Protocolo de Eletroforese Em Gel de Agarose[1]

FACULDADE MAURÍCIO DE NASSAU DISCIPLINA BIOLOGIA MOLECULAR Prof a . Patrícia Haver PROTOCOLO PARA ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE PREPARAÇÃO DO GEL DE AGAROSE GEL DE AGAROSE A 0,8% Agarose –0,4 g TBE 1X q.s.p. – 50ml Aquecer a mistura, sob agitação, até a completa fervura. Deixar esfriar até a temperatura de 45ºC (a temperatura tolerada pela nossa mão sem o auxílio de proteção!) e acrescentar 2,5µl de brometo de etídio. Homogeneizar a solução e vertê-la na placa onde o gel irá polimerizar. Observação: 1. O brometo de étidio é uma substância cancerígena e como tal deve ser cuidadosamente manipulado. 2. Para que ocorra a formação dos poços no gel de agarose, o pente deve ser colocado imediatamente após o derramamento do gel na placa, evitando a formação de bolhas, pois estas podem interferir na corrida eletroforética. 3. Caso ocorra a formação de bolhas no gel, estas devem ser retiradas com o auxílio de uma ponteira descartável. 4. Todo o material plástico utilizado na confecção do gel contendo o brometo de etídio deve ser descartado em local adequado. 5. As demais vidrarias devem ser descontaminadas, conforme as normas de biossegurança. PREPARAÇÃO DO GEL DE AGAROSE PARA A APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS 1. Após a preparação do gel, colocá-lo em uma cuba e adicionar o tampão TBE até cobrir totalmente o gel e os eletrodos. 2. Retirar o pente do gel (isto só deve ser feito quando o gel está submerso no tampão) 3. Proceder à preparação das amostras para a aplicação no gel: a. Adicionar 10µl de DNA obtido na extração. b. Adicionar 5µl de tampão para DNA c. Homogenizar com a pipeta. 4. Aplicar 1µl de Peso molecular. 5. Aplicar todo o volume de DNA preparado (15µl) dentro do poço formado no gel. 6. Proceder a aplicação das demais amostras.

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Page 1: Protocolo de Eletroforese Em Gel de Agarose[1]

FACULDADE MAURÍCIO DE NASSAUDISCIPLINA BIOLOGIA MOLECULAR

Profa. Patrícia Haver

PROTOCOLO PARA ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

PREPARAÇÃO DO GEL DE AGAROSE

GEL DE AGAROSE A 0,8%

Agarose –0,4 gTBE 1X q.s.p. – 50ml

Aquecer a mistura, sob agitação, até a completa fervura. Deixar esfriar até a temperatura de 45ºC (a temperatura tolerada pela nossa mão sem o auxílio de proteção!) e acrescentar 2,5µl de brometo de etídio. Homogeneizar a solução e vertê-la na placa onde o gel irá polimerizar.

Observação:1. O brometo de étidio é uma substância cancerígena e como tal deve ser cuidadosamente

manipulado.2. Para que ocorra a formação dos poços no gel de agarose, o pente deve ser colocado imediatamente

após o derramamento do gel na placa, evitando a formação de bolhas, pois estas podem interferir na corrida eletroforética.

3. Caso ocorra a formação de bolhas no gel, estas devem ser retiradas com o auxílio de uma ponteira descartável.

4. Todo o material plástico utilizado na confecção do gel contendo o brometo de etídio deve ser descartado em local adequado.

5. As demais vidrarias devem ser descontaminadas, conforme as normas de biossegurança.

PREPARAÇÃO DO GEL DE AGAROSE PARA A APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS1. Após a preparação do gel, colocá-lo em uma cuba e adicionar o tampão TBE até cobrir totalmente

o gel e os eletrodos.2. Retirar o pente do gel (isto só deve ser feito quando o gel está submerso no tampão)3. Proceder à preparação das amostras para a aplicação no gel:

a. Adicionar 10µl de DNA obtido na extração.b. Adicionar 5µl de tampão para DNAc. Homogenizar com a pipeta.

4. Aplicar 1µl de Peso molecular.5. Aplicar todo o volume de DNA preparado (15µl) dentro do poço formado no gel.6. Proceder a aplicação das demais amostras.7. Ao término, fechar a cuba e conectá-la na fonte.8. Ajustar a voltagem para 100V, por 20 minutos.9. Observar o DNA na luz ultravioleta.

SOLUÇÕES NECESSÁRIASTBE 1XTBE 10X – 100mlH2Od q.s.p – 1 litro

TBE 10XTris base - 107,8gEDTA (Na2EDTA*2H2O) – 7,44gÁcido bórico pa – 55gH2Od q.s.p. – 1 litro

BROMETO DE ETÍDIO(Esta solução já foi comprada pronta para uso)Brometo de etídio – 1gH2O q.s.p. – 100mlEstocar em frasco escuro a 4ºC.

TAMPÃO PARA DNAAzul de BromofenolTris EDTA (TE) 10:1 – 14mlGlicerol – 6mlAutoclavar, aliquotar e congelar.