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MARIANA LIMA BORONI MARTINS PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS RELACIONADOS À DEFESA DE PLANTAS E ANÁLISE PROTEÔMICA DE FOLHAS DE TOMATE INOCULADAS COM Xanthomonas campestris pv. vesicatoria VIÇOSA MINAS GERAIS – BRASIL 2010 Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae
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MARIANA LIMA BORONI MARTINS
PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS RELACIONADOS À DEFESA DE PLANTAS E
ANÁLISE PROTEÔMICA DE FOLHAS DE TOMATE INOCULADAS COM Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL 2010
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae
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MARIANA LIMA BORONI MARTINS
PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS RELACIONADOS À DEFESA DE PLANTAS E
ANÁLISE PROTEÔMICA DE FOLHAS DE TOMATE INOCULADAS COM Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria
APROVADA: 30 de Julho de 2010. Prof. Leandro Licursi de Oliveira Dra. Meire de Oliveira Barbosa (Coorientador) (Coorientador) Prof.a Claudine Márcia Carvalho Prof. Humberto Josue de O. Ramos
Prof.a Maria Cristina Baracat Pereira (Orientadora)
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae
ii
A os M eus queridos pais,
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por sempre abençoar minha vida, iluminar meu
caminho e me dar forças para superar as dificuldades e alcançar mais este
objetivo.
Ao apoio das pessoas que amo e são fundamentais na minha vida: meu
pai Eduardo, minha mãe Denise e meus irmãos Natália e Matheus.
À Profª. Cristina Baracat pela oportunidade, confiança e orientação.
Obrigada por todas valiosas lições.
Ao Prof. Reginaldo Romeiro (in memorian), e sua equipe, por toda
atenção, gentileza e contribuição nos experimentos de fitopatologia.
Aos meus Coorientadores, Prof. Leandro L. de Oliveira e Meire de Oliveira Barbosa, pelas valiosas colaborações.
Ao Prof. Humberto Ramos pela disponibilidade e ajuda nas análises de
Bioinformática.
Às minhas amigas Patrícia, Hebréia, Poliene, Carolina e Renata pelos
valiosos conselhos, por sempre estarem presentes, e me fazerem sentir
especial.
Aos meus queridos amigos e companheiros do Laboratório de
Proteômica e Bioquímica de Proteínas Patrícia, Hebréia, Meire, Nayara, Tânus, Ana, Marcos, Lanna, pelo apoio, incentivo, ajuda nos experimentos e
principalmente pela convivência diária tão feliz.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais –
FAPEMIG, pela concessão da bolsa de estudo de mestrado, ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq pela concessão
da bolsa de iniciação científica, à Financiadora de Estudos e Projetos - FINEP
pelo financiamento do projeto.
iv
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS............................................................................................................... VI LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. VII LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................. VIII RESUMO................................................................................................................................. X ABSTRACT ............................................................................................................................XI
INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................................1
CAPÍTULO I .............................................................................................................................3 RESUMO..................................................................................................................................3 ABSTRACT ..............................................................................................................................4 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................5 2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................7 2.1. PR PEPTÍDEOS E PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS (AMPS)........................................7 2.2. TIONINAS (PR-13) ...........................................................................................................9
2.2.1. ATIVIDADE BIOLÓGICA DAS TIONINAS E MODO DE AÇÃO............................................10 2.2.2. LOCALIZAÇÃO DAS TIONINAS EM PLANTAS ...............................................................11
2.3. DEFENSINAS DE PLANTAS (PR-12) ............................................................................12 2.3.1. ATIVIDADE BIOLÓGICA DAS DEFENSINAS E MODO DE AÇÃO .......................................12 2.3.2. LOCALIZAÇÃO DAS DEFENSINAS EM PLANTAS ...........................................................15
2.4. PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE LIPÍDEOS (PR-14) .........................................15 2.4.1. ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS LTPS E MODO DE AÇÃO.................................................16 2.4.2. LOCALIZAÇÃO DOS LTPS EM PLANTAS ....................................................................17
2.5. INIBIDORES DE PROTEASES (PR-6) ...........................................................................18 2.5.1. ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS INIBIDORES DE PROTEASES E MODO DE AÇÃO..................19 2.5.2. LOCALIZAÇÃO DOS INIBIDORES DE PROTEASES EM PLANTAS .....................................20
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................21
CAPÍTULO II ..........................................................................................................................22 RESUMO................................................................................................................................22 ABSTRACT ............................................................................................................................24 1. INTRODUÇÃO ...............................................................................................................25 2. REVISÃO DE LITERATURA ..........................................................................................27
2.1. A CULTURA DO TOMATE.............................................................................................27 2.2. A MANCHA BACTERIANA DO TOMATEIRO ......................................................................28 2.3. MECANISMOS DE DEFESA VEGETAL ............................................................................29 2.3.1. RESPOSTA HIPERSENSITIVA ..................................................................................29 2.3.2. INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA .....................................................................................30 2.3.3. PROTEÍNAS PR ....................................................................................................32 2.4. ANÁLISE PROTEÔMICA ..............................................................................................33 2.5. FERRAMENTAS PROTEÔMICAS ...................................................................................35
v
2.5.1. ABORDAGEM PROTEÔMICA POR ELETROFRESE BIDIMENSIONAL.................................36 2.5.2. IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRIA DE MASSA .............................37 2.5.3. MÉTODOS COMPUTACIONAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS.............................38
3. OBJETIVOS ...................................................................................................................42 3.1. OBJETIVO GERAL......................................................................................................42 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................................................42 3.3. METAS ....................................................................................................................42
4. MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................43 4.1. PLANTIO DAS SEMENTES ...........................................................................................43 4.2. ESTRESSE BIÓTICO...................................................................................................43 4.3. AVALIAÇÃO DA SEVERIDADE DO PATÓGENO.................................................................44 4.4. COLETA DO MATERIAL ...............................................................................................44 4.5. PREPARO DO EXTRATO FOLIAR ..................................................................................44 4.5.1. EXTRATO PARA ATIVIDADE ENZIMÁTICA...................................................................44 4.5.2. EXTRATO PARA ANÁLISE PROTEÔMICA....................................................................45 4.6. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS ....................................................45 4.6.1. QUANTIFICAÇÃO PELO MÉTODO DO ÁCIDO-BICINCONÍNICO .......................................45 4.6.2. QUANTIFICAÇÃO PELO MÉTODO DE BRADFORD ........................................................46 4.7. DETECÇÃO DA ATIVIDADE DAS ENZIMAS INDICADORAS DO ESTADO DE INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA DAS PLANTAS ....................................................................................................46 4.7.1. ATIVIDADE DE LIPOXIGENASES (LOX) .....................................................................46 4.7.2. ATIVIDADE DE PEROXIDASES (PO) .........................................................................47 4.7.3. ATIVIDADE DE FENILALANINA AMÔNIA-LIASE (PAL)...................................................47 4.7.4. ATIVIDADE DE QUITINASES ....................................................................................48 4.7.5. ATIVIDADE DE Β-1,3-GLUCANASES ..........................................................................48 4.8. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL.................................................................................49 4.8.1. FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA (IEF)...........................................................................49 4.8.2. EQUILÍBRIO DAS TIRAS DE GRADIENTE DE PH IMOBILIZADO .......................................49 4.8.3. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA NA PRESENÇA DE SDS (SDS-PAGE)....50 4.8.4. VISUALIZAÇÃO DOS GÉIS .......................................................................................50 4.9. CAPTURA DAS IMAGENS.............................................................................................51 4.10. ANÁLISE DOS GÉIS....................................................................................................51 4.11. RETIRADA DE PROTEÍNAS DOS GÉIS BIDIMENSIONAIS E TRIPSINÓLISE ............................51 4.12. ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA ATRAVÉS DE MALDI-TOF/TOF .......................................53 4.13. IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS .................................................................................53
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................................................................55 5.1. AVALIAÇÃO DO GRAU DE SEVERIDADE DA DOENÇA INDUZIDA PELO PATÓGENO ...............55 5.2. AVALIAÇÃO DA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA....................................................................55 5.2.1. ATIVIDADE DAS ENZIMAS INDICADORAS DA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA ........................55 5.2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS ................................................60 5.3. ANÁLISE PROTEÔMICA COMPARATIVA .........................................................................60 5.3.1. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS ................................................60 5.3.2. ANÁLISE DO PERFIL PROTÉICO DE FOLHAS DE TOMATEIRO APÓS INOCULAÇÃO COM O PATÓGENO POR ELETROFORESE BIDIMENSIONAL .....................................................................61 5.4. ESPECTROS DE MASSA E BUSCA EM BANCOS DE DADOS ..............................................63
6. CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ...................................................................76
CONCLUSÕES GERAIS ........................................................................................................78 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................79
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: FOLHA DE TOMATE COM SINTOMAS TÍPICOS DE MANCHA BACTERIANA. ...........................29
FIGURA 2: FOLHAS DE TOMATEIROS INOCULADOS COM PROPAGOS DA BACTÉRIA XANTHOMONAS
CAMPESTRIS PV. VESICATÓRIA.. ..........................................................................................56
FIGURA 3: ATIVIDADE ESPECÍFICA DAS ENZIMAS INDUTORAS DO ESTADO DE INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA
SISTÊMICA. .......................................................................................................................59
FIGURA 4: ELETROFORESE BIDIMENSIONAL DE EXTRATOS PROTÉICOS. .........................................62
FIGURA 5: EXPRESSÃO DIFERENCIAL DA PROTÉINA A1M39. ........................................................64
FIGURA 6 : METABOLISMO FOTORRESPIRATÓRIO MULTICOMPARTIMENTADO DO CARBONO E DO
NITROGÊNIO EM PLANTAS. ..................................................................................................65
FIGURA 7: EXPRESSÃO DIFERENCIAL DA PROTÉINA A1M48. ........................................................66
FIGURA 8: REAÇÕES DA FRUTOSE 1,6-BIFOSFATO ALDOLASE......................................................67
FIGURA 9: EXPRESSÃO DIFERENCIAL DA PROTÉINA A1M59 .........................................................68
FIGURA 10: EXPRESSÃO DIFERENCIAL DA PROTÉINA A1M80. ......................................................69
FIGURA 11: EXPRESSÃO DIFERENCIAL DA PROTÉINA A2M5.. .......................................................71
FIGURA 12: EXPRESSÃO DIFERENCIAL DA PROTÉINA A2M12. ......................................................72
FIGURA 13: EXPRESSÃO DIFERENCIAL DA PROTÉINA A2M110. ....................................................73
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DAS FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS PR. .............. 5
TABELA 2: PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DAS FAMÍLIAS DE PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS DE
PLANTAS.................................................................................................................................... 6
TABELA 3: REVISÕES SOBRE PR-PEPTÍDEOS ............................................................................21
TABELA 4 : ETAPAS UTILIZADAS DURANTE A FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA DAS FITAS DE 24 CM..........49
TABELA 5: DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO ÁCIDO
BICINCONÍNICO NOS EXTRATOS FOLIARES UTILIZADOS PARA OS ENSAIOS ENZIMÁTICOS......................60
TABELA 6: DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE BRADFORD NOS
EXTRATOS FOLIARES UTILIZADOS PARA A ANÁLISE PROTEÔMICA......................................................60
TABELA 7 :LISTA DE PROTEÍNAS IDENTIFICADAS EM FOLHAS DE TOMATE USANDO PEPTIDE MASS
FINGERPRINTING (PMF).............................................................................................................74
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
2DE: Eletroforese bidimensional
AMPs: Peptídeos antimicrobianos (AntiMicrobial Peptides)
AS: Ácido salicílico
BBI: Inibidores Bowman Birk
BCA: Ácido-Bicinconínico (Bicinchoninic Acid)
BSA: Albumina soro bovina (Bovine Serum Albumin)
CID: Câmaras de colisão (Collision-Induced Dissociation)
DTT: Ditiotreitol
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético (EthyleneDiamine Tetraacetic Acid)
ES: Extratos protéicos solúveis
ESI: Ionização por electrospray (Electron Spray Ionization)
ET: Etileno
HAPHB: Hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico
HPLC: Cromatografia líquida de alto desempenho (High-Performance Liquid
Chromatography)
HR: Resposta hipersensitiva (Hypersensitive Response)
IEF: Focalização Isoelétrica (Isoeletric Focalization)
IPG: Gradiente imobilizado de pH (Immobilized pH Gradient)
ISR: Resistência Sistêmica Induzida (Induced Systemic Resistance)
JA: Ácido jasmônico (Jasmonc Acid)
LTPs: Proteínas transportadoras de lipídeos
LOX: Lipoxigenases
MALDI: Ionização/Dessorção de Matriz Assistida por Laser (Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization)
MDLC: Cromatografia líquida multidimensional
MS: Espectrometria de massa (Mass Spectrometry)
nsLTP: Proteínas transportadoras de lipídios não-específicas
PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida (PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis)
PAL: Fenilalanina amônia-liase
PAMPs: Padrões moleculares associados a patógenos
PIs: Inibidores de protease
PO: Peroxidases
ix
PR: Relacionadas à patogênese (Pathogenesis Related)
PFF: Peptide Fragment Fingerprinting
PME: Pectinesterase ou Pectina metilesterase
PMF: Peptide Mass Fingerprinting
PMSF: Fluoreto de fenilmetilsulfonila (PhenylMethylSulphonyl Fluoride)
PVPP: Polivinilpolipirrolidona
RMN: Ressonância magnética nuclear
ROS: Espécies reativas de Oxigênio (Reactive Oxygen Species)
S/I: Sem inóculo
SAR: Resistência Sistêmica Adquirida (Systemic Acquired Resistance)
SDS: Dodecilsulfato de sódio (Sodium Dodecyl Sulfate)
SDS-PAGE: Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida na presença
de SDS
TFA: Ácido trifluoracético (TriFluoroacetic Acid)
TOF: Tempo de vôo (Time-Of-Flight)
TRIS: Tris (Hidroximetil) aminometano
x
RESUMO MARTINS, Mariana Lima Boroni Martins, M.S., Universidade Federal De
Viçosa, Julho, 2010. Proteínas e Peptídeos Relacionados à Defesa de Plantas e Análise Proteômica de Folhas de Tomate Inoculadas com Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Orientador: Prof.a Maria Cristina Baracat Pereira. Conselheiros: Prof. Leandro Licursi De Oliveira e Dra. Meire De Oliveira Barbosa.
Na natureza há uma grande diversidade de microorganismos que estão,
diretamente, em contato com as plantas, mas que não causam, na sua maioria,
qualquer dano a estas, evidenciando a predominância da resistência sobre a
suscetibilidade. A resistência de plantas ao ataque de patógenos pode ser
entendida como a capacidade que elas desenvolveram de impedir, restringir ou
retardar a penetração destes organismos em seus tecidos, diminuindo os
efeitos danosos potenciais. Para se defenderem de doenças e pragas, as
plantas estão equipadas com as defesas pré-formadas ou constitutivas, e com
defesas pós-formadas ou induzidas. Tais eventos e reações podem determinar
o sucesso da resistência da planta contra o ataque do fitopatógeno, evitando,
assim, o estabelecimento da doença. Entretanto, o mecanismo pelo qual as
plantas se defendem do ataque de patógenos ainda não é totalmente
elucidado. Assim, o estudo de mecanismos bioquímicos e de biomoléculas
relacionadas à defesa de plantas em resposta a patógenos contribui para a
elucidação desses processos e consecutivamente, para a derscoberta de
novos agentes de defesa contra organismos fitopatogênicos.
xi
ABSTRACT MARTINS, Mariana Lima Boroni Martins, M.S., Universidade Federal De
Viçosa, Julho, 2010. Proteins and Peptides Related to Plant Defense and Proteomics Analysis of Tomato Leaves Inoculated with Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Adviser: Prof.a Maria Cristina Baracat Pereira. Co-advisers: Prof. Leandro Licursi De Oliveira e Dra. Meire De Oliveira Barbosa.
There is a wide diversity of microorganisms that are directly in contact
with plants without cause any damage to these, highlighting the resistance
prevalence over susceptibility. Plant resistance to pathogens attack can be
understood as their capacity to prevent, restrict or delay the entry of these
organisms in their tissues, reducing the potential harmful effects. Plants are
equipped with pre-formed or constitutive defenses and with the post-formed or
induced defenses. These events and responses can determine the plant
resistance success against pathogen attack, thus preventing the establishment
of the disease. However, the mechanism by which plants defend themselves
against the attack by pathogens is not yet fully elucidated. Therefore, the study
of biochemical mechanisms and biomolecules related to plant defense in
response to pathogens attack contributes to the elucidation of these processes
and consecutively to discovery of new defense agents against pathogenic
organisms.
1
INTRODUÇÃO GERAL
As plantas reagem às agressões que sofrem de vírus, bactérias, insetos
e outros organismos, ou de agentes não-biológicos, como a radiação, as
temperaturas extremas, a poluição e outros. Além das defesas pré-formadas ou
constitutivas, que são aquelas naturalmente presentes na planta, funcionando
como barreiras físicas e químicas, as plantas desenvolveram para
sobreviverem, durante sua evolução, mecanismos de resposta a danos e
doenças, acionados assim que reconhecem a agressão (Beckers e Conrath,
2007).
Estes mecanismos, ausentes ou de pouca expressividade em plantas
sadias, são aquelas que se tornam evidentes somente após a invasão do
patógeno ou quando a planta é injuriada. Nestes casos, além da resposta
hipersensitiva, que se caracteriza pelo rápido e localizado colapso do tecido
vegetal em volta do local da infecção, há o aumento na concentração ou
síntese de várias proteínas relacionadas à patogênese (PRs), e, ainda, a
resistência sistêmica adquirida (SAR), que se caracteriza pela indução da
resistência em locais da planta distantes do local da infecção pelo patógeno
(van Loon, 1997; Silva et al., 2004; van Loon et al., 2006; Walters e Heil, 2007).
O estudo das rotas de defesa e das proteínas-chave que desencadeiam
as cascatas de reações em resposta a danos bióticos e abióticos, ou proteínas
efetoras que atuam diretamente contra o ataque de patógenos constituem
alvos na bioengenharia de plantas. O entendimento dos mecanismos de defesa
vegetal é de fundamental importância para a agricultura, que busca a melhoria
na produção de alimentos de origem vegetal, com a concomitante diminuição
do uso de agrotóxicos danosos ao meio ambiente em vários de seus níveis
tróficos.
Dentre as diversas moléculas sintetizadas pelas plantas para atuarem
tanto na defesa constitutiva, quanto induzida, os peptídeos PRs também se
destacam por corresponderem a uma estratégia de defesa econômica (atuam
em baixas concentrações e são muitas vezes produzidos com baixo consumo
energético). Ainda, possuem amplo espectro de ação, não induziriam
resistência pelos patógenos, baixa toxicidade e baixo impacto ambiental
(Reddy et al., 2004). São relativamente pequenos (até 10 kDa) e podem ser
2
divididos em 4 famílias: Inibidores de proteases, Defensinas, Tioninas e LTPs,
sendo os três últimos também classificados como peptídeos antimicrobianos
(AMPs) (Sels et al., 2008).
Dessa forma, proteínas e peptídeos envolvidos nos mecanismos de
defesa de plantas têm sido estudados com o propósito de serem utilizados na
biotecnologia para o melhoramento genético de plantas ou desenvolvimento de
defensivos de origem protéica.
O conhecimento sobre proteínas e peptídeos PR e AMPs apresenta-se
de grande importância para a proposta de estudos e a avaliação de novas
estratégias em potencial para a bioengenharia da resistência vegetal, pelo uso
desses peptídeos como agentes de defesa contra fitopatógenos, seja na forma
de agentes de defesa comercialmente disponíveis ou como biomoléculas a
serem superexpressas em plantas para o desenvolvimento de maior resistência
ou tolerância a doenças.
3
CAPÍTULO I PEPTÍDEOS PR E AMPs: ASPECTOS BIOQUÍMICOS
RESUMO
As plantas sintetizam barreiras estruturais e biomoléculas da defesa
constitutiva e induzida, como proteínas e peptídeos relacionados à
patogêneses (PR), incluindo-se também os peptídeos antimicrobianos (AMPs).
Os PR peptídeos são uma forma de defesa natural e não tóxica, em geral, para
diversas formas de vida, incluindo-se mamíferos. São de grande importância
para a defesa vegetal, uma vez que são uma forma de defesa rápida e efetiva
contra o ataque de fitopatógenos e pragas. São relativamente pequenos (até
10 kDa) e apresentam espectro de ação contra uma ampla gama de
microrganismos. O mecanismo molecular de ação de muitos desses peptídeos
não está ainda totalmente desvendado, mas já é conhecida a atuação dos
AMPs pela desestabilização da membrana celular e pela atuação sobre vias de
sinalização e expressão gênica de células procarióticas. Devido a questões
ambientais e econômicas, o interesse biotecnológico nos AMPs tem
aumentado, uma vez que não induziriam resistência pelos patógenos, atuam
em baixas concentrações, com baixa toxicidade e baixo impacto ambiental.
Dessa forma, aspectos bioquímicos sobre os PR Peptídeos serão abordados e
discutidos sob nesta revisão, a fim de se contribuir no estudo dessas
biomoléculas que é essencial para a descoberta de novos agentes de defesa
contra organismos fitopatogênicos, que apresentem custo e dano ambiental
baixos.
4
ABSTRACT
Plants synthesize structural barriers and constitutive and induced
defense biomolecules, such as pathogenesis related (PR) proteins and
peptides, also including antimicrobial peptides (AMPs). The PR peptides are a
natural defense and non-toxic, in general, to various life forms, including
mammals. They are of great importance for plant protection, since they are a
quick and effective defense form against pathogens and pests attack. They are
relatively small (up to 10 kDa) and have spectrum of activity against a wide
range of microorganisms. The molecular action mechanism of many of these
peptides is not fully identified, but it is known the AMPs performance by
destabilizing the cell membrane and by acting on signaling pathways and gene
expression in prokaryotic cells. Due to environmental and economic concerns,
the biotechnology interest in AMPs has increased, since it does not induce
resistance by pathogens, acting at low concentrations, with low toxicity and low
environmental impact. Thus, the study of PR peptides is essential for the
discovery of natural molecules against these organisms, which have low cost
and low environmental damage.
5
1. INTRODUÇÃO
Os peptídeos relacionados à patogênese (PR) são moléculas com
massas moleculares abaixo de 10 kDa (Tabela 1), que são produzidas em
concentrações elevadas sob condições de infecção ou exposição a estresse
(Gorjanovic, 2009). São divididos em famílias, de acordo com suas
características bioquímicas e fisiológicas: Inibidores de protease, Defensinas,
Tioninas e Proteínas transportadoras de lipídeos não-específicas (nsLTP) (Sels
et al., 2008).
TABELA 1: Principais características das famílias de Proteínas e Peptídeos PR. As famílias de peptídeos PR têm massa abaixo de 10 kDa e estão destacadas na tabela. Adaptada de Sels et al., 2008
FAMÍLIA MEMBRO TAMANHO TÍPICO (KDA) PROPRIEDADES
PR-1 Tobacco PR-1a 15 Antifúngico PR-2 Tobacco PR-2 30 β-1,3-Glucanase
PR-3 Tobacco P, Q 25–30 Quitinase (classe I,II, IV,V,VI,VI)
PR-4 Tobacco ‘R’ 15–20 Quitinase classe I,II PR-5 Tobacco S 25 Thaumatin-like PR-6 Tomato Inhibitor I 8 Inibidor de Protease PR-7 Tomato P69 75 Endoprotease PR-8 Cucumber chitinase 28 Quitinase classe III
PR-9 Tobacco ‘lignin-forming peroxidase’ 35 Peroxidase
PR-10 Parsley ‘PR1’ 17 ‘Ribonuclease-like’ PR-11 Tobacco ‘class V’ chitinase 40 Quitinase classe I PR-12 Radish Rs-AFP3 5 Defensina PR-13 Arabidopsis THI2.1 5 Tionina PR-14 Barley LTP4 9 LTPs PR-15 Barley OxOa (germin) 20 Oxalato oxidase PR-16 Barley OxOLP 20 ‘Oxalato oxidase-like’ PR-17 Tobacco PRp27 27 Desconhecida
Eles são importantes componentes da defesa constitutiva e indusida de
plantas, e sua ação corresponde a uma estratégia de defesa evolutiva,
econômica e com amplo espectro de ação (Reddy et al., 2004). Os inibidores
de proteases são induzidos em plantas, em resposta a ferimentos ou ataque
por insetos ou patógenos (Ryan, 1989), e atuam como inibidores de protease
anti-metabólicos, que interferem com o processo digestivo dos insetos. Já as
Defensinas, Tioninas e LTPs são classificados como peptídeos antimicrobianos
(AMPs) (Tabela 2).
6
TABELA 2: Principais características das famílias de peptídeos antimicrobianos de plantas. As famílias de AMPs que estão relacionadas à patogênese (Peptídeos PR) estão destacados na tabela.
FAMÍLIA Nº DE RESÍDUOS AÇÃO CONTRA
LTPs 90 -95 Bactéria e fungo
Snakins (GASA) 61 – 70 Bactéria e fungo
Defensinas 45 – 54 Bactéria e fungo
Tioninas 45 – 47 Bactéria e fungo
Hevein-like 43 Bactéria Gram + e fungo
Knotin-like 36 – 37 Bactéria Gram + e fungo
Shepherdins 28 – 38 Bactéria e fungo
MBP-1 20 Bactéria Gram + e fungo
Pept. Macrocíclicos 29 – 31 Bactéria Gram +
Ib-AMPs 20 Bactéria Gram + e fungo
Os AMPs constituem um mecanismo de defesa primitivo, são
encontrados desde os organismos simples, como bactérias, até organismos
mais complexos, como animais, incluindo-se os humanos. (Bechinger e Lohner,
2006; Straus e Hancock, 2006). Os AMPs são, em sua maioria, menores que
10 kDa, têm carga líquida positiva, e 50% de seus aminoácidos são
hidrofóbicos (Hancock e Diamond, 2000). Os AMPs descobertos têm sido
divididos em vários grupos baseados em seu tamanho, estrutura secundária e
terciária, e na presença ou ausência de pontes dissulfeto (Reddy et al., 2004).
Muitos são pré-sintetizados ou ativados por proteólise a partir de proteínas
específicas, mas podem ser prontamente sintetizados de uma maneira flexível
e com um baixo consumo de energia e de biomassa, em função do seu
pequeno tamanho (Borregaard et al., 2000). Possuem capacidade de
estabelecimento de defesa rápida e efetiva.
No agronegócio, pesquisas visam obter novos defensivos agrícolas
contendo tais compostos, já que podem apresentar atividades contra bactérias,
fungos, vírus e/ou protozoários e atuam em baixas concentrações. (Almeida et
7
al., 2007). Entretanto, o mecanismo molecular de ação de muitos desses
peptídeos não é ainda totalmente conhecido. Dessa forma, o estudo desses PR
Peptídeos é essencial para a descoberta de moléculas naturais de defesa
contra esses organismos, que apresentem baixo custo, baixa toxicidade à vida
animal e baixo dano ambiental.
2. Revisão de Literatura 2.1. PR Peptídeos e Peptídeos Antimicrobianos (AMPs)
As plantas desenvolveram uma variedade de mecanismos diferentes
para lidar com a constante ameaça por microrganismos fitopatogênicos. Elas
desenvolveram barreiras físicas e a expressão de compostos antimicrobianos
constitutivos, além de mecanismos sensoriais para detectar o ataque de
patógenos e desencadear as vias de sinalização que induzem respostas de
defesa rápida. Estes mecanismos incluem não só a detecção direta de
eliciadores derivados de patógeno (por exemplo, padrões moleculares
associados a patógenos (PAMPs) e fatores de avirulência ou efetores), mas
também a detecção indireta do impacto de patógenos sobre as plantas
hospedeiras (Hématy et al., 2009). Quando um patógeno penetra na parede
celular da planta, o contato entre o patógeno e o protoplasma da célula
hospedeira desencadeia sistematicamente a ativação ou a amplificação de
mecanismos celulares, com o objetivo de conter a instalação ou a multiplicação
dos patógenos (Heil e Ton, 2008; Walters, 2009). Compostos tóxicos para o
patógeno são produzidos, dentre eles proteínas e peptídeos de defesa (van
Loon et al., 2006) conhecidas como moléculas PR (pathogenesis related) (Ye
et al., 1990; Koch et al., 1992; van Loon, 1997; Silva et al., 2004; van Loon et
al., 2006; Walters e Heil, 2007). Proteínas PR complementam as barreiras
estruturais das plantas às infecções microbianas, aos ataques de insetos e aos
desafios ambientais. Muitas proteínas PRs estão presentes constitutivamente
nos diferentes tecidos e contribuem para a resistência basal de plantas sadias
contra patógenos, e são produzidas em concentrações elevadas sob condições
de infecção ou exposição a estresse (Gorjanovic, 2009). As PR moléculas
foram originalmente definidas como proteínas que são induzidas em patologias
ou situações relacionadas, e que atuam na defesa vegetal contra um confronto
8
provável (van Loon, 1997). Atualmente, essa terminologia corresponde a um
grupo de proteínas heterogêneo, codificadas por genes que são rapidamente
induzidos por infecções patogênicas, pelo ácido salicílico (SA), ácido jasmônico
(JA) e etileno (ET), além de fatores ambientais como ferimentos, estresses
causados por frio, metais pesado e exposição a produtos químicos (Seo et al.,
2008). São proteínas solúveis, com baixas massas moleculares, estáveis a
baixos valores de pH, resistentes a proteases (Gozzo, 2003), que se acumulam
nos espaços intercelulares ou nos vacúolos de células de plantas durante
interações com vírus, bactérias ou fungos. Essas moléculas são classificadas
em 17 “famílias” (Tabela 1) baseadas em suas propriedades bioquímicas e
moleculares, de PR-1 a PR-17 (van Loon et al., 2006), incluindo-se as
moléculas com massas abaixo de 10 kDa, denominadas peptídeos PR, os
quais também são divididos em classes, de acordo com suas características
bioquímicas e fisiológicas: Inibidores de protease, PR-6; Defensinas, PR-12;
Tioninas, PR-13; e Proteínas transportadoras de lipídeos, PR-14 (Sels et al.,
2008).
Os peptídeos tais como tioninas (MM ~ 5 kDa), defensinas (MM ~ 5 kDa)
e ns-LTPs (MM 7 e 9 kDa), classificados como PRs, são peptídeos
antimicrobianos (AMPs). AMPs são componentes importantes da defesa
natural de diversos organismos contra a invasão de patógenos. Constitutivos
ou induzidos e ubíquos na natureza, são em geral catiônicos, anfipáticos
(Hancock e Diamond, 2000), e apresentam comprimentos, sequências e
estruturas variáveis, presença de um número variável de resíduos de cisteínas,
que contribuem para estabilizar a conformação nativa pela formação de ligação
de dissulfeto, além de espectro de ação contra uma ampla gama de
microrganismos (Yeaman e Yount, 2003; Reddy et al., 2004; Padovan et al.,
2010b). Dez grupos de peptídeos de defesa foram identificados em plantas,
podendo ter uma expressão constitutiva ou estimulada por patógenos (García-
Olmedo et al., 2001). Muitos AMPs parecem promover a lise celular por
rompimento da membrana plasmática (Reddy et al., 2004). Peptídeos de
diferentes classes, em alguns casos agem sinergisticamente contra patógenos
quando produzidos pelo mesmo tecido, e contribuem para prolongar a defesa
contra uma ampla gama de micróbios (Padovan et al., 2010b). A diversidade de
AMPs e proteínas antimicrobianas é muito grande, e muitos não estão incluídos
na classificação de PRs (Bechinger e Lohner, 2006; Straus e Hancock, 2006).
9
Os AMPs já descritos têm sido divididos em vários grupos baseados em seu
tamanho, estrutura secundária e terciária, e na presença ou ausência de
pontes dissulfeto (Reddy et al., 2004). Possuem capacidade de
estabelecimento de defesa rápida e efetiva. O acúmulo de AMPs desempenha
um papel importante na proteção de plantas jovens vulneráveis na fase inicial
de desenvolvimento, quando outros mecanismos de defesa ainda estão
inativos (Almeida et al., 2007; Gorjanovic, 2009). Almeida e colaboradores
(2007) verificaram uma maior atividade antimicrobiana de peptídeos na parede
celular de plantas jovens quando comparadas com folhas maduras, que
apresentaram maior atividade desses peptídeos na fração solúvel.
2.2. Tioninas (PR-13)
O primeiro registro relacionado à presença de substâncias com atividade
antimicrobiana de plantas foi feita por Jago e Jago (1895), que sugeriram a
existência de uma substância letal para o fermento de pão na farinha de trigo,
depois de observar uma diminuição na liberação de dióxido de carbono durante
o processo de fermentação. Em 1942, Balls e colaboradores cristalizaram esta
substância tóxica a partir do endosperma do trigo (Triticum aestivum L.). Ele
era um material protéico, de baixo peso molecular, com alto teor de enxofre,
que foi denominado purothionin (do grego puro, trigo e tio, enxofre). As
Tioninas (Bohlmann e Apel, 1987, 1991; Bohlmann, 1994) são pequenas
proteínas (~ 5 kDa), ricas em resíduos contendo enxofre (cisteína, arginina e
lisina), geralmente básicas (pI > 8), encontradas em monocotiledôneas e
dicotiledôneas. Apesar de pequenas variações de comprimento (45-47
aminoácidos), eles compartilham a mesma estrutura tridimensional (forma da
letra grega Γ) e modo de ação, conforme testado em uma variedade de culturas
bacterianas e linhas de células de mamíferos (Stec et al., 2004; Stec, 2006).
Tradicionalmente, as α / β-Tioninas foram subdivididas em cinco diferentes
classes (I, II, III, IV e V) de acordo com suas características bioquímicas e
estruturais (Bohlmann, 1994; Stec, 2006). As Tioninas têm em geral um
peptídeo líder com cerca de 25 resíduos de aminoácidos, cuja clivagem é
necessária para a ativação da toxina, e um peptídeo com cerca de 60 resíduos
de aminoácidos que se encontra logo após o peptídeo catiônico (o peptídeo
funcional) e que neutraliza a toxina. O domínio correspondente à toxina é
muito mais variável do que os dois peptídeos que flanqueiam a pró-proteína e,
10
provavelmente, reflete a adaptação das proteínas a papéis desempenhados
nas diferentes partes da planta em que são expressos, bem como as pressões
evolutivas (Stec et al., 2004).
A toxicidade das Tioninas a diferentes tipos de organismos e culturas de
células tem sido investigada há várias décadas, após os relatos iniciais de suas
propriedades antibióticas (Balls e Hale, 1942), sugerindo um papel importante
na defesa de plantas contra micro-organismos patogênicos. Rayapuram e
colaboradores (2008), silenciando o gene PR13/Thionin em Nicotiana
attenuata, mostraram que a tionina é claramente uma proteína de defesa
ecologicamente relevante, envolvida na resistência a patógenos.
2.2.1. Atividade Biológica das Tioninas e Modo de Ação
A principal característica das Tioninas é o seu efeito tóxico em diferentes
sistemas biológicos como bactérias (Molina et al., 1993; Loeza-Ángeles et al.,
2008; Ochoa-Zarzosa et al., 2008), fungos (Molina et al., 1993; Epple et al.,
1997b; Bohlmann et al., 1998; Loeza-Ángeles et al., 2008), protozoários
(Berrocal-Lobo et al., 2009), cultura de células de mamíferos (Carrasco et al.,
1981).
Acredita-se que seus efeitos tóxicos derivam da lise das membranas das
células alvo, no entanto, o mecanismo preciso permanece desconhecido. O
tratamento da hifa de Neurospora crassa com a tionina antifúngica α-
Hordothionin, obtida a partir de grãos de cevada, levou a um aumento da
captação de Ca2+, aumento do efluxo de K+ e alcalinização do meio, sendo que
esses fluxos ocorreram mais rapidamente em comparação com aqueles
causados por defensinas vegetais. Além disso, a tionina promoveu a
permeabilização de hifas e alterou as propriedades elétricas de membranas
lipídicas artificiais, levando à ruptura das bicamadas lipídicas, mostrando que
Tioninas inibem o crescimento de fungos como resultado de interações diretas
do peptídeo com a membrana (Thevissen et al., 1996). Usando medições
eletrofisiológicas, foi demonstrado que β-purothionin obtida de farinha de trigo
pode formar canais de cátions íon-seletivos em membranas de bicamada
lipídica artificial e no plasmalema de neurônios do hipocampo de
camundongos. Esses resultados sugerem que a toxicidade de Tioninas a
diversos organismos é devido à sua capacidade de gerar canais de íons nas
11
membranas celulares, resultando na dissipação do gradiente de íons, essencial
para a manutenção da homeostase celular (Hughes et al., 2000). Stec e
colaboradores (2004), por estudos físico-quimicos, propuseram um modelo de
interação específica entre fosfolipídeos de membrana e tioninas, mediada pela
ligação de fragmentos de fosfolipídios carregados negativamente (ácido
fosfatídico ou fosfatidilserina). A formação dos complexos proteolipídicos causa
solubilização e lise da membrana. Ainda, o modelo sugere que a
oligomerização pode desempenhar um papel no processo de ativação da
toxina. Winkler e colaboradores (2008) verificaram que esta ligação é
reversível. A análise de rearranjos conformacionais nas extremidades opostas
do núcleo α-hélice de tioninas, induzida por interações com ânions presentes
no sítio de ligação com os fosfolipídeos, pode ser relevante para um
mecanismo de atividade e de permeabilização de membranas (Oard et al.,
2010).
A lise da membrana constitui o primeiro grande efeito exercido nas
tioninas, que iniciam uma cascata de eventos citoplasmática, levando à morte
celular. Foi descrito que algumas enzimas, como a β-glucuronidase, são
inativadas por tionina oxidada, uma reação dependente da concentração e do
tempo, tanto in vitro, quanto quando expresso em protoplastos de plantas, e
essa inativação foi prevenida e revertida pelo Ditiotreitol (DTT) (Diaz et al.,
1992). Estudos posteriores mostraram que essa inativação é decorrente de
ligações dissulfídicas formadas entre tioninas e as proteínas estudadas, e que
existe uma seletividade na reação (Piñeiro et al., 1995). Também foi
demonstrado que Tioninas exibem efeito estimulatório e citotóxico em células
do sistema imune humano (Stein et al., 1999). Há ainda relatos que as Tioninas
podem interferir com a síntese de proteínas e DNA (Castro e Fontes, 2005),
podem atuar como proteínas regulatórias, dada sua atividade como
tiorredoxina, e também como mensageiro secundário, atuando como tiol, na
regulação redox de enzimas (Johnson et al., 1987).
2.2.2. Localização das Tioninas em Plantas
As tioninas são sintetizadas após estresse, como contato com patógeno,
ou ferimentos (Bohlmann et al., 1998; Vignutelli et al., 1998), ou são expressas
constitutivamente, podendo ser encontradas nas sementes (Orrù et al., 1997),
12
ou nos tecidos vegetativos, como no tonoplasto e na parede celular de folhas
(Bohlmann et al., 1998) e flores, provavelmente atuando como uma primeira
linha de defesa costitutiva. Tioninas encontradas em sementes também podem
atuar como proteínas de armazenamento, especialmente como fonte de
enxofre. Evidências desse papel foram relatadas para viscotoxinas, cujos níveis
decrescem drasticamente durante a senescência de folhas (Schrader-Fischer e
Apel, 1993).
2.3. Defensinas de Plantas (PR-12)
Defensinas são parte do sistema imune inato do hospedeiro, uma
estratégia de defesa antiga, usada por organismos multicelulares que incluem
plantas, animais, e até mesmo fungos para controlar sua microbiota natural ou
combater patógenos microbianos (Thevissen et al., 2007). As primeiras
defensinas de plantas foram isoladas a partir de trigo e de grãos de cevada por
Colilla et al. (1990) e Mendez et al. (1990), respectivamente. Elas foram
inicialmente chamadas de γ-Tioninas por apresentarem semelhanças no
tamanho (5 kDa) e no número de pontes dissulfídicas (quatro) com as α- e β-
Tioninas, já caracterizadas. Mais tarde, as γ-Tioninas foram renomeadas
defensinas vegetais devido à sua semelhança estrutural com defensinas de
mamíferos e insetos (Terras et al., 1995). Defensinas vegetais possuem quatro
pontes dissulfeto, apresentam entre 45 e 55 resíduos aminoacídicos (Wong et
al., 2007; Carvalho e Gomes, 2009), resultando em uma pequena molécula
com massa entre 5 e 7 kDa. São peptídeos básicos, com pI próximo a 9. Sua
estrutura tridimensional compreende uma cadeia tripla de folha-β (βαββ), e
uma α-hélice paralela, formando uma ponte dissulfeto estabilizando o motivo α-
hélice folha-β.
2.3.1. Atividade Biológica das Defensinas e Modo de Ação
A precisão da função in vivo das defensinas de planta permanece
incerta, e diferentes papéis têm sido atribuídos a elas, especialmente na defesa
da planta (Thevissen et al., 2007). Sua atividade mais caracterizada é a
capacidade de inibir o crescimento de fungos in vitro, podendo ser divididas em
dois grupos: o primeiro formado por defensinas que inibem o crescimento dos
13
fungos por distorções morfológicas das hifas, enquanto que o segundo grupo
corresponde a peptídeos que inibem o crescimento dos fungos sem a distorção
morfológica (Osborn et al., 1995). No entanto, alguns membros da família de
defensinas de plantas apresentam ainda atividade antibacteriana, anti-HIV-1 e /
ou atividade inibidora contra células tumorais (Wong e Ng, 2005; Wong et al.,
2006; Ma et al., 2009; Lin et al., 2010). Lin e colaboradores (2010) mostraram a
vasta gama de atividade de uma defensina-like isolada de feijão “purple pole
beans (Phaseolus vulgaris cv. ‘Extra-long Purple Pole bean’)”. Esse peptídeo
inibiu o crescimento micelial de diferentes fungos, a proliferação de células
tumorais, mas não de hepatócitos humanos, e ainda mostrou atividade contra a
transcriptase reversa do vírus HIV-1. Além disso, alguns trabalhos têm
mostrado que além de atividade antimicrobiana (Carvalho et al., 2006),
algumas defensinas de plantas apresentam atividade inibitória de serino
proteases (Wijaya et al., 2000) e da α-amilase, importante enzima presente no
aparelho digestivo de insetos (Pelegrini et al., 2008; dos Santos et al., 2010).
Trabalhos também sugerem que as defensinas de plantas desempenham um
papel na defesa contra as pragas, pois elas interferem na digestão de insetos,
privando-os assim de energia derivada da degradação do amido (Lin et al.,
2007).
Sobre o mecanismo de ação das defensinas, ao contrário das
defensinas de mamíferos e insetos, defensinas de plantas não formam poros
permeáveis a íons nas membranas artificiais e não apresentam atividade de
permeabilização da membrana de hifas. Entretanto, mostrou-se que dois
peptídeos antifúngicos diferentes, membros da família defensinas de planta,
Rs-AFP2 e DM-AMP1, induziram uma série de respostas relativamente rápida
em membrana de fungos, incluindo captação de Ca2+, efluxo de K+, a
alcalinização do meio, e a mudança no potencial de membrana (Thevissen et
al., 1996), indicando que defensinas de plantas podem agir por um mecanismo
diferente, possivelmente mediado por receptores. Posteriormente, verificou-se
que a interação de defensinas de planta com um sítio específico lhes permite
inserir na membrana plasmática, causando uma ruptura estrutural e a alteração
da permeabilidade da membrana a íons como o Ca2+ e o K+ , e moléculas
orgânicas (Thevissen et al., 1999).
Em contrapartida, de Medeiros et al. (2010) mostraram, utilizando
técnicas de RMN, a importância do Loop1 da defensina catiônica antifúngica
14
Psd1 de ervilha na interação com vesículas sintéticas contendo os lipídeos
aniônicos fosfatidilcolina, ou dodecilfosfatidilcolina, com glucosilceramida,
isoladas de Fusarium solani. Além disso, van der Weerden et al. (2008),
utilizando técninas de imunoflorescência, mostraram que a defensina NaD1,
proveniente das flores de Nicotiana alata, se ligou às paredes celulares das
hifas tratada, permeabilizou as membranas plasmáticas fúngicas através da
formação de uma abertura, resultando em granulação do citoplasma e em
morte celular.
Esses resultados em conjunto mostram que algumas regiões das
defensinas são importantes para a interação com a membrana alvo, enquanto
outras regiões são importantes para sua atividade na célula. A interação de
defensinas de planta com um local específico posteriormente lhes permite
inserir na membrana plasmática, causando uma ruptura estrutural e alteração
da permeabilidade da membrana a íons como o Ca2+ e o K+ , e moléculas
orgânicas. Ainda não está claro o alvo intracelular específico das defensinas de
plantas. A interação com a membrana pode ser só o primeiro destino celular.
Depois, eles podem ser internalizadas e interagir com um alvo citoplasmático,
como no caso das defensinas c e x-hordothionin, isoladas do endosperma da
cevada, que inibem a síntese protéica em eucariotos, bem como em sistemas
de células procariotas livres (Mendez et al., 1990; Mendez et al., 1996), ou no
caso da defensina RsAFP2 isolada de rabanete (Raphanus sativus) que induz
apoptose e, concomitantemente, desencadeia a activação das caspases ou
proteases-like caspase no patógeno Candida albicans (Aerts et al., 2009), ou
como a defensina extraída de semente de alfalfa (Medicago sativa), MsDef1,
que bloqueia o canal de Ca2+ do tipo L em células de mamíferos, mas sua
relação com a atividade antifúgica não foi determinada (Spelbrink et al., 2004).
Ainda, mostrou-se que defensinas podem estar envolvidas na tolerância a Zn
(Mirouze et al., 2006).
As defensinas têm sua atividade diminuída com o aumento da força
iônica do meio, principalmente na presença de cátions divalentes, e
experimentos mostram que o efeito antagonista dos cátions na atividade
antifúngica está relacionado ao fungo teste, indicando que os cátions devem
interferir na interação do peptídeo com a membrana alvo (Lay e Anderson,
2005).
15
Defensinas em geral apresentam baixa conservação da sequência
primária, provavelmente devido a diferentes mecanismos de interação com a
membrana. Entretanto, a similaridade entre as sequências pode chegar a altos
escores nos loops de interação, se compararmos defensinas que compartilham
o mesmo destino da membrana (de Medeiros et al., 2010).
2.3.2. Localização das defensinas em Plantas
As defensinas de plantas estão localizadas em células periféricas e
estomáticas para combater os patógenos (dos Santos et al., 2010). Eles
geralmente são secretados, uma vez que a maioria dos peptídeos carrega um
peptídeo sinal, entretanto, alguns peptídeos da famíia de defensinas de plantas
parece não conter essa tal sequência, sugerindo que esses peptídeos
permanecem no citoplasma (Thomma et al., 2002). Além disso, têm sido
relatada a presença desses peptídeos na parede celular de vegetais (Segura et
al., 1998; Teixeira et al., 2006; Almeida et al., 2007), formando uma primeira
linha de defesa em plantas. Elas podem ser encontradas em diferentes partes
das plantas como, sementes (Spelbrink et al., 2004; Wong e Ng, 2005; Wong et
al., 2006; Tavares et al., 2008b; Lin et al., 2010; Vieira et al., 2010), folhas
(Penninckx et al., 1996; Segura et al., 1998; Thomma e Broekaert, 1998;
Teixeira et al., 2006; Almeida et al., 2007; Mukherjee et al., 2010), flores
(Tavares et al., 2008a) e outros tecidos vegetativos como os vasculares, raízes
e cascas (Moreno et al., 1994; Epple et al., 1997a; Park et al., 2002; Silverstein
et al., 2007). A maioria dos tecidos vegetais expressa constitutivamente dois ou
mais genes de defensinas, enquanto outros genes podem ser expressos após
estímulo, como a infecção por patógeno (Thomma e Broekaert, 1998). Isto
sugere que peptídeos individuais são expressos em circunstâncias específicas
ou em sítios específicos.
2.4. Proteínas Transportadoras de Lipídeos (PR-14)
Proteínas transportadoras de lipídeos (LTPs) são pequenos peptídeos,
catiônicos, com pI próximo a 9, ricos em cisteína, encontrados em várias
espécies de plantas. LTPs foram nomeados por sua capacidade de facilitar a
transferência de fosfolipídios entre as membranas in vitro (Kader, 1975). Eles
16
são capazes de transferir vários tipos de lipídios, incluindo fosfatidilinositol,
fosfatidilcolina e galactolipídeos (Blein et al., 2002; Yeats e Rose, 2008).
Devido a esta baixa especificidade para o substrato lipídico, LTPs de plantas
também são chamados "proteínas transportadoras de lipídios não-específicas"
(nsLTP). São geralmente identificados como uma pequena família multigênica
e estão presentes em quantidades abundantes, até o máximo de 4% do total
de proteínas solúveis (Wang et al., 2010). nsLTP foram previamente divididas
em duas subfamílias, LTP1 e LTP2, de acordo com a massa molecular, cerca
de 9 e 7 kDa respectivamente (Kader, 1996). Recentemente, Boutrot et al.
(2008) ampliou a classificação dos nsLTPs a nove diferentes classes através
de uma análise filogenética. LTPs possuem oito resíduos de cisteínas
conservados, formando quatro pontes dissulfeto, que são responsáveis pela
dobramento compacto dos nsLTP e estabilidade ao tratamento térmico e
proteólise, propriedades que os tornam verdadeiros alérgenos alimentares
(Fernandez-Rivas, 2009).
2.4.1. Atividade Biológica dos LTPs e Modo de Ação
A molécula de nsLTP forma uma cavidade hidrofóbica única, delimitada
por quatro α-hélices, em que podem residir ácidos graxos, acil-CoA, ou
fosfolipídios que poderiam ser transportados através da membrana celular das
plantas (Blein et al., 2002; Ooi et al., 2006). Apesar de seu nome, um papel no
transporte intracelular de lípidos é considerado improvável, baseado em sua
localização extracelular. LTPs possuem um peptídeo sinal, o que os direciona a
matriz extracelular(Finkina et al., 2007; Yeats e Rose, 2008). Embora as
estruturas de nsLTPs sejam altamente conservadas, nsLTPs diferentes
parecem possuir funções biológicas distintas correspondentes a diferentes
regulações da expressão dos genes (Wang et al., 2010).
No que diz respeito ao desenvolvimento da planta, várias funções têm
sido sugeridas, tais como envolvimento na mobilização de lipídios de
armazenamento em sementes, na formação da cutícula, na adesão do tubo
polínico, na morte celular programada do endosperma, e na flexibilização da
parede celular (Bakan et al., 2006). Em matéria de defesa, apresenta atividade
de inibição de bactérias e fungos (Oshchepkova et al., 2009), inibidor de
protease e sinalização da resistência sistêmica (Pyee et al., 1994).
17
Segundo Blein et al. (2002), dois mecanismos básicos principais estão
provavelmente envolvidos na defesa de plantas e estão de acordo com a
localização extracelular dos nsLTPs: (1) a formação de camadas protetoras
hidrofóbica (cutina e suberina) e (2) a inibição do crescimento fúngico . Embora
o papel exato dos nsLTPs na formação de camadas de cutina seja
desconhecida, eles poderiam desempenhar um papel no transporte de
monômeros hidrofóbicos para a polimerização extracelular .
Elicitinas, proteínas secretadas por oomycetes, são conhecidos
eliciadores de defesa da planta, e trabalhos recentes demonstraramm que as
proteínas elicitinas e LTPs apresentam afinidade e concorrência para o mesmo
receptor de membrana. Entretanto, elicitinas induzem a morte celular via
hipersensibilidade e resistência sistêmica inespecífica, enquanto que estas
respostas celulares são inibidas por nsLTP1, que se comportam como
antagonistas de elicitinas (Blein et al., 2002), indicam que LTPs podem estar
envolvidos na sinalização celular contra patógenos.
Ainda, verificou-se que nsLTPs de A. thaliana estão envolvidas na
transdução de sinal de lipídios vegetais, incluindo a promoção de sinalização
de longa distância durante SAR (Maldonado et al., 2002; Salcedo et al., 2007).
2.4.2. Localização dos LTPs em Plantas
Estudos envolvendo imunolocalização mostraram que LTPs estão
localizadas principalmente no citosol, mas são posteriormente excretadas e,
finalmente, se acumulam na interface plasmalema-parede celular e na parede
celular (Thoma et al., 1993; Borges et al., 2006).
Um estudo de genomas sequenciados de plantas sugere que as duas
famílias caracterizadas bioquimicamente de LTPs são restritas
filogeneticamente às plantas que produzem sementes (Yeats e Rose, 2008) e
já foram identificadas (em nível protéico ou DNA) em diferentes tecidos, em
espécies de mono e dicotiledôneas (García-Olmedo et al., 2001).
Eles são abundantes no malte de cevada, contribuindo para a qualidade
da cerveja e a formação de espuma, e também foram identificadas como os
principais agentes alergênicos para humanos, especialmente nas frutas da
família Rosaceae, tais como maçã e pêssego (Yeats e Rose, 2008).
18
2.5. Inibidores de proteases (PR-6)
Os inibidores de proteases (PIs) que estão presentes naturalmente são
essenciais para regular a atividade das suas proteases correspondentes e
desempenham papéis-chave na regulação de muitos processos biológicos
(Habib e Fazili, 2007). Um importante mecanismo de controle de enzimas
ativas envolve a interação com proteínas que inibem a atividade dos PIs. Estes
inibidores formam complexos menos ativos ou completamente inativos com
suas enzimas cognatas,. Os PIs ativos contra diferentes classes de proteases
foram classificadas em 48 famílias, com base em similaridade significativa de
sequências e relações estruturais (Rawlings et al., 2004). Proteínas contendo
um único inibidor da unidade são denominados inibidores simples, e aqueles
que contêm inibidor com múltiplas unidades são denominados inibidores
complexos (Habib e Fazili, 2007).
PIs são de ocorrência comum no reino vegetal. PIs de Plantas
geralmente são pequenas proteínas. Eles também são encontrados
costitutivamente ou são induzidos em plantas, em resposta a ferimentos ou
ataque por insetos ou patógenos (Ryan, 1989). Nas plantas, essas proteínas
atuam como inibidores da protease anti-metabólicos, que interferem com o
processo digestivo dos insetos.
O número de PIs de plantas identificados e isolados é grande, sendo os
PIs serínicos e cisteínicos os que apresentam melhor caracterização. A maioria
dos PIs serínicos reage com suas enzimas cognatas através de um mecanismo
semelhante ao que ocorre na ligação entre enzima e substrato (Grutter et al.,
1990). As plantas contêm uma variedade de inibidores de serino proteases
que podem ser divididos em 16 classes (Ryan, 1989). Entretanto, quatro
classes são mais conhecidas: os inibidores de tripsina do tipo Kunitz de soja;
os inibidores de Bowman Birk e os inibidores do tipo I e II, presentes na batata.
Os Inibidores Bowman Birk (BBI) foram isolados e caracterizados pela primeira
vez em feijão (Bowman, 1945) e sementes de soja (Birk et al., 1963) sendo,
posteriormente, identificados em outras leguminosas (Norioka e Ikenaka, 1983)
e gramíneas (Odani et al., 1986). Os BBI possuem em sua estrutura dois
domínios ativos que podem agir de forma independente, pois em sua estrutura
existem duas regiões distintas que inibem as enzimas semelhantes à tripsina e
quimotripsina, sendo conhecidos como “inibidores de dupla-cabeça”. Essas
19
moléculas, geralmente, possuem uma baixa massa molecular variando de 6 a 9
kDa, e frequentemente apresentam sete ligações dissulfeto altamente
conservadas. Essa característica confere uma simetria à molécula, onde as
duas “cabeças”, que estão localizadas em lados opostos, contêm os sítios de
ligação (Gariani et al., 1999).
2.5.1. Atividade Biológica dos Inibidores de Proteases e Modo de
Ação
Os PIs em plantas atuam geralmente como proteínas de reserva (fonte
de nitrogênio), como reguladores de enzimas endógenas, ou estão
relacionados com um mecanismo de defesa contra o ataque de pragas e/ou
patógenos. Resultados recentes sugerem que os PIs desempenham um papel
ativo na resistência a doenças. As plantas sintetizam, em resposta ao ataque,
polipeptídeos inibitórios que podem suprimir a atividade das enzimas proteases
produzidas por microrganismos fitopatogênicos (Kim et al., 2009a).
Esses inibidores podem atuar como fatores de defesa contra fungos. Os
fungos são bem conhecidos pela habilidade em degradar uma ampla variedade
de substratos e produzem, entre os compostos biologicamente ativos, uma
variedade de enzimas hidrolíticas, as quais se encarregam de gerar peptídeos
e aminoácidos a partir do crescimento em substratos protéicos. A função das
enzimas hidrolíticas extracelulares parece ser nutricional, uma vez que
catalisam a hidrólise de grandes moléculas em moléculas menores ou blocos
construtivos para a subsequente utilização pelas células, o que também é
verdadeiro para algumas enzimas intracelulares (Barata et al., 2002). Os PIs
atuam nessas enzimas hidrolíticas causando a morte do microrganismo.
Também no caso de defesa contra insetos, os PIs interferem no
processo digestivo dos insetos se deve à diminuição da assimilação de
nutrientes, interferindo tanto no desenvolvimento como na reprodução. Quando
insetos são submetidos a uma dieta artificial que contenha inibidores
específicos para a principal classe de proteinases de seus intestinos, estes têm
seu crescimento e desenvolvimento retardados, bem como podem apresentar
índices de mortalidade bastante significantes (McManus e Burgess, 1995).
Foi também demonstrado que um peptídeo inibidor de cisteíno protease
tem atividade nematicida (Andrade et al., 2010).
20
Entretanto, outras funções além de bloquear a ação de proteases
também foram encontradas para alguns PIs, como as atividades de fator de
crescimento ou envolvimento na carcinogênese (Habib e Fazili, 2007).
Os inibidores BBI também possuem outras atividades biológicas. A
exemplo, a interação BBI-Protease do vírus da dengue é modelo para o
desenvolvimento de novas drogas inibidoras dessa protease que é fundamental
na replicação viral (Krishna Murthy et al., 2000), que atuam inibindo enzimas
envolvidas na regulação de sistemas fisiológicos de animais superiores, como
as enzimas proteolíticas de leucócitos polimorfonucleares humanos como a
elastase (HLE) e catepsina G (HLCG), que hidrolisam proteínas estruturais
importantes como elastina, colágeno (tipos I-V, IX, X, XI) e fibronectina.
Acredita-se que a hidrólise da elastina por HLE possua um papel importante na
destruição de tecidos em diversas doenças inflamatórias, como enfisema
pulmonar, artrite, e outras.
PIs estão entre os candidatos mais estudados na engenharia genética
para a resistência de plantas contra insetos-praga. Vários estudos têm
mostrado que inibidores de protease são ativos contra as enzimas de
diferentes espécies de insetos, tanto em análises in vitro como in vivo (Mosolov
et al., 2001; Rahbé et al., 2003).
2.5.2. Localização dos Inibidores de Proteases em Plantas
PIs são encontradas em plantas pertencentes a uma variedade de
grupos sistemáticos, embora altos níveis de PIs sejam frequentemente
encontrados em muitas plantas pertencentes à família Solanaceae (Kim et al.,
2009a). PIs de plantas têm sido principalmente descritos como presentes nos
tecidos de armazenamento, tais como sementes e tubérculos, mas eles
também foram encontrados na parte aérea das plantas, como folhas, em seus
órgãos reprodutivos, tecidos vegetativos e frutos (De Leo et al., 2002).
Estes peptídeos são expressos em altas concentrações, tanto local
como sistemicamente, durante o ataque do patógeno, o que apóia a sugestão
de que elas desempenham um papel na proteção de plantas (Kim et al.,
2009b).
21
TABELA 3: Revisões sobre PR-Peptídeos PR-PEPTÍDEOS REVISÃO
Tioninas (PR – 13) (Bohlmann e Apel, 1991; Bohlmann, 1994; Florack e
Stiekema, 1994; Stec, 2006)
Defensinas (PR – 12)
(Broekaert et al., 1995; Thomma et al., 2002; Lay e
Anderson, 2005; Pelegrini e Franco, 2005; Yang e Lyu,
2008; Carvalho e Gomes, 2009; Stotz et al., 2009;
Padovan et al., 2010a)
Proteínas Transportadoras de
Lipídeos - LTPs (PR-14)
(Kader, 1996; Douliez et al., 2000; Carvalho e Gomes,
2007; Salcedo et al., 2007; Yeats e Rose, 2008)
Inibidores de Proteases (PR-10) (Mosolov et al., 2001; Habib e Fazili, 2007; Mosolov e
Valueva, 2008; Kim et al., 2009a)
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Apesar de sésseis, as plantas desenvolveram no decorrer da evolução
inúmeros mecanismos de respostas específicas a estresses variados. Estes
organismos conseguem alterar o seu plano de desenvolvimento para contornar
situações desfavoráveis, como ataques de pestes ou patógenos, fatores
abióticos impróprios, dentre outros. Além disso, podem contar com um arsenal
de defesas constitutivas que já fazem parte do seu metabolismo normal.
Peptídeos de plantas têm sido propostos como novas fontes úteis de
utilização no desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes a
fitopatógenos. Nesse âmbito, diversos peptídeos têm sido isolados, e
caracterizados com o propósito de serem utilizados na biotecnologia para o
melhoramento genético de plantas ou desenvolvimento de defensivos de
origem protéica.
O conhecimento sobre peptídeos relacionados à patogênese e
peptídeos antimicrobianos apresenta-se de grande importância para a proposta
de estudos e a avaliação de novas estratégias em potencial para a
bioengenharia da resistência vegetal, pelo uso desses peptídeos como agentes
de defesa contra fitopatógenos, seja na forma de agentes de defesa
comercialmente disponíveis ou como biomoléculas a serem superexpressas
em plantas para o desenvolvimento de maior resistência ou tolerância a
doenças.
22
CAPÍTULO II ANÁLISE PROTEÔMICA DE FOLHAS DE TOMATE INOCULADAS COM
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
RESUMO
A resistência natural das plantas a patógenos é baseada em
mecanismos pré-formados como barreiras físicas e compostos antimicrobianos
constitutivos e em mecanismos induzidos, que são ativados após a percepção
do patógeno pela planta, desencadeando vias de sinalização que induzem
respostas de defesa rápida, com a síntese de proteínas que desempenham
importante papel contra o ataque de fitopatógenos. A proteômica aplica-se com
sucesso à identificação de proteínas diferencialmente expressas em resposta
de plantas de tomate ao estresse biótico, visando identificar proteínas
importantes relacionadas à defesa de plantas. Verificou-se que após o inoculo
com a bactéria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, houve indução de
resistência nas plantas de tomate e a resposta da planta ao estresse variou de
acordo com a severidade da doença. Essa resposta diferenciada pôde ser
observada pelo teste das enzimas indicadoras do estado de resistência, como
quitinases, β-1,3-glucanases, lipoxigenases, peroxidases e fenilalanina amônia-
liase, e pela expressão diferencial de proteínas. Neste trabalho, géis
bidimensionais 12,5% de extratos protéicos solúveis (ES) de folhas de
tomateiros inoculados com o patógeno e colhidas em diferentes tempos, foram
comparados com géis de extratos ES de plantas sem inóculo, a fim de se
identificar proteínas diferencialmente expressas entre os diferentes
tratamentos. Os spots diferencialmente expressos foram extraídos e
tripsinizados. Pela análise dos espectros gerados por Peptide Mass Fingerprint,
foi possível identicar proteínas diferencialmente expressas relacionadas com
fotossíntese, resistência a doença, mecanismos de defesa, energia e
metabolismo. A identificação dessas proteínas é de grande importância para a
evidenciação das vias metabólicas envolvidas e assim a melhor compreensão
da resposta das plantas frente ao ataque por patógenos. Esse auxílio na
identificação de rotas metabólicas e, ou, de mecanismos de defesa certamente
auxiliam a direcionar pesquisas e caminhos na bioengenharia, visando à
23
geração de plantas resistentes ou na identificação de processos metabólicos
de defesa a serem utilizados como mecanismos naturais contra patógenos.
24
ABSTRACT
The natural plants resistance to pathogens is based on preforms
mechanisms, as physical barriers and constitutive antimicrobial compounds,
and induced mechanisms that are activated after the perception of the pathogen
by the plant, triggering signaling pathways that induce quickly defense
responses, as proteins synthesis that play an important role against attack by
pathogens. Proteomics successfully applies to identify differentially expressed
proteins in biotic stress response of tomato plants, to identify important proteins
related to plant defense. It was found that after inoculation with Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria, tomato plants showed induced resistance and plant
response varied according to disease severity. This differential response could
be observed by the detect increases in activity of enzymes known to be
involved with induced systemic resistance such as lipoxygenases,
phenylalanine, amonia-lyases, peroxidases, chitinases and β-1,3-glucanase,
and the differential expression of proteins. In this study, two-dimensional gels of
soluble protein extracts (ES) from tomato leaves inoculated with the bacteria
and harvested at different times were compared with gels of ES extracts from
plants without inoculum, to identify differentially expressed proteins between
different treatments. The spots differentially expressed, after identification by
ImageMaster, were extracted and trypsinized. By analyzing the spectra
generated by Mass Spectrometry (MS), we identified proteins tha are involved
in several processes, i.e. photosynthesis, disease resistance, defense
mechanisms, energy and metabolism. The identification of these proteins is
important to better understand the plants response against pathogens attack
and may help identify metabolic pathways and / or defense mechanisms that
help further research in the bioengineering field in the generation of resistant
plants or identifying defense metabolic processes to be used as natural
mechanisms against pathogens.
25
1. INTRODUÇÃO
As plantas reagem às agressões que sofrem de vírus, bactérias, insetos
e outros organismos, ou de agentes não-biológicos, como a radiação, as
temperaturas extremas, a poluição e outros. Para sobreviverem, durante sua
evolução, elas desenvolveram mecanismos de resposta a danos e doenças,
acionados assim que reconhecem a agressão.
Na maior parte das vezes, a alta capacidade de adaptação das plantas
permite que sobrevivam, mesmo tendo muitas vezes seu desenvolvimento
prejudicado. Os efeitos são mais graves sobre as espécies de interesse
agrícola, muito vulneráveis, porque, em geral, são usadas em plantio de
monoculturas geneticamente uniformes. Quando uma doença atinge essas
espécies, as perdas podem ser severas.
O tomate está entre as hortaliças mais consumidas no mundo, sendo
uma fonte de vitaminas A e C, e de sais minerais como potássio e magnésio. É
um fruto originário dos países andinos, desde o norte do Chile até a Colômbia,
e pertence à família Solanaceae, assim como o pimentão, o jiló, a berinjela e a
batata. Dentre as hortaliças cultivadas no país, o tomate de mesa destaca-se
em área plantada e em produção, sendo cultivado em todas as regiões
geográficas, sob diferentes condições de manejo cultural (Melo, 2003). Em
2007, o Brasil ocupou o sexto lugar no ranking da produção mundial, com uma
produção de três milhões de toneladas plantadas numa área de 57,6 mil
hectares (AGRIANUAL, 2008). Em função do grande número de pragas e
doenças que afetam o tomateiro, a cultura do tomate ocupa o segundo lugar
em consumo de agrotóxicos por área na produção comercial (Neves et al.,
2003). A busca por uma cultura que possa ser produzida sem a utilização de
agrotóxicos vem crescendo, principalmente com a divulgação frequente de
contaminação do fruto com resíduos de pesticidas (ANVISA, 2005) Assim, a
produção de tomates constitui uma grande oportunidade de negócio para os
agricultores e, ao mesmo tempo, um desafio, pois estes não possuem
informações e alternativas efetivas para o combate de doenças e de pragas
nas safras.
A proteômica, que corresponde à avaliação do conjunto de proteínas
expressas em um organismo, tecido ou célula em dada situação celular, aplica-
se com sucesso à identificação de proteínas diferencialmente expressas em
26
resposta de plantas de tomate a estresses bióticos e abióticos. A identificação
de proteínas envolvidas em rotas metabólicas de defesa poderá auxiliar na
identificação de mecanismos de defesa que auxiliem o agronegócio na geração
de plantas resistentes. Poderão ainda ser identificados processos metabólicos
de defesa a serem utilizados como mecanismos naturais contra fitopatógenos,
ou ainda, ser identificados compostos antimicrobianos para uso como
defensivos agrícolas naturais. Este projeto visa identificar proteínas
diferencialmente expressas em plantas de tomate submetidas a estresse
biótico por infecção com Xanthomonas campestris pv vesicatoria, para auxiliar
na elucidação de mecanismos de ação de defesa e busca de agentes de
controle para a cultura do tomate.
27
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A cultura do Tomate
Tomates (Solanum lycopersicum L., syn. Lycopersicon esculentum Mill.)
são importantes constituintes na dieta dos seres humanos. Estão entre as
hortaliças mais consumidas no mundo, sendo uma fonte de vitaminas A e C e
de sais minerais, como potássio e magnésio. São, também, boas fontes de
licopeno, um antioxidante natural associado à proteção contra alguns tipos de
câncer (Carvalho e Pagliuca, 2007).
O tomate é um fruto originário dos países andinos, sendo produzido
desde o norte do Chile até a Colômbia. Pertence à família Solanaceae, como o
pimentão, o jiló, a berinjela e a batata. É cultivado em praticamente todos os
países, quer em campos abertos ou em culturas protegidas, o que o leva ao
topo de maior produção/consumo, com destaque para a China e os Estados
Unidos, que produzem 30% do total mundial. Em 2007, o Brasil ocupou o sexto
lugar no ranking da produção mundial, com uma produção de três milhões de
toneladas plantadas numa área de 57,6 mil hectares (AGRIANUAL, 2008).
Dentre as hortaliças cultivadas no País, o tomate de mesa destaca-se
em área plantada e em produção, sendo cultivado em todas as regiões
geográficas, sob diferentes condições de manejo cultural (Melo, 2003).
Bactérias como Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Pseudomonas syringae pv. tomato,
Pseudomonas solanacearum e Erwinia spp, além de fungos como
Phytophthora infestans, Fusarium oxysporum fsp. Lycopersici e Alternaria
solanii são responsáveis por doenças prejudiciais ao crescimento e ao
desenvolvimento da planta e de seus frutos. Com relação aos nematóides, os
causadores da galha do gênero Meloidogyne são importantes patógenos do
tomateiro. Já os vírus que mais causam danos econômicos na cultura de
tomate, no Brasil, são os geminivírus. Em função do grande número de pragas
e doenças que afetam o tomateiro, essa cultura ocupa o segundo lugar em
consumo de agrotóxicos por área na produção de frutos com valor comercial
(Neves et al., 2003). A busca por uma cultura que possa ser produzida com
redução no uso de agrotóxicos é crescente, considerando a divulgação de
contaminação dos frutos com resíduos dos pesticidas (ANVISA, 2005).
28
2.2. A mancha Bacteriana do Tomateiro
Dentre diversas doenças que acometem o tomateiro, com elevada
capacidade destrutiva e difícil controle, destaca-se a pústula-bacteriana ou
mancha-bacteriana, causada por Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
(Doidge) Dye (Jones et al., 1998; Tamir-Ariel et al., 2007), uma bactéria
baciliforme, Gram-negativa, móvel por meio de um flagelo polar. Esta bactéria
foi reclassificada recentemente, propondo-se quatro diferentes espécies:
Xanthomonas vesicatoria, Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas gardneri,
e Xanthomonas perforans (Tamir-Ariel et al., 2007). Como a aceitação da nova
nomenclatura ainda está para ser determinada pela comunidade científica, aqui
utilizamos a nomenclatura clássica.
A mancha bacteriana, causada por espécies do gênero Xanthomonas,
frequentemente ataca plantas de tomate e de pimentão. A doença é favorecida
por temperaturas entre 20 e 30 ºC, e ocorre com maior severidade onde a
chuva está associada a ventos fortes. Os sintomas da mancha bacteriana
ocorrem em toda a parte aérea da planta, podendo se manifestar em qualquer
estágio da cultura (Jones et al., 1998; Tamir-Ariel et al., 2007). Nas folhas, os
primeiros sintomas aparecem na forma de pequenas áreas encharcadas, de
formato irregular e bordos definidos. Estas manchas (Figura 1) tornam-se
deprimidas, passando de uma coloração amarelada ou verde-clara para
marrom-escura, até a necrose do tecido (Goode e Sasser, 1980).
Essa doença é uma das mais importantes e destrutivas do tomateiro
para processamento industrial no país. As perdas devido à doença são
diretamente resultantes da redução da produção em decorrência dos sintomas
(as manchas necróticas nas folhas contribuem para o secamento das mesmas)
e também do custo dos produtos químicos empregados como estratégias de
controle (Goode e Sasser, 1980).
O êxito ou fracasso do controle químico à bactéria pode ser, em parte,
atribuído à maior ou menor eficácia dos princípios ativos aplicados, a cuidados
e épocas de tratamento e, principalmente, à sensibilidade ou resistência das
populações do patógeno a bactericidas comumente empregados.
29
FIGURA 1: Folha de tomateiro com sintomas típicos de mancha bacteriana.
2.3. Mecanismos de Defesa Vegetal
Em função do grande número de mecanismos de defesa utilizados pelas
plantas e, por serem de alta eficiência, a infecção por patógenos resulta em
danos reduzidos nas plantas. A resistência natural das plantas é baseada tanto
em mecanismos pré-formados constitutivos quanto em mecanismos induzidos.
A resistência constitutiva, inespecífica ou estática constitui o principal
mecanismo no caso de resistência não específica, e ocorre mesmo sem a ação
de agentes agressores, pois, quando recebida por herança dos ancestrais,
torna as plantas imunes (ou não-hospedeiras) à maioria dos patógenos. É
constituída por mecanismos de defesa naturais pré-existentes nas plantas, uma
série de barreiras estruturais que conferem a elas proteção a patógenos, como
cutículas serosas e componentes antimicrobianos, que estão presentes na
forma ativa em plantas sadias, ou possuem precursores inativos que
rapidamente são ativados em resposta ao estresse ou ao ataque de patógenos.
Há ainda outros mecanismos de defesa, ainda mais eficientes, que conferem
resistência pós-infeccional ou induzida, que, aparentemente, permanecem
inativos ou latentes, só sendo acionados ou ativados, após a exposição das
plantas a agentes eliciadores (Colson e Deverall, 1996; Heath, 2000; Gozzo,
2003; Beckers e Conrath, 2007).
2.3.1. Resposta Hipersensitiva
30
Ao contrário do que ocorre na maquinaria de defesa do sistema imune
em mamíferos, as células vegetais não se movem, e as respostas de defesa
são autônomas, de modo que cada célula possa detectar e responder ao
ataque microbiano. Uma das mais eficientes formas de defesa das plantas é a
resposta de hipersensibilidade (HR – do inglês, hypersensitive response),
caracterizada pela morte celular localizada das células vegetais e a formação
de lesões necróticas no sítio de penetração do patógeno, ocorrendo o
desenvolvimento de lesões que limitam o crescimento do patógeno e/ou seu
espalhamento ou, até mesmo, a autodestruição de toda a planta (Bonas e
Lahaye, 2002). Comuns a todas as plantas em resposta a diferentes
patógenos, os aspectos fisiológicos da HR incluem o aumento rápido e
transitório de espécies reativas de oxigênio (ROS – do inglês, reactive oxygen
species), tais como, O2-, OH- e H2O2; a perda de íons potássio (K+) e o ganho
de íons hidrogênio (H+) pelas células; a destruição de compartimentos e o
espessamento das paredes celulares e da cutícula; além da síntese de toxinas
(fitoalexinas) e de proteínas relacionadas à defesa, conhecidas como proteínas
PR (relacionadas à patogênese ou, do inglês, pathogenesis related) (Ye et al.,
1990; Koch et al., 1992; van Loon, 1997; Silva et al., 2004; van Loon et al.,
2006; Walters e Heil, 2007).
2.3.2. Indução de Resistência
Além dos mecanismos de defesa constitutivos, plantas possuem
mecanismos de defesa pós-infeccional, ainda mais eficientes, que são
acionados após elas serem expostas a agentes de indução. O contato entre o
patógeno e o protoplasma da célula hospedeira desencadeia reações de
síntese de compostos tóxicos para o patógeno. A resposta, após uma infecção
primária por agente patogênico microbiano, por ataque por pragas ou pela
exposição a moléculas capazes de atuarem como indutores pode levar as
plantas a desenvolver uma resistência aumentada a ataques futuros. Este
fenômeno é conhecido como indução de resistência (Walters e Heil, 2007). É
considerado um estado “de aumento da capacidade defensiva”, eliciada por
estímulo ambiental específico, por meio da qual as defesas constitutivas das
plantas são potencializadas contra os desafios bióticos subsequentes (van
Loon, 1997; Van Loon et al., 1998; van Loon et al., 2006).
31
Os dois mecanismos mais conhecidos de resistência induzida são SAR -
Resistência Sistêmica Adquirida (Systemic Acquired Resistance) e ISR -
Resistência Sistêmica Induzida (Induced Systemic Resistance). Estes
fenômenos são distintos quanto à forma através da qual são induzidos e
regulados por mecanismos bioquímicos, embora semelhantes fenotipicamente.
Ambos resultam em indução de resistência (ou tolerância) contra um ataque
subsequente de patógenos ou parasitas e têm seus mecanismos de defesa
ativados não apenas no sítio de indução, como também em outros locais dele
distantes. Eles podem ser diferenciados com base na natureza do eliciador e
na via metabólica regulatória envolvidas. As diferenças entre os dois
fenômenos são que a SAR envolve o acúmulo de proteínas PR como
mecanismos induzidos de defesa da planta, sua indução é salicilato-
dependente, pode resultar em alterações visuais (necroses, por exemplo) na
planta que sofreu indução, e geralmente é induzida por patógenos ou
ativadores químicos (Loake e Grant, 2007). No caso de ISR, não há acúmulo
de proteínas PR, a planta que sofreu indução não exibe alterações, o agente
indutor é usualmente um microrganismo não-patogênico e sua indução não é
salicilato-dependente, parecendo haver uma outra rota de sinalização mais
associada a jasmonatos e ao etileno (Stiche et al., 1997; van Loon, 1997; Van
Loon et al., 1998; Grant e Lamb, 2006; van Loon et al., 2006; Walters e Heil,
2007).
A resistência induzida acontece se a planta percebe a presença do
agente agressor e transmite os sinais, por meio de moléculas que se ligam a
receptores de membrana, que ativam mecanismos de defesa. O
reconhecimento rápido de patógenos invasores pelas células vegetais e a
indução rápida das respostas de defesa são essenciais para a resistência das
plantas. Desta forma, a resistência ocorre quando respostas múltiplas de
defesa são ativadas rapida e coordenadamente (Yamamizo et al., 2006).
Foi proposta a existência de um sistema de reconhecimento gene-a-
gene, com interação específica. Uma planta com o gene dominante de
resistência R reconhece um patógeno com o gene dominante de avirulência avr
correspondente, e assim, a presença do gene avr torna o patógeno não-
virulento se a planta tiver o gene R apropriado. Se o gene certo não existe na
planta ou no agente patogênico, não há reconhecimento nem resistência, e a
doença se instala. Acredita-se que o gene R codifica o receptor, que, por sua
32
vez, reconhece a molécula indutora gerada direta ou indiretamente pela ação
do gene avr, ativando os mecanismos de defesa (Flor, 1971; Keen, 1990;
Bonas e Lahaye, 2002; Walters e Heil, 2007).
2.3.3. Proteínas PR
Das alterações decorrentes da interação planta-patógeno, a síntese de
proteínas PR talvez seja a mais evidente. Proteínas PR são um grupo de
proteínas heterogêneo codificadas por genes que são rapidamente induzidos
por infecções patogênicas, pelo ácido salicílico (SA), ácido jasmônico (JA) e
etileno (ET), além de fatores ambientais (Seo et al., 2008). Elas participam
ativamente no fenômeno de resistência induzida, tanto quando a indução é por
fatores bióticos (Bol et al., 1990), como por abióticos (Shah et al., 1997). Elas
são classificadas em 17 “famílias” baseadas em suas propriedades bioquímicas
e moleculares, de PR-1 a PR-17. As mais comumente investigadas são as PR-
1, que contém as primeiras PRs descobertas cujas atividades biológicas são
ainda desconhecidas, PR-2 (-1,3-glucanases), PR-3 (Quitinases) e PR-5
(Osmotina) (van Loon et al., 2006).
Proteínas PR têm baixo peso molecular, são estáveis a baixos valores
de pH e resistem a proteases (Gozzo, 2003). Acumulam-se em locais de
infecção e em sítios remotos destes, em casos de indução de resistência
sistêmica (Sticher et al., 1997). Podem se acumular tanto nos espaços
intercelulares (quando teriam uma ação direta sobre o patógeno) como em
vacúolos (teriam ação após eventos de patogênese que culminam com a
descompartimentalização).
Um grande número de enzimas PR também tem sido associado à ISR,
incluindo peroxidases (E.C. 1.11.1.7), fenilalanina amônia-liase (PAL) (E.C
4.3.1.5), lipoxigenases (E.C. 1.13.11.12), β-1,3-glucanases (E.C. 3.2.1.6), e
quitinases (E.C. 3.2.1.14) (Silva et al., 2004; van Loon et al., 2006; Seo et al.,
2008). Quitinases e β-1,3-glucanases mostram atividade antifúngica sinérgica.
Estas enzimas levam à liberação de moléculas que provocam os primeiros
passos da indução de resistência, como as fitoalexinas e compostos fenólicos.
Peroxidase participa na lignificação da parede celular, fazendo-a mais
resistente à degradação pelo arsenal enzimático do patógeno ou à penetração
mecânica, e na eliminação de ROS. A enzima PAL é uma enzima-chave,
33
responsável pela transformação da fenilalanina em ácido cinâmico. A atividade
de fenilalanina amônia-liase também gera precursores da biossíntese de
lignina, que podem exercer efeito tóxico sobre o patógeno ou podem se ligar à
parede celular fúngica, fazendo-a mais rígida e impermeável (Hammerschmidt
et al., 1982), e outros compostos fenólicos que se acumulam em resposta à
infecção. Produtos da ação das lipoxigenases contribuem para as reações de
defesa por meio da inibição do crescimento de patógenos, induzindo produção
de fitoalexinas e por transdução de sinal. O aumento da atividade e
acumulação destas enzimas depende principalmente do agente indutor, mas
também do genótipo da planta, condição fisiológica, e dos agentes patogênicos
(Silva et al., 2004). O aumento da atividade dessas enzimas indica um estado
de indução de resistência.
2.4. Análise Proteômica
Com o sequenciamento completo de genomas inteiros e a
disponibilização dessas informações, pesquisadores têm focado esforços na
compreensão dos proteomas. Estudos dos genes por meio do seu
sequenciamento e de suas características estruturais, por si só, não poderiam
prever a estrutura dinâmica de uma proteína.
Proteínas são biomoléculas responsáveis por vários eventos
bioquímicos em organismos vivos, desde a formação e a composição até a
regulação e o funcionamento. Elas são montadas nas células com base na
informação contida nos genes, e é a forma específica que adquirem depois de
construídas que determina como (e se) vão atuar na célula. A busca pelo
entendimento da expressão, da função e regulação das proteínas codificadas
por um organismo deu início à chamada Era Proteômica.
Proteômica é o estudo do proteoma, o conjunto de proteínas contidas
numa célula em uma dada situação celular, as quais são determinadas pelo
genoma da mesma. O termo proteoma foi cunhado por Wilkins e Williams, em
1995, significando o conjunto de todas as proteínas expressas por um genoma,
em um tecido ou sistema biológico em dado momento celular, ou como o
conjunto de todas as proteínas celulares expressas pelo genoma de um
organismo sob determinada situação fisiológica (Wilkins, 1996). A proteômica
despontou como uma das vertentes da era pós-genômica, como resultado
34
direto dos avanços conseguidos pelo sequenciamento em larga escala do DNA
(Mann et al., 2001).
A análise proteômica permite a avaliação sistemática da expressão
protéica comparativa em tecidos sob momentos fisiológicos diferentes, como
tecidos doentes e sadios, tratados e não-tratados, resistentes e suscetíveis
(Wasinger et al., 1995). O objetivo é contribuir para o entendimento global e
integrado do funcionamento da célula, ou seja, refere-se ao estudo funcional de
proteínas e seu envolvimento em vias metabólicas celulares. As informações
não podem ser obtidas apenas pelo estudo dos genes, já que são as proteínas
um dos principais agentes responsáveis pelos fenótipos das células. Os
genomas indicam o potencial proteômico de uma célula. A identificação do
proteoma apresenta grandes dificuldades, ao contrário do genoma, pois o
proteoma de cada célula viva é dinâmica, alterando-se em resposta a
moléculas-sinal, intra e extracelulares. Conhecer como funciona o proteoma é
um processo complexo, porque na maioria das vezes a proteína não age
sozinha realizando determinada tarefa, é a interação entre elas que vai
condicionar o processo (Gazzana e Borlak, 2007).
Além disso, análise proteômica gera conhecimento sobre vias de
sinalização celular, conjunto de proteínas reguladoras, permite identificar,
quantificar e estudar as modificações pós-traducionais das proteínas em uma
célula, tecido ou mesmo organismos em um dado momento fisiológico, bem
como outras informações importantes sobre os estados fisiológicos e
fisiopatológicos de células e organismos (Mann e Jensen, 2003; Newton et al.,
2004).
Na proteômica estrutural, em evidência no período entre 1995 e 2000,
os projetos proteômicos tiveram como objetivos primários separar e detectar o
máximo de proteínas possível de uma fonte, permitindo que sejam catalogadas
computacionalmente para estudo por técnicas analíticas. Em sua segunda era,
a proteômica funcional, prega-se o estudo funcional das proteínas
diferencialmente expressas, visando o seu envolvimento em rotas metabólicas,
ou de defesa, ou em mecanismos diversos que permitam avanços em termos
de genômica funcional. Esse estudo funcional simultâneo de um grande
número de proteínas requer o uso de técnicas sofisticadas. Dentre as técnicas
de separação de proteínas, a cromatografia líquida multidimensional (MDLC) e
a eletroforese bidimensional (2D) apresentam uma maior versatilidade e são as
35
mais usadas. Já no processo de detecção, destacam-se os espectrômetros de
massa (MS).
A análise proteômica tornou-se uma ciência poderosa, oferecendo
ferramentas para a caracterização de plantas. Com o progresso alcançado no
que diz respeito à sensibilidade e à rapidez na identificação de proteínas pela
espectrometria de massa e na contínua melhoria nas técnicas de análise
descritiva de proteínas, pela eletroforese 2D, a proteômica trouxe novas
perspectivas para analisar as complexas funções de espécies de plantas e
grãos, em diferentes níveis (Newton et al., 2004; Agrawal et al., 2005b, a).
O interesse na análise proteômica de plantas tem crescido rapidamente
nos últimos anos. O estudo do conjunto de proteínas expressas em órgãos e
tecidos vegetais tem sido aplicado para monitorar mudanças adquiridas ou
influência de estímulo ambiental nos padrões de expressão protéica (Agrawal
et al., 2005b). A proteômica aplica-se com sucesso ao estudo de variações de
proteínas em diferentes organismos vegetais (Mo et al., 2003), variações na
resposta a eventos fisiológicos (Gallardo et al., 2001), variações na interação
hospedeiro-patógeno (Elvira et al., 2008), associado ao melhoramento vegetal,
incluindo-se a prospecção de proteínas-alvo visando a defesa de plantas.
2.5. Ferramentas Proteômicas
Um dos grandes problemas enfrentados pela análise proteômica é a
composição complexa de muitas amostras analisadas, uma vez que um gene
pode dar origem a proteínas diferentes, incluindo as isoformas e também as
modificações co- e pós-transducionais que as proteínas sofrem. Considerando-
se a ocorrência de cerca de 40.000 genes no genoma humano como exemplo,
é estimado que mais de 100.000 tipos únicos funcionais de proteínas possam
ser encontrados em uma célula humana e, com as múltiplas modificações de
cada proteína, o número total de proteínas pode chegar a cerca de um milhão
(Ashcroft, 2003). As proteínas podem sofrer modificações pós-traducionais
como fosforilação, metilação, acetilação e clivagem proteolítica entre outras.
Por este motivo, a estrutura final e função das diversas proteínas não podem
ser definidas com base apenas nas sequências nucleotídicas dos genes que as
codificam. Além disso, muitos dos produtos gênicos são produzidos em
quantidades diferentes nas células, e aqueles que são produzidos em menores
36
quantidades podem não ser detectados, pois seus sinais se perdem no
background. Para resolver essa questão, um pré-fracionamento da amostra é
uma prática eficiente.
2.5.1. Abordagem Proteômica por Eletrofrese Bidimensional
Atualmente, a eletroforese bidimensional é o modo mais direto para
mapear o proteoma de um organismo (Dailey, 2001). Na eletroforese
bidimensional (2DE), as proteínas são separadas de acordo com seu ponto
isoelétrico (pI) por focalização isoelétrica (IEF) na primeira dimensão, e de
acordo com sua massa molecular por meio de eletroforese desnaturante em
gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS–PAGE) na segunda dimensão
(O'Farrell, 1975). As proteínas separadas por 2DE podem ser visualizadas
posteriormente por coloração com coomassie blue, coloração por prata,
corantes fluorescentes, detecção imunológica ou por radiomarcação.
A eletroforese bidimensional é um método de separação eficiente
porque todas as proteínas em uma amostra são separadas simultaneamente
fornecendo informações úteis sobre ponto isoelétrico, massa molecular,
expressão, abundância relativa e modificações pós-traducionais, verificadas
pela alteração da mobilidade eletroforética (Pandey e Mann, 2000). A
capacidade de separar com alta resolução um grande número de proteínas de
uma amostra complexa, e a possibilidade de se fazer análise da expressão
gênica por meio de comparação entre perfis protéicos de diferentes situações
fisiológicas, posiciona essa metodologia entre as principais ferramentas para
aplicação em proteômica. A separação e a visualização de proteínas de um
extrato bruto obtido de um tecido, organismo ou célula por 2DE seguida por
sua identificação e caracterização por espectrometria de massa é o método
mais comum para análises proteômicas atuais (Sarma et al., 2008).
Entretanto, perfis gerados pela 2DE nem sempre representam a
totalidade do proteoma, uma vez que esta técnica apresenta limitações para
detectar proteínas presentes em baixa concentração, com valores de massas
moleculares e pI extremos e proteínas hidrofóbicas, incluindo as de
membranas, as quais, muitas são normalmente usadas como alvos para a
ação de drogas, e são promissoras para o desenvolvimento de novas drogas
ou testes diagnósticos (Nägele et al., 2004). Proteínas com massas
37
moleculares abaixo de 10 kDa, geralmente, não são retidas pela malha do gel e
podem não ser detectadas quando essa técnica é empregada (Baggerman et
al., 2004).
Diversos procedimentos podem ser adotados para contornar tais
limitações, dentre eles, o pré-fracionamento da amostra, utilização de faixas
estreitas de pH para realização da IEF, fracionamento sub-celular e/ou
remoção das proteínas mais abundantes da amostra (Hancock, 2002).
Devido a essas limitações, a cromatografia líquida multidimensional
(MDLC-HPLC) vem sendo empregada com sucesso como alternativa à
utilização da 2DE (Newton et al., 2004; Ye et al., 2007). Técnicas e
equipamentos para a separação e detecção de proteína e peptídeo
recentemente desenvolvidos, tais como nano-HPLC e HPLC multidimensional,
permitiram que a proteômica experimentasse um crescimento dinâmico durante
os últimos anos (Mitulovic e Mechtler, 2006).
2.5.2. Identificação de Proteínas por Espectrometria De Massa
A espectrometria de massa (MS) tornou-se uma técnica indispensável
para as pesquisas em ciências biológicas, como uma ferramenta robusta, não
só devido à sua notável sensibilidade, mas também pela qualidade e variedade
de informações fornecidas pela técnica (Cañas et al., 2006). O espectrômetro
de massa é um instrumento analítico capaz de converter moléculas neutras em
íons na forma gasosa e separá-las de acordo com a sua razão massa/carga
(m/z), utilizando, para isso, campos eletromagnéticos. Este equipamento atua
como uma balança de íons de altíssima precisão e, em sua grande maioria, é
composto por uma fonte ionizante, por analisador(es), e detector(es). Como
resultado, é emitido um espectrograma, no qual o eixo y representa a
intensidade do sinal dos íons gerados e o eixo x, a razão m/z destes (Cañas et
al., 2006).
Apesar de a MS ser uma tecnologia usada há muito tempo no campo
das engenharias e da física, era pouco utilizada nas ciências da saúde por
degradar biomoléculas ao ionizá-las. Foram desenvolvidas duas técnicas
capazes de ionizar biomoléculas de alta massa molecular, como oligopeptídeos
e proteínas. Estas técnicas também são capazes de alterar o analito de sua
fase sólida ou líquida para gasosa, estado necessário para se analisar em MS
38
sem a degradação do analito. Tais técnicas foram denominadas matrix assisted
laser desorption ionization (MALDI) e electron spray ionization (ESI),
aperfeiçoadas para estudos de macromoléculas biológicas por John Fenn et al.
em 1989.
A possibilidade de identificar rapidamente um grande número de
proteínas pelo uso da espectrometria de massa (MS) permitiu o atual avanço
na área da proteômica e peptidômica. As conexões dos sistemas de ionização
com os analisadores formaram tipos de espectrômetro de massas bastante
utilizados em estudos de biomoléculas, como é o caso do MALDI-TOF (time-of-
flight), MALDI-TOF-TOF e Q-TOF.
2.5.3. Métodos Computacionais para Identificação de Proteínas
Identificação de proteínas por espectrometria de massa pode ser feita
seguindo-se duas abordagens: Peptide Mass Fingerprinting (PMF), baseando-
se em um único estágio do MS, e do Peptide Fragment Fingerprinting (PFF),
que é baseado na espectrometria de massa em tandem (MS/MS) (Blueggel et
al., 2004; McHugh e Arthur, 2008; Tiengo et al., 2009). A identificação das
proteínas utilizando os dados de MS por PMF é realizada por comparação
entre os mapas de peptídeos, em que as proteínas e os peptídeos maiores são
submetidos a uma digestão enzimática ou a uma clivagem química, e os
peptídeos resultantes têm sua massa molecular, posteriormente, identificada
por MS. Esses valores de massas moleculares obtidos são utilizados nas
buscas computacionais em que são comparados com resultados de digestão
“in silico” das proteínas existentes em bancos de dados, utilizando softwares
específicos, em geral pela ação de tripsina como a enzima proteolítica. A
tripsina, normalmente utilizada para a digestão das proteínas, faz clivagem
específica C-terminal adjacente a resíduos de arginina e lisina, gerando um
conjunto de peptídeos únicos cujas massas são determinadas por
espectrometria de massa (Shevchenko et al., 1996; Cagney et al., 2003) e que
podem ser considerados como impressão digital daquela molécula.
Já na análise por PFF, dois analisadores de massa acoplados em série
são utilizados. Os peptídeos previamente detectados durante o PMF
(chamados de íons precursores ou parentais) são então isolados e submetidos
à fragmentação, que proporciona a geração de fragmentos filhos. O espectro
39
obtido é chamado espectro de fragmentação ou MS/MS. Os espectros gerados
são analisados computacionalmente, onde são comparados com espectros
gerados in sílico dos peptídeos provenientes das proteínas existentes em
bancos de dados, utilizando softwares específicos (Blueggel et al., 2004;
McHugh e Arthur, 2008). Infelizmente, a abordagem da PFF só é útil quando há
uma coincidência exata entre os dados experimentais e uma sequência
incluída no banco de dados. Qualquer diferença de massa devido a
modificações inesperadas impede a identificação (Cañas et al., 2006).
Um dos softwares mais utilizados para as buscas é o MASCOT,
disponível em http://www.matrixscience.com/search_form_select.html, cuja
abordagem fundamental para calcular a probabilidade é de que a
correspondência observada entre o conjunto de dados experimentais e cada
entrada de seqüência contida nos bancos de dados é um acontecimento
fortuito. O Mascot envolve o cálculo de fragmentos teoricamente preditos para
todos os peptídeos de um banco de dados de acordo com a massa do íon
precursor, previamente determinada. Os valores de m/z dos fragmentos
preditos são comparados com os fragmentos experimentais sendo que, neste
caso, a comparação se inicia com base nos íons -b e -y mais intensos. A
probabilidade de o valor de m/z de um fragmento teoricamente obtido coincidir,
de maneira randômica, com o valor de m/z de um fragmento obtido
experimentalmente é calculada e expressa como sendo o negativo do logaritmo
desse número (score). Assim, quanto maior for o valor obtido, menor é a
probabilidade de que este resultado seja fruto de uma "coincidência". Esse
software fornece para cada busca submetida um valor limite (dependendo das
condições usadas para a busca) a partir do qual o valor obtido indica que a
determinação possui probabilidade inferior a 5% de ser um evento randômico
(Cantú et al., 2008). Se esta correspondência é também uma correspondência
importante, depende do tamanho do banco de dados utilizado para a pesquisa
(McHugh e Arthur, 2008).
Infelizmente, às vezes um espectro da amostra não se assemelha a
qualquer espectro teórico no banco de dados de proteína, perto o suficiente
para fazer uma identificação confiável. Isso pode acontecer por vários motivos,
tais como modificações pós-translacionais ou químicas inesperadas, splice
variantes, variações da sequência individual (polimorfismos de um único
nucleotídeo [SNPs] e outros), ou de omissões e erros no banco de dados
40
(McHugh e Arthur, 2008). Ainda, apesar de o PMF ser conceitualmente simples
e rápido, ele pode apresentar alguns falso-positivos na lista final,
especialmente quando a amostra é uma mistura de proteínas e o banco de
dados de referência é amplo. As ferramentas disponíveis atualmente para as
buscas apresentam algumas limitações. Os principais problemas dizem
respeito à possibilidade de escolher o banco de dados de proteína de
referência e de atualização, de escolher um número máximo de clivagens
perdidas adequadas ou as modificações pós-translacionais de interesse.
Normalmente, as massas de contaminantes detectados pelo espectrômetro
não são removidos antes de identificações ou proteínas contaminantes não
podem ser especificadas pelo usuário e em alguns casos, a avaliação
estatística dos resultados são muitas vezes inexistentes (Tiengo et al., 2009).
Outra técnica de identificação importante para a análise proteômica é o
sequenciamento de aminoácidos com o uso da técnica Sequenciamento de
novo (MS/MS). Os peptídeos ionizados (íons parentais) são acelerados para
uma região do espectrômetro preenchida com um gás inerte (hélio, argônio ou
nitrogênio) proporcionando, assim, a colisão entre os peptídeos ionizados e as
moléculas do gás inerte (no caso de aparelhos que usam CID – Câmaras de
colisão ou, do inglês, collision-induced dissociation), culminando na
desestabilização das ligações do esqueleto polipeptídico e, por consequência,
induzindo a formação de dois íon-fragmentos, que são classificados como íons
que retêm a carga residual (próton) no lado N-terminal (gerando fragmentos -a,
-b e -c, dependendo da ligação que é fragmentada); íons que retém a carga
residual (próton) na região C-terminal (gerando os fragmentos -x, -y -z,
dependendo da ligação que é fragmentada), segundo a nomenclatura proposta
por Roepstorff–Fohlmann–Biemann (Cantú et al., 2008). Esses íons filhos são
detectados, determinando os seus valores de razão massa/carga. Os espectros
gerados são analisados pela diferença de massa entre os picos referentes aos
íons filhos, e essa diferença é associada à massa dos 20 aminóacidos que
compõe as proteínas, na forma intacta ou modificada, fornecendo informações
para a formação da sequência (Westermeier et al., 2002). As sequências
geradas são utilizadas para buscas por similaridade através do alinhamento de
sequências via programas como o BLAST.
As diversas bases de dados utilizadas para as buscas são o “Genbank”,
o “SwissProt Database”, o “Protein Database” e o “EMBL”. A identificação é
41
fortemente influenciada pela quantidade de proteína na amostra, grau de
modificação pós-traducional, qualidade das buscas automáticas e presença da
proteína nos bancos de dados (Hancock, 2002; Gazzana e Borlak, 2007;
Tiengo et al., 2009; Pestana-Calsa et al., 2010). O conhecimento do genoma
de um organismo é de grande importância para permitir a identificação exata
das proteínas pelo padrão de peptídeos.
Na área vegetal, a proteômica teve seus primeiros resultados publicados
após 2000, e a pesquisa nessa área permanece ainda bastante incipiente.
Assim como para o estudo das células animais, microbianas e de insetos, a
proteômica na área vegetal certamente trará grandes avanços na identificação
de proteínas, enzimas ou peptídeos envolvidos em processos metabólicos de
interesse biotecnológico.
42
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Considerando que plantas submetidas a formas de estresses bióticos
são induzidas a uma resposta sistêmica que provoca uma alteração nos seus
estados fisiológicos e fisiopatológicos, o objetivo do trabalho foi identificar
proteínas e peptídeos diferentemente sintetizados em tomateiros (Solanum
lycopersicum) eliciados por Xanthomonas campestris pv. vesicatoria.
3.2. Objetivos Específicos
i – Estabelecimento de um sistema de cultivo e de eliciação de plantas
de tomate que permita identificar proteínas e peptídeos diferencialmente
sintetizados por estresse biótico após infecção bacteriana;
ii – Purificação e evidencição da ocorrência de proteínas e peptídeos
diferencialmente expressos após eliciação por Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria;
iii – Identificação e caracterização estrutural parcial de proteínas e
peptídeos relacionados à patogênse (PR) em plantas de tomate em condições
de estresse biótico por infecção por Xanthomonas campestris pv. vesicatoria.
3.3. Metas
i – Plantar as sementes de tomate, promover ataque por bactérias em
plantas adultas, colher e armazenar as folhas a –80oC para uso como fonte
protéica;
ii – Ajustar a metodologia de extração de folhas de tomateiro;
iii – Determinar as atividades de enzimas marcadoras da indução de
resistência;
iv – Ajustar o protocolo de purificação dos extratos por eletroforese
bidimensional (2DE).
iv – Caracterizar bioquímica e estruturalmente proteínas selecionadas:
determinar a massa molecular (MM) das proteínas de interesse.
v – Buscar homologia em bancos de dados genômicos e proteômicos.
vi – Buscar correlações biológicas que justifiquem a ocorrência da
expressão diferencial das proteínas identificadas.
43
4. MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos de fitopatologia foram realizados em colaboração com
o Laboratório de Bacteriologia e Controle Biológico – DFP/UFV, então
cordenado pelo Professor Reginaldo da Silva Romeiro (in memorian). As
demais análises foram feitas no Laboratório de Proteômica e Bioquímica de
Proteínas- BIOAGRO/UFV, sob a cordenação da Professora Maria Cristina
Baracat Pereira e no Núcleo de Análises de Biomoléculas, sob a cordenação
do Professor Everaldo Golçalves de Barros. As análises de bioinformática
tiveram a colaboração do Prof Humberto Ramos – DBB/UFV.
4.1. Plantio das Sementes
As sementes de tomateiro (Solanum lycopersicum) da cultivar Santa
Clara SAKATA® foram semeadas em copos descartáveis de poliestireno (500
mL), contendo substrato Bioplant® não esterilizado. Foram plantadas três
sementes por copo, em um total de 99 copos descartáveis, totalizando três
grupos de 33 copos cada. Após 10 dias de semeadura, promoveu-se a
desbastagem, mantendo-se 2 plantas por copo. Foram realizadas 66
repetições/tratamento, em que cada planta representou uma repetição. O
delineamento experimental foi o completamente casualizado. O experimento foi
todo conduzido sobre uma bancada no interior de casa-de-vegetação com
média de temperatura dia/noite de 30-22 ºC, umidade relativa > 60 % e
fotoperíodo de aproximadamente 12 horas.
4.2. Estresse Biótico
A bactéria Xanthomonas campestris pv vesicatoria, gentilmente cedida
pelo professor Reginaldo da Silva Romeiro, então cordenador do Laboratório
de Bacteriologia e Controle Biológico– DFP/UFV, foi plaqueada em meio sólido
Luria-Bertani broth (LB) e incubada por 48 h a 28 ± 2 ºC. Em seguida, a
bactéria foi ressuspendida em água, até que a a A540 tivesse uma leitura igual a
0,3. Para a inoculação, as plantas foram transferidas para a câmara de
nevoeiro, onde permaneceram por 24 horas. Os grupos de tomateiros foram,
então, inoculados com propagos de Xanthomonas campestris pv vesicatoria,
44
utilizando-se um atomizador (Romeiro, 2001), em dois diferentes tempos. Após
outras 24 horas, as plantas retornaram à casa de vegetação. Todas as plantas
foram coletadas no mesmo dia, de forma que tivessem a mesma idade. Desta
forma, as plantas foram submetidas a três tratamentos:
1) Sem inóculo (Grupo controle);
2) Inoculadas 1 dia antes da coleta;
3) Inoculadas 7 dias antes da coleta.
4.3. Avaliação da Severidade do Patógeno
As plantas de tomate, constituindo os dois grupos inoculados em tempos
diferentes com a bactéria X. campestris, foram avaliadas quanto à severidade
da doença, pela análise (contagem) dos sintomas visuais típicos apresentados
nas folhas, utilizando o programa Severity Pro (NUTTER Jr., F.W. e
LITWILLER, D. Severity Pro. Iowa State University Research Foundation, Inc.
1998).
4.4. Coleta do Material
As amostras consistiram da coleta de todas as folhas de cada planta
submetida a cada um dos três tratamentos, aos 41 dias após a semeadura.
Cada grupo de plantas correspondente a um tratamento foi coletado
separadamente. As folhas foram, então, armazenadas em envelopes de papel
alumínio e estocadas a -80 0C, obtendo-se os seguintes tratamentos:
1) Sem Inóculo (Grupo controle) – S/I;
2) Inoculadas 1 dia antes da coleta – 1 Dia;
3) Inoculadas 7 dias antes da coleta – 7 Dias;
4.5. Preparo do Extrato Foliar
4.5.1. Extrato para Atividade Enzimática
A extração seguiu-se de acordo com Shen (2002), com algumas
modificações. Folhas (5 g) de cada tratamento foram pulverizadas
separadamente em nitrogênio líquido, utilizando almofariz e pistilo. O pó obtido
foi homogeneizado com polivinilpolipirrolidona (PVPP) 2%, e em seguida, com
45
tampão de extração Tris-HCl 50mM, pH 7,0, (extração 1:3, g:mL), acrescido de
fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) e benzamidina, ambos na concentração
final de 1mM. O extrato obtido foi centrifugado a 20.000 g, 4 oC, por 25
minutos, e os sobrenadantes foi reservado.
4.5.2. Extrato para Análise Proteômica
A extração seguiu-se de acordo com Shen (2002), com algumas
modificações. 5 g de folhas de cada tratamento foram pulverizados
individualmente em nitrogênio líquido, utilizando almofariz e pistilo. O pó obtido
foi homogeneizado com PVPP 2% e adicionado de tampão de extração, na
proporção de 1:4, contendo tris-HCl 40 mM pH 7,5 , sacarose 250 mM, ácido
etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 10 mM, triton X-100 1%, PMSF 1 mM,
tiouréia 2 mM, benzamidina 1 mM, DTT 1mM. Após agitação durante 2h a 4 °C,
o material foi centrifugado a 21.000 g por 30 min a 4 °C. O sobrenadante foi
reservado. Ao precipitado, adicionou-se novamente o tampão de extração, na
proporção de 1:4, e após 1h sob agitação a 4 °C, o material foi novamente
centrifugado (21.000 g, 30 min, 4 °C). O sobrenadante foi recolhido e
adicionado ao primeiro sobrenadante.
As proteínas foram então precipitadas overnight a -20 °C, adicionando-
se TCA 10% em acetona gelada, na proporção de 1:1,5. A amostra foi então
centrifugada a 21.000 g por 30 min a 4 °C, e o precipitado foi lavado com
acetona gelada quatro vezes, até que o precipitado ficasse branco. O
precipitado foi então lavado com etanol 80%, e seco em SpeedVac.
O pó protéico resultante foi solubilizado em 500 µL de Tampão de
Solubilização (uréia 7M , tiouréia 2M, CHAPS 2%, DTT 0,3%), com a ajuda de
um sonicador de haste. Para remover as partículas, fez-se uma rápida
centrifugação, e o sobrenadante foi removido e quantificado.
4.6. Determinação da Concentração de Proteínas 4.6.1. Quantificação pelo Método do Ácido-Bicinconínico
A quantificação de proteínas totais dos extratos utilizados para a
detecção das atividades das enzimas foi feita pelo Método do Ácido-
Bicinconínico (BCA) (Smith et al., 1985), ajustado para microquantidades. O
46
ensaio foi conduzido em placas de 96 poços. O ensaio foi constituído de 5 µL
de amostra, 55 µL de água destilada e 120 µL do reagente, mantendo-se a
placa em banho-maria por 30 minutos, a 37 0C e por 20 minutos em
temperatura ambiente, seguindo-se a leitura em um leitor de microplacas a 560
nm. Para se determinar a concentração de proteínas, preparou-se uma curva-
padrão com BSA (albumina soro bovina) como proteína padrão, entre 0 a 40 µg
de BSA. A equação da reta da curva padrão ajustada foi y=0,0399x + 0,1371,
com R2=0,9968.
4.6.2. Quantificação pelo Método de Bradford
Devido à presença de interferentes presentes na amostra, a
quantificação de proteínas totais dos extratos utilizados para a análise
proteômica foi feita pelo Método de Bradford (Bradford, 1976 ), ajustado para
microquantidades. O ensaio foi conduzido em placas de 96 poços. O ensaio foi
constituído de 0,5 µL de amostra diluída em 143,5 µL de água destilada e 36
µL do reagente 5X. Após 10 minutos em repouso, em temperatura ambiente,
fez-se a leitura em um leitor de microplacas a 595 nm. Para se determinar a
concentração de proteínas, preparou-se uma curva-padrão com BSA (albumina
soro bovina) como proteína padrão, entre 0 a 60 µg de BSA. A equação da reta
da curva padrão ajustada foi y=0,0865x + 0,0843, com R2=0,9928.
4.7. Detecção da Atividade das Enzimas Indicadoras do Estado de
Indução de Resistência das plantas 4.7.1. Atividade de Lipoxigenases (LOX)
O aumento das atividades de LOX foi avaliado segundo metodologia
descrita por Axelrod et al. (1981), pelo aumento da absorvância no
comprimento de onda de 234 nm, pela formação de um sistema de ligações
duplas conjugadas no hidroperóxido formado, utilizando-se ácido linoléico
(linoleato de sódio 10 mM, pH 9,0) como substrato. A mistura de reação
constituiu-se de 1000 µL de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0, 20 µL do
substrato e 10 µL do extrato vegetal. As leituras foram realizadas em
espectrofotômetro a partir de 30 segundos do início da reação, e a 10 minutos
e 30 segundos, após o início da reação.
47
A velocidade de formação dos produtos (V) foi calculada pela equação:
V = A234 / . I . t, utilizando-se o coeficiente de extinção molar () dos
hidroperóxidos para o ácido linoléico de 25.000 M-1.cm-1, o caminho ótico (I), de
1,0 cm e o tempo de reação (t), de 10 minutos. Os resultados finais de
atividade enzimática foram expressos em µmol de 9-hidroperóxido do ácido
linoléico.min-1.µg proteína-1.
4.7.2. Atividade de Peroxidases (PO)
A atividade das peroxidases foi determinada a 30 ºC, pela da medida da
conversão do guaiacol em tetraguaiacol a 470nm (Hammerschmidt et al.,
1982). A mistura de reação constituiu-se de 1019 µL de uma solução de reação
(constituída na proporção de 125 µL de guaiacol, 153 µL peróxido de
hidrogênio em 50 mL de tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 6,0) e 1 µL do
extrato vegetal). A reação foi incubada em banho-maria e, em seguida, foram
realizadas leituras de absorvância, no comprimento de onda de 470 nm, nos
tempos de 30 segundos e 15 minutos e 30 segundos, após o início da reação.
A atividade das peroxidases foi expressa em unidades de absorvância.min -1.µg
proteína -1 (U.A..min -1.µg proteína -1).
4.7.3. Atividade de Fenilalanina Amônia-liase (PAL)
Para a detecção da atividade de PAL, foi utilizado o método descrito por
Pascholati et al. (1986), pela quantificação colorimétrica do ácido trans-
cinâmico liberado do substrato fenilalanina, com pequenas modificações.
Determinou-se a atividade por medida espectrofotométrica direta, pela
conversão de L-fenilalanina para ácido cinâmico a 290 nm e 37 ºC, nos tempos
de 30 segundos, e seguido por 5 minutos e 30 segundos após o início da
reação. A mistura da reação foi composta de 10 µL do extrato foliar e 1000 µL
de uma solução 0,2% de L-fenilalanina. A variação () das leituras de
absorvância foram plotadas em curva padrão para ácido cinâmico: y = 0,3621x
- 0,3891, R2=0,9968, em que y representa o valor da absorvância a 290 nm e x
representa os nmoles de ácido cinâmico produzido. Os resultados foram
expressos como atividade específica: nmol ácido cinâmico.min-1.µg proteína-1.
48
4.7.4. Atividade de Quitinases
A atividade de quitinases foi avaliada pela variação colorimétrica do
produto liberado na reação com o substrato Chitin Azure, na qual ocorre a
liberação de fragmentos solúveis de quitina carboximetilada marcada com
remazol brilhante violeta (CM-Chitin-RBV), segundo método descrito por
Hackman e Goldberg (1964), com pequenas modificações. Chintin Azure (10
µg, que consiste na concentração final do substrato de 1% (p/v) de mistura de
reação) foi pesada em um microtubo, em seguida acrescentados 600 µL de
tampão de extração e 400 µL do extrato foliar. Na reação-controle, o extrato
vegetal foi substituído por tampão de extração, no mesmo volume. Os ensaios
foram incubados a 25 °C por 48 horas. Em seguida a absorvância foi
determinada, a 575 nm. Para o cálculo da atividade específica, foi utilizada a
diferença entre o valor de absorvância de cada amostra e valor de absorvância
do controle. Os resultados finais foram expressos em atividade de quitinase.dia-
1. g quitina-1.g proteína-1.
4.7.5. Atividade de β-1,3-glucanases
A atividade de β-1,3-glucanases nas amostras foi determinada pela
variação colorimétrica de glicose liberada do substrato laminarina usando
hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (HAPHB) (Lever, 1972). A mistura de
reação foi incubada a 45 ºC por 1 hora, contendo 220 µL do tampão de
extração (acetato de sódio 100 mM, pH 5,0), 250 µL da solução de substrato
(laminarina 4 mg.mL-1.) e 30 µL do extrato vegetal. Após esse período, foram
acrescentados 1,5 mL de HAPHB, solução de desenvolvimento de cor (0,5 g da
HAPHB dissolvido em 10 mL de HCl 0,5 M, acrescido de 50 mL de NaOH 0,5
M), sendo esta mistura, em seguida, aquecida a 100 ºC por 5 minutos.
Após resfriamento em gelo até a temperatura de 30 ºC, determinou-se a
absorvância das amostras, utilizando-se um comprimento de onda de 410 nm.
O valor de absorvância de cada amostra foi subtraído pelo valor de
absorvância do controle (esse controle correspondeu a uma mistura idêntica à
da amostra, mas sem incubação prévia). Os resultados foram expressos em
unidades de absorvância.min-1.µg proteína-1.
49
4.8. Eletroforese Bidimensional
4.8.1. Focalização Isoelétrica (IEF)
A focalização Isoelétrica das proteínas foi realizada em equipamento
Ettan IPGphor 3, marca GE Healthcare. A IEF foi conduzida em tiras de
gradiente imobilizado de pH (Immobilized pH gradient - IPG) de 24 cm
(ImmobilineTM DryStrip, GE Healthcare), contendo um gradiente linear de pH
(pH 3-10) em gel de poliacrilamida fixado em plástico. Foram feitas 4 repetições
experimentais de cada tratamento.
Previamente à IEF, 800 µg de cada amostra foram adicionados de
solução de reidratação para um volume de 450 µL de concentração final de
uréia 7M, CHAPS 2%, tampão IPG (pH 3-10) 2%, DTT 40mM e azul de
bromofenol 0,002%, segundo instruções do fabricante (GE Healthcare). A
solução foi aplicada nas bandejas de reidratação e as fitas foram posicionadas
com o gel voltado para baixo, após remoção do plástico protetor. A re-
hidratação foi feita à temperatura ambiente durante 19 horas.
A focalização isoelétrica foi iniciada logo após o término da reidratação,
seguindo as orientações do fabricante, e ocorreu em cinco etapas, conforme
descrito na Tabela 2.
TABELA 4 : Etapas utilizadas durante a focalização isoelétrica das fitas de 24 cm.
Tipo de Voltagem Voltagem (V) Tempo (h) ou Voltagem acumulada (Vh)
Fixa 200 12 h
Fixa 500 1 h
Gradiente 1.000 800 Vh
Gradiente 10.000 16.500 Vh
Fixa 10.000 27.000 Vh
Após a IEF as tiras foram imediatamente armazenadas em congelador a
-80ºC para posterior utilização.
4.8.2. Equilíbrio das Tiras de Gradiente de pH Imobilizado
50
Após a IEF, as amostras foram reduzidas e alquiladas por incubação
consecutiva por 30 min cada em 15 mL de DTT 1% e iodoacetamida 2,5% em
tampão de equilíbrio, contendo tris-HCl 75 mM pH 8.8, uréia 6M, glicerol 30%
(p/v), SDS 2% (p/v) e azul de bromofenol 0,002% (p/v).
Após, as tiras foram lavadas com água destilada, e submersas por
alguns minutos em tampão de corrida (Laemmli, 1970), e imediatamente
submetidas à segunda dimensão por eletroforese em gel de poliacrilamida com
SDS (SDS-PAGE).
4.8.3. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na Presença de SDS
(SDS-PAGE)
A eletroforese das proteínas presentes nas tiras IPG foi feita em gel de
poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE), utilizando a metodologia
descrita por Laemmli (1970). O gel de separação foi preparado na
concentração de 12,5 %T. A eletroforese foi realizada em cubas de eletroforese
vertical modelo Ettan DALTsix (GE Healthcare). As tiras IPG foram
mergulhadas por alguns minutos no tampão de corrida e em seguida
posicionadas horizontalmente no topo do gel, mantendo pleno contato com
este. Posicionou-se juntamente papel de filtro (0,5x0,5cm) contendo 15 µL de
marcador Broad Range (BioRad). As tiras foram cobertas com 3mL de solução
de agarose morna (agarose 0,5%, SDS 1% e azul de bromofenol 0,002%), que
foi deixada solidificar por aproximadamente 5 minutos. A corrida foi feita em
fonte para eletroforese modelo EPS 601 (GE Healthcare), limitando-se a
corrente a 40 mA/gel até o azul de bromofenol atingir o limite inferior do gel. A
temperatura foi mantida a 8ºC por meio de refrigeração com circulador
termostático modelo MultiTemp III (GE Healthcare).
4.8.4. Visualização dos Géis
Os géis bidimensionais foram visualizados por meio de coloração com
Coomassie Blue coloidal, conforme o fabricante (GE Healthcare). Os géis
corados com Coomassie coloidal permaneceram pelo menos 48 horas em
solução de Coomassie Blue G250 0,08%, ácido fosfórico 0,8%, sulfato de
amônio 8% e metanol 20%. O corante residual foi removido com lavagens com
51
solução de ácido acético 1% e foram estocados em ácido acético 5% até a
remoção dos spots.
4.9. Captura das Imagens
As imagens dos géis bidimensionais foram digitalizadas utilizando o
scanner ImmageScan (GE Healthcare), em modo transparência, com a
resolução de 300 dpi (dotch per inch). As imagens geradas em formato .mel
foram analisadas no programa ImageMaster.
4.10. Análise dos Géis
As análises dos géis bidimensionais foram feitas no programa
ImageMaster 2D platinum (GE Healthcare). A detecção de pontos protéicos foi
feita automaticamente seguida de correções manuais. O volume dos pontos
protéicos detectados foi normalizado utilizando o modo de normalização de
volume total de pontos protéicos, no qual o volume de cada ponto foi dividido
pelo volume total dos pontos detectados e multiplicado por 100. As imagens de
géis resultantes de um mesmo tratamento foram sobrepostas e foi criado um
gel de referência artificial representativo de cada tratamento. Os géis
representativos de cada condição foram comparados para verificar diferenças
de expressão protéica. Para considerar uma proteína como induzida ou
reprimida, o critério utilizado foi respectivamente o aparecimento ou
desaparecimento da proteína do gel. Nas análises, foram considerados pontos
diferencialmente expressos aqueles que apresentaram uma variação na
percentagem de volume entre os tratamentos de 1,5 vezes ou mais, em pelo
menos três géis, com p< 0,05 segundo ANOVA.
4.11. Retirada de Proteínas dos Géis Bidimensionais e Tripsinólise
A retirada de proteínas para posterior análise por espectrometria de
massa foi feita com auxílio de uma ponteira de 1000 µL, estéril, com a ponta
cortada. O preparo das amostras para análise por meio de MALDI-ToF foi feito
conforme o seguinte protocolo, modificado de Shevchenko (2006). Para
remoção dos corantes os pedaços de gel contendo as proteínas foram
transferidos para tubos de 500µL siliconizados e receberam 200µL de solução
52
acetonitrila 50% em bicarbonato de amônio 25 mM pH 8,0. A suspensão foi
agitada em vortex e deixada em repouso durante 10 minutos. O procedimento
foi repetido 3 vezes, sendo a última lavagem realizada overnight, até a total
descoloração do gel e a remoção de SDS. Para realizar a desidratação dos
fragmentos de géis, foram feitas 2 lavagens com 200 µL de acetonitrila 100%
por 5 min cada e, em seguida, os géis foram secos em sistema de
centrifugação a vácuo durante 15 minutos.
Os pedaços de gel foram reduzidos em 100 µL de DTT 65 mM em
bicarbonato de amônio 100 mM pH 8,0, por 30min a 56 °C, e alquilados com
100 µL de iodoacetamida 200 mM em bicarbonato de amônio 100 mM pH 8,0,
por 30min à temperatura ambiente. Os pedaços de gel foram lavados em
seguida com 200 µL bicarbonato de amônio 100 mM pH 8,0 utilizando-se
vortex por 10 min. Os géis foram novamente desidratados com 200 µL de
acetonitrila 100% por 5 min no vórtex. A acetonitrila foi removida, e os géis
reidratados com 200 µL bicarbonato de amônio 100 mM pH 8,0. Os géis foram
mais uma vez desidratados com 200 µL de acetonitrila 100% por 5 min no
vórtex. A acetonitrila foi removida e em seguida os géis foram secos em
sistema de centrifugação a vácuo durante 15 minutos.
Na etapa de digestão enzimática, os géis foram reidratados com solução
contendo tripsina (25 µg/mL) – Tripsin Gold, Mass Spectrometry Grade,
Promega - em 40 mM de solução bicarbonato de amônio pH 8,0 e acetonitrila
10%, em quantidade suficiente para cobrir completamente os pedaços de géis.
A solução com enzima foi aplicada fria (4ºC) e as amostras permaneceram em
banho de gelo durante 45 minutos. Em seguida, foram adicionados 50 µL de
solução de bicarbonato de amônio pH 8,0 e acetonitrila 10%. As amostras
foram colocadas em banho-maria a 37ºC durante 16 horas. Após este período,
as amostras foram sonicadas por 10 min, agitadas em vortex por 20s e a
solução com enzima foi removida para um tubo limpo. Ao gel restante, foram
adicionados 15 µL de solução de ácido fórmico 5% e acetonitrila 50%, o tubo
foi agitado em vortex por 20s e foi deixado em repouso por 15 min em
temperatura ambiente. As amostras foram novamente sonicadas por 2 min,
agitadas em vortex por 20s e a solução contendo os peptídeos foi removida e
adicionada à removida anteriormente. O passo anterior foi novamente repetido,
e a solução foi removida e combinada com a contida no tubo limpo. As
amostras foram concentradas em sistema de centrifugação a vácuo.
53
Os digestos foram dessalinizados antes da análise em MS utilizando
micro-colunas de fase reversa C18 ZipTip (Milipore) de acordo com as
instruções do fabricante.
4.12. Análise Espectrométrica Através de MALDI-TOF/TOF
As análises espectrométricas dos peptídeos resultantes da digestão com
tripsina foram feitas em equipamento do tipo MALDI-TOF/TOF Ultraflex III
(Bruker Daltonics®). Aplicou-se 1 µL da mistura (1:3) de amostra e matriz de
ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (5 µg.mL-1 em 50% de acetonitrila e ácido
trifluoracético (TFA) 0,1%) no poço da placa de aço MTP Anchor Chip TM
600/384 TF (Bruker Daltonics®) do espectrômetro de massa. Para que os
espectros obtidos tivessem a maior precisão e confiabilidade, foi realizada a
calibração externa com o padrão, “Peptide calibration standard II” (Bruker
Daltonics®), que foi espotado com a mesma matriz em um outro poço da placa
de aço. Esse padrão é composto pelos peptídeos bradicinina (757 Da),
angiotensina II (1046 Da), angiotensina I (1296 Da), substância P (1347 Da),
bombesina (1619 Da), ACTH clip 1-17 (2093 Da), ACTH clip 18-39 (2465 Da) e
somatostatina (3147 Da).
O método de aquisição utilizado foi o modo de detecção tipo refletor
para íons com polaridade positiva. Os espectros foram editados manualmente,
no programa FlexAnalysis, com seleção dos picos monocarregados apenas.
4.13. Identificação das Proteínas
As massas monoisotópicas de cada peptídeo detectados pelo MALDI-
TOF/TOF foram submetidas à busca no MASCOT, instalado no servidor do
Núcleo de Análises de Biomoléculas – UFV, programa que permite a
identificação por Peptide Mass Fingerprinting. As pesquisas foram realizadas
no banco de dados NCBI e Swiss-Prot. Para ambas as buscas, foi utilizado o
grupo taxonômico das Plantas Verdes (Viridiplantae). Os critérios de busca
foram todas as massas moleculares, carboxamidometilação de cisteínas como
modificação fixa e oxidação de metionina como modificação variável. Foi
tolerada no máximo uma clivagem perdida para peptideos semi-trípticos e uma
variação de massa dos peptídeos de 0,05 Da. A identificação foi considerada
não ambígua quando existiram pelo menos 4 peptídeos encontrados, uma
54
cobertura de pelo menos 15% da sequência inteira da proteína não madura e
pela coincidência próxima da massa molecular e pI teóricos e experimentais da
proteína. Critérios como percentagem em score, massas moleculares e
espécies à qual pertencem as proteínas foram também levados em
consideração para evitar interpretações equivocadas.
55
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1. Avaliação do Grau de Severidade da Doença Induzida pelo
Patógeno
Após a inoculação de propagos de Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria, somente as plantas do tratamento 7 dias apresentaram os
sintomas da Mancha-Bacteriana do tomateiro, causada pelo patógeno (Figura
2). A severidade da doença, avaliada pelos sintomas nas folhas, foi
significativamente maior para o tratamento 7 dias (Figura 2e), como já era
esperado, uma vez que há a necessidade de um período para que o patógeno
se estabeleça, colonize os tecidos e expresse a doença.
Considerando os diferentes graus de severidade observados pela
expressão da mancha-bacteriana nas plantas, constatou-se que as plantas
usadas como material-fonte de proteínas, para avaliação da expressão
diferencial frente à inoculação do patógeno, foram submetidas a diferentes
situações de estresse biótico.
5.2. Avaliação da Indução de Resistência
As Proteínas PR constituem-se na principal classe de compostos
induzidos após a reação de hipersensibilidade, pois participam ativamente no
fenômeno de resistência induzida. Embora as proteínas PR estejam envolvidas
na defesa de plantas, elas não são necessariamente identificadas por sua ação
antipatogênica, mas sim por seu simples acúmulo em plantas submetidas à
situação de patogênese (van Loon, 1997). As enzimas indicadoras do estado
de indução estão incluídas dentre as proteínas PR.
5.2.1. Atividade das Enzimas Indicadoras da Indução de Resistência
As atividades das enzimas indicadoras da indução de resistência
mostraram-se estatisticamente diferenciada entre os tratamentos nos extratos
foliares, de acordo com o Teste de Tukey (α= 0,05) (Figura 3). Esses
56
resultados sugerem que as plantas dos diferentes tratamentos encontram-se
em diferentes estados fisiológicos em relação à resposta de indução de
resistência pelo patógeno X. campestris pv. vesicatoria.
FIGURA 2: Folhas de tomateiros inoculados com propagos da bactéria Xanthomonas campestris pv. vesicatória. a: Plantas não inoculadas; b: Após 1 dia de inoculação; c: Após 7 dias de inoculação. Os sintomas da mancha-bacteriana estão indicados pelas setas em c. d:
57
Severidade da doença expressa como a média do número de lesões por folheto em plantas de tomate após a inoculação pelo patógeno. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem significativamente pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
A atividade de Quitinase (Figura 3a) foi maior no tratamento 7 Dias.
Cavalcanti et al. (2006a) mostraram que plantas de tomateiro pulverizadas com
as substâncias testadas (Ecolife e VLA - extrato aquoso de ramos de lobeira
(Solanum lycocarpum) infectados por C. perniciosa) apresentaram, durante o
período testado de 9 a 12 dias, valores mais altos na atividade de quitinases do
que os observados nas plantas correspondentes pulverizadas com água.
A atividade de β-1,3-glucanase (Figura 3b) para 1 e 7 Dias foi menor do
que a do extrato controle S/I, entretanto mostrou tendência de aumento entre 1
e 7 Dias. Cavalcanti et al. (2006a), quando estudaram plantas de tomateiro
pulverizadas com formulação biológica proveniente de biomassa cítrica,
denominada Ecolife, e suspensão de quitosana proveniente de micélio de
Crinipellis perniciosa mostraram haver aumento na atividade de β-1,3-
glucanases em folhas, à primeira hora após a pulverização, em relação a
plantas pulverizadas com água. A atividade entre 3 e 12 dias após a
pulverização não diferiu significativamente da encontrada em plantas
pulverizadas com água e das pulverizadas com água e submetidas
posteriormente à inoculação com Xanthomonas campestris pv vesicatoria.
A atividade da enzima PAL (Figura 3c) foi estatisticamente maior no
tratamento 1 Dia. Segundo van Loon (1997) e Podile e Laxmi (1998), o produto
de PAL, o ácido cinâmico, está diretamente ligado ao processo de lignificação
celular, e os níveis mais elevados de atividade da PAL geralmente ocorrem
cerca de 24 h após a infecção inicial, o que foi observado nesse trabalho.
Aumentos na atividade de PAL foram também observados por indução por
ferimentos (Saltveit, 2000) ou luz (Chen et al., 2002), com picos de atividade
enzimática entre 24 e 48 h após a indução. A atividade da PAL está
relacionada com a resistência de plantas a patógenos, pelo envolvimento
dessa enzima no primeiro passo da síntese dos fenilpropanóides, com a sua
conversão de fenilalanina em ácido-transcinâmico, resultando em compostos
como fitoalexinas e, principalmente, lignina, que confere maior resistência à
parede celular das plantas aos patógenos (Nakazawa et al., 2001).
A atividade de LOX foi significativamente maior nos tratamentos 1 e 7
(Figura 3d), quando comparada ao controle, sendo o pico de atividade em 7
Dias. As LOX catalisam a oxidação de ácidos graxos polinsaturados com uma
58
fração (cis,cis)-1,4-pentadieno a hidroperóxidos de ácidos graxos e têm um
papel importante na danificação de membranas durante a HR. Além disso,
produtos voláteis da ação das lipoxigenases contribuem para reações de
defesa por ação na inibição do crescimento de patógenos.
Aumento significativo da atividade de PO (Figura 3e) foi observado para
os tratamentos 7 Dias quando comparado com o controle S/I, coincidente com
o grau de severidade da doença. Buonaurio e Kumar (1995) avaliaram a
atividade enzimática de PO em plantas inoculadas com X. campestris pv.
vesicatoria 3 a 12 dias após a infecção e observaram que a maior atividade de
PO foi na fase mais avançada da doença (12-15 dias após a inoculação).
As atividades das lipoxigenases (LOX) e das peroxidases (PO) maiores
nos tratamentos citados podem indicar uma indução das PO para neutralizar
hidroperóxidos gerados pelas LOX no processo de sinalização celular.
Os superóxidos gerados provocam a peroxidação de lipídeos de
membrana, responsáveis pela produção de ácidos graxos livres, como o
linoléico e o linolênico (BREUSEGEM et al., 2001). Hidroperóxidos desses
ácidos são produtos de reações catalisadas pelas LOX, como o ácido
hidroperoxilinolênico, um precursor da óxido sintase presente na via de síntese
metabólica do ácido jasmônico, um importante fitormônio de defesa de plantas
(Guzzo, 2004). A reação de hipersensibilidade é o mecanismo de defesa
induzida inicial resultando em uma alta concentração de espécies reativas de
oxigênio, cujo efeito citotóxico resulta na necrose das células vegetais,
privando o patógeno de nutrientes e dificultando a sua propagação (Soares e
Machado, 2007).
Os resultados obtidos indicam que diferentes grupos de proteínas foram
expressos em cada um dos tratamentos, sugerindo um material-fonte de
proteínas que certamente deve permitir a avaliação do proteoma diferencial
envolvido no estresse por X. campestris pv vesicatoria em plantas de tomate.
59
FIGURA 3: Atividade específica das enzimas marcadoras do estado de indução de resistência sistêmica em extratos de tomate após inoculação com X. campestris pv. vesicatoria. Os tratamentos corresponderam ao tempo de coleta das folhas (1 e 7 dias) após a inoculação, comparados com o tratamento controle (S/I – Sem Inóculo). a: Quitinase (∆A575.dia-1.g quitina-
1.mg proteina-1); b: -1,3-glucanase (∆A410.min-1.mg proteina-1), c: fenilalanina amônia-liase (PAL, nmol ácido cinâmico.min-1.mg proteina-1), d: lipoxigenases (LOX, nmol ácido linoleico.min-1.mg proteina-1), e e: peroxidases (PO, ΔA470.min-1.mg proteina-1). As barras representam a média ± desvio padrão. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem significativamente pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
60
5.2.2. Determinação da Concentração de Proteínas
Para a determinação das atividades específicas das enzimas
indicadoras de indução de resistência, avaliou-se a concentração de proteínas
das amostras (Tabela 3) determinada pelo método do ácido bicinconínico
(Smith et al., 1985), tendo sido ajustada a equação de reta y= 0,0399x +
0,1371, R2=0,9968. O método do ácido bicinconínico foi escolhido por
apresentar alta sensibilidade e boa reprodutibilidade para o procedimento
descrito, não sendo influenciado pelas concentrações utilizadas de
componentes do extrato (conforme prospectos de informação do produto
fornecidos pelo fabricante).
TABELA 5: Determinação da concentração de proteínas pelo método do ácido bicinconínico
nos extratos foliares utilizados para os ensaios enzimáticos
AMOSTRA ∆Abs (560nm) Ptn (µg) Ptn (µg.µL-1) S/I 0,378 6,05 1,21 1Dia 0,493 8,93 1,79 7Dias 0,416 7,00 1,40
5.3. Análise Proteômica Comparativa
5.3.1. Determinação da Concentração de Proteínas
Após a precipitação das proteínas extraídas e ressolubilização, as
amostras foram quantificadas (Tabela 4) pelo método de Bradford (1976 ),
ajustado para micro quantidades, tendo sido ajustada a equação de reta y=
0,0865x + 0,0843, R2=0,9928. A escolha do método é devido aos componentes
do tampão de ressolubilização, que são interferentes para outros métodos de
quantificação.
TABELA 6: Determinação da concentração de proteínas pelo método de Bradford nos extratos
foliares utilizados para a análise proteômica
AMOSTRA ∆Abs (595nm) Ptn (µg) Ptn (µg.µL-1) S/I 0,847 8,82 17,63 1 Dia 0,490 4,69 9,38 7 Dias 0,650 6,54 13,08
61
5.3.2. Análise do Perfil Protéico de Folhas de Tomateiro após Inoculação com o Patógeno por Eletroforese Bidimensional
Os perfis protéicos dos três diferentes tratamentos (Figura 4) sugerem
que as proteínas das folhas de tomate são predominantemente aniônicas,
similar ao perfil protéico de folhas de tomateiro separadas por Gel 2D descrito
por outros grupos de pesquisa (Corpillo et al., 2004; Kok et al., 2008; Afroz et
al., 2009). Os perfis protéicos referentes aos três tratamentos, quando
comparados, apresentaram diferenças com relação à presença ou ausência,
formas e intensidades de pontos protéicos em uma ampla faixa de massa
molecular analisada, entre 200 e 14 kDa. A expressão de muitas proteínas é
diminuída após o estresse, enquanto outras proteínas foram sintetizadas.
Assim, confirmou-se que a resposta de defesa da planta variou de acordo com
o tempo de estresse, como pode ser observada pela expressão diferencial de
proteínas após 1 dia de inoculação (Tratamento 1Dia) e após 7 Dias
(Tratamento 7Dias).
Após análise das imagens pelo ImageMaster (GE), foram detectados
255 pontos protéicos diferencialmente expressos com p<0,05 entre controle e 1
Dia e 192 pontos protéicos entre controle e 7 Dias. Para posterior análise por
MS, fez-se uma análise criteriosa para seleção dos pontos protéicos a serem
analisados, considerando-se como significativas apenas as expressões que
diferenciaram pelo menos cerca de 1,5 vezes, e os pontos protéicos presentes
em um tratamento e ausentes em outro. Dessa forma, selecionou-se 44 pontos
protéicos para excisão e digestão enzimática.
62
FIGURA 4: Eletroforese bidimensional de extratos protéicos de folhas de tomateiros. A primeira dimensão foi realizada em gradiente de pH 3-10 e a segunda dimensão por eletroforese SDS-PAGE 12,5%. Utilizou-se como padrão de massa molecular o marcador Broad Range (BioRad).
63
Os géis foram corados por Coomassie Blue Coloidal. a- Controle sem Inóculo, b- Tratamento 1 Dia, c- Tratamento 7 Dias.
5.4. Espectros de Massa e Busca em Bancos de Dados
Após a digestão tríptica, a análise por MS forneceu um espectro com a
razão massa/carga dos peptídeos trípticos obtidos de cada um dos pontos
protéicos retirados dos géis.
As proteínas foram identificadas pela comparação entre as massas
obtidas pela digestão tríptica dos pontos protéicos e a massa dos peptídeos
teóricos obtidos do banco de dados do NCBI e SwissProt.
Dos 42 picos submetidos à análise, foram identificadas sete proteínas
(Tabela 4). De acordo com o algosritmo do MASCOT, somente duas dessas
foram significativas, com p<0,05. Entretanto, sabendo das limitações da
técnica, e usando outros atributos, descritos na metodologia, para validar os
resultados, outras cinco proteínas foram também identificadas.
Dentre as proteínas identificadas, três tiveram sua expresão diminuída
ou inibida após 1 dia de inoculação com o patógeno Xanthomonas campestris
pv. vesicatoria. São elas: A1M39, A1M48 e A1M59. Uma aumentou após 1 Dia
de inoculo, A1M80, e três no tratamento 7 Dias: A2M5, A2M12, A2M110.
A1M39 (pI 6,96 e MM 41,131kDa) (Figura 5) foi identificada como a
enzima hidroxipiruvato redutase de Solanum lycopersicum (pI 8,15 e MM
13,203 kDa). Esta enzima é importante para a redução do hidroxipiruvato a
glicerol, que é então fosforilado nos cloroplastos, e o 3-fosfoglicerato resultante
entra no ciclo de Calvin (Figura 6). A principal atividade da hidroxipiruvato
redutase das folhas é de uma enzima altamente ativa localizada em
peroxissomos, que utiliza preferencialmente NADH como cofator. Em menor
quantidade, NADPH também pode ser utilizado pela enzima peroxisomal. Uma
segunda enzima hidroxipiruvato redutase está localizado no citoplasma, que
preferencialmente usa NADPH, mas também pode usar como cofactor NADH
(Bauwe et al., 2010). Esses resultados sugerem o redirecionamento do poder
redutor, que em situações fisiológicas normais seria utilizado para o
crescimento da planta, e que numa situação de estresse causado pelo
patógeno, passa a ser utilizado nas reações desencadeadas pelos
mecanismos de defesa da planta.
64
FIGURA 5: Expressão diferencial da protéina A1M39. a: proteína presente no controle SI (sem inoculo; b: proteína ausente no tratamento 1 Dia; c: espectro de massa do perfil peptídico da proteína A1M39 após digestão enzimática com tripsina 25 ng/ µL.
65
FIGURA 6 : Metabolismo fotorrespiratório multicompartimentado do carbono e do nitrogênio em plantas. Fluxograma das reações que constituem o núcleo do ciclo C2 (azul), o ciclo da fotorrespiração do nitrogênio (preto), e diversas reações associadas (azul e cinza claro). As enzimas são CAT, catalase; Complex, NADH: ubiquinona redutase da cadeia mitocondrial de transporte de elétrons; GDC, glicina descarboxilase; GLYK, o glicerol 3-quinase; GOGAT, glutamato sintase dependente de ferredoxina; GOX, glicolato oxidase; GGT, glutamato: glioxilato aminotransferase; GS, glutamina sintetase; HPR1, hidroxipiruvato redutase peroxisomal; HPR2, hidroxipiruva redutase citosólica; MDH, malato desidrogenase; NDAin, NADH:ubiquinona redutase interno, PGP, 2PG fosfatase; SGT, serina:glioxilato aminotransferase e SHMT, serina hidroximetil. As múltiplas setas de 3PGA para RuBP simbolizam as reações do ciclo de Calvin. Retirado de: Photorespiration: players, partners and origin (Bauwe et al., 2010).
A1M48 (pI 5,38 e MM 34,937 kDa) (Figura 7), que teve sua expressão
diminuída 2,7 vezes após 1 Dia do inóculo, foi identificada como aldolase (pI
5,47 e MM 37,974 kDa) da espécie Pisum sativum. Esta proteína possui alta
homologia com frutose-1,6-bifosfato aldolase de Solanum lycopersicum
(AAK62818.1) segundo BLASTp (Score 206, e-value 2e-54 e 55% de
cobertura). Esta é uma enzima importante para o metabolismo da Glicose. A
enzima é também um componente do ciclo das pentoses-fosfato e do ciclo de
Calvin em plantas superiores (Figura 8) (Purev et al., 2008). Esta alteração da
regulação da fotossíntese em plantas de tomate, com a diminuição da
expressão da enzima com frutose-1,6-bifosfato aldolase, foi também verificada
em plantas superexpressando glutationa peroxidase (Herbette et al., 2005).
Purev e colaboradores (2008) também verificaram a dimunição da expressão
do gene dessa enzima, via RT-PCR em C. lanceolata após 48h submetidas ao
estresse por ferimentos. Outro estudo, entretanto, revelou um aumento nos
66
níveis da proteína em resposta à infecção fúngica (Campo et al., 2004), o que
está de acordo com um trabalho que mostra que um aumento nos níveis de
sacarose no tecido foliar se correlaciona com resistência a fungos (Murillo et
al., 2003).
FIGURA 7: Expressão diferencial da proteína A1M48. a: proteína presente no controle SI (sem inoculo; b: proteína expressa 2,7 vezes menos no tratamento 1 Dia; c: espectro de massa do perfil peptídico da proteína A1M48 após digestão enzimática com tripsina 25 ng/ µL.
67
FIGURA 8: Reações da Frutose 1,6-Bifosfato aldolase.
A1M59 (pI 6,66 e MM 39.067 kDa) (Figura 9), que teve sua expressão
diminuída após 1 Dia do inóculo, foi identificada como uma possível
pectinesterase/pectinesterase inibidor 19 (pI 7,00 e MM 59.168 kDa) da
espécie Arabidopsis thaliana. Esta proteína possui alta homologia com a
Pectinesterase de Solanum lycopersicum (P14280) segundo BLASTp (Score
408, e-value 3e-115 e 95% de cobertura). A Pectinesterase ou Pectina
metilesterase (PME) (EC 3.1.1.11) é uma das enzimas modificadoras de
pectina, presente tanto em plantas quanto em microrganismos fitopatogênicos
(fungos e bactérias). Acredita-se desempenhar um papel importante no
metabolismo da parede celular (Phan et al., 2007). Ela remove os grupos metila
presentes, como grupos carboximetil, na cadeia poligalacturonato, produzindo
pectina com menor grau de metilação e metanol. Como consequência, prótons
são liberados no meio. A desmetilação permite a agregação de pectina, via
interquelação com cálcio, fortalecendo a parede. Entretanto, a desmetilação
pode também tornar a pectina mais suscetível à degradação pela
poligalacturonase da parede celular, atuando assim no enfraquecimento da
parede. Dessa forma, é provável que as muitas isoformas de PME encontradas
associadas com diferentes tecidos da planta, poderiam ter funções muito
diferentes durante o desenvolvimento da planta. Em tomateiro (Solanum
lycopersicum), a atividade da enzima PME está presente em todo o
desenvolvimento e amadurecimento dos frutos e também está presente nas
folhas e raízes. Esta atividade, como em outras plantas, está associada com
múltiplas isoformas (Phan et al., 2007).
68
O ponto protéico A1M80 (pI 6,57 e MM 25,891 kDa) (Figura 10) teve
sua expressão aumentada após 1 dia do inóculo com o patógeno. A proteína
foi identificada como uma isoforma citosólica da triosefosfato isomerase (pI
5,73 e MM 27,252 kDa) da espécie Solanum chacoense, pertencente à mesma
família dos tomates. A triose-fosfato isomerase é uma enzima que cataliza a
interconversão reversível de dihidroxiacetona fosfato a D-gliceraldeido-3-
fosfato. Esta enzima desempenha um papel importante na glicólise, sendo
essencial para uma produção eficiente de energia.
FIGURA 9: Expressão diferencial da protéina A1M59. a: proteína presente no controle SI (sem inoculo; b: proteína com expressão diminuída no tratamento 1 Dia; c: espectro de massa do perfil peptídico da proteína A1M59 após digestão enzimática com tripsina 25 ng/ µL.
69
FIGURA 10 : Expressão diferencial da protéina A1M80. a: proteína presente no controle SI (sem inoculo; b: proteína com expressão aumentada no tratamento 1 Dia; c: espectro de massa do perfil peptídico da proteína A1M59 após digestão enzimática com tripsina 25 ng/ µL.
70
O ponto protéico A2M5 (pI 4,05 e MM 42,761 kDa) (Figura 11) Teve
sua expressão aumentada após 7 dias de inoculção e foi identificado como
Peroxidase de Solanum lycopersicum (pI 4,56 e MM 35,374 kDa), o que está
de acordo com os ensaios enzimáticos previamente apresentados. Os
mecanismos de defesa das plantas contra fitopatógenos envolvem alterações
metabólicas que estão correlacionadas com mudanças na atividade de
enzimas-chaves nos metabolismos primário e secundário. Neste contexto o
grupo de peroxidases (PR 9) representam um papel importante na defesa das
plantas. As peroxidases de planta são glicoproteínas que contêm um
grupamento heme em sua estrutura e possuem a função básica de catalisar a
oxidação do peróxido de hidrogênio (H2O2) a partir de numerosas espécies de
substratos orgânicos e inorgânicos. Elas são proteínas de massa molecular em
torno de 40 kDa, conhecidas como enzimas de “função dupla” pois elas
produzem o H2O2 como produto de sua reação e também o utilizam como
substrato em outras reações (Cavalcanti et al., 2006b). Defesas das plantas
contra patógenos, cicatrização de ferimentos, oxidação de fenóis, formação de
lignina, metabolismo da auxina, biossíntese de etileno, regulação da elongação
de células respiração, processos intermediados por luz, crescimento e
senescência são alguns exemplos de eventos fisiológicos nos quais existe a
participação das peroxidases. Na biossíntese de lignina, as peroxidases
removem os átomos de hidrogênio dos álcoois hidroxicinâmicos, resultando na
produção de radicais que reagem espontaneamente durante a deposição de
lignina na parede celular (Torres e Andrews, 2006). A lignina, juntamente com a
celulose e outros polissacarídeos que ocorrem na parede celular das plantas
superiores, funciona como uma barreira física à penetração fúngica. Jung
(2004) demosntrou que a atividade peroxidase aumenta cerca de 100 vezes,
sete dias após o tratamento de folhas de Arabidopsis thaliana com metil
jasmonato.
O ponto protéico A2M12 (pI 5,15 e MM 61,185 kDa) (Figura12), que foi
induzido no tartamento 7 Dias, foi identificado como uma proteína predita de
Populus trichocarpa (pI 9,87 e MM 42,891 kDa).
Já A2M110 (pI 4,79 e MM 14,943 kDa) (Figura 13), que também foi
induzido após 7 dias de inoculção apresentou homologia com uma proteína
desconhecida de Zea mays (pI 8,98 e MM 11,431 kDa).
71
FIGURA 11 : Expressão diferencial da protéina A2M5. a: proteína presente no controle SI (sem inoculo; b: proteína com expressão aumentada no tratamento 7 Dias; c: espectro de massa do perfil peptídico da proteína A1M59 após digestão enzimática com tripsina 25 ng/ µL.
72
FIGURA 12: Expressão diferencial da protéina A2M12. a: proteína ausente no controle SI (sem inoculo; b: proteína com expressão aumentada no tratamento 7 Dias; c: espectro de massa do perfil peptídico da proteína A1M59 após digestão enzimática com tripsina 25 ng/ µL.
73
FIGURA 13 : Expressão diferencial da protéina A2M110. a: proteína ausente no controle SI (sem inoculo; b: proteína com expressão aumentada no tratamento 7 Dias; c: espectro de massa do perfil peptídico da proteína A1M59 após digestão enzimática com tripsina 25 ng/ µL.
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TABELA 7 :Lista de Proteínas identificadas em folhas de tomate usando Peptide Mass Fingerprinting (PMF).
Amostra Match ID
PI teórico
MM
teórico Identificação Acesso PI MM Score %
Cobertura Número de Matchs
Erro Banco de Dados
A1M39 2227 6.96 41131 hydroxypyruvate reductase [Solanum lycopersicum] EU574918.1 8.15 13203 45 58% 8 ± 0.05
Da NCBI
A1M48 801 5.39 34937 aldolase [Pisum sativum] M97477.1 5.47 37974 651 20% 6 ± 0.05
Da SwissProt
A1M48 801 5.39 34937 aldolase [Pisum sativum] M97477.1 5.47 37974 65 20% 6 ± 0.05
Da NCBI
A1M59 2216 6.66 39067
Probable pectinesterase/pectinesterase inhibitor 19 [Arabidopsis thaliana]
Q84JX1 7.00 59168 43 20% 9 ± 0.05 Da SwissProt
A1M80 743 6.57 25891 triose phosphate isomerase cytosolic isoform [Solanum chacoense]
AY438596.1 5.73 27251 52 35% 8 ± 0.05 Da NCBI
A2M5 1567 4.05 42761 Peroxidase [Solanum lycopersicum] Y19023.1 4.56 35374 92 42% 12 ± 0.05
Da NCBI
A2M12 1587 5.15 61185 predicted protein [Populus trichocarpa]
XP_002297718.1 9.87 42891 50 21% 7 ± 0.05
Da NCBI
A2M110 248 4.79 14943 unknown [Zea mays] BT084055.1 8.98 11431 59 63% 6 ± 0.05
Da NCBI
1 Os escores em negrito são estatisticamente significativos (p<0,05) segundo o algorismo do MASCOT.
75
O grau de similaridade observado pode ser fruto dos bancos de dados
utilizados. Além de muitos serem incompletos, o PMF é baseado nos valores
exatos das massas de peptídeos gerados por digestão enzimática, é
imprescindível que a sequência da proteína ou de seu gene esteja
disponibilizada em bancos de dados. Um projeto internacional para o
seqüenciamento do genoma do tomate começou em 2004, entretanto somente
um rascunho do banco de dados do tomateiro poser encontrado
(http://solgenomics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/). Esta dificuldade em
encontrar um banco de dados mais adequado para cada análise contribui para
a baixa pontuação dos valores obtidos. Além disso, a pesquisa foi realizada por
homologia em bancos de dados amplos (NCBI e SwissProt – Plantas Verdes),
apresentando um elevado número de diferentes sequências correspondendo a
muitas espécies de plantas. Este fator limitante pode ser claramente observado
na análise da proteína A1M48. Observa-se que quando a busca foi feita no
banco de dados do NCBI, apesar de apresentar uma homologia com uma
aldolase, essa homologia não foi significativa segundo o algoritimo MASCOT.
Entretanto, quando a mesma pesquisa foi feita, utilizando-se um banco de
dados menor, o SwissProt, verificou-se uma homologia significativa com a
aldolase, mostrando que o tamanho do banco interfere nos resultados
estatísticos.
Além disso, a presença de interferentes como queratina, produtos da
autólise da tripsina, e ainda contaminantes não protéicos, como detergentes e
plásticos, gera um conjunto de picos que podem interferir na identificação da
proteína, podendo até levar a uma identificação errônea.
A identificação com sucesso de uma proteína depende de vários fatores,
sendo os mais importantes: (i) exatidão da massa dos picos (erro permitido), (ii)
a relação entre os picos atribuídos e não atribuídos do espectro, e (iii) o
tamanho da base de dados utilizada (Cañas et al., 2006; Cañas Montalvo et al.,
2006).
Outro ponto importante é que são considerados desvios de pI e de
massa teórica até cerca de 10%, em função de problemas experimentais na
resolução dos géis, ou pelas modificações decorrentes da fosforilação,
acetilação e adição de grupos glicosídicos. Porém, quando encontramos
resultados que não estão na faixa proposta, devemos observar se as proteínas
são precursoras, ou proteínas maduras, o que pode gerar erro na predição do
76
pI e da massa molecular. Valores diferentes de massa molecular podem ser
função da proteólise limitada da proteína (nos casos em que a MM encontrada
é menor que a esperada) ou da formação de agregados de uma mesma
proteína ou associação com outras proteína quando a MM observada é
superior à esperada (Wildgruber et al., 2002).
6. CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS
A defesa de plantas é um processo complexo que envolve uma extensa
regulação gênica. O perfil proteômico é vital para uma melhor comprrensão
dos mecanismos de defesa das plantas em reposta a atque por patógenos,
como a bactéria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria.
Nesse estudo, algumas proteínas foram identificadas em resposta ao
estresse em plantas de tomate por ataque de uma bactéria fitopatogênica,
utilizando 2-DE. Esses resultados serão utilizados como base para estudos
complementares, que visam ao entendimento dos processos de defesa que
ocorrem na planta.
A análise computacional dos géis mostrou que muitas proteínas foram
induzidas após a inoculação, enquanto outras tiveram a expressão diminuída
ou foram até inibidas após o estímulo. Foi possível observar que além de
induzir a síntese de proteínas diretamente ligadas á defesa contra patógenos,
como o caso das Peroxidases, encontrada diferencialmente expressa, além
das outras enzimas PR com atividade aumentada, enzimas que regulam a
fotossíntese e respiração nas plantas tiveram uma diminuição de sua
expressão, como a aldolase e a hidroxipiruvato redutase. Dessa forma, é
provável que o metabolismo normal da planta tenha sido alterado, de forma a
concentrar sua energia para a síntese de compostos que atuam diretamente na
defesa contra o patógeno.
Novas análises computacionais poderão ser feitas na tentativa de
melhorar os resultados obtidos: pretende-se utilizar um programa para remoção
dos picos de massa referente a interferentes como autólise da tripsina,
queratina e matriz, e ainda montar um banco de dados de tomate para
aumentar as chances de identificação. Pretende-se também obter a
fragmentação dos peptídeos trípticos encontrados para novas análises de PFF
e ou sequenciamento de novo.
77
Outra perspectiva é de analisar o proteoma dessas plantas utilizando
fitas e IPG de pH 3-7, favorecendo a focalização das proteínas ácidas,
principais constituintes da amostra.
Destaca-se a necessidade de continuar esse tipo de estudo, visto que
pouco ainda se sabe sobre a interação planta-patógeno o que possibilitará
prever estratégias potenciais para a bioengenharia da resistência vegetal.
Considerações sobre o uso de fungicidas na agricultura, como oneração do
custo de produção, degradação dos recursos naturais, problemas de
intoxicação dos aplicadores de defensivos agrícolas, aumento dos riscos da
presença de resíduos nos produtos colhidos, assim como surgimento de raças
de microrganismos resistentes têm levado a uma procura crescente por
práticas de manejo de doenças mais racionais. Portanto, conhecer tanto a
complexa sequência de sinais que leva a aos mecanismos de defesa da planta,
quanto sua regulação é essencial para desenvolver novas estratégias de
controle das doenças vegetais.
78
CONCLUSÕES GERAIS
Plantas possuem mecanismos de defesa constitutivos, que atuam como
primeira fase de defesa contra fitopatógenos, e ainda, mecanismos latentes,
que são acionados após estímulo biótico ou abiótico. O estudo de proteínas e
peptídeos relacionados a esses mecanismos de defesa em plantas possibilita
identificar alvos de interesse biotecnológico. Dessa forma, as biomoléculas
identificadas poderiam ser produzidas para serem utilizadas na forma de
agentes de defesa comercialmente disponíveis, ou novas tecnologias de
obtenção de plantas geneticamente modificadas poderiam incorporar genes de
defesa no genoma de cultivares de interesse, advindos de outras plantas e
variedades.
79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aerts, A. M., et al. The antifungal plant defensin RsAFP2 from radish induces apoptosis in a metacaspase independent way in Candida albicans. FEBS letters, v.583, n.15, p.2513-2516. 2009. Afroz, A., et al. Comparative proteomic analysis of bacterial wilt susceptible and resistant tomato cultivars. Peptides, v.30, n.9, p.1600-1607. 2009. Agrawal, G. K., et al. System, trends and perspectives of proteomics in dicot plants: Part I: Technologies in proteome establishment. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, v.815, n.1-2, p.109-123. 2005a. ---. System, trends and perspectives of proteomics in dicot plants: Part III: Unraveling the proteomes influenced by the environment, and at the levels of function and genetic relationships. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, v.815, n.1-2, p.137-145. 2005b. AGRIANUAL. Anuário da agricultura brasileira. São Paulo: FNP Consultoria e comércio. 2008 Almeida, H. O., et al. Peptide fraction inhibiting plant pathogen growth predominated in cell wall extracts from young plants or in soluble cell fraction from expanded leaves from eggplants. Journal of Phytopathology, v.155, n.11-12, p.735-737. 2007. Andrade, L. B. d. S., et al. Effects of a Novel Pathogenesis-Related Class 10 (PR-10) Protein from Crotalaria pallida Roots with Papain Inhibitory Activity against Root-Knot Nematode Meloidogyne incognita. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.58, n.7, p.4145-4152. 2010. ANVISA. Controlando agrotóxicos nos alimentos 2005. Ashcroft, A. E. Protein and peptide identification: The rôle of mass spectrometry in proteomics. Natural Product Reports, v.20, n.2, p.202-215. 2003. Axelrod, B., et al. Lipoxygenase from soybeans : EC 1.13.11.12 Linoleate:oxygen oxidoreductase. Methods in Enzymology, v.71, p.441-451. 1981. Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, v.803, n.1, p.3-16. 2004. Bakan, B. n. d., et al. Specific Adduction of Plant Lipid Transfer Protein by an Allene Oxide Generated by 9-Lipoxygenase and Allene Oxide Synthase. Journal of Biological Chemistry, v.281:, December 22, 2006, p.38981-38988. 2006.
80
Balls, A. K. e Hale, W. S. A crystalline protein obtained from lipoprotein of wheat flour. Cereal Chem, v.19, p.279-281. 1942. Barata, R. A., et al. Purification and characterization of an extracellular trypsin-like protease of Fusarium oxysporum var. lini. Journal of Bioscience and Bioengineering, v.94, n.4, p.304-308. 2002. Bauwe, H., et al. Photorespiration: players, partners and origin. Trends in Plant Science, v.15, n.6, p.330-336. 2010. Bechinger, B. e Lohner, K. Detergent-like actions of linear amphipathic cationic antimicrobial peptides. Biochimica et biophysica acta, v.1758, n.9, p.1529-1539. 2006. Beckers, G. J. M. e Conrath, U. Priming for stress resistance: from the lab to the field. Current Opinion in Plant Biology, v.10, n.4, p.425-431. 2007. Berrocal-Lobo, M., et al. Leishmania donovani: Thionins, plant antimicrobial peptides with leishmanicidal activity. Experimental Parasitology, v.122, n.3, p.247-249. 2009. Birk, Y., et al. A pure trypsin inhibitor from soya beans. The Biochemical journal, v.87, p.281-284. 1963. Blein, J.-P., et al. From elicitins to lipid-transfer proteins: a new insight in cell signalling involved in plant defence mechanisms. Trends in Plant Science, v.7, n.7, p.293-296. 2002. Blueggel, M., et al. Bioinformatics in proteomics. Current pharmaceutical biotechnology, v.5, n.1, p.79-88. 2004. Bohlmann, H. The role of thionins in plant protection. CRIT.REV.PLANT SCI., v.13, n.1, p.1-16. 1994. Bohlmann, H. e Apel, K. Isolation and characterization of cDNAs coding for leaf-specific thionins closely related to the endosperm-specific hordothionin of barley (Hordeum vulgare L.). Molecular and General Genetics, v.207, n.2-3, p.446-454. 1987. ---. Thionins. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v.42, n.1, p.227-240. 1991. Bohlmann, H., et al. Leaf-specific thionins of barley a novel class of cell wall proteins toxic to plant-pathogenic fungi and possibly involved in the defence mechanism of plants. The EMBO Journal. 1998. Bol, J. F., et al. Plant pathogenesis-related proteins induced by virus infection. Annual review of phytopathology, v.28, p.113-138. 1990. Bonas, U. e Lahaye, T. Plant disease resistance triggered by pathogen-derived molecules: Refined models of specific recognition. Current Opinion in Microbiology, v.5, n.1, p.44-50. 2002.
81
Borges, J. P., et al. The lipid transfer proteins (LTP) essentially concentrate in the skin of Rosaceae fruits as cell surface exposed allergens. Plant Physiology and Biochemistry, v.44, n.10, p.535-542. 2006. Borregaard, N., et al. Innate immunity: from plants to humans. Immunology today, v.21, n.2, p.68-70. 2000. Boutrot, F., et al. Genome-wide analysis of the rice and Arabidopsis non-specific lipid transfer protein (nsLtp) gene families and identification of wheat nsLtp genes by EST data mining. BMC genomics, v.9, p.86. 2008. Bowman, D. E. Amylase inhibitor of navy beans. Science, v.102, n.2649, p.358-359. 1945. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Annual Biochemistry, v.7, n.72, p.248-254. 1976 BREUSEGEM, V., et al. The role of active oxygen species in plant signal transduction. Shannon, IRLANDE: Elsevier, v.161. 2001 Broekaert, W. F., et al. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. Plant Physiology, v.108, n.4, p.1353-1358. 1995. Buonaurio, R. e Kumar, N. N. U. Active Oxygen-Producing and Oxygen-Scavenging Enzymes in Pepper Leaves Infected with Xanthomonas-Campestris Pv Vesicatoria. Journal of Phytopathology-Phytopathologische Zeitschrift, v.143, n.3, Mar, p.165-168. 1995. Cagney, G., et al. In silico proteome analysis to facilitate proteomics experiments using mass spectrometry. Proteome Science, v.1. 2003. Campo, S., et al. The defense response of germinating maize embryos against fungal infection: A proteomics approach. Proteomics, v.4, n.2, p.383-396. 2004. Cañas, B., et al. Mass spectrometry technologies for proteomics. Briefings in Functional Genomics and Proteomics, v.4, n.4, p.295-320. 2006. Cañas Montalvo, B., et al. Mass spectrometry technologies for proteomics. Briefings in Functional Genomics and Proteomics, v.4, n.4, p.295-320. 2006. Cantú, M. D., et al. Seqüenciamento de peptídeos usando espectrometria de massas: um guia prático. Química Nova, v.31, p.669-675. 2008. Carrasco, L., et al. Thionins: plant peptides that modify membrane permeability in cultured mammalian cells. European journal of biochemistry / FEBS, v.116, n.1, p.185-189. 1981. Carvalho, A. d. O. e Gomes, V. M. Role of plant lipid transfer proteins in plant cell physiology-a concise review. Peptides, v.28, n.5, p.1144-1153. 2007.
82
---. Plant defensins--prospects for the biological functions and biotechnological properties. Peptides, v.30, n.5, p.1007-1020. 2009. Carvalho, A. O., et al. Cloning and characterization of a cDNA encoding a cowpea seed defensin and analysis of its expression. Protein and Peptide Letters, v.13, n.10, p.1029-1036. 2006. Carvalho, J. L. d. e Pagliuca, L. G. Tomate: Um mercado que não pára de crescer globalmente. Hortifruti Brasil, v.6, n.58, p.6-14. 2007. Castro, M. S. e Fontes, W. Plant defense and antimicrobial peptides. Protein and Peptide Letters, v.12, n.1, p.13-18. 2005. Cavalcanti, F. R., et al. Chitinase and beta-1,3-glucanase activities after the elicitation of tomato defenses against bacterial spot. Pesquisa Agropecuaria Brasileira, v.41, n.12, Dec, p.1721-1730. 2006a. ---. Activities of antioxidant enzymes and photosynthetic responses in tomato pre-treated by plant activators and inoculated by Xanthomonas vesicatoria. Physiological and Molecular Plant Pathology, v.68, n.4-6, Apr-Jun, p.198-208. 2006b. Chen, Y. A., et al. Effect of light on peroxidase and lignin synthesis in mungbean hypocotyls. Plant Physiology and Biochemistry, v.40, n.1, p.33-39. 2002. Colilla, F. J., et al. γ-Purothionins: Amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm. FEBS letters, v.270, n.1-2, p.191-194. 1990. Colson, E. e Deverall, B. Helping plants fight their own disease battles. Australian Cottongrower, v.17, n.5, p.76-80. 1996. Corpillo, D., et al. Proteomics as a tool to improve investigation of substantial equivalence in genetically modified organisms: the case of a virus-resistant tomato. Proteomics, v.4, n.1, p.193-200. 2004. Dailey, H. Proteomics - from protein sequence to function. Human Genetics, v.108, n.6, p.555-555. 2001. De Leo, F., et al. PLANT-Pls: A database for plant protease inhibitors and their genes. Nucleic Acids Research, v.30, n.1, p.347-348. 2002. de Medeiros, L. N., et al. Backbone dynamics of the antifungal Psd1 pea defensin and its correlation with membrane interaction by NMR spectroscopy. BBA - Biomembranes, v.1798, n.2, p.105-113. 2010. Diaz, I., et al. Effects of thionins on beta-glucuronidase in vitro and in plant protoplasts. FEBS letters, v.296, n.3, p.279-282. 1992.
83
dos Santos, I. S., et al. Purification of a defensin isolated from Vigna unguiculata seeds, its functional expression in Escherichia coli, and assessment of its insect [alpha]-amylase inhibitory activity. Protein Expression and Purification, v.71, n.1, p.8-15. 2010. Douliez, J. P., et al. Mini Review: Structure, Biological and Technological Functions of Lipid Transfer Proteins and Indolines, the Major Lipid Binding Proteins from Cereal Kernels. Journal of Cereal Science, v.32, n.1, p.1-20. 2000. Elvira, M. I., et al. Proteomic analysis of pathogenesis-related proteins (PRs) induced by compatible and incompatible interactions of pepper mild mottle virus (PMMoV) in Capsicum chinense L3 plants. J. Exp. Bot., v.59, n.6, April 1, 2008, p.1253-1265. 2008. Epple, P., et al. ESTs reveal a multigene family for plant defensins in Arabidopsis thaliana. FEBS letters, v.400, n.2, p.168-172. 1997a. ---. Overexpression of an endogenous thionin enhances resistance of arabidopsis against Fusarium oxysporum. Plant Cell, v.9, n.4, p.509-520. 1997b. Fernandez-Rivas, M. The place of lipid transfer proteins (LTP) in the cross-reactivity of plant foods. Revue Francaise d'Allergologie, v.49, n.5, p.433-436. 2009. Finkina, E. I., et al. Purification and primary structure of novel lipid transfer proteins from germinated lentil (lens culinaris) seeds. Biochemistry (Moscow), v.72, n.4, p.430-438. 2007. Flor, H. H. Current status of the gene-for-gene concept Annual review of phytopathology, v.9, p.275-296. 1971. Florack, D. E. A. e Stiekema, W. J. Thionins: Properties, possible biological roles and mechanisms of action. Plant Molecular Biology, v.26, n.1, p.25-37. 1994. Gallardo, K., et al. Proteomic analysis of Arabidopsis seed germination and priming. Plant Physiology, v.126, n.2, p.835-848. 2001. García-Olmedo, F., et al. Antibiotic activities of peptides, hydrogen peroxide and peroxynitrite in plant defence. FEBS letters, v.498, n.2-3, p.219-222. 2001. Gariani, T., et al. The role of the P<sub>2</sub>' position of Bowman-Birk proteinase inhibitor in the inhibition of trypsin: Studies on P<sub>2</sub>' variation in cyclic peptides encompassing the reactive site loop. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology, v.1431, n.1, p.232-237. 1999. Gazzana, G. e Borlak, J. Improved method for proteome mapping of the liver by 2-DE MALDI-TOF MS. Journal of proteome research, v.6, n.8, p.3143-3151. 2007.
84
Goode, M. J. e Sasser, M. Prevention the key to controlling bacterial spot and bacterial speck of tomato. Plant Disease, v.64, p.831-834. 1980. Gorjanovic, S. A Review: Biological and Technological Functions of Barley Seed Pathogenesis-Related Proteins (PRs). Journal of the Institute of Brewing, v.115, n.4, p.334-360. 2009. Gozzo, F. Systemic acquired resistance in crop protection: From nature to a chemical approach. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.51, n.16, p.4487-4503. 2003. Grant, M. e Lamb, C. Systemic immunity. Current Opinion in Plant Biology, v.9, n.4, p.414-420. 2006. Grutter, M. G., et al. Crystal structure of the thrombin-hirudin complex: A novel mode of serine protease inhibition. EMBO Journal, v.9, n.8, p.2361-2365. 1990. Guzzo, S. D. Aspectos Bioquímicos e Moleculares da Resistência Sistêmica Adquirida em cafeeiro contra Hemileia vastarix. . Piracicaba: Editora da USP. 2004 Habib, H. e Fazili, K. M. Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects. Biotechnology and Molecular Biology Review, v.2, n.3, p.68-85. 2007. Hackman, R. H. e Goldberg, M. New substrates for use with chitinases. Analytical biochemistry, v.8, n.3, p.397-401. 1964. Hammerschmidt, R., et al. Association of enhanced peroxidase activity with induced systemic resistance of cucumber to Colletotrichum lagenarium. Physiological Plant Pathology, v.20, n.1, p.73-82. 1982. Hancock, R. E. e Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends in microbiology, v.8, n.9, p.402-410. 2000. Hancock, W. S. The challenges ahead. Journal of proteome research, v.1, n.1, p.9. 2002. Heath, M. C. Nonhost resistance and nonspecific plant defenses. Current Opinion in Plant Biology, v.3, n.4, p.315-319. 2000. Heil, M. e Ton, J. Long-distance signalling in plant defence. Trends in Plant Science, v.13, n.6, p.264-272. 2008. Hématy, K., et al. Host-pathogen warfare at the plant cell wall. Current Opinion in Plant Biology, v.12, n.4, p.406-413. 2009. Herbette, S., et al. Modification of photosynthetic regulation in tomato overexpressing glutathione peroxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, v.1724, n.1-2, p.108-118. 2005.
85
Hughes, P., et al. The Cytotoxic Plant Protein, β-Purothionin, Forms Ion Channels in Lipid Membranes. Journal of Biological Chemistry, v.275, n.2, January 14, 2000, p.823-827. 2000. Johnson, T. C., et al. Reduction of Purothionin by the Wheat Seed Thioredoxin System. Plant Physiol., v.85, n.2, October 1, 1987, p.446-451. 1987. Jones, J. B., et al. Diversity among Xanthomonads pathogenic on pepper and tomato. Annual review of phytopathology. 36: 41-58 p. 1998. Jung, S. Variation in antioxidant metabolism of young and mature leaves of Arabidopsis thaliana subjected to drought. Plant Science, v.166, n.2, p.459-466. 2004. Kader, J. C. Proteins and the intracellular exchange of lipids. I. Stimulation of phospholipid exchange between mitochondria and microsomal fractions by proteins isolated from potato tuber. Biochimica et biophysica acta, v.380, n.1, p.31-44. 1975. ---. Lipid-transfer proteins in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v.47, n.1, p.627-654. 1996. Keen, N. T. Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions. Annual Review of Genetics, v.24, p.447-463. 1990. Kim, J.-Y., et al. Protease Inhibitors from Plants with Antimicrobial Activity. International Journal of Molecular Sciences, v.10, n.6, p.2860-2872. 2009a. Kim, J. Y., et al. Protease inhibitors from plants with antimicrobial activity. International Journal of Molecular Sciences, v.10, n.6, p.2860-2872. 2009b. Koch, E., et al. A lipoxygenase from leaves of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) is induced in response to plant pathogenic Pseudomonads. Plant Physiology, v.99, n.2, p.571-576. 1992. Kok, E. J., et al. Changes in Gene and Protein Expression during Tomato Ripening -- Consequences for the Safety Assessment of New Crop Plant. Food Science and Technology International, v.14, n.6, p.503-518. 2008. Krishna Murthy, H. M., et al. Crystal structure of dengue virus NS3 protease in complex with a bowman-birk inhibitor: Implications for flaviviral polyprotein processing and drug design. Journal of Molecular Biology, v.301, n.4, p.759-767. 2000. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature, v.227, n.5259, p.680-685. 1970. Lay, F. T. e Anderson, M. A. Defensins - Components of the Innate Immune System in Plants. Current Protein & Peptide Science: Bentham Science Publishers Ltd. 6: 85-101 p. 2005.
86
Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical biochemistry, v.47, n.1, p.273-279. 1972. Lin, K.-F., et al. Structure-based protein engineering for alpha-amylase inhibitory activity of plant defensin. Proteins-Structure Function and Bioinformatics, v.68, n.2, p.530-540. 2007. Lin, P., et al. A defensin with highly potent antipathogenic activities from the seeds of purple pole bean. Bioscience Reports, v.30, n.2, Apr, p.101-109. 2010. Loake, G. e Grant, M. Salicylic acid in plant defence--the players and protagonists. Current Opinion in Plant Biology, v.10, n.5, p.466-472. 2007. Loeza-Ángeles, H., et al. Thionin Thi2.1 from Arabidopsis thaliana expressed in endothelial cells shows antibacterial, antifungal and cytotoxic activity. Biotechnology Letters, v.30, n.10, p.1713-1719. 2008. Ma, D. Z., et al. A peptide with potent antifungal and antiproliferative activities from Nepalese large red beans. Peptides, v.30, n.12, p.2089-2094. 2009. Maldonado, A. M., et al. A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance signalling in Arabidopsis. Nature, v.419, n.6905, p.399-403. 2002. Mann, M., et al. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 70: 437-473 p. 2001. Mann, M. e Jensen, O. N. Proteomic analysis of post-translational modifications. Nature Biotechnology, v.21, n.3, p.255-261. 2003. McHugh, L. e Arthur, J. W. Computational Methods for Protein Identification from Mass Spectrometry Data. PLoS Computational Biology, v.4, n.2. 2008. McManus, M. T. e Burgess, E. P. J. Effects of the soybean (Kunitz) trypsin inhibitor on growth and digestive proteases of larvae of Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology, v.41, n.9, p.731-738. 1995. Melo, P. C. T. Desenvolvimento sustentável da cadeia produtiva do tomate para consumo in natura no Brasil e os desafios do melhoramento genético. Horticultura Brasileira, v.21, n.2. 2003. Mendez, E., et al. Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free system of a novel thionin, γ-hordothionin, from barley endosperm. European Journal of Biochemistry, v.194, n.2, p.533-539. 1990. ---. Primary structure of beta-hordothionin, a member of a novel family of thionins from barley endosperm, and its inhibition of protein synthesis in eukaryotic and prokaryotic cell-free systems. European Journal of Biochemistry, v.239, n.1, p.67-73. 1996. Mirouze, M., et al. A putative novel role for plant defensins: a defensin from the zinc hyper-accumulating plant, Arabidopsis halleri, confers zinc tolerance. Plant Journal, v.47, n.3, Aug, p.329-342. 2006.
87
Mitulovic, G. e Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis - A short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics and Proteomics, v.5, n.4, p.249-260. 2006. Mo, B., et al. Organelle identification and proteomics in plant cells. Trends in biotechnology, v.21, n.8, p.331-332. 2003. Molina, A., et al. Inhibition of bacterial and fungal plant pathogens by thionins of types I and II. Plant Science, v.92, n.2, p.169-177. 1993. Moreno, M., et al. Pseudothionin-St1, a potato peptide active against potato pathogens. European Journal of Biochemistry, v.223, n.1, p.135-139. 1994. Mosolov, V. V., et al. Plant proteinase inhibitors as polyfunctional proteins (a review). Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia, v.37, n.6, p.643-650. 2001. Mosolov, V. V. e Valueva, T. A. Proteinase inhibitors in plant biotechnology: a review. Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia, v.44, n.3, p.261-269. 2008. Mukherjee, A. K., et al. Proteomics of the response of Arabidopsis thaliana to infection with Alternaria brassicicola. Journal of Proteomics, v.73, n.4, p.709-720. 2010. Murillo, I., et al. Engineering photoassimilate partitioning in tobacco plants improves growth and productivity and provides pathogen resistance. Plant Journal, v.36, n.3, p.330-341. 2003. Nägele, E., et al. 2D-LC/MS techniques for the identification of proteins in highly complex mixtures. Expert review of proteomics, v.1, n.1, p.37-46. 2004. Nakazawa, A., et al. Expression pattern and gene structure of phenylalanine ammonia-lyase in Pharbitis nil. Journal of Plant Research, v.114, n.3, p.323-328. 2001. Neves, E. M., et al. Bataticultura: dispêndios com defensivos agrícolas no qüinqüênio 1997-2001. Batata Show, v.6, p.22-23. 2003. Newton, R. P., et al. Plant proteome analysis by mass spectrometry: Principles, problems, pitfalls and recent developments. Phytochemistry, v.65, n.11, p.1449-1485. 2004. Norioka, S. e Ikenaka, T. Amino acid sequences of trypsin-chymotrypsin inhibitors (A-I, A-II, B-I, and B-II) from peanut (Arachis hypogaea): a discussion on the molecular evolution of legume Bowman-Birk type inhibitors. Journal of Biochemistry, v.94, n.2, p.589-599. 1983. O'Farrell, P. H. High resolution two dimensional electrophoresis of proteins. Journal of Biological Chemistry, v.250, n.10, p.4007-4021. 1975.
88
Oard, S. V., et al. Structural changes induced in thionins by chloride anions as determined by molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry, v.147, n.1-2, p.42-52. 2010. Ochoa-Zarzosa, A., et al. Antibacterial activity of thionin Thi2.1 from Arabidopsis thaliana expressed by bovine endothelial cells against Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis. Veterinary Microbiology, v.127, n.3-4, p.425-430. 2008. Odani, S., et al. Wheat germ trypsin inhibitors. Isolation and structural characterization of single-headed and double-headed inhibitors of the Bowman-Birk type. Journal of Biochemistry, v.100, n.4, p.975-983. 1986. Ooi, L. S. M., et al. Purification and characterization of non-specific lipid transfer proteins from the leaves of Pandanus amaryllifolius (Pandanaceae). Peptides, v.27, n.4, p.626-632. 2006. Orrù, S., et al. Amino acid sequence, S-S bridge arrangement and distribution in plant tissues of thionins from Viscum album. Biological chemistry, v.378, n.9, p.989-996. 1997. Osborn, R. W., et al. Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae. FEBS letters, v.368, n.2, p.257-262. 1995. Oshchepkova, Y., et al. Isolation of the lipid-transporting protein Ns-LTP1 from seeds of the garden fennel flower (Nigella sativa). Russian Journal of Bioorganic Chemistry, v.35, n.3, p.315-319. 2009. Padovan, L., et al. Techniques for Plant Defensin Production. Current Protein & Peptide Science, v.11, n.3, May, p.231-235. 2010a. ---. Structural aspects of plant antimicrobial peptides. Current Protein & Peptide Science, v.11, n.3, p.210-219. 2010b. Pandey, A. e Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature, v.405, n.6788, p.837-846. 2000. Park, H. C., et al. Characterization of a stamen-specific cDNA encoding a novel plant defensin in Chinese cabbage. Plant Molecular Biology, v.50, n.1, p.59-69. 2002. Pascholati, S. F., et al. Phenylalanine ammonia-lyase activity and anthocyanin accumulation in wounded maize mesocotyls. Journal of Phytopathology, v.115, n.2, p.165-172. 1986. Pelegrini, P. B. e Franco, O. L. Plant γ-thionins: Novel insights on the mechanism of action of a multi-functional class of defense proteins. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v.37, n.11, p.2239-2253. 2005.
89
Pelegrini, P. B., et al. Novel insights on the mechanism of action of alpha-amylase inhibitors from the plant defensin family. Proteins-Structure Function and Bioinformatics, v.73, n.3, Nov, p.719-729. 2008. Penninckx, I., et al. Pathogen-Induced Systemic Activation of a Plant Defensin Gene in Arabidopsis Follows a Salicylic Acid-Independent Pathway. Plant Cell, v.8, n.12, December 1, 1996, p.2309-2323. 1996. Pestana-Calsa, M. C., et al. Bioinformatics-Coupled Molecular Approaches for Unravelling Potential Antimicrobial Peptides Coding Genes in Brazilian Native and Crop Plant Species. Current Protein & Peptide Science, v.11, n.3, May, p.199-209. 2010. Phan, T. D., et al. Silencing of the Major Salt-Dependent Isoform of Pectinesterase in Tomato Alters Fruit Softening. Plant Physiol., v.144, n.4, August 1, 2007, p.1960-1967. 2007. Piñeiro, M., et al. Selective disulphide linkage of plant thionins with other proteins. FEBS letters, v.369, n.2-3, p.239-242. 1995. Podile, A. R. e Laxmi, V. D. V. Seed Bacterization with Bacillus subtilis AF 1 Increases Phenylalanine Ammonialyase and Reduces the Incidence of Fusarial Wilt in Pigeonpea. Journal of Phytopathology, v.146, n.5-6, p.255-259. 1998. Purev, M., et al. [Isolation of a novel fructose-1,6-bisphosphate aldolase gene from Codonopsis lanceolata and analysis of the response of this gene to abiotic stresses]. Molekuliarnaia biologiia, v.42, n.2, p.206-213. 2008. Pyee, J., et al. Identification of a Lipid Transfer Protein as the Major Protein in the Surface Wax of Broccoli (Brassica oleracea) Leaves. Archives of Biochemistry and Biophysics, v.311, n.2, p.460-468. 1994. Rahbé, Y., et al. Effects of the cysteine protease inhibitor oryzacystatin (OC-I) on different aphids and reduced performance of Myzus persicae on OC-I expressing transgenic oilseed rape. Plant Science, v.164, n.4, p.441-450. 2003. Rawlings, N. D., et al. Evolutionary families of peptidase inhibitors. Biochemical Journal, v.378, n.3, p.705-716. 2004. Rayapuram, C., et al. PR-13/Thionin But Not PR-1 Mediates Bacterial Resistance in Nicotiana attenuata in Nature, and Neither Influences Herbivore Resistance. Molecular Plant-Microbe Interactions, v.21, n.7, p.988-1000. 2008. Reddy, K. V. R., et al. Antimicrobial peptides: premises and promises. International journal of antimicrobial agents, v.24, n.6, p.536-547. 2004. Romeiro, R. S. Métodos em Bacteriologia de Plantas. Viçosa: Editora UFV, v.1. 2001 Ryan, C. A. Proteinase inhibitor gene families: strategies for transformation to improve plant defenses against herbivores. BioEssays, v.10, n.1, p.20-24. 1989.
90
Salcedo, G., et al. Plant non-specific lipid transfer proteins: an interface between plant defence and human allergy. Biochimica et biophysica acta, v.1771, n.6, p.781-791. 2007. Saltveit, M. E. Wound induced changes in phenolic metabolism and tissue browning are altered by heat shock. Postharvest Biology and Technology, v.21, n.1, p.61-69. 2000. Sarma, A. D., et al. Plant protein isolation and stabilization for enhanced resolution of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical biochemistry, v.379, n.2, p.192-195. 2008. Schrader-Fischer, G. e Apel, K. The anticyclic timing of leaf senescence in the parasitic plant Viscum album is closely correlated with the selective degradation of sulfur-rich viscotoxins. Plant Physiology, v.101, n.3, p.745-749. 1993. Segura, A., et al. Novel defensin subfamily from spinach (Spinacia oleracea). FEBS letters, v.435, n.2-3, p.159-162. 1998. Sels, J., et al. Plant pathogenesis-related (PR) proteins: A focus on PR peptides. Plant Physiology et Biochemistry, v.46, n.11, p.941-950. 2008. Seo, P. J., et al. Molecular and functional profiling of Arabidopsis pathogenesis-related genes: insights into their roles in salt response of seed germination. Plant & cell physiology, v.49, n.3, p.334-344. 2008. Shah, J., et al. Characterization of a salicylic acid-insensitive mutant (sai1) of Arabidopsis thaliana, identified in a selective screen utilizing the SA-inducible expression of the tms2 gene. Molecular plant-microbe interactions : MPMI, v.10, n.1, p.69-78. 1997. Shen, S., et al. A proteomic analysis of leaf sheaths from rice. Journal of Biochemistry, v.132, n.4, p.613-620. 2002. Shevchenko, A., et al. Linking genome and proteome by mass spectrometry: Large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.93, n.25, p.14440-14445. 1996. ---. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols, v.1, n.6, p.2856-2860. 2006. Silva, H. S. A., et al. Rhizobacterial induction of systemic resistance in tomato plants: non-specific protection and increase in enzyme. Biological Control, v.29, n.2, p.288-295. 2004. Silverstein, K. A. T., et al. Small cysteine-rich peptides resembling antimicrobial peptides have been under-predicted in plants. The Plant Journal, v.51, n.2, p.262-280. 2007. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry, v.150, n.1, p.76-85. 1985.
91
Soares, A. M. S. e Machado, O. L. T. Plant Defense: chemical signaling and reactive oxygen species. Revista Trópica – Ciências Agrárias e Biológicas, v.1, n.1, p.9-19. 2007. Spelbrink, R. G., et al. Differential antifungal and calcium channel-blocking activity among structurally related plant defensins. Plant Physiology, v.135, n.4, p.2055-2067. 2004. Stec, B. Plant thionins--the structural perspective. Cellular and molecular life sciences : CMLS, v.63, n.12, p.1370-1385. 2006. Stec, B., et al. Proposal for molecular mechanism of thionins deduced from physico-chemical studies of plant toxins. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society, v.64, n.6, p.210-224. 2004. Stein, G. M., et al. Characterisation of granulocyte stimulation by thionins from European mistletoe and from wheat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, v.1426, n.1, p.80-90. 1999. Stiche, L., et al. Systemic Acquired Resistance. Annual review of phytopathology, v.35, p.235-270. 1997. Sticher, L., et al. Systemic acquired resistance. Annual review of phytopathology. 35: 235-270 p. 1997. Stotz, H. U., et al. Plant defensins: defense, development and application. Plant signaling & behavior, v.4, n.11, p.1010-1012. 2009. Straus, S. K. e Hancock, R. E. W. Mode of action of the new antibiotic for Gram-positive pathogens daptomycin: comparison with cationic antimicrobial peptides and lipopeptides. Biochimica et biophysica acta, v.1758, n.9, p.1215-1223. 2006. Tamir-Ariel, D., et al. Identification of genes in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria induced during its interaction with tomato. Journal of Bacteriology, v.189, n.17, p.6359-6371. 2007. Tavares, L. S., et al. Biotechnological potential of antimicrobial peptides from flowers. Peptides, v.29, n.10, p.1842-1851. 2008a. Tavares, P. M., et al. In vitro activity of the antifungal plant defensin RsAFP2 against Candida isolates and its in vivo efficacy in prophylactic murine models of candidiasis. Antimicrobial agents and chemotherapy, v.52, n.12, p.4522-4525. 2008b. Teixeira, F. R., et al. Bioprospection of cationic and anionic antimicrobial peptides from bell pepper leaves for inhibition of Ralstonia solanacearum and Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis growth. Journal of Phytopathology, v.154, n.7-8, p.418-421. 2006.
92
Terras, F. R., et al. Small cysteine-rich antifungal proteins from radish: Their role in host defense. Plant Cell, v.7, n.5, p.573-588. 1995. Thevissen, K., et al. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins. Journal of Biological Chemistry, v.271, n.25, Jun, p.15018-15025. 1996. ---. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug discovery today, v.12, n.21-22, p.966-971. 2007. ---. Permeabilization of fungal membranes by plant defensins inhibits fungal growth. Applied and Environmental Microbiology, v.65, n.12, p.5451-5458. 1999. Thoma, S., et al. A non-specific lipid transfer protein from Arabidopsis is a cell wall protein. Plant Journal, v.3, n.3, p.427-436. 1993. Thomma, B., et al. Plant defensins. Planta, v.216, n.2, p.193-202. 2002. Thomma, B. P. H. J. e Broekaert, W. F. Tissue-specific expression of plant defensin genes PDF2.1 and PDF2.2 in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry, v.36, n.7, p.533-537. 1998. Tiengo, A., et al. A Perl procedure for protein identification by Peptide Mass Fingerprinting. BMC Bioinformatics, v.10, n.Suppl 12, p.S11-S11. 2009. Torres, C. A. e Andrews, P. K. Developmental changes in antioxidant metabolites, enzymes, and pigments in fruit exocarp of four tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) genotypes: β-carotene, high pigment-1, ripening inhibitor, and 'Rutgers'. Plant Physiology and Biochemistry, v.44, n.11-12, p.806-818. 2006. van der Weerden, N. L., et al. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. Journal of Biological Chemistry, v.283, n.21, May, p.14445-14452. 2008. van Loon, L. C. Induced resistance in plants and the role of pathogenesis-related proteins. European Journal of Plant Pathology, v.103, p.753-765. 1997. Van Loon, L. C., et al. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria. Annual review of phytopathology. 36: 453-483 p. 1998. van Loon, L. C., et al. Significance of inducible defense-related proteins in infected plants. Annual review of phytopathology, v.44, p.135-162. 2006. Vieira, F. A., et al. Differential expression of defence-related proteins in Vigna unguiculata (L. Walp.) seedlings after infection with. Crop Protection, v.29, n.5, p.440-447. 2010. Vignutelli, A., et al. Systemic and local induction of an Arabidopsis thionin gene by wounding and pathogens. Plant Journal, v.14, n.3, p.285-295. 1998.
93
Walters, D. e Heil, M. Costs and trade-offs associated with induced resistance. Physiological and Molecular Plant Pathology, v.71, n.1, p.3-17. 2007. Walters, D. R. Are plants in the field already induced? Implications for practical disease control. Crop Protection, v.28, n.6, p.459-465. 2009. Wang, H. W., et al. Expressional diversity of wheat nsLTP genes: evidence of subfunctionalization via cis-regulatory divergence. Genetica, p.1-10. 2010. Wasinger, V. C., et al. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes Mycoplasma genitalium. Electrophoresis, v.16, n.7, p.1090-1094. 1995. Westermeier, R., et al. Proteomics technology. Journal of Clinical Ligand Assay, v.25, n.3, p.242-252. 2002. Wijaya, R., et al. Defense proteins from seed of Cassia fistula include a lipid transfer protein homologue and a protease inhibitory plant defensin. Plant Science, v.159, n.2, p.243-255. 2000. Wildgruber, R., et al. Web-based two-dimensional database of Saccharomyces cerevisiae proteins using immobilized pH gradients from pH 6 to pH 12 and matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry. Proteomics, v.2, n.6, p.727-732. 2002. Wilkins, M. R. From proteins to proteomes: large scale protein identification by two-dimensional electrophoresis and amino acid analysis. Bio/Technology, v.14, n.1, p.61-65. 1996. Winkler, K., et al. Interactions of Viscotoxins with Vesicles of Genuine Plant Membranes. Planta Med, v.74, n.02, p.163-167. 2008. Wong, J. H., et al. A Review of Defensins of Diverse Origins. Current Protein & Peptide Science: Bentham Science Publishers Ltd. 8: 446-459 p. 2007. Wong, J. H. e Ng, T. B. Sesquin, a potent defensin-like antimicrobial peptide from ground beans with inhibitory activities toward tumor cells and HIV-1 reverse transcriptase. Peptides, v.26, n.7, p.1120-1126. 2005. Wong, J. H., et al. A mitogenic defensin from white cloud beans (Phaseolus vulgaris). Peptides, v.27, n.9, p.2075-2081. 2006. Yamamizo, C., et al. Rewiring mitogen-activated protein kinase cascade by positive feedback confers potato blight resistance. Plant Physiology, v.140, n.2, p.681-692. 2006. Yang, Y.-F. e Lyu, P.-C. The proteins of plant defensin family and their application beyond plant disease control. Recent patents on DNA & gene sequences, v.2, n.3, p.214-218. 2008. Ye, L., et al. High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of bile acid profiles in serum of women with
94
intrahepatic cholestasis of pregnancy. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, v.860, n.1, p.10-17. 2007. Ye, X. S., et al. Association of pathogenesis-related proteins and activities of peroxidase, beta-1,3-glucanase and chitinase with systemic. Physiological and Molecular Plant Pathology, v.36, n.6, p.523-531. 1990. Yeaman, M. R. e Yount, N. Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacological reviews, v.55, n.1, p.27-55. 2003. Yeats, T. H. e Rose, J. K. C. The biochemistry and biology of extracellular plant lipid-transfer proteins (LTPs). Protein science : a publication of the Protein Society, v.17, n.2, p.191-198. 2008.
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