol, Eugênio e Daniel, pela

convivência sempre cordial e, em especial, ao Camilo, meu amigo e companheiro de

trabalho no laboratório aos fins de semana, pelos ensinamentos e discussões

científicas sempre construtivas.

Aos meus amigos de LabDop, Bruno, Vinícius, Fernanda, Gustavo e Marco, com

os quais convivi boa parte do curso de doutorado e trouxeram grandes alegrias em

tempos de tribulação.

Aos meus amigos Marcelo e Cristiano que, por também saberem como é cursar

um doutorado com tantas outras obrigações, sempre me brindaram com palavras de

incentivo durante todo o precurso.

Enfim, aos meus professores da pós-graduação, por todo o conhecimento

adquirido e aos componentes da banca por todas as contribuições dadas a este

trabalho.

“Comece fazendo o necessário, depois, o que

é possível e, de repente, você estará fazendo

o impossível.”

São Francisco de Assis

RESUMO

LEAL, Felipe Dias. QSAR 2D/3D e docagem de inibidores da enzima DYRK1A como

potenciais fármacos contra a doença de Alzheimer. Rio de Janeiro, 2015. Tese

(Doutorado em Química) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Rio de Janeiro, 2015

Este trabalho descreve estudos de modelagem molecular aplicados a uma série

congênere de 46 derivados da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas, sintetizados e

avaliados farmacologicamente como inibidores da quinase-1A de especificidade dual

regulada via fosforilação da tirosina (DYRK1A), uma enzima que participa ativamente

de mecanismos de desenvolvimento da doença de Alzheimer, sendo um potencial alvo

terapêutico. Primeiramente, foram realizados estudos de relação quantitativa estrutura-

atividade em duas e três dimensões (QSAR 2D/3D), os quais permitiram a construção

de modelos capazes de predizer atividades biológicas de compostos ainda não

sintetizados e indicar grupos funcionais na estrutura dos ligantes que sejam

responsáveis pelo aumento ou redução da atividade biológica dos mesmos. No estudo

de QSAR 2D, foi aplicado o método de holograma QSAR (HQSAR) e, no estudo de

QSAR 3D, foram aplicados os métodos de análise comparativa de campos moleculares

(CoMFA) e análise comparativa de índices de similaridade moleculares (CoMSIA). Os

modelos foram analisados e todos apresentaram parâmetros estatísticos aceitáveis,

resultando em modelos robustos e com boa capacidade preditiva (HQSAR: q2 = 0,757;

CoMFA: q2 = 0,608; CoMSIA: q2 = 0,713). Em seguida, foram realizados estudos de

docagem molecular utilizando o programa Molegro Virtual Docker. Este método permitiu

um melhor entendimento no modo de ligação dos derivados estudados à enzima alvo e,

também, à corroboração de hipóteses desenvolvidas nos estudos de QSAR. Estes

estudos permitiram a proposta de quatro novos análogos desta série a serem avaliados

como inibidores da DYRK1A.

Palavras-chave: QSAR 2D/3D, docagem molecular, 6-arilquinazolina-4-aminas,

doença de Alzheimer

ABSTRACT

LEAL, Felipe Dias. QSAR 2D/3D e docagem de inibidores da enzima DYRK1A como

potenciais fármacos contra a doença de Alzheimer. Rio de Janeiro, 2015. Tese

(Doutorado em Química) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Rio de Janeiro, 2015

Molecular modeling studies were applied to a series of 46 6-arylquinazolin-4-

amine derivatives, which were sinthetized and pharmacologically evaluated as dual

specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase-1A (DYRK1A) inhibitors. The

DYRK1A enzyme is actively involved in mechanisms of the Alzheimer’s disease

development, thus being a potential therapeutic target for its treatment. Firstly, it were

carried out two and three dimensional quantitative structure-activity relationship (2D/3D

QSAR) studies, which allowed the development of models capable of predicting

biological activities of non-sinthetized compounds and indicating functional groups of the

inhibitors responsible for increasing or decreasing their biological activities. In the 2D

QSAR study, it was applied the hologram QSAR (HQSAR) method and in the 3D QSAR

study, it were applied the Comparative Molecular Field Analysis (CoMFA) and

Comparative Molecular Similarity Index Analysis (CoMSIA) methods. The models were

statistically analysed and all of them presented acceptable statistic parameters, resulting

in statistically robust models and with good predictive capability (HQSAR: q2 = 0.757;

CoMFA: q2 = 0.608; CoMSIA: q2 = 0.713). Subsequently, it were performed molecular

docking studies using the Molegro Virtual Docker program. This approach allowed a

better understanding about the binding mode between the inhibitors and the target

enzyme, supporting the hypotheses developed in the 2D/3D QSAR approach. These

studies enabled the proposal of four new analogs of this series to be evaluated as

DYRK1A inhibitors.

Keywords: 2D/3D-QSAR, molecular docking, 6-arylquinazolin-4-amines, Alzheimer’s

disease

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Comparação entre cortes cerebrais de um cérebro de um paciente com

DA e um cérebro normal (Adaptado de HOLTZMAN; MORRIS; GOATE, 2013).

29

Figura 2. Fotomicrografia de uma placa amiloide (PA) e de um emaranhado

neurofibrilar (ENF) (Adaptado de HOLTZMAN; MORRIS; GOATE, 2011).

29

Figura 3. Estrutura tridimensional em modelo de fita da DYRK1A humana e

detalhe do sítio de autofosforilação composto por um resíduo de tirosina

fosforilado (O3POTyr321 = pTyr321) e dois resíduos de arginina (Arg325 e

Arg328) (Adaptado de OGAWA et al., 2010).

34

Figura 4. Sítio de ligação do INDY (inibidor de DYRK) à DYRK1A humana

(Adaptado de OGAWA et al., 2010).

35

Figura 5. Sítio de ligação dos derivados 3 (A) e 32 (B) da classe das pirido[2,3-

d]pirimidinas à DYRK1A humana (Adaptado de ANDERSON et al., 2013).

36

Figura 6. Contribuição da superexpressão da DYRK1A para a β-amiloidose e

degeneração neurofibrilar em doenças neurodegenerativas. ASF – Fator

Alternativo de Splicing; PPA – Proteína Precursora Amiloide; ENFs –

Emaranhados Neurofibrilares (Adaptado de WEGIEL; GONG; HWANG, 2011).

38

Figura 7. Estrutura química da harmina. 41

Figura 8. Estrutura química do galato de epigalocatequina (epigalocatequina-3-

galato, EGCG).

42

Figura 9. Estruturas químicas dos compostos INDY e TG003. 43

Figura 10. Estrutura geral do composto mais ativo da série de derivados

pirido[2,3-d]pirimidinas.

43

Figura 11. Estrutura geral da série de derivados 6-arilquinazolina-4-aminas. 44

Figura 12. Esquema geral do desenvolvimento de um modelo de QSAR

(Adaptado de MYINT; XIE, 2011).

48

Figura 13. Esquema geral da geração de hologramas moleculares e modelos de

HQSAR (Adaptado de MYINT; XIE, 2011).

51

Figura 14. Representação de um mapa de contribuição de um ligante da série

de ácidos 2-(oxalilamino) benzoicos (Adaptado de CHENG et al., 2010).

52

Figura 15. Diagrama representando os potenciais eletrostático (Coulomb) e de

van der Waals (Lennard-Jones) em função da distância interatômica (Adaptado

de KUBINYI, 2003).

55

Figura 16. Esquema geral da análise por CoMFA (Adaptado de MYINT; XIE,

2011).

56

Figura 17. Gráfico da distribuição dos valores de atividade biológica (pIC50) dos

36 compostos (Rosenthal et al. 2010; 2011) do grupo de treinamento.

70

Figura 18. Gráfico da distribuição dos valores de atividade biológica (pIC50) dos

10 compostos (Rosenthal et al. 2010; 2011) do grupo de teste.

71

Figura 19. Modelo de ligação do inibidor DJM2005 à DYRK1A humana

(Adaptado de SOUNDARARAJAN et al., 2013).

74

Figura 20. Estruturas químicas dos compostos 24 e DJM2005 usados na

definição da hipótese farmacofórica.

74

Figura 21. Gráfico dos valores de pIC50 preditos versus os valores de pIC50

experimentais para os grupos de treinamento (azul) e de teste (vermelho),

utilizando o melhor modelo de HQSAR com o parâmetro de distinção de

fragmentos A/L/C/Q/DA.

90

Figura 22. Gráfico dos valores de pIC50 preditos versus os valores de pIC50



fragmentos A/L.

91

Figura 23. Mapas de contribuição para os compostos mais ativo (24) e menos

ativo (6), segundo os melhores modelos A/L/C/Q/DA (A) e A/L (B). As estruturas

dos compostos estão representadas em modelo bastão e apenas os

heteroátomos estão representados pela letra do elemento químico (Cl, N, O, S).

O espectro do amarelo ao verde indica que o fragmento tem contribuição positiva

para a atividade biológica; o espectro do laranja ao vermelho indica que o

fragmento tem contribuição positiva para a atividade biológica; a cor branca

indica que o fragmento tem contribuição neutra para a atividade biológica e a cor

azul representa a estrutura comum a todos os compostos da série.

93

Figura 24. (A) Estrutura comum calculada pelo método distill rigid para a série

das 6-arilquinazolina-4-aminas. (B) Sobreposição dos 46 derivados.

96

Figura 25. Gráfico com os valores de pIC50 preditos versus os valores de pIC50


utilizando o melhor modelo de CoMFA (átomo de prova: H +1; método de cálculo

das cargas parciais: AM1; nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1 e espaçamento

da grade: 1,0 Å).

103

Figura 26. Mapas de contorno do melhor modelo de CoMFA (átomo de prova: H

+1; método de cálculo das cargas parciais: AM1; nível de corte de energia: 30

kcal.mol-1 e espaçamento da grade: 1,0 Å) obtido para o composto 24 (modelo

em bastão e colorido por elementos). (A) O mapa estérico indica as áreas onde

grupos volumosos aumentam (verde) ou diminuem (amarelo) a atividade

biológica. (B) O mapa eletrostático indica áreas onde grupos com grande

densidade eletrônica ou carga negativa aumentam (vemelho) ou diminuem (azul)

a atividade biológica.

106

Figura 27. Mapa de contorno estérico do melhor modelo de CoMFA (átomo de

prova: H +1; método de cálculo das cargas parciais: AM1; nível de corte de

energia: 30 kcal.mol-1 e espaçamento da grade: 1,0 Å) obtido para o composto

46 (modelo em bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde

grupos volumosos aumentam (verde) ou diminuem (amarelo) a atividade

biológica.

108

Figura 28. Mapa de contorno eletrostático do melhor modelo de CoMFA (átomo

de prova: H +1; método de cálculo das cargas parciais: AM1; nível de corte de

energia: 30 kcal.mol-1 e espaçamento da grade: 1,0 Å) obtido para o composto 6

(modelo em bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde grupos

com alta densidade eletrônica aumentam (vermelho) ou diminuem (azul) a

atividade biológica.

109

Figura 29. Gráfico com os valores de pIC50 preditos versus os valores de pIC50

experimentais para os grupos de treinamento (azul) e de teste (vermelho)

utilizando o melhor modelo de CoMSIA.

116

Figura 30. Mapa de contorno eletrostático do melhor modelo de CoMSIA (átomo

de prova: H +1; método de cálculo das cargas parciais: AM1; nível de corte de

energia: 30 kcal.mol-1; espaçamento da grade: 1,0 Å; campos moleculares:

estérico, hidrofóbico e doador de ligação hidrogênio; fator de atenuação 0,2)

obtido para o composto 24 (modelo em bastão e colorido por elementos),

mostrando as áreas onde grupos com alta densidade eletrônica aumentam

(vermelho) ou diminuem (azul) a atividade biológica.

118

Figura 31. Estrutura química do composto 24 com as cargas parciais calculadas

pelo método AM1 destacadas para os átomos de oxigênio e carbono do anel 1,3-

benzo-dioxola.

118

Figura 32. Mapa de contorno hidrofóbico do melhor modelo de CoMSIA (átomo

de prova: H +1; método de cálculo das cargas parciais: AM1; espaçamento da

grade: 1,0 Å; campos moleculares: estérico, hidrofóbico e doador de ligação

hidrogênio; fator de atenuação 0,2) obtido para o composto 24 (modelo em

bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde grupos hidrofóbicos

aumentam (amarelo) ou diminuem (roxo) a atividade biológica.

119







120







121

Figura 35. Mapa de contorno doador de ligação hidrogênio do melhor modelo de

CoMSIA (átomo de prova: H +1; método de cálculo das cargas parciais: AM1;

espaçamento da grade: 1,0 Å; campos moleculares: estérico, hidrofóbico e

doador de ligação hidrogênio; fator de atenuação 0,2) obtido para o composto 24

(modelo em bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde grupos

doadores de ligação hidrogênio aumentam (azul claro) ou diminuem (preto) a


122

Figura 36. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre o anel quinazolina

da série de derivados 6-arilquinazolina-4-aminas, representada pelo enantiômero

R do composto 34, e os principais resíduos de aminoácidos da DYRK1A. A

interação via ligação hidrogênio está representada pela cor verde e as interações

hidrofóbicas pela cor rosa.

126

Figura 37. Mapa de superfície da DYRK1A construído no programa Discovery

Studio Visualizer versão 4.1 (Accelrys Software Inc), indicando áreas da proteína

contendo grupos doadores e aceptores de ligação hidrogênio, usando o

enantiômero R do composto 34 como exemplo de ligante.

127

Figura 38. Mapa de superfície da DYRK1A construído no programa Discovery

Studio Visualizer versão 4.1 (Accelrys Software Inc), indicando áreas

hidrofóbicas e hidrofílicas com o composto 34 como exemplo de ligante.

128

129

Figura 39. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre o composto 24

(mais ativo) e os principais resíduos de aminoácidos da DYRK1A. A ligação

hidrogênio está representada pela cor verde, as interações do tipo dipolo-dipolo

estão representadas pela cor azul e as interações hidrofóbicas pela cor rosa.

Figura 40. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre o composto 6

(menos ativo) e os principais resíduos de aminoácidos da DYRK1A. As

interações do tipo dipolo-dipolo estão representadas pela cor azul e as

interações hidrofóbicas pela cor rosa.

130

Figura 41. Estruturas químicas das soluções obtidas para o composto 29 (outlier

nos estudos de CoMFA/CoMSIA) durante o processo de docagem molecular.

Solução 1 é a melhor obtida segundo o PLANTS Score e a Solução 2 é a melhor

obtida segundo o Rerank Score.

131

Figura 42. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre a solução 1

(PLANTS Score) do composto 29 (outlier nos estudos de CoMFA/CoMSIA) e os

principais resíduos de aminoácidos da DYRK1A. As interações do tipo dipolo-

dipolo estão representadas pela cor azul, as interações hidrofóbicas pela cor

rosa e a interação com o átomo de enxofre pela cor amarela.

133

Figura 43. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre a solução 2

(Rerank Score) do composto 29 (outlier nos estudos de CoMFA/CoMSIA) e os

principais resíduos de aminoácidos da DYRK1A. As interações hidrofóbicas pela

cor rosa e a interação desfavorável entre grupos doadores de ligação hidrogênio

pela cor vermelha.

134

Figura 44. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre o anel

tetraidrofurano presente na região R3 dos enantiômeros R (A) e S (B) do

composto 32 e um resíduo de aminoácido da DYRK1A. As interações

hidrofóbicas são representadas pela cor rosa.

135


tetraidropirano presente na região R3 dos enantiômeros R (A) e S (B) do

composto 33 e resíduos de aminoácidos da DYRK1A. As interações hidrofóbicas

são representadas pela cor rosa e as interações dipolo-dipolo pela cor azul.

136


tetraidrofurano presente na região R3 dos enantiômeros R (A) e S (B) do

composto 34 e um resíduo de aminoácido da DYRK1A. As interações

hidrofóbicas são representadas pela cor rosa.

136

Figura 47. Estruturas químicas dos compostos propostos A1 e A2 e dos seus

respectivos análogos. (A) Composto A1 é análogo ao composto 36. (B)

Composto A2 é análogo ao composto 24. (C) Composto 36. (D) Composto 24.

138

Figura 48. Estruturas químicas dos compostos propostos A3 e A4 e dos seus

respectivos análogos. (A) Composto A3 é análogo ao enantiômero (R) do

composto 34. (B) Composto A4 é análogo ao enantiômero (S) do composto 34.

(C) Enantiômero (R) do composto 34. (D) Enantiômero (S) do composto 34.

139

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Parâmetros de distinção dos fragmentos moleculares empregados no

método HQSAR.

50

Tabela 2. Estruturas químicas dos 46 compostos da classe das 6-arilquinazolina-

4-aminas e seus respectivos valores de IC50 (nM) e pIC50. Os compostos do

conjunto de teste estão marcados com um asterisco.

64

Tabela 3. Resumo dos índices estatísticos dos modelos de HQSAR para as

diversas combinações de distinção de fragmentos (DF), utilizando o tamanho

padrão de fragmentos (4-7 átomos) para os derivados da série das 6-

arilquinazolina-4-aminas (N=36). Os quatros melhores modelos estão

assinalados em negrito.

83


diversas combinações de tamanho de fragmentos (TF), utilizando o parâmetro de

distinção de fragmentos A/L/C/Q/DA para os derivados da série das 6-

arilquinazolina-4-aminas (N=36). O melhor modelo está assinalado em negrito.

84


diversas combinações de tamanho de fragmentos (TF), utilizando o parâmetro de

distinção de fragmentos A/L para os derivados da série das 6-arilquinazolina-4-

aminas (N=36). O melhor modelo está assinalado em negrito.

85

Tabela 6. Resumo dos índices estatísticos dos modelos de HQSAR do teste de

randomização-Y utilizando o tamanho padrão de fragmentos (4-7 átomos) para

os derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas (N=36).

86

Tabela 7. Valores da atividade biológica experimental (Exp), predita (Pred) e

resíduos (Res) dos compostos da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas,


fragmentos A/L/C/Q/DA. Os compostos do conjunto de teste estão marcados

com um asterisco.

88

Tabela 8. Valores da atividade biológica experimental (Exp), predita (Pred) e

resíduos (Res) dos compostos da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas,


fragmentos A/L. Os compostos do conjunto de teste estão marcados com um

asterisco.

89

Tabela 9. Índices estatísticos dos modelos de CoMFA, obtidos para os derivados

da série das 6-arilquinazolina-4-aminas em função do método de cálculo das

cargas parciais (N=36).

97

Tabela 10. Índices estatísticos dos modelos de CoMFA obtidos para os

derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas em função do átomo de prova

(N=36). Método de cálculo de cargas parciais (AM1), valor de corte de energia

(30 kcal.mol-1), espaçamento da grade (2,0 Å).

98


derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas em função do nível de corte de

energia (N=36). Método de cálculo de cargas parciais (AM1), átomo de prova (H

+1), espaçamento da grade (2,0 Å).

99


derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas em função do espaçamento da

grade (N=36). Método de cálculo de cargas parciais (AM1), átomo de prova (H

+1), nível de corte de energia (30 kcal.mol-1).

100

Tabela 13. Valores das atividades biológicas experimentais (Exp), preditas

(Pred) e resíduos (Res) dos compostos da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas

utilizando o melhor modelo de CoMFA. Átomo de prova: H +1; método de cálculo

das cargas parciais: AM1; nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1 e espaçamento

da grade: 1,0 Å. Os compostos do conjunto de teste estão marcados com um

asterisco.

102

Tabela 14. Índices estatísticos obtidos no teste de randomização-Y para o

melhor modelo de CoMFA: átomo de prova: H +1; método de cálculo das cargas

parciais: AM1; nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1 e espaçamento da grade:

1,0 Å.

104

Tabela 15. Índices estatísticos dos modelos de CoMSIA obtidos para os

derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas (N=36) em função das

diversas combinações de campos moleculares (S, E, H, D, A).

111

Tabela 16. Índices estatísticos dos modelos de CoMSIA obtidos para os

derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas (N=36) em função do fator de

atenuação (α) contendo os campos moleculares eletrostático (E), hidrofóbico (H)

e doador de ligação hidrogênio (D).

112

Tabela 17. Valores de atividade biológica (pIC50, M) experimental (Exp), predita

(Pred) e resíduos (Exp – Pred) dos compostos da classe das 6-arilquinazolina-4-

aminas utilizando o melhor modelo de CoMSIA (campos moleculares E, H, D e

fator de atenuação α = 0,2). Os compostos do conjunto de teste estão marcados

com um asterisco.

114

Tabela 18. Índices estatísticos obtidos nas quatro randomizações da atividade

biológica no teste de randomização-Y para o melhor modelo de CoMSIA.

117

Tabela 19. Resumo das estruturas tridimensionais da DYRK1A resolvidas por 123

difração de raios-X do cristal e seus respectivos ligantes disponíveis no PDB.

Tabela 20. Número de soluções com valor de RMSD menor do que 2,0 Å,

considerando os complexos 2WO6 e 4MQ1 e as combinações de algoritmo de

busca e função de pontuação.

124

Tabela 21. Energias internas e de complexação ligante-enzima para as duas

melhores soluções encontradas para o composto 29 (outlier nos estudos de

CoMFA/CoMSIA).

132

Tabela 22. Energias de complexação ligante-enzima para os pares de

enantiômeros dos compostos 32, 33 e 34.

135

Tabela 23. Substituintes dos derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas

que geram melhor perfil de atividade inibitória contra a enzima DYRK1A,

observados nos estudos de QSAR e docagem molecular.

137

Tabela 24. Valores de pIC50 preditos para os compostos propostos (A1, A2, A3 e

A4) e seus análogos correspondentes (36, 24, 34 (R) e 34 (S), respectivamente)

segundo os melhores modelos de QSAR obtidos.

139

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AB atividade biológica

ASF alternative splicing factor (fator de splicing alternativo)

ATP adenosine triphosphate (trifosfato de adenosina)

CDK cyclin-dependent kinase (quinase dependente de ciclina)

CH comprimento do holograma

CK creatine kinase (creatina quinase)

CLK CDK-1 like kinase (quinase semelhante à CDK-1)

CoMFA Comparative Molecular Field Analysis (Análise Comparativa de Campos Moleculares)

CoMSIA Comparative Molecular Similarity Index Analysis (Análise Comparativa de Índices de Similaridade Moleculares)

DA doença de Alzheimer

DF distinção de Fragmentos

DFT density funcional theory - teoria funcional de densidade

DNA ácido desoxirribonucleico

DMAT 2-dimetilamino-4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzimidazol

DP desvio padrão

DYRK1A Dual-Specificity Regulated-Tyrosine Kinase 1A (quinase-1A de especificidade dual regulada via fosforilação da tirosina)

ECGC epigalocatequina-3-galato

EP erro padrão da estimativa

EPVC erro padrão da validação cruzada

ENF emaranhados neurofibrilares

GSK glycogen synthase kinase (glicogênio sintase quinase)

HQSAR Holograma QSAR

LOOCV leave-one-out cross validation (validação cruzada por exclusão individual exaustiva)

MAO monoamina oxidase

MAPK proteína quinase ativada por mitógeno

MVD Molegro Virtual Docker

NC número de componentes principais

NFATc1 Nuclear Factor of Activated T-Cells 1 (Fator nuclear ativador de células-T)

NINCDS-ADRDA National Institute for Communicative Disorders and Stroke – Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association (Instituto Nacional para Desordens Comunicativas e Derrame – Associação Doença de Alzheimer e Desordens Relacionadas)

NMDA N-metil-D-aspartato

QSAR quantitative structure-activity relationship (relação quantitativa estrutura-atividade)

PA placas amiloides

PCA principal component analysis (análise por componentes principais)

PLP piecewise linear potential (potencial linear definido por partes)

PDB Protein Data Bank (Banco de Dados de Proteínas)

PLS partial least squares (mínimos quadrados parciais)

PPA proteína precursora amiloide

RCAN1 regulador da Calcineurina 1

RESP restrained molecular electrostatic potential (potencial eletrostático molecular restrito)

RMN ressonância magnética nuclear

RMSD root-mean-square deviation (raiz do desvio médio quadrático)

RNA ácido ribonucleico

SE simplex evolution (evolução symplex)

SLN Sybyl line notation (Notação em linha Sybyl)

TBB 4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazol

TF tamanho de fragmentos

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 27

1.1

1.1.1

1.1.2

1.1.3

1.1.4

1.1.5

1.1.6


Aspectos Históricos

Aspectos Clínicos

Processo Patológico

Aspectos Genéticos

Diagnóstico

Aspectos Epidemiológicos

27

27

27

28

30

31

31

1.1.7 Tratamento 32

1.2

ENZIMA DYRK1A COMO UM NOVO ALVO CONTRA A


33

1.2.1

1.2.2

1.2.3

1.2.4

1.2.5

1.2.6

1.2.6.1

Quinase 1A de especificidade dual regulada via

fosforilação de tirosina

Estrutura Tridimensional da DYRK1A

Papel da DYRK1A no Desenvolvimento da Doença de

Alzheimer

Ativação da DYRK1A

Regulação da DYRK1A

Inibição da DYRK1A Humana

Inibidores da DYRK1A Humana

33

34

37

39

40

40

41

1.3 MODELAGEM MOLECULAR E PLANEJAMENTO DE

NOVOS FÁRMACOS

45

1.3.1

1.3.1.1

1.3.1.2

1.3.2

QSAR

QSAR 2D: Holograma QSAR (HQSAR)

QSAR 3D: CoMFA e CoMSIA

Docagem Molecular

46

49

53

58

2 OBJETIVOS 63

3 METODOLOGIA 64

3.1 CONJUNTO DE DADOS ESTRUTURAL E BIOLÓGICO 64

3.1.1 Conjuntos de Treinamento e Teste 70

3.2 HQSAR 71

3.2.1 Construção das Estruturas dos Ligantes 71

3.2.2 Obtenção dos Modelos de HQSAR 71

3.2.3 Teste de Randomização da Variável Y 72

3.2.4 Validação Externa do Modelo Detecção de Outliers 72

3.3 CoMFA e CoMSIA 73

3.3.1

Construção e Otimização das Estruturas Tridimensionais

dos Ligantes

73

3.3.2 Definição da Hipótese Farmacofórica 73

3.3.3 Cálculo das Cargas Atômicas Parciais 74

3.3.4 Alinhamento da Série de Compostos 75

3.3.5 Definição dos Átomos de Prova 75

3.3.6 Definição dos Valores de Corte dos Campos Moleculares 76

3.3.7 Definição do Espaçamento da Grade 76

3.3.8 Obtenção dos Modelos de CoMFA 76

3.3.9 Teste de Randomização da Variável Y do Melhor Modelo

de CoMFA

77

3.3.10 Validação Externa do Modelo de CoMFA e Detecção de

Outliers

77

3.3.11 Obtenção dos Modelos de CoMSIA 77

3.3.12 Teste de Randomização da Variável Y do Melhor Modelo

de CoMSIA

78

3.3.13 Validação Externa do Modelo de CoMSIA e Detecção de

Outliers

78

3.4 DOCAGEM MOLECULAR 78

3.4.1 Preparo dos Ligantes e da Proteína 78

3.4.2 Validação do Protocolo de Docagem (Re-docagem) 79

3.4.3 Docagem da Série de 6-arilquinazolina-4-aminas 80

4

RESULTADOS E DISCUSSÃO

82

4.1 HQSAR 82

4.1.1

4.1.2

Avaliação do Parâmetro Distinção de Fragmentos na

Qualidade dos Modelos de HQSAR

Avaliação do Tamanho dos Fragmentos na Qualidade

dos Modelos de HQSAR

82

83

4.1.3 Teste de Randomização-Y 85

4.1.4 Validação Externa do Modelo e Detecção de Outliers 87

4.1.5

Análise dos Mapas de Contribuição

92

4.2 CoMFA e CoMSIA 95

4.2.1 Análise da Sobreposição dos Compostos 95

4.2.2 Avaliação do Melhor Método de Cálculo das Cargas

Parciais

96

4.2.3 Avaliação do Melhor Átomo de Prova 98

4.2.4 Avaliação do Melhor Nível de Corte de Energia 99

4.2.5 Avaliação do Melhor Espaçamento de Grade 100

4.2.6 Validação Externa do Melhor Modelo de CoMFA e

Detecção de Outliers

101

4.2.7 Avaliação do Teste de Randomização-Y para o Melhor

Modelo de CoMFA

104

4.2.8 Análise dos Mapas de Contorno 105

4.2.9 Avaliação do Melhor Modelo de CoMSIA 110

4.2.10 Validação Externa do Melhor Modelo de CoMSIA e

Detecção de Outliers

113

4.2.11 Avaliação do Teste de Randomização-Y para o Melhor

Modelo de CoMSIA

116

4.2.12 Análise dos Mapas de Contorno 117

4.3 DOCAGEM MOLECULAR 122

4.3.1 Validação do Protolocolo de Docagem (Re-docagem) 122

4.3.2 Docagem da Série 6-arilquinazolina-4-aminas 124

4.4 PROPOSTA DE NOVOS COMPOSTOS 137

5 CONCLUSÕES 141

6 PERSPECTIVAS 142

REFERÊNCIAS

ANEXO

23

1 INTRODUÇÃO

1.1 DOENÇA DE ALZHEIMER

1.1.1 Aspectos Históricos

Em 1906, o psiquiatra alemão Alois Alzheimer apresentou, durante um

congresso em Tübingen, na Alemanha, os resultados de seu estudo clínico em uma

paciente que apresentava um caso peculiar de demência aos 51 anos de idade.

Alzheimer correlacionou os aspectos cognitivos e comportamentais desta paciente,

após sua morte aos 55 anos, com achados histopatológicos do seu córtex cerebral

(ALZHEIMER et al., 1995). Nos anos seguintes, diversos pesquisadores estudaram

pacientes em condições clínicas semelhantes, aumentando o entendimento sobre a

patologia. O termo “Doença de Alzheimer” (DA) foi primeiro mencionado por Emil

Kraepelin, em 1910, na oitava edição do seu livro Handbook of Psychiatry, onde ele

relata as severas alterações celulares descobertas por Alzheimer (MAURER; VOLK;

GERBALDO, 1997).

1.1.2 Aspectos Clínicos

A demência é uma síndrome caracterizada por perda ou diminuição da memória

e outras habilidades cognitivas, e representa o declínio do nível intelectual de uma

pessoa, interferindo negativamente na capacidade de execução de tarefas do seu

cotidiano. A DA é uma doença neurodegenerativa, sendo a causa mais comum de

demência, responsável por 60 a 70% dos casos (BARKER et al., 2002).

O aspecto essencial da DA é o declínio das habilidades cognitivas, que possui

um início insidioso ao longo de vários meses, com subsequente progressão gradual e

irreversível de etapas sucessivas de demência. O tempo médio desta patologia é de 7 a

10 anos e, inevitavelmente, culmina com a morte. O sintoma inicial da DA é a perda da

memória recente, mas outros sintomas também são observados, como alterações no

estado de atenção e na capacidade de resolver problemas. Com a progressão da

24

demência, sintomas como desorientação visuoespacial, disfunções de linguagem,

perda de noção e alterações na personalidade aparecem com frequência (HOLTZMAN;

MORRIS; GOATE, 2011).

No estágio inicial da DA, que compreende um período de 2 a 5 anos, os

pacientes apresentam aparente normalidade, sendo ainda independentes e capazes de

manter atividades cotidianas; embora pessoas próximas sejam capazes de identificar

um declínio nos níveis das funções cognitivas do indivíduo. No estágio moderado da

DA, que se estende de 2 a 4 anos, os pacientes apresentam um distúrbio de memória

mais pronunciado, incluindo a perda de memória de longo prazo; maior dificuldade de

realizar tarefas cotidianas, como banhar-se, vestir-se ou cuidar-se, as quais necessitam

de supervisão; e dificuldade de socialização. No estágio avançado, os pacientes

passam a ser totalmente dependentes para todas as atividades cotidianas e podem

tornar-se mudos, incapazes de se locomover e de controlar a função de órgãos como

bexiga e intestino (HOLTZMAN; MORRIS; GOATE, 2011).

1.1.3 Processo Patológico

Em nível macroscópico, analisando e comparando cortes cerebrais de pacientes

com DA e normais, é possível observar em pacientes com DA uma grave atrofia

cerebral (Figura 1); enquanto que, em nível microscópico, podem ser observados

placas amiloides (PA) (também conhecidas como placas senis) e emaranhados

neurofibrilares (ENFs) (Figura 2), além de extensa perda neuronal (HOLTZMAN;

MORRIS; GOATE, 2011).

25

Figura 1. Comparação entre cortes cerebrais de um cérebro de um paciente com doença de Alzheimer

(DA) e um cérebro normal (Adaptado de HOLTZMAN; MORRIS; GOATE, 2011).

Figura 2. Fotomicrografia de uma placa amiloide (PA) e de um emaranhado neurofibrilar (ENF)

(Adaptado de HOLTZMAN; MORRIS; GOATE, 2011).

Placas amiloides (PA) são depósitos moleculares no espaço extracelular do

cérebro e seus principais componentes proteicos são peptídeos Aβ, que possuem de 38

a 43 aminoácidos e são derivados da proteína precursora amiloide (PPA). No interior

26

das placas, estes peptídeos formam agregados insolúveis, via um processo conhecido

como β-amiloidose (GOLDE; ECKMAN; YOUNKIN, 2000). Quando as proteínas nos

agregados apresentam uma conformação do tipo folha-β, os agregados são chamados

de placas neuríticas e podem ser identificados por microscopia ótica (KAYED et al.,

2003). Ao redor das placas neuríticas, ocorre também um processo inflamatório,

envolvendo hipertrofia e alterações na morfologia das células gliais e multiplicação de

astrócitos e micróglia, resultando em dano cerebral (LUCIN; WYSS-CORAY, 2009).

Quando os agregados apresentam um formato diferente do tipo folha-β, eles são

chamados de placas difusas e podem ser detectados por técnicas imuno-histoquímicas

(KAYED et al., 2003).

Além da deposição do peptídeo Aβ na forma de placas amiloides, os corpos

celulares neuronais também desenvolvem ENFs, que são estruturas formadas por uma

forma agregada e hiperfosforilada da proteína Tau. Esta proteína é sintetizada em todos

os neurônios e também está presente nas células da glia, tendo como função estabilizar

os microtúbulos via ligação à tubulina. Entretanto, na DA, a proteína Tau

hiperfosforilada sofre dissociação dos microtúbulos e ocorre uma autoagregação,

gerando os ENFs (GRUNDKE-IQBAL et al., 1986).

Estudos genéticos, bioquímicos e neurobiológicos sugerem que a agregação, a

modificação conformacional e o acúmulo de diferentes formas do peptídeo Aβ

desempenham um papel central no desenvolvimento da patogênese da DA, embora

uma variedade de modificações adicionais, dependentes ou não do peptídeo Aβ,

parecem contribuir para o declínio cognitivo e a progressão da demência. Existem

evidências que a disfunção da proteína Tau hiperfosforilada contribua para a

progressão clínica da DA, provavelmente via processos posteriores à agregação do

peptídeo Aβ, mas, também, em função de algum grau de dano neuronal independente

da β-amiloidose (SMALL; DUFF, 2008).

1.1.4 Aspectos Genéticos

Existem evidências de que fatores genéticos podem ser muito relevantes para o

desenvolvimento da DA, pois o histórico familiar positivo para esta patologia associado

27

à idade são os únicos fatores sistemáticos da DA (HEYMAN et al., 1984). A DA pode

ser transmitida de forma autossômica dominante e as características relacionadas à

idade de aparecimento e à evolução da doença são determinadas por subtipos

genéticos distintos. Mutações genéticas presentes nos cromossomos 14 (gene pré-

senilina-1) (LEVY-LAHAD et al., 1995) e 21 (gene PPA) (GOATE et al., 1991) estão

diretamente envolvidas com o aparecimento precoce da doença (idade menor que 65

anos). Outros cromossomos envolvidos nos subtipos genéticos são o 1 (gene pré-

senilina-2) e o 19 (apolipoproteína ε4) (VAN DUIJN, 1996).

1.1.5 Diagnóstico

Ainda não existem marcadores específicos para a investigação laboratorial e por

imagem da DA, mas alguns exames convencionais na DA permitem a exclusão de

causas reversíveis e, também, a observação de parâmetros de neuroimagem

compatíveis com os variados estágios da DA; como atrofia cortical, alterações no

hipocampo e lobo temporal mesial (POULIN; ZAKZANIS, 2002).

O diagnóstico definitivo da DA somente pode ser realizado pela observação de

aspectos histopatológicos característicos da doença no tecido cerebral, como a perda

neuronal nas camadas piramidais do córtex cerebral e degenerações sinápticas

intensas nos níveis neocortical e hipocampal (BRAAK; BRAAK, 1991). Em função desta

limitação, a única forma de diagnóstico é pelo exame neuropatológico segundo os

critérios definidos pela NINCDS-ADRDA (National Institute for Communicative Disorders

and Stroke – Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association) em conjunto com

a exclusão de outras possíveis causas de demência (MCKHANN et al., 1984).

1.1.6 Aspectos Epidemiológicos

A DA e a isquemia cerebrovascular são as causas mais frequentes da demência

(NITRINI et al., 2005). Nos países desenvolvidos, a prevalência da DA é de,

aproximadamente, 1,5% em pessoas com idade em torno de 65 anos e chega a 30%,

em pessoas com cerca de 80 anos (RITCHIE; LOVESTONE, 2002). Nos Estados

28

Unidos, foi estimado que 3% dos indivíduos com idade entre 65 e 74 anos possuem

DA. Este número aumenta para 17,6%, em pessoas com idade entre 75 e 85 anos, e

para 32,3%, em pessoas com idade superior a 85 anos. Estima-se, ainda, que o

número de pessoas com DA aumente de 4,7 milhões em 2010 para 13,8 milhões em

2050 (HEBERT et al., 2013). No Brasil, um estudo encontrou uma prevalência de 7,1%

de casos de demência em uma população com idade igual ou maior que 65 anos. A

taxa de incidência anual encontrada foi de 7,7 casos por 100.000 habitantes e a causa

mais frequente da síndrome demencial foi a DA, representando um percentual de

55,1% (HERRERA et al., 2001).

1.1.7 Tratamento

O tratamento da DA envolve abordagens farmacológicas e não-farmacológicas, e

o acompanhamento psicológico do paciente é extremamente importante neste

processo. Dentre as principais opções farmacológicas atuais estão os inibidores

reversíveis da enzima acetilcolinesterase (por exemplo, tacrina, galantamina e

donepezil) e os inibidores pseudo-irreversíveis (por exemplo, rivastigmina), visto que se

supõe uma deficiência colinérgica em pacientes com esta patologia; e os antagonistas

competitivos do receptor glutamatérgico N-metil-D-aspartato (NMDA), por exemplo,

memantina, visto que o glutamato pode atuar como uma excitotoxina e provocar morte

neuronal, mesmo sendo também um dos neurotransmissores mais importantes do

sistema nervoso central (FORLENZA, 2005).

Algumas outras abordagens farmacológicas menos comuns foram propostas,

como o uso de antioxidantes (SANO et al., 1997), estrógenos (GREEN; GRIDLEY;

SIMPKINS, 1996), estatinas (EVANS et al., 2004), anti-inflamatórios não esteroidais

(LIM et al., 2001) e Ginkgo biloba (BIRKS; GRIMLEY EVANS, 2007); mas são menos

utilizadas, pois estudos realizados com estas abordagens não foram capazes de

comprovar os seus benefícios no tratamento da DA (BIRKS; FLICKER, 2003;

HENDERSON et al., 2000; TABET; FELDMAND, 2003; ZANDI et al., 2005). A

importância da descoberta de novos fármacos para o tratamento de pacientes afetados

29

pela DA se dá em função dos fármacos que são utilizados atualmente não serem

capazes de curar a doença, mas apenas retardar seu avanço (FORLENZA, 2005).

1.2 ENZIMA DYRK1A COMO UM NOVO ALVO CONTRA A DOENÇA DE ALZHEIMER

1.2.1 Quinase 1A de especificidade dual regulada via fosforilação de tirosina

As quinases de especificidade dual reguladas via fosforilação de tirosina – Dual-

specificity tyrosine-regulated kinases (DYRKs) são uma família de quinases eucarióticas

que pertencem a uma superfamília conhecida como CMGC quinases, que incluem,

entre outras, proteínas quinases como: proteínas quinases ativadas por mitógeno –

mitogen-activated protein kinases (MAPKs), quinases glicogênio sintase – glycogen

synthase kinases (GSKs), quinases dependentes de ciclina - cyclin dependente kinases

(CDKs) e as quinases do tipo CDK (BECKER; SIPPL, 2011). A família DYRK contém

cinco subtipos: 1A, 1B, 2, 3 e 4. Entretanto, apenas o gene da DYRK1A está localizado

no interior do cromossomo humano 21, precisamente, na região crítica da Síndrome de

Down (SD) (BECKER; JOOST, 1999; GUIMERÁ et al., 1996). A família DYRK mantém

alta similaridade entre as sequências de aminoácidos em diferentes espécies. A

DYRK1A humana mantém 99% de conservação com as homólogas de ratos e

camundongos, possuindo bons modelos experimentais para estudos de atividade e de

participação em processos biológicos (MARTÍ et al., 2003).

A DYRK1A é uma proteína quinase capaz de catalisar a fosforilação de resíduos

de serina e treonina em substratos proteicos exógenos, assim como a sua

autofosforilação em resíduos de tirosina presentes em seu segmento de alça de

ativação (HIMPEL et al., 2001; KENTRUP et al., 1996). Estudos indicam a participação

desta enzima no desenvolvimento anormal do cérebro, levando a uma deficiência

intelectual na SD (HÄMMERLE et al., 2003; PARK; SONG; CHUNG, 2009) e, também,

no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas como a DA (FERRER et al.,

2005).

30

1.2.2 Estrutura Tridimensional da DYRK1A

A estrutura tridimensional da DYRK1A é semelhante à de outras quinases e

apresenta o resíduo Tyr321, presente na alça de ativação, autofosforilado com

interações com dois resíduos de arginina (Arg325 e Arg328, Figura 3). Este é um

domínio conservado em todas as enzimas da família DYRK (OGAWA et al., 2010). A

região de homologia da família DYRK e o domínio catalítico da enzima estão

localizados entre os resíduos Val135 e Lys480 (SOUNDARARAJAN et al., 2013).

Figura 3. Estrutura tridimensional da DYRK1A humana e detalhe do sítio de autofosforilação composto

por um resíduo de tirosina fosforilado (O3POTyr321 = pTyr321) e dois resíduos de arginina (Arg325 e

Arg328) (Adaptado de OGAWA et al., 2010).

Existem algumas estruturas da DYRK1A co-cristalizadas com alguns ligantes

disponíveis no banco de dados de proteínas – Protein Data Bank (PDB) (BERMAN et

al., 2000). Todos estes compostos se ligam ao sítio de ligação do trifosfato de

adenosina (ATP) necessário para as reações de fosforilação de substratos catalisada

por esta enzima. O ligante benzotiazólico chamado INDY (inibidor de DYRK) interage

com a enzima por ligações hidrogênio com o átomo de nitrogênio da cadeia principal do

31

resíduo Leu241 e com o átomo de nitrogênio da cadeia lateral do resíduo Lys188, além

de várias interações hidrofóbicas com os resíduos Val173, Ala186, Phe238, Leu241,

Leu294 e Val306 (Figura 4) (Código no PDB – 2WO6) (OGAWA et al., 2010).

Figura 4. Sítio de ligação do INDY (inibidor de DYRK) à DYRK1A humana (Adaptado de OGAWA et al., 2010).

Dois inibidores da classe das pirido[2,3-d]pirimidinas, inicialmente desenvolvidas

como inibidores da DYRK1B, também se apresesentam co-cristalizados à DYRK1A. O

derivado 3 (Figura 5A) (Código no PDB – 4MQ1) interage com a enzima alvo por

ligações hidrogênio com os resíduos Leu241 e Lys188 e por ligação halogênio

(WILCKEN et al., 2013) com Glu239. O derivado 32 (Figura 5B) (Código no PDB –

4MQ2) mantém as interações por ligação hidrogênio com os resíduos Leu241 e Lys188

e faz uma ligação hidrogênio adicional com o resíduo Asn292 (ANDERSON et al.,

2013). Este mesmo padrão de interações por ligações hidrogênio é observado quando

se analisa a estrutura da DYRK1A co-cristalizada com a leucettina L41, um derivado do

alcaloide marinho leucettamina B (Código no PDB – 4MQ2). A leucettina L41 também

faz interações hidrofóbicas com os resíduos Val222, Leu241, Leu294 e Val306

(TAHTOUH et al., 2012).

32

Figura 5. Sítio de ligação dos derivados 3 (A) e 32 (B) da classe das pirido[2,3-d]pirimidinas à DYRK1A

humana (Adaptado de ANDERSON et al., 2013).

33

Outro inibidor co-cristalizado com a DYRK1A é o DJM2005, que faz diversas

interações por ligações hidrogênio com os resíduos Ser169, Tyr243, Lys289, Glu291,

Asn292 e Asp307, além de várias interações hidrofóbicas (SOUNDARARAJAN et al.,

2013).

1.2.3 Papel da DYRK1A no Desenvolvimento da Doença de Alzheimer

A DYRK1A possui múltiplas funções biológicas em função das suas interações

com diversas proteínas do citoesqueleto celular, proteínas sinápticas e nucleares,

incluindo fatores de transcrição e fatores envolvidos com a remoção pós-transcricional

de íntrons e éxons (splicing) de ácidos ribonucleicos (RNAs) (GALCERAN et al., 2003).

A expressão da DYRK1A em neurônios durante o período fetal e pós-natal, assim como

em neurônios de indivíduos adultos e na velhice, sugere que a regulação desta

expressão está envolvida com o desenvolvimento neuronal, sua maturação e

envelhecimento posteriores (WEGIEL et al., 2004). Esta enzima é expressa em todo o

organismo humano, mas é particularmente abundante no cerebelo, bulbo olfatório e

hipocampo. Sua expressão é regulada positivamente nos primeiros estágios do

desenvolvimento embrionário seguida de uma diminuição gradual a baixos níveis nos

estágios posteriores (MARTÍ et al., 2003).

Foi observada imunorreatividade aumentada para DYRK1A no citoplasma e

núcleo de neurônios dispersos no córtex entorrinal, hipocampo e neocortex em doenças

neurodegenerativas associadas à fosforilação de proteínas Tau; incluindo DA, SD e

Doença de Pick (FERRER et al., 2005). A expressão aumentada da DYRK1A está

envolvida tanto com a formação dos ENFs, via hiperfosforilação da proteína Tau;

quanto com a formação das placas amiloides, via clivagem da PPA e consequente

formação do peptídeo Aβ; resultando em perda neuronal e demência (Figura 6)

(WEGIEL; GONG; HWANG, 2011).

34

Figura 6. Contribuição da superexpressão da DYRK1A para a β-amiloidose e degeneração neurofibrilar

em doenças neurodegenerativas. ASF (fator alternativo de splicing); PPA (proteína precursora amiloide);

ENFs (emaranhados neurofibrilares) (Adaptado de WEGIEL; GONG; HWANG, 2011).

A fosforilação de proteínas Tau induzida pela DYRK1A com a atividade

aumentada leva a subsequente fosforilação de proteínas Tau induzida pela GSK-3β

(LIU et al., 2008; WOODS et al., 2001). Paralelamente, a DYRK1A fosforila o fator de

splicing alternativo (alternative splicing fator, ASF), que por sua vez leva ao aumento da

expressão da proteína Tau-3R (SHI et al., 2008), causando a interrupção do equilíbrio

nos níveis das proteínas Tau-3R e Tau-4R, fundamental para a função neuronal ótima

(GOEDERT; JAKES, 2005). A formação de ENFs por estas duas vias de sinalização

celular leva à degeneração neurofibrilar presente em doenças neurodegenerativas.

35

Estudos indicam que a fosforilação da PPA pela DYRK1A pode facilitar a

clivagem da mesma por secretase-β1 (LEE et al., 2003) e secretase-γ (VINGTDEUX et

al., 2005); e aumentar a produção de peptídeos Aβ. Em camundongos transgênicos,

que superexpressam o gene da DYRK1A humana, foram encontrados níveis

aumentados de Aβ40 e Aβ42, em 160% e 17% respectivamente; indicando que a

superexpressão da DYRK1A promove a clivagem da PPA e aumenta a produção de

peptídeos Aβ (RYOO et al., 2008). O acúmulo destes oligômeros tóxicos inibe funções

neuronais críticas e; portanto, contribui para a demência observada na DA (SAKONO;

ZAKO, 2010).

A DYRK1A também fosforila o regulador da calcineurina-1 (RCAN1), o que

diminui sua velocidade de degradação e aumenta a interação entre o RCAN1 e a

calcineurina-1, contribuindo para o aumento da capacidade de inibição da atividade

fosfatásica da mesma, o que resulta no aumento da quantidade de proteínas Tau

fosforiladas e na redução da atividade transcricional da calcineurina/fator nuclear de

células-T ativadas (NFAT) (JUNG et al., 2011).

1.2.4 Ativação da DYRK1A

A maioria das proteínas quinases pode adotar conformações ativa e inativa, que

podem sofrer interconversão via fosforilações reversíveis em resíduos de serina,

treonina ou tirosina presentes em uma região chamada de alça de ativação. A

fosforilação destes resíduos presentes na alça estabiliza uma conformação da proteína

que contém um sítio de ligação a um determinado substrato apropriadamente

posicionado (NOLEN; TAYLOR; GHOSH, 2004). As quinases da família DYRK

dependem da fosforilação de um resíduo conservado de tirosina presente na alça de

ativação (Tyr321) para atingir a atividade catalítica máxima (HIMPEL et al., 2001). Esta

fosforilação ocorre imediatamente após a tradução da mesma (LOCHHEAD et al.,

2005).

A autofosforilação da DYRK1A de mamíferos é uma capacidade intrínseca do

domínio catalítico e não depende de outros domínios ou quaisquer cofatores

(GÖCKLER et al., 2009). Apesar da necessidade da autofosforilação para o alcance da

36

atividade catalítica máxima, ainda não existem evidências que a atividade catalítica das

enzimas da família DYRK seja efetivamente regulada pela fosforilação e desfosforilação

da tirosina presente na alça de ativação (BECKER; SIPPL, 2011).

Acerca do mecanismo de ativação da DYRK1A, sabe-se que a mutação de

Tyr321 para fenilalanina reduz a atividade catalítica da enzima em mais de 80%

(WIECHMANN et al., 2003); entretanto, a desfosforilação deste resíduo,

surpreendentemente, não provoca a inativação da mesma, o que sugere que a

fosforilação deste resíduo é importante para mudar a conformação para a sua forma

ativa, mas não para mantê-la (ADAYEV et al., 2007).

1.2.5 Regulação da DYRK1A

Como a fosforilação da Tyr321 da alça de ativação é aparentemente constitutiva,

a atividade da DYRK1A é regulada pelo seu nível de expressão gênica, o que pode ser

explicado pela observação de pacientes com deficiência homozigota da DYRK1A

(MØLLER et al., 2008). Dentre os fatores de transcrição descritos com propriedades

inibidoras da expressão da DYRK1A estão o E2F1 (MAENZ et al., 2008) e o fator

nuclear de células-T ativadas 1 – Nuclear Factor of Activated T-Cells 1 (NFATc1) (LEE

et al., 2009).

1.2.6 Inibição da DYRK1A Humana

Substâncias inibidoras de proteínas quinases capazes de permear membranas

celulares são importantes no estudo de mecanismos de transdução de sinais

intracelulares, pois possuem melhor controle temporal experimental e geram resultados

fenotípicos diferentes quando comparadas com técnicas genéticas existentes, como a

interferência por RNA (KNIGHT; SHOKAT, 2007).

A inibição da função da DYRK1A poderia, teoricamente, atenuar diversos

processos relacionados à progressão da neurodegeneração associada à DA, visto que

alvos da DYRKA, como as proteínas Tau, PPA e pré-senilina 1, estão claramente

envolvidas em mecanismos pelos quais a atividade elevada da DYRK1A contribui para

37

o desenvolvimento da DA. Dada esta hipótese, há um grande interesse nesta enzima

como potencial alvo farmacológico para novos inibidores (KIM et al., 2006; SAVAGE;

GINGRICH, 2009).

1.2.6.1 Inibidores da DYRK1A Humana

A harmina é um alcaloide β-carbolínico conhecido por ser um potente inibidor

da monoamina oxidase (MAO) (BAIN et al., 2007); e é produzida por diferentes

espécies vegetais, incluindo o cipó sul-americano Banisteriopsis caapi. Este composto é

um dos componentes da ayahuasca, uma mistura alucinógena utilizada em rituais

religiosos e também na medicina tradicional dos povos amazônicos (KIM; SABLIN;

RAMSAY, 1997). Como inibidor de quinases, a harmina apresenta grande

especificidade para a DYRK1A (IC50 = 80 nM) entre 69 proteínas quinases (CALLAWAY

et al., 1999). Há evidências que a harmina (Figura 7) é capaz de inibir a fosforilação

direta de proteínas Tau via DYRK1A em células de neuroglioma H4 sem afetar a

viabilidade celular (FROST et al., 2011). O principal problema relacionado à harmina é o

seu potencial alucinogênico, mostrado como resultado de sua afinidade por receptores

de serotonina e triptamina (AIRAKSINEN et al., 1987).

N

N

H

O

IC50 = 80 nM

Figura 7. Estrutura química da harmina.

O galato de epigalocatequina (epigalocatequina-3-galato, EGCG) (Figura 8) é o

maior componente polifenólico do chá verde e apresenta atividade inibidora sobre a

DYRK1A humana, seletivamente, entre 29 quinases testadas (IC50 = 300 nM) (BAIN et

al., 2003), sendo o mecanismo de inibição do tipo não-competitivo (ADAYEV et al.,

2006). Estudos in vivo indicam que camundongos mutantes com DYRK1A

38

hiperexpressa apresentam melhor estrutura cerebral, plasticidade sináptica e função

cognitiva; incluindo melhoria no aprendizado e nas memórias de curto e longo prazo,

quando submetidos a uma dieta com chá verde contendo EGCG (GUEDJ et al., 2009).

Apesar da atividade satisfatória, a EGCG possui uma farmacocinética complexa e baixa

biodisponibilidade oral, o que limita sua utilização em modelos experimentais animais

(LAMBERT; SANG; YANG, 2007).

OHO

OH

O

OOH

OH

OH

OH

OH

OH

IC50 = 300 nM

Figura 8. Estrutura química do galato de epigalocatequina (epigalocatequina-3-galato, EGCG).

Um composto benzotiazólico chamado INDY foi identificado como um inibidor

dual de DYRK1A/CLK humanas. Este composto é um derivado do TG003, um inibidor

de quinase tipo CDK-1 (CDK-1 like kinase, CLK), embora três vezes mais potente

(Figura 9). Ambos os compostos também apresentaram atividade frente a outras

enzimas da família DYRK humanas, como a DYRK1B. A atividade biológica do INDY

também foi verificada em dois estudos in vitro: ele foi capaz de inibir a expressão da

proteína Tau pThr212 em células de fibroblastos do tipo COS-7 e de bloquear a

atividade reguladora negativa da DYRK1A na via calcineurina/NFAT de forma

dependente da concentração (OGAWA et al., 2010).

39

S

N

O

OR

R = H - INDY; IC50 = 240 nM

R = CH3 - TG003; IC50 = 930 nM

Figura 9. Estruturas químicas dos compostos INDY e TG003.

A busca por inibidores de outras enzimas da família DYRK também gerou

compostos capazes de inibir a DYRK1A. A avaliação de uma série de derivados

pirido[2,3-d]pirimidinas, objetivando o tratamento de cânceres via a inibição da

DYRK1B, resultou em diversos compostos com atividade biológica pronunciada na

DYRK1A humana, incluindo o derivado mostrado na Figura 10, o que levou ao estudo

farmacocinético de alguns dos derivados obtidos (ANDERSON et al., 2013). Foi

salientado, inclusive, que a diferença entre as DYRK1A e DYRK1B na região de ligação

ao ATP é de apenas um aminoácido (leucina na DYRK1A e metionina na DYRK1B).

Assim, é um desafio conseguir compostos seletivos para uma destas enzimas que se

liguem a esta região (LEDER et al., 1999).

N

N N O

H

N

O

O

N

H

Cl

N

O

H

NH2

IC50 = 5 nM

Figura 10. Estrutura geral do composto mais ativo da série de derivados pirido[2,3-d]pirimidinas.

Outros inibidores da DYRK1A humana foram avaliados e, dentre estes, podem

ser citados produtos naturais como a quinalizarina que, apesar de inibir a DYRK1A,

possui maior afinidade pela proteína quinase CK2 (COZZA et al., 2009); flavonoides

como o acalinol A e B, que apresentam seletividade, mas atividades moderadas como

40

inibidores de DYRK1A (AHMADU et al., 2010); benzocumarinas (SARNO et al., 2012) e

indolocarbazois, como a estaurosporina e a rebecamicina (SÁNCHEZ et al., 2009).

Dentre os compostos sintéticos, o universo de compostos é muito maior, e

podem ser citados como exemplos as pirazolidino-3,5-dionas (KOO et al., 2009); as

meriolinas (ECHALIER et al., 2008); as meridianinas (GIRAUD et al., 2011) e os

cromeno[3,4-b]indóis (NEAGOIE et al., 2012). Todos os análogos ainda estão em fase

de testes in vitro, e nenhum teste clínico foi realizado.

Um aspecto em comum em diversos trabalhos buscando inibidores da DYRK1A

é a pequena quantidade de compostos com valores exatos de atividade biológica.

Nestes trabalhos, a relação entre estrutura e atividade biológica é discutida de forma

apenas qualitativa, pois não há um número de compostos suficientes para a geração de

modelos quantitativos de relação estrutura-atividade. Uma série que atende a esta

característica é a de 6-arilquinazolina-4-aminas (Figura 11) testadas para diversas

CLKs e para DYRK1A e 1B.

N

N

NR3R2

R1

Figura 11. Estrutura geral da série de derivados 6-arilquinazolina-4-aminas.

Os derivados 6-arilquinazolina-4-aminas foram inicialmente idealizados como

inibidores de CLKs, onde um destes derivados, o NCGC00010037 foi reportado como

inibidor das enzimas CLK1, CLK4 e DYRK1A (MOTT et al., 2009), o que despertou o

interesse sobre esse grupo de derivados, visto que quinazolinas substituídas são

farmacóforos comuns para inibidores competitivos da ATP (ROSENTHAL et al., 2010,

2011).

Em função deste interesse, dois trabalhos mais aprofundados sobre estes

derivados foram realizados. Nestes trabalhos, foram empregadas diversas substituições

nas posições R1, R2 e R3 (Figura 11), e os derivados obtidos foram testados contra uma

série de proteínas quinases em ensaios enzimáticos utilizando ATP marcado com 33P.

41

Com os resultados dos ensaios in vitro, foi proposta a relação qualitativa entre a

estrutura química e atividade biológica destes compostos (ROSENTHAL et al., 2010,

2011). A partir destes trabalhos, foram selecionados 46 compostos com atividade sobre

a DYRK1A humana para estudos quantitativos de relação estrutura atividade no

presente trabalho.

1.3 MODELAGEM MOLECULAR E PLANEJAMENTO DE NOVOS FÁRMACOS

Inicialmente, os métodos de obtenção de novos fármacos eram baseados em

tentativas e erros, e qualquer substância com potencial valor terapêutico poderia ser

testada diretamente em indivíduos doentes para tratar empiricamente uma determinada

patologia e, consequentemente, atestar sua eficácia. Com o avanço das técnicas

químicas, os pesquisadores passaram a purificar substâncias de preparações de

origem vegetal com propriedades medicinais conhecidas e elucidar suas estruturas

químicas (SNEADER, 2005). A ciência da descoberta de novos fármacos avançou

ainda mais em função dos progressos nas áreas de bioquímica e biologia molecular,

utilizando conceitos de expressão gênica, síntese de proteínas e a relação ligante-

receptor (DREWS, 2000).

Com a ampliação do conhecimento em genômica e proteômica, ocorrido nos

anos 90 e com os avanços nas áreas de bioinformática e quimioinformática, foram

desenvolvidas e introduzidas novas técnicas de análise capazes de identificar genes e

proteínas relacionadas com diversas patologias. Esta introdução foi feita,

primeiramente, em genômica e proteômica (BUTCHER; BERG; KUNKEL, 2004) e,

posteriormente, em bioinformática (CHEN; CHEN, 2008) e quimioinformática (ENGEL,

2006), possibilitando o processamento de dados em larga escala e a experimentação in

silico (ou seja, por simulação computacional) (LEE; HUANG; JUAN, 2011).

Um dos objetivos do planejamento de fármacos é selecionar um alvo terapêutico

na etiologia de uma determinada patologia e encontrar uma ou mais substâncias

capazes de interagir com este alvo, ativando-o ou desativando-o (MOON; HOWE,

1991). As modificações resultantes desta interação desencadearão uma série de

reações, gerando um determinado efeito terapêutico (SLENO; EMILI, 2008).

42

A modelagem molecular compreende um conjunto diverso de métodos que

permite construir, visualizar, analisar e armazenar sistemas moleculares complexos,

contribuindo no planejamento de novos fármacos. Existem duas abordagens principais

na concepção de novos fármacos utilizando técnicas de modelagem molecular: a

abordagem indireta (ou dependente do ligante) e a abordagem direta (ou dependente

da estrutura do receptor) (COHEN et al., 1990).

Na abordagem indireta, o planejamento de fármacos é baseado em processos

que utilizam, como dados de partida, ligantes conhecidos de um determinado receptor

alvo. Modelos farmacofóricos, modelos de relação quantitativa estrutura-atividade de

uma, duas, três ou quatro dimensões, independente do receptor, são exemplos de

métodos deste tipo de abordagem (TINTORI; MANETTI; BOTTA, 2010).

Na abordagem direta, informações sobre a estrutura tridimensional do receptor

alvo devem estar disponíveis. Estas informações podem ser obtidas por técnicas de

ressonância magnética nuclear (RMN) ou cristalografia e difração de raios-X. Estudos

de docagem molecular e simulações de dinâmica molecular são exemplos de técnicas

desta abordagem (IVANOV et al., 2006).

1.3.1 QSAR

O método de relação quantitativa estrutura-atividade (quantitative structure-

activity relationship, QSAR) tenta correlacionar a variação da resposta da atividade

biológica com a variação da estrutura química (ou propriedades derivadas da estrutura

química) em uma série de compostos. Se a atividade de um grupo de ligantes puder ser

determinada, é possível construir um modelo matemático que descreva esta relação

(ESPOSITO; HOPFINGER; MADURA, 2004). A descrição da estrutura de um fármaco é

um problema complexo, visto que não pode ser representada por um único parâmetro.

Desta forma, um grupo de propriedades químicas ou estruturais conhecidas como

descritores são calculados a partir da estrutura e usados nesta quantificação. Utilizando

os descritores como variáveis independentes e a atividade biológica como a variável

dependente, pode-se construir um modelo que as relacione (PERKINS et al., 2003).

43

Uma grande variedade de métodos de QSAR foi desenvolvida desde a

introdução deste conceito em 1964 (FREE; WILSON, 1964; HANSCH; FUJITA, 1964).

Os métodos tradicionais de QSAR 1D e 2D, como Free-Wilson e Hansch-Fujita, usam

substituintes moleculares ou fragmentos bidimensionais e propriedades físico-químicas

para gerar modelos preditivos quantitativos. O primeiro método de QSAR 3D chamado

de análise comparativa de campos moleculares - Comparative Molecular Field Analysis

(CoMFA) foi introduzido em 1988 (CRAMER; PATTERSON; BUNCE, 1988) e deu

origem a outros métodos de QSAR 3D, como a análise comparativa de índices de

similaridade moleculares - Comparative Molecular Similarity Index Analysis (CoMSIA),

assim como métodos de QSAR multidimensionais como o QSAR 4D, QSAR 5D, entre

outros, com o objetivo de solucionar o problema crucial dos métodos de QSAR 3D, a

limitação de uma única conformação para a estrutura tridimensional de cada ligante

(VEDANI; DOBLER; LILL, 2006).

Em geral, a modelagem por QSAR envolve um processo sistemático com

múltiplas etapas (Figura 12), incluindo o preparo do conjunto de dados, seleção e

geração dos descritores moleculares, desenvolvimento do modelo matemático,

validação interna do modelo, utilizando um conjunto de treinamento e a validação

externa utilizando um conjunto de teste (MYINT; XIE, 2010).

Durante a primeira etapa (Figura 12), é importante estar atento à qualidade dos

dados para desenvolver um modelo de QSAR confiável. Os dados devem advir do

mesmo tipo de protocolo de ensaio biológico e é preferível utilizar dados de um único

laboratório, a fim de evitar inconsistência e variabilidade interlaboratorial dos dados

(MYINT; XIE, 2010). Além disso, o conjunto de dados deve conter um número mínimo

de compostos para assegurar a consistência estatística; suas atividades biológicas

devem cobrir uma larga faixa de valores e possuir uma boa distribuição dentro desta

faixa e o mesmo deve ser dividido em grupos de treinamento e de teste (PERKINS et

al., 2003).

A segunda etapa (Figura 12) envolve a geração e a seleção dos descritores

moleculares. Vários descritores podem ser gerados, mas apenas alguns deles podem

estar correlacionados de forma significativa com a atividade biológica. Portanto, a

seleção apropriada destes descritores é fundamental para gerar um modelo de QSAR

44

robusto. Na terceira etapa, é necessário escolher o método estatístico adequado para

relacionar os descritores com as atividades biológicas. Alguns modelos lineares, como a

regressão linear múltipla ou o método dos mínimos quadrados parciais – do inglês

partial least squares (PLS) ou não lineares, como as redes neurais, podem ser

utilizados como funções de correlação (LEACH, 2011).

Figura 12. Esquema geral do desenvolvimento de um modelo de QSAR (Adaptado de MYINT; XIE,

2011).

45

Na quarta etapa, o modelo de QSAR deve ser submetido à validação interna. Um

método de validação bastante utilizado é a validação cruzada por exclusão individual

exaustiva, mais conhecida pelo seu termo em inglês – leave-one-out cross validation

(LOOCV) – realizada para avaliar a estabilidade estatística do modelo, onde um

composto por vez é excluído do conjunto de treinamento. Na quinta etapa, realiza-se a

validação externa do modelo; utilizando o conjunto de teste que é constituído por

compostos relacionados estruturalmente aos compostos do conjunto de treinamento,

mas que não deram origem ao modelo, o que é importante para avaliar a capacidade

preditiva externa do mesmo (LIVINGSTONE, 1995).

1.3.1.1 QSAR 2D: Holograma QSAR (HQSAR)

HQSAR é um método de QSAR 2D baseado em fragmentos moleculares e que,

portanto, não requer informações que são necessárias em técnicas tridimensionais;

como a determinação da estrutura tridimensional, conformação de ligação ao receptor e

alinhamento molecular (HURST; HERITAGE, 2001; LOWIS, 1997). Nesta técnica, cada

molécula do grupo de treinamento é representada na forma de uma notação linear

específica, neste caso, a Sybyl line notation (SLN) e desmembrada em fragmentos

estruturais únicos (lineares, ramificados ou cíclicos) os quais irão formar um holograma

molecular, uma espécie de impressão digital que codifica todos os possíveis fragmentos

formados. Em seguida, é atribuído um número inteiro positivo a cada fragmento por um

algoritmo de checagem de redundância e estes fragmentos são ordenados em

hologramas (matrizes contendo posições chamadas bins) de comprimentos variados.

As frequências de ocupação destes bins são os descritores estruturais desta técnica

que contém informações topológicas e constitucionais das moléculas, incluindo

algumas informações tridimensionais, como hibridização e quiralidade (SALUM;

ANDRICOPULO, 2009).

Existem alguns parâmetros que podem afetar a qualidade dos modelos de

HQSAR; como tamanho dos fragmentos, comprimento do holograma e distinção dos

fragmentos. O tamanho dos fragmentos é um parâmetro que define o número máximo e

mínimo de átomos em que as moléculas do conjunto de dados são fragmentadas; o

46

comprimento do holograma expressa o número de bins disponíveis para a alocação dos

fragmentos e o parâmetro de distinção de fragmentos define características diferenciais

entre os fragmentos, descritas na Tabela 1.

Tabela 1. Parâmetros de distinção dos fragmentos moleculares empregados no método

HQSAR.

Distinção de fragmentos Definição

Átomos (A) Tipos de átomos

Ligações (L) Tipos de ligação: simples, dupla ou tripla

Conectividade (C) Tipos de hibridização dos átomos

Hidrogênio (H) Número de átomos de hidrogênio

Quiralidade (Q) Centros de quiralidade

Doador e aceptor de ligação

hidrogênio (DA) Átomos doadores ou aceptores de ligação hidrogênio

As frequências são, então, relacionadas aos valores de atividade biológica na

forma de uma equação matemática pelo método de regressão por PLS. Este método

estatístico é semelhante à análise por componentes principais, do inglês – principal

componente analysis (PCA), a qual busca correlacionar a variável dependente

(atividade biológica) com as variáveis independentes (descritores moleculares) de uma

única vez, sendo extremamente útil em estudos de QSAR nos quais é gerada uma

quantidade muito grande de variáveis. O método de PLS reduz as variáveis iniciais pela

construção de variáveis latentes, que são combinações lineares das variáveis iniciais

(SALUM; ANDRICOPULO, 2009).

A análise por PLS gera uma equação de regressão que correlaciona os valores

dos bins dos hologramas com as respectivas atividades biológicas (ABs) (Equação 1).

47

∑

(Eq. 1)

Na Equação 1, ABi é a atividade biológica do i-ésimo composto, xij é o valor de

ocupação do holograma molecular do i-ésimo composto no bin j, Cj é o coeficiente para

o bin j derivado da análise por PLS, e L é o comprimento do holograma (Figura 13).

Figura 13. Esquema geral da geração de hologramas moleculares e modelos de HQSAR (Adaptado de

MYINT; XIE, 2010).

Para a identificação do número adequado de variáveis ou componentes que

resulta em um modelo ótimo, é realizado o processo de validação interna do modelo por

LOOCV, uma técnica que consiste na exclusão sistemática de cada composto do

48

conjunto de treinamento, seguida pela predição da sua respectiva atividade biológica

pelo novo modelo gerado a partir dos compostos restantes até que todos os compostos

tenham sido excluídos uma vez.

Um problema do método de HQSAR é o fenômeno chamado de colisão de

fragmentos que pode ocorrer durante o processo de ordenação dos fragmentos, o que

pode fazer com que existam hologramas com diferentes fragmentos no mesmo bin. A

alteração dos comprimentos dos hologramas, os quais controlam o número de bins em

cada holograma, modifica os padrões das ocupações dos bins. Os comprimentos dos

hologramas podem ser definidos e existem 12 comprimentos padrões previamente

testados com bons resultados em diferentes conjuntos de dados que geram grupos

únicos de colisões de fragmentos (LOWIS, 1997).

A técnica de HQSAR também fornece informações úteis sobre a relação entre

cada fragmento de um ligante e a atividade biológica do mesmo. Estes fragmentos

podem ser facilmente visualizados nos denominados “mapas de contribuição” (Figura

14), que refletem a contribuição individual de cada átomo ou fragmento estrutural de

uma dada molécula bioativa do conjunto de dados (HURST; HERITAGE, 2001). Estes

mapas de contribuição podem fornecer informações diretas para os químicos sintéticos

medicinais e podem auxiliar no processo de planejamento de novos fármacos

(ALBUQUERQUE et al., 2007).

Figura 14. Representação de um mapa de contribuição de um ligante da série de ácidos 2-(oxalilamino)

benzoicos (Adaptado de CHENG et al., 2010).

49

A técnica de HQSAR tem sido frequentemente aplicada a diversos conjuntos de

dados com resultados excelentes (BHANSALI; KULKARNI, 2014; CHENG et al., 2010;

PALANGSUNTIKUL et al., 2013; TROSSINI; MALTAROLLO; SCHMIDT, 2014).

1.3.1.2 QSAR 3D: CoMFA e CoMSIA

O CoMFA é um método de QSAR que descreve as relações entre estrutura

tridimensional e atividade, pois considera as estruturas tridimensionais dos ligantes,

para as quais são gerados campos moleculares estéricos e eletrostáticos que são

sobrepostos e, portanto, é considerado um método que depende do alinhamento

molecular e da determinação das conformações bioativas dos ligantes. Estes campos

moleculares são os descritores que são correlacionados com a atividade biológica por

meio de uma equação matemática (CRAMER; PATTERSON; BUNCE, 1988).

O conjunto de dados a ser modelado pelo método CoMFA deve possuir uma

característica: todos os ligantes devem interagir com a mesma proteína alvo, seja ela

um receptor, enzima ou transportador, segundo um mesmo modo de ligação com a

mesma geometria relativa (KUBINYI, 2003). Este conjunto deve ser dividido em

conjuntos de treinamento e teste de forma semelhante ao executado na análise por

HQSAR.

Em seguida, é necessário o cálculo das cargas atômicas parciais e a seleção das

prováveis conformações bioativas pela definição da hipótese farmacofórica, a partir de

estudos de docagem previamente realizados ou de dados cristalográficos obtidos da

literatura (GOLBRAIKH; BERNARD; CHRÉTIEN, 2000). Quando não há informações

sobre qual é a conformação bioativa, o consenso é a utilização da conformação de

menor energia (RODRIGUES, 1999). A etapa de alinhamento (e sobreposição) do

conjunto de dados é complexa, principalmente quando as estruturas 3D dos ligantes

não são semelhantes (IVANCUIC, 2000), o que significa que um alinhamento ideal é

algo muito difícil, mesmo para séries congêneres.

Após o alinhamento, os compostos sobrepostos são inseridos numa caixa,

mantendo-se uma distância mínima entre os compostos e os limites da caixa. Define-

50

se, então, a distância da grade que gerará pequenos cubos no interior da caixa, cujo

valor padrão é de 2 Å, podendo ser variado, embora a diminuição desta distância

aumente exponencialmente o tempo de cálculo dos campos moleculares (BRITO,

2008).

Os campos moleculares são calculados, separadamente, para cada composto do

conjunto de dados, utilizando um átomo de prova, que simula átomos da proteína

receptora, podendo ser de diversos tipos, os mais comuns são: carbono sp3 com carga

+1, hidrogênio com carga +1 e oxigênio sp3 com carga -1 (CHO; TROPSHA, 1995). Os

campos estéricos são calculados de acordo com a função potencial de Lennard-Jones

(Equação 2), enquanto os campos eletrostáticos são calculados segundo a função

potencial de Coulomb (Equação 3).

∑

(Eq. 2)

Na Equação 2, EC é a energia de interação de Coulomb, qi é a carga parcial do

átomo i na molécula, qj é a carga do átomo de prova, rij é a distância entre o átomo i e o

ponto de interseção da grade onde o átomo de prova j é inserido, e D é a constante

dielétrica do meio (KUBINYI, 2003).

∑

(Eq. 3)

Na Equação 3, EvdW é a energia de interação de van der Waals, r ij é a distância

entre o átomo i e o ponto de interseção da grade onde o átomo de prova j é inserido, A ij

e Cij são constantes que dependem do raio de van der Waals de cada átomo na

molécula. É importante ressaltar que o termo Aijrij-12 descreve a repulsão, enquanto o

termo Cijrij-6 descreve a atração. Conforme a diminuição da distância entre os átomos

que interagem diminui, as energias de interação estérica e eletrostática tendem ao

infinito, o que ocorreria com a sobreposição dos mesmos, portanto, valores de corte

51

(cut-off) são definidos para evitar que este fenômeno ocorra (Figura 15) (KUBINYI,

2003).

Figura 15. Diagrama representando os potenciais eletrostático (Coulomb) e de van der Waals (Lennard-

Jones) em função da distância interatômica (Adaptado de KUBINYI, 2003).

A obtenção do modelo de CoMFA (incluindo a validação interna) e a validação

externa do mesmo são realizadas pelas mesmas técnicas utilizadas na análise por

HQSAR: PLS e LOOCV, respectivamente. A Equação 4 mostra a relação entre a

atividade biológica (AB) e os campos moleculares obtidos. Também é necessária a

validação externa do modelo para estabelecer a sua capacidade de predizer a atividade

biológica de outros compostos relacionados (i.e., dos compostos do conjunto de teste).

∑

(Eq. 4)

Na Equação 4, ABi é a atividade biológica do i-ésimo composto, Fij é a j-ésima

energia de campo (eletrostática/estérica) calculada para o composto i, e aij é o

coeficiente associado a esta energia.

52

A visualização das interações eletrostáticas e estéricas favoráveis e

desfavoráveis para a atividade biológica do conjunto de dados pode ser realizada pelos

mapas de contorno tridimensionais, sendo possível a identificação de sítios de

interação com o receptor. Um esquema geral da análise por CoMFA é mostrado na

Figura 16.

Figura 16. Esquema geral da análise por CoMFA (Adaptado de MYINT; XIE, 2011).

53

O CoMSIA é um método semelhante ao CoMFA, pois também é dependente de

alinhamento molecular, onde os compostos sobrepostos também são inserido numa

caixa gradeada, com diferenças no método de cálculo dos descritores. No CoMSIA, os

descritores são calculados em termos de índices de similaridade, ao invés de funções

de potenciais de interação, como as funções de Coulomb e de Lennard-Jones. O índice

de semelhança AF para um determinado composto j com átomos i em um ponto da

caixa q é uma função do tipo Gaussiana, dependente da distância e é determinado de

acordo com a Equação 5.

∑

(Eq. 5)

Na Equação 5, wprova,k é o átomo de prova, wi,k é o valor da propriedade química

k do átomo i, riq é a distância entre o átomo de prova e o átomo i do composto, e α é o

fator de atenuação (KLEBE; ABRAHAM; MIETZNER, 1994).

Neste método, podem ser avaliadas cinco propriedades físico-químicas: estérica,

eletrostática, hidrofóbica, doadora e aceptora de ligação hidrogênio. Para esta

avaliação, usa-se um único átomo de prova com raio de 1 Å, carga igual a +1 e

propriedades de ligação hidrogênio e hidrofóbica. Os índices estéricos estão

relacionados à terceira potência da distância, os índices eletrostáticos derivam das

cargas atômicas parciais previamente calculadas, os índices hidrofóbicos são baseados

no logaritmo do coeficiente de partição (n-ocatanol/água) (VISWANADHAN et al., 1989)

e os índices relacionados às propriedades doadoras e aceptoras de ligação hidrogênio

baseiam-se em um conjunto de regras determinadas a partir de valores determinados

experimentalmente (KLEBE; MIETZNER; WEBER, 1999).

Os valores do fator de atenuação podem variar entre 0,2 e 0,4. Valores maiores

do que 0,4 resultam em funções Gaussianas mais íngremes e que atenuam mais

fortemente os efeitos dependentes da distância no cálculo dos índices de similaridade.

Desta forma, valores mais altos de α significam avaliações mais localizadas da

similaridade, enquanto valores mais baixos de α significam avaliações mais globais (DA

CUNHA, 2006).

54

1.3.2 Docagem Molecular

A docagem molecular (do inglês, molecular docking) é uma técnica de

modelagem molecular que busca predizer modos de ligação (encaixe) entre duas (ou

mais) moléculas, dadas as suas respectivas coordenadas atômicas (HALPERIN et al.,

2002). Um método de docagem bem sucedido deve conseguir predizer a conformação

nativa do ligante no interior do sítio de ligação da proteína, assim como as interações

moleculares relacionadas ao complexo ligante-proteína (JAIN; NICHOLLS, 2008). Além

disso, o método deve permitir a distinção entre ligantes e não ligantes e ordenar

corretamente os ligantes do conjunto de dados (KOLB; IRWIN, 2009).

Os algoritmos básicos de um método de docagem capaz de gerar e avaliar as

conformações de um determinado ligante são os algoritmos de busca (pesquisa) e de

função de pontuação. A capacidade de tratar a flexibilidade molecular intrínseca do

sistema e de descrever corretamente a energia das interações ligante-proteína é um

fator crítico no desenvolvimento de métodos de docagem úteis no planejamento de

fármacos (GUEDES; DE MAGALHÃES; DARDENNE, 2013).

Os algoritmos de busca podem ser classificados em três grupos principais de

acordo com o método empregado na exploração da flexibilidade do ligante: algoritmos

de busca sistemática, estocástica e determinística; sendo que alguns algoritmos são

considerados híbridos, pois associam duas ou todas as estratégias (BROOIJMANS;

KUNTZ, 2003).

Os algoritmos de busca sistemática exploram todos os graus de liberdade do

ligante e, por sua vez, podem ser classificados em três grupos: exaustivo, construção

incremental e conjunto de conformações. Os algoritmos por busca exaustiva exploram,

sistematicamente, os valores de cada grau de liberdade de modo combinatório

(HUANG; GRINTER; ZOU, 2010). Os algoritmos de busca por construção incremental

fragmentam o ligante em subunidades e selecionam e encaixam um fragmento-base no

sítio de ligação do receptor, reconstruindo o ligante via ligações covalentes sucessivas

dos demais fragmentos ao fragmento-base (SMELLIE; CRIPPEN; RICHARDS, 1991).

Os algoritmos de busca por conjunto de conformações encaixam de forma rígida um

determinado grupo de conformações ao sítio de ligação (EWING et al., 2001).

55

Os algoritmos de busca estocástica ou randômica modificam, aleatoriamente,

todos os graus de liberdade do ligante (translacional, rotacional e conformacional) a

cada etapa, gerando uma grande diversidade de soluções (poses). Estas poses são

avaliadas de acordo com um determinado critério probabilístico para ser decidido quais

serão rejeitadas ou não. Estes métodos não garantem a convergência para uma

solução ótima e, portanto, devem ser realizadas várias corridas independentes para

encontrar o mínimo global de energia. Como exemplos destes algoritmos, podem ser

citados os métodos de Monte Carlo, algoritmos evolucionários, busca tabu e otimização

por enxame (HUANG; GRINTER; ZOU, 2010).

Nos algoritmos determinísticos, o estado atual do sistema determina as

modificações que serão realizadas para alcançar o próximo estado; ou seja, uma

solução depende fortemente da estrutura antecessora, pois uma determinada

configuração estrutural inicial associada a um determinado conjunto de parâmetros

resultará sempre no mesmo estado final. Como exemplos destes algoritmos, podem ser

citados os métodos de minimização de energia e de dinâmica molecular (GUEDES; DE

MAGALHÃES; DARDENNE, 2013).

As funções de pontuação avaliam a qualidade das soluções geradas pelos

algoritmos de busca, indicando quais poses são as mais relevantes durante o processo

de docagem. Estas funções devem ser capazes de distinguir as soluções em função da

sua energia de ligação, classificar ligantes como ativos ou inativos e predizer

constantes de afinidade e classificar as diversas soluções de acordo com a potência

(CHENG et al., 2009). Estas funções podem ser divididas em três tipos: baseadas em

campos de força, empíricas e baseadas em conhecimento (WANG et al., 2005).

As funções baseadas em campos de força consistem em uma soma de termos

de energia e, usualmente, consideram as energias de interação entre ligante e proteína,

além da energia interna do ligante (MORRIS et al., 1998; VERDONK et al., 2003). As

funções empíricas são baseadas na ideia de que é possível correlacionar a energia livre

de ligação a uma soma ponderada de variáveis não relacionadas, cujos coeficientes

são obtidos por análise de regressão, utilizando dados de afinidade experimentais (DE

AZEVEDO; DIAS, 2008). As funções baseadas em conhecimento empregam análise

estatística das interações entre de pares de átomos de complexos sistema ligante-

56

proteína experimentais, e o resultado desta análise é convertido em um

pseudopotencial que descreve a geometria dos pares de átomos do sistema ligante-

proteína problema (WALLQVIST; COVELL, 1996).

A inclusão da flexibilidade proteica nos protocolos de docagem é um grande

desafio neste campo. Apesar de gerar resultados mais próximos da realidade em

função da grande liberdade conformacional de proteínas em geral, esta inclusão gera

um custo de tempo de cálculo e de capacidade computacional muito maior do que em

análises que consideram proteínas rígidas (GUEDES; DE MAGALHÃES; DARDENNE,

2013).

O Molegro Virtual Docker (MVD) é um programa para estudos de docagem que

utiliza algoritmos de busca combinados com um algoritmo de predição de cavidades

que identifica de forma rápida e precisa os potenciais modos de ligação entre ligante e

proteína. Este programa contém três tipos de algoritmos de busca e dois tipos de

funções de pontuação, que podem ser combinados para obter a associação que melhor

se aplica ao sistema problema. Os algoritmos de busca inclusos no MVD são: MolDock

Optimizer, MolDock Simplex Evolution (SE) e Iterated Simplex; e as funções de

pontuação são: MolDock Score e PLANTS Score.

O algoritmo de busca padrão do MVD é o MolDock Optimizer que é baseado em

uma classe de algoritmos evolucionários conhecida como evolução diferencial, que

gera soluções-filhas a partir da diferença ponderada das soluções-pais selecionadas

aleatoriamente da população de soluções (STORN; PRICE, 1997). O MolDock SE é um

algoritmo estocástico alternativo aplicável a ligantes com muitos graus de liberdade,

funcionando em sistemas onde o algoritmo padrão falha, pois combina a construção

incremental das poses com a escolha aleatória de indivíduos para o início da busca

pelas soluções de menor energia. O Iterated Simplex gera soluções que são

sucessivamente refinadas, utilizando níveis de tolerância de diferenças de energia de

ligação entre as melhores e piores soluções cada vez menores até um número máximo

de repetições previamente determinado (THOMSEN; CHRISTENSEN, 2006).

A função de pontuação MolDock Score é derivada de funções do tipo potencial

linear composto - piecewise linear potential (PLP), originalmente propostas por

Gehlhaar e colaboradores (GEHLHAAR; BOUZIDA; REJTO, 1998; GEHLHAAR et al.,

57

1995), e posteriormente modificada por Yang e Chen (YANG & CHEN, 2004), definida

pela Equação 6.

(Eq. 6)

Na Equação 6, Einter é a energia de interação entre ligante e proteína e Eintra é a

energia interna do ligante. A energia de interação ligante-proteína (Einter), por sua vez, é

definida pela equação 7.

∑ ∑ [ ( )

]

(Eq. 7)

Na Equação 7, EPLP é o potencial linear composto (PLP); enquanto o segundo

termo descreve as interações eletrostáticas do sistema. Nesta equação, a soma

engloba todos os átomos pesados (ou seja, todos os átomos com exceção do átomo de

hidrogênio), incluindo água e cofatores presentes no sistema, e o valor de 332 é

utilizado para que a unidade de energia seja Kcal/mol (THOMSEN; CHRISTENSEN,

2006).

A energia interna do ligante (Eintra) é descrita pela Equação 8.

∑ ∑ ( ) ∑ [ ]

(Eq. 8)

Na Equação 8, a soma dupla no primeiro termo considera todos os pares de

átomos no ligante, excluindo os pares de átomos que estão conectados por duas

ligações ou menos. O segundo termo representa a energia torsional do ligante e é

parametrizado de acordo com a hibridização dos átomos que definem o ângulo de

torção (θ). O terceiro termo, Ecol, acrescenta penalidade à energia interna do ligante,

quando dois átomos não ligados estão a menos de 2,0 Å entre si, evitando

conformações improváveis do ligante (THOMSEN; CHRISTENSEN, 2006).

58

A função de pontuação PLANTS Score é definida pela Equação 9.

(Eq. 9)

Na Equação 9, o potencial fPLP é semelhante ao potencial PLP da função

MolDock Score, porém contendo mais tipos de interação. Os potenciais de colisão (fcol)

e torsional (ftors) levam em consideração colisões internas e contribuições torsionais

para ligações simples (KORB; STÜTZLE; EXNER, 2009), o termo cesfera aplica uma

penalidade caso o ligante encontre-se fora do sítio de ligação definido por uma esfera

no espaço e o último termo, -20, foi necessário para que os valores desta nova função

sejam comparáveis aos da função PLANTS inicial.

59

2 OBJETIVOS

Em função da grande importância que a enzima DYRK1A possui no processo de

desenvolvimento da doença de Alzheimer e do interesse no desenvolvimento de

inibidores desta enzima, este estudo tem por objetivo compreender a relação entre a

estrutura química e a atividade inibitória sobre a DYRK1A de uma série de 6-

arilquinazolina-4-aminas (46 compostos) e o modo de interação com a enzima alvo para

orientar o planejamento de novos potenciais candidatos a fármacos para o tratamento

de indivíduos acometidos por esta patologia. Para atingir estes objetivos, serão

construídos modelos de QSAR 2D (HQSAR) e 3D (CoMFA e CoMSIA) e serão obtidos

complexos ligante-enzima por método de docagem molecular.

60

3 METODOLOGIA

3.1 CONJUNTO DE DADOS ESTRUTURAL E BIOLÓGICO

Uma série de 46 compostos da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas foi obtida

de trabalhos publicados na literatura por Rosenthal e colaboradores, onde os ensaios

para a determinação da atividade biológica in vitro de cada composto da série seguiu o

mesmo protocolo experimental (ROSENTHAL et al., 2010, 2011). Alguns dos

compostos presentes nestes trabalhos não possuíam o valor exato da sua atividade

biológica, pois ultrapassaram o valor limite de quantificação da atividade do método

utilizado (10000 nM) e, portanto, não foram utilizados na construção dos modelos.

Os valores da atividade biológica dos compostos são expressos como a

concentração mínima necessária para inibir 50% da atividade catalítica da DYRK1A

humana (IC50, em nM). Estes valores foram convertidos para a unidade molar (M) e,

posteriormente, transformados em seus respectivos logaritmos inversos (pIC50). A

Tabela 2 apresenta as estruturas químicas dos compostos da série e seus respectivos

valores de pIC50, que estão regularmente distribuídos entre 5,05 e 7,85.

Tabela 2. Estruturas químicas dos 46 compostos da classe das 6-arilquinazolina-4-

aminas e seus respectivos valores de IC50 (nM) e pIC50. Os compostos do conjunto de

teste estão marcados com um asterisco.

N

N

NR3 R2

R1

Composto R1 R2 R3 IC50 (nM) pIC50

1

O

O

H S

62 7,21

2 O

H S

1262 5,90

61

Tabela 2. (cont.)

# a,b,c R1 R2 R3 IC50 (nM) pIC50

3* O

H S

3480 5,46

4 O

CH3

H S

5697 5,24

5

OCH3

H S

3152 5,50

6

Cl

H S

9012 5,05

7

O

O

F

H S

164 6,79

8 N

CH3

H S

4517 5,35

9

O

O

H S

180 6,74

10 O

OEtO

H S

1437 5,84

11* O

OH

H

S

4657 5,33

62

Tabela 2. (cont.)


12

O

O

CH3 S

31 7,51

13

O

O

CH2CH3 S

38 7,42

14

O

O

H S

H3C

1158 5,94

15

O

O

CH3

S

CH3

260 6,59

16

O

O

H

S

CH3

35 7,46

17

O

O

H O

84 7,08

18

O

O

CH3 O

98 7,01

19

O

O

H O

74 7,13

20*

O

O

H O

H3C

57 7,24

21

O

O

H O

126 6,90

63

Tabela 2. (cont.)


22

O

O

H O

H3C

93 7,03

23*

O

O

H

N

S

H3C

206 6,69

24

O

O

CH3

N

S

H3C

14 7,85

25

O

O

H

S

N

70 7,15

26

O

O

CH3

S

N

51 7,29

27

O

O

CH3

S

N

H3C

26 7,59

28

O

O

H N

N

H

155 6,81

29*

O

O

CH3 N

N

H

922 6,04

30

O

O

H

NNH

541 6,27

31

O

O

CH3 N

O

N

H3C

120 6,92

64

Tabela 2. (cont.)


32*

O

O

H O

93 7,03

33*

O

O

H

O

135 6,87

34*

O

O

H

30 7,52

35

O

O

H

76 7,12

36*

O

O

H

H3C

H3C

H3C

17 7,77

37 O

CH3

1136 5,94

38 O

OH

CH3

557 6,25

39 O

NHEt

H

H3C

H3C

H3C

594 6,23

40 O

OEtO

H

3629 5,44

O

S

CH3

S

CH3

O

H3C

65

Tabela 2. (cont.)


41 O

CH3

H

3388 5,47

42 O

OEtO

CH3

1501 5,82

43* O

OEtO

H

NNH

1406 5,85

44 O

OEtO

H N

N

H

2706 5,57

45 O

H

N

S

H3C

4820 5,31

46 O

OEtO

H

N

S

H3C

8307 5,08

a Os compostos do conjunto de teste estão marcados com asterisco.

b Os compostos 42 até o 46 são de

(Rosenthal et al., 2010), os outros compostos são de (Rosenthal et al., 2011). c Os compostos 32, 33, e

34 possuem centros de quiralidade e suas atividades biológicas são das suas respectivas misturas

racêmicas.

O

H3C

S

CH3

66

3.1.1 Conjuntos de Treinamento e Teste

Para os estudos de HQSAR, CoMFA e CoMSIA, o conjunto de dados contendo

os 46 compostos foi dividido em um conjunto de treinamento com 36 compostos,

incluindo o mais e o menos ativo; e um conjunto de teste com 10 compostos, que estão

assinalados com um asterisco na Tabela 2, representando, aproximadamente, 20% do

número total de compostos. A divisão não foi completamente aleatória para garantir a

diversidade química e de atividade biológica para os dois grupos. Os compostos 32, 33

e 34, contendo um único centro de quiralidade cada, foram incluídos no grupo teste,

pois seus valores de atividade biológica são das correspondentes misturas racêmicas,

entretanto, as suas formas enantioméricas (R e S) foram modeladas separadamente.

As distribuições dos valores de atividade biológica dos compostos do grupo de

treinamento e de teste podem ser observadas nas Figuras 17 e 18, respectivamente.

Figura 17. Gráfico da distribuição dos valores de atividade biológica (pIC50) dos 36 compostos (Rosenthal

et al. 2010; 2011) do grupo de treinamento.

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0

pIC

50

pIC50

67

Figura 18. Gráfico da distribuição dos valores de atividade biológica (pIC50) dos 10 compostos (Rosenthal

et al. 2010; 2011) do grupo de teste.

3.2 HQSAR

3.2.1 Construção das Estruturas dos Ligantes

As estruturas dos 46 compostos, incluindo os pares de enantiômeros dos

compostos 32, 33 e 34, foram construídas utilizando a ferramenta

Build disponível no programa Spartan versão 10 (Wavefunction, Inc.) (DEWAR et al.,

1985).

3.2.2 Obtenção dos Modelos de HQSAR

A modelagem por HQSAR foi realizada utilizando o programa SYBYL versão 8.0

(Tripos, Inc.). Durante o desenvolvimento dos modelos, foram utilizados os

comprimentos padrões de hologramas (53, 59, 61, 71, 83, 97, 151, 199, 257, 307, 353 e

401 bins), mantendo o tamanho de fragmento padrão (4-7 átomos). Em seguida, foi

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0

pIC

50

pIC50

68

verificada a influência dos tamanhos dos fragmentos na qualidade dos modelos,

avaliando-se o tamanho de 2 a 12 átomos por fragmento. Finalmente, seis tipos de

distinções de fragmentos foram combinadas, utilizando átomos (A), ligações (L),

conectividade (C), átomos de hidrogênio (H), quiralidade (Q) e átomos

doadores/aceptores de ligação hidrogênio (DA) (DE SOUZA et al., 2012).

Os modelos de HQSAR foram gerados por análise de PLS, enquanto a validação

interna foi realizada pelo método LOOCV. Subsequentemente, os melhores modelos de

HQSAR foram selecionados baseados na análise de diversos parâmetros estatísticos,

como o coeficiente de correlação quadrático (r2), o coeficiente de correlação da

validação cruzada (q2), o erro padrão da estimativa (EP) e o erro padrão da validação

cruzada (EPVC). Este procedimento também informa o número ótimo de componentes

principais (NC) e o comprimento do holograma utilizado (CH).

3.2.3 Teste de Randomização da Variável Y

Com o objetivo de avaliar uma possível correlação fortuita, foi realizado teste de

randomização (ou aleatorização) da variável Y (i.e., variável dependente), também

conhecido como randomização (ou aleatorização) da resposta; que consiste em um

procedimento de validação adicional onde os valores da atividade biológica são

randomizados e a análise por HQSAR é realizada novamente para o mesmo conjunto

de treinamento. Caso não haja correlação fortuita, os parâmetros estatísticos obtidos

devem ser desfavoráveis (RÜCKER; RÜCKER; MERINGER, 2007).

3.2.4 Validação Externa do Modelo e Detecção de Outliers

A validação externa do modelo é realizada com os compostos do conjunto de

teste, que não foram utilizados na construção do modelo, com o objetivo de avaliar a

capacidade preditiva do mesmo. Esta avaliação consiste no cálculo do coeficiente de

correlação quadrático preditivo (r2pred) definido pela Equação 10.

69

(Eq. 10)

Na Equação 10: DP é a soma dos desvios quadráticos entre os valores de

atividade biológica dos compostos do conjunto de teste e a atividade biológica média

dos compostos do conjunto de treinamento e PRESS é a soma dos desvios quadráticos

entre os valores de atividade biológica experimentais e os valores preditos pelo modelo

(CRAMER; PATTERSON; BUNCE, 1988). O requisito para um composto ser

considerado um outlier neste trabalho é apresentar um valor residual, ou seja, valor da

diferença entre a atividade biológica experimental e a predita, superior a uma unidade

logarítmica (SOBHIA; BHARATAM, 2005).

3.3 CoMFA e CoMSIA

3.3.1 Construção e Análise Conformacional das Estruturas dos Ligantes

A construção dos ligantes foi realizada como descrito no item 3.2.1. As

geometrias dos compostos foram otimizadas por mecânica molecular, utilizando o

campo de força MMFF e, em seguida, pelo método semi-empírico AM1, ambos

disponíveis no programa Spartan. As estruturas foram ainda submetidas à análise

conformacional sistemática padrão utilizando o método mecânico quântico semi-

empírico AM1 também disponível no programa Spartan.

3.3.2 Definição da Hipótese Farmacofórica

A hipótese farmacofórica foi derivada do modo de ligação do composto DJM2005

na DYRK1A (código no PDB: 2WO6 – resolução 2,5 Å) (Figura 19) (SOUNDARARAJAN

et al., 2013), um inibidor competitivo com o ATP, que possui alguma semelhança

estrutural com o composto 24, o mais ativo da série. Ambos os compostos possuem um

anel heteroaromático nitrogenado central ligado a dois grupos, cada um contendo um

anel aromático (Figura 20).

70

Figura 19. Modelo de ligação do inibidor DJM2005 à DYRK1A humana (Adaptado de

SOUNDARARAJAN et al., 2013).

Composto 24 DJM2005

S

N

H3C

N

N

NH3C O

O

N

N

NH

N

H

H

O

O

NH

H

Cl

Figura 20. Estruturas químicas dos compostos 24 e DJM2005 usados na definição da hipótese

farmacofórica.

3.3.3 Cálculo das Cargas Atômicas Parciais

Em função da contribuição eletrostática, tanto na análise por CoMFA quanto na

análise por CoMSIA, é importante verificar o efeito de diferentes abordagens de

cálculos de cargas atômicas parciais na qualidade dos modelos obtidos. Para isso, o

assinalamento das cargas atômicas parciais da série de compostos foi realizado pelo

ajuste das cargas a um potencial eletrostático molecular restrito (Restrained Molecular

71

Electrostatic Potential, RESP), empregando quatro métodos de cálculo de mecânica

quântica; os métodos semi-empíricos AM1 e PM3; o método da teoria funcional de

densidade (Density Funcional Theory, DFT), empregando o funcional B3LYP e o

conjunto de bases 6-31G*; e o método ab initio Hartree-Fock (HF), usando o conjunto

de bases 6-31G*; todos disponíveis no programa Spartan versão 10 (Wavefunction,

Inc.) (BRITO, 2008).

3.3.4 Alinhamento da Série de Compostos

Em estudos de CoMFA e CoMSIA, a etapa do alinhamento da série de

compostos é considerada crítica, pois as energias de interação entre ligante e proteína

dependem da posição espacial relativa entre diferentes grupos funcionais presentes

nas moléculas (PETERSON; SCHAAL; KARLÉN, 2006).

Um alinhamento pode ser considerado ótimo quando ocorre um máximo de

superposição dos campos eletrostáticos e estéricos de um determinado conjunto de

compostos. Assim, somente quando modelos forem gerados com alinhamentos válidos,

os seus resultados podem ser considerados pertinentes e significantes (PERKINS et al.,

2003).

Os compostos foram exportados para o programa SYBYL versão 8.0 (Tripos,

Inc.) e foram alinhados segundo o método distill rigid. Este método identifica uma

estrutura comum a toda série congênere e baseia-se nesta estrutura comum para

alinhar os compostos. A eficiência deste método de alinhamento e sua aplicação de

estudos de QSAR-3D já foram descrita em estudos anteriores (PATEL; GHATE, 2014;

VYAS et al., 2013).

3.3.5 Definição dos Átomos de Prova

Após o alinhamento, os compostos do conjunto de treinamento foram inseridos

em uma caixa tridimensional virtual, regularmente gradeada com espaçamento de 2,0

Å. Assim, em cada vértice das grades da caixa foram calculados os campos

moleculares eletrostáticos e estéricos, utilizando três tipos diferentes de átomos de

72

prova: átomo de carbono com hibridização sp3 e carga +1; átomo de hidrogênio com

carga +1; e átomo de oxigênio com hibridização sp3 e carga -1, mantendo o valor de

corte padrão do programa de 30 kcal.mol-1.

3.3.6 Definição dos Valores de Corte dos Campos Moleculares

Para avaliar a influência de diferentes valores de corte (cut-off) dos campos

moleculares na qualidade dos modelos de CoMFA, estes valores foram variados em

três níveis idênticos para ambos os campos eletrostático e estérico: 30 kcal.mol-1, 20

kcal.mol-1 e 10 kcal.mol-1, enquanto mantiveram-se fixos o método de assinalamento

das cargas parciais e o átomo de prova que gerou o melhor resultado.

3.3.7 Definição do Espaçamento da Grade

O melhor espaçamento da grade foi avaliado mantendo-se fixos os parâmetros

avaliados anteriormente que geraram as melhores equações durante o processo de

otimização dos modelos de CoMFA, e variando-se o espaçamento da grade em três

níveis: 1,0 Å, 1,5 Å e 2,0 Å.

3.3.8 Obtenção dos Modelos de CoMFA

Como na análise por HQSAR, os modelos de CoMFA foram obtidos por análise

de PLS, enquanto a validação interna foi realizada pelo método LOOCV, com a diferença

que, neste método, a análise é realizada duas vezes. A primeira análise é feita

juntamente com a validação cruzada, definindo-se o número máximo de componentes

principais extraídos como sendo N/5, onde N é o número de compostos do grupo de

treinamento, com o objetivo de evitar o superajuste do modelo (MELVILLE; HIRST,

2004). Esta análise gera os seguintes parâmetros estatísticos: coeficiente de correlação

da validação cruzada (q2); o erro padrão da validação cruzada (EPVC) e número ótimo

de componentes principais (NC); que corresponde ao primeiro mínimo do EPVC. A

segunda é realizada sem a validação cruzada e com o NC obtido na primeira análise e

73

gera os seguintes parâmetros: coeficiente de correlação quadrático (r2), o erro padrão

da estimativa (EP), o valor de Fisher (F) e as porcentagens de contribuição das

interações eletrostática (E) e estérica (S). As colunas com variação de energia menor

do que 2,0 kcal.mol-1 são automaticamente excluídas do cálculo, o que reduz,

significativamente, o tempo da análise sem prejudicar a qualidade do modelo gerado

pela mesma.

3.3.9 Teste de Randomização da Variável Y do Melhor Modelo de CoMFA

Nos estudos de QSAR 3D, também é necessário avaliar uma possível correlação

fortuita pelo teste de randomização da variável dependente Y. Este teste foi realizado

pela randomização dos valores da atividade biológica dos derivados da série e

construindo novos modelos de CoMFA para cada conjunto randomizado. Assim como

na análise por HQSAR, os índices estatísticos obtidos neste teste devem ser

desfavoráveis.

3.3.10 Validação Externa do Modelo de CoMFA e Detecção de Outliers

Os procedimentos de validação externa do modelo e de identificação de outliers

foram realizados de forma análoga a da análise de HQSAR descrita no item 3.2.4.

3.3.11 Obtenção dos Modelos de CoMSIA

A metodologia de CoMSIA foi aplicada ao mesmo conjunto de dados do estudo

de CoMFA, utilizando alinhamento, nível de teoria do assinalamento de cargas parciais,

átomo de prova e espaçamento da grade idênticos aos que geraram o melhor modelo

de CoMFA. Contudo, como a análise de CoMSIA permite a representação de campos

moleculares adicionais, além do eletrostático e do estérico, a mesma foi executada

utilizando cinco campos moleculares: eletrostático (E), estérico (S), hidrofóbico (H),

aceptor de ligação hidrogênio (A) e doador de ligação hidrogênio (D).

74

Além da utilização dos cinco campos moleculares em conjunto para gerar

modelos de QSAR, combinações entre 2, 3 e 4 índices foram testadas para gerar outros

modelos. A razão para isso é a possibilidade da substituição de um grupo funcional de

um ligante por outro que possa afetar os índices de similaridade de forma semelhante;

o que geraria modelos com informações redundantes (BÖHM; ST RZEBECHER;

KLEBE, 1999); por exemplo, a substituição de um grupo funcional carregado por um

não carregado afeta os índices eletrostático e hidrofóbico. Após a geração do modelo

de CoMSIA com os melhores parâmetros, investigou-se a influência do fator de

atenuação (α) na qualidade dos modelos, para isso, foram avaliados três valores de α:

0,2, 0,3 e 0,4.

3.3.12 Teste de Randomização da Variável Y do Melhor Modelo de CoMSIA

O teste de randomização-Y realizado para o melhor modelo de CoMSIA foi

idêntico ao realizado para o melhor modelo de CoMFA descrito no item 3.3.9.

3.3.13 Validação Externa do Modelo de CoMSIA e Detecção de Outliers

Os procedimentos de validação externa do modelo e de identificação de outliers

foram realizados de forma análoga às das análises de HQSAR e CoMFA descritas nos

itens 3.2.4 e 3.3.9, respectivamente.

3.4 DOCAGEM MOLECULAR

3.4.1 Preparo dos Ligantes e da Proteína

Todas as simulações de docagem molecular foram realizadas no programa

Molegro Virtual Docker (MVD) versão 2008.2.4 (Molegro ApS), devido ao melhor

desempenho global de simulações de re-docagem e à maior velocidade de obtenção de

resultados utilizando este programa quando comparado com outros programas de

docagem molecular como o Autodock (ARAÚJO et al., 2011).

75

Para as simulações realizadas, todos os tipos de átomos e as ordens de ligação

foram corrigidos para as estruturas da enzima e dos ligantes, empregando o método de

preparação automático do programa (THOMSEN; CHRISTENSEN, 2006). Também

foram adicionados os átomos de hidrogênio em todas as estruturas. As cargas parciais

dos átomos dos ligantes utilizados na validação do protocolo de docagem e na

docagem propriamente dita foram assinaladas pelo método semi-empírico AM1 do

programa Spartan. Já as cargas parciais dos átomos da enzima foram assinaladas pelo

MVD. É importante ressaltar que, em todas as simulações, as ligações rotacionáveis

dos ligantes foram mantidas livres, a proteína foi considerada fixa, e todas as moléculas

de água, cofatores e íons foram excluídos dos complexos. As cavidades da enzima

foram identificadas pelo emprego de um algoritmo baseado em grid disponível no

programa (ARAÚJO et al., 2011).

3.4.2 Validação do Protocolo de Docagem (Re-docagem)

Nesta etapa, é importante identificar qual das combinações entre algoritmos de

busca e funções de pontuação se adequa melhor ao sistema. Como não há um ligante

da série congênere cristalizado com a DYRK1A, foram obtidas no Protein Data Bank

(PDB) estruturas tridimensionais da enzima co-cristalizadas com ligantes que se

adequavam aos seguintes critérios: resolução menor que 2,50 Å e número de ligações

rotacionáveis entre 4 e 8, mesma faixa de liberdade conformacional dos ligantes da

série das 6-arilquinazolina-4-aminas.

Nesta avaliação, foram combinados os algoritmos de busca MolDock Optmizer,

MolDock SE e Iterated Simplex com as funções de pontuação MolDock Score e

PLANTS Score. A única exceção foi a combinação entre o algoritmo MolDock SE e a

função PLANTS Score que não é possível de ser realizada no programa.

Os parâmetros das simulações utilizados nesta simulação foram os seguintes: a

população de partida utilizada foi de 50 para os algoritmos MolDock Optimizer e

MolDock SE e de 20 para o algoritmo Iterated Simplex; o número máximo de iterações

foi 2000 para o algoritmo MolDock Optimizer, 1500 para o MolDock SE e 100 para o

Iterated Simplex; todos valores padrão do programa. O número de corridas

76

independentes foi de 40 para todas as combinações, cada uma retornando uma única

solução.

No processo de avaliação do melhor protocolo, busca-se uma combinação que

gere soluções mais próximas possíveis da estrutura experimental. Esta similaridade é

uma medida da distância entre a solução gerada pelo programa e a estrutura do

complexo ligante-enzima experimental. Esta distância é calculada pela raiz do desvio

médio quadrático (root-mean-square deviation, RMSD), entre dois conjuntos de

coordenadas atômicas, neste caso, um do complexo ligante-proteína cristalizado e

outra das coordenadas das soluções obtidas pelo método de docagem, segundo a

Equação 11.

√

∑

(Eq. 11)

Na Equação 11, xc,i, yc,i e zc,i são as coordenadas espaciais do átomo i no ligante

cristalizado, xp,i, yp,i e zp,i são as coordenadas espaciais do átomo i na solução

resultante do processo de docagem, e n é o número de átomos do ligante. Um

resultado pode ser considerado aceitável quando o valor de RMSD é menor do que 2,0

Å (FRIESNER et al., 2004) e a combinação a ser escolhida é a que retorne o maior

número de soluções possíveis com valores de RMSD aceitáveis.

3.4.3 Docagem da Série de 6-arilquinazolina-4-aminas

Com a definição da melhor combinação de algoritmo de busca e função de

pontuação, os 46 ligantes foram submetidos ao processo de docagem e a enzima

utilizada foi a de código do PDB 4MQ1, pois é a estrutura com melhor resolução (2,35

Å). Os parâmetros foram idênticos aos utilizados no processo de re-docagem,

entretanto o número de poses retornadas foi de cinco.

A análise pormenorizada das soluções com as melhores pontuações foi realizada

para os compostos mais e menos ativos da série, os outliers dos estudos de QSAR e os

compostos com centros de quiralidade. Foram analisadas interações eletrostáticas,

77

hidrofóbicas (e.g., van der Waals e empilhamento-π) e ligações hidrogênio. A

apresentação dos resultados da docagem e a construção de superfícies hidrofóbica e

de ligação hidrogênio da proteína foram realizadas no programa Discovery Studio

Visualizer versão 4.1 (Accelrys Software Inc), devido à sua qualidade gráfica na

apresentação dos dados.

78

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 HQSAR

4.1.1 Avaliação do Parâmetro Distinção de Fragmentos na Qualidade dos

Modelos de HQSAR

Nesta primeira avaliação, foram investigadas diferentes combinações de

distinção de fragmentos, mantendo constante o tamanho dos fragmentos (4 – 7 átomos)

e selecionando todos os valores padrões de comprimento de hologramas disponíveis. O

número máximo de componentes principais foi definido em 15, um valor menor do que a

metade do número de compostos do grupo de treinamento e a análise gerou um total

de 16 modelos. A influência deste parâmetro na qualidade dos modelos de HQSAR

está indicada na Tabela 3.

De acordo com a Tabela 3, todos os modelos de HQSAR gerados são aceitáveis,

pois o menor valor de q2 é 0,640. Para diminuir o número de modelos analisados, foram

considerados somente os modelos com q2 maiores do que 0,730. Desta forma, foram

selecioados quatro modelos: A/L/C/Q/DA (q2=0,743), A/C/Q/DA (q2=0,742), C/H

(q2=0,740), e A/L (q2=0,732); os quais foram avaliados para investigar a influência do

tamanho dos fragmentos na qualidade dos modelos.

79

Tabela 3. Resumo dos índices estatísticos dos modelos de HQSAR para as diversas

combinações de distinção de fragmentos (DF), utilizando o tamanho padrão de

fragmentos (4-7 átomos) para os derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas

(N=36). Os quatros melhores modelos estão assinalados em negrito.

DFb Índices Estatísticosa

q2 r2 EP EPVC NC CH

A/L 0,732 0,847 0,373 0,493 3 61

A/C 0,728 0,799 0,421 0,489 2 353

A/H 0,640 0,782 0,444 0,571 3 199

A/DA 0,697 0,896 0,323 0,551 6 59

L/C 0,711 0,841 0,380 0,512 3 53

L/H 0,727 0,824 0,400 0,498 3 59

C/H 0,740 0,801 0,419 0,478 2 353

C/DA 0,720 0,834 0,394 0,512 4 61

A/L/C 0,724 0,855 0,323 0,500 3 53

A/L/H 0,670 0,781 0,446 0,547 3 401

A/C/H 0,656 0,818 0,413 0,567 4 401

A/C/DA 0,721 0,842 0,394 0,511 4 61

L/C/Q 0,711 0,841 0,380 0,512 3 53

A/L/C/H 0,691 0,777 0,443 0,521 2 353

A/C/Q/DA 0,742 0,876 0,341 0,491 4 257

A/L/C/Q/DA 0,743 0,917 0,284 0,498 5 53 a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro

padrão sem a validação cruzada; EPvc, erro padrão da validação cruzada; NC, número ótimo

de componentes; CH, comprimento do holograma; b DF, Parâmetros de distinção de

fragmentos: átomos (A); ligações (L); conexões (C); quiralidade (Q); átomos de hidrogênio (H)

e átomos doadores/aceptores de ligação hidrogênio (DA).

4.1.2 Avaliação do Tamanho dos Fragmentos na Qualidade dos Modelos de

HQSAR

Com o objetivo de melhorar os modelos construídos, oito novos modelos foram

gerados a partir de cada um dos quatro melhores modelos selecionados anteriormente,

considerando diferentes faixas de tamanhos de fragmentos, contendo entre 2 e 12

80

átomos, com variação de quatro unidades cada (2-5, 3-6, 4-7, 5-8, 6-9, 7-10, 8-11 e 9-

12 átomos). A variação do parâmetro de tamanho dos fragmentos não foi capaz de

melhorar significativamente os modelos com as seguintes distinções de fragmentos:

A/C/Q/DA e C/H. Entretanto, os modelos com distinções de fragmentos A/L/C/Q/DA e

A/L obtiveram uma melhora significativa e seus índices estatísticos estão mostrados

nas Tabelas 4 e 5, respectivamente.


combinações de tamanho de fragmentos (TF), utilizando o parâmetro de distinção de

fragmentos A/L/C/Q/DA para os derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas

(N=36). O melhor modelo está assinalado em negrito.

TFb Índices Estatísticosa

q2 r2 EP EPVC NC CH

2-5 0,734 0,855 0,362 0,491 3 401

3-6 0,757 0,937 0,251 0,493 6 53

4-7 0,743 0,917 0,284 0,498 5 53

5-8 0,751 0,883 0,331 0,483 4 53

6-9 0,738 0,871 0,347 0,496 4 61

7-10 0,732 0,920 0,282 0,518 6 53

8-11 0,681 0,906 0,302 0,556 5 151

9-12 0,642 0,804 0,421 0,570 3 151 a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro


de componentes; CH, comprimento do holograma; b TF, Tamanho dos fragmentos, de 2 a 12

átomos.

81


combinações de tamanho de fragmentos (TF), utilizando o parâmetro de distinção de

fragmentos A/L para os derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas (N=36). O

melhor modelo está assinalado em negrito.

TFb Índices Estatísticosa

q2 r2 EP EPVC NC HL

2-5 0,737 0,848 0,372 0,488 3 61

3-6 0,717 0,858 0,359 0,507 3 83

4-7 0,732 0,847 0,373 0,493 3 61

5-8 0,713 0,839 0,382 0,510 3 61

6-9 0,719 0,848 0,377 0,513 4 61

7-10 0,748 0,847 0,372 0,478 3 199

8-11 0,724 0,848 0,371 0,500 3 401

9-12 0,705 0,829 0,394 0,517 3 83 a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro


de componentes; CH, comprimento do holograma; b TF, Tamanho dos fragmentos, de 2 a 12

átomos.

O melhor modelo com o parâmetro de distinção de fragmentos A/L/C/Q/DA

contém de 3 a 6 átomos por fragmento (Tabela 3), enquanto o melhor modelo com o

parâmetro de distinção de fragmentos A/L contém de 7 a 10 átomos por fragmento

(Tabela 4). É importante ressaltar que o modelo com maior valor de q2 avaliado contém

cinco parâmetros de distinção de fragmentos (A/L/C/Q/DA) e um tamanho de fragmento

de 3 a 6 átomos, o que significa que a atividade biológica desta série de compostos

parece ser mais bem explicada por um modelo mais diversificado e com fragmentos de

tamanho reduzido, logo, a remoção de algum destes parâmetros de distinção resulta

em perda significativa de informação.

4.1.3 Teste de Randomização-Y

O teste de randomização-Y foi realizado de forma a avaliar a robustez dos

melhores modelos obtidos. Neste teste, os valores das atividades biológicas foram

82

randomizados e novas análises de HQSAR foram feitas. De acordo com a Tabela 6,

todos os modelos obtidos por este teste são estatisticamente ruins (o maior valor de q2

foi 0,211), o que reforça a robustez dos modelos originais, visto que a probabilidade de

que a correlação original tenha sido obtida ao acaso é baixa.

Tabela 6. Resumo dos índices estatísticos dos modelos de HQSAR do teste de

randomização-Y, utilizando o tamanho padrão de fragmentos (4-7 átomos) para os

derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas (N=36).

DFb Índices Estatísticosa

q2 r2 EP EPVC NC CH

A/L 0,143 0,396 0,694 0,827 2 353

A/C 0,117 0,722 0,502 0,895 6 59

A/H 0,058 0,381 0,703 0,867 2 199

A/DA 0,113 0,586 0,593 0,868 4 59

L/C 0,062 0,183 0,795 0,852 1 53

L/H 0,041 0,824 0,400 0,498 3 59

C/H 0,055 0,264 0,756 0,868 2 401

C/DA 0,089 0,202 0,785 0,840 1 53

A/L/C 0,211 0,713 0,510 0,846 6 61

A/L/H 0,044 0,351 0,719 0,873 2 401

A/C/H 0,045 0,359 0,715 0,872 2 353

A/C/DA 0,098 0,215 0,779 0,835 1 71

B/C/Q 0,062 0,183 0,794 0,852 1 53

A/B/C/H 0,051 0,314 0,739 0,870 2 257

A/C/Q/DA 0,106 0,222 0,776 0,832 1 71

A/B/C/Q/DA 0,099 0,235 0,770 0,835 1 151 a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro


de componentes; CH, comprimento do holograma; b DF, Parâmetros de distinção de

fragmentos: átomos (A); ligações (L); conexões (C); quiralidade (Q); átomos de hidrogênio (H)

e átomos doadores/aceptores de ligação hidrogênio (DA).

83

4.1.4 Validação Externa do Modelo e Detecção de Outliers

A capacidade preditiva dos dois modelos selecionados foi avaliada utilizando os

compostos do conjunto de teste pelo cálculo do parâmetro r2pred. Os valores das

atividades biológicas experimentais (Exp), preditas (Pred) e os resíduos (Exp – Pred)

dos derivados da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas obtidos pelos melhores

modelos de HQSAR com os parâmetros de distinção A/L/C/Q/DA e A/L são mostrados

nas Tabelas 7 e 8, respectivamente. Os gráficos comparativos entre os valores de Exp

e Pred dos grupos de treinamento e de teste com os parâmetros de distinção

A/L/C/Q/DA e A/L são mostrados nas Figuras 21 e 22, respectivamente

84

Tabela 7. Valores da atividade biológica experimental (Exp), predita (Pred) e resíduos

(Res) dos compostos da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas, utilizando o melhor

modelo de HQSAR com o parâmetro de distinção de fragmentos A/L/C/Q/DA. Os

compostos do conjunto de teste estão marcados com um asterisco.

# Exp Pred Res # Exp Pred Res

1 7,21 6,86 0,35 26 7,29 7,36 -0,07

2 5,90 5,52 0,38 27 7,59 7,38 0,21

3* 5,46 5,26 0,20 28 6,81 6,79 0,02

4 5,24 5,53 -0,29 29* 6,04 6,78 -0,74

5 5,50 5,45 0,05 30 6,27 6,25 0,02

6 5,05 4,98 0,07 31 6,92 6,76 0,16

7 6,79 6,82 -0,03 32 (R)* 7,03 7,13 -0,10

8 5,35 5,35 0,00 32 (S)* 7,03 7,25 -0,22

9 6,74 6,81 -0,07 33 (R)* 6,87 6,99 -0,12

10 5,84 5,89 -0,05 33 (S)* 6,87 6,98 -0,11

11* 5,33 6,14 -0,81 34 (R)* 7,52 7,20 0,32

12 7,51 7,26 0,25 34 (S)* 7,52 6,97 0,55

13 7,42 7,30 0,12 35 7,12 7,09 0,03

14 5,94 6,39 0,45 36* 7,77 6,93 0,84

15 6,59 7,33 -0,74 37 5,94 5,98 0,04

16 7,46 6,97 0,49 38 6,25 6,00 0,25

17 7,08 7,16 -0,08 39 6,23 6,20 0,03

18 7,01 7,08 -0,07 40 5,44 5,43 0,01

19 7,13 7,03 0,10 41 5,47 5,25 0,22

20* 7,24 6,78 0,46 42 5,82 5,19 0,63

21 6,90 6,83 0,07 43* 5,85 5,66 0,19

22 7,03 7,15 -0,12 44 5,57 5,06 0,51

23* 6,69 6,56 0,13 45 5,31 5,19 0,13

24 7,85 7,92 -0,07 46 5,08 4,73 0,35

25 7,15 7,28 -0,13

85

Tabela 8. Valores da atividade biológica experimental (Exp), predita (Pred) e resíduos

(Res) dos compostos da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas, utilizando o melhor

modelo de HQSAR com o parâmetro de distinção de fragmentos A/L. Os compostos do

conjunto de teste estão marcados com um asterisco.


1 7,21 6,89 0,32 26 7,29 7,25 0,04

2 5,90 5,35 0,55 27 7,59 7,30 0,29

3* 5,46 5,53 -0,07 28 6,81 6,57 0,24

4 5,24 5,63 -0,39 29* 6,04 6,98 -0,94

5 5,50 5,89 -0,39 30 6,27 6,88 -0,61

6 5,05 5,19 -0,14 31 6,92 7,08 -0,16

7 6,79 7,07 -0,28 32 (R)* 7,03 7,10 -0,07

8 5,35 5,00 0,35 32 (S)* 7,03 7,10 -0,07

9 6,74 6,68 0,06 33 (R)* 6,87 7,13 -0,26

10 5,84 5,39 0,45 33 (S)* 6,87 7,13 -0,26

11* 5,33 5,60 -0,27 34 (R)* 7,52 6,93 0,59

12 7,51 7,32 0,19 34 (S)* 7,52 6,93 0,59

13 7,42 7,45 -0,03 35 7,12 7,13 -0,01

14 5,94 6,84 -0,90 36* 7,77 7,25 0,52

15 6,59 7,35 -0,76 37 5,94 5,81 0,13

16 7,46 6,91 0,55 38 6,25 6,05 0,20

17 7,08 6,82 0,26 39 6,23 6,20 0,03

18 7,01 7,26 -0,25 40 5,44 5,36 0,08

19 7,13 6,99 0,14 41 5,47 5,19 0,28

20* 7,24 6,97 0,27 42 5,82 5,41 0,41

21 6,90 6,89 0,01 43* 5,85 5,39 0,46

22 7,03 6,85 0,18 44 5,57 5,07 0,50

23* 6,69 6,70 -0,01 45 5,31 5,16 0,16

24 7,85 7,24 0,61 46 5,08 5,21 -0,13

25 7,15 6,83 0,32

86

Figura 21. Gráfico dos valores de pIC50 preditos versus os valores de pIC50 experimentais para os grupos

de treinamento (azul) e de teste (vermelho), utilizando o melhor modelo de HQSAR com o parâmetro de

distinção de fragmentos A/L/C/Q/DA.

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00

pIC

50 p

red

ito

pIC50 experimental

Conjunto de treinamento

Conjunto de teste

87

Figura 22. Gráfico dos valores de pIC50 preditos versus os valores de pIC50 experimentais para os grupos

de treinamento (azul) e de teste (vermelho), utilizando o melhor modelo de HQSAR com o parâmetro de

distinção de fragmentos A/L.

Ambos os modelos não contêm outliers, pois em nenhum deles surgiu algum

composto com valor de resíduo maior do que uma unidade logarítmica. Entretanto, o

desvio padrão (DP) dos valores residuais do modelo com o parâmetro de distinção de

fragmentos A/L/C/Q/DA (DP = 0,322) é menor do que o do modelo com o parâmetro de

distinção de fragmentos A/L (DP = 0,379), indicando que os valores de pIC50 preditos

pelo primeiro modelo estão mais próximos dos valores experimentais. Os valores

calculados de r2pred para os modelos A/L/C/Q/DA (r2

pred = 0,659) e A/L (r2pred = 0,743)

são maiores do que 0,5, indicando que ambos os modelos possuem capacidade

preditiva aceitável.

Os compostos contendo um centro de quiralidade (32, 33 e 34), modelados nas

suas duas formas enantioméricas (R e S), apresentaram valores de pIC50 idênticos ou

muito próximos, independente do modelo ou do enantiômero, indicando que estes

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00

pIC

50 p

red

ito

pIC50 experimental

Conjunto de treinamento

Conjunto de Teste

88

centros de quiralidade não possuem relevância no estudo da relação entre estrutura e

atividade destes compostos, segundo o método HQSAR.

4.1.5 Análise dos Mapas de Contribuição

A análise abrangente de HQSAR envolve a interpretação dos mapas de

contribuição, que consistem em diagramas coloridos onde as contribuições positivas

para a atividade são representadas em amarelo e verde, as contribuições neutras, em

branco e as contribuições negativas, em laranja e vermelho. A Figura 23 mostra os

mapas de contribuição para o composto mais ativo (24) e para o menos ativo (6),

segundo os melhores modelos A/L/C/Q/DA (Figura 23A e A/L (Figura 23B). Neste

diagrama, a cor azul representa a parte da estrutura química comum a todos os

compostos da série.

89

Figura 23. Mapas de contribuição para os compostos mais ativo (24) e menos ativo (6) segundo os

melhores modelos A/L/C/Q/DA (A) e A/L (B). As estruturas dos compostos estão representadas em

modelo bastão e apenas os heteroátomos estão representados pela letra do elemento químico (Cl, N, O,

S). O espectro do amarelo ao verde indica que o fragmento tem contribuição positiva para a atividade

biológica; o espectro do laranja ao vermelho indica que o fragmento tem contribuição positiva para a

atividade biológica; a cor branca indica que o fragmento tem contribuição neutra para a atividade

biológica e a cor azul representa a estrutura comum a todos os compostos da série.

Considerando apenas os mapas de contribuição do composto 24 (mais ativo,

Figura 23), ambos os modelos foram capazes de identificar fragmentos que contribuem

positivamente para a atividade biológica, já que em ambos existem fragmentos

coloridos em amarelo e verde. Entretanto, o mesmo não ocorreu para o composto 6

(menos ativo, Figura 23), onde apenas o modelo A/L/C/Q/DA foi capaz de identificar

fragmentos que diminuem a atividade biológica, visto que apenas no mapa de

contribuição deste modelo existe um fragmento colorido em vermelho. No mapa obtido

pelo modelo A/L, somente aparecem fragmentos em branco (contribuição neutra) e azul

90

(estrutura comum), que não se correlacionam com a atividade biológica.

Consequentemente, o modelo A/L/C/Q/DA parece ser o mais capaz de fazer distinções

entre os compostos mais e menos ativos e, portanto, seria o modelo mais útil do ponto

de vista da química medicinal.

Uma característica adicional, observada apenas no mapa de contribuição do

composto 24 do modelo A/L/C/Q/DA (Figura 23A) é a presença de um fragmento

colorido em verde, que corresponde ao átomo de nitrogênio do anel tiazolila

(substituinte R3, Tabela 2). Como apenas este modelo possui o parâmetro de distinção

de fragmentos relacionado à presença de átomos doadores ou aceptores de ligação

hidrogênio, essa característica salienta a importância deste átomo como aceptor de

ligação hidrogênio em uma possível interação entre este composto e a DYRK1A, e

reforça o modelo A/L/C/Q/DA como sendo, de fato, o melhor; e, portanto, o único a ser

discutido a partir deste ponto.

O mapa de contribuição do composto 24, de acordo com o melhor modelo de

HQSAR, identifica três substituintes chamados R1, R2 e R3 (Tabela 2), que possuem

influência significativa na atividade biológica desta série de compostos. O anel 1,3-

benzo-dioxola (R1), o grupo metila (R2) e o grupo tiazolila (R3) estão presentes na

maioria dos compostos mais ativos, como os compostos 24, 26 e 27. De fato, todos

estes grupos possuem fragmentos (pelo menos um átomo) coloridos em verde ou

amarelo, salientando suas contribuições positivas para a atividade biológica.

O mapa de contribuição do composto 6, de acordo com o melhor modelo de

HQSAR, identifica um átomo colorido em vermelho localizado no grupo orto-cloro-fenila

(R1), que é prejudicial à atividade biológica, provavelmente, pelo fato do átomo de cloro

na posição orto impedir uma maior co-planaridade entre os anéis aromáticos, uma

característica possivelmente importante para a interação ligante-proteína. Além disso, a

presença de um fragmento colorido em vermelho e a ausência de fragmentos coloridos

em verde ou amarelo explicam a baixa atividade biológica do composto 6, assim como,

a substituição do grupo metila (R2) por hidrogênio e a substituição do grupo tiazolila (R3)

pelo grupo tiofenila.

Alguns destes resultados estão de acordo com os apresentados em um estudo

de modelagem por QSAR 3D, utilizando esta mesma série de derivados 6-

91

arilquinazolina-4-aminas (PAN; WANG; BRYANT, 2013). Neste estudo, foi observado

que a atividade inibitória da DYRK1A aumenta quando R1. é um grupo fenila com

substituintes hidrofílicos e retiradores de elétrons, R3 é um anel heterocíclico com um

substituinte hidrofóbico e R2 um substituinte volumoso e hidrofóbico. Por outro lado, a

atividade inibitória da DYRK1A decresce quando R2 é um átomo de hidrogênio, e R1 e

R2 são grupos aromáticos hidrofóbicos (PAN; WANG; BRYANT, 2013).

4.2 CoMFA e CoMSIA

4.2.1 Análise do Alinhamento dos Compostos

A estrutura comum calculada pelo método distill rigid (Figura 24A) corresponde

ao anel quinazolina com o grupo amino na posição 4, seguido por dois átomos de

carbono (R3) e o primeiro átomo de carbono do grupo R1 na posição 6. Analisando a

sobreposição da série congênere (Figura 24B), é possível observar uma excelente

sobreposição do anel quinazolina de todos os 46 derivados e, também, uma boa

sobreposição dos anéis aromáticos em R1 e dos grupos metila e hidrogênio em R2. Os

substituintes em R3 apresentam uma sobreposição mais distante da ideal em função da

grande diversidade estrutural de grupos nessa posição. Estes resultados indicam que o

alinhamento pelo método distill rigid foi capaz de sobrepor adequadamente os

derivados da série de 6-arilquinazolina-4-aminas.

92

Figura 24. (A) Estrutura comum calculada pelo método distill rigid para a série das 6-arilquinazolina-4-

aminas. (B) Sobreposição dos 46 derivados.

4.2.2 Avaliação do Melhor Método de Cálculo das Cargas Parciais

Posteriormente ao alinhamento, investigou-se qual método empregado para o

cálculo das cargas atômicas parciais geraria um melhor método de CoMFA, mantendo-

se constantes o átomo de prova (carbono sp3 e carga +1), o nível de corte de energia

(30 kcal.mol-1) e o espaçamento da grade (2,0 Å). A Tabela 9 mostra os parâmetros

estatísticos obtidos nesta primeira análise.

93

Tabela 9. Índices estatísticos dos modelos de CoMFA obtidos para os derivados da

série das 6-arilquinazolina-4-aminas em função do método de cálculo das cargas

parciais (N=36). Átomo de prova (Csp3 +1), valor de corte de energia (30 kcal.mol-1),

espaçamento da grade (2,0 Å).

Métodob Índices Estatísticosa

q2 r2 EP EPVC NC F S(%) E(%)

AM1 0,576 0,816 0,366 0,556 2 73280 40,3 59,7

PM3 0,568 0,812 0,370 0,561 2 71193 38,1 61,9

DFT 0,555 0,808 0,373 0,569 2 69601 40,2 59,8

HF 0,550 0,815 0,367 0,572 2 72765 43,3 56,7 a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro


de componentes; F, valor de Fisher; S, porcentagem da contribuição estérica; E, porcentagem

da contribuição eletrostática. b AM1, método semi-empírico AM1; PM3, método semi-empírico

PM3; DFT, método da teoria funcional de densidade empregando o funcional B3LYP e o

conjunto de bases 6-31G*; HF, método ab initio Hartree-Fock usando o conjunto de bases 6-

31G*.

É possível observar na Tabela 9 que os maiores valores de q2 e r2 foram obtidos

quando as cargas parciais foram calculadas pelo método semi-empírico AM1. Este

mesmo modelo apresentou os menores valores de erro padrão, com e sem a validação

cruzada, resultando no melhor desempenho preditivo entre os quatro modelos

avaliados. Segundo os valores de r2 encontrados, pode-se afirmar que todos os

modelos são capazes de explicar mais de 80% da variabilidade da atividade biológica

com dois componentes principais.

Em relação às porcentagens das contribuições estéricas e eletrostáticas e,

observa-se pouca diferença entre os modelos, visto que todos apresentam cerca de

40% de contribuição estérica e cerca de 60% de contribuição eletrostática. A maior

contribuição eletrostática pode ser devida à presença de heteroátomos mais

eletronegativos, como oxigênio e nitrogênio, na estrutura dos derivados que podem se

ligar à enzima via este tipo de interação intermolecular.

94

Ao final desta análise, o modelo utilizando o método AM1 para o cálculo das

cargas parciais foi escolhido como aquele a ser utilizado na continuidade das análises

dos impactos da variação de parâmetros de cálculo dos modelos de CoMFA.

4.2.3 Avaliação do Melhor Átomo de Prova

A segunda avaliação envolveu a análise do impacto do átomo de prova na

qualidade dos modelos de CoMFA. Para isso, foram mantidos o espaçamento da grade

(2,0 Å) e o nível de corte de energia (30 kcal.mol-1) e utilizou-se o método de cálculos

de cargas parciais AM1, identificado como o melhor método na etapa anterior, variando

apenas os átomos de prova: carbono sp3 com carga +1, hidrogênio com carga +1 e

oxigênio sp3 com carga -1. Os índices estatísticos obtidos nesta etapa da análise são

mostrados na Tabela 10.


série das 6-arilquinazolina-4-aminas em função do átomo de prova (N=36). Método de

cálculo de cargas parciais (AM1), valor de corte de energia (30 kcal.mol -1),

espaçamento da grade (2,0 Å).

Átomo de prova

Índices Estatísticosa


Csp3 (+1) 0,576 0,816 0,366 0,556 2 73280 40,3 59,7

H (+1) 0,603 0,827 0,355 0,546 3 78669 47,4 52,6

Osp3 (-1) 0,580 0,823 0,359 0,553 2 76724 43,3 56,7 a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro



da contribuição eletrostática.

É possível observar na Tabela 10 que a mudança do átomo de prova promoveu

uma melhora na capacidade preditiva do modelo, visto que ambos os modelos com

hidrogênio ou oxigênio como átomos de prova possuem maiores valores de q2 do que o

modelo com carbono. Entre os dois modelos novos, o modelo que utilizou hidrogênio

95

como átomo de prova apresentou os melhores parâmetros estatísticos e, portanto, foi

utilizado na etapa seguinte. O uso do hidrogênio como átomo de prova aumentou a

resolução do cálculo dos campos moleculares devido ao seu menor raio atômico, o que

permitiu uma maior proximidade com os ligantes no momento do cálculo.

4.2.4 Avaliação do Melhor Nível de Corte de Energia

Esta etapa consistiu na obtenção de modelos de CoMFA mantendo o método de

cálculo de cargas parciais (AM1), o átomo de prova (hidrogênio com carga +1), e o

espaçamento da grade (2,0 Å) e variando apenas o nível de corte de energia. A Tabela

11 mostra os modelos gerados em três níveis de corte de energia distintos: 10, 20 e 30

kcal.mol-1.


série das 6-arilquinazolina-4-aminas em função do nível de corte de energia (N=36).

Método de cálculo de cargas parciais (AM1), átomo de prova (H +1), espaçamento da

grade (2,0 Å).

Nível de corte (kcal.mol-1)



10 0,588 0,815 0,367 0,548 2 72548 42,7 57,3

20 0,584 0,821 0,361 0,550 2 75715 46,4 53,6

30 0,603 0,827 0,355 0,546 3 78669 47,4 52,6 a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro




Ao contrário do ocorrido na etapa anterior, o modelo obtido anteriormente

apresentou melhor desempenho do que os novos modelos gerados, ou seja, maiores

valores de q2 e r2 e menores valores de EP e EPVC e, portanto, foi mantido o valor de

corte em 30 kcal.mol-1 a ser utilizado na próxima etapa.

96

4.2.5 Avaliação do Melhor Espaçamento da Grade

A última etapa de refinamento dos modelos de CoMFA envolveu a manutenção

dos melhores parâmetros obtidos até agora (método de cálculo das cargas parciais:

AM1, átomo de prova: hidrogênio +1, nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1) e

variando somente o espaçamento da grade em três níveis: 1, 1,5 e 2,0 Å. Os

parâmetros estatísticos obtidos nesta última etapa podem ser observados na Tabela 12.


série das 6-arilquinazolina-4-aminas em função do espaçamento da grade (N=36).

Método de cálculo de cargas parciais (AM1), átomo de prova (H +1), nível de corte de

energia (30 kcal.mol-1).

Espaçamento da grade (Å)



1,0 0,608 0,891 0,286 0,542 3 87459 38,8 61,2

1,5 0,601 0,819 0,363 0,548 2 74750 43,9 56,1

2,0 0,603 0,827 0,355 0,546 3 78669 47,4 52,6 a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro




Segundo os dados da Tabela 12, é possível observar que a diminuição do

espaçamento da grade de 2,0 para 1,5 Å gerou um modelo com quase o mesmo

desempenho, mas a diminuição 2,0 para 1,0 Å gerou o modelo com os melhores

parâmetros estatísticos desta análise. Este modelo possui um valor de q2 ligeiramente

maior que o anterior e um valor de r2 bem maior do que o anterior, passando a explicar

quase 90% da variabilidade da atividade biológica dos compostos da série, além dos

menores valores de EP e EPVC e o maior valor de Fisher (único acima de 80000) entre

todos os modelos gerados até então. Pode ser observado, também, que em todas as

etapas da análise, modelos com NC iguais a 3 eram de qualidade superior aos modelos

com NC iguais a 2. Em função do melhor modelo de CoMFA obtido possuir

97

espaçamento da grade igual a 1,0 Å e o hidrogênio como átomo de prova, o qual possui

o menor raio atômico entre os átomos de prova testados, pode-se inferir que o modelo

responde de forma estatisticamente favorável a uma exploração mais minuciosa da

superfície da molécula, que não seria possível com átomos de prova com raios

atômicos maiores e com vértices da grade mais afastados entre si.

4.2.6 Validação Externa do Melhor Modelo de CoMFA e Detecção de Outliers

A capacidade preditiva do melhor modelo de CoMFA obtido foi verificada de

forma análoga ao do método de HQSAR, onde foi calculado o valor da diferença entre

as atividades biológicas experimentais e preditas pelo modelo e também o valor de r2pred

para este modelo. A Tabela 13 mostra os valores de Exp, Pred e dos resíduos (Exp –

Pred) dos derivados da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas obtidos pelo melhor

modelo de CoMFA (átomo de prova: H +1; método de cálculo das cargas parciais: AM1;

nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1 e espaçamento da grade: 1,0 Å).

98

Tabela 13. Valores das atividades biológicas experimentais (Exp), preditas (Pred) e

resíduos (Res) dos compostos da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas utilizando o

melhor modelo de CoMFA. Átomo de prova: H +1; método de cálculo das cargas

parciais: AM1; nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1 e espaçamento da grade: 1,0 Å.

Os compostos do conjunto de teste estão marcados com um asterisco.


1 7,21 6,72 0,49 26 7,29 7,44 -0,15

2 5,90 5,28 0,62 27 7,59 7,51 0,08

3* 5,46 5,13 0,33 28 6,81 7,06 -0,25

4 5,24 5,54 -0,30 29* 6,04 7,44 -1,40

5 5,50 5,70 -0,20 30 6,27 6,27 0,00

6 5,05 4,96 0,09 31 6,92 6,96 -0,04

7 6,79 6,57 0,22 32 (R)* 7,03 7,19 -0,16

8 5,35 5,31 0,04 32 (S)* 7,03 7,01 0,02

9 6,74 6,30 0,44 33 (R)* 6,87 7,01 -0,14

10 5,84 5,66 0,18 33 (S)* 6,87 7,11 -0,24

11* 5,33 5,52 -0,19 34 (R)* 7,52 6,98 0,54

12 7,51 7,26 0,25 34 (S)* 7,52 7,08 0,44

13 7,42 7,36 0,06 35 7,12 7,14 -0,02

14 5,94 6,60 -0,66 36* 7,77 7,13 0,64

15 6,59 7,18 -0,59 37 5,94 5,85 0,09

16 7,46 7,14 0,32 38 6,25 6,03 0,22

17 7,08 6,99 0,09 39 6,23 6,28 -0,05

18 7,01 7,33 -0,32 40 5,44 5,79 -0,35

19 7,13 7,15 -0,02 41 5,47 5,46 0,01

20* 7,24 7,07 0,17 42 5,82 5,95 -0,13

21 6,90 6,75 0,15 43* 5,85 5,90 -0,05

22 7,03 6,89 0,14 44 5,57 5,75 -0,18

23* 6,69 6,93 -0,24 45 5,31 5,51 -0,19

24 7,85 7,68 0,17 46 5,08 5,33 -0,25

25 7,15 7,10 0,05

99

A análise da Tabela 13 informa que apenas 13% dos compostos apresentaram

valor residual superior a 0,5 em valor modular. Este fato, somado ao valor calculado de

r2pred igual a 0,572 indicam que o modelo de CoMFA gerado possui capacidade preditiva

aceitável para novos compostos desta série congênere. É possível também observar a

presença de um composto outlier, composto 29, que pertence ao grupo de teste. Como

o composto 29 não foi considerado um outlier no estudo de HQSAR, o comportamento

do composto 29 provavelmente se deve a fatores tridimensionais. A Figura 25 mostra o

gráfico comparativo entre os valores de Exp e Pred dos grupos de treinamento e de

teste do melhor modelo de CoMFA, onde é possível observar o ponto relativo ao

composto 29 afastado dos demais, os quais seguem uma distribuição semelhante. Foi

possível observar também que os centros de quiralidade nos substituintes localizados

na posição R3 não parecem impactar na atividade biológica dos compostos, visto que

as diferenças nos valores de pIC50 preditos não diferem de forma significativa para os

enantiômeros dos compostos 32, 33 e 34.

Figura 25. Gráfico com os valores de pIC50 preditos versus os valores de pIC50 experimentais para os

grupos de treinamento (azul) e de teste (vermelho) utilizando o melhor modelo de CoMFA (átomo de

prova: H +1; método de cálculo das cargas parciais: AM1; nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1

e

espaçamento da grade: 1,0 Å).

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

pIC

50 E

xp

eri

me

nta

l

pIC50 Predito

Conjunto de Treinamento

Conjunto de Teste

29

100

4.2.7 Avaliação do Teste de Randomização-Y para o Melhor Modelo de CoMFA

O teste de randomização-Y foi realizado de forma ligeiramente diferente da

análise por HQSAR. Nesta etapa, quatro randomizações dos valores de atividade

biológica foram realizadas, seguidas pela elaboração de um modelo de CoMFA para

cada randomização, mantendo os mesmos parâmetros do melhor modelo de CoMFA

obtido no processo de refinamento. Os parâmetros estatísticos resultantes deste teste

encontram-se na Tabela 14.

Tabela 14. Índices estatísticos obtidos no teste de randomização-Y para o melhor

modelo de CoMFA: átomo de prova: H +1; método de cálculo das cargas parciais: AM1;

nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1 e espaçamento da grade: 1,0 Å.

# Índices Estatísticosa


1 -0,333 0,315 0,696 0,972 1 15671 36 64

2 -0,320 0,326 0,691 0,967 1 16408 36,1 63,9

3 -0,666 0,291 0,709 1,086 1 13948 40 60

4 -0,489 0,217 0,745 1,027 1 9398 41,4 58,6 a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro




Como esperado, os parâmetros estatísticos obtidos para as quatro

randomizações realizadas foram ruins. Valores baixos de r2, chegando a valores

negativos para q2 e valores muito altos para os desvios padrões com e sem validação

cruzada, o que descarta a correlação ao acaso entre a atividade biológica e os campos

moleculares calculados dos compostos pelo melhor método de CoMFA.

101

4.2.8 Análise dos Mapas de Contorno

Os mapas de contorno são representações dos vértices da grade onde as

diferenças nos valores dos campos estão associadas com diferenças na afinidade entre

ligante e proteína e, portanto, na atividade biológica dos mesmos, contribuindo com

informações úteis acerca do modo de ligação à enzima alvo.

No mapa de contorno estérico, áreas representadas por poliedros verdes são

regiões onde grupos volumosos são favoráveis à atividade biológica, enquanto áreas

representadas por poliedros amaralelos são regiões onde grupos volumosos são

desfavoráveis à atividade biológica. No mapa de contorno eletrostático, áreas

representadas por poliedros vermelhos são regiões onde grupos com grande densidade

eletrônica ou carga negativa são favoráveis à atividade biológica, enquanto áreas

representadas por poliedros azuis grupos são regiões onde grupos com grande

densidade eletrônica ou carga negativa diminuem a atividade biológica.

Os mapas de contorno estérico e eletrostático para o composto mais ativo da

série (24) são mostrados nas Figuras 26A e 26B, respectivamente.

102

Figura 26. Mapas de contorno do melhor modelo de CoMFA (átomo de prova: H +1; método de cálculo

das cargas parciais: AM1; nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1

e espaçamento da grade: 1,0 Å) obtido

para o composto 24 (modelo em bastão e colorido por elementos). (A) O mapa estérico indica as áreas

onde grupos volumosos aumentam (verde) ou diminuem (amarelo) a atividade biológica. (B) O mapa

eletrostático indica áreas onde grupos com grande densidade eletrônica ou carga negativa aumentam

(vemelho) ou diminuem (azul) a atividade biológica.

103

No mapa de contorno estérico do composto 24 (Figura 26A), podem ser

observadas duas regiões onde grupos volumosos aumentam a atividade biológica: a

primeira é na região onde se situa o grupo metila (R2) ligado ao átomo de nitrogênio do

grupo amino e a segunda é na região onde se localizam os átomos de hidrogênio do

grupo metilenodioxi do anel 1,3-benzo-dioxola (R1). A primeira região ilustra o fato dos

compostos que contém o grupo metila em R2 serem, em geral, mais ativos do que os

compostos que contém hidrogênio nesta posição, por exemplo, os cinco compostos

menos ativos da série possuem hidrogênio na posição R2 e, dos cinco compostos mais

ativos da série, os compostos 36 e 34 não possuem o grupo metila em R2. Compostos

análogos de 36 e 34 com grupos metila em R2 não fazem parte do conjunto de dados e

poderiam ser compostos com atividade maior do que os apresentados nesta série.

Regiões onde a presença de grupos volumosos diminui a atividade biológica

podem ser observadas ao redor no anel 1,3-benzo-dioxola em R1 e em alguns pontos

próximos do anel heterocíclico em R3. Isso reforça que anéis diferentes do 1,3-benzo-

dioxola em R1 como os ésteres etílicos do furano presentes nos compostos 40, 42, 43,

44 e 46 os quais possuem este grupo, possuem baixa atividade biológica. De fato,

todos estes compostos possuem pIC50 menores do que 6,0. A Figura 27 exemplifica a

presença do grupo éster etílico do furano do composto 46 na região onde grupos

volumosos são prejudiciais à atividade biológica dos compostos.

104

Figura 27. Mapa de contorno estérico do melhor modelo de CoMFA (átomo de prova: H +1; método de

cálculo das cargas parciais: AM1; nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1

e espaçamento da grade: 1,0 Å)

obtido para o composto 46 (modelo em bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde

grupos volumosos aumentam (verde) ou diminuem (amarelo) a atividade biológica.

Observando o mapa de contorno eletrostático do composto 24 (Figura 26B), é

possível observar duas regiões onde átomos com densidade eletrônica elevada são

favoráveis à atividade biológica. Estas regiões estão localizadas ao redor dos átomos

de oxigênio do grupo metilenodioxi do anel 1,3-benzo-dioxola, que são eletronegativos

e, portanto, conferem um aumento na atividade biológica dos compostos contendo esse

grupo.

Também é possível observar na Figura 26B que existem regiões onde átomos

com densidade eletrônica elevada são prejudiciais à atividade biológica, como por

exemplo, a região posicionada diante do carbono sp3 do grupo metilenodioxi do anel

1,3-benzo-dioxola, que possui carga parcial positiva em função da presença dos

átomos de oxigênio na vizinhança, o que reforça a importância deste anel para a

atividade biológica. A presença de grupos com alta densidade eletrônica também

diminui a atividade biológica em outra região próxima ao anel fenila na posição 6 do

105

anel quinazolina. Esta região se localiza precisamente onde o átomo de cloro do

composto 6 (o menos ativo da série) está presente (Figura 28).

Figura 28. Mapa de contorno eletrostático do melhor modelo de CoMFA (átomo de prova: H +1; método

de cálculo das cargas parciais: AM1; nível de corte de energia: 30 kcal.mol-1

e espaçamento da grade:

1,0 Å) obtido para o composto 6 (modelo em bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde

grupos com alta densidade eletrônica aumentam (vermelho) ou diminuem (azul) a atividade biológica.

Na figura 28, a presença de regiões de cor azul em volta do anel heterocíclico

em R3 deve-se ao fato de alguns derivados contendo anéis heterocíclicos com

substituintes metila apresentarem baixa atividade biológica. Entretanto, existem

compostos com baixa atividade biológica que não possuem grupos metila em anéis

heterocíclicos e, portanto este campo molecular não é uma região capaz de diferenciar

os compostos da série.

Os resultados de CoMFA apresentados estão em conformidade com um estudo

de QSAR 3D realizado por Pan e colaboradores com esta mesma série de compostos.

Este estudo utiliza características tridimensionais assim como o método de CoMFA,

mas a apresentação gráfica dos resiltados é semelhante à do HQSAR, pois aponta

regiões onde a presença de determinados grupos favorece ou não a atividade biológica,

106

sem especificificar a razão do favorecimento. Como resultados deste estudo, os autores

estabelecem que o anel 1,3-benzo-dioxola em R1 e o grupo metila em R2 são grupos

favoráveis para a atividade biológica, como no composto 24, assim como o átomo de

cloro ligado ao anel benzênico em R1 e o átomo de hidrogênio em R2 no composto 6

como desfavoráveis à atividade biológica (PAN; WANG; BRYANT, 2013).

.

4.2.9 Avaliação do Melhor Modelo de CoMSIA

O mesmo conjunto de treinamento utilizado para obter os modelos de CoMFA

foram utilizados para obter os modelos de CoMSIA, que foram gerados com o mesmo

conjunto de parâmetros utilizado para o melhor modelo de CoMFA, ou seja, método de

cálculo das cargas atômicas parciais (AM1), átomo de prova (hidrogênio com carga +1)

e espaçamento da grade (1,0 Å). As etapas de validação interna e externa,

determinação de outliers e visualização de mapas de contorno foram executadas da

mesma forma que no método CoMFA. Como o método CoMSIA utiliza funções

gaussianas para gerar os índices de similaridade, não há a necessidade de avaliação

de valores de corte de energia (cut-off), uma limitação do método CoMFA.

Desta forma, a primeira etapa da análise foi a obtenção de modelos de CoMSIA,

considerando diferentes combinações dos índices estérico (S), eletrostático (E),

hidrofóbico (H), doador (D) e aceptor (A) de ligação hidrogênio, mantendo o valor do

fator de atenuação (α) padrão igual a 0,3. Os resultados desta análise são mostrados

na Tabela 15.

107

Tabela 15. Índices estatísticos dos modelos de CoMSIA obtidos para os derivados da

série das 6-arilquinazolina-4-aminas (N=36) em função das diversas combinações de

campos moleculares (S, E, H, D, A).

Campos

Moleculares a

Índices Estatísticos b Contribuição (%)

q2 r2 EP EPVC NC F S E H D A

S + E 0,529 0,766 0,412 0,586 2 54044 14,4 85,6 - - -

0,355 0,653 0,511 0,697 4 16024 53,0 - - - 47,0

S + H 0,686 0,792 0,395 0,470 2 90627 23,2 - 76,8 - -

E + D 0,550 0,710 0,459 0,572 2 40382 - 80,5 - 19,5 -

E + A 0,514 0,733 0,441 0,594 2 45312 - 74,9 - - 25,1

E + H 0,700 0,762 0,410 0,460 1 108576 - 45,0 55,0 - -

H + D 0,675 0,794 0,395 0,486 2 63445 - - 79,5 20,5 -

H + A 0,663 0,745 0,393 0,497 3 60451 - - 66,2 - 33,8

S + E + H 0,690 0,758 0,413 0,468 1 106443 9,1 40,9 50,0 - -

S + E + A 0,518 0,751 0,426 0,592 2 49731 11,5 69,9 - - 18,6

S + E + D 0,526 0,703 0,465 0,587 2 39090 10,9 69,7 - 19,3 -

S + D + A 0,326 0,668 0,500 0,712 4 17106 36,5 - - 18,4 45,2

S + H + D 0,683 0,790 0,397 0,469 2 64247 14,4 - 67,8 17,8 -

S + H + A 0,665 0,785 0,401 0,495 3 61076 18,1 - 55,7 - 26,2

E + H + D 0,712 0,795 0,386 0,457 2 64168 - 33,2 49,5 17,3 -

E + D + A 0,499 0,774 0,412 0,613 3 36514 - 61,4 - 16,3 22,3

E + H + A 0,672 0,800 0,382 0,489 2 65937 - 35,8 49,5 - 14,7

H + D + A 0,668 0,784 0,414 0,490 2 53276 - - 57,3 26,2 16,5

S + E + H + A 0,672 0,806 0,376 0,489 2 68606 8,6 32,3 45,0 - 14,1

S + E + H + D 0,700 0,793 0,388 0,467 2 63138 7,2 30,6 45,8 16,5 -

S + E + D + A 0,499 0,766 0,419 0,613 3 34936 12,6 51,1 - 15,8 20,6

E + H + D + A 0,679 0,791 0,390 0,483 2 32451 - 26,4 42,5 14,6 16,5

S + H + D + A 0,701 0,819 0,368 0,474 3 48422 8,9 - 56,9 18,1 16

S + E + H + D + A 0,673 0,792 0,389 0,488 2 63005 5,9 24,7 39,9 14,1 15,4 a Campos moleculares: estérico (S), eletrostático (E), hidrofóbico (H), doador (D) e aceptor (A)

de ligação hidrogênio. b q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de

determinação; EP, erro padrão sem a validação cruzada; EPvc, erro padrão da validação

cruzada; NC, número ótimo de componentes; F, valor de Fisher; o símbolo “-“ foi utilizado

quando o campo molecular correspondente não foi considerado na construção do modelo.

Foram excluídos os modelos com valor de q2 menor ou igual a 0,3.

108

Considerando apenas os campos moleculares estérico e eletrostático, podem ser

comparados os valores de q2 do melhor modelo de CoMFA (q2 = 0,608) com o modelo

de CoMSIA (q2 = 0,529), onde é possível observar que o modelo de CoMFA é mais

preditivo do que o de CoMSIA correspondente. Entretanto, a inclusão dos três demais

campos moleculares gera um modelo de CoMSIA mais preditivo (q2 = 0,673) do que o

modelo de CoMFA (q2 = 0,608), indicando que a variação da atividade biológica desta

série congênere não depende apenas de parâmetros estéricos e eletrostáticos.

Ao analisar-se o modelo de CoMSIA contendo todos os campos moleculares, é

possível observar que o índice de similaridade hidrofóbico é o que mais contribui para a

explicação da variação da atividade biológica desta série (aproximadamente 40%), este

fato é corroborado pelo fato de que todos os modelos que contêm este índice possuem

maiores valores de q2 do que os que não o contêm.

Dentre os modelos de CoMSIA obtidos, o que possui maior valor de q2 e,

portanto, é o modelo com melhor validação interna, é o que possui três dos cinco

campos moleculares estudados: eletrostático, hidrofóbico e doador de ligação

hidrogênio e, portanto, foi utilizado para investigar o impacto do fator de atenuação (α)

nos modelos de CoMSIA. Este fator foi variado em três níves: 0,2, 0,3 e 0,4 e os

resultados encontram-se na Tabela 16.

Tabela 16. Índices estatísticos dos modelos de CoMSIA obtidos para os derivados da

série das 6-arilquinazolina-4-aminas (N=36) em função do fator de atenuação (α)

contendo os campos moleculares eletrostático (E), hidrofóbico (H) e doador de ligação

hidrogênio (D).

α Índices Estatísticos a Contribuição (%) b


0,2 0,713 0,796 0,385 0,457 2 64327 - 29,9 51,2 18,9 -

0,3 0,712 0,795 0,386 0,457 2 64168 - 33,2 49,5 17,3 -

0,4 0,712 0,794 0,387 0,458 2 63702 - 33,4 49,8 16,7 - a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro


de componentes; F, valor de Fisher. b Campos moleculares: estérico (S), eletrostático (E),

hidrofóbico (H), doador (D) e aceptor (A) de ligação hidrogênio.

109

De acordo com os resultados obtidos nesta etapa, é possível concluir que o fator

de atenuação não impacta nos índices estatísticos, visto que os parâmetros estatísticos

obtidos para todos os modelos praticamente não diferem entre si, sendo equivalentes

estatisticamente. Logo, os três modelos foram submetidos à validação externa.

4.2.10 Validação Externa do Melhor Modelo de CoMSIA e Verificação da Presença

de Outliers

A capacidade preditiva do melhor modelo de CoMSIA obtido foi verificada de

forma análoga ao procedimento realizado para o melhor modelo de CoMFA. Os valores

calculados de r2pred para os modelos de CoMSIA com fator de atenuação igual a 0,2, 0,3

e 0,4 foram 0,506, 0,487 e 0,490, respectivamente. Em função deste resultado, foi

possível concluir que apesar do fator de atenuação não impactar nos parâmetros

estatísticos da etapa de validação interna, o mesmo não ocorreu na validação externa

dos modelos, visto que para ser considerado um modelo preditivo o valor de r2pred deve

ser maior do que 0,5, algo que somente foi observado para o modelo com fator de

atenuação igual a 0,2 que obviamente foi considerado o melhor modelo.

A Tabela 17 apresenta os valores experimentais e calculados de atividade

biológica (pIC50, M) e os valores residuais considerando o melhor modelo de CoMSIA

dos derivados da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas.

110

Tabela 17. Valores de atividade biológica (pIC50, M) experimental (Exp), predita (Pred)

e resíduos (Exp – Pred) dos compostos da classe das 6-arilquinazolina-4-aminas

utilizando o melhor modelo de CoMSIA (campos moleculares E, H, D e fator de

atenuação α = 0,2). Os compostos do conjunto de teste estão marcados com um

asterisco.

# Exp Pred Resíduo # Exp Pred Resíduo

1 7,21 6,77 0,44 26 7,29 7,33 -0,04

2 5,90 5,39 0,51 27 7,59 7,31 0,28

3* 5,46 5,22 0,24 28 6,81 6,88 -0,07

4 5,24 5,84 -0,60 29* 6,04 7,30 -1,26

5 5,50 6,06 -0,56 30 6,27 6,88 -0,61

6 5,05 5,26 -0,21 31 6,92 7,29 -0,37

7 6,79 7,14 -0,35 32 (R)* 7,03 6,72 0,31

8 5,35 5,28 0,07 32 (S)* 7,03 6,66 0,37

9 6,74 7,01 -0,27 33 (R)* 6,87 6,85 0,02

10 5,84 5,53 0,31 33 (S)* 6,87 6,84 0,03

11* 5,33 5,65 -0,32 34 (R)* 7,52 6,81 0,71

12 7,51 7,26 0,25 34 (S)* 7,52 6,74 0,78

13 7,42 7,28 0,14 35 7,12 6,91 0,21

14 5,94 6,77 -0,83 36* 7,77 6,87 0,90

15 6,59 7,23 -0,64 37 5,94 5,84 0,10

16 7,46 6,81 0,65 38 6,25 6,10 0,15

17 7,08 6,78 0,30 39 6,23 5,93 0,30

18 7,01 7,25 -0,24 40 5,44 5,51 -0,07

19 7,13 6,89 0,24 41 5,47 5,49 -0,02

20* 7,24 6,81 0,43 42 5,82 5,54 0,28

21 6,90 6,80 0,10 43* 5,85 5,64 0,21

22 7,03 6,77 0,26 44 5,57 5,60 -0,03

23* 6,69 6,78 -0,09 45 5,31 5,43 -0,11

24 7,85 7,32 0,53 46 5,08 5,59 -0,51

25 7,15 6,76 0,39

Para o modelo de CoMSIA, aproximadamente 26% dos compostos apresentaram

valor residual superior a 0,5 (em módulo). O composto 29, considerado um outlier na

análise do modelo de CoMFA, também foi considerado um outlier nesta análise. Este

111

comportamento se deve, provavelmente, devido à similaridade estrutural com

compostos bastante ativos, como o composto 24, que também possui um grupo metila

em R2, um anel 1,3-benzo-dioxola em R1 e um anel heterocíclico em R3. A atividade

biológica deste composto foi superestimada em ambos os estudos de QSAR 3D.

Como estes estudos são independentes da estrutura tridimensional da enzima e

partem da premissa que todos os compostos interagem com a proteína da mesma

forma, a explicação da atividade biológica deste composto ser menor que a estimada é,

provavelmente, em função da conformação bioativa deste composto ser distinta dos

demais, o que pode ser avaliado em estudos de docagem molecular.

A Figura 29 mostra o gráfico comparativo entre os valores de Exp e Pred dos

compostos dos grupos de treinamento e de teste do melhor modelo de CoMSIA, onde

também é possível observar o ponto relativo ao composto 29 afastado dos demais,

bastante semelhante ao observado na Figura 25. As figuras 29 e 25 também apontam

uma perda de sensibilidade dos métodos de QSAR-3D, visto que compostos com

valores de Exp acima de 6,50 possuem valores de Pred subestimados, resultando em

um platô nessa região dos gráficos Exp versus Pred.

A exemplo do ocorrido para o modelo de CoMFA, o modelo de CoMSIA também

não é capaz de discriminar compostos com centros de quiralidade posicionados na

posição R3, visto que para os enantiômeros dos compostos 32, 33 e 34 não foram

preditas atividades biológicas distintas.

112

Figura 29. Gráfico com os valores de pIC50 preditos versus os valores de pIC50 experimentais para os

grupos de treinamento (azul) e de teste (vermelho) utilizando o melhor modelo de CoMSIA.

4.2.11 Avaliação do Teste de Randomização-Y para o Melhor Modelo de CoMSIA

O teste de randomização-Y foi realizado de forma idêntica a da análise por

CoMFA, onde quatro randomizações dos valores de atividade biológica foram

realizadas, seguidas pela elaboração de um modelo de CoMSIA para cada

randomização. Os parâmetros estatísticos resultantes deste teste encontram-se na

Tabela 18.

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00

pIC

50 p

red

ito

pIC50 experimental

Conjunto de Treinamento

Conjunto de Teste

29

113

Tabela 18. Índices estatísticos obtidos nas quatro randomizações da atividade biológica

no teste de randomização-Y para o melhor modelo de CoMSIA.

# Índices Estatísticos a Contribuição (%) b


1 -0,046 0,163 0,770 0,861 1 6622 - 36,8 22,1 41,2 -

2 -0,040 0,166 0,769 0,858 1 6752 - 35,9 21,7 42,3 -

3 -0,306 0,237 0,746 0,976 2 5120 - 65,1 24,2 10,6 -

4 -0,435 0,118 0,790 1,008 1 4555 - 56,5 21,9 21,7 - a q2, coeficiente de correlação da validação cruzada; r2, coeficiente de determinação; EP, erro


de componentes; F, valor de Fisher. b Campos moleculares: estérico (S), eletrostático (E),

hidrofóbico (H), doador (D) e aceptor (A) de ligação hidrogênio.

Assim como no teste para o modelo de CoMFA, foram encontrados valores de r2

muito baixos, valores de q2 negativos para e valores altos para os desvios padrões com

e sem validação cruzada, o que também exclui a possibilidade de correlação ao acaso

entre a atividade biológica e os campos moleculares calculados para os compostos no

melhor modelo de CoMSIA.

4.2.12 Análise dos Mapas de Contorno

Em função do melhor modelo de CoMSIA conter apenas campos moleculares

eletrostático, hidrofóbico e doador de ligação hidrogênio, somente estes três tipos de

mapas foram obtidos. O mapa eletrostático para o composto 24 (o mais ativo da série)

pode ser observado na Figura 30, onde é possível perceber a semelhança com o mapa

eletrostático obtido pelo método de CoMFA (Figura 26B). Ambos os mapas indicam a

importância do anel 1,3-benzo-dioxola para a atividade biológica da série congênere,

tanto pela presença de regiões nas quais átomos com elevada densidade eletrônica

aumentam a atividade biológica correspondendo aos átomos de oxigênio deste grupo,

quanto pela presença de regiões nas quais átomos com elevada densidade eletrônica

diminuem a atividade biológica correspondendo aos átomos de carbono vizinhos aos

114

átomos de oxigênio os quais possuem cargas parciais positivas, como exemplificado na

Figura 31.

Figura 30. Mapa de contorno eletrostático do melhor modelo de CoMSIA (átomo de prova: H +1; método

de cálculo das cargas parciais: AM1; espaçamento da grade: 1,0 Å; campos moleculares: estérico,

hidrofóbico e doador de ligação hidrogênio; fator de atenuação 0,2) obtido para o composto 24 (modelo

em bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde grupos com alta densidade eletrônica

aumentam (vermelho) ou diminuem (azul) a atividade biológica.

Figura 31. Estrutura química do composto 24 com as cargas parciais calculadas pelo método AM1

destacadas para os átomos de oxigênio e carbono do anel 1,3-benzo-dioxola.

115

Este mapa eletrostático de CoMSIA também posiciona uma região azul próxima

ao átomo de cloro do composto 6, assim como no mapa eletrostático do modelo de

CoMFA deste composto, entretanto este mapa posiciona uma região vermelha próxima

ao átomo de nitrogênio do grupo amino da série, o que também indica que quanto mais

grupos doadores de elétrons estiverem ligados a ele, maior é a atividade biológica dos

compostos, reforçando a importância de grupos metila na posição R2 para o aumento

da atividade biológica dos derivados.

O mapa de contorno do índice de similaridade hidrofóbico para o composto 24

(Figura 32) também está posicionado no anel 1,3-benzo-dioxola. Uma região onde

grupos hidrofóbicos são desfavoráveis para a atividade biológica dos compostos está

posicionada no centro deste anel, onde existem ligações covalentes polares entre

carbono e oxigênio. Esta diferença de polaridade é mais bem evidenciada pelas cargas

parciais calculadas anteriormente (Figura 31).

Figura 32. Mapa de contorno hidrofóbico do melhor modelo de CoMSIA (átomo de prova: H +1; método



em bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde grupos hidrofóbicos aumentam (amarelo)

ou diminuem (roxo) a atividade biológica.

116

Ao analisarmos o mesmo mapa de contorno hidrofóbico para o composto 46

(Figura 33), é possível perceber que diversos átomos de oxigênio do substituinte em R1

estão posicionados em uma região onde grupos hidrofóbicos aumentam a atividade

biológica de compostos desta série, o que explica a baixa atividade biológica deste

composto e de outros com o mesmo substituinte em R1 (40, 42, 43 e 44). O composto

6, possui um átomo de cloro hidrofóbico, mas que está posicionado fora da região onde

grupos hidrofóbicos aumentam a atividade biológica dos compostos e, portanto, não

contribui para a redução da atividade biológica (Figura 34).




em bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde grupos hidrofóbicos aumentam (amarelo)

ou diminuem (roxo) a atividade biológica.

117



hidrofóbico e doador de ligação hidrogênio; fator de atenuação 0,2) obtido para o composto 6 (modelo em

bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde grupos hidrofóbicos aumentam (amarelo) ou

diminuem (roxo) a atividade biológica.

O mapa de contorno do índice de similiaridade doador de ligação hidrogênio para

o composto 24 (Figura 35) mostra uma região na qual grupos doadores de ligação

hidrogênio são desfavoráveis para a atividade biológica. Esta região é próxima ao grupo

metila da posição R2, indicando que compostos contendo átomos de hidrogênio polares

(N-H) nesta posição possuem menor atividade biológica do que compostos

semelhantes contendo grupos metila nesta mesma posição, já que o grupo metila não

possui propriedade de doação de ligação hidrogênio.

118

Figura 35. Mapa de contorno doador de ligação hidrogênio do melhor modelo de CoMSIA (átomo de

prova: H +1; método de cálculo das cargas parciais: AM1; espaçamento da grade: 1,0 Å; campos

moleculares: estérico, hidrofóbico e doador de ligação hidrogênio; fator de atenuação 0,2) obtido para o

composto 24 (modelo em bastão e colorido por elementos), mostrando as áreas onde grupos doadores

de ligação hidrogênio aumentam (azul claro) ou diminuem (preto) a atividade biológica.

4.3 DOCAGEM MOLECULAR

4.3.1 Validação do Protocolo de Docagem (Re-docagem)

Para a avaliação do melhor protocolo de docagem foram obtidas cinco estruturas

tridimensionais da DYRK1A disponíveis no PBD, cujas informações mais relevantes

estão resumidas na Tabela 19.

119

Tabela 19. Resumo das estruturas tridimensionais da DYRK1A resolvidas por difração

de raios-X do cristal e seus respectivos ligantes disponíveis no PDB.

PDB a Ligante b Rot. c R (Å) d

2WO6 D15 7 2,50

3ANQ EHB 2 2,60

3ANR HRM 1 2,60

4MQ1 2C3 7 2,35

4MQ2 2C4 5 2,80 a Código do complexo da proteína no PDB. b Código do ligante no PDB. c Número de ligações

rotacionáveis do ligante. d Resolução da estrutura do complexo ligante-proteína.

Em função da necessidade de complexos ligante-enzima com alta resolução (R

igual ou menor do que 2,5 Å) e um número de ligações rotacionáveis dos ligantes entre

quatro e oito (números de ligações rotacionáveis da série das 6-arilquinazolina-4-

aminas), apenas dois complexos satisfizeram essas duas condições e foram

selecionados para a validação. Os complexos selecionados contêm os seguintes

ligantes: DJM2005 (código do complexo do PDB: 2WO6; código do ligante: D15; página

73) com resolução igual a 2,50 Å e sete ligações rotacionáveis (SOUNDARARAJAN et

al., 2013) e 2C3, um dos ligantes da série das pirido[2,3-d]pirimidinas (código do

complexo no PDB: 4MQ1; página 42), com resolução igual a 2,35 Å e sete ligações

rotacionáveis (ANDERSON et al., 2013).

Utilizando os dois complexos selecionados (2WO6 e 4MQ1), a busca do melhor

protocolo de docagem foi realizada pela análise dos valores de RMSD obtidos para

cada combinação entre algoritmo de busca e função de pontuação. Para o complexo

2WO6, todas as combinações retornaram, ao menos, uma solução com valor de RMSD

menor do que 2,0 Å e a faixa de valores de RMSD menor do que 2,0 Å encontrada foi

de 0,88 a 1,95 Å. Para o complexo 4MQ1, todas as combinações também retornaram,

ao menos, uma solução com valor de RMSD menor do que 2,0 Å e faixa entre 0,78 e

2,00 Å. A Tabela 20 resume as informações obtidas no processo de validação do

protocolo de docagem.

120

Tabela 20. Número de soluções com valor de RMSD menor do que 2,0 Å, considerando

os complexos 2WO6 e 4MQ1 e as combinações de algoritmo de busca e função de

pontuação.

PDB a Combinação b Soluções c

MolDock Optimizer/MolDock Score 1

MolDock SE/MolDock Score 1

2WO6 Iterated Simplex/ MolDock Score 2

MolDock Optimizer/PLANTS Score 1

Iterated Simplex/PLANTS Score 3

MolDock Optimizer/MolDock Score 2

MolDock SE/MolDock Score 3

4MQ1 Iterated Simplex/ MolDock Score 4

MolDock Optimizer/PLANTS Score 1

Iterated Simplex/PLANTS Score 5 a Código do complexo da proteína no PDB. b Combinação entre algoritmo de busca e função de

pontuação. c Número de soluções com valor de RMSD menor ou igual a 2,0 Å.

Na análise da Tabela 20, é possível observar que, independente da função de

pontuação e do complexo analisado, o algoritmo de busca Iterated Simplex retornou um

maior número de soluções com valor de RMSD menor do que 2,0 Å e que a melhor

função de pontuação para este algoritmo de busca foi a PLANTS Score, as quais

obtiveram os maiores números de soluções com valor de RMSD menor do que 2,0 Å,

para ambos os complexos ligante-enzima avaliados. Desta forma, a combinação

Iterated Simplex/PLANTS Score foi utilizada para a docagem da série de derivados 6-

arilquinazolina-4-aminas.

4.3.2 Docagem da Série 6-arilquinazolina-4-aminas

Para a avaliação das interações intermoleculares presentes nos complexos entre

a série de derivados 6-arilquinazolina-4-aminas e a DYRK1A, foram considerados três

compostos: o composto 24 (mais ativo da série); o composto 6 (menos ativo da série); o

composto 29 (outlier segundo os modelos de CoMFA e CoMSIA). Além disso, também

121

foram analisados ambos os enantiômeros dos compostos 32, 33 e 34, para avaliar a

importância do centro de quiralidade para a atividade destes compostos.

As diferentes soluções obtidas para os ligantes complexados com a DYRK1A

foram avaliadas por dois tipos de função de pontuação: PLANTS Score, pois foi a

função de pontuação escolhida para a docagem dos derivados, e Rerank Score, uma

função que reclassifica as corridas de docagem molecular, considerando um termo de

torção sp2-sp2 e um potencial 12-6 de Lennard-Jones. Os procedimentos de

reclassificação, após o uso de funções de pontuações simples, são mais adequados

para a identificação de modos de ligação de alta qualidade ao invés do uso de funções

de pontuação mais avançadas (MORRIS et al., 1998).

As melhores soluções retornadas pelo MVD, classificadas tanto em função do

Rerank Score como em função do PLANTS Score, eram bastante semelhantes ou até

mesmo iguais entre si, com exceção das soluções obtidas para o composto 29. Assim,

arbitrariamente, foram escolhidas as melhores soluções classificadas em função do

Rerank Score para a avaliação das interações intermoleculares entre os ligantes e a

DYRK1A.

Em função de todos os derivados possuírem uma subestrutura em comum, era

esperado que algumas interações com a proteína fossem comuns a todos os derivados.

Estas interações em comum foram identificadas e estão representadas na Figura 36,

usando o composto 34 R como exemplo. É possível observar na Figura 36 uma ligação

hidrogênio entre o átomo de nitrogênio na posição 3 do anel quinazolina e um dos

átomos de hidrogênio do grupo amino da cadeia lateral do aminoácido Lys188. Como

este grupo amino está protonado, esta ligação hidrogênio é reforçada por interação

eletrostática com a carga formal positiva. Este resíduo já havia sido identificado como

importante na ligação de outros inibidores da DYRK1A (NEAGOIE et al., 2012; SARNO

et al., 2012).

122

Figura 36. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre o anel quinazolina da série de derivados

6-arilquinazolina-4-aminas, representada pelo enantiômero R do composto 34, e os principais resíduos

de aminoácidos da DYRK1A. A interação via ligação hidrogênio está representada pela cor verde e as

interações hidrofóbicas pela cor rosa.

Além da interação via ligação hidrogênio, podem ser observadas ainda na Figura

36 diversas interações hidrofóbicas entre o sistema de elétrons π do anel quinazolina

aromático e grupos alquila dos aminoácidos Val173, Ala 186, Val222, Val306 e

Leu294. Esta quantidade de interações hidrofóbicas também é capaz de explicar o fato

de diversos inibidores desta enzima possuírem anéis aromáticos em suas regiões mais

centrais.

123

Na análise do mapa de superfície de grupos doadores e aceptores de ligação

hidrogênio da DYRK1A (Figura 37), percebemos uma região de grupos doadores de

ligação hidrogênio na proteína direcionados à região onde está localizado o átomo de

nitrogênio na posição 3 do anel quinazolina do ligante (enantiômero R do composto 34),

o que reforça a importância desta estrutura comum para a atividade biológica desta

série congênere. Da mesma forma, a importância da presença de grupos hidrofóbicos

também é reforçada na análise do mapa de superfície hidrofóbica da DYRK1A (Figura

38), onde se percebe uma grande área hidrofóbica na proteína localizada no sítio de

ligação dos inibidores desta enzima.

Figura 37. Mapa de superfície da DYRK1A construído no programa Discovery Studio Visualizer versão

4.1 (Accelrys Software Inc), indicando áreas da proteína contendo grupos doadores e aceptores de

ligação hidrogênio, usando o enantiômero R do composto 34 como exemplo de ligante.

124

Figura 38. Mapa de superfície da DYRK1A construído no programa Discovery Studio Visualizer, versão

4.1 (Accelrys Software Inc), indicando áreas hidrofóbicas e hidrofílicas da proteína, usando o enantiômero

R do composto 34 como exemplo de ligante.

Em relação ao composto 24 (mais ativo), é possível observar diversas interações

entre o mesmo e a DYRK1A, além das interações do anel quinazolina comum a todas

as estruturas (Figura 39). A exemplo do que ocorre com o anel quinazolina, o sistema π

do anel 1,3-benzo-dioxola faz diversas interações hidrofóbicas com os aminoácidos

Ile165, Ala186, Leu294 e Met240. Interações hidrofóbicas também são observadas

entre o anel tiazola e os aminoácidos Lys188 e Val173. O átomo de nitrogênio do anel

tiazola é capaz de interagir com a Lys188 via ligação hidrogênio e interação dipolo-

dipolo. Além das interações explicitadas anteriormente, o composto 24 ainda pode

interagir via interação dipolo-dipolo com o oxigênio do grupo caxboxilato do aminoácido

Asp307.

Possivelmente, este grande número de interações com caráter polar e, portanto,

mais fortes que as interações hidrofóbicas explicam a melhor atividade do composto 24

em relação aos demais derivados da série. É possível observar, inclusive, uma

proximidade entre o grupo metila em R2 e a região hidrofóbica do resíduo Val173, o que

125

provavelmente implica em uma interação de van der Waals que não existe nos

compostos da série que não possuem este grupo metila, os quais são, por sua vez, em

geral, menos ativos.

Figura 39. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre o composto 24 (mais ativo) e os principais

resíduos de aminoácidos da DYRK1A. A ligação hidrogênio está representada pela cor verde, as

interações do tipo dipolo-dipolo estão representadas pela cor azul e as interações hidrofóbicas pela cor

rosa.

A análise das interações intermoleculares entre o composto 6 (menos ativo) e a

DYRK1A (Figura 40) revela um padrão de interações hidrofóbicas semelhante ao que

ocorre no composto 24, pois o grupo fenila também interage com os mesmos quatro

aminoácidos apolares (Ile165, Ala186, Leu294 e Met240) e as mesmas interações

hidrofóbicas também são observadas entre o anel heterocíclico em R3 e os aminoácidos

126

Lys188 e Val173. A única interação com caráter polar é a ligação dipolo-dipolo com o

resíduo Asp307, que também é observada no composto 24. É importante ressaltar qua

não há ligação hidrogênio entre o anel heterocíclico em R3 e o resíduo Lys188,

característica que pode ser fundamental para explicar a menor atividade deste

derivado. Em função da presença do átomo de cloro, duas novas interações

hidrofóbicas entre este átomo e os resíduos Ile165 e Val173 surgem, mas estas

interações não parecem contribuir para uma melhor atividade biológica deste composto.

Figura 40. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre o composto 6 (menos ativo) e os

principais resíduos de aminoácidos da DYRK1A. As interações do tipo dipolo-dipolo estão representadas

pela cor azul e as interações hidrofóbicas pela cor rosa.

127

A análise do composto 29 (outlier nos estudos de CoMFA/CoMSIA) é mais

complexa, pois a solução com melhor valor de Rerank Score apresenta uma

conformação diferente da solução com melhor valor de PLANTS Score. Durante as

análises de CoMFA e CoMSIA, o composto 29 foi considerado um outlier em função da

sua atividade biológica predita ser maior do que a atividade biológica experimental em

mais de uma unidade logarítmica. Naquela análise, a hipótese proposta era que,

provavelmente, a conformação bioativa deste composto deveria ser diferente dos

demais compostos da série.

Ao visualizarmos as duas soluções lado a lado (Figura 41), verificamos que a

única diferença está na conformação da molécula. A solução 1 (PLANTS Score) contém

o anel imidazola orientado para o mesmo lado do anel 1,3-benzo-dioxola e a solução 2

(Rerank Score) contém o anel imidazola orientado para o lado oposto ao anel 1,3-

benzo-dioxola e é a mesma conformação observada para os demais compostos da

série das 6-arilquinazolina-4-aminas.

Figura 41. Estruturas químicas das soluções obtidas para o composto 29 (outlier nos estudos de

CoMFA/CoMSIA) durante o processo de docagem molecular. Solução 1 é a melhor obtida segundo o

PLANTS Score e a Solução 2 é a melhor obtida segundo o Rerank Score.

A Tabela 21 apresenta os valores das energias internas das soluções 1 e 2

assim como os valores das energias dos complexos ligante-enzima. Quando se

compara os valores de energia do sistema através dos valores de Rerank Score,

128

observa-se que solução 2 possui um valor de energia menor do que a solução 1 (-

134,852 kJ/mol e -133,781 kJ/mol, respectivamente), entretanto, a diferença entre as

energias das soluções é de apenas 1,071 kJ/mol, o que é um valor baixo de energia.

Entretanto, quando se compara apenas as energias internas das soluções, verifica-se

uma diferença pronunciada nos valores, visto que a energia interna da solução 2 é de

21,790 kJ/mol e a da solução 1 é de 11,109 kJ/mol, ou seja, pode-se afirmar que a

energia interna da solução 2 é, aproximadamente, o dobro da energia interna da

solução 1 e, portanto, a solução 2 representa uma conformação menos estável do que

a solução 1, mesmo possuindo energias do sistema semelhantes entre si. É importante

ressaltar que essa diferença não foi encontrada para nenhum dos demais compostos

da série analisados neste trabalho.

Tabela 21. Energias internas e de complexação ligante-enzima para as duas melhores

soluções encontradas para o composto 29 (outlier nos estudos de CoMFA/CoMSIA).

Solução a EC (kJ/mol) b EC (kcal/mol) EI (kJ/mol) c EI (kcal/mol)

1 -133,781 -31,974 11,109 2,655

2 -134,852 -32,230 21,790 5,208 a Número da solução obtida pela docagem. b EC: energia de complexação ligante-enzima obtida

pela função Rerank Score. c EI: energia interna da solução obtida pela função Rerank Score.

Ao avaliarmos as interações intermoleculares entre a solução 1 e a DYRK1A

(Figura 42), é possível observar interações hidrofóbicas entre o anel 1,3-benzo-dioxola

e os resíduos Ile165, Ala186 e Leu294 e também entre o anel imidazola e o

aminoácido Val173. Uma interação do tipo dipolo-dipolo entre o grupo metila,

diretamente ligado a um átomo de nitrogênio, na posição R2 e um átomo de oxigênio do

grupo carboxilato do resíduo Asp307 também pode ser observada. Uma interação

observada para esta solução, em especial, é entre o átomo de enxofre do resíduo

Met240 e o anel 1,3-benzo-dioxola que foi anteriormente descrita em outros sistemas

(ZAUHAR et al., 2000).

129

Figura 42. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre a solução 1 (PLANTS Score) do composto

29 (outlier nos estudos de CoMFA/CoMSIA) e os principais resíduos de aminoácidos da DYRK1A. As

interações do tipo dipolo-dipolo estão representadas pela cor azul, as interações hidrofóbicas pela cor

rosa e a interação com o átomo de enxofre pela cor amarela.

A solução 2 possui as mesmas interações hidrofóbicas com os resíduos Ile165,

Ala186, Leu294 e Val173, porém não possui a interação dipolo-dipolo com o resíduo

Asp307. Ademais, esta solução possui uma interação desfavorável entre dois grupos

doadores de ligação hidrogênio, o hidrogênio ligado ao nitrogênio do anel imidazola e o

grupo amino do resíduo Lys188. Em função da maior energia interna e da ausência de

uma interação intermolecular desta solução com a DYRK1A, é possível sugerir que o

composto 29 possui uma conformação bioativa diferente das conformações observadas

para os demais derivados da série e, por isso, foi assinalado como outlier nos estudos

de QSAR 3D.

130

Figura 43. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre a solução 2 (Rerank Score) do composto

29 (outlier nos estudos de CoMFA/CoMSIA) e os principais resíduos de aminoácidos da DYRK1A. As

interações hidrofóbicas pela cor rosa e a interação desfavorável entre grupos doadores de ligação

hidrogênio pela cor vermelha.

Para verificar a possível influência do centro de quiralidade presente no

substituinte R3 dos compostos 32, 33 e 34, os pares de enantiômeros de cada

composto foram docados separadamente. As pontuações dos complexos ligante-

enzima são mostradas na Tabela 22. É importante ressaltar que as diferenças entre as

pontuações entre cada par de enantiômeros não ultrapassou 3,0 KJ/mol (0,717

Kcal/mol) para nenhum dos três compostos. Em relação ao composto 32, tanto o

enantiômero R (Figura 44A) quanto o enantiômero S (Figura 44B), fazem apenas uma

131

interação hidrofóbica com um resíduo de Val173 na região onde se localiza o centro de

quiralidade e essa interação independe da orientação do átomo de oxigênio do anel

tetraidrofurano em relação à enzima.

Tabela 22. Energias de complexação ligante-enzima para os pares de enantiômeros

dos compostos encontradas para os compostos 32, 33 e 34.

# EC (kJ/mol) a EC (kcal/mol)

32(R) -100,759 -24,066

32(S) -98,063 -23,422

33(R) -108,035 -25,804

33(S) -106,001 -25,318

34(R) -100,391 -23,978

34(S) -98,974 -23,640 a EC: energia de complexação ligante-enzima obtida pela função Rerank Score.

Figura 44. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre o anel tetraidrofurano presente na região

R3 dos enantiômeros R (A) e S (B) do composto 32 e um resíduo de aminoácido da DYRK1A. As

interações hidrofóbicas são representadas pela cor rosa.

Em relação aos enantiômeros dos compostos 33 e 34 são observadas as

mesmas interações entre cada par de enantiômeros. No caso composto 33 (Figura 45),

132

o anel tetraidropirano de cada enantiômero participa de uma interação hidrofóbica com

o resíduo Val173 e de uma interação dipolo-dipolo com o átomo de oxigênio da

carbonila do resíduo Gly171. Os enantiômeros do composto 34 (Figura 46) fazem

unicamente a interação hidrofóbica com o resíduo Val173.

Figura 45. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre o anel tetraidropirano presente na região

R3 dos enantiômeros R (A) e S (B) do composto 33 e resíduos de aminoácidos da DYRK1A. As

interações hidrofóbicas são representadas pela cor rosa e as interações dipolo-dipolo pela cor azul.

Figura 46. Interações intermoleculares (linha pontilhada) entre o anel tetraidrofurano presente na região

R3 dos enantiômeros R (A) e S (B) do composto 34 e um resíduo de aminoácido da DYRK1A. As

interações hidrofóbicas são representadas pela cor rosa.

Em suma, a docagem molecular foi capaz de confirmar resultados obtidos nos

estudos de QSAR, já que ela foi capaz de identificar interações importantes entre os

133

ligantes e a DYRK1A, identificando mais interações relevantes no composto mais ativo

(24) do que no composto menos ativo da série (6), além de ter sido capaz de dar

suporte a uma hipótese para o comportamento outlier do composto 29 e confirmado a

pouca importância do centro de quiralidade presente no substituinte R3 dos compostos

32, 33 e 34 para a atividade biológica.

4.4 PROPOSTA DE NOVOS COMPOSTOS

A compilação dos resultados obtidos nos estudos de QSAR e de docagem

molecular pode ser observada na Tabela 23. Estes resultados evidenciaram a

importância do grupo metila em R2, do anel 1,3-benzo-dioxola em R1 e quatro

estruturass diferentes em R3. Baseados nesses resultados, quatro novos compostos

foram propostos com o objetivo de gerar novos derivados da classe das 6-

arilquinazolina-4-aminas os quais podem possuir melhor atividade biológica do que os

derivados apresentados.

Tabela 23. Substituintes dos derivados da série das 6-arilquinazolina-4-aminas que

geram melhor perfil de atividade inibitória contra a enzima DYRK1A, observados nos

estudos de QSAR e docagem molecular.

Substituinte Estrutura

R1

O

O

R2 CH3

R3

N

S

H3C

H3C

H3C

O O

134

O composto A1 (Figura 47A) é um análogo do 36 (pIC50 = 7,77), cuja modificação

estrutural, refletida na troca do átomo de hidrogênio por um grupo metila, poderia

aumentar ainda mais a atividade biológica, visto que o composto 36 é um dos mais

potentes da série (pIC50 = 7,77). O composto A2 (Figura 47B) é um análogo do 24

(pIC50 = 7,85) sem o grupo metila ligado ao anel tiazolila, pois a importância de grupos

metila ligados a anéis aromáticos localizados na posição R3 não foi totalmente

confirmada.

N

N

NO

O

CH3N

SN

N

NO

O

CH3H3C

CH3

H3C

A) B)

N

N

NO

O

HH3C

CH3

H3C

C) D)A1 A2

36

N

N

NO

O

CH3N

S

H3C

24Figura 47. Estruturas químicas dos compostos propostos A1 e A2 e dos seus respectivos análogos. (A)

Composto A1 é análogo ao composto 36. (B) Composto A2 é análogo ao composto 24. (C) Composto 36.

(D) Composto 24.

Os compostos A3 e A4 (Figura 48A e B) são resultantes da mesma modificação

estrutural feita para o composto A1, mas em relação aos enantiômeros do composto 34

(pIC50 = 7,52).

135

N

N

NO

O

CH3OA) B)

N

N

NO

O

CH3O

N

N

NO

O

HO

N

N

NO

O

HO

C) D)

A3 A4

34 (R) 34 (S)Figura 48. Estruturas químicas dos compostos propostos A3 e A4 e dos seus respectivos análogos. (A)

Composto A3 é análogo ao enantiômero (R) do composto 34. (B) Composto A4 é análogo ao

enantiômero (S) do composto 34. (C) Enantiômero (R) do composto 34. (D) Enantiômero (S) do composto

34.

Estes quatro compostos possuem grupos considerados importantes para a

atividade biológica da série de derivados 6-arilquinazolina-4-aminas e podem se tornar

candidatos a novos fármacos para o tratamento da DA por inibição da DYRK1A. A

Tabela 24 contém os valores preditos por todos os modelos de QSAR estudados para

cada um dos compostos propostos.

Tabela 24. Valores de pIC50 (M) preditos para os compostos propostos (A1, A2, A3 e

A4) e seus análogos correspondentes (36, 24, 34 (R) e 34 (S), respectivamente)

segundo os melhores modelos de QSAR obtidos.

Composto HQSAR CoMFA CoMSIA

A1 6,95 7,32 7,35

36 6,93 7,13 6,87

A2 8,16 7,40 7,30

24 7,92 7,68 7,32

A3 7,50 7,46 7,34

34 (R) 7,20 6,98 6,81

A4 7,50 7,12 7,31

34 (S) 6,97 7,08 6,74

136

De acordo com os dados da Tabela 24, os compostos A1, A3 e A4 apresentam

todos os valores de atividade biológica preditos pelos modelos de HQSAR, CoMFA e

CoMSIA superiores aos valores dos seus respecitvos análogos desmetilados (composto

36, 34 R e 34 S), o que reforça o impacto positivo do grupo metila na posição R2,

segundo os três modelos de QSAR estudados.

Para o composto A2, observa-se que apenas o modelo de HQSAR prevê a sua

atividade biológica como sendo maior do que a do seu análogo (composto 24),

apresentando, inclusive, um valor de pIC50 acima de 8,0 M, algo não obtido por nenhum

dos compostos da série das 6-arilquinazolina-4-aminas. Os modelos de CoMFA e

CoMSIA preveêm valores de pIC50 ligeiramente mais baixos para este composto em

comparação ao análogo 24, mas ainda, assim, valores altos de atividade biológica

quando comparado com diversos outros compostos desta série. Este composto A2,

além de possuir um alto valor de pIC50, não possui um grupo metila ligado a um anel

aromático, conhecida como posição benzílica, a qual é extremamente suscetível a

reações de oxidação catalisadas por enzimas do citocromo P450 e, portanto,

provavelmente, possui um tempo de meia-vida mais alto do que o composto 24, uma

característica que pode ser interessante do ponto de vista terapêutico.

Em função das características apresentadas por estes novos análogos

propostos, todos os compostos podem ser sintetizados e testados para a confirmação

de suas atividades biológicas, pois se tratam de potenciais fármacos desta série

congênere para o tratamento da DA.

137

5 CONCLUSÕES

Neste trabalho, foram construídos e avaliados modelos de QSAR 2D (HQSAR) e

3D (CoMFA e CoMSIA) de uma série congênere de 46 derivados 6-arilquinazolina-4-

aminas inibidores da enzima DYRK1A, onde o conjunto de treinamento possui 36

compostos e o conjunto de teste possui 10 compostos. Além disso, os derivados desta

série foram submetidos à docagem molecular no sítio ativo da enzima para a predição

do modo de ligação.

Todos os modelos de QSAR obtidos apresentaram boa capacidade preditiva

(HQSAR: q2 = 0,757; CoMFA: q2 = 0,608; CoMSIA: q2 = 0,713) e, portanto, podem ser

utilizados para a predição da atividade biológica de novos compostos. Em geral, estes

modelos apontaram a importância de grupos metila na posição R2 e do anel 1,3-benzo-

dioxola na posição R1. Como a posição R3 apresenta uma maior possibilidade de

substituintes, observou-se que a presença de anéis aromáticos heterocíclicos

(metilados ou não) e o grupo terc-butila nesta posição geram derivados com alta


A docagem molecular permitiu a identificação de interações comuns a todos os

compostos da série congênere, como uma ligação hidrogênio reforçada por carga entre

o átomo de nitrogênio na posição 3 do anel quinazolina e o grupo amino protonado da

Lys188 e, também, interações diferentes entre os compostos e a enzima, que podem

explicar a variação nos valores de atividade biológica. Além disso, a docagem molecular

conseguiu dar suporte a hipóteses geradas durante os estudos de QSAR 3D, como a

conformação bioativa sugerida para o composto 29 (um outlier do CoMFA/ CoMSIA) e a

irrelevância de um centro de quiralidade presente no substituinte R3 de três compostos

da série.

Todas estas informações obtidas neste trabalho permitiram a proposta de quatro

novos compostos desta série, os quais podem ser importantes moléculas para o

tratamento contra a DA.

138

6 PERSPECTIVAS

A DA é uma patologia neurodegenerativa caracterizada por um estado de

demência progressiva e que, usualmente, leva ao falecimento em aproximadamente

nove anos (CITRON, 2010). A neurodegeneração ocorre, principalmente, devido ao

acúmulo de ENFs e à β-amiloidose, mecanismos patogênicos que contam com a

participação da DYRK1A, o que desperta interesse nesta enzima como um novo alvo

terapêutico no tratamento desta patologia (WEGIEL; GONG; HWANG, 2011).

A síntese de inibidores da DYRK1A tem sido o esforço de diversos grupos de

pesquisa no mundo, mas poucos conseguem gerar uma quantidade de derivados

suficientes para a construção de modelos relacionando a estrutura e a atividade

biológica de forma quantitativa (SMITH et al., 2012).

Em função da capacidade da modelagem molecular de identificar modos de

ligação entre ligante e enzima e, também, de gerar modelos com alta capacidade

preditiva, novos estudos devem ser realizados com o objetivo de aumentar o

conhecimento sobre estes sistemas. Entre os estudos que podem ser realizados, pode

ser citada a simulação por dinâmica molecular, que pode gerar informações não

acessíveis por estudos in silico estáticos e in vitro.

Além de avançar nos estudos de modelagem molecular, a perspectiva é que os

derivados propostos possam ser sintetizados e avaliados como inibidores da DYRK1A,

já que o processo sintético é bastante viável, a caracterização química dos produtos é

simples e o teste in vitro também é factível. Dessa forma os derivados propostos serão

validados e, enfim, disponibilizados para ensaios pré-clínicos e clínicos futuros.

139

REFERÊNCIAS

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ANEXO

QSAR 2D/3D E DOCAGEM DE INIBIDORES DA ENZIMA DYRK1A … · docagem molecular utilizando o programa...

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