Proteínas ancoradas por GPI de promastigotas de ...livros01.livrosgratis.com.br/cp086569.pdf4.5...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PPrrootteeíínnaass aannccoorraaddaass ppoorr GGPPII ddee

pprroommaassttiiggoottaass ddee LLeeiisshhmmaanniiaa aammaazzoonneennssiiss::

iissoollaammeennttoo ee iinnccoorrppoorraaççããoo eemm ssiisstteemmaass

mmiimmééttiiccooss ddee mmeemmbbrraannaass

Marcelle Carolina Colhone

Ribeirão Preto

2009

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Marcelle Carolina Colhone

PPrrootteeíínnaass aannccoorraaddaass ppoorr GGPPII ddee

pprroommaassttiiggoottaass ddee LLeeiisshhmmaanniiaa aammaazzoonneennssiiss::

iissoollaammeennttoo ee iinnccoorrppoorraaççããoo eemm ssiisstteemmaass

mmiimmééttiiccooss ddee mmeemmbbrraannaass

Orientador: Prof. Dr. Pietro Ciancaglini

Co-orientador: Prof. Dr. Francisco Juarez Ramalho Pinto

Ribeirão Preto

2009

Tese Apresentada à Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo para Obtenção do Título de Doutor

em Ciências, Área: Bioquímica.

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,

PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Colhone, Marcelle Carolina. Proteínas ancoradas por GPI de promastigotas de Leishmania amazonensis: isolamento e incorporação em sistemas miméticos de membranas. Ribeirão Preto, 2009. 115 p.

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Área de concentração em Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Pietro Ciancaglini Co-orientador: Prof. Dr. Francisco Juarez Ramalho Pinto 1. Leishmania amazonensis – 2. Proteínas ancoradas por GPI – 3. Sistemas miméticos de membranas – 4. Vacinação.

Dedicatória

Dedico este trabalho às pessoas mais importantes da minha vida:

Aos meus pais Lúgiro Colhone e Maria de Lourdes Colhone. Obrigada por acreditarem em

mim e por todo o incentivo, amor, dedicação e sacrifícios oferecidos em pró da minha

formação acadêmica e pessoal.

Às minhas irmãs Cássia e Michelle. Obrigada pelo apoio, incentivo, paciência, amor e por

sempre estarem perto nos momentos de alegrias e tristezas e por sempre acreditarem em mim.

Ao meu namorado Rodrigo Gimenez por todo apoio, amor, paciência e incentivo e por

simplesmente entrar em minha vida e estar ao meu lado agora.

Agradecimentos

Em especial agradeço ao Professor Dr. Pietro Ciancaglini pela valiosa orientação,

oportunidade concedida, amizade e pelo exemplo de dedicação, competência e

responsabilidade. Gostaria de expressar todo o meu carinho e reconhecimento

por esse grande professor.

Ao Professor Dr. Francisco Juarez Ramalho Pinto pela co-orientação deste

trabalho e por permitir a utilização do espaço físico do seu laboratório.

À Professora Maria Elisabete D. Zaniquelli e a sua aluna Thatyane M. Nobre por

toda atenção, orientação e apoio que contribuíram grandemente para o

desenvolvimento e finalização deste trabalho. Obrigada por permitir a utilização

do espaço físico de seu laboratório e utilização dos seus equipamentos.

Ao Professor Dr. Rodrigo G. Stabeli pelas valiosas sugestões e auxílio para o

desenvolvimento do artigo científico e por todo auxílio e apoio oferecidos em

Porto Velho - RO.

À Professora Dra. Vânia Luíza Deperon Bonato, pela atenção e valiosas sugestões

nas técnicas imunológicas que enriqueceram este trabalho.

À amiga e técnica Denise Brufato Ferraz por todo o auxílio e apoio técnico em

meus experimentos que contribuíram grandemente para o desenvolvimento

deste trabalho. Obrigada pela amizade e pelo exemplo de profissionalismos e

competência.

Aos técnicos Nilton Rosa Alves e Ivana Aparecida Borin pelo apoio e exemplos de

competência, seriedade e profissionalismo.

Ao Professores Drs. Luis Ricardo O. Tosi, Joaquim Coutinho Netto, Lúcia Maria X.

Lopes e Fábio T. M. Costa pela participação na banca examinadora e pelas

valiosas sugestões a este trabalho.

Aos Docentes, Pós-Graduandos e Funcionários do Departamento de Bioquímica

da FMRP, pelo aprendizado, convivência e auxílios dispensados durante a

realização deste trabalho.

Aos funcionários do Biotério de Criação de Camundongos Isogênicos da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, pelo

fornecimento dos animais necessários para este trabalho.

Às amigas Izaltina, Vanessa, Andressa, Fabiana, Fernanda, Viviane e Mariana

pela convivência agradável e momentos de alegria e principalmente por todo

apoio necessário para a realização deste trabalho. Em especial a Iza por todo

apoio e auxílio oferecidos em Porto Velho - RO.

Aos amigos do laboratório Luiz Eduardo, Carolina, Ana Maria, Simone,

Rosângela, Maytê, Juliana, Tony e Fernanda pela amizade, companheirismo,

pelos momentos de alegria compartilhados e acima de tudo obrigada por todo

apoio e auxílio que me ofereceram durante todos esses anos de convivência. Em

especial a Juliana Sakamoto Yoneda pela convivência diária, pela amizade e

apoio.

Aos amigos da iniciação científica Imaculada, Bruno, Thais, Ricardo, Andréia pela

amizade, companheirismo e pelos auxílios no laboratório.

À CAPES e ao FAEPA pela bolsa e auxílios concedidos.

Agradeço a todos aqueles que contribuíram de alguma forma com a execução

deste trabalho.

SSuummáárriioo

Resumo

Abstract

11.. IInnttrroodduuççããoo............................................................................................1

1.1 A leishmaniose tegumentar ................................................................2

1.2 Proteínas ancoradas por GPI da superfície celular do parasita ..................5

1.3 Resposta imune do hospedeiro na leishmaniose................................... 10

1.4 O desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose.............................. 13

1.5 Os lipossomos ................................................................................ 18

1.6 Monocamadas de Langmuir .............................................................. 20

22.. OObbjjeettiivvooss............................................................................................ 22

2.1 Objetivos Gerais ............................................................................. 23

33.. MMaatteerriiaall ee MMééttooddooss............................................................................... 24

3.1 Animais ......................................................................................... 26

3.2 Obtenção e cultivo dos parasitas ....................................................... 26

3.3 Preparação do soro contendo os anticorpos contra os determinantes

imunogênicos de L. amazonensis ............................................................ 26

3.4 Solubilização de proteínas de membrana ancoradas por GPI de

promastigotas de L. amazonensis ........................................................... 27

3.5 Tratamento com fosfolipase C........................................................... 27

3.6 Eletroforese em condição desnaturante [SDS-PAGE (sodium dodecyl

sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)] .............................................. 28

3.7 Western Blotting ............................................................................. 28

3.8 Remoção do detergente Triton X-114................................................. 29

3.9 Preparação dos lipossomos e dos proteolipossomos contendo as proteínas

de membrana ancoradas por GPI de promastigotas de L. amazonensis ........ 29

3.10 Medidas de distribuição de tamanho de partícula por espalhamento de luz

dinâmico ............................................................................................. 30

3.11 Preparação do gradiente isopícnico de densidade de sacarose.............. 31

3.12 Dosagem de proteínas ................................................................... 32

3.13 Dosagem de fosfato inorgânico........................................................ 32

3.14 Dosagem de colesterol ................................................................... 33

3.15 Imunização de camundongos com os proteolipossomos e avaliação da

proteção contra a infecção com L. amazonensis ........................................ 33

3.16 Monocamadas de Langmuir: isotermas π - A e cinética de adsorção...... 34

3.17 Obtenção, cultivo e estimulação de macrófagos peritoneais murinos..... 34

3.18 Infecção das culturas de macrófagos com L. amazonensis................... 35

3.19 Avaliação da viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos .............. 35

3.20 Análise da produção de nitrito ......................................................... 36

3.21 Análise estatística ......................................................................... 37

44.. RReessuullttaaddooss.......................................................................................... 38

4.1 Solubilização das proteínas ancoradas por GPI da membrana de L.

amazonensis utilizando o detergente Triton X-114..................................... 39

4.2 Preparação dos lipossomos e proteolipossomos e suas caracterizações. .. 43

4.3 Caracterização dos proteolipossomos preparados com DPPC:Colesterol... 54

4.4 Avaliação da incorporação de proteínas ancoradas por GPI de L.

amazonensis em monocamadas de Langmuir. .......................................... 56

4.5 Avaliação da proteção contra a infecção com L. amazonensis em

camundongos BALB/c: Primeira imunização com os proteolipossomos.......... 61


camundongos BALB/c: Segunda imunização com os proteolipossomos. ........ 67

4.7 Avaliação dos efeitos dos diferentes tratamentos na infecção de

macrófagos peritoneais murinos com formas amastigotas de L. amazonensis.71

4.8 Análise da produção de óxido nítrico (NO). ......................................... 76

4.9 Análise da viabilidade de macrófagos peritoneais murinos estimulados com

lipossomos, EBSGPI e proteolipossomos. ................................................... 78

55.. DDiissccuussssããoo ........................................................................................... 81

66.. CCoonncclluussõõeess ......................................................................................... 98

77.. RReeffeerrêênncciiaass BBiibblliiooggrrááffiiccaass.................................................................... 101

Anexos

Índice de Figuras e Tabelas Figura 1 - Estrutura de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (modificado de www.sigmaaldrich.com, acessado em 01/10/2008).............. 06 Figura 2 - Proteínas da superfície da forma promastigota de Leishmania (modificado de Bogdan & Rollinghoff, 1998) ............................................. 08 Figura 3 - Eletroforese em condição desnaturante (SDS-PAGE) e coloração pela prata ........................................................................................... 41 Figura 4 - Análise por Western Blotting das proteínas da superfície de promastigotas de L. amazonensis ........................................................... 42 Figura 5 - Efeito das diferentes razões molares dos lipossomos na incorporação de proteínas ancoradas por GPI de promastigotas de L. amazonensis........................................................................................ 45 Figura 6 - Eletroforese em condição desnaturante (SDS-PAGE) e coloração pela prata ........................................................................................... 53 Figura 7 - Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose............... 55 Figura 8 - Curva pressão superficial x área molecular (π-A) para as diferentes monocamadas ..................................................................................... 57 Figura 9 - Cinética da adsorção de proteínas ancoradas por GPI da superfície de formas promastigotas de L. amazonensis, em monocamadas a 30mN/m.. 59 Figura 10 - Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por via i.p. com tampão, 200 µL de lipossomos ou com 5 µg de proteolipossomos e desafiados com 104 promastigotas de L. amazonensis .... 62 Figura 11 - Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por via i.p. com tampão ou com 10 µg de proteolipossomos e desafiados com 104 promastigotas de L. amazonensis...................................................... 64 Figura 12 - Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por via i.p. com tampão ou com 20 µg de proteolipossomos e desafiados com 104 promastigotas de L. amazonensis...................................................... 65 Figura 13 - Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por via i.p. com tampão, 200 µL de lipossomos, EBSGPI ou com proteolipossomos e desafiados com 104 promastigotas de L. amazonensis .... 68 Figura 14 - Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por via i.p. com tampão (controle), 200 µL de lipossomos, 5 µg de EBSGPI ou com 40 µg de proteolipossomos e desafiados com 104 promastigotas de L. amazonensis........................................................................................ 70 Figura 15 - Efeitos de diferentes tratamentos em macrófagos peritoneais murinos infectados com amastigotas de L. amazonensis ............................ 72

Figura 16 - Efeitos de diferentes tratamentos em macrófagos peritoneais murinos infectados com amastigotas de L. amazonensis ............................ 74 Figura 17 - Efeitos de diferentes tratamentos em macrófagos peritoneais murinos infectados com amastigotas de L. amazonensis ............................ 75 Figura 18 - Produção de nitrito em culturas de macrófagos peritoneais murinos estimulados com diferentes tratamentos...................................... 77 Figura 19 – Efeitos de diferentes tratamentos na viabilidade de macrófagos peritoneais murinos .............................................................................. 79 Figura 20 - Efeitos das proteínas ancoradas por GPI na viabilidade de macrófagos peritoneais murinos ............................................................. 80 Tabela I - Composição lipídica (razão em mol) e diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos preparados conforme descrito em Material e Métodos .............................................................................................. 44 Tabela II - Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos preparados com fosfolipídios com diferentes grupos cabeça polar na ausência do colesterol ........................................................................................ 47 Tabela III - Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos preparados com fosfolipídios com diferentes grupos cabeça polar na presença do colesterol ........................................................................................ 48 Tabela IV - Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos preparados com fosfolipídios com diferentes tamanhos de cadeias hidrocarbônicas na ausência do colesterol ................................................ 50 Tabela V - Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos preparados com fosfolipídios com diferentes tamanhos de cadeias hidrocarbônicas na presença do colesterol................................................ 51

LLiissttaa ddee SSiiggllaass ee AAbbrreevviiaattuurraass

A: área

APC: células apresentadoras de antígenos

AP-GPI: fostatase alcalina ancorada por GPI

BCG: bacilo de Calmette-Guérin

BSA: albumina de soro bovino

C3b: componente C3 do sistema complemento

C3bi: componente C3 do sistema complemento

CaCl2: cloreto de cálcio

DAB: 3,3’ diaminobenzidina

DCs: células dentríticas

DHFR-TS: dihidrofolato redutase-timidilato sintase

DLPC: dilauroilfosfatidilcolina

DMPC: dimiristoilfosfatidilcolina

DNA: ácido desoxirribonucléico

DPPA: ácido dipalmitoilfosfatídico

DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina

DPPG: dipalmitoilfosfatidilglicerol

DPPS: dipalmitoilfosfatidilserina

DSPC: distearoilfosfatidilcolina

DTH: hipersensibilidade do tipo tardia

EBSGPI: extrato bruto solubilizado enriquecido com as proteínas ancoradas por

GPI de formas promastigotas de L. amazonensis.

FML: ligante de fucose e manose

fPPG: forma filamentosa das proteofosfoglicanas

GIPL: glicoinositolfosfolipídeos livres de GPI

gp42: glicoproteína da superfície da Leishmania com peso de 42 KDa

gp46/M2: glicoproteína da superfície da Leishmania com peso de 46 KDa

gp63: glicoproteína da superfície da Leishmania com peso de 63 KDa

GPI: Glicosilfosfatidilinositol

H2O2: peróxido de hidrogênio

HCl: ácido clorídrico

HEPES: ácido hidroxietil piperazina etanosulfúrico

i.p.: intraperitoneal

IFN-γ: interferon-γ

IgG: imunoglobulina G

IL-12: interleucina-12

IL-1α: interleucina 1-α



iNOS: óxido nítrico sintase induzível

KO: knock-out

LACK: Leishmania homologue of receptors for activated C kinase

LC: líquido condensado

LE: líquido expandido

LPG: lipofosfoglicanas

LTA: Leishmaniose Tegumentar Americana

MTT: (3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil brometo tetrazolina)

MyD88: fator de diferenciação mielóide 88

NaCl: cloreto de sódio

NK: células natural Killer

NO: óxido nítrico

O2-: superóxido

PBS: salina tamponada com fosfato

PIPLC: fosfolipase C específica para glicosilfosfatidilinositol

PO: proteína ribossomal ácida de Leishmania

PPG: proteofosfoglicanas

s.c.: subcutânea

Sch/SFB: Schneider contendo sulfato de gentamicina e soro fetal bovino

Sch: Schneider

SDS: dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

SFB: soro fetal bovino

SPF: Specific Patogen Free

Th1: T helper 1

Th2: T helper 2

TNF-α: fator de necrose tumoral α

Tris: (hydroxymethyl-)aminomethane

Triton X-114: Octylphenoxypoly-ethoxyethanol

Tween 20: polyoxyethylenesorbitan monolaurate

π: pressão superficial

RReessuummoo Neste trabalho, nós investigamos a influência de diferentes lipídios:colesterol

(mol:mol) na incorporação de proteínas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol

(GPI) de Leishmania amazonensis em lipossomos e monocamadas de Langmuir.

Em um segundo passo, nós avaliamos se proteolipossomos carregando proteínas

ancoradas por GPI de formas promastigotas do parasita podem induzir

imunidade protetora em camundongos BALB/c. Lipossomos foram formados em

todas as condições estudadas, mas a incorporação das proteínas ancoradas por

GPI ocorreu somente na presença do colesterol, alcançando um máximo de

adsorção da proteína (57±9 %) quando a razão molar 2,1:1 de

dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC):Colesterol foi usada. O aumento da quantidade

de colesterol não aumenta a adsorção das proteínas ancoradas por GPI. Além

disso, na ausência do colesterol, a reconstituição é mais dificultada, sendo este

resultado confirmado por experimentos em monocamadas de Langmuir, onde a

inserção da proteína via GPI, leva a desestabilização da monocamada de DPPC.

Para avaliar a proteção, camundongos BALB/c foram injetados

intraperitonealmente com tampão, lipossomos, extrato bruto de proteínas

ancoradas por GPI solubilizadas com Triton X-114 (EBSGPI) ou proteolipossomos

e, após três semanas, foram desafiados na pata traseira direita com 104 formas

promastigotas de L. amazonensis. A proteção foi avaliada semanalmente até a

14ª semana através de medidas do tamanho das lesões causadas pelo parasita.

Camundongos BALB/c imunizados com 40 µg (proteínas totais) de

proteolipossomos mostraram uma proteção de 50 %, quando comparados aos

camundongos que receberam somente tampão. Entretanto, camundongos

imunizados com 5 µg (proteínas totais) de EBSGPI mostraram um máximo de

proteção de 60 % pós infecção. Assim, esses resultados indicam que tanto o

EBSGPI quanto os proteolipossomos podem ser usados para induzir imunidade

protetora em camundongos contra L. amazonensis. Além disso, macrófagos

peritoneais murinos estimulados com lipossomos, EBSGPI ou proteolipossomos

mostraram redução da porcentagem de células infectadas (42, 39 e 99%,

respectivamente) e do número de parasitas intracelulares por célula (29, 32 e

99%, respectivamente). A cinética de infecção indica que diferentes estímulos

não impediram a fagocitose de amastigotas de L. amazonensis, mas induziram

macrófagos a reduzirem o parasitismo intracelular.

AAbbssttrraacctt

The reconstitution of membrane proteins into liposomes is a useful tool to

prepare antigenic components to induce immunity. In this work we investigated

the influence of different lipids:cholesterol molar ratios in the incorporation of a

glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins from Leishmania

amazonensis in liposomes and Langmuir monolayers. In a second step, we

evaluated if proteoliposomes carrying GPI-anchored proteins of parasite

promastigotes could induce infection protective immunity in BALB/c mice. The

liposomes were formed in all conditions studied, but the incorporation of the GPI-

proteins occurs only in the presence of cholesterol, reaching a maximum of

protein adsorption (57±9 %) when a 2,1:1 ratio of dipalmitoylphosphatidylcholine

(DPPC):cholesterol was used. The increase of cholesterol quantities does not

increase GPI-protein adsorption. Moreover, in the absence of cholesterol,

reconstitution is more difficult and it was correlated to the disruption of the DPPC

layer. To assay protective immunity, BALB/c mice were injected intraperitoneally

with buffer, liposomes, Triton X-114 solubilized GPI-protein extract (EBSGPI) or

proteoliposomes and, three weeks later, challenged in the footpad with 104 L.

amazonensis promastigotes. Protective immunity was evaluated weekly for up to

14 weeks by measuring the size of lesions caused by the parasite. BALB/c mice

immunized with 40 µg (total protein) of proteoliposomes showed a protection of

50 %, as compared to mice that received only the buffering solution. However,

mice immunized with 5 µg (total protein) of GPI-solubilized protein extract

(EBSGPI) displayed a maximum protection of 60 % post-infection. Thus, these

results indicate that either EBSGPI or proteoliposomes may be used to induce

protective immunity against L. amazonensis in mice. Furthermore, murine

peritoneal macrophages stimulated with liposomes, EBSGPI or proteoliposomes

showed a reduction of the percentage of infected cells (42, 39 and 99%,

respectively) and of the number of intracellular parasites per cell (29, 32 and

99%, respectively). The kinetic of infection indicated that different stimulus did

not depress L. amazonensis phagocytosis but induced macrophages to reduce

intracellular parasitism.

11.. IInnttrroodduuççããoo

1.1 A leishmaniose tegumentar

Entre todas as doenças emergentes, aquelas causadas por protozoários

são de grande importância por apresentarem um elevado nível de morbidade e

mortalidade, como é o caso da leishmaniose (Santos et al., 2008). Esta doença

afeta aproximadamente 12 milhões de pessoas e está presente em 88 países,

principalmente em áreas tropicais e subtropicais. A incidência anual é de

aproximadamente 2 milhões de novos casos e cerca de 350 milhões de pessoas

vivem em áreas endêmicas revelando assim a importância dessa doença

negligenciada (http://www.who.int/).

A leishmaniose é causada por parasitas do gênero Leishmania, um grupo

de protozoários kinetoplastida, que podem causar um amplo espectro de

manifestações clínicas. Na pele, essas manifestações variam de úlceras cutâneas

localizadas (leishmaniose cutânea) e mucocutânea (leishmaniose mucocutânea)

a leishmaniose cutânea difusa e visceral que pode muitas vezes ser fatal

(Teixeira, 2006). A variedade de manifestações clínicas presentes na

leishmaniose cutânea está diretamente relacionada ao estado imunológico do

paciente e a espécie de Leishmania envolvida. As diferentes formas de

leishmaniose cutânea constituem um importante problema de saúde pública

principalmente pela dificuldade de sua prevenção (MS/FUNASA, 2000).

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença que

acompanha o homem desde a antiguidade, existindo relatos e descrições

encontrados na literatura desde o séc. I d.C (Laison, 1997; Camargo & Barcinski,

2003). O primeiro a observar o parasita do gênero Leishmania foi Cunningham

em 1885, na Índia, em casos de leishmaniose visceral. No Brasil, Cerqueira, em

1855, observou a existência da moléstia da pele, identificando-a clinicamente

como botão de Biskra. Em 1895, na Itália, Breda, descreveu a moléstia em

italianos provenientes de São Paulo (Pessoa, 1982).

Entretanto, no Brasil, a natureza leishmaniótica das lesões cutâneas e

nasofaríngeas só foi confirmada, pela primeira vez, em 1909, por Lindenberg,

que encontrou formas de Leishmania, idênticas a Leishmania tropica (Wright,

1903) da leishmaniose do Velho Mundo, em lesões cutâneas de indivíduos que

trabalhavam nas matas do interior do Estado de São Paulo (Pessoa, 1982).

A leishmaniose tegumentar tem aumentando nos últimos 20 anos em

quase todos os estados brasileiros, e surtos epidêmicos tem ocorrido no Sudeste,

Centro-Oeste, Nordeste, e mais recentemente, região Amazônica, devido ao

processo predatório de colonização (Delorenzi et al., 2001; Gontijo & Melo,

2004).

Há aproximadamente 21 espécies de Leishmania, transmitidas por cerca

de 30 espécies de flebotomíneos (Cunningham, 2002). Nos hospedeiros

mamíferos, representados na natureza por várias ordens e espécies, a

Leishmania assume a forma amastigota, arredondada e imóvel, que se multiplica

obrigatoriamente dentro de células do sistema monocítico fagocitário. À medida

que as formas amastigotas vão se multiplicando, os macrófagos se rompem

liberando parasitas que serão fagocitados por outros macrófagos (Gontijo &

Carvalho, 2003).

Todas as espécies do gênero são transmitidas pela picada de fêmeas

infectadas de dípteros da subfamília Phlebotominae, pertencentes aos gêneros

Lutzomyia – no Novo Mundo, e Phlebotomus – no Velho Mundo. Esses vetores

sugam junto com o sangue as formas amastigotas de um animal infectado, que

se alojam em partes de seu intestino levando-as a se transformar em

promastigotas, morfológicas e bioquimicamente distintas das amastigotas

(Marzochi, 1992; Gontijo & Carvalho, 2003). Esta forma é alongada e apresenta

um longo flagelo livre. No sistema digestivo de seus vetores, as formas

promastigotas multiplicam-se por aparente divisão simples e assexuada e

migram para a probóscíde do inseto após aproximadamente 4 a 5 dias. A esta

altura, bloqueiam o proventrículo, de onde podem ser inoculadas na pele do

hospedeiro vertebrado, junto com a saliva (Marzochi, 1992).

Leishmania tem desenvolvido uma variedade de mecanismos adaptativos

não somente para viver dentro do vetor, mas também para escapar da resposta

imune do hospedeiro vertebrado, inclusive dentro do macrófago (Cunningham,

2002). Vários receptores da superfície celular dos macrófagos, moléculas da

superfície do parasita e fatores derivados do soro são responsáveis pelas

interações das formas promastigotas com a célula hospedeira garantindo assim a

sobrevivência, multiplicação, patogênese ou mesmo a morte do parasita no

hospedeiro (Mosser & Rosenthal, 1993; Garg et al., 2005).

O controle da leishmaniose, tanto em saúde pública como individualmente,

é pouco eficiente, não existindo medidas simples e eficazes de proteção e

consiste principalmente em tratamentos quimioterápicos, e infelizmente, ainda

não há uma vacina efetiva contra este parasita (Silva & Camargo-Neves, 2004).

Atualmente, o tratamento da leishmaniose primeiramente conta com

quimioterapias, com algumas tentativas no uso de imunoterapias (Ghosh et al.,

2003; Santos et al., 2003; Borja-Cabrera et al., 2004). A primeira linha de

tratamento é predominantemente baseada em antimoniais pentavalentes, um

tratamento clássico na maioria das áreas endêmicas. Contudo, a sua utilidade

tem sido comprometida pela emergência de resistência. A segunda linha de

tratamento inclui drogas tais como anfotericina B e pentamidina, que são

caracterizadas pela alta eficiência, mas são relativamente caras e apresenta

vários efeitos colaterais (Berman, 2003; Davis e Kedzierski, 2005).

Novas drogas, tais como formulações lipídicas de anfotericina B, têm sido

efetivas no tratamento da leishmaniose visceral, mas o custo dessa droga é

certamente inviável para a maioria dos pacientes (Berman et al., 1998; Murray,

2004). Recentemente, miltefosine tem mostrado ser um tratamento oral efetivo

para leishmaniose visceral na Índia (Sundar et al., 2002), e para leishmaniose

cutânea na América do Sul (Soto et al., 2001).

Com a restrita oferta de poucas drogas utilizadas para o tratamento de

infecções por Leishmania ssp. é necessário a busca de novas drogas para o

controle desta doença.

1.2 Proteínas ancoradas por GPI da superfície celular do parasita

Considerando a estratégia de invasão da Leishmania, proteínas presentes

na superfície celular desses parasitas são de extrema importância, sendo

responsáveis pela interação com a célula do hospedeiro garantindo a

manutenção da sobrevivência, multiplicação e patogênese do parasita no

hospedeiro (Garg et al., 2005).

A superfície celular de todos os tripanossomatídeos é dominada por

proteínas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI), formando uma cobertura

que protege a superfície do parasita e medeiam essenciais interações parasita-

hospedeiro. No parasita Leishmania essas proteínas formam uma efetiva barreira

de difusão macromolecular que protege as formas promastigotas de processos

microbicidas tais como lise mediada pelo sistema complemento, radicais oxigênio

e hidrolases dos hospedeiros vertebrados e invertebrados (Descoteaux &Turco,

1999; Ilgoutz & McConville, 2001).

Protozoários tendem a expressar significativamente maiores densidades de

proteínas ancoradas por GPI na superfície celular do que eucariotos superiores

(Macedo et al., 2003). Acredita-se que essas proteínas ancoradas por GPI

formem clusters em microdomínios da membrana celular geralmente chamado

lipids rafts, em associação com glicoesfingolipidios, esfingomielina, colesterol e

outras proteínas sinalizadoras.

Como mostra a Figura 1, a âncora dessas proteínas é covalentemente

ligada à porção C terminal das proteínas e consiste de uma cadeia central

conservada de glicana ligada ao fosfatidilinositol com duas cadeias acil ancoradas

na bicamada da membrana (Simons & Ikonen, 1997; Macedo et al., 2003).

Figura 1. Estrutura de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (modificado de

www.sigmaaldrich.com, acessado em 01/10/2008).

Possíveis modificações para Man3-GlcN: R1: Man α-(1-2) R2: Fosfoetanolamina R3: Fosfoetanolamina R4: Gal4

R5: GalNac β-(1-4) R6: Ácido Graxo em C2 ou C3 do inositol

As formas promastigotas de Leishmania são cobertas por um grande

número de glicoproteínas ancoradas por GPI, como por exemplo, gp63, gp42,

gp46/M2 e proteofosfoglicanas (PPG), e ainda um complexo lipofosfoglicano

(LPG) que possui uma âncora estruturalmente distinta da GPI (McConville &

Ferguson, 1993) e uma abundante família de GPIs livre (aproximadamente 10

vezes mais abundante do que proteínas ancoradas por GPI e LPG), denominada

glicoinositolfosfolipideos (GIPL) (McConville et al., 2002).

Ao contrário, as formas amastigotas de Leishmania, que proliferam dentro

do fagolisossomo do macrófago do hospedeiro, são recobertas por um mínimo

glicocálix que é quase exclusivamente composto por GIPLs e glicolipídeos

derivado da célula do hospedeiro, e a expressão das proteínas ancoradas por GPI

e LPG é dramaticamente baixo-regulada neste estágio (McConville & Blackwell,

1991; Winter et al., 1994).

A glicoproteína ancorada por GPI mais predominante da superfície de

Leishmania é a zinco-metaloprotease chamada gp63 com peso molecular de 63

KDa (Bordier, 1987; Button & McMaster, 1988). Essa proteína é expressa na

superfície de promastigotas de diferentes espécies de Leishmania e nas formas

promastigotas e amastigotas de L. major e L. mexicana (Frommel, 1990). Cada

promastigota é coberta com aproximadamente 5x105 cópias de gp63 o que

corresponde a aproximadamente 1% das proteínas totais (Ilgoutz & McConville,

2001). Essa glicoproteína apresenta um importante papel na leishmaniose por

agir com aceptor para o componente C3 do complemento (C3b e C3bi) mediando

a ligação da forma promastigota ao macrófago (Brittingham et al., 1995; Russell

et al., 1989). Outros estudos também mostraram que gp63 é o ligante para

múltiplos receptores de macrófagos, incluindo Mac-1 (CD11b/CD18) e receptor

celular para fibronectina (Figura 2) (Brittingham et al., 1999).

Figura 2. Proteínas da superfície da forma promastigota de Leishmania (modificado de

Bogdan & Rollinghoff, 1998).

Ainda, gp63 pode ter um importante papel na proteção contra degradação

dentro do fagolisossomo do macrófago (Chaudhuri et al., 1989). Essa proteína

exibiu atividade ótima sob o ambiente ácido do fagolisossomo, e têm mostrado

degradar as enzimas lisossomais presentes neste ambiente (Cunningham, 2002).

Devido a sua abundância e sua habilidade em mediar resistência contra

promastigotas infectantes, gp63 tem sido sugerida como uma possível candidata

para vacinação contra infecções por Leishmania (Bhowmick et al., 2008; Jaafari

et al., 2006, 2007).

Macrófago

Macrófago

Outras proteínas ancoradas também mostraram ter um importante papel

na resposta imune como, por exemplo, as PPGs que constituem uma classe

distinta de moléculas e que são sintetizadas por ambas formas promastigotas e

amastigotas do parasita. Essas proteofosfoglicanas podem estar ancoradas por

GPI na superfície celular ou serem secretadas (forma filamentosa fPPG) (Ilgoutz

& McConville, 2001) e apresentam importante papel na virulência do parasita

tanto no hospedeiro vertebrado quanto no hospedeiro invertebrado (Ilg et al.,

1999).

As proteínas antigênicas gp42 e gp46/M2 também parecem estar

envolvidas na resposta imunológica do hospedeiro vertebrado. A gp42 mostrou

induzir alta resposta proliferativa, assim como produção de interleucina-2 (IL-2)

e interferon-γ (IFN-γ) por linfócitos humanos de pacientes com leishmaniose

(Burns et al., 1991). Também, protocolos de vacinação com gp46/M2 em

associação com outras proteínas da superfície do parasita, resultou em uma

significativa inibição do desenvolvimento de lesões em camundongos suscetíveis

BALB/c desafiados com L. major (Tonui et al., 2004).

Ainda, outra proteína da superfície do parasita e que apresenta importante

papel na interação parasita-hospedeiro é a LPG. Essa proteína, uma das mais

abundante na superfície de promastigotas de Leishmania, forma um denso

glicocálix ao redor do parasita. Ela possui uma âncora estruturalmente distinta

das GPIs, constituída por unidades repetidas de Galβ1,4Manα-PO4 ligada a

membrana de promastigotas via uma ancora lipídica específica; 1-Ο-alquil-2-liso-

fosfatidil(mio)inositol com uma cadeia não usual longa de ácido graxo saturado

de 24-26 carbonos (Turco & Descoteaux, 1992). A LPG, assim como outros

glicoconjugados, têm um importante papel na interação Leishmania-

complemento e ainda, se ligam e interagem com outras proteínas do soro para

promover a entrada na célula hospedeira. A LPG pode contribuir para a

habilidade da Leishmania em resistir ou escapar dos efeitos antimicrobicidas dos

macrófagos (Descoteaux & Turco, 2002). Dentro dos macrófagos, as LPGs

apresentam vários efeitos como, por exemplo, inibição da maturação do

fagossomo, inibição da proteína C kinase e modulação da produção de óxido

nítrico (NO) (Winberg et al., 2009; Descoteaux & Turco, 2002).

O papel biológico específico dessas moléculas ancoradas por GPI da

superfície do parasita tem sido o tema de muitas pesquisas. Assim, o principal

foco no desenvolvimento de vacinas é a elucidação de uma variedade e

especificidade de uma resposta imune anti-Leishmania, e a identificação de

antígenos definidos provenientes deste parasita. Conhecer tais antígenos é

necessário para o desenvolvimento de imunoproteção como vacinas. Em adição,

os antígenos podem ser ferramentas úteis para avaliações imunes da infecção,

doença e resistência, e ainda serem usados para o desenvolvimento de novos

diagnósticos (Forgber, 2006).

1.3 Resposta imune do hospedeiro na leishmaniose

Imunidade protetora contra leishmaniose é principalmente mediada por

células T. A expansão de clones T helper do tipo 1 (Th1) parece proteger durante

a infecção, enquanto a expansão de células T helper do tipo 2 (Th2) exacerba a

doença (Cunningham, 2002). O tipo da resposta imune do hospedeiro é um dos

principais fatores controladores da doença. O modelo animal de infecção é

amplamente utilizado para definir mecanismos imunológicos que contribuem pra

o controle desse patógeno intracelular. Ainda, foi mostrado que células do

sistema imune (macrófagos, células dentríticas (DCs), células natural killer (NK),

células CD4+ e CD8+), citocinas (IFN-γ e IL-12), e moléculas efetoras (NO

produzido pela indução da enzima óxido nítrico sintase (iNOS)) são os

componentes chaves da reposta imune contra o parasita Leishmania (Bogdan et

al., 1993; Solbach & Laskay, 2000; Liese et al., 2008).

Em anos recentes, o envolvimento de células T CD8+ tem mostrado um

importante papel na imunidade contra leishmaniose cutânea (Belkaid et al.,

2002; Rodrigues et al., 2003). Semelhantemente, imunidade inata incluindo

células NK, IL-1α e o fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88) agem como

imunomoduladores determinando resistência inicial a infecção (Handman, 2001).

Macrófagos e DCs são as principais fontes de IL-12 imediatamente após

infecção com Leishmania (Gorak et al., 1998). A produção de IL-12 por essas

células induz as produção de IFN-γ por células NK e células T. IFN-γ em

associação ao fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) produzido pelo próprio

macrófago infectado induzem a ativação do macrófago para produzir moléculas

que serão tóxicas ao parasita (Kane & Mosser, 2000). Os dois mediadores mais

bem descritos e envolvidos na morte do parasita por macrófagos ativados com

IFN-γ e TNF-α são os radicais do oxigênio como o superóxido (O2- ) e o peróxido

de hidrogênio (H2O2) e os intermediários reativos de nitrogênio como o NO e o

peroxinitrito que são formados durante o burst respiratório (Kane & Mosser,

2000; Linares et al., 2001).

O papel das citocinas na resistência e suscetibilidade durante infecções

experimentais de camundongos com as diferentes espécies do gênero

Leishmania, como por exemplo, L. major ainda não está claro. Esse parasita

parece induzir a produção de IL-4 por camundongos BALB/c levando a

suscetibilidade enquanto a produção de IL-12, dependente da produção de IFN-γ

por muitas linhagens de camundongos, leva a ativação de macrófagos e controle

do crescimento do parasita (Sacks & Noben-Trauth, 2002).

Contudo, há evidências de que a resposta imune do hospedeiro a infecções

por L. amazonensis, que é a espécie utilizada em nosso trabalho, é diferente da

resposta causada por L. major. Camundongos C3H, C57BL/6 e C57BL/10, que

são resistentes a L. major, desenvolvem lesões crônicas com parasitismo

persistente quando infectadas com L. amazonensis (Afonso & Scott, 1993; Jones

et al., 2000; Jones et al., 2002; Soong et al., 1996). A manutenção da lesão

crônica é independente da expressão de IL-4 e de uma correspondente resposta

Th2 (Afonso & Scott, 1993; Jones et al., 2000; Soong et al., 1996). L.

amazonensis causa produção inicial de IL-12 e IFN-γ em camundongos C57BL/6

similarmente a L. major (Oliveira et al., 2000), mas infecções de camundongos

C3H resultam em produção de baixos níveis de IL-12 e IFN-γ por células TCD4+

antígenos-específicas (Jones et al., 2000). De fato, infecções crônicas por L.

amazonensis em camundongos C3H e C57BL/6 persistem após administração de

IL-12 (Jones et al., 2000) e IFN-γ exógenos (Barral-Netto et al., 1996).

A incapacidade da IL-12 de dirigir uma resposta imune celular efetiva

mediada por células durante infecção com L. amazonensis sugere que o parasita

pode provocar um potente mecanismo imunomodulatório para evitar a morte

generalizada estimulando assim infecções crônicas. Contudo, o desenvolvimento

de lesões e a carga parasitária mostram ser exacerbados por células TCD4+

(Soong et al., 1997; Terabe et al., 2000), demonstrando que células T são

ativadas durante infecções com L. amazonensis e que elas podem contribuir

significativamente para imunopatologia da doença (Soong et al., 1997).

DCs são células apresentadoras de antígenos (APC) altamente

especializadas, que recebem sinais da imunidade inata e converte-os em uma

resposta celular T adequada (Steinman, 2003). DCs são essenciais para uma

resposta imune contra patogénos, que em termos, tem desenvolvido

mecanismos para evitar a iniciação de uma resposta imune, por exemplo, por

interferir com a biologia e função de DCs (Favali et al., 2007). Ainda, DCs de

regiões periféricas estão em um estado imaturo e tem máxima capacidade de

fagocitar antígenos. Uma vez ativadas, essas células produzem IL-12, que

promove diferenciação de Th1, caracterizada pela produção de IFN-γ. Esta

citocina é crítica para matar macrófagos infectados com Leishmania (Favali et al.,

2007). Entretanto, recentemente estudos sugerem que L. amazonensis podem

infectar e possivelmente alterar a biologia das DCs, favorecendo o

estabelecimento da infecção (Qi et al., 2001).

Células NK são classicamente definidas como CD3- e CD16/56- e

participam da imunidade inata, por apresentar atividade citotóxica e produção

inicial de citocinas antes da imunidade adaptativa ser estabelecida (Tosi, 2005).

Durante infecções com Leishmania, células NK direcionam a resposta imune de

células T em direção ao tipo Th1 pela liberação de IFN-γ em poucas horas após a

infecção (Scharton & Scott, 1993). Modelos murinos de infecção mostram

deficiência de NK como um fator de suscetibilidade conduzindo a uma

significativa maior replicação e distribuição de parasitas comparáveis a

vulnerabilidade de camundongos após depleção de IFN-γ (Belosevic et al., 1989;

Laskay et al., 1995). Ainda, Lieke et al. (2008) identificaram gp63 como uma

importante molécula inibitória que age através da ligação direta com um subtipo

de células NK.

1.4 O desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose

A resistência às drogas (antimoniais pentavalentes, como o glucantime)

utilizadas tradicionalmente na terapia contra as leishmanioses, aliada aos efeitos

colaterais destes compostos fazem com que alternativas ao tratamento sejam

estudadas (Herwaldt, 1999). Devido à facilidade na utilização dos modelos in

vivo e in vitro de infecção com Leishmania, a eficiência de vários compostos e

protocolos de vacinação estão sendo testados (Handman et al., 2000).

Vacinação contra leishmaniose cutânea humana tem sido praticada por

séculos. A primeira vacina contra leishmaniose foi desenvolvida por Adler da

Universidade Hebrew de Jerusalém. Ele observou que mães libanesas expunham

os braços de seus filhos a picadas pelo inseto vetor porque elas intuitivamente

sabiam que o desenvolvimento de uma primeira e única lesão que se auto curava

poderia proteger seus filhos de uma forma mais severa da doença no futuro. Por

essa razão, práticas antigas inoculavam em indivíduos não infectados o material

infeccioso de lesões, em regiões do corpo onde a cicatriz pudesse ser escondida

(Palatnik-de-Souza, 2008). Essa prática era chamada de leishmanização e o uso

de material de lesões humanas ou de outros animais foi substituído pelo uso de

promastigotas de L. major obtidas de culturas (Greenblatt, 1980; Senekji &

Beattie, 1941). A leishmanização foi usada em Israel na década de 70 e no Irã

nos anos 80 (Nadim et al., 1983), como uma vacina profilática. Essa prática

também foi adotada pelo Governo iraniano em um programa que abrangeu cerca

de 2 milhões de pessoas, durante a guerra entre o Irã e o Iraque, um conflito

que foi de 1980 a 1988. A variabilidade no tamanho e na duração das lesões

resultantes da inoculação de cepas virulentas fez com que a técnica fosse

abandonada no Irã, após a guerra. Assim, vacinas de primeira geração

compostas de parasitas mortos foram gradualmente substituindo a

leishmanização (Modabber, 1995).

Em geral, as vacinas em desenvolvimento contra a leishmaniose, assim

como contra outras doenças infecciosas, podem ser divididas em três categorias:

(i) Vacinas vivas, incluindo também as construções geneticamente modificadas;

(ii) Vacinas de primeira geração, que são aquelas produzidas com frações do

agente patogênico ou ainda com o patógeno inteiro e morto, com ou sem

adjuvante e (iii) Vacinas de segunda e terceira geração, produzidas com

proteínas recombinantes ou DNA (ácido desoxirribonucléico) e vetores

microbianos (vírus e bactérias) expressando antígenos do parasita.

Vacinação usando preparações contendo antígenos obtidos de formas

promastigotas de várias espécies de Leishmania, tanto com ou sem o adjuvante

BCG (bacilo de Calmette-Guérin), foram testados contra leishmaniose cutânea e

visceral em triagens clínicas humanas em ambos Velho e Novo Mundo. Em geral,

não há evidencias que duas injeções de L. major autoclavadas resultaram em

significativa proteção comparada com BCG sozinho (Khalil et al., 2000). Triagens

de vacinação que demonstram que tanto o cocktail composto de cinco linhagens

de Leishmanias mortas ou uma única linhagem de L. amazonensis induz

significativa proteção da doença causada por infecções naturais (De luca et al.,

1999), têm conduzido o registro no Brasil de uma vacina para leishmaniose.

Esses estudos também indicam que a hipersensibilidade do tipo tardia (DTH)

pode ser usada como um marcador substituto para imunidade protetora. Embora

esses métodos de vacinas utilizando extratos brutos do parasita não sejam

ideais, eles confirmam alguns dados em animais indicando que a indução de

proteção contra leishmaniose é possível e pode ser conseguida com uma vacina

viável ou com componentes do parasita (Coler & Reed, 2005).

No Brasil, o uso de parasitas mortos na tentativa de se induzir uma

proteção contra a leishmaniose teve início na década de 40. A partir de 1970,

Wilson Mayrink e seus colaboradores na Universidade Federal de Minas Gerais

(UFMG), desenvolveram uma vacina morta composta de quatro espécies

diferentes de Leishmania (Genaro et al., 1996). Essa vacina acabou sendo

simplificada pelo uso de uma única espécie e está sendo usada aqui no Brasil

como um adjuvante durante o tratamento contra a leishmaniose (Machado-Pinto

et al., 2002) após ter sido aprovada pelo Ministério da Saúde. Além disso, essa

vacina também foi testada na Colômbia (Vélez et al., 2000; Vélez et al., 2005) e

no Equador (Armijos et al., 2004).

As vacinas de primeira geração, produzidas com frações do parasita,

também já foram empregadas. Uma vacina de subunidade contra a leishmaniose

visceral canina, conhecida como Leishmune® está sendo produzida e

comercializada no Brasil, desde que foi autorizada pelo Ministério da Agricultura

em junho de 2003. Essa vacina, constituída pelo ligante de fucose e manose

(FML) da L. donovani com saponina, induz cerca de 92 a 97% de proteção contra

a leishmaniose visceral zoonótica (Saraiva et al., 2006). A Leishmune® , apesar

de eficaz, traz riscos para a população, pois tanto o cão que recebeu a vacina

como o que foi infectado naturalmente, se tornam soropositivos, dificultando a

distinção entre o animal vacinado e o infectado assintomático.

Outra abordagem na busca de uma vacina contra a leishmaniose baseia-se

na manipulação gênica e criação de parasitas geneticamente modificados. Nessa

estratégia, aqueles genes que são essenciais para a sobrevivência da Leishmania

no seu hospedeiro são bloqueados, removidos ou mesmo substituídos por outros

genes. A primeira construção que gerou um mutante deficiente para um gene

deu origem a uma cepa de L. major knock-out (KO) para a enzima dihidrofolato

redutase-timidilato sintase (DHFR-TS) (Cruz et al., 1991). Os camundongos

inoculados com esses mutantes apresentaram uma proteção significativa, mas

temporária, após o desafio com os parasitas virulentos (Veras et al., 1999; Titus

et al., 1995).

Na construção das vacinas de segunda geração, muitos antígenos de

Leishmania já foram utilizados. A região codificadora para a parte protéica da

glicoproteína da superfície da Leishmania, a gp63, foi a primeira vacina de

plasmídeo produzida contra a leishmaniose (Xu & Liew, 1994). Ainda, outro

antígeno utilizado é o LACK (Leishmania homologue of receptors for activated C

kinase), contudo, resultados conflitantes foram observados. Enquanto cães

vacinados com vetores do vírus da vaccinia expressando esse antígeno

apresentaram 60% de proteção contra a leishmaniose visceral causada pela L.

infantum (Ramiro et al., 2003), camundongos BALB/c vacinados com DNA do

LACK não foram protegidos contra a infecção pela L. chagasi (Marques-da-Silva

et al., 2005).

Outras proteínas tais como a dp72 e PO (proteína ribossomal ácida) da

superfície de promastigotas de L. donovani e L. infantum; cisteínas proteases da

membrana de formas amastigotas de Leishmania; proteínas P4 e P8 de

amastigotas; vacinas com antígenos únicos ou com vários componentes e ainda

componentes da saliva do inseto vetor também estão sendo estudados como

possíveis alvos para o desenvolvimento de uma vacina contra a leishmaniose

(Kedzierski & Handman, 2006).

Recentemente, o uso de substâncias com estruturas moleculares bem

definidas em vacinas de segunda e terceira geração contra leishmaniose estão

emergindo (Coler & Reed, 2005). Embora o desenvolvimento de vacinas de

primeira geração seja mais barato e não necessita equipamentos sofisticados e

avanços tecnológicos, o desenvolvimento de uma vacina de antígenos bem

definidos tem vantagens na reprodutibilidade sobre vacinas com o extrato bruto

de Leishmania. Muitos dos antígenos de Leishmania que estão sendo testados

em modelos animais mostraram proteger quando usados com um adjuvante

apropriado (Afonso et al., 1994; Aebischer et al., 2000; Campos-Neto et al.,

2001).

Assim, vacinas preventivas são reconhecidas como a melhor e com maior

medida de proteção contra patógenos, e Leishmania não é uma exceção.

Contudo, o desenvolvimento de vacinas para leishmaniose tem demonstrado ser

uma tarefa difícil e desafiadora, que pode ser provavelmente devido a

conhecimentos insuficientes da patogênese do parasita e a complexidade da

resposta imune necessária para proteção. Vários novos antígenos estão sendo

avaliados e com a conclusão do genoma de L. major e L. infantum serão, sem

dúvida, descobertos mais candidatos promissores (Kedzierski et al., 2006).

1.5 Os lipossomos Há uma urgente necessidade de se obter um adjuvante eficaz e seguro que

possa promover uma apropriada resposta imunológica às vacinas em programas

de imunização humana. Isto é especialmente verdade para a maioria dos

peptídios sintéticos e vacinas contendo subunidades antigênicas que, em adição,

tornam-se caros ou somente avaliáveis em pequenas quantidades, e podem ser

fracos ou não imunogênicos. Entretanto, adjuvantes imunológicos até agora

avaliados como, por exemplo, adjuvantes incompletos ou completos como o

Freund's, endotoxinas bacterianas, poliânions, adsorventes minerais, induzem

toxicidade local ou sistêmica, formam granulomas, tem pouca eficiência ou tem

efeitos por tempo limitado. Outro possível perigo com alguns adjuvantes é a

apresentação de reações alérgicas às vacinas em alguns casos, principalmente

aqueles que já haviam sido sensibilizados pelo antígeno (Gregoriadis et al., 1993;

Powell & Newman, 1995).

Os lipossomos são tipicamente constituídos de moléculas lipídicas naturais,

biodegradáveis, não tóxicas e não imunogênicas e podem encapsular ou se

ligarem a uma variedade de moléculas que podem ser encontradas associadas à

membrana lipídica ou dentro do lipossomo. Ainda, os lipossomos são fagocitados

por macrófagos e podem, portanto servir como um excelente veículo de liberação

de drogas nestas células (Lasic, 1998).

A propriedade adjuvante imunológica dos lipossomos foi estabelecida

primeira quando uma forte resposta imune humoral a difeteria tóxica

(encapsulada em lipossomos) foi obtida depois de injetadas em camundongos.

Diferentes de outros adjuvantes, não há granulomas no local da injeção (Manesis

et al., 1978; Gregoriadis et al., 1999) e nenhuma reação de hipersensibilidade foi

observada em animais pré-imunizados com antígenos dentro de lipossomos

(Gregoriadis & Allison, 1974). Além disso, lipossomos compostos de fosfolipídios

apropriados (como por exemplo, fosfatidilcolina do ovo) não desenvolve

anticorpos contra seu componente lipídico (Alving, 1991) e não apresenta

nenhum efeito colateral em pacientes injetados repetidamente (Gregoriadis,

1995; Gregoriadis et al., 1999).

Antígenos sozinhos são geralmente fracos imunógenos e requerem um

adjuvante para induzir imunidade protetora. Novamente, uma proteína precisa

não somente ser protegida da degradação extracelular, mas necessita ser

apresentada para as células relevantes do sistema imune. Lipossomos são úteis

como adjuvantes imunológicos para vários antígenos de Leishmania (Kahl et al.,

1989; Sharma et al., 2006; Jaafari et al., 2006). Eles podem induzir respostas

das células T CD4+ e dos linfócitos T citotóxicos (Chikh & Schutze-Redelmeier,

2002). O potencial do adjuvante em relação ao antígeno associado é devido em

parte a eficiência em apresentar o antígeno para as APCs, incluindo macrófagos e

DCs (Nakanishi et al., 1997; Foged et al., 2004). A qualidade da resposta imune

gerada, contudo, depende da ação combinada do antígeno e da natureza física do

lipossomo, incluindo tamanho, composição lipídica e carga na superfície

(Felnerova et al., 2004).

Muitos protocolos de vacinação contra a leishmaniose experimental

utilizando lipossomos como adjuvantes podem ser encontrados na literatura e

muitos deles apresentam resultados promissores. Assim, a obtenção de proteínas

antigênicas ancoradas por GPI da superfície celular de formas promastigotas de

L. amazonensis, associadas à lipossomos, pode indicar uma possível aplicação

desses sistemas miméticos de membranas na preparação de uma vacina contra o

parasita Leishmania.

1.6 Monocamadas de Langmuir

Embora muitas investigações sobre as interações de proteínas com lipídios

usando a técnica de Langmuir sejam relatadas (Gericke et al., 1997; Rosengarth

et al., 1998; Ruano et al., 1998; Wang et al., 1998; Johnson et al., 1998;

Estrela-Lopis et al., 2001), há muito poucos resultados a respeito da natureza

das interações envolvendo proteínas ancoradas por GPI com lipídios (Kloboucek

et al., 1999).

Bicamadas lipídicas, vesículas e monocamadas de Langmuir são os

sistemas biomiméticos mais comumente usados, e cada um têm vantagem

particular dependendo do aspecto da aplicação de interesse (Brockman, 1999;

Maget-Dana, 1999; Ronzon et al., 2002; Brown & Brockman, 2007). Como já

visto, a reconstituição de proteínas de membrana em lipossomos mostrou ser

uma técnica útil para preparar componentes antigênicos para induzir imunidade

em modelos experimentais. Contudo, para compreender a organização de

membranas biológicas e a interação entre proteínas e lipídios, membranas

artificiais são os modelos mais bem usados.

Monocamadas de Langmuir são formadas pelo espalhamento de moléculas

anfifílicas insolúveis, como lipídios, em uma interface ar/água, produzindo filmes

monomoleculares que podem ser comprimidos por meio de barreiras móveis na

interface (Langmuir, 1917; Langmuir, 1937). Elas constituem a metade de uma

bicamada e assim podem também ser usadas como modelos de biomembranas

(Brockman, 1999). Uma importante característica desse sistema é a

possibilidade de estudar densidades superficiais e o empacotamento da superfície

em curvas de pressão (π) - área (A).

Várias substâncias têm influência no empacotamento dos fosfolipídios e na

fluidez da monocamada, como por exemplo, o colesterol. Por isso, a adição de

substâncias capazes de interagir simultaneamente como o fosfolipídio e a

proteína altera a curva π − Α e consequentemente a fluidez da monocamada. Os

efeitos do colesterol em monocamadas de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) são

bem descritos na literatura (Regen, 2002; Róg & Pasenkiewicz-Gierula, 2001;

Dynarowicz-£atka & Hac-Wydro, 2004). Alguns autores observaram um efeito de

condensação manifestado na presença do esterol que pode ser atribuído a uma

formação complexa entre as moléculas, ou um peculiar efeito dos grupos cabeça

polar dos fosfolipídios agindo como guarda-chuvas, protegendo o contato da

porção apolar do colesterol com a água (Dynarowicz-£atka & Hac-Wydro, 2004;

Huang & Feigenson, 1999).

Recentemente têm sido investigadas as interações da fosfatase alcalina

(AP-GPI), uma proteína ancorada por GPI, em sistemas biomiméticos de

membranas tais como monocamadas, para determinar a natureza das interações

da proteína com o lipídio e as relações estrutura-função de tais proteínas

(Brockman, 1999; Maget-Dana, 1999; Ronzon et al., 2002; Caseli et al., 2005).

22.. OObbjjeettiivvooss

2.1 Objetivos Gerais

Obter proteínas ancoradas por GPI das formas promastigotas de L.

amazonensis e reconstituí-las em sistemas de lipossomos.

Especificamente pretendemos:

1. Solubilizar proteínas ancoradas por GPI da superfície celular de formas

promastigotas de L. amazonensis e reconstituí-las em lipossomos,

contendo diferentes proporções de lipídios.

2. Estudar a influência das diferentes proporções de lipídios na incorporação

de proteínas ancoradas por GPI de L. amazonensis em sistemas de

monocamadas.

3. Avaliar o potencial profilático de proteínas antigênicas ancoradas por GPI,

associadas a lipossomos, na indução de resposta imune em camundongos

BALB/c.

4. Analisar os efeitos in vitro na resistência/susceptibilidade à infecção com

L. amazonensis e na produção de NO em culturas de macrófagos

peritoneais murinos, estimulados com as proteínas ancoradas por GPI e

com os sistemas de lipossomos.

33.. MMaatteerriiaall ee MMééttooddooss

Lista de alguns compostos utilizados e procedências

Meio de Cultura Schneider Sigma, USA

Sulfato de Gentamicina Ducto, BR

SFB HyClone, USA

Tris Sigma, USA

Triton X-114 Sigma, USA

PI-PLC Sigma, USA

Padrão de Peso Molecular (20-120 KDa) Sigma, USA

SDS Gibco, USA

Membrana de Nitrocelulose Gibco, USA

Leite em Pó Desnatado Nestlé, BR

3,3’ aminobenzidina Sigma, USA

Biobeads BioRad, USA

DPPC Sigma, USA

Colesterol Sigma, USA

DMPC Sigma, USA

DLPC Sigma, USA

DSPC Sigma, USA

DPPA Sigma, USA

DPPS Sigma, USA

DPPG Sigma, USA

BSA Sigma, USA

Meio de Cultura RPMI 1640 Sigma, USA

HEPES Sigma, USA

Giemsa Sigma, USA

MTT Sigma, USA

Reagente de Griess Sigma, USA

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos da linhagem BALB/c, fêmeas, 8-12

semanas de idade, entre 19-22g e SPF (Specific Patogen Free) obtidos do

Biotério de Criação de Camundongos Isogênicos da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.

3.2 Obtenção e cultivo dos parasitas

Formas amastigotas e promastigotas de Leishmania (Leishmania)

amazonensis IFLA/BR/67/PH8, foram utilizadas a partir de uma cultura original

de promastigotas.

A propagação in vitro das promastigotas de L. amazonensis foi feita em

meio Schneider (Sch) contendo 50 mg/L de sulfato de gentamicina e 10% de

soro fetal bovino (SFB) previamente inativado a 56ºC por 30 minutos.

A cultura inicial foi obtida de camundongos BALB/c previamente infectados

com 106 promastigotas de L. amazonensis pela via subcutânea (s.c.) na pata

traseira. Após 2 meses de infecção, os animais foram sacrificados e as patas

contendo a lesão foram retiradas e mantidas em álcool para a remoção da pele

necrosada. Em seguida, as patas foram maceradas em meio Sch/SFB liberando

as amastigotas de L. amazonensis que foram isoladas e colocadas em meio

Sch/SFB, onde se transformaram em promastigotas. Os parasitas foram

mantidos a 25ºC e repicados por sucessivas passagens.

3.3 Preparação do soro contendo os anticorpos contra os determinantes

imunogênicos de L. amazonensis

Camundongos BALB/c foram infectados pela via s.c. em uma das patas

traseiras com 106 promastigotas de L. amazonensis. Dois meses após a infecção,

o sangue dos animais foi coletado por via retrorbital para a obtenção do soro

contendo os anticorpos contra os determinantes imunogênicos do parasita.

Para analisar o perfil protéico no proteolipossomo, camundongos BALB/c

foram imunizados intraperitonealmente (i.p.) com 40 µg de proteolipossomos e

após 14 semanas de imunização o soro foi coletado por via retrorbital.

3.4 Solubilização de proteínas de membrana ancoradas por GPI de

promastigotas de L. amazonensis

Formas promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de

crescimento, obtidas como descrito anteriormente, foram lavadas e o pellet,

obtido após centrifugação a 1.200 x g durante 10 minutos foi estocado a -20ºC.

O pellet foi ressuspenso em tampão Tris [(hydroxymethyl-)aminomethane]-HCl

(ácido clorídrico) (50 mM, pH 7,25) contendo 2 mM CaCl2 (Cloreto de Cálcio) e

10 mM NaCl (Cloreto de Sódio) e sonicado. Após a ultracentrifugação da

suspensão a 100.000 x g por 1 hora a 4ºC, o sobrenadante foi descartado e o

pellet ressuspenso e ultracentrifugado novamente. O pellet contendo a fração de

membrana (5 mg/mL) foi então ressuspenso na solução tampão Tris-HCl 50mM e

solubilizado em 1% de Triton X-114 (Octylphenoxypoly-ethoxyethanol) em

banho de gelo por 1 hora em constante agitação. O material solubilizado pelo

detergente foi aquecido a 37ºC, permitindo a separação de fases dependente da

temperatura, com as proteínas ancoradas por GPI localizadas na fase do

detergente. As fases aquosa, detergente e pellet, formadas após a separação de

fases foram isoladas e estocadas a -70ºC para posterior análise por SDS-PAGE e

Western Blotting.

3.5 Tratamento com fosfolipase C

O pellet contendo a fração de membrana (2 mg/mL) ressuspendido em

tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,25 e a fase detergente contendo as proteínas

ancoradas por GPI foram tratados com 0,2 U (4 µl/mL) de fosfolipase C

específica para glicosilfosfatidilinositol (PI-PLC) de Bacillus thuringiensis por 1h a

37ºC sob constante agitação. Após, as amostras foram centrifugadas a 100.000

x g por 30 minutos a 4ºC, pellet e sobrenadante foram separados e estocados a -

20ºC para posterior análise por SDS-PAGE e Western Blotting.

3.6 Eletroforese em condição desnaturante [SDS-PAGE (sodium dodecyl

sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)]

Os pesos moleculares das proteínas foram determinados pelo método

descrito por Laemmli (1970). Resumidamente, 5% de poliacrilamida foi utilizada

no gel de empilhamento e 10% no gel de separação. As amostras, tratadas

conforme descritos pelo método de Laemmli (1970), foram levadas ao banho-

maria a 100ºC por 5 minutos e aplicadas no gel. Padrões de massa molecular

(20-120 KDa) foram utilizados em cada gel para determinar a mobilidade relativa

de cada proteína.

Para a visualização das proteínas fracionadas no SDS-PAGE, o gel foi

corado pela prata segundo o método descrito por Blum et al. (1987).

3.7 Western Blotting

As amostras de proteínas foram submetidas à eletroforese em gel de

poliacrilamida, como descrito acima, e transferidas por corrente elétrica para

membranas de nitrocelulose. Após a transferência feita sob voltagem constante

de 100 V a 4ºC por 1 hora, a membrana foi bloqueada com tampão de bloqueio

PBS (salina tamponada com fosfato)/Tween 20 (polyoxyethylenesorbitan

monolaurate) 0,05% contendo 5% de leite em pó desnatado por 1 hora a

temperatura ambiente. Posteriormente, a membrana foi lavada com tampão de

lavagem (PBS/Tween 20 0,05%) e incubada “overnight” com o soro imune

diluído 1:75 em tampão de bloqueio. A membrana foi lavada com tampão de

lavagem e incubada por 1 hora com o anticorpo de cabra anti-IgG de

camundongo conjugado com peroxidase diluído 1:1000 em tampão de lavagem.

A membrana foi revelada com 3,3’ diaminobenzidina (DAB) na concentração de

0,5 mg/mL.

3.8 Remoção do detergente Triton X-114

Para remover o excesso de detergente utilizado para solubilizar as

proteínas ancoradas por GPI, foi utilizada a resina hidrofóbica Biobeads na

proporção 0,07g para cada mililitro de amostra com 2 trocas em banho de gelo.

Após 3 horas de contato, a resina foi trocada e novamente mantida em contato

com a amostra por mais 2 horas. Após a decantação da resina, a suspensão foi

coletada e adicionada ao sobrenadante da mistura contendo lipossomos

conforme descrito a seguir, ou adicionada ao tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,25,

contendo 2 mM CaCl2 e 10 mM NaCl para formar o extrato bruto solubilizado

(EBSGPI) enriquecido com proteínas ancoradas por GPI do parasita.

3.9 Preparação dos lipossomos e dos proteolipossomos contendo as

proteínas de membrana ancoradas por GPI de promastigotas de L.

amazonensis

Os lipossomos constituídos de somente DPPC e DPPC:Colesterol nas

proporções 2,1:1, 1,5:1, 1,2:1 e 0,9:1 (mol:mol), e ainda lipossomos

constituídos por dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dilauroilfosfatidilcolina (DLPC),

distearoilfosfatidilcolina (DSPC), ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA),

dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) na ausência

ou presença do colesterol na razão molar 1,2:1, foram preparados conforme

descrito por Camolezi et al. (2002). Resumidamente, dissolveu-se 1 mg/mL do

fosfolipídio em clorofórmio e posteriormente o clorofórmio foi evaporado através

da passagem de nitrogênio pela solução. Em seguida, o lipídio foi ressuspenso

em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,25, contendo 2 mM CaCl2 e 10 mM NaCl e a

mistura foi mantida a 60ºC por 1 hora, com agitações constantes a intervalos de

10 minutos. Então, a mistura foi sonicada e ultracentrifugada a 100.000 x g por

20 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi estocado a 4ºC e

posteriormente foi utilizado para obter o proteolipossomo.

Para preparação dos proteolipossomos, as amostras de proteínas que

foram obtidas na fase rica em detergente e tratadas com a resina hidrofóbica

Biobeads conforme descrito no item 3.8, para remoção do excesso de

detergente, foram adicionadas ao sobrenadante da mistura acima contendo os

lipossomos. A mistura foi então mantida por 16 horas à temperatura ambiente.

Em seguida, a amostra foi ultracentrifugada a 100.000 x g por 1 h a 4ºC.

Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e o pellet contendo os

proteolipossomos foi ressuspenso ao volume original em tampão Tris-HCl 50 mM,

pH 7,25 contendo 2 mM CaCl2 e 10 mM NaCl.

3.10 Medidas de distribuição de tamanho de partícula por espalhamento

de luz dinâmico

A determinação de distribuição de tamanho de lipossomos e/ou

proteolipossomos foi realizada por espalhamento de luz, usando um Beckman

Coulter submicron particle size analyzer (modelo N5), com cubetas de 1 cm de

caminho óptico. As amostras foram filtradas e diluídas para um adequado índice

de polidispersão. Nos experimentos de espalhamento de luz dinâmico, o

diâmetro médio é determinado a partir do coeficiente de difusão, D, das

vesículas quando estas se movem ao acaso devido ao movimento Brawniano. O

coeficiente de difusão das vesículas é calculado a partir da flutuação da

intensidade da luz espalhada, expressa através do decaimento da função de

correlação:

g(τ) = 1 + e(-2Dq2 τ )

onde g(τ) é função de auto-correlação temporal,

D é o coeficiente de difusão das partículas,

q é o módulo do vetor de espalhamento

q = λΠ4

sen2θ

onde λ é o comprimento de onda da radiação e θ é o ângulo da luz coletada em

relação ao feixe incidente.

A intensidade de luz espalhada é modulada através do movimento

Brawniano das vesículas que se difundem resultando na ampliação da largura da

linha do laser (efeito Doppler). Pelo exame da amplitude espectral da luz

espalhada, o tamanho da vesícula pode ser calculado.

O raio hidrodinâmico pode ser obtido pela equação de Navier-Stokes:

D = h

B

RTK

ηΠ6

onde KB é a constante de Boltzmann

T é a temperatura (kelvin)

η é a viscosidade do solvente

Rh é o raio hidrodinâmico

3.11 Preparação do gradiente isopícnico de densidade de sacarose

Um gradiente contínuo de sacarose foi preparado (1 – 15% de sacarose

em tampão Tris-HCl 50 mM contendo 2 mM CaCl2 e 10 mM NaCl, com a

densidade variando de 3.0 to 10.6 g/mL), utilizando-se para a montagem do

mesmo um Gradient Maker. As amostras de proteolipossomos, lipossomos e

proteínas ancoradas por GPI solúveis (0,5 mL) foram aplicadas no gradiente e

ultracentrifugadas a 180.000 x g durante 4 horas a 4oC. Os gradientes foram

fracionados (0,5 mL) e analisados para proteínas e fosfato inorgânico conforme

descrito por Chen et al. (1956).

3.12 Dosagem de proteínas

As concentrações de proteínas foram determinadas pelo método descrito

por Hartree (1972) na presença de 2 % de dodecil sulfato de sódio (SDS)

utilizando-se como padrão a albumina de soro bovino (BSA).

Especificamente, para a determinação da concentração protéica das

frações de proteolipossomos obtidas após a centrifugação em gradiente de

sacarose foi empregado o método descrito por Read e Northcote (1981),

utilizando-se também BSA como padrão.

3.13 Dosagem de fosfato inorgânico

O fosfato inorgânico liberado pela hidrólise dos fosfolipídios foi quantificado

utilizando-se o procedimento descrito por Chen et al. (1956). Alíquotas de 0,3

mL da amostra foram tratadas com 0,5 mL de ácido nítrico 65 % a temperatura

de 120ºC até a completa secagem. Em seguida, as alíquotas foram ressuspensas

em 0,5 mL de água destilada e misturadas com 1,0 mL do reagente (1 parte de

ácido ascórbico 10 % para 6 partes da solução de molibdato de amônio 3,4 mM e

ácido sulfúrico 0,45 mM). Em seguida, as amostras foram mantidas por 20

minutos em banho-maria a 45ºC e submetidas à análise espectrofotométrica,

utilizando-se um comprimento de onde de 820 nm. A determinação da

concentração de fosfato inorgânico foi estimada a partir da regressão linear dos

valores obtidos.

Para a obtenção da curva padrão. Foram utilizadas concentrações de 5 a

80 nM de fosfato preparado a partir de uma solução estoque de dihidrogênio

fosfato de sódio 1,0 mM.

3.14 Dosagem de colesterol

As concentrações de colesterol foram determinadas pelo método descrito

por Higgins (1987), utilizando-se como padrão uma solução de colesterol 0,01 %

em ácido acético glacial.

Após a completa secagem das alíquotas através da passagem de uma

corrente de nitrogênio pela solução foi adicionado 1,5 mL de ácido acético glacial

e 0,5 mL de uma solução constituída de cloreto de ferro hexa-hidratado 2,5 %

em ácido ortofosfórico 85 % diluído 12,5 vezes em ácido sulfúrico concentrado.

Após 10 minutos de incubação, as amostras foram submetidas à análise

espectrofotométrica utilizando-se um comprimento de onda de 550 nm.

3.15 Imunização de camundongos com os proteolipossomos e avaliação

da proteção contra a infecção com L. amazonensis

Grupos de cinco camundongos BALB/c foram imunizados com tampão Tris-

HCl (50 mM, pH 7,25 contendo 10 mM NaCl e 2 mM CaCl2), lipossomos (200 µL),

proteínas ancoradas por GPI solubilizadas com Triton X-114 (EBSGPI) (5 µg) ou

proteolipossomos (5, 10, 20 e 40 µg de proteínas ancoradas por GPI

incorporadas nesses sistemas). Após três semanas, os animais foram desafiados

com 104 formas promastigotas de L. amazonensis de fase estacionária de

crescimento. O desafio foi feito por via s.c. na pata traseira direita de cada um

dos camundongos e o tamanho da lesão foi avaliado semanalmente. As patas

traseiras dos animais foram medidas com o auxílio de um paquímetro de

resolução 0,02 mm (Starrett, cat. # 125MEA-6/150, Brasil) e o tamanho da lesão

foi calculado pela diferença de tamanho entre a pata direita e a pata esquerda. O

tamanho da lesão foi representado pela média ± SE das diferenças obtidas em

cada camundongo.

Para que o EBSGPI fosse utilizado nesses ensaios, a retirada do detergente

foi necessária conforme descrito no item 3.8.

3.16 Monocamadas de Langmuir: isotermas π - A e cinética de adsorção

Monocamadas contendo as misturas de DPPC:Colesterol nas proporções

2,1:1, 1,5:1, 1,2:1 e 0,9:1 foram preparadas a uma temperatura de 24 ± 0,5ºC,

em uma cuba de Langmuir (Insight-Brasil). Para cada proporção lipídica foi

espalhado 1 mg/mL da mistura lipídica em 125 mL de solução tampão (50 mM

Tris-HCl, pH 7,25 contendo 10 mM NaCl e 2 mM CaCl2) presente na cuba. Após,

a monocamada foi comprimida até a pressão de 30 mN/m e uma pequena

alíquota da solução de proteína (0,05 µg/mL), previamente tratada com a resina

Biobeads como descrito no item 3.8, foi injetada na subfase próxima da

interface, e os valores de π foram monitorados em função do tempo.

3.17 Obtenção, cultivo e estimulação de macrófagos peritoneais murinos

Camundongos isogênicos BALB/c foram sacrificados por deslocamento

cervical. Com auxílio de seringa estéril descartável, injetou-se 15 mL de solução

de PBS estéril suplementada com gentamicina no peritôneo do camundongo; o

abdômen do animal foi massageado e a pele rebatida. Novamente introduziu-se

a seringa na cavidade peritoneal do animal para retirada do exsudato,

armazenando-o em frasco imerso em banho de gelo. O exsudato foi centrifugado

a 7.000 x g por 10 minutos a 4°C, e posteriormente ressuspendido em meio

RPMI 1640 (suplementado com 10% de SFB, 20mM de bicarbonato de sódio,

10mM de tampão HEPES e 25 µg/mL de sulfato de gentamicina) e o número de

células foi contado em câmara de Neubauer (Boeco, Alemanha). Foi plaqueado 1

x 106 macrófagos/mL em placas de cultura de 24 poços (Corning, TRP),

incubando-os por 4 horas a 37ºC (estufa incubadora com 21% O2, 5% CO2).

Após, os macrófagos foram estimulados com 50 µL/mL de lipossomos, 5 µg/mL

de EBSGPI e 1 µg/mL proteolipossomos por 20 horas e posteriormente infectados

com formas amastigotas de L. amazonensis conforme descrito a seguir.

3.18 Infecção das culturas de macrófagos com L. amazonensis

As culturas de macrófagos peritoneais murinos estimuladas com os

diferentes tratamentos conforme descrito anteriormente, foram infectadas com 3

amastigotas para cada macrófago e incubadas por 1 hora a temperatura

ambiente. Após este período o meio de cultura foi retirado e adicionou-se meio

de cultura fresco. As culturas foram então incubadas em estufa úmida a 5% CO2,

21% O2 a 37ºC por 24 horas.

Para a avaliação do número de células, de parasitas e a porcentagem de

infecção, as lamínulas com os macrófagos aderidos e infectados foram fixadas

em metanol (10 min) e coradas com Giemsa (10 min) (Giorgio & Barão, 1998) e

avaliados em microscópio óptico.

3.19 Avaliação da viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos

A viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos, estimulados com os

lipossomos, EBSGPI e proteolipossomos como descrito no item 3.17, foi

determinada através do teste do MTT (3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil

brometo tetrazolina). Os macrófagos foram cultivados e então estimulados com

os diferentes tratamentos (lipossomos ou proteolipossomos) conforme descrito

no iten 3.17, e incubados em estufa úmida a 5% CO2, 21% O2 a 37ºC por 48

horas. Já para o EBSGPI, as culturas de macrófagos (2 x 105 células/ 100 µL)

foram estimuladas com 5 µg/100µL de EBSGPI e mantidas em estufa úmida (5%

CO2, 21% O2 a 37ºC) por 20 horas. A seguir, o meio de cultura foi retirado e

adicionou-se meio de cultura novo, para remover o excesso de Triton X-114, e as

culturas foram novamente incubadas por 24 horas a 5% CO2, 21% O2 a 37ºC.

Em cada poço foi adicionado o MTT (1,6 mg de MTT/mL de meio RPMI 1640 sem

SFB), e as placas foram então incubadas a 37ºC por 4h. Após este período, foi

retirado todo o meio de cultura e adicionou-se isopropanol com um volume igual

ao volume inicial do meio de cultura. Logo após a adição do isopropanol, a

viabilidade celular foi medida em diferentes comprimentos de ondas conforme

metodologia descrita por Mosmann (1983).

3.20 Análise da produção de nitrito

Macrófagos peritoneais murinos foram cultivados em meio RPMI 1640 a

uma concentração de 1 x 106 células/mL. Os sobrenadantes das culturas

celulares estimuladas com os lipossomos, EBSGPI e proteolipossomos conforme

descrito no item 3.17, foram coletados após 20 horas de estímulo e congelados a

-20ºC.

A produção de óxido nítrico foi dosada indiretamente pela concentração de

seu metabólito no meio de cultura (nitrito), pelo método de Griess (Green et al.,

1984). Resumidamente, os sobrenadantes foram descongelados e um volume de

150 µL foi colocado em placa de 96 poços (Corning, TRP), adicionando-se igual

quantidade de reagente de Griess. As placas foram incubadas a temperatura

ambiente por 15 minutos e a quantificação colorimétrica foi realizada em 540 nm

em leitor de ELISA. A curva padrão foi feita com nitrito.

3.21- Análise estatística

Foi utilizada a análise de 1 via (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey. Os

valores foram considerados estatisticamente diferentes quando o valor de p era

menor ou igual a 0,05. O teste estatístico foi realizado no software GraphPad

Prism 5.

44.. RReessuullttaaddooss

4.1 Solubilização das proteínas ancoradas por GPI da membrana de L.

amazonensis utilizando o detergente Triton X-114.

Para se obter as proteínas ancoradas por GPI presentes na superfície das

formas promastigotas do parasita, frações de membranas foram solubilizadas

com 1% do detergente não iônico Triton X-114, que tem sido frequentemente

utilizado para obter preparações enriquecidas com proteínas ancoradas por GPI

de homogeinados celulares. Esse procedimento separa as proteínas em três

frações de acordo com a sua solubilidade. Após a separação de fases dependente

da temperatura, conforme descrito no item 3.4 de Material e Métodos, as

proteínas ancoradas por GPI são recuperadas na fase rica em detergente

enquanto que proteínas solúveis encontradas na fase aquosa e outras proteínas

que não foram solubilizadas pelo detergente formando um pellet, foram

removidas. A média de recuperação das proteínas ancoradas por GPI na fase rica

em detergente foi de 8%.

Para visualizar as proteínas presentes nas diferentes fases após o

tratamento com o detergente, foi realizada a eletroforese em condição

desnaturante. O perfil eletroforético das proteínas de membrana da superfície de

L. amazonensis mostrou um limitado número de componentes variando de 20 a

66 KDa (Figura 3). Ainda, o perfil eletroforético das proteínas ancoradas por

GPI mostrou uma maior intensidade das bandas entre 65-45 KDa

aproximadamente (Figura 3, coluna d). Como proteínas ancoradas por GPI

podem ser facilmente identificadas por tratamento com PIPLC, nós utilizamos

essa enzima a fim de se comprovar a presença dessas proteínas ancoradas

solubilizadas e recuperadas na fase rica em detergente. Como podemos

observar, quando tratamos a fase rica em detergente (0,2 mg/mL de proteína

total) com 0,2 U/mL de PI-PLC de B. thuringiensis, análises por eletroforese

mostraram similares resultados entre as amostras da fase rica em detergente e

as amostras tratadas com PI-PLC (Figura 3, colunas d e e,

respectivamente).

A fim de verificar se o tratamento da fração de membrana com o

detergente Triton X-114 alteraria a atividade antigênica das proteínas, foi

realizado um Western Blotting. A Figura 4 mostra a análise das proteínas que

foram solubilizadas pelo detergente e posteriormente submetidas à separação de

fases a 20ºC com o soro contendo os anticorpos contra os determinantes

imunogênicos de L. amazonensis. Como podemos observar o material

solubilizado não apresentou alteração significativa na ligação com o anticorpo

(Figura 4, coluna d).

Uma vez determinadas as condições adequadas para a solubilização das

proteínas ancoradas por GPI da superfície de L. amazonensis, foram realizados

estudos sistemáticos para definir a melhor condição para a incorporação dessas

proteínas em lipossomos.

Figura 3. Eletroforese em condição desnaturante (SDS-PAGE) e coloração pela

prata. (a) fração de membrana de formas promastigotas. Alíquotas de 0,5 mg/mL de

fração de membrana foram incubadas por 1 hora em banho de gelo com o Triton X-114

conforme descrito no item 3.4 de Material e Métodos: (b) pellet contendo membrana; (c)

fase aquosa; (d) fase rica em detergente. Uma alíquota da fase rica em detergente foi

tratada com PI-PLC e (e) corresponde ao sobrenadante após tratamento conforme

descrito no item 3.5 de Material de Métodos. Padrão de massa molecular em KDa.

66

45

36

24

20

a b c d e

Figura 4. Análise por Western Blotting das proteínas da superfície de

promastigotas de L. amazonensis. (a) fração de membrana de formas promastigotas.

Alíquotas de 0,5 mg/mL de fração de membrana foram incubadas por 1 hora em banho

de gelo com o Triton X-114 conforme descrito no item 3.4 de Material e Métodos: (b)

pellet contendo membrana; (c) fase aquosa; (d) fase rica em detergente. Uma alíquota

da fase rica em detergente foi tratada com PI-PLC e (e) corresponde ao sobrenadante

após tratamento conforme descrito no item 3.5 de Material de Métodos.

a b c d e

66

45

29

36

4.2 Preparação dos lipossomos e proteolipossomos e suas

caracterizações.

Para preparar os lipossomos e os proteolipossomos diferentes proporções

lipídicas contendo DPPC:Colesterol (2,1:1, 1,5:1, 1,2:1 e 0,9:1) (mol:mol) ou

somente DPPC e 0,0625 mg/mL de proteínas ancoradas por GPI solubilizadas

pelo Triton X-114 foram preparados conforme descrito no item 3.9 de Material e

Métodos.

Na Tabela I, observamos que lipossomos foram formados em todas as

condições estudadas, mas a incorporação das proteínas ancoradas só ocorreu na

presença do colesterol, alcançando um máximo de incorporação (57 ± 4 %)

quando foi utilizada a proporção molar 2,1:1 de DPPC:Colesterol (Figura 5).

Podemos observar ainda que o aumento da quantidade de colesterol não

aumentou significativamente a adsorção das proteínas (Figura 5).

O aumento da quantidade de colesterol não afetou expressivelmente o

diâmetro hidrodinâmico dos lipossomos, medido através do espalhamento de luz,

como indicado na Tabela I. Contudo, após incorporação das proteínas ancoradas

o diâmetro dos proteolipossomos foi aproximadamente 2 vezes maior que dos

lipossomos (Tabela I).

Diâmetro (nm) DPPC:Colesterol

razão (mol/mol) Lipossomo Proteolipossomo

1,0:0 99,4 ± 8 Não forma

2,1:1 78,7 ± 12 204,0 ± 13

1,5:1 71,8 ± 9 178,0 ± 21

1,2:1 82,7 ± 13 224,0 ± 41

0,9:1 82,5 ± 11 197,0 ± 15

Tabela I. Composição lipídica (razão em mol) e diâmetro médio (nm)

dos lipossomos e proteolipossomos preparados conforme descrito em

Material e Métodos.

O diâmetro dos lipossomos e dos proteolipossomos foi determinado em seis diferentes preparações (média ± SD).

2,14:1 1,5:1 1,2:1 0,9:1

45

54

63

P

rote

ína i

nco

rpo

rad

a (

%)

Lipossomos (DPPC:Colesterol mol:mol)

Figura 5. Efeito das diferentes razões molares dos lipossomos constituídos de

DPPC:Colesterol na incorporação de proteínas ancoradas por GPI de

promastigotas de L. amazonensis. Alíquotas de 0,0625 mg/mL de proteínas

ancoradas por GPI solubilizadas com o Triton X-114, foram incubadas overnight com os

lipossomos nas diferentes razões molares. A porcentagem de proteína incorporada foi

acompanhada pela dosagem de proteínas no pellet e no sobrenadante, conforme descrito

no item 3.9 de Material e Métodos.

Um passo importante para alcançar um alto rendimento na incorporação das

proteínas ancoradas por GPI nesses sistemas vesiculares é o estudo da

composição lipídica mais adequada. Portanto, para verificar se variações na

composição lipídica poderiam alterar a incorporação dessas proteínas, utilizamos

além de DPPC outros lipídios que apresentam diferentes grupos cabeça polar

(DPPS, DPPG e DPPA) ou então que apresentam variações no comprimento da

cadeia de ácidos graxos (DLPC, DMPC e DSPC) na presença ou ausência de

colesterol.

Quando fomos avaliar a formação de lipossomos e proteolipossomos

utilizando fosfolipídios com diferentes grupos cabeça polar, observamos a

formação de lipossomos em todas as condições estudadas, alcançando um maior

diâmetro (126,5 ± 6 e 115,8 ± 6 nm) com o fosfolipídio DPPS, que apresenta

carga negativa na sua superfície (Tabela II e III, respectivamente). Não

observamos a incorporação das proteínas ancoradas por GPI da superfície do

parasita na ausência do colesterol (Tabela II). Contudo, podemos observar um

aumento de aproximadamente 3 vezes no diâmetro dos proteolipossomos após

incorporação das proteínas nos lipossomos constituídos pelos diferentes

fosfolipídios na presença do colesterol (Tabela III).

Tabela II. Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos

preparados com fosfolipídios com diferentes grupos cabeça polar na

ausência do colesterol.

a em pH 7,25

(*) Não forma proteolipossomos

O diâmetro dos lipossomos e dos proteolipossomos foi determinado em três diferentes

preparações (média ± SD).

Fosfolipídio (1 mg/mL)

DPPG DPPS DPPA DPPC

Carga do Fosfolipídioa -1 -1 -1 0

Diâmetro dos Lipossomos

(nm)

87,7 ± 4 126,5 ± 6 73,9 ± 4 82,7 ± 13

Diâmetro dos

Proteolipossomos (nm)

* * * *

Incorporação de proteína

(%)

0 0 0 0

Tabela III. Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos

preparados com fosfolipídios com diferentes grupos cabeça polar na

presença do colesterol.

*em pH 7,25. O diâmetro dos lipossomos e dos proteolipossomos foi determinado em três diferentes preparações (média ± SD).

Fosfolipídío:Colesterol

1,2:1 (razão em mol)

DPPG:Col DPPS:Col DPPA:Col DPPC:Col

Carga do Fosfolipídio* -1 -1 -1 0


(nm)

78,1 ± 4 115,8 ± 6 80,5 ± 4 82,7 ± 13

Diâmetro dos


398,6 ± 20 386,1 ± 19 388,8 ± 19 224,0 ± 41


(%)

48,5 ± 2 49,3 ± 2 43,6 ± 2 51,0 ± 2

Fomos avaliar também se lipossomos constituídos de fosfolipídos, que

apresentam diferentes tamanhos na cadeia hidrocarbônica, influenciariam a

formação dos proteolipossomos. As Tabelas IV e V mostram que em todas as

condições estudadas, podemos verificar a formação de lipossomos, apresentando

um maior diâmetro (124,9 ± 6 nm) para o fosfolipídio DSPC que apresenta 18

carbonos na sua cadeia hidrocarbônica. Novamente, não observamos a

incorporação das proteínas ancoradas por GPI da superfície do parasita na

ausência do colesterol (Tabela IV).

Também, não observamos diferenças significativas na incorporação das

proteínas ancoradas por GPI nos diferentes lipossomos estudados, mostrando

uma eficiente incorporação das proteínas ancoradas por GPI da superfície de L.

amazonensis nesses sistemas (Tabela V). Podemos observar ainda que durante

a formação do proteolipossomo constituído de DSPC:Colesterol houve um

aumento de aproximadamente 5 vezes no seu tamanho (Tabela V).

A partir desses resultados, padronizamos uma metodologia de obtenção de

proteolipossomos utilizando-se DPPC:Colesterol sempre na proporção molar

1,2:1. Essa relação escolhida apresentou eficiente incorporação de proteínas

ancoradas por GPI (51,0 ± 2 %) (Figura 5), além de se mostrarem muito

estáveis mesmo após quinze dias de preparo. Ainda, como podemos observar na

Tabela I, a presença do colesterol foi um fator limitante para formação dos

proteolipossomos e uma maior concentração de colesterol pode, portanto facilitar

a incorporação de proteínas ancoradas, assim como já relatado na literatura e

como observado nos experimentos realizados com monocamadas de Langmuir.

Tabela IV. Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos

preparados com fosfolipídios com diferentes tamanhos de cadeias

hidrocarbônicas na ausência do colesterol.

(*) Não forma proteolipossomos

O diâmetro dos lipossomos e dos proteolipossomos foi determinado em três diferentes preparações (média ± SD).

Fosfolipídio (1 mg/mL)

DLPC DMPC DPPC DSPC

Comprimento da cadeia

Hidrocarbônica

12 14 16 18


(nm)

69,7 ± 3 99,3 ± 5 82.7 ± 13 124,9 ± 6

Diâmetro dos


* * * *


(%)

0 0 0 0

Tabela V. Diâmetro médio (nm) dos lipossomos e proteolipossomos

preparados com fosfolipídios com diferentes tamanhos de cadeias

hidrocarbônicas na presença do colesterol.

O diâmetro dos lipossomos e dos proteolipossomos foi determinado em três diferentes preparações (média ± SD).

Fosfolipídío:Cholesterol

1,2:1 (razão em mol)

DLPC:Col DMPC:Col DPPC:Col DSPC:Col

Comprimento da cadeia

Hidrocarbônica

12 14 16 18


(nm)

69,7 ± 3 99,3 ± 5 82.7± 13 124,9 ± 6

Diâmetro dos


240,4 ± 12 205,5 ± 10 224,0 ± 41 575,2 ± 29


(%)

46,9 ± 2 45,8 ± 2 51,0 ± 2 52,2 ± 3

Em adição, o perfil eletroforético revelou uma variedade de proteínas com

uma distribuição similar entre as amostras do EBSGPI e as amostras dos

proteolipossomos (Figura 6A, coluna b e c, respectivamente), indicando

incorporação não seletiva das proteínas do parasita nesses lipossomos.

Ainda, na Figura 6B podemos observar o potencial desses sistemas

vesiculares em induzir a produção de anticorpos contra as proteínas de L.

amazonensis. Para isso, cinco camundongos da linhagem BALB/c foram

inoculados pela via i.p. com 40 µg de proteínas ancoradas por GPI incorporadas

nos proteolipossomos, preparados com DPPC:Colesterol na razão 1,2:1

(mol:mol). A Figura 6B mostra o Western Blotting do EBSGPI previamente

separado por eletroforese, transferido para uma membrana de nitrocelulose e

imunocorado com o anticorpo secundário acoplado a peroxidase. Como podemos

observar, as bandas protéicas foram reconhecidas pelos anticorpos presentes no

soro de camundongos imunizados com proteolipossomos, indicando que tanto o

EBSGPI quanto esses sistemas vesiculares apresentam atividade imunogênica

(Figura 6B, coluna b e c).

A B Figure 6. (A) Eletroforese em condição desnaturante (SDS-PAGE) e coloração

pela prata. (P) Padrão de massa molecular em KDa. (a) fração de membrana de

promastigotas de L. amazonensis; (b) EBSGPI e (c) proteínas presentes nos

proteolipossomos. (B) Western Blotting. (a) Fração de membrana de promastigotas de

L. amazonensis. Análise do EBSGPI (b) e das proteínas presentes nos proteolipossomos

(c) com soro coletado 14 semanas após imunização i.p. de camundongos BALB/c com 40

µg de proteolipossomos.

a b c

66

45

36

24

20

P a b c

4.3 Caracterização dos proteolipossomos preparados com

DPPC:Colesterol.

Para caracterizar o grau de incorporação das proteínas ancoradas por GPI

de L. amazonensis nos proteolipossomos, foi realizada uma centrifugação em

gradiente de densidade de sacarose, e as frações foram analisadas para seus

conteúdos protéicos e de fosfato inorgânico. Na Figura 7A, as frações contendo

os lipossomos apresentaram um pico correspondente ao conteúdo de fosfato

inorgânico ao redor de 4% de sacarose. Já para as frações contendo o EBSGPI,

podemos observar a presença de proteínas na região média do gradiente, na

faixa de 8-10% de sacarose (Figura 7B). Finalmente, os proteolipossomos

mostraram um único pico e ao redor de 6% de sacarose (Figura 7C). Esses

picos únicos, correspondentes ao conteúdo de fosfato inorgânico e proteínas,

indicam uma eficiente incorporação durante a reconstituição das proteínas

presentes no EBSGPI nos sistemas de lipossomos.

Figura 7. Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. (A) lipossomos,

(B) EBSGPI e (C) proteolipossomos. Análise espectrofotométrica: (ο) proteína, utilizando-

se comprimento de onda de 595 nm e (●) lipídio, utilizando-se comprimento de onda de

820 nm; (■) porcentagem de sacarose determinada por refratometria.

Ab

sorb

ân

cia

Saca

rose

(%

)

Frações

Ab

sorb

ân

cia

Saca

rose

(%

)

Frações

4.4 Avaliação da incorporação de proteínas ancoradas por GPI de L.

amazonensis em monocamadas de Langmuir.

Para investigar a influência da fluidez da membrana na incorporação das

proteínas ancoradas por GPI da superfície do parasita, foram feitos experimentos

de penetração da proteína em monocamadas utilizando a mistura lipídica

DPPC:Colesterol em diferentes proporções molares (2,1:1, 1,5:1, 1,2:1 e 0,9:1).

A Figura 8 mostra as isotermas da pressão superficial x área obtidas

usando DPPC puro e na presença de diferentes razões molares DPPC:Colesterol.

Podemos observar na isoterma obtida para o DPPC puro a característica transição

de fase de líquido expandido (LE) para líquido condensado (LC) representado por

um platô ao redor de 10 mN/m e uma área limitante ao redor de 60 Å2.

Entretanto, essa região característica de transição de fase observada para as

monocamadas constituídas de DPPC puro foi eliminada na presença do colesterol

(Figura 8). Ainda, observamos que a área mínima observada para a

monocamada de DPPC puro (60 Å2) diminui para 50 e 43 Å2 quando utilizamos

monocamadas mistas de DPPC:Colesterol nas razões molares 1,5:1 e 0,9:1,

respectivamente (Figura 8). O inserto na Figura 8 mostra que o módulo

compressional (Cs-1), correspondente à isoterma, exibe mais pronunciadamente

a influência do aumento de colesterol na composição mista das monocamadas.

Esses resultados denotam alterações na fluidez promovida pela presença do

colesterol, uma vez que maiores conteúdos de colesterol resultam em

monocamadas mais condensadas.

Figura 8. Curva pressão superficial x área molecular (π-A) para as diferentes

monocamadas. (___) DPPC puro; (---) DPPC:Colesterol razão molar 1,5:1 e (……) DPPC:Colesterol razão molar 0,9:1. Inserto: Cs-1 valores correspondentes as isotermas.

As isotermas foram feitas a 24±0.5 °C, em uma cuba de Langmuir como descrito no item

3.16 de Material e Métodos, pelo espalhamento de 1mg/mL da solução lipídica em

solução tampão constituída por 50mM Tris-HCl, pH 7,25 contendo 10mM NaCl e 2mM

CaCl2. Os experimentos foram realizados em triplicatas e as curvas representam os

valores médios.

Área molecular (Å2)

Pre

ssão

Su

perf

icia

l (m

N/

m)


Cs

-1(m

N/

m)


Pre

ssão

Su

perf

icia

l (m

N/

m)


Cs

-1(m

N/

m)

Mudanças na pressão superficial após injeção das proteínas ancoradas por

GPI, como mostra a Figura 9, representa a cinética da penetração da proteína

nas monocamadas constituídas de DPPC puro e na presença de diferentes

proporções de DPPC:Colesterol. A flecha em 30 mN/m em 10 segundos

representa o ponto de injeção. A monocamada lipídica de Langmuir foi pré-

formada e comprimida até a pressão superficial atingir 30 mN/m. Esse

empacotamento lipídico foi escolhido devido a equivalência com o

empacotamento lipídico de uma biomembrana. Ainda, podemos assumir que os

efeitos de difusão são os mesmos, já que a injeção foi feita no mesmo ponto e o

volume total foi o mesmo para todas as condições estudadas.

A injeção de proteínas ancoradas por GPI de L. amazonensis em

monocamadas constituídas por somente DPPC (Figura 9) causa um rápido

aumento na pressão superficial, que permanece constante por quase 8 minutos,

ao redor de 42 mN/m. Após esse tempo, a pressão superficial diminui

exponencialmente, alcançando valores mais baixos que os iniciais. A Figura 9

também mostra a incorporação das proteínas ancoradas por GPI em

monocamadas mistas de DPPC:Colesterol. Quando a proporção molar 1,5:1 de

DPPC:Colesterol foi usada, após 1 minuto da injeção da proteína o aumento na

pressão superficial ocorreu em passos ou escadas (durante 30 segundos),

permanecendo constante por aproximadamente 30 minutos, ao redor de 47

mN/m.

Figura 9. Cinética da adsorção de proteínas ancoradas por GPI da superfície de

formas promastigotas de L. amazonensis, em monocamadas a 30mN/m como

descrito em Material e Métodos. As monocamadas são constituídas por: (___) somente

DPPC, (---) DPPC:Colesterol razão molar 1.5:1 e (……) DPPC:Colesterol razão molar 0,9:1.

Após a estabilização da pressão superficial, uma pequena alíquota da solução da

proteínas ancoradas por GPI do parasita (0,0625 mg/mL), previamente tratada com

Biobeads, foi injetada (como indicada pela flecha) na subfase próxima da interface, e a

pressão superficial foi monitorada em função do tempo. Os experimentos foram

realizados em triplicata e as curvas representam os valores médios.

Tempo de Adsorção (s)

Pres

são

Super

fici

al (

mN

/m)

Tempo de Adsorção (s)

Pres

são

Super

fici

al (

mN

/m)

Por outro lado, quando a razão molar 0,9:1 DPPC:Colesterol foi usada,

após um retardo no tempo de aproximadamente 20 segundos, observamos um

aumento na pressão superficial ocorrendo em um único passo e permanecendo

constante logo após 40 segundos, ao redor de 40 mN/m. Entretanto,

contrastando com a curva obtida para monocamadas constituídas de somente

DPPC, a pressão superficial nas monocamadas mistas de DPPC:Colesterol não

diminui após 40 minutos (Figura 9). Para um menor conteúdo de colesterol nas

monocamadas mistas, como ocorre na razão molar 1,5:1 DPPC:Colesterol, o

atraso no tempo muda para 50 segundos e o equilíbrio da pressão superficial

ultrapassa 45 mN/m (Figura 9).


camundongos BALB/c: Primeira imunização com os proteolipossomos.

Após caracterização dos proteolipossomos constituídos de DPPC:Colesterol

na razão molar de 1,2:1, eficientemente incorporado com proteínas ancoradas

por GPI (51,0 ± 2 % de incorporação) da superfície de formas promastigotas do

parasita, fomos testar uma possível atividade protetora dessa preparação. Para

isso, camundongos da linhagem BALB/c foram imunizados com tampão Tris-HCl

(50 mM, pH 7,25 contendo 10mM NaCl e 2mM CaCl2), lipossomos, 20 µg/animal

do EBSGPI e 5, 10 e 20 µg/animal de proteolipossomos. Estas proporções sempre

estão relacionadas com a quantidade de proteína presente nas amostras

administradas, ou seja, 20 µg de extrato protéico (EBSGPI) por animal ou 5, 10 e

20 µg de proteína incorporada no proteolipossomo por animal. Os camundongos

receberam uma imunização e após três semanas foram desafiados por via s.c. na

pata traseira direita com 104 formas promastigotas de L. amazonensis.

A Figura 10 mostra o desenvolvimento das lesões características da

leishmaniose na pata traseira dos camundongos imunizados com o tampão,

lipossomos ou com 5 µg de proteolipossomos, e como podemos observar até a

6ª semana todos os grupos de camundongos imunizados apresentaram o mesmo

padrão de crescimento da pata. Contudo, podemos observar que a partir da 7ª

semana os grupos de camundongos imunizados com os lipossomos ou com os

proteolipossomos apresentaram diferenças significativas no tamanho da lesão,

apresentando lesões (aproximadamente 58 e 20 %, respectivamente) menores

quando comparado ao grupo de camundongos que receberam somente tampão

(Figura 10).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

1

2

3

4

5

6

7

T

am

an

ho

da l

esã

o (

mm

)

semanas

tampão lipossomos 5 µg de proteolipossomos

Figura 10. Tamanho da lesão das patas de camundongos BALB/c imunizados por

via i.p. com tampão, 200 µL de lipossomos ou com 5 µg de proteolipossomos e

desafiados com 104 promastigotas de L. amazonensis. Os camundongos receberam

uma imunização e após três semanas foram desafiados por via s.c. na pata traseira

direita. A medida e o cálculo do tamanho da lesão das patas foram feitos como descritos

no item 3.15 de Material de Métodos.

Ainda, o grupo imunizado com os lipossomos manteve essa diferença

significativa no crescimento da pata até a 16ª semana. Contudo, o grupo

imunizado com os proteolipossomos não mostra mais diferenças significativas no

desenvolvimento da lesão a partir da 11ª semana após infecção (Figura 10).

Quando fomos avaliar outras concentrações de proteolipossomos (10 e 20

µg) podemos observar que os grupos imunizados com esses sistemas

apresentaram o mesmo padrão de crescimento da pata quando comparado ao

grupo de animais imunizados com proteolipossomos em concentração menor (5

µg). O grupo imunizado com 10 µg de proteolipossomos apresentou uma

diferença significativa de cerca de 20 % no tamanho da pata quando comparado

ao grupo imunizado com o tampão (Figura 11). Contudo, uma maior diferença

significativa foi observada quando grupos de animais foram imunizados com 20

µg de proteolipossomos, mostrando uma diferença de aproximadamente 60 %

no tamanho da lesão quando comparado ao grupo que foi imunizado com o

tampão (Figura 12).

Novamente, a partir da 11ª semana essas diferenças diminuem até atingir

o mesmo padrão de desenvolvimento das lesões do grupo imunizado com o

tampão (Figura 11 e 12).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

1

2

3

4

5

6

7

8

T

am

an

ho

da l

esã

o (

mm

)

semanas

tampão 10 µg de proteolipossomos


via i.p. com tampão ou com 10 µg de proteolipossomos e desafiados com 104

promastigotas de L. amazonensis. Os camundongos receberam uma imunização e

após três semanas foram desafiados por via s.c. na pata traseira direita. A medida e o

cálculo do tamanho da lesão das patas foram feitos como descritos no item 3.15 de

Material de Métodos.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

1

2

3

4

5

6

T

am

an

ho

da l

esã

o (

mm

)

semanas

tampão 20 µg de proteolipossomos


via i.p. com tampão ou com 20 µg de proteolipossomos e desafiados com 104

promastigotas de L. amazonensis. Os camundongos receberam uma imunização e

após três semanas foram desafiados por via s.c. na pata traseira direita. A medida e o

cálculo do tamanho da lesão das patas foram feitos como descritos no item 3.15 de

Material de Métodos.

Os resultados apresentados nas Figuras 10, 11 e 12 sugerem que as

imunizações dos camundongos com os lipossomos ou com os proteolipossomos

parecem retardar o aparecimento das lesões nas patas desses animais. Contudo

esses tratamentos não foram suficientes para manter a proteção por períodos

mais longos de infecção com o parasita, tornando-se insignificantes no final do

experimento, indicando assim que concentrações maiores de proteolipossomos

podem ser necessárias.

Ainda, os animais do grupo que foram imunizados com 20 µg de EBSGPI

morreram após 10 minutos de imunização. Esses resultados sugerem um

possível efeito tóxico do detergente ou até mesmo das proteínas que estão

presentes no EBSGPI. Contudo, serão necessários estudos com menores

concentrações desse tratamento.


camundongos BALB/c: Segunda imunização com os proteolipossomos.

Na tentativa de buscar uma melhor proteção com os proteolipossomos,

decidimos variar as concentrações do EBSGPI e dos proteolipossomos. Novamente

para isso, camundongos da linhagem BALB/c foram imunizados com tampão

Tris-HCl (50 mM, pH 7,25 contendo 10mM NaCl e 2mM CaCl2), lipossomos, 5

µg/animal do EBSGPI e 40 µg/animal de proteolipossomos. Contudo, devido a

grande dificuldade em se obter quantidades suficientemente altas de

proteolipossomos não conseguimos utilizar mais de uma concentração para esses

experimentos. Os camundongos receberam uma imunização e após três semanas

foram desafiados por via s.c. na pata traseira direita com 104 formas

promastigotas de L. amazonensis.

Na Figura 13, podemos observar que até a 7ª semana todos os grupos de

camundongos apresentaram o mesmo padrão de desenvolvimento das lesões nas

patas, e a partir da 8ª semana uma pequena diferença já pode ser observada no

tamanho das patas dos grupos imunizados com o EBSGPI e com os

proteolipossomos. A partir da 9ª semana, podemos observar que os

camundongos imunizados com o EBSGPI ou com os proteolipossomos mostraram

uma proteção de cerca de 60 e 50 %, respectivamente, no desenvolvimento da

lesão das patas, quando comparados aos animais que receberam tampão

(Figura 13). Essas diferenças apresentadas pelos grupos tratados com o EBSGPI

ou com os proteolipossomos se mantiveram até o final do experimento.

0 2 4 6 8 10 12 14

0

1

2

3

4

5

6

Tampão Lipossomos 5 µg de EBS 40 µg de Proteolipossomos

tam

an

ho

da l

esã

o (

mm

)

semanas


via i.p. com tampão, 200 µL de lipossomos, EBSGPI ou com proteolipossomos e

desafiados com 104 promastigotas de L. amazonensis. Os camundongos receberam

uma imunização e após três semanas foram desafiados por via s.c. na pata traseira

direita. A medida e o cálculo do tamanho da lesão das patas foram feitos como descritos

no item 3.1 de Material de Métodos.

Ainda, não observamos diferenças significativas entre os grupos

imunizados com o tampão e os grupos imunizados com os lipossomos até a 11ª

semana de infecção. A partir da 12ª semana de infecção os grupos tratados com

os lipossomos começam a apresentar uma discreta diferença significativa (20 %)

no tamanho da lesão quando comparado ao grupo que recebeu tampão,

chegando a apresentar uma maior proteção (aproximadamente 36%) na 13ª

semana de infecção (Figura 13).

A Figura 14 mostra a lesão dos animais inoculados com tampão,

lipossomos, 5 µg de EBSGPI e 40 µg de proteolipossomo. Esses animais foram

fotografados quando estavam com treze semanas de infecção. Como podemos

observar, os animais imunizados com o EBSGPI ou com o proteolipossomo

apresentaram um menor tamanho da lesão nas patas traseiras infectadas com o

parasita L. amazonensis.


via i.p. com tampão (controle), 200 µL de lipossomos, 5 µg de EBSGPI ou com 40

µg de proteolipossomos e desafiados com 104 promastigotas de L. amazonensis.

Os camundongos receberam uma imunização e após três semanas foram desafiados por

via s.c. na pata traseira direita. As imagens foram feitas quando os animais estavam com

treze semanas de infecção após a imunização.

Controle Lipossomo

EBS Proteolipossomo

Controle Lipossomo

EBS Proteolipossomo

4.7 Avaliação dos efeitos dos diferentes tratamentos na infecção de

macrófagos peritoneais murinos com formas amastigotas de L.

amazonensis.

Para avaliar um possível efeito dos diferentes tratamentos estudados, na

infecção de macrófagos peritoneais murinos com formas amastigotas de L.

amazonensis, as células foram estimuladas com 50 µL/mL de lipossomos, 5

µg/mL de EBSGPI ou 1 µg/mL de proteolipossomos durante 20 horas e

posteriormente infectadas com o parasita conforme descrito no item 3.18 de

Material e Métodos.

Para comprovar que as células foram eficientemente infectadas com o

parasita, avaliamos a porcentagem de células infectadas após 1 hora de infecção,

tempo necessário para que o macrófago fagocite o parasita. Nas Figuras 15 e

16 podemos observar que não há diferenças significativas na porcentagem de

infecção e nem no número de parasitas por células quando estimuladas com os

diferentes tratamentos e comparadas com as células controles que não

receberam nenhum estímulo.

Na Figura 15, podemos observar significativas diminuições na

porcentagem de macrófagos infectados e estimulados com os diferentes

tratamentos após 24 horas de infecção. Quando fomos analisar os efeitos dos

lipossomos na infecção de macrófagos, observamos que a porcentagem de

infecção foi significativamente menor (cerca de 42%) nas células estimuladas

com lipossomos após 24 horas quando comparadas as células controles que

apresentaram cerca de 70 % de infecção (Figura 15). O mesmo resultado pode

ser observado quando avaliamos o número de amastigotas por células.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0

15

30

45

60

75

ProteolipossomoEBSLipossomocontrole

P

orc

en

tag

em

de c

élu

las

infe

ctad

as (

%)

Figura 15. Efeitos de diferentes tratamentos em macrófagos peritoneais

murinos infectados com amastigotas de L. amazonensis. Macrófagos peritoneais

(1x106cel/mL) foram estimulados com 50µL/mL de lipossomos, 5µg/mL de EBSGPI ou

1µg/mL de proteolipossomos por 20 horas e posteriormente infectados com amastigotas

na proporção 3:1 (parasita: célula) e mantidos em estufa úmida a 20,8% O2, 5% CO2 e

N2 atmosférico durante 1h ou 24h. A porcentagem de células infectadas foi determinada

em lamínulas coradas com Giemsa. Diferenças significativas entre controle, lipossomo,

EBSGPI e proteolipossomo após 24 horas de infecção. ***P < 0,001.

1h de infecção

24h de infecção

***

***

***

Macrófagos estimulados com os lipossomos apresentaram uma diminuição

significativa no numero de parasitas por células (cerca de 29 %) após 24 horas

quando comparadas às células controle (Figura 16). Ainda, células estimuladas

com os proteolipossomos (1 µg/mL) também apresentaram uma diminuição

significativa (cerca de 39 %) na porcentagem de infecção quando comparadas as

células controle após 24 horas de infecção (Figura 15), e uma diminuição

significativa (cerca de 32 %) no número de parasitas por células (Figura 16).

Contudo, quando avaliamos o efeito do EBSGPI na infecção de macrófagos

peritoneais, observamos uma drástica diminuição (cerca de 99 %) no número de

células infectadas após 24 horas de infecção com o parasita quando comparada

as células controles (Figura 15). Novamente, o mesmo efeito foi observado com

relação ao número de parasita por célula (cerca de 99 %) quando comparado ao

controle (Figura 16).

Estes resultados sugerem que macrófagos, estimulados com lipossomos,

EBSGPI ou proteolipossomos durante 20 horas, foram capazes de reduzirem a

porcentagem de infecção e conduzirem a destruição de amastigotas

intracelulares de L. amazonensis pelo macrófago.

Como podemos observar na Figura 17, fotografias das culturas de

macrófagos peritoneais murinos que foram estimuladas com os diferentes

tratamentos e infectadas com amastigotas de L. amazonensis, mostram redução

na porcentagem de células infectadas.

0

5

10

15

20

25

30

ProteolipossomoEBS Lipossomocontrole

P

ara

sita

s p

or

célu

las


murinos infectados com amastigotas de L. amazonensis. Macrófagos peritoneais

(1x106cel/mL) foram estimulados com 50µL/mL de lipossomos, 5µg/mL de EBSGPI ou

1µg/mL de proteolipossomos por 20 horas e posteriormente infectados com amastigotas

na proporção 3:1 (parasita: célula) e mantidos em estufa úmida a 20,8% O2, 5% CO2 e

N2 atmosférico durante 1h ou 24h. O número de parasitas por célula foi determinado em

lamínulas coradas com Giemsa. Diferenças significativas entre controle, lipossomo,

EBSGPI e proteolipossomo após 24 horas de infecção. **P < 0,01. ***P < 0,001.

1h de infecção

24h de infecção

**

***

**


murinos infectados com amastigotas de L. amazonensis. (A) Macrófagos

peritoneais (1x106cel/mL) que não receberam nenhum tratamento, e macrófagos

peritoneais (1x106cel/mL) que foram estimulados com (B) 50µL/mL de lipossomos, (C)

5µg/mL de EBSGPI ou (D) 1µg/mL de proteolipossomos por 20 horas e posteriormente

infectados com amastigotas na proporção 3:1 (parasita: célula) e mantidos em estufa

úmida a 20,8% O2, 5% CO2 e N2 atmosférico durante 1h ou 24h. ( ) Macrófago

infectado com o parasita. As lamínulas foram coradas com Giemsa (400x).

A B

C D

4.8 Análise da produção de óxido nítrico (NO).

Considerando-se que o NO é uma das principais substâncias envolvidas

nos efeitos leishmanicidas de macrófagos ativados com INF-γ e LPS (Linares et

al., 2000), avaliamos sua produção em macrófagos estimulados com 50 µL/mL

de lipossomos, 5 µg/mL de EBSGPI ou 1 µg/mL de proteolipossomos que, como já

observado, reduziram a carga parasitária. Avaliamos a concentração de nitrito no

sobrenadante dessas culturas pelo método de Griess.

Como podemos observar na Figura 18, baixos níveis de nitrito são

produzidos pelas células controles que não receberam nenhum estímulo (0,015

µM). Contudo, quando culturas de macrófagos foram estimuladas com

lipossomos podemos observar um aumento significativo de aproximadamente 46

% na quantidade de nitrito presente no sobrenadante dessas culturas quando

comparado às culturas controles (Figura 18). Culturas de macrófagos

estimuladas com EBSGPI apresentaram uma maior produção de nitrito no seu

sobrenadante (0,042 µM) quando comparada as culturas controles (0,015 µM)

(Figura 18). Ainda, culturas estimuladas com os proteolipossomos também

mostraram um aumento significativo na produção de nitrito nos seus

sobrenadantes (cerca de 40 %) quando comparadas às culturas controles

(Figura 18).

O aumento na produção de nitrito (Figura 15) observado nos

sobrenadantes das culturas que foram estimuladas com os diferentes

tratamentos sugere que esses estímulos podem estar ativando as células, o que

pode conduzir a um maior efeito leishmanicida dos macrófagos.

1 2 3 4 5 6 7 8

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

ProteolipossomoEBSLipossomoControle

Nit

rito

(µM

)

Figura 18. Produção de nitrito em culturas de macrófagos peritoneais murinos

estimulados com diferentes tratamentos. Macrófagos peritoneais (1x106cel/mL)

foram estimulados com 50µL/mL de lipossomos, 5µg/mL de EBSGPI ou 1µg/mL de

proteolipossomos foram mantidos em estufa úmida a 21% O2, 5% CO2 e N2 atmosférico

durante 20h. Após, o sobrenadante das amostras de células foram utilizados para

análises da concentração de nitrito através do método de Griess conforme item 3.20 de

Materiais e Métodos. Diferenças significativas entre controle, lipossomo, EBSGPI e

proteolipossomo. *P < 0,05. ***P < 0,001.

*

***

*

4.9 Análise da viabilidade de macrófagos peritoneais murinos

estimulados com lipossomos, EBSGPI e proteolipossomos.

Considerando que o número de macrófagos infectados é reduzido quando

estes foram estimulados com os diferentes tratamentos durante 20 horas

(Figura 15), decidimos avaliar se isto ocorreu devido a uma diminuição do

número de célula nas culturas estimuladas com lipossomos, EBSGPI ou

proteolipossomos. Para tanto, utilizamos o ensaio do MTT para analisar a

viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos estimulados com 50 µL/mL de

lipossomos, 5 µg/mL de EBSGPI ou 1 µg/mL de proteolipossomos durante 48

horas de estímulo.

As Figuras 19 e 20 mostram que todas as culturas que foram

estimuladas não apresentaram uma menor viabilidade quando comparadas com

as culturas controles que não receberam nenhum estímulo. Como podemos

observar na Figura 20, uma viabilidade significativamente menor foi observada

para as culturas estimuladas com o EBSGPI quando comparada com as culturas

controles. Contudo, mesmo apresentando uma menor viabilidade podemos

observar que o tratamento não apresentou um efeito extremo tóxico nessas

culturas. De acordo com esses resultados, podemos sugerir que os lipossomos, o

EBSGPI e os proteolipossomos durante o período de estímulo não exerceram um

efeito tóxico nos macrófagos peritoneais murinos.

1 2 3 4 5 6

0,2

0,4

0,6

0,8

ProteolipossomoLipossomoControle

D

en

sid

ad

e ó

pti

ca (

57

0n

m -

69

0n

m)

Figura 19. Efeitos de diferentes tratamentos na viabilidade de macrófagos

peritoneais murinos. Macrófagos peritoneais (1x106cel/mL) foram estimulados com

50µL/mL de lipossomos ou 1µg/mL de proteolipossomos e mantidos em estufa úmida a

21% O2, 5% CO2 e N2 atmosférico durante 48 horas. A viabilidade foi avaliada pelo teste

do MTT conforme descrito no item 3.19 de Material e Métodos.

1,0 1,5

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Controle EBS

D

en

sid

ad

e ó

pti

ca (

57

0 -

69

0 n

m)

Figura 20. Efeitos das proteínas ancoradas por GPI na viabilidade de

macrófagos peritoneais murinos. Macrófagos peritoneais (2x105cel/100µL) foram

estimulados 5µg/100µL de EBSGPI e mantidos em estufa úmida a 21% O2, 5% CO2 e N2

atmosférico durante 20 horas. Após, o meio de cultura foi retirado e adicionou-se meio

de cultura novo, e as culturas foram mantidas por mais 24 horas em estufa úmida a 21%

O2, 5% CO2 e N2 atmosférico. A viabilidade foi avaliada pelo teste do MTT conforme

descrito no item 3.19 de Material e Métodos. Diferenças significativas entre controle e

EBSGPI. ***P < 0,001.

***

55.. DDiissccuussssããoo

A membrana plasmática dos parasitas tem um importante papel nos

processos de infecções. As proteínas da superfície celular e/ou glicoproteínas têm

um importante papel estrutural e estão envolvidas em diferentes processos, tais

como adsorção, transporte de nutrientes, reconhecimento celular e escape (De

Souza, 1995). Portanto, proteínas e glicoproteínas da membrana do parasita são

os principais alvos para uma efetiva resposta imune, e por isso, muito utilizadas

na preparação de vacinas. Algumas vacinas são constituídas por patógenos

irradiados ou atenuados quimicamente (Daneshvar et al., 2003). A atenuação da

virulência apresenta certo risco, pois existe a possibilidade dos agentes

patogênicos atenuados sofrerem reativação ou mesmo escapar ao tratamento.

Esses riscos são importantes devido à capacidade que muitos organismos têm de

produzir doenças graves.

Uma alternativa que é empregada com sucesso é o isolamento de

compostos, particularmente proteínas, da membrana de agentes patogênicos e a

sua reconstituição em lipossomos (Daghastanli et al., 2004; Santos et al., 2006;

Jaafari et al., 2007). Por esses processos, tenta-se preservar as características

estruturais desejáveis para sua antigenicidade, sem o perigo da patogenicidade.

Como as técnicas utilizadas para isolar e purificar as proteínas de

membranas são bastante drásticas, podendo causar a desorganização da

estrutura nativa da proteína, a principal preocupação nesses estudos é a de

preservar a estrutura protéica e, consequentemente, a sua função, para que

estas não sejam alteradas ou perdidas, após os procedimentos de solubilização e

purificação (le Maire et al., 2000).

Uma maneira de impedir a desnaturação dessas proteínas é reincorporá-

las em uma estrutura que mimetize a membrana plasmática, um processo

conhecido como reconstituição (Rigaud, 2002). A reconstituição de proteínas de

membrana em lipossomos revelou-se uma alternativa viável para a preparação

de componentes antigênicos visando a indução de imunidade (imunogenicidade)

em animais de experimentação (Leserman, 2004). Além de preservar a estrutura

nativa das proteínas, os lipossomos apresentam a vantagem de conferir

atividade adjuvante nas vacinas contra vários patógenos (Laing et al., 2006;

Daghastanli et al., 2004; Santos et al., 2006).

Como os componentes da membrana da Leishmania estão associados com

a sua patogenicidade, acredita-se que a geração de uma resposta imune contra

esses componentes possa levar ao desenvolvimento de uma imunoprofilaxia

contra a leishmaniose (Sacks & Nobentrauth, 2002). Nesse trabalho nós

utilizamos formas promastigotas de L. amazonensis como fonte de antígenos

para estudos de interações com sistemas miméticos de membranas e para a

preparação de uma possível vacina contra a leishmaniose. Proteínas ancoradas

por GPI da superfície desse parasita são responsáveis por mediar essenciais

interações parasita-hospedeiro, e por essa razão essas proteínas têm sido

amplamente utilizadas como possíveis candidatas à vacina. Há vários trabalhos

na literatura utilizando proteínas ancoradas por GPI, principalmente a gp63 da

superfície de promastigotas de Leishmania, na tentativa de induzir imunidade

contra a leishmaniose utilizando como adjuvante os lipossomos, com altas taxas

de proteção (Jaafari et al., 2006, 2007; Afrin et al., 2002; Bhowmick et al.,

2008). Contudo, a maioria desses autores utiliza a forma recombinante ou

purificada dessa proteína ancorada por GPI da superfície do parasita. Não há

relatos na literatura da utilização de um pool de proteínas ancoradas por GPI de

promastigotas de L. amazonensis incorporadas em lipossomos como um possível

candidato a vacinas. Por essa razão, nós padronizamos uma metodologia rápida

e eficaz para obtenção de proteínas ancoradas por GPI da superfície de formas

promastigotas de L. amazonensis utilizando o detergente não iônico Triton X-

114. Uma vez solubilizadas, fomos verificar a interação dessas proteínas com

sistemas miméticos de membrana e, com isso, verificar se os proteolipossomos

eram capazes de proteger camundongos isogênicos contra a leishmaniose

cutânea experimental.

Para se obter as proteínas ancoradas por GPI da superfície do parasita,

preparações foram solubilizadas em Triton X-114, que tem sido frequentemente

utilizado para obter preparações enriquecidas com proteínas ancoradas por GPI

de homogeinados celulares totais. Uma característica dessas preparações que

utilizam o Triton X-114 é a separação de fases dependente de temperatura, onde

proteínas anfipáticas integrais da membrana e proteínas ancoradas por GPI são

recuperadas na fase detergente enquanto que as proteínas hidrofílicas não

ligadas à membrana são recuperadas na fase aquosa.

Análise por SDS-PAGE das proteínas da membrana do parasita

demonstrou a presença de um limitado número de componentes variando de 20

a 66 KDa (Figura 3). Várias repetições revelaram um padrão bem estabilizado e

reprodutível de obtenção das proteínas ancoradas por GPI. Isto indica a

credibilidade dessa metodologia de separação e sua reprodutibilidade para se

obter especificamente frações ricas em proteínas ancoradas por GPI.

Observamos ainda a presença de proteínas com aproximadamente 65-60, 52 e

50-47 kDa (Figura 3) da superfície do parasita como já descrito por outros

autores (Hernandez et al., 1981; Araújo-Soares et al., 2003; Rojas et al., 2008).

Além disso, proteínas ancoradas por GPI podem ser facilmente

identificadas por tratamentos com PI-PLC, que hidrolisa a ligação fosfodiéster

produzindo diacilglicerol e um fosfato cíclico inositol no motivo glicosil

remanescente da proteína (Cardoso de Almeida & Heise, 1993). Nós utilizamos

PI-PLC de B. thuringiensis para confirmar se essas proteínas solubilizadas da

superfície do parasita eram realmente ancoradas por GPI, e análises por SDS-

PAGE mostraram similares resultados entre as amostras recuperadas da fase rica

em detergente e as amostras tratadas com PI-PLC (Figura 3, colunas d e e,

respectivamente). Esses resultados sugerem perda do motivo lipídico

covalentemente ligado, indicando que essas proteínas são ancoradas na

membrana através de um domínio GPI.

Ainda, o tratamento das frações de membranas com o detergente Triton

X-114 não afetou de forma considerável a capacidade de ligação das proteínas

solubilizadas com os anticorpos gerados contra os determinantes antigênicos de

L. amazonensis (Figura 4, coluna d). Assim, uma vez padronizada a

metodologia de solubilização das proteínas ancoradas por GPI da superfície do

parasita, fomos avaliar a interação dessas proteínas com os sistemas miméticos

de membrana.

Em ordem, para preparar os lipossomos e proteolipossomos, diferentes

proporções molares de diferentes lipídios e 0,0625 mg/mL de proteínas

ancoradas por GPI foram usados (Tabelas I, II, III, IV e V). Lipossomos foram

formados em todas as condições estudadas, mas a incorporação das proteínas só

ocorre na presença do colesterol, alcançando um máximo de incorporação (57 ±

4 %) quando a razão molar DPPC:Colesterol 2,1:1 foi usada. Observamos ainda

que o aumento da concentração de colesterol não aumenta a incorporação das

proteínas nesses sistemas (Figura 5).

O aumento da quantidade de colesterol na mistura também não afetou o

diâmetro hidrodinâmico dos lipossomos, como indicado na Tabela I, III e V.

Contudo, após incorporação das proteínas o diâmetro dos proteolipossomos foi

aproximadamente 2, 3 e até mesmo 5 vezes maior do que os lipossomos

(Tabela I, III e V, respectivamente). A incorporação de proteínas em

sistemas miméticos de membrana depende de muitos fatores, mas

principalmente do tamanho da cadeia hidrocarbônica dos ácidos graxos e do tipo

de cabeça polar dos fosfolipídios componentes dos lipossomos, como descrito

para proteínas antigênicas da membrana de Pasteurella multocida (Camolezi et

al., 2002; Daghastanli et al., 2004). Contudo, em nosso trabalho observamos

que variações no tamanho da cadeia hidrocarbônica ou no grupo cabeça polar

dos diferentes fosfolipídios estudados não influenciaram a porcentagem de

incorporação das proteínas ancoradas por GPI de L. amazonensis nesses

sistemas (Tabela III e V).

O SDS-PAGE dos proteolipossomos constituídos de DPPC:Colesterol

revelou uma variedade de proteínas com uma distribuição similar a observada

para as proteínas solubilizadas pelo Triton X-114, indicando uma incorporação

não seletiva das proteínas ancoradas por GPI do parasita nos lipossomos

(Figura 6A, coluna b e c, respectivamente). Nossos resultados indicam que

proteínas ancoradas por GPI do parasita são eficientemente incorporadas em

proteolipossomos contendo diferentes lipídios em associação com o colesterol.

Para caracterizar o grau de incorporação dessas proteínas nos

proteolipossomos, foi feita uma centrifugação em gradiente de densidade de

sacarose e observamos que um pico para o fosfato inorgânico, originado da

hidrólise ácida do lipídio, foi encontrado ao redor de 4 % de sacarose,

correspondente às frações contendo os lipossomos (Figura 7A). Já para o

EBSGPI, um pico pode ser observado na faixa de 8-10 % de sacarose (Figura

7B) e finalmente um pico único ao redor 6 % de sacarose para as frações que

continham os proteolipossomos (Figura 7C). Assim, proteolipossomos

mostraram um único perfil simétrico de eluição, como detectado pela estimação

do fosfato e proteínas, indicando uma distribuição notavelmente homogenia do

sistema e uma consistente ausência de outros agregados de lipídios-proteínas.

Além disso, esses sistemas aparecem em baixas densidades provavelmente

devido ao seu conteúdo de colesterol, como já descrito por outros autores (Cevc

& March, 1987). Nossos resultados claramente indicam que o método utilizado

pode conduzir a uma eficiente reconstituição das proteínas em lipossomos.

Algumas proteínas se associam preferencialmente com microdomínios da

membrana plasmática ricos em colesterol, conhecidos como lipid rafts (Almeida

et al., 2005). As proteínas ancoradas por GPI são preferencialmente localizadas

nesses domínios. Denny et al. (2001) demonstraram que essas regiões estão

presentes em Leishmania.

Por essa razão, através de estudos utilizando monocamadas fomos

verificar a influência da fluidez da membrana, associada ao conteúdo de

colesterol, na incorporação das proteínas ancoradas por GPI da superfície do

parasita. Para isso, utilizamos monocamadas de Langmuir constituídas da

mistura lipídica DPPC:Colesterol em diferentes razões molares (2,1:1, 1,5:1,

1,2:1 e 0,9:1). Como mostra a Figura 8, isotermas obtidas para monocamadas

constituídas por somente DPPC apresentaram uma típica transição de fase (LE

para LC) representada por um platô ao redor de 10 mN/m e uma área limitante

ao redor de 60 Å2. Essa área, relativamente menor do que a descrita por outros

autores, pode ser atribuída à composição do tampão presente na subfase. Ainda,

essa transição de fase observada para as monocamadas de DPPC foi eliminada

na presença do colesterol. Essa observação é amplamente atestada na literatura

para outras composições derivadas de fosfatidilcolina e colesterol (Dynarowicz-

£atka & Hac-Wydro, 2004; Chapman et al., 1969). Esse efeito do colesterol na

pressão superficial é provavelmente uma conseqüência do maior caráter anfifílico

do colesterol comparado com o DPPC.

Alterações na área molecular mostrada na Figura 8, onde observamos

que a área mínima para a monocamada de DPPC puro (60 Å2) diminui para 50 e

43 Å2 quando utilizamos monocamadas mistas de DPPC:Colesterol nas razões

molares 1,5:1 e 0,9:1 respectivamente, denotam alterações na fluidez

promovida pela presença do colesterol, uma vez que maiores conteúdos de

esteróis resultam em uma monocamada mais condensada.

A cinética da penetração da proteína nas monocamadas constituídas de

DPPC puro e na presença de diferentes proporções de DPPC:Colesterol, mostrou

mudanças na pressão superficial após injeção das proteínas ancoradas por GPI

(Figura 9). A injeção de proteínas ancoradas por GPI de L. amazonensis em

monocamadas constituídas por somente DPPC causa um rápido aumento na

pressão superficial, que permaneceu constante por quase 8 minutos, ao redor de

42 mN/m. Após esse tempo, a pressão superficial diminui exponencialmente,

alcançando valores mais baixos que os iniciais.

Essa seqüência de rápido aumento, seguida por uma contínua diminuição

na pressão superficial já foi relatada na literatura para adsorção da fosfatase

alcalina, que também é ancorada por GPI, em um fosfolipídio carregado

negativamente em altas pressões superficiais (Caseli et al., 2003). Entretanto,

neste caso, a mudança resultante na pressão superficial, (∆π = πeq - πin) foi

quase zero, que é interpretada por outros autores (Ronzon et al., 2002) como a

ausência da penetração da proteína dentro da monocamada em elevadas

pressões superficiais. Por outro lado, Caseli et al. (2008) concluiu que a adsorção

da enzima fosfatase alcalina tem um comportamento semelhante a um pistão.

Após que, o motivo polipeptídio da proteína se organiza na subfase, mantendo

somente a ancora GPI na interface, causa a diminuição observada na pressão

superficial.

Contudo, com base nos resultados obtidos, nós podemos afirmar que a

interação das proteínas ancoradas por GPI com monocamadas constituídas de

somente DPPC ocorre pelo menos em dois passos: primeiro, a rápida penetração

da proteína, devido à diluição/precipitação, a qual causa uma transiente

reorientação das cadeias hidrofóbicas do fosfolipídio; o segundo passo, contudo,

difere do observado por Caseli et al. (2008), já que o equilíbrio da pressão

superficial é menor do que o medido para monocamadas contendo somente

DPPC. Há duas possibilidades para explicar esse resultado: a proteína é de fato

pelo menos parcialmente incorporada causando uma expansão da monocamada,

aumentando a fluidez e diminuindo a pressão superficial ou, por outro lado, há

também a possibilidade que algumas moléculas de fosfolipídios serem removidas

da monocamada e solubilizadas em uma grande fase pela interação com a

âncora da proteína. Esta segunda explicação é corroborada com a não formação

dos proteolipossomos quando utilizamos os lipossomos constituídos por somente

DPPC (Tabela I).

Ainda, a Figura 9 mostrou a incorporação das proteínas em

monocamadas mistas de DPPC:Colesterol e observamos que quando a proporção

molar 1,5:1 de DPPC:Colesterol foi usada, após 1 minuto da injeção da proteína

o aumento na pressão superficial ocorreu em passos ou escadas (durante 30

segundos), permanecendo constante por aproximadamente 30 minutos, ao redor

de 47 mN/m (Figura 9). Estágios iniciais da adsorção, na qual nós observamos

algumas oscilações nos valores da pressão superficial, são provavelmente devido

ao processo de reorganização das proteínas ancoradas na interface. Embora

esses platôs possam estar associados a reorientações ou mudanças

conformacionais das proteínas, isto não é comum e provavelmente pode ser que

eles estejam associados com a adsorção de diferentes frações de proteínas, de

acordo com seus pesos moleculares.

Por outro lado, observamos um retardo no aumento da pressão superficial

e um único passo após injeção da proteína, que permaneceu constante logo após

40 segundo ao redor de 40 mN/m, quando uma razão molar de 0,9:1

DPPC:Colesterol foi usada. Contudo, a pressão superficial para as monocamadas

mistas não diminui após 40 minutos comparada a monocamada com somente

DPPC. Nós podemos concluir, baseado nos efeitos do colesterol, que a

penetração inicial das proteínas ancoradas por GPI nas monocamadas mistas é

facilitada em monocamadas mais condensada (alto conteúdo de colesterol)

implicando em um retardo no tempo de adsorção. Isso já foi anteriormente

relatado que polipeptídios não ancorados interagem unicamente com os grupos

cabeças polares dos lipídios através de interações eletrostáticas e sem

penetração na monocamada, não afetando a pressão superficial (Demel et al.,

1973). Entretanto, a mudança na área por molécula de fosfolipídio observada

para DPPC:Colesterol e DPPC:Colesterol:Proteína ancorada (Figura 8 e 9,

respectivamente) sugerem que o empacotamento molecular do DPPC em altas

densidades superficiais é influenciada pela presença do colesterol e permite a

inserção das GPIs e estabilização.

As diferenças observadas para os efeitos do aumento da concentração do

colesterol nas isotermas das monocamadas de DPPC:Colesterol (Figura 8),

reforçam a importância da âncora GPI para a adsorção da proteína nas

monocamadas de fosfolipídios. Realmente, grandes mudanças na pressão

superficial são esperadas ocorrerem para macromoléculas hidrofílicas como é o

caso quando a âncora de GPI é removida (Caseli et al., 2003), confirmando que

a ausência do motivo diacilglicerol na proteína resulta em uma menor atividade

superficial. A presença da âncora hidrofóbica é aparentemente envolvida no

empacotamento das moléculas de fosfolipídios, e este processo é dependente do

estado da monocamada e da presença de uma apropriada composição para

permitir a adsorção da GPI e estabilização.

Após caracterização dos proteolipossomos e avaliações das interações das

proteínas ancoradas por GPI da superfície do parasita com monocamadas, fomos

avaliar a atividade protetora desses sistemas de proteolipossomos. Para isso

camundongos da linhagem suscetível BALB/c foram imunizados através da via

i.p. com tampão, lipossomos, EBSGPI e proteolipossomos e após três semanas da

imunização eles foram desafiados por via s.c. com 104 formas promastigotas de

L. amazonensis e acompanhamos semanalmente o desenvolvimento das lesões

características da leishmaniose cutânea experimental.

Como observamos na Figura 10, camundongos que foram imunizados

com lipossomos apresentaram proteção por aproximadamente 15 semanas

quando comparado ao grupo imunizado com o tampão, contudo, a partir da 16ª

semana essa proteção foi diminuída até se tornar insignificante no final do

experimento. Ainda, os animais que receberam 5, 10 ou 20 µg de

proteolipossomos tiveram um comportamento semelhante ao observado para o

grupo que foi imunizado com os lipossomos. Novamente, os animais que

receberam os proteolipossomos com as diferentes concentrações apresentaram

proteção até aproximadamente a 12ª semana quando a partir daí, essa proteção

foi diminuindo até se tornar insignificante no final do experimento (Figuras 10,

11 e 12). Para tentar melhorar essa proteção conferida pelos proteolipossomos,

nós decidimos aumentar a concentração dos proteolipossomos.

Embora lipossomos vazios apresentarem uma parcial proteção em

camundongos imunizados com esse sistema, essa proteção foi significativamente

menor quando comparado aos grupos de animais que foram imunizados com 5

µg de EBSGPI e 40 µg de proteolipossomos (Figura 13). Contudo, não

observamos um aumento significativo da capacidade adjuvante dos

proteolipossomos, uma vez que, como observado na Figura 13, animais

imunizados com o EBSGPI apresentaram uma maior proteção (cerca de 60 %) do

que a encontrada para animais imunizados com os proteolipossomos (cerca de

50 %).

Segundo alguns autores, antígenos sozinhos são geralmente fracos

imunógenos e requerem um adjuvante para induzir imunidade protetora. A

qualidade da resposta imune gerada, contudo, depende da ação combinada do

antígeno e da natureza física dos lipossomos (Felnerova et al., 2004; Bhowmick

et al., 2007). Vários trabalhos na literatura mostram significativos níveis de

proteção à leishmaniose utilizando proteínas da superfície de Leishmania

associadas com adjuvantes, tais como os lipossomos. Uma proteína bastante

estudada como um possível alvo para vacinas é a gp63, que está envolvida em

vários eventos relacionados com a interação parasita-hospedeiro. Segundo

Jaafari et al. (2006), o crescimento da pata de camundongos BALB/c imunizados

com a gp63 recombinante (rgp63) associada a lipossomos, diminuiu

significativamente após desafio com promastigotas de L. major. Por outro lado, o

crescimento da pata diminuiu parcialmente em camundongos imunizados com a

rgp63 sozinha.

Imunizações de camundongos BALB/c utilizando a proteína nativa gp63

purificada e incorporada em lipossomos protegeram significativamente todos os

animais contra infecções progressivas com L. donovani (Bhowmick et al., 2008).

Contudo, resultados conflitantes foram relatados em modelos experimentais

usando a gp63 purificada e diferentes adjuvantes (Rivier et al., 1999).

Antígenos solúveis totais de formas promastigotas de Leishmania

associados a lipossomos também estão sendo usados para imunizar

camundongos, alcançando altos níveis de proteção (70 - 87 %) contra infecções

com o parasita (Afrin et al., 2002; Afrin & Ali, 1997; Bhowmick et al., 2007;

Mazumdar et al., 2004). Por outro lado, em estudos realizados por Gurunathan

et al. (1998), vacinação de camundongos BALB/c com antígenos solúveis e LACK

recombinante mais a IL-12 recombinante, falharam em controlar a infecção

quando os animais foram desafiados com L. major 12 semanas após imunização.

Similarmente, proteção por longo tempo contra leishmaniose cutânea não foi

demonstrada em camundongos C57BL/6 quando estes foram imunizados com

antígenos do parasita e IL-12 recombinante (Méndez et al., 2001).

Como podemos observar há muitos trabalhos utilizando proteínas da

superfície do parasita associadas a lipossomos, com altas taxas de proteção.

Contudo, não há dados na literatura relacionados à proteção de camundongos

suscetíveis utilizando um pool de proteínas ancoradas por GPI da superfície de

promastigotas de L. amazonensis associadas a lipossomos constituídos por

DPPC:Colesterol, como utilizado em nosso trabalho.

Ainda, as proteínas ancoradas por GPI utilizadas em nossos estudos,

mostraram ser fortes imunógenos e induziram parcial proteção (60 %) na

ausência do adjuvante em camundongos imunizados e posteriormente desafiados

com o parasita (Figura 13). Resultados similares a esse também já foram

observados por outros autores. Jaafari et al. (2006) mostraram que rgp63

sozinha em PBS sem nenhum imunoadjuvante pode induzir uma resposta

positiva em camundongos vacinados e proteger parcialmente contra

promastigotas de L. major. Também, antígenos solúveis na ausência de

adjuvantes foram imunogênicos, resultando em uma proteção parcial, sugerindo

que estas moléculas podem ter uma inerente atividade adjuvante (Afrin & Ali,

1997; Ali & Afrin, 1997). Nesses trabalhos o nível de proteção é aumentado

quando essas proteínas são incorporadas a lipossomos, contudo, isso não foi

observado em nossos resultados (Figura 13).

Bhowmick et al. (2007) também observaram que a capacidade

imunopotencializadora de lipossomos neutros pareceu baixa, uma vez que eles

não mostraram impacto na atividade protetora de antígenos solúveis de L.

donovani sozinhos. Esses autores observaram que esses antígenos solúveis

sozinhos, parcialmente protetores, induzem significativos e comparáveis níveis

de IL-12 assim como antígenos solúveis incorporados em lipossomos carregados

positivamente, o que é bastante interessante uma vez que a IL-12 pode

promover o desenvolvimento de uma resposta imune do tipo Th1 (Sypek et al.,

1993; Heinzel et al., 1993), sugerindo o potencial desses antígenos solúveis

sozinhos como um possível imunoterapêutico contra leishmaniose visceral.

Segundo Melby et al. (1998) e Armijos et al. (1998), o sucesso da

vacinação em humanos e animais é frequentemente relacionado a antígenos que

induzem uma resposta DTH (Hipersensibilidade do Tipo Tardia) in vivo, e

estimulação de células T com mitógenos e antígenos in vitro. Baixos, mas

significativos níveis de DTH foram observados por Mazumdar et al. (2004) em

animais imunizados com antígenos sozinhos, sugerindo uma correlação entre

resposta imune mediada por células, e imunidade à infecção neste modelo.

Ainda, esses mesmos autores observaram que camundongos BABL/c imunizados

com antígenos encapsulados apresentaram uma resposta IgG específica ao

antígeno. Contudo, essas respostas IgG parecem estar ausentes em outros

animais incluindo aqueles imunizados com antígenos sozinhos.

Em conclusão, nós demonstramos que tanto o EBSGPI quanto os

proteolipossomos foram capazes de proteger parcialmente camundongos BALB/c

contra infecção com L. amazonensis. Contudo, imunizações com maiores

concentrações de EBSGPI e proteolipossomos, e avaliações para verificar o tipo da

resposta imune gerada nesses camundongos imunizados são necessárias.

Ainda, para verificar se os mecanismos utilizados pelos macrófagos para

matar o parasita intracelularmente in vivo são induzidos pelas imunizações,

culturas de macrófagos peritoneais de animais sadios foram estimuladas com os

lipossomos, EBSGPI ou proteolipossomos e posteriormente infectadas com formas

amastigotas de L. amazonensis, e a porcentagem de infecção, o número de

parasita por célula e a produção de nitrito foram avaliados.

A porcentagem de infecção e o número de parasitas intracelulares nas

culturas de macrófagos peritoneais que foram estimuladas por 20 horas com

lipossomos, 5 µg/mL de EBSGPI ou 1 µg/mL de proteolipossomos foram

semelhantes após 1 hora de infecção com o parasita quando comparados as

culturas de macrófagos que não foram estimuladas (controle). Esses resultados

indicam claramente que os estímulos não impediram a entrada e a presença

inicial dos parasitas nos macrófagos (Figura 15 e 16). Entretanto, após 24

horas de infecção os macrófagos imunizados com os diferentes tratamentos

apresentaram significativamente menores porcentagens de infecção e menores

números de parasitas por células comparadas às culturas controles, que

apresentaram uma elevada multiplicação dos parasitas após 24 horas de infecção

(Figura 16). Ainda, observamos que as culturas estimuladas com o EBSGPI

apresentaram uma significativa diminuição de aproximadamente 99 % de células

infectadas (Figura 15).

A habilidade do EBSGPI e dos proteolipossomos em ativar macrófagos

peritoneais para impedir a multiplicação das amastigotas intracelulares foi

confirmada pelos significativos aumentos na produção de NO, avaliados nos

sobrenadantes dessas culturas após 20 horas de estímulos comparados as

culturas controles (Figura 18). Observamos ainda uma maior produção de NO

nas culturas estimuladas com o EBSGPI quando comparadas às culturas

estimuladas com os proteolipossomos, corroborando com os resultados acima

obtidos, uma vez que culturas estimuladas com o EBSGPI apresentaram uma

maior diminuição da infecção (Figura 15).

A maior produção de NO nessas culturas estimuladas indica uma super-

regulação da iNOS por citocinas associadas as células Th1 e confirma que os

mecanismos efetores mediados por NO dos macrófagos é critico para controlar a

replicação do parasita em camundongos (Murray & Nathan, 1999).

Diminuição no número de parasitas intracelulares e aumentos nos níveis

de NO também foi observada por Mazumdar et al. (2004). Culturas de

macrófagos peritoneais de camundongos vacinados, que foram estimuladas por

antígenos livres de L. donovani e antígenos incorporados em lipossomos

constituídos por DSPC, apresentaram significativas diminuições no número de

parasitas por células, contudo, neste caso culturas que foram estimuladas com

os antígenos incorporados em lipossomos apresentaram uma maior diminuição

no número de parasitas por células quando comparadas às culturas estimuladas

com antígenos livres. Ainda, maiores níveis de NO também foram observados

nas culturas estimuladas com os antígenos incorporados em lipossomos por 72

horas. Também, Afrin et al. (2002) observaram que estimulações com gp63

livres ou incorporadas em lipossomos ativam macrófagos peritoneais impedindo

assim a multiplicação de amastigotas de L. donovani in vitro. A atividade

leishmanicida dos macrófagos estimulados com os lipossomos associados a gp63

foi significativamente maior quando comparada à atividade dos macrófagos

estimulados com a gp63 livre.

Para avaliar se a redução na infecção observada durante o estímulo com

os lipossomos, EBSGPI ou proteolipossomos não está relacionada a uma menor

viabilidade de macrófagos, realizamos o teste do MTT. Esse teste tem muitas

vantagens, como, por exemplo, é rápido, podem-se analisar muitas amostras de

uma só vez e o substrato não interfere na medida do produto. Segundo

Mosmann (1983) através do teste do MTT é possível diferenciar células vivas de

células mortas sendo de ampla aplicabilidade para medidas de sobrevivência e

proliferação de várias células. Nossos resultados mostram que macrófagos

peritoneais não apresentaram grandes diferenças significativas na viabilidade

celular quando estimulados com os diferentes tratamentos quando comparado às

culturas controles (Figura 19 e 20). Assim podemos sugerir que a redução na

infecção não está relacionada à morte de macrófagos provocada pelos diferentes

estímulos.

Os dados do presente trabalho mostram que o estímulo com os

lipossomos, EBSGPI ou proteolipossomos não afetou a fagocitose de amastigotas

de L. amazonensis pelos macrófagos (Figura 15 e 16), mas induz culturas de

macrófagos a inibir o crescimento e/ou induzem morte intracelular do parasita

(Figura 16). Podemos sugerir assim que macrófagos são ativados/estimulados

com os diferentes tratamentos.

66.. CCoonncclluussõõeess

1. As proteínas ancoradas por GPI da superfície de formas promastigotas de

L. amazonensis foram eficientemente solubilizadas após tratamento com

Triton X-114.

2. As proteínas ancoradas por GPI isoladas da superfície do parasita

mostraram um limitado número de componentes variando de 20 a 66 KDa,

com uma maior intensidade das bandas entre 65-45 KDa

aproximadamente.

3. Lipossomos foram formados em todas as condições estudadas, contudo a

incorporação das proteínas ancoradas por GPI, formando os

proteolipossomos, só ocorre na presença do colesterol.

4. Lipossomos constituídos por lipídios com diferentes tamanhos da cadeia

hidrocarbônica dos ácidos graxos ou diferentes grupos cabeça polares, na

presença do colesterol, foram igualmente eficazes no processo de

incorporação das proteínas ancoradas por GPI do parasita.

5. Estudos em monocamadas de Langmuir indicam que a presença do

colesterol facilita a adsorção das proteínas ancoradas por GPI em

lipossomos, e que uma apropriada proporção lipídica (DPPC:Colesterol na

razão molar 1,5:1) é necessária para a inserção dessas proteínas e

subseqüente estabilização.

6. Camundongos da linhagem BALB/c imunizados com 40 µg de proteínas

ancoradas por GPI incorporadas nos proteolipossomos mostram proteção

parcial (cerca de 50 %) após o desafio com 104 formas promastigotas de

L. amazonensis por aproximadamente 14 semanas.

7. As proteínas antigênicas ancoradas por GPI da superfície do parasita

sozinhas (5 µg de proteínas ancoradas por GPI totais) apresentaram uma

maior capacidade de induzir proteção parcial (cerca de 60 %) em

camundongos da linhagem BALB/c, após o desafio com 104 formas

promastigotas de L. amazonensis por aproximadamente 14 semanas.

8. Estudos in vitro mostram que culturas de macrófagos peritoneais murinos

estimulados com lipossomos, EBSGPI ou proteolipossomos reduzem a

porcentagem de infecção (42, 39 e 99%, respectivamente) e o número de

amastigotas intracelulares de L. amazonensis (29, 32 e 99%,

respectivamente). Essa redução não está relacionada à morte de

macrófagos, mas provavelmente a capacidade destas células de eliminar o

parasita diante do estímulo.

9. A maior produção de NO nas culturas de macrófagos peritoneais murinos

indica que essas células são ativadas pelos diferentes tratamentos

(lipossomos, EBSGPI ou proteolipossomos) para matar o parasita

intracelular.

77.. RReeffeerrêênncciiaass BBiibblliiooggrrááffiiccaass

Aebischer, T., Wolfram, M., Patzer, S. I., Ilg, T., Wiese, M. & Overath, P. Subunit vaccination of mice against new world cutaneous leishmaniasis comparison of three proteins expressed in amastigotas and six adjuvants. Infect. Immun., 68: 1328-1336, 2000. Afonso, L. C & Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infect. Immun. 61: 2952-2959, 1993. Afonso, L. C. C., Scharton, T. M., Vieira, L. W., Wysocka, M., Trinchieri, G., Scott, P. The adjuvant effect of interleukin-12 in a vaccine against Leishmania major. Science, 263: 235-237, 1994. Afrin, F. & Ali, N. Adjuvanticity and protective immunity elicited by Leishmania donovani antigens encapsulated in positively charged liposomes. Infec. Immun., 65: 2371-2377, 1997. Afrin, F.; Rajesh, R.; Anam, K.; Gopinath, M.; Pal, S. & Ali, N. Characterization of Leishmania donovani antigens encapsulated in liposomes that induce protective immunity in BALB/c mice. Infect. Immun., 70: 6697-6706, 2002. Ali, N. & Afrin, F. Protection of mice against visceral leishmaniasis by immunization with promastigote antigen incorporated in liposomes. J. Parasitol., 83: 70-75, 1997. Almeida, P. F., Pokorny, A. & Hinderliter, A. Thermodynamics of membrane domains. Biochim. Biophys. Acta, 1720: 1-13, 2005. Alving, C. R. Liposomes as carriers of antigens and adjuvants. J. Immunol. Methods. 140: 1-13, 1991. Araújo-Soares, R. M., Santos, A. L. S., Bonaldo, M. C., Andrade, A. F. B., Alviano, C. S., Angluster, J. & Goldenberg, S. Leishmania (Leishmania) amazonensis: differential expression of proteinases and cell-surface polypeptides in avirulent and virulent promastigotas. Exp. Parasitol., 104: 104-112, 2003. Armijos, R. X., Weigel, M. M., Aviles, H., Maldonado, R. & Racines, J. Field trial of a vaccine against New World cutaneous leishmaniasis in an at-risk child population: safety, immunogenicity, and efficacy during the first 12 months of follow-up. J. Infect. Dis., 177: 1352-1357, 1998. Armijos, R. X., Weigle, M. M., Calvopina, M., Hidalgo, A., Cevallos, W. & Correa, J. Safety, immunogenecity, and efficacy of an autoclaved Leishmania amazonensis vaccine plus BCG adjuvant against New World cutaneous leishmaniasis. Vaccine, 22: 1320-1326, 2004. Barral-Neto, M.; Von Sohten, R. L.; Teixeira, M.; Dos Santos, W. L.; Pompeu, M. L.; Moreira, R. A.; Oliveira, J. T.; Cavada, B. S.; Falcoff, E. & Barral, A. In vivo protective effect of the lectin from Canavalia brasiliensis on BALB/c mice infected by Leishmania amazonensis. Acta. Trop., 60: 237-250, 1996. Belkaid, Y., Von Stebut, E., Mendez, S., Lira, R., Caler, E., Berhtolet, S., Udey, M. C. & Sacks, D. CD8+ T cells are required for primary immunity in C57BL/6

mice following low-dose, intradermal challenge with Leishmania major. J. Immunol., 168: 3992-4000, 2002. Belosevic, M., Finbloom, D. S., Van Der Meide, P. H., Slayter, M. V., Nacy, C. A. Administration of monoclonal anti-IFN-gamma antibodies in vivo abrogates natural resistance of C3H/HeN mice to infection with Leishmania major. J. Immunol., 143: 266-274, 1989. Berman, J. D., Badaro, R., Thakur, C. P., Wasunna, K. M., Behbehani, K., Davidson, R., Kuzoe, F., Pang, L., Weerasuriya, K. & Bryceson, A. D. Efficacy and safety of liposomal amphotericin B (AmBiosome) for visceral leishmaniasis in endemic developing countries. Bulletin of the World Health Organization, 76: 25-32, 1998. Berman, J. Current treatment approaches to leishmaniasis. Current Opinion In Infectious Diseases, 16: 397-401, 2003. Bhowmick, S., Ravindram, R. & Ali, N. Leishmanial antigens in liposomes promote protective immunity and provide immunotherapy against visceral leishmaniasis via polarized Th1 response. Vaccine, 25: 6544-6556, 2007. Bhowmick, S., Ravindran, R. & Ali, N. Gp63 in stable cationic liposomes confers sustained vaccine immunity to susceptible BALB/c mice infected with Leishmania donovani. Infect. Immun., 76: 1003-1015, 2008. Blum, H., Heise, H. & Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Eletrophoresis, 8: 93-99, 1987. Bogdan, C., Gessner, A. & Rollinghoff, M. Cytokines in Leishmaniasis: a complex network of stimulatory and inhibitory interaction. Immunobiology, 189: 356-396, 1993. Bogdan, C & Rollinghoff, M. The immune response to Leishmania: mechanisms of parasite control and evasion. Int. J. Parasitol., 28: 121-134, 1998. Bordier, C. The promastigote surface of Leishmania. Parasitol. Today., 24: 73-79, 1987. Borja-Cabrera, G. P., Cruz Mendes, A., Paraguai de Souza, E., Hashimoto Okada, L. Y., de Atrivellato, F. A., Kawasaki, J. K., Costa, A. C., Reis, A. B., Genaro, O., Batista, L. M., Palatnik, M. & Palatnik-de-Sousa, C. B. Effective immunotherapy against canine visceral leishmaniasis with the FML-vaccine. Vaccine, 2234-2243, 2004. Brittingham, A.; Morrison, C. J.; McMaster, W. R.; McGwire, B. S.; Chang, K. P. & Mosser, D. M. Role of the Leishmania surface protease gp63 in complement fixation, cell adhesion, and resistance to complement-mediated lysis. J. Immunol., 155: 3102-3111, 1995. Brittingham, A.; Chen, G.; McGwire, B. S.; Chang, K. P. & Mosser, D. M. Interaction of Leishmania gp63 with cellular receptors for fibronectin. Infect. Immun., 67: 4477-4484, 1999.

Brockman, H. L. Lipid monolayers: why use half a membrane to characterize protein-membrane interactions?, Curr. Opin. Struct. Biol., 9: 438-43, 1999. Brown, R. E. & Brockman, H. L. Using monomolecular films to characterize lipid lateral interactions. Methods Mol Biol., 398: 41-58, 2007. Burns, J. M. Jr.; Scott, J. M.; Carvalho, E. M.; Russo, D. M.; March, C. J.; Van Ness, K. P. & Reed, S. G. Characterization of a membrane antigen of Leishmania amazonensis that stimulates human immune responses. J. Immunol., 146: 742-748, 1991. Button, L. L. & McMaster, W. R. Molecular cloning of the major surface antigen of Leishmania. J. Exp. Med., 167: 724-729, 1988. Camargo, L. M. A. & Barcinski, M. A. Leishmanioses, feridas bravas e kalazar. Ciência e Cultura, 1: 34-37, 2003. Camolezi, F.L; Daghastanli, K.R.P.; Magalhães, P.P; Pizauro, J.M. and Ciancaglini, P. Construction of an alkaline phosphatase-liposome system: a tool for biomineralization study. Int. J. Biochem. Cell Biol., 1282: 1-11, 2002. Campos-Neto, A., Porrozzi, R., Greeson, K., Coler, R. N., Webb, J. R., Seiky, Y. A. W., Reed, S. G., Grimaldi, G. Protection against cutaneous leishmaniasis induced by recombinant antigens in murine and non-human primate models of the human disease. Infect. Immun., 69: 4103-4108, 2001. Cardoso de Almeida, M. L. & Heise, N. Proteins anchored via glycosylphosphatidylinositol and solubilizing phospholipases in Trypanosoma cruzi. Biol. Res., 26: 285-312, 1993. Caseli, L., Zaniquelli, M. E. D., Furriel, R. P. M. & Leone, F. A. Adsorption of detergent solubilized and phospholipase C solubilized alkaline phosphatase at air-liquid interfaces. Colloids and Surfaces B, 25: 273-282, 2003. Caseli, L., Masui, D. C., Furriel, R. P. M., Leone, F. A., Zaniquelli, M. E. D., Orbulesco, J. & Leblanc, R. Rat Osseous plate alkaline phosphatase as Langmuir monolayer - an infrared study at the air-water interface. Journal of Colloid and Interface Science, 320: 476-482, 2008. Caseli, L., Masui, D. C., Furriel, R. P. M., Leone, F. A. & Zaniquelli, M. E. D. Incorporation conditions guiding the aggregation of a glycosylphosphatidyl inositol (GPI)-anchored protein in Langmuir monolayers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 46: 248–254, 2005. Cevc, G. & March, D. Bilayer elasticity. In: E. E. Bittar editor. Phospholipid bilayer, Physical Principles and Models. Cell Biology: A Series of Monographs. Wiley, New York, 1987, pp: 347-368. Chapman, D., Owens, N. F., Phillips, M. C. & Walker, D. A. Mixed Monolayers of Phospholipids and Cholesterol characteristics of saturated 1,2,-diacyl phosphatidylcholines (lecithins) and phosphatidylethanolamines at the air-water interface. Biochim. Biophys. Acta., 183: 458-65, 1969.

Chaudhuri, G.; Chaudhuri, M.; Pan, A. & Gang, K. P. Surface acid proteinase (gp63) of Leishmania mexicana. J. Biol. Chem., 264: 7483-7489, 1989. Chen, P.S.Jr.; Toribara, T.Y & Warner, H. Microdetermination of phosphorus. Anal. Chem., 28: 1756-1758, 1956. Chikh, G & Schutze-Redelmeier, M. P. Liposomal delivery of CTL epitopes to dendritic cells. Biosci. Rep., 22: 339-353, 2002. Coler, R. N. & Reed, S. G. Second-generation vaccines against leishmaniasis. Trends in Parasitology, 21: 244-249, 2005. Cruz, A., Coburn, C. M. & Beverley, S. M. Double targeted gene replacement for creating null mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7170-7174, 1991. Cunningham, A. C. Parasitic adaptive mechanisms in infection by Leishmania. Exp. Mol. Pathol., 72: 132-141, 2002. Daneshvar, H., Coombs, G. H., Hagan, P. & Phillips, R. S. Leishmania mexicana and Leishmania major: attenuation of wild-type parasites and vaccination with the attenuated lines. J. Infect. Dis., 187: 1662-1668, 2003. Daghastanli, K. R. P., Ferrreira, R. B., Thedei, G. Jr., Maggio, B. & Ciancaglini, P. Lipid composition-dependent incorporation of multiple membrane proteins into liposomes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 36: 127-137, 2004. Davis, A. J. & Kedzierski, L. Recent advances in antileishmanial drug development. Current Opinion in Investigational Drugs, 6: 163-169, 2005. Delorenzi, J. C., Attias, M., Gattass, C., Andrade, M., Rezende, C., Pinto, A. C., Henrique, A. T., Bou-Habib, D. C., Saraiva, E. M. Antileishmanial activity of na índole alkaloid from Peschiera australis. Antimicrob. Agents. Chemother., 45: 1349-1354, 2001. De luca, P. M., Mayrink, W., Alves, C. R., Coutinho, S. G., Oliveira, M. P., Bertho, A. L., Toledo, V. P., Costa, C. A., Genaro, O., Mendonça, S. C. Evaluation of the stability and immunogenicity of autoclaved and nonautoclaved preparations of a vaccine against American tegumentary leishmaniasis. Vaccine, 17: 1179-1185, 1999. Demel, R. A., London, Y., Geurts van Kessel, W. S. M., Vossenberg, F. G. A. & van Deenen, L. L. M. The specific interaction of myelin basic protein with lipids at the air-water interface. Biochem. Biophys. Acta, 311: 507-519, 1973. Denny, P. W., Field, M. C. & Smith, D. F. GPI-anchored proteins and glycoconjugates segregate into lipid rafts in Kinetoplastida. FEBS Lett, 491: 148-153, 2001. De Souza, W. Structural organization of the cell surface of pathogenic protozoa. Micron, 26: 405-430, 1995. Descoteaux, A. & Turco, S. J. Glycoconjugates in Leishmania infectivity. Biochim. Biophys. Acta., 1455: 341-352, 1999.

Descoteaux, A. & Turco, S. J. Functional aspects of the Leishmania donovani lipophosphoglycan during macrophage infection. Microbes Infect., 4: 975-981, 2002. Dynarowicz-£atka, P. & Hac-Wydro, K. Interactions between phosphatidylcholines and cholesterol in monolayers at the air/water interface. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 37: 21–25, 2004. Estrela-Lopis, I., Brezesinski, G. & Mohwald, H. Dipalmitoyl-phosphatidylcholine/phospholipase D interactions investigated with polarization-modulated infrared reflection absorption spectroscopy. Biophys. J., 80: 749-754, 2001. Favali, C., Tavares, N., Clarêncio, J., Barral, A., Barra-Neto, M. & Brodskyn, C. Leishmania amazonensis infection impairs differentiation and function of human dendritic cells. J. Leukoc. Biol., 82: 1401-1406, 2007. Felnerova, D., Viret, J. F., Gluck, R. & Moser, C. Liposomes and virosomes as delivery systems for antigens, nucleic acids and drugs. Curr. Opin. Biotechnol., 15: 518-529, 2004. Foged, C., Arigita, C., Sundblad, A., Jiskoot, W., Storm, G. & Frokjaer, S. Interaction of dendritic cells with antigen-containing liposomes: effect of bilayer composition. Vaccine, 22: 1903-1913, 2004. Forgber, M.; Basu, R.; Roychoudhury, K.; Theinert, S.; Roy, S.; Sundar, S. & Walden, P. Mapping the antigenicity of the parasites in Leishmania donovani infection by proteome serology. Plos One, 20: 1-10, 2006. Frommel, T. O.; Button, L. L.; Fujikura, Y. & McMaster, W. R. The major surface glycoprotein (GP63) is present in both life stages of Leishmania. Mol. Biochem. Parasitol., 38: 25-32, 1990. Garg, R.; Srivastava, J. K.; Pal, A.; Naik, S. & Dube, A. Isolation of integral membrane proteins of Leishmania promastigotes and evaluation of their prophylactic potencial in hamsters against experimental visceral leishmaniasis. Vaccine, 23: 1189-1196, 2005. Genaro, O., de Toledo, V. P., da Costa, C. A., Hermeto, M. V., Afonso, L. C. & Mayrink, W. Vaccine for prophylaxis and immunotherapy, Brazil. Clin. Dermatol., 14: 503-512, 1996. Gericke, A., Flach, C. R. & Mendelsohn, R. Structure and orientation of lung surfactant SP-C and L-alpha-dipalmitoylphosphatidylcholine in aqueous monolayers. Biophys. J., 73: 492-499, 1997. Giorgio, S. & Barao, S. C. Intracellular Leishmania amazonensis killing induced by the guanine nucleoside 8-bromoguanosine. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo., 40: 237-40, 1998. Gontijo, B. & Carvalho, M. L. R. Leishmaniose tegumentar americana. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 36: 71-80, jan-fev, 2003. Gontijo, C. M. F. & Melo, M. N. Leishmaniose visceral no Brasil: Quadro atual,

desafios e perpectivas. Rev. Bras. Epidemiol., 7: 338-349, 2004. Gorak, P. M.; Engwerda, C. R. & Kaye, P. M. Dendritic cells, but not macrophages, produce IL-12 immediately following Leishmania infection. Eur. J. Immunol., 28:687-695, 1998. Green, S. J.; Meltzer, M. S.; Hibbs J. B. & Nacy, N. A. Activated macrophages destroy intracellular Leishmania major amastigotes by an L-arginine-dependent killing mechanism. J. Immunol., 144: 278-283, 1990. Greenblatt, C. L. The present and future of vaccination for cutaneous leishmaniasis. Prog. Clin. Biol. Res., 47: 259-285, 1980. Gregoriadis, G. & Allison, A. C. Entrapment of proteins in liposomes prevents allergic reactions in pre-immunised mice. FEBS Lett., 45: 71-74, 1974. Gregoriadis, G., Allison, A. C. & Poste, G. (Eds.) Vaccines: Recent Trends and Progress, Plenum, New York, 1993. Gregoriadis, G. Engineering liposomes for drug delivery: progress and problems. Trends Biotechnol., 13: 527-537, 1995. Gregoriadis, G.; Mccormack, B.; Obrenovic, M.; Saffie, R.; Zadi, B. And Perrie, Y. Vaccine entrapment in liposomes. Methods, 19: 156-162, 1999. Gurunathan, S., Prussin, C., Sacks, D. L. & Seder, R. A. Vaccine requirements for sustained cellular immunity to an intracellular parasitic infection. Nat. Med., 4: 1409-1415, 1998. Handman, E. Cell biology of Leishmania. Adv. Parasitol., 44:1-39, 2000. Handman, E. Leishmaniasis: current status of vaccine development. Clin. Microbiol. Rev., 14: 229-243, 2001. Hartree, E. F. Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a linear photometric response. Anal. Biochem., 48: 422-427, 1972. Heinzel, F. P., Schoenbaut, D. S., Rerko, R. M., Rosser, L. E. & Gately, M. K. Recombinant interleukin 12 cures mice infected with Leishmania major. J. Exp. Med., 177: 1505-1509, 1993. Hernandez, A. G., Arguello, C., Ayesta, C., Dagger, F., Infante, R. B., Stojanovich, K., Dawidowicz, F., Riggione, F. & Riva, G. In: The surface membrane of Leishmania ed. Slutzky, G.M, The Biochemistry of Parasites. Pergamon Press, Oxford, 1981, p. 47. Herwaldt, B. L. Leishmaniasis. Lancet, 354: 1191-1199, 1999. Higgins, G. in: J. B. C. Findlay, W. H. Evans, Separation and analysis of membrane lipid components, ed. Biological Membranes, Pratical Approach Series, 1987, p. 104. IRL Press, Oxford. Huang, J & Feigenson, G. W. A microscopic interaction model of maximum solubility of cholesterol in lipid bilayers. Biophys. J., 76: 2142-2157, 1999.

Ilg, T.; Handman, E. & Stierhof, Y. D. Proteophosphoglycan from Leishmania promastigotes and amastigotes. Biochem. Soc. Trans., 27: 518-525, 1999. Ilgoutz, S. C. & McConville, M. J. Function and assembly of the Leishmania surface coat. Int. J. Parasitol., 31: 899-908, 2001. Jaafari, M. R.; Ghafarian, A.; Farrokh-Gisour, A.; Samiei, A.; Kheiri, M. T.; Mahboudi, F.; Barkhordari, F.; Khamesipour, A. & McMaster, W. Immune response and protection assay of recombinant major surface glycoprotein of Leishmania (rgp63) reconstituted with liposomes in BALB/c mice. Vaccine, 24: 5708-5717, 2006. Jaafari, M. R., Badiee, A., Khamesipour, A., Samiei, A., Soroush, D., Kreiri, M. T., Barkhordari, F., McMaster, W. R. & Mahboudi, F. The role of CpG ODN in enhancement of immune response and protection in BALB/c mice immunized with recombinant major surface glycoprotein of Leishmania (rgp63) encapsulated in cationic liposome. Vaccine, 25: 6107-6117, 2007. Johnson, J. E., Rao, M. N., Hui, S. W., Cornell, R. B. Conformation and lipid binding properties of four peptides derived from the membrane-binding domain of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase. Biochemistry, 37: 9509-9519, 1998. Jones, D. E.; Buxbaum, L. U. & Scott, P. IL-4-independent inhibition of IL-12 responsiveness during Leishmania amazonensis infection. J. Immunol., 165: 364-372, 2000. Jones, D. E.; Ackermann, M. R.; Wille, U.; Hunter, C. A. & Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infect. Immun., 70: 2151-2158, 2002. Kahl, L. P., Scott, C. A., Lelchuk, R., Gregoriadis, G., Liew, F. Y. Vaccination against murine cutaneous leishmaniasis by using Leishmania major antigen/liposomes. Optimization and assessment of the requirement for intravenous immunization. J. Immunol., 142: 4441-4449, 1989. Kane, M. M. & Mosser, D. M. Leishmania parasites and their ploys to disrupt macrophage activation. Curr. Opin. Hematol., 7: 26-31, 2000. Kedzierski, L., Zhu, Y. & Handman, E. Leishmania vaccines: progress and problems. Parasitol., 133: S87-S112, 2006. Khalil, E. A., El Hassan, A. M., Zijlstra, E. E., Mukhtar, M. M., Ghalib, H. W., Musa, B., Ibrahim, M. E., Kamil, A. A., Elsheikh, M., Babiker, A. & Modabber, F. Autoclaved Leishmania major vaccine for prevention of visceral leishmaniasis: a randomized, double-blind, BCG-controlled trial in Sudan. Lancet, 356: 1565-1569, 2000. Kloboucek, A., Behrisch, A., Faix, J., Sackmann, E. Adhesion-induced receptor segregation and adhesion plaque formation: A model membrane study. Biophys. J., 77: 2311-2328, 1999.

Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685, 1970. Laing, P., Bacon, A., McCormack, B., Gregoriadis, G., Frisch, B. & Schuber, F. The co-delivery approach to liposomal vaccines: application to the development of influenza-A and hepatitis-B vaccine candidates. J. Liposome Res., 16: 229-235, 2006. Laison, R. Leishmania e leishmaniose, com particular referência à região Amazônica do Brasil. Revista Paraense de Medicina, 11: 29-40, 1997. Langmuir, I. The Shapes of Group Molecules Forming the Surfaces of Liquids. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 3: 251-257, 1917. Langmuir, I., Schaefer, V. J. & Wrinch, D. M. Built-up filmes of proteins and their properties. Science, 85: 76-80, 1937. Laskay, T., Diefenbach, A., Rollinghoff, M. & Solbach, W. Early parasite contaimment is decisive for resistance to Leishmania major infection. Eur. J. Immunol., 25: 2220-2227, 1995. Lasic, D.D. Novel applications of lipossomes. Trends in Biotechnol., 16: 307-321, 1998. Le Maire, M.; Champeli, P. & Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta., 1508: 86-111, 2000. Leserman, L. Liposomes as protein carriers in immunology. J. Liposome Res., 14: 175-189, 2004. Lieke, T., Nylén, S., Eidsmo, L., McMaster, W. R., Mohammadi, A. M., Khamesipour, A., Berg, L. & Akuffo, H. Leishmania surface protein gp63 binds directly to human natural killer cells and inhibits proliferation. Clin. Exp. Immunol., 153: 221-230, 2008. Liese, J., Schleicher, U. & Bogdan, C. The innate immune response against Leishmania parasites. Immunobiology, 213: 377-387, 2008. Linares, E.; Augusto, O.; Barão, S. C. & Giorgio, S. Leishmania amazonensis infection does not inhibit systemic nitric oxide levels elicited by lipopolysaccharide in vivo. J. Parasitol., 86: 78-82, 2000. Linares, E.; Giorgio, S.; Mortara, R. A.; Santos, C. X. C.; Yamada, A. T. & Augusto, O. Role of peroxynitrite in macrophage microbicidal mechanisms in vivo revealed by protein nitration and hydroxylation. Free Radical Biology and Medicine, 30: 1234-1242, 2001. Macedo, S. de., Shams-Eldin, H., Smith, T. K., Schwarz, R. T. & Arrouz, N. Inhibitors of glycosyl-phosphatidylinositol anchor biosynthesis. Biochimie, 85: 465-472, 2003. Machado-Pinto, J., Pinto, J., da Costa, C. A., Genaro, O., Marques, M. J., Modabber, F. & Mayrink, W. Immunochemotherapy for cutaneous leishmaniasis:

a controlled trial using killed Leishmania (Leishmania) amazonensis vaccine plus antimonial. Int. J. Dermatol., 41: 73-78, 2002. Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1462: 109-140, 1999. Manesis, E. K.; Cameron, C. H. & Gregoriadis, G. Incorporation of hepatitis-B surface antigen (HBsAg) into liposomes. Biochem. Soc. Trans., 6:925-928, 1978. Marques-da-Silva, E. A., Coelho, E. A., Gomes, D. C., Vilela, M. C., Masioli, C. Z., Tavares, C. A., Fernandes, A. P., Afonso, L. C. & Rezende, S. A. Intramuscular immunization with p36(LACK) DNA vaccine induces IFN-gamma production but does not protect BALB/c mice against Leishmania chagasi intravenous challenge. Parasitol. Res., 98: 67-74, 2005. Marzochi, M. C. A. Leishmanioses no Brasil (As leishmanioses tegumentares). J. B. M., 63: 81-105, 1992. Mazumdar, T., Anam, K. & Ali, N. A mixed Th1/Th2 response elicited by a liposomal formulation of Leishmania vaccine instructs Th1 responses and resistance to Leishmania donovani in susceptible BALB/c mice. Vaccine, 22: 1162-1171, 2004. McConville, M. J. & Ferguson, M. A. The structure, biosynthesis and function of glycosylated phosphatidylinositols in the parasite protozoa and higher eukaryotes. Biochem. J., 294: 305-324, 1993. McConville, M. J.; Mullin, K.; Ilgoutz, S. & Teasdale, R.D. Secretory pathaway of trypanosomatids parasites. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66: 122-154, 2002. McConville, M. J. & Blackwell, J. M. Developmental changes in the glycosylated phosphatidylinositols of Leishmania donovani. Characterization of the promastigotes and Amastigote glycolipids. J. Biol. Chem., 266: 1510-1519, 1991. Melby, P. C., Yang, Y-Z., Cheng, J. & Zhao, W. Regional differences in the cellular immune response to experimental cutaneous or visceral infection with Leishmania donovani. Infect. Immun., 66: 18-27, 1998. Méndez, S., Gurunathan, S., Kamhawi, S., Belkaid, Y., Moga, M. A., Skeiky, Y. A., Campos-Neto, A., Reed, S., Seder, A. & Sacks, D. The potency and durability of DNA- and protein-based vaccines against Leishmania major evaluated using low-dose, intradermal challenge. J. Immunol., 166: 5122-5128, 2001. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Manual de Controle da Leishmaniose Tegumentar Americana. Coordenação de Vigilância Epidemiológica. 5ª edição, 2000. Modabber, F. Vaccines against leishmaniasis. Ann. Trop. Med. Parasitol., 89: 83-88, 1995.

Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth., 65: 55-63, 1983. Mosser, D. M. & Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Semin. Cell. Biol., 4: 315-322, 1993. Murray, H. W. & Nathan, C. F. Macrophage microbicidal mechanisms in vivo: reactive nitrogen versus oxygen intermediates in killing of intracellular visceral Leishmania donovani. J. Exp. Med., 189: 741-746, 1999. Murray, H. W. Progress in the treatment of a neglected infectious disease: visceral leishmaniasis. Expert. Review of Anti-Infective Therapy, 2: 279-292, 2004. Nadim, A., Javadian, E., Tahvildar-Bidruni, G. & Ghorbani, M. Effectiveness of leishmanization in the control of cutaneous leishmaniasis. Bull. Soc. Pathol. Exot. Filiales, 76: 377-383, 1983. Nakanishi, T., Kunisawa, J., Hayashi, A., Tsutsumi, Y., Kubo, K., Nakagawa, S., Fujiwara, H., Hamaoka, T. & Mayumi, T. Positively charged liposome function as an efficient immunoadjuvant in inducing immune responses to soluble proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun., 240: 793-797, 1997. Oliveira, M. A.; Santiago, H. C.; Lisboa, C. R.; Ceravollo, I. P.; Trinchieri, G.; Gazzinelli, R. T. & Vieira, L. Q. Leishmania sp: comparative study with Toxoplasma gondii and Trypanosoma cruzi in their ability to initialize IL-12 and IFN-gamma synthesis. Exp. Parasitol., 95: 96-105, 2000. Palatnik-de-Souza, C. B. Vaccines for leishmaniasis in the fore coming 25 years. Vaccine, 26: 1709-1724, 2008. Pessoa, S. M. Parasitologia Médica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1982. Powell, M. F. & Newman, M. J. (Eds.) Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Plenum, New York, 1995. Qi, H., Popov, V., Soong, I. Leishmania amazonensis-dendritic cell interaction in vitro and the priming of parasite-specific CD4(+) T cells in vivo. J. Immunol., 167: 4534-4542, 2001. Ramiro, M. J., Zarate, J. J., Hanke, T., Rodriguez, D., Rodriguez, J. R., Esteban, M., Lucientes, L., Castillo, J. A. & Larraga, V. Protection in dogs against visceral leishmaniasis caused by Leishmania infantum is achieved by immunization with a heterologous prime-boost regime using DNA and vaccinia recombinant vectors expressing LACK. Vaccine, 21: 2474-2484, 2003. Read, S. M. & Northcote, D. H. Minimization of variation in the response to different proteins of the Coomassie blue G dye-binding assay for protein. Anal. Biochem., 116: 53-64, 1981. Regen, S. L. Lipid-lipid recognition in fluid bilayers: solving the cholesterol mystery. Curr. Opin. Chem. Biol., 6: 729-735, 2002.

Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituited proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res., 35: 753-766, 2002. Rivier, D., Boway, P., Shah, R., Didisheim, S. & Mauel, J. Vaccination against Leishmania major in a CBA mouse model of infection: role of adjuvants and mechanism of protection. Parasite Immunol., 21: 461-473, 1999. Rodrigues, M. M., Boscardins, S. B., Vasconcelos, J. R., Hiyane, M. I., Salay, G. & Soares, I. S. Importance of CD8 T cell-mediated immune response during intracellular parasitic infections and its implications for the development of effective vaccines. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 75: 443-468, 2003. Róg, T & Pasenkiewicz-Gierula, M. Cholesterol effects on the phospholipid condensation and packing in the bilayer: a molecular simulation study. FEBS Lett., 502: 68-71, 2001. Rojas, A., Garcia-Lugo, P., Crisante, G., Anez-Rojas, N. & Anez, N. Isolation, purification, characterization and antigenic evaluation of GPI-anchored membrane proteins from Leishmania (Viannia) braziliensis. Acta. Trop., 105: 139-144, 2008. Rosengarth, A., Wintergales, A., Galla, H. J., Hinz, H. J. & Gerke, V. Ca2+-independent interaction of annexin I with phospholipid monolayers. FEBS lett., 438: 279-284, 1998. Ronzon, F., Desbat, B., Chauvet, J. P. & Roux, B. Behavior of a GPI-anchored protein in phospholipids monolayers at the air-water interface. Biochim. Biophys. Acta., 1560: 1-13, 2002. Ruano, M. L. F., Nag, K., Worthman, L. A., Casals, C., Perez-Gil, J., Keough, K. M. W. Differential partitioning of pulmonary surfactant protein SP-A into regions of monolayers of dipalmitoylphosphatidylcholine and dipalmitoylphosphatidylcholine /dipalmitoylphosphatidylglycerol. Biophys. J., 74: 1101-1109, 1998. Russel, D. G.; Talamas-Rohana, P. & Zelechowski, J. Antibodies raised against synthetic peptides from the Arg-Gly-Asp-containing region of the Leishmania surface protein gp63 cross-react with human C3 and interfere with pg63-mediated binding to macrophages. Infec. Immun., 57: 630-632, 1989. Sacks, D. L. & Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nat. Rev. Immunol., 2: 845-858, 2002. Santos, W. R., Aguiar, I. A., Paraguai de Souza, E., de Lima, V. M., Palatnik, M. & Palatnik-de-Sousa, C. B. Immunotherapy against murine experimental visceral leishmaniasis with the FML-vaccine. Vaccine, 21: 4668-4676, 2003. Santos, F. R.; Ferraz, D. B.; Daghastanli, K. R. P.; Ramalho-Pinto, F. J. And Ciancaglini, P. Mimetic membrane system to carry multiple antigenic proteins from Leishmania amazonensis. J. Membrane Biol., 1-10, 2006. Santos, D. O., Coutinho, C. E. R., Madeira, M. F., Bottino, C. G., Vieira, R. T.,

Nascimento, S. B., Bernardino, A., Bourguignon, S. C., Corte-Real, S., Pinho, R. T., Rodrigues, C. R., Castro, H. C. Leishmaniasis treatment – a challenge that remains: a review. Parasitol. Res., 103: 1-10, 2008. Saraiva, E. M., de Figueiredo Barbosa, A., Santos, F. N., Borja-Cabrera, G. P., Nico, D., Souza, L. O., de Oliveira Mendes-Aguiar, C., de Souza, E. P., Fampa, P., Parra, L. E., Menz, I., Dias Jr, J. G., de Oliveira, S. M. and Palatnik-de-Sousa, C. B. The FNL-vaccine (Leishmune®) against canine visceral leishmaniasis: a transmission blocking vaccine. Vaccine, 24: 2423-2431, 2006. Scharton, T. M. & Scott, P. Natural killer cells are a source of interferon gamma that drives differentiation of CD4+ T cell subsets and induces early resistance to Leishmania major in mice. J. Exp. Med., 178: 567-577, 1993. Senekji, H. A. & Beattie, C. P. Artificial infection and immunization of man with cultures of Leishmania tropica. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 34: 415-419, 1941. Sharma, S. K., Dube, A., Nadeem, A., Khan, S., Saleem, I. & Garg, R. Non PC liposome entrapped promastigote antigens elicit parasite specific CD8+ and CD4+ T-cell immune response and protect hamsters against visceral leishmaniasis. Vaccine, 24: 1800-1810, 2006. Silva, L. J.; Camargo-Neves, V. L. F. 2004. As leishmanioses, uma visão para o clínico. Prática Hospitalar. 36(VI): nov-dez. Disponível em: <http://www.praticahospitalar.com.br/pratica2036/paginas/materia/2010-36.html>. (10/07/2006). Simons, K. & Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature, 387: 569-572, 1997. Solbach, W. & Laskay, T. The host response to Leishmania infection. Adv. Immunol., 74: 275-317, 2000. Soong, L.; Xu, J. C.; Greval, I. S.; Kima, P.; Sun, J.; Lougley, B. J. Jr.; Ruddle, N. H.; Mcmahon-Pratt D. & Flavell, R. A. Disruption of CD40-CD40 ligand interactions results in an enhanced susceptibility to Leishmania amazonensis infection. Immunity, 4: 263-273, 1996. Soong, L.; Chang, C. H.; Sun, J.; Lougley Jr, B. J.; Ruddle, N. H.; Flavell, R. A. And Mcmahon-Pratt, D. Role of CD4+T cells in pathogenesis associated with Leishmania amazonensis infection. J. Immunol., 158: 5374-5383, 1997.

Soto, J., Toledo, J., Gutierrez, P., Nicholls, R. S., Padilha, J., Engel, J., Fischer, C., Voss, A. & Berman, J. Treatment of American cutaneous leishmaniasis with miltefosine, an oral agent. Clinical Infectious Disease, 33: E57-61, 2001. Steinman, R. M. Some interfaces of dendritic cell biology. APMIS, 111: 675-697, 2003. Sypek, J. P., Chung, C. L., Mayor, S. E., Subramanyam, J. M., Goldman, S. J., Sieburth, D. S., Wolf, S. F. & Schaub, R. G. Resolution of cutaneous leishmaniasis: interleukin 12 initiates a protective T herper type 1 immune response. J. Exp. Med., 177: 1797-1802, 1993.

Teixeira, M. J.; Teixeira, C. R.; Andrade, B. B.; Barral-Netto, M.; Barral, A. Chemokines in host-parasite interactions in leishmaniasis. Trends in Parasitology, 22: 32-40, 2006. Terabe, M.; Kuramochi, T.; Ito, M.; Hatabu, T.; Sanjoba, C.; Chang, K. P.; Onodera, T. And Matsumoto, Y. CD4+ cells are indispensable for ulcer development in murine cutaneous leishmaniasis. Infect. Immun., 68: 4574-4577, 2000. Titus, R. G., Gueiros-Filho, F. J., de Freitas, L. A. & Beverley, S. M. Development of a safe live Leishmania vaccine line by gene replacement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 10267-10271, 1995. Tonui, W. K., Mejia, S., Hochberg, L., Mbow, M. L., Ryan, J. R., Chan, A. S. T., Martin, S. K. & Titus, G. Immunization with Leishmania major exogenous antigens protects susceptible BALB/c mice against challenge infection with L. major. Infect. Immun., 72: 5654-5661, 2004. Tosi, M. F. Innate immune responses to infection. J. Allergy. Clin. Immunol., 116: 241-9;quiz 50, 2005. Turco, S. J. & Descoteaux, A. The lipophosphoglycan of Leishmania parasites. Annu. Rev. Microbiol., 46: 65-94, 1992. Vélez, I. D., del Pilar Agudelo, S., Arbelaez, M. P., Gilchrist, K., Robledo, S. M., Puerta, J. A., Zicker, F., Berman, J. & Modabber, F. Safety and immunogenicity of a killed Leishmania (L.) amazonensis vaccine against cutaneous leishmaniasis in Colombia: a randomized controlled trial. Trans. R. Soc.Trop. Med. Hyg., 94: 698-703, 2000. Vélez, I. D., Gilchrist, K., Arbelaez, M. P., Rojas, C. A., Puerta, J. A., Antunes, C. M., Zicker, F. and Modabber, F. Failure of a killed Leishmania amazonensis vaccine against American cutaneous leishmaniasis in Colombia. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 99: 593-598, 2005. Veras, P., Brodskyn, C., Balestieri, F., Freitas, L., Ramos, A., Queiroz, A., Barral, A., Beverley, S. & Barral-Netto, M. A dhfr-ts- Leishmania major knock-out mutant cross-protects against Leishmania amazonensis. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 94: 491-496, 1999. Wang, S. X., Cai, G. P., Sui, S. F. The insertion of human apolipoprotein H into phospholipid membranes: a monolayer study. Biochem. J., 335: 225-232, 1998. Winberg, M. E., Holm, A., Sarndahl, E., Vinet, A. F., Descoteaux, A., Magnusson, K-E., Rasmusson, B. & Lerm. Leishmania donovani lipophosphoglycan inhibits phagosomal maturation via action on membrane rafts. Microbes Infec., 3: 1-8, 2009. Winter, G.; Fuchs, M.; McConville, M. J.; Stierhof, Y.D. & Overath, P. Surface antigens of Leishmania mexicana amastigotes-characterization of glicoinositol phospholipids and a macrophage-derived glycosphingolipid. J. Cell. Sci., 107: 2471-2482, 1994.

Xu, D. & Liew, F. Y. Genetic vaccination against leishmaniasis. Vaccine, 12: 1534-1536, 1994.

AAnneexxoo 11

AAnneexxoo 22

Ms. No.: JCIS-08-2206R1 Title: Incorporation of antigenic GPI-proteins from Leishmania amazonensis to membrane mimetic systems: influence of DPPC/cholesterol ratio Corresponding Author: Professor Pietro Ciancaglini Authors: Marcelle C Colhone, MS; Thatyane M Nobre, PhD; Maria Elisabete D Zaniquelli, PhD; Rodrigo G Stabeli, PhD; Dear Professor Ciancaglini, I am pleased to inform you that your manuscript referenced above has been accepted for Publication in the Journal of Colloid & Interface Science. Proofs of the article will be sent to you in the near future. Many thanks for submitting your manuscript to the Journal of Colloid & Interface Science. We hope that you have been pleased with the handling of your manuscript, and that you will consider submitting other quality manuscripts in the future. For further assistance, please visit our customer support site at http://epsupport.elsevier.com. Here you can search for solutions on a range of topics. You will also find our 24/5 support contact details should you need any further assistance from one of our customer support representatives. With kind regards, Catherine Wilson Journal Managers Journal of Colloid and Interface Science Editorial Office Elsevier 525 B Street, Suite 1900 San Diego, CA 92101-4495 USA Phone: (619) 699-6397 Fax: (619) 699-6855 E-mail: [email protected]

ARTICLE IN PRESS

UN

CO

RR

EC

TED

PR

OO

F

Please cite this article in press as: M.C. Colhone et al., J. Colloid Interface Sci. (2009), doi:10.1016/j.jcis.2009.01.043

JID:YJCIS AID:14677 /FLA [m5G; v 1.79; Prn:3/02/2009; 9:34] P.1 (1-7)

Journal of Colloid and Interface Science ••• (••••) •••–•••

Contents lists available at ScienceDirect

Journal of Colloid and Interface Science

www.elsevier.com/locate/jcis

1 67

2 68

3 69

4 70

5 71

6 72

7 73

8 74

9 75

10 76

11 77

12 78

13 79

14 80

15 81

16 82

17 83

18 84

19 85

20 86

21 87

22 88

23 89

24 90

25 91

26 92

27 93

28 94

29 95

30 96

31 97

32 98

33 99

34 100

35 101

36 102

37 103

38 104

39 105

40 106

41 107

42 108

43 109

44 110

45 111

46 112

47 113

48 114

49 115

50 116

51 117

52 118

53 119

54 120

55 121

56 122

57 123

58 124

59 125

60 126

61 127

62 128

63 129

64 130

65 131

66 132

Incorporation of antigenic GPI-proteins from Leishmania amazonensis to membranemimetic systems: Influence of DPPC/cholesterol ratio

Marcelle C. Colhone a, Thatyane M. Nobre b,c, Maria Elisabete D. Zaniquelli b, Rodrigo G. Stabeli d,Pietro Ciancaglini b,∗a Depto Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP), 14049-900, São Paulo, Brazilb Depto Química, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP), Universidade de São Paulo (USP), 14040-901, São Paulo, Brazilc Instituto de Física de São Carlos (IFSC), Universidade de São Paulo (USP), São Carlos-SP, Brazild Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Rondônia (UNIR) and Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais – IPEPATRO, Rondônia, Brazil

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history:Received 12 December 2008Accepted 16 January 2009Available online xxxx

Keywords:Leishmania amazonensisDPPCCholesterolGPI-proteinsLipidsProteoliposomes

The reconstitution of membrane proteins into liposomes is a useful tool to prepare antigenic componentsthat induce immunity. We have investigated the influence of the dipalmitoylphosphatidylcholine(DPPC)/cholesterol molar ratio on the incorporation of a GPI-protein from Leishmania amazonensison liposomes and Langmuir monolayers. The latter system is a well behaved and practical model,for understanding the effect of variables such as surface composition and lipid packing on proteinincorporation. We have found that the DPPC/cholesterol molar ratio significantly alters the incorporationof the GPI-protein. In the absence of cholesterol, reconstitution is more difficult and proteoliposomescannot be prepared, which we correlated with disruption of the DPPC layer. Our results provide importantinformation that could be employed in the development of a vaccine system for this disease or be usedto produce other GPI-systems for biotechnological application.

© 2009 Published by Elsevier Inc.

1. Introduction

The cell surface of all trypanosomatids, including the Leishma-nia species, are dominated by (GPI)-anchored proteins localizedon the outer layer of the plasma membrane. These proteins formprotective surface coatings and mediate essential host-parasite in-teractions, forming an effective macromolecular diffusion barrierthat protects the promastigotes from microbicidal processes suchas complement-mediated lysis, and attack by oxygen radicals andhydrolases in the mammalian and insect host environments [1,2].GPI-anchored proteins are a diverse set of (glyco)lipid-linked cell-surface, exoplasmic eukaryotic proteins [3]. They are believed tobe clustered in membrane microdomains generally called rafts [4],in association with glycosphingolipids, sphingomyelin, cholesterol,and other signaling proteins. However, some authors state thatthey are diffusely distributed on the cell surface, thus belying theexistence of rafts [3,5–8]. Whichever their distribution, the GPIanchor is covalently attached to the C-termini of proteins and con-sists of a glycan chain bound to phosphatidylinositol with two acylchains anchored into the membrane bilayer.

* Corresponding author. Fax: +55 16 36024838.E-mail address: [email protected] (P. Ciancaglini).

Some recent studies have reported the interaction between aGPI-enzyme (alkaline phosphatase as only one protein component)with a liposome system [9] and Langmuir monolayers [10,11], re-vealing that lipid composition is an important choice in proteinreconstitution. There are very few results concerning the natureof the interaction involving GPI-anchored proteins from Leishmaniawith biomimetic membrane systems.

Lipid bilayers, vesicles, and Langmuir monolayers are the mostcommonly employed biomimetic systems. Each of them has spe-cific advantages, depending on the aspect or application of inter-est [12–15]. Liposomes and bilayer vesicles encapsulating aqueouscontents have been used as delivery systems for drugs, peptides,proteins, and DNA [16].

The reconstitution of membrane proteins into liposomes hasbeen shown to be a useful tool for the preparation of antigeniccomponents that induce immunity in experimental models [17–20]. Liposomes have been demonstrated to serve as appropriateantigen carriers for the generation of antibody response in vivo andas effective vehicles for peptides and proteins, thus enhancing theirimmunogenicity [21,22]. In addition, liposomes have adjuvant ac-tivity in vaccines against protozoan parasites [23–25].

Langmuir monolayers are formed by the spreading of insolubleamphiphilic molecules, such as lipids, at the air/water interface,producing monomolecular films that can be compressed by meansof barriers sliding on the interface [26,27]. They constitute half of

0021-9797/$ – see front matter © 2009 Published by Elsevier Inc.doi:10.1016/j.jcis.2009.01.043

http://www.ScienceDirect.com/

http://www.elsevier.com/locate/jcis

mailto:[email protected]

http://dx.doi.org/10.1016/j.jcis.2009.01.043

ARTICLE IN PRESS

UN

CO

RR

EC

TED

PR

OO

F



2 M.C. Colhone et al. / Journal of Colloid and Interface Science ••• (••••) •••–•••

1 67

2 68

3 69

4 70

5 71

6 72

7 73

8 74

9 75

10 76

11 77

12 78

13 79

14 80

15 81

16 82

17 83

18 84

19 85

20 86

21 87

22 88

23 89

24 90

25 91

26 92

27 93

28 94

29 95

30 96

31 97

32 98

33 99

34 100

35 101

36 102

37 103

38 104

39 105

40 106

41 107

42 108

43 109

44 110

45 111

46 112

47 113

48 114

49 115

50 116

51 117

52 118

53 119

54 120

55 121

56 122

57 123

58 124

59 125

60 126

61 127

62 128

63 129

64 130

65 131

66 132

a bilayer and can therefore be used as a biomembrane model [12].This system enables determination of surface densities and surfacepacking from the surface pressure (π )–area (A) curves.

Several substances have influence on the phospholipid packingand monolayer fluidity, quantified from the 2D isothermal com-pressibility Cs, or more often from the interfacial compressionmodulus C−1

s = −(∂π/∂ ln A)T . Therefore, addition of substancesable to simultaneously interact, with the phospholipid and proteinto be immobilized should alter the π–A curve and thus the mono-layer fluidity.

The effects of cholesterol on DPPC monolayers have been welldescribed in the literature. Many authors have described thatthe non-ideal behavior is promoted by mutual phospholipid–cholesterol interactions [28–31]. In this sense, the observed effectof condensation manifested in the presence of the sterol is at-tributed by some authors to formation of a complex between themolecules, or to a peculiar effect of the phospholipid head groups,which act as “umbrellas” and protect the apolar part of cholesterolfrom contact with water [31,32].

In this study, we have obtained GPI-anchored proteins of Leish-mania amazonensis promastigotes, hereafter called GPI-proteins,and reconstituted them in liposomes containing different DPPC/cholesterol ratios. The efficiency of multiple protein incorporationinto liposomes was characterized by isopycnic centrifugation insucrose gradient and dynamic light scattering. We also describeGPI-proteins penetration experiments on mixed DPPC/cholesterolmonolayers at different molar ratios, in order to investigate theinfluence of the membrane fluidity on protein incorporation ourresults reveal, for the first time, the cholesterol-dependent inser-tion of a GPI-anchored protein.

2. Materials and methods

2.1. Chemicals

All solutions were prepared using Millipore DirectQ ultra pureapyrogenic water. Bovine serum albumin (BSA); 3,3′-diaminobenzi-dine (DAB); dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC); 1-piperazine-ethane sulfonic acid; 4-(2-hydroxyethyl)-monosodium salt (HEPES);phosphate buffered saline (PBS); sodium dodecylsulfate (SDS);tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris); molecular weight mark-ers (14 to 205 kDa); cholesterol, polyoxyethylene-sorbitan mono-laurate (Tween 20); Triton X-114; RPMI-1640 and Schneider’smedium were purchased from Sigma Chemical Co. (St Louis, MO,USA). Peroxidase labeled goat anti-mouse IgG conjugate was ac-quired from Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham,AL, USA). Biobeads SM2-adsorbent resin was obtained from Bio-Rad (Hercules, CA, USA). All other reagents, salts, and solvents,grade p.a. from known suppliers, were used. RPMI-1640 mediumwas supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum(Cultilab, Brazil), 20 mM HEPES, 0.5 μg mL−1 gentamicin, and0.2 μg mL−1 sodium bicarbonate.

2.2. Mice and parasites

Female BALB/c mice, 8–12 weeks old, were bred and main-tained under standard conditions in the animal facility at theFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de SãoPaulo. The parasite strain IFLA/BR/67/PH8 of L. amazonensis wasmaintained in BALB/c [33,34]. The amastigotes were isolated fromfootpad lesions of infected mice and transferred to Schneider’smedium.

2.3. Preparation and solubilization of GPI-anchored protein ofL. amazonensis

L. amazonensis promastigotes were cultured at 26 ◦C in Schnei-der’s medium containing 10% fetal calf serum (FCS). Promastigoteswere harvested at the early stationary phase (day 4 to 5), at thepeak of their cytolytic activity [35]. Parasites were washed twicewith 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.25 containing 10 mM NaCl,and 2 mM CaCl2. Pellets obtained by centrifugation at 1200g for15 min, were kept at −20 ◦C until required.

The frozen promastigote pellets were resuspended in the samebuffer and sonicated at 4 ◦C during 30 s at 240 W, centrifugedat 1000g for sedimentation of organelles, nuclei and intact cells,which were discarded. Membrane fractions were isolated aftersupernatant ultracentrifugation at 100,000g for 1 h at 4 ◦C. The re-suspended pellet was ultracentrifugated again, in the same condi-tions above. Samples of membrane fraction proteins (0.5 mg mL−1)were solubilized in 1% Triton X-114 for 1 h at 4 ◦C, under con-stant agitation, and vortexed at 10-min intervals [36]. After phaseseparation at 20 ◦C, the detergent-rich phase, aqueous phase andmembrane-containing pellet were analyzed by SDS-PAGE andWestern blotting.

2.4. PI-PLC treatment

To confirm the presence of GPI-proteins in the detergent richphase, an aliquot of this fraction (0.2 mg mL−1 of total protein)was incubated with 0.2 U mL−1 phosphatidylinositol-specific phos-pholipase C (PI-PLC from B. thuringiensis) for 1 h, under constantstirring, at 37 ◦C. Both samples were centrifuged at 100,000g for20 min, at 4 ◦C. The supernatants were analyzed by SDS-PAGE andWestern blotting.

2.5. Estimation of protein concentration

Protein concentration was estimated in the presence of SDS2.0% (w/v) by the procedure described by Hartree [37], using crys-tallized BSA as standard. The method described by Read and North-cote [38], which also uses crystallized BSA as standard, was em-ployed to estimate protein concentration in the fractions collectedafter isopycnic density gradient centrifugation.

2.6. Antiserum preparation

BALB/c mice were infected subcutaneously in the lipid footpadwith 106 stationary growth phase L. amazonensis promastigotes.Two months after infection, the animals were bled, and the serumagainst total L. amazonensis antigenic determinants was collected.

In addition, in order to analyze the protein extract of L. ama-zonensis in the proteoliposome, BALB/c mice were immunized in-traperitoneally with 40 μg of proteoliposomes, and the serum wascollected 14 weeks after immunization.

2.7. SDS–polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting

Determination of the molecular mass of the proteins wasachieved by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), as de-scribed by Laemmli [39]. Briefly, 5% polyacrylamide was used forthe stacking gel and 10% for the running gel. The gels were silver-stained for visualizations of the protein band profile. Molecularweight markers ranged from 10 to 120 kDa. Western blotting wasperformed by electrophoretically transferring the protein bandsto a nitrocellulose membrane. The membrane was treated withblocking buffer (PBS, containing 5% (w/v) nonfat milk and 0.05%(w/v) Tween 20) for 1 h and probed with antiserum against totalL. amaonensis at a dilution of 1:75 in the blocking buffer overnight.

Original text:

Inserted Text:

Polyacrylamide

ARTICLE IN PRESS

UN

CO

RR

EC

TED

PR

OO

F



M.C. Colhone et al. / Journal of Colloid and Interface Science ••• (••••) •••–••• 3

1 67

2 68

3 69

4 70

5 71

6 72

7 73

8 74

9 75

10 76

11 77

12 78

13 79

14 80

15 81

16 82

17 83

18 84

19 85

20 86

21 87

22 88

23 89

24 90

25 91

26 92

27 93

28 94

29 95

30 96

31 97

32 98

33 99

34 100

35 101

36 102

37 103

38 104

39 105

40 106

41 107

42 108

43 109

44 110

45 111

46 112

47 113

48 114

49 115

50 116

51 117

52 118

53 119

54 120

55 121

56 122

57 123

58 124

59 125

60 126

61 127

62 128

63 129

64 130

65 131

66 132

Excess proteins were removed with four 5 min washes, with wash-ing buffer (PBS, containing 0.05% (v/v) Tween 20). Finally, themembrane was probed with peroxidase-labeled goat anti-mouseIgG conjugate at a 1:1000 dilution in the washing buffer. The DABsubstrate was used to reveal protein–antibody interaction.

2.8. Liposome and proteoliposomes preparation

Liposomes and proteoliposomes were prepared with cholesteroland DPPC at different ratios. The phospholipids and cholesterol inappropriate proportion (6 mg) were dissolved in 1 mL chloroform,and dried under nitrogen flow, and the obtained lipid film wasmaintained under vacuum for 1 h. Then, 6 mL of a 50 mM Tris-HClbuffer solution was added to the film. The mixture was incubatedfor 1 h at 60 ◦C, above the critical temperature of the lipid, andvortexed at 10 min intervals. After that, the lipid emulsion wassonicated, for 2 min at 240 W, by means of a microtip. The ob-tained mixture was centrifuged at 100,000g for 20 min at roomtemperature, and the pellet was discarded. The supernatant thatcorresponds to small unilamellar vesicles was used to obtain theproteoliposome.

A protein sample obtained from the Triton X-114 rich phase(0.25 mg of total protein) was treated with 0.07 g mL−1 Biobeadshydrophobic resin for 5 h at 4 ◦C, to remove excess detergent.The resulting sample was then mixed with 4 mL of the previ-ously obtained liposome. The mixture was incubated overnight atroom temperature. Finally, the resulting solution was centrifugedat 100,000g for 1 h. The pellet, constituted by proteoliposomes,was resuspended in 50 mM Tris-HCl buffer, and the supernatantwas discarded. The phospholipids and cholesterol were quantifiedas described by Chen, Toribara and Warner [40], and Higgins [41],respectively.

After standardization, the usual liposome and proteoliposomepreparations were achieved using a 1.5:1 DPPC/cholesterol molarratio. The resulting preparations were employed in the other stepsof this work.

2.9. Isopycnic density gradient centrifugation

A continuous sucrose gradient was prepared (1–15% sucrose in50 mM Tris-HCl buffer, density ranging from 3.0 to 10.6 g mL−1)using a Gradient Maker (Hoefer Scientific Instruments San Fran-cisco, CA). Samples of solubilized GPI-anchored protein, liposomesor proteoliposomes (1 mL) were loaded onto the gradient and cen-trifuged in a Hitachi P65VT3 vertical rotor, in a Hitachi 55P-72ultracentrifuge at 180,000g for 4 h at 4 ◦C. The gradients werethen fractioned into 0.5 mL fractions and analyzed for protein andinorganic phosphate content, as described by Chen, Toribara andWarner [40].

2.10. Light scattering of proteoliposomes

The determination of liposome and/or proteoliposome size dis-tribution was done by dynamic light scattering using a BeckmanCoulter (model N5 submicron particle size analyzer). The samplewas filtered and diluted to an adequate polydispersion index.

2.10.1. Langmuir monolayers: π–A isotherms and adsorption kineticsLangmuir monolayers of the DPPC/cholesterol mixtures were

prepared at 24 ± 0.5 ◦C, in a Langmuir trough (Insight-Brazil), byspreading a 1 mg mL−1 lipid solution on a buffer solution (50 mMTris-HCl, pH 7.25 containing 10 mM NaCl, and 2 mM CaCl2). Themonolayer was compressed up to 30 mN m−1. After that, a smallaliquot of protein solution (6.25 μg mL−1), previously treated withBiobeads as described above, was injected into the subphase nearto the interface, and the π values were monitored as a function oftime.

Fig. 1. Silver-stained SDS-PAGE gel proteins from promastigotes L. amazonensis.(P) Molecular mass standard proteins in kDa. (a) Membrane fraction from promatig-ote cells. Aliquots of 0.5 mg mL−1 of membrane fraction were mixed with TritonX-114 at 4 ◦C, as described in Section 2: (b) membrane-containing pellet; (c) aque-ous phase; (d) detergent-rich phase. An aliquot of the detergent-rich phase wastreated with PI-PLC: (e) corresponds to the supernatants after the treatment de-scribed in Section 2.

3. Results and discussion

3.1. Solubilization of L. amazonensis membrane and identification ofantigenic proteins

To begin the analysis of the surface of the L. amazonensispromastigote membrane, preparations were solubilized in Tri-ton X-114, which has been frequently used to obtain prepara-tions enriched with GPI-anchored proteins from crude cellularhomogenates. This procedure separates the proteins into threefractions, according to their solubility behavior [36,42]. After atemperature-dependent phase separation, amphipathic integralmembrane and GPI-proteins were recovered in the detergentphase, and the aqueous phase containing non-membrane-boundhydrophilic components was removed. Analysis by SDS-PAGE ofL. amazonensis membrane proteins demonstrated the presence ofa limited number of components ranging from 20 to 66 kDa(Fig. 1). Several repeated assays revealed a well-stabilized andreproducible GPI-anchored protein pattern. This indicates the re-liability of the separation methodology and its reproducibility toobtain specific GPI-anchored protein rich fractions with approxi-mately 65–60, 52, and 50–47 kDa (Fig. 1d) compared with thosepreviously obtained by other researcher on surface proteins ofLeishmania [43,44]. The maximum recovery of solubilized GPI-anchored protein was 8% in the detergent-rich phase. The cellsurfaces of all trypanosomatids are dominated by GPI-anchoredprotein and/or free GPI glycolipids, which form protective sur-face coatings and mediate essential host-parasite interaction [2].Furthermore, GPI-anchored proteins can be easily identified bytreatment with PI-PLC, which hydrolyze the phosphodiester bond,thus producing diradylglycerol and an inositol cyclic phosphate onthe reminiscent glycosyl moiety of the protein [45]. Therefore, toconfirm that we were recovering GPI-anchored proteins from theparasite extract, after phase separation at 20 ◦C, the detergent richphase was treated (0.2 mg mL−1 of total protein) with 0.2 U mL−1

of PI-PLC of the Bacillus thuringiensis, and analysis by SDS-PAGEshowed similar results between the sample of the detergent-richphase and the sample treated with PI-PLC (Fig. 1e). This suggestsloss of their covalently bound lipid moiety, indicating that theseproteins were anchored to the membrane domains through theGPI anchor. Fig. 2 shows the antigenic profiles of the crude ex-tract and Triton X-114-solubilized protein extract after reactionwith antiserum against total L. amazonensis antigenic determi-nants.

ARTICLE IN PRESS

UN

CO

RR

EC

TED

PR

OO

F




1 67

2 68

3 69

4 70

5 71

6 72

7 73

8 74

9 75

10 76

11 77

12 78

13 79

14 80

15 81

16 82

17 83

18 84

19 85

20 86

21 87

22 88

23 89

24 90

25 91

26 92

27 93

28 94

29 95

30 96

31 97

32 98

33 99

34 100

35 101

36 102

37 103

38 104

39 105

40 106

41 107

42 108

43 109

44 110

45 111

46 112

47 113

48 114

49 115

50 116

51 117

52 118

53 119

54 120

55 121

56 122

57 123

58 124

59 125

60 126

61 127

62 128

63 129

64 130

65 131

66 132

Fig. 2. Western blotting analysis of proteins from promastigotes L. amazonensis.(a) Membrane fraction from promatigote cells. Aliquots of 0.5 mg mL−1 of mem-brane fraction were mixed with Triton X-114 at 4 ◦C, and carried out as describedin Section 2: (b) membrane-containing pellet; (c) aqueous phase; (d) detergent-richphase. An aliquot of the detergent-rich phase was treated with PI-PLC: (e) corre-sponds to the supernatants after the treatment described in Section 2.

Table 1Summary of the lipid composition (mol mol−1 ratio) and average diameters (nm)of the liposomes and proteoliposomes preparations done as described in Section 2.Lipid proportions were determined in the initial mixture and in the prepared lipo-somes. The diameters of the liposome and the proteoliposome were determined inthree different preparations (mean ± SD).

DPPC/cholesterolratio (mol mol−1)

Diameter (nm)

Liposome Proteoliposome

1:0 99.4 ± 8 Not formed2.14:1 78.7 ± 12 204 ± 131.5:1 71.8 ± 9 178 ± 211.2:1 82.7 ± 13 224 ± 410.9:1 82.5 ± 11 197 ± 15

3.2. Liposome and proteoliposome preparation and characterization

In order to prepare liposome and proteoliposomes, differentcholesterol/DPPC ratios 0 to 1.1) and 0.0625 mg mL−1 of TritonX-114 solubilized GPI-protein extract (Table 1) were used. Lipo-somes were formed in all the studied conditions, but incorpora-tion of the GPI-proteins occurs in the presence of cholesterol only,reaching a maximum of protein adsorption (57 ± 9%) when a 2:1DPPC/cholesterol ratio was employed. The increase in cholesterolquantities does not increase GPI-protein adsorption.

The increase in the amount of cholesterol does not expres-sively affect the liposome hydrodynamic diameter, as indicated inTable 1. However, after GPI-protein adsorption, the diameters ofthe proteoliposomes are approximately twofold larger than thatof the liposome (see Table 1). It is noteworthy that pure DPPCdoes not form proteoliposomes, demonstrating the importance ofcholesterol in the system. Incorporation of the protein into vesi-cles depends on the synergic combination of several factors in thepolar head group, the hydrocarbon chains and aqueous environ-ment [46]. In previous works it was described that the incorpo-ration of antigenic membrane proteins of Pasteurella multocida inliposome was dependent on the length of the fatty acid hydrocar-bon chains and the type of polar head group of the phospholipidcomponent in the liposomes [9,17]. Both parameters affect the flu-idity of the liposome system. In addition, SDS-PAGE of proteoli-posomes revealed a variety of proteins with a distribution similarto that observed in the Triton X-114-solubilized protein extract ofL. amazonensis, indicating the nonselective incorporation of para-site proteins into the liposomes (Fig. 3c). Our results suggest thatL. amazonensis GPI-proteins are efficiently incorporated on proteoli-

Fig. 3. (A) Silver-stained SDS-PAGE of proteins from L. amazonensis. (B) Western blot-ting analysis of protein extract from L. amazonensis as described in Section 2. Seraused were collected 14 weeks after the intraperitoneal immunization of mice with40 μg of total protein present in proteoliposomes. (P) Molecular mass of standardprotein in kDa. (a) Membrane fraction from promatigote cells; (b) Triton X-114-solubilized proteins extract; and (c) proteins present in the proteoliposome.

Fig. 4. Isopycnic density sucrose gradient centrifugation study. (A) Liposome; (B) Tri-ton X-114-solubilized protein extract from L. amazonensis; and (C) Proteoliposome.(!) Protein, absorbance at 595 nm; (") lipid, absorbance at 820 nm; and (2) per-cent sucrose.

posomes containing the palmitoyl acyl chain, which is present inphosphatidylcholine and cholesterol.

To characterize the degree of incorporation of L. amazonensisGPI-protein into proteoliposomes, an isopycnic density gradientcentrifugation was performed, and the fractions were assayed forprotein and phosphate contents (Fig. 4). A peak for the inorganic

ARTICLE IN PRESS

UN

CO

RR

EC

TED

PR

OO

F




1 67

2 68

3 69

4 70

5 71

6 72

7 73

8 74

9 75

10 76

11 77

12 78

13 79

14 80

15 81

16 82

17 83

18 84

19 85

20 86

21 87

22 88

23 89

24 90

25 91

26 92

27 93

28 94

29 95

30 96

31 97

32 98

33 99

34 100

35 101

36 102

37 103

38 104

39 105

40 106

41 107

42 108

43 109

44 110

45 111

46 112

47 113

48 114

49 115

50 116

51 117

52 118

53 119

54 120

55 121

56 122

57 123

58 124

59 125

60 126

61 127

62 128

63 129

64 130

65 131

66 132

Fig. 5. Surface pressure–area (π–A) curves for lipid monolayers constituted by: (—) pure DPPC; (- - -) DPPC/cholesterol 1.5:1 molar ratio; and (· · ·) DPPC/cholesterol 1:1 molarratio. Insert: C−1

s values corresponding to the isotherms. The isotherms were recorded at 24 ± 0.5 ◦C, in a Langmuir monolayer as described in Section 2, by spreading a1 mg mL−1 lipid solution on a buffer solution constituted by 50 mM Tris-HCl, pH 7.25 containing 10 mM NaCl, and 2 mM CaCl2. The experiments were carried out intriplicate and the curves represent average values.

phosphate, generated from the acid hydrolysis of the lipids, wasfound in the range of 4% sucrose, corresponding to the liposomefraction (Fig. 4A). As shown in Fig. 4B, analysis of the solubilizedGPI-protein extract revealed the presence of protein in the nearmiddle region of the gradient (around 8–10% sucrose concentra-tion). Finally, proteoliposomes showed a single peak at 6% sucrose,for both the inorganic phosphate and protein, indicating efficientincorporation during reconstitution of solubilized GPI-protein ex-tract (Fig. 4C). Our results concerning the use of sucrose densitygradients to characterize protein incorporation on the lipid bi-layer of liposomes suggest that liposomes reconstituted with DPPCand cholesterol present a peak of phosphate due to the acid hy-drolysis of phospholipids. This gives evidence of liposome pop-ulations distributed in a single peak. Proteoliposomes showed asingle symmetric elution profile, as detected by phosphate andprotein estimation, indicating a remarkably homogeneous distri-bution of the vesicle population and the consistent absence ofother lipid–protein aggregates. Furthermore, these systems appearin lower densities probably because of their cholesterol content, asdescribed by other authors [47]. Our results clearly show that themethod employed here may lead to efficient protein reconstitution.

3.3. Incorporation on Langmuir monolayers

Fig. 5 shows the surface pressure–area isotherms obtained us-ing pure DPPC and in the presence of different DPPC/cholesterolmolar ratios. The isotherm obtained for pure DPPC displays thecharacteristic liquid-expanded (LE) to liquid-condensed (LC) phasetransition represented by a plateau around 10 mN m−1 and a mini-mum area, taken as the extrapolation of the more-condensed stateto a nil surface pressure, around 60 Å2, in agreement with previ-ous reports [48]. This area, relatively lower than those describedby several authors, could be attributed to the buffer composi-tion present in the subphase. The coexistence region between theliquid-expanded (LE) and liquid-condensed (LC) states observed forthe DPPC monolayer was eliminated in the presence of choles-terol. This observation is largely attested in the literature even forother PC derivatives/cholesterol compositions [31,48]. This effectof cholesterol on the surface pressure is probably a consequence

of the highly amphiphilic character of cholesterol compared withDPPC. The minimum areas observed for DPPC were approximately60 Å2, and for DPPC/cholesterol 1.5:1 and 1:1 molar ratios thisvalue decreased to 50 and 43 Å2, respectively. The insert in Fig. 5shows that the compressional modulus (C−1

s ), corresponding to theisotherms, increases as the cholesterol content in the compositionof the mixed monolayers increases. These results denote alterationsin fluidity promoted by the presence of cholesterol, since highercontents of the sterol resulted in more condensed monolayers. Thecondensing effect of sterols on phospholipid monolayers has longbeen known, being attributed by the majority of authors to the for-mation of stable phospholipids/sterol complexes in the condensedregion, as a consequence of hydrogen bond formation betweenboth components [49]. These complexes have been intensively in-vestigated by different morphological techniques such as Brewsterangle microscopy (BAM) and epifluorescence microscopy measure-ments [50], which resulted in the observation of domains rich inone of the compounds. These observations could be related withthe ability of the GPI-proteins to incorporate into the mixed mono-layer, influenced by the alteration in fluidity and domain formationpromoted by cholesterol.

Nonionic surfactants are often used to solubilize GPI-proteins,and spreading of the protein in a large area/volume ratio causes itsdilution and surface precipitation [14,51]. Caseli et al. [52] verifiedthe influence of C12E9 on the surface properties of a GPI-alkalinephosphatase by measuring surface pressure curves and monolayertransfer with mass quantification by the quartz crystal microbal-ance technique. Their results indicated that, in that specific case,the nonionic surfactant effect could be neglected. Since the pro-tein/surfactant ratios employed to solubilize the GPI-proteins byCaseli et al. [10,52] and in the present work were similar, we mayadopt the idea that the influence of the detergent solubilized GPI-protein is mainly due to the protein itself.

Changes in surface pressure upon injection of the GPI-proteinshown in Fig. 6 represent the kinetics of protein penetration onthe monolayer constituted by DPPC alone and in the presence ofdifferent DPPC/cholesterol ratios. The arrow at 30 mN m−1 in 10 srepresents the injection point. The lipid Langmuir monolayer waspreformed and compressed up to 30 mN m−1. This lipid packing

Original text:

Inserted Text:

seconds

ARTICLE IN PRESS

UN

CO

RR

EC

TED

PR

OO

F




1 67

2 68

3 69

4 70

5 71

6 72

7 73

8 74

9 75

10 76

11 77

12 78

13 79

14 80

15 81

16 82

17 83

18 84

19 85

20 86

21 87

22 88

23 89

24 90

25 91

26 92

27 93

28 94

29 95

30 96

31 97

32 98

33 99

34 100

35 101

36 102

37 103

38 104

39 105

40 106

41 107

42 108

43 109

44 110

45 111

46 112

47 113

48 114

49 115

50 116

51 117

52 118

53 119

54 120

55 121

56 122

57 123

58 124

59 125

60 126

61 127

62 128

63 129

64 130

65 131

66 132

Fig. 6. Kinetics of L. amazonensis GPI-protein adsorption on a monolayer at30 mN m−1 carried out as described in Section 2. The monolayers were con-stituted by: (—) pure DPPC; (- - -) DPPC/cholesterol 1.5:1 molar ratio; and (· · ·)DPPC/cholesterol 1:1 molar ratio. After stabilization of the surface pressure, a smallaliquot of the GPI-protein solution (6.25 μg mL−1), previously treated with Biobeads,was injected (as indicated by the arrow) onto the subphase near the interface, andsurface pressure was monitored as a function of time. The experiments were carriedout in triplicate and the curves represent average values.

was chosen be cause of the equivalence with the lipid packing in abiomembrane [53]. It is assumed that the bulk diffusion effects arethe same, since the injection was performed at the same point.The total volume was also considered the same for the studiedconditions. The injection of GPI-proteins on pure DPPC monolay-ers, Fig. 6, causes a fast increase in surface pressure, which remainsconstant for almost 8 min (around 42 mN m−1). After that, the sur-face pressure decreases exponentially, reaching lower values thanthe initial one.

The sequence of fast increase followed by a continuous de-crease in surface pressure has already been reported in the lit-erature for the adsorption of an alkaline phosphatase GPI-proteinonto a negatively charged phospholipid at high surface pressure[10]. However, in that case the resulting change in surface pres-sure (�π = πeq − πin), was almost zero, which is interpreted byother authors [14] as the absence of protein penetration withinthe monolayer at elevated surface pressure. On the other hand,on the basis of results from monolayer transfer and FTIR analysisCaseli et al. [11], concluded that the enzyme adsorbs in a piston-like behavior. After that, the polypeptide moiety organizes itself inthe subsurface. This maintains only the GPI-anchor at the interface,thus leading to the observed decrease in π .

By revising these papers, we can affirm that the interactionof the GPI-proteins with pure DPPC monolayer occurs at leastin two steps. Firstly, there is fast penetration due to a dilu-tion/precipitation, process which causes a transient reorientation ofthe phospholipid hydrophobic chains, analogous to the piston-likebehavior. The second step, however, differs from the one observedby Caseli et al. [11], since the equilibrium surface pressure is lowerthan the one measured for the pure DPPC monolayer. One couldexplain this result in two ways: either the protein is in fact atleast partially incorporated, causing an expansion of the monolayerand, increasing its fluidity and decreasing π , or some phospholipidmolecules are removed from the monolayer and solubilized intothe bulk phase by interaction with the GPI anchor of the protein.This second explanation is corroborated by the fact that there isno formation of proteoliposomes with pure DPPC (see Table 1).

Fig. 6 also shows the incorporation of the GPI-proteins onmixed DPPC/cholesterol monolayers. When a DPPC/cholesterol1.5:1 molar ratio was used, the increase in surface pressure oc-curs in steps or jumps (for 30 s) after 1 min of the GPI-protein

infection, and it remains constant at 30 min (around 47 mN m−1).The earlier stages of the adsorption, in which we observe someoscillation in π values, are probably due to the reorganization ofthe GPI-protein at the interface. Although these plateaus could beassociated with reorientation or changes in protein conformation,this is not usual. So it is likely that the plateaus are associatedwith the adsorption of different GPI-protein fractions, probably ac-cording to their molecular weights.

On the other hand, when a DPPC/cholesterol 1:1 molar ratiowas employed, the increase in surface pressure occurred in onestep after a delay time of about 20 s, and it remained constantsoon after 40 s (around 40 mN m−1). However, contrasting withthe curve obtained for the pure DPPC monolayer, the surface pres-sure for the mixed monolayers did not fall even after 40 min. For alower cholesterol content in the mixed monolayer (correspondingto a DPPC/cholesterol molar ratio of 1.5:1), the delay time shifts to50 s and the equilibrium surface pressure surpasses 45 mN m−1.Onthe basis of the effect of cholesterol on the equilibrium elastic-ity or C−1

s , one may conclude that the initial penetration of theGPI protein on the mixed monolayer is facilitated by the morecondensed monolayer (higher cholesterol content), implying in alower delay time for adsorption. It has been previously reportedthat non-anchored polypeptides interacting solely with the lipidhead groups through electrostatic interactions and without pene-tration into the monolayer do not affect the surface pressure [54].However, the shift in area per phospholipid molecule observed forthe DPPC/cholesterol and DPPC/cholesterol/GPI-Protein (Figs. 5 and6, respectively) suggests that the molecular packing of DPPC athigh phospholipid surface density is influenced by the presenceof cholesterol and allows GPI insertion and stabilization. Therefore,it is likely that the difference in �π from ∼15 to ∼10 mN m−1 forDPPC/cholesterol ratios of 1.5:1 and 1:1 represents the incorpora-tion of the protein together with an effect of monolayer accom-modation. In other words, we believe that, although the proteincontent is roughly the same in the proteoliposome above a choles-terol content corresponding to a molar ratio DPPC/cholesterol of2.1:1, protein arrangement or distribution could be somehow mod-ified by probably considering the cholesterol-rich domain “rafts”within the membrane/monolayer.

The differences observed for the effect of increasing choles-terol concentrations on the surface isotherms of DPPC/cholesterolmixed monolayers (see Fig. 5) reinforce the importance of the GPIanchor for protein adsorption on the phospholipid monolayer. In-deed, large changes in the surface pressure are not expected tooccur for hydrophilic macromolecules, as is the case when GPIis removed [10]. This confirms that the absence of the diacyl-glycerol moiety in the protein resulted in lower surface activity.The hydrophobic anchor is apparently involved in the packing ofthe phospholipid molecules, and this process is dependent on themonolayer state and the presence of an on appropriate composi-tion to allow GPI adsorption and stabilization.

4. Conclusions

The influence of cholesterol on the adsorption of the GPI-hydrophobic anchor of the antigenic protein from L. amazonensisat Langmuir monolayers and liposomes has been studied. Our datashow that cholesterol in liposomes prepared by the mixed system,DPPC/cholesterol, facilitates the adsorption of GPI-proteins. Our re-sults also demonstrate that an increase in the cholesterol contentat the liquid–air interface speeds the adsorption of the GPI-proteinand its subsequent stabilization. In conclusion, the GPI-protein ex-hibits penetration phenomena on DPPC/cholesterol (1.5:1 or 1:1molar ratio) monolayers, forming mixed monolayers and stableproteoliposomes.

Original text:

Inserted Text:

minutes

Original text:

Inserted Text:

minute

Original text:

Inserted Text:

minutes

Original text:

Inserted Text:

seconds

Original text:

Inserted Text:

seconds

Original text:

Inserted Text:

minutes

Original text:

Inserted Text:

sec

ARTICLE IN PRESS

UN

CO

RR

EC

TED

PR

OO

F




1 67

2 68

3 69

4 70

5 71

6 72

7 73

8 74

9 75

10 76

11 77

12 78

13 79

14 80

15 81

16 82

17 83

18 84

19 85

20 86

21 87

22 88

23 89

24 90

25 91

26 92

27 93

28 94

29 95

30 96

31 97

32 98

33 99

34 100

35 101

36 102

37 103

38 104

39 105

40 106

41 107

42 108

43 109

44 110

45 111

46 112

47 113

48 114

49 115

50 116

51 117

52 118

53 119

54 120

55 121

56 122

57 123

58 124

59 125

60 126

61 127

62 128

63 129

64 130

65 131

66 132

Acknowledgments

The authors thank Mrs. Cynthia M. de Campos Prado Mansoand Priscila Cerviglieri for revision of the text. We also thankConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Ensino Su-perior (CAPES), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de SãoPaulo (FAPESP), and Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e As-sistência do Hospital das Clínicas da FMRP-USP (FAEPA) for finan-cial support. M.C.C. was the recipient of a scholarship from CAPES.

References

[1] A. Descoteaux, S.J. Turco, Biochim. Biophys. Acta 1455 (1999) 341.[2] S.C. Ilgoutz, M.J. McConville, Int. J. Parasitol. 31 (2001) 899.[3] M.J. McConville, M.A. Ferguson, Biochem. J. 294 (1993) 305.[4] K. Simons, E. Ikonen, Nature 387 (1997) 569.[5] S. Mayor, F.R. Maxfield, Mol. Biol. Cell 6 (1995) 929.[6] S. Mayor, K.G. Rothberg, F.R. Maxfield, Science 264 (1994) 1948.[7] R.G. Parton, B. Joggerst, K. Simons, J. Cell Biol. 127 (1994) 1199.[8] T. Fujimoto, J. Histochem. Cytochem. 44 (1996) 929.[9] F.L. Camolezi, K.R. Daghastanli, P.P. Magalhãe, J.M. Pizauro, P. Ciancaglini, Int. J.

Biochem. Cell Biol. 34 (2002) 1091.[10] L. Caseli, M.E.D. Zaniquelli, R.P.M. Furriel, F.A. Leone, Colloids Surf. B 25 (2003)

273.[11] L. Caseli, D.C. Masui, R.P.M. Furriel, F.A. Leone, M.E.D. Zaniquelli, J. Orbulesco,

R. Leblanc, J. Colloid Interface Sci. 320 (2008) 476.[12] H.L. Brockman, Curr. Opin. Struct. Biol. 9 (1999) 438.[13] R. Maget-Dana, Biochim. Biophys. Acta 1462 (1999) 109.[14] F. Ronzon, B. Desbat, J.P. Chauvet, B. Roux, Biochim. Biophys. Acta 1560

(2002) 1.[15] R.E. Brown, H.L. Brockman, Methods Mol. Biol. 398 (2007) 41.[16] M.R. Jaafari, A. Ghafarian, A. Farrokh-Gisour, A. Samiei, M.T. Kheiri, F. Mah-

boudi, F. Barkhordari, A. Khamesipour, Vaccine 24 (2006) 5708.[17] K.R.P. Daghastanli, R.B. Ferrreira, G. Thedei Jr., B. Maggio, P. Ciancaglini, Colloids

Surf. B Biointerfaces 36 (2004) 127.[18] Y. Kita, T. Tanaka, S. Yoshida, N. Ohara, Y. Kaneda, S. Kuwayama, Y. Muraki,

N. Kanamaru, S. Hashimoto, H. Takai, C. Okada, Y. Fukunaga, Y. Sakaguchi, I. Fu-rukawa, K. Yamada, Y. Inoue, Y. Takemoto, M. Naito, T. Yamada, M. Matsumoto,D.N. McMurray, E.C. Dela Cruz, E.V. Tan, R.M. Abalos, J.A. Burgos, R. Gelber,Y. Skeiky, S. Reed, M. Sakatani, M. Okada, Vaccine 23 (2005) 2132.

[19] F.R. Santos, D.B. Ferraz, K.R.P. Daghastanli, F.J. Ramalho-Pinto, P. Ciancaglini,J. Membr. Biol. 210 (2006) 173.

[20] V. Migliaccio, F.R. Santos, P. Ciancaglini, F.J. Ramalho-Pinto, Chem. Phys. Lip-ids 152 (2008) 86.

[21] J.M. Brewer, L. Richmond, F.Y. Leiw, J. Alexander, J. Immunol. 161 (1998) 4000.[22] R. Ignatius, K. Mahnke, M. Rivera, K. Hong, F. Isdell, R.M. Steinman, M. Pope,

L. Stamatatos, Blood 96 (2000) 3505.[23] F. Afrin, R. Rajesh, K. Anam, M. Gopinath, S. Pal, N. Ali, Infect. Immun. 70 (2002)

6697.[24] T. Mazumdar, K. Anam, N. Ali, Vaccine 22 (2004) 1162.[25] A. Uemura, S. Watarai, Y. Ohnishi, H. Kodama, J. Parasitol. 91 (2005) 73.[26] I. Langmuir, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3 (1917) 251.[27] I. Langmuir, V.J. Schaefer, D.M. Wrinch, Science 85 (1937) 76.[28] S.L. Regen, Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (2002) 729.[29] A. Radhakrishnan, H.M. McConnell, Biophys. J. 77 (1999) 1507.[30] T. Róg, M. Pasenkiewicz-Gierula, FEBS Lett. 502 (2001) 68.[31] P. Dynarowicz-Latka, K. Hac-Wydro, Colloids Surf. B Biointerfaces 37 (2004) 21.[32] J. Huang, G.W. Feigenson, Biophys. J. 76 (1999) 2142.[33] F.S.M. Noronha, A.C. Nunes, K.T. Souza, M.N. Melo, F.J. Ramalho-Pinto, Acta

Trop. 69 (1998) 17.[34] A.C. Nunes, F.R. Almeida-Campos, M.F. Horta, F.J. Ramalho-Pinto, Parasitol-

ogy 115 (1997) 601.[35] F.S.M. Noronha, F.J. Ramalho-Pinto, M.F. Horta, Infect. Immun. 64 (1996) 3975.[36] C. Bordier, J. Biol. Chem. 256 (1981) 1604.[37] E.F. Hartree, Anal. Biochem. 48 (1972) 422.[38] S.M. Read, D.H. Northcote, Anal. Biochem. 116 (1981) 53.[39] U.K. Laemmli, Nature 227 (1970) 680.[40] P.S. Chen Jr., T.Y. Toribara, H. Warner, Anal. Chem. 28 (1956) 1756.[41] G. Higgins, in: J.B.C. Findlay, W.H. Evans (Eds.), Biological Membranes, in: Prac-

tical Approach Series, IRL Press, Oxford, 1987, p. 104.[42] R.J. Etges, J. Bouvier, R. Hoffman, C. Bordier, Mol. Biochem. Parasitol. 14 (1985)

141.[43] R.M. Araújo Soares, A.L.S. Santos, M.C. Bonaldo, A.F.B. Andrade, C.S. Alviano,

J. Angluster, S. Goldenberg, Exp. Parasitol. 104 (2003) 104.[44] A.G. Hernandez, C. Arguello, C. Ayesta, F. Dagger, R.B. Infante, K. Stojanovich,

F. Dawidowicz, F. Riggione, G. La Riva, in: G.M. Slutzky (Ed.), The Biochemistryof Parasites, Pergamon Press, Oxford, 1981, p. 47.

[45] M.L. Cardoso de Almeida, N. Heise, Biol. Res. 26 (1993) 285.[46] J.L. Rigaud, Braz. J. Med. Biol. Res. 35 (2002) 753.[47] G. Cevc, D. March, Bilayer elasticity, in: E.E. Bittar (Ed.), Cell Biology: A Series

of Monographs, Wiley, New York, 1987, p. 347.[48] D. Chapman, N.F. Owens, M.C. Phillips, D.A. Walker, Biochim. Biophys. Acta 183

(1969) 458.[49] J.P. Slotte, Biochim. Biophys. Acta 26 (1995) 127.[50] L.D. Worthman, K. Nag, P.J. Davis, K.M.W. Keough, Biophys. J. 72 (1997) 2569.[51] L. Caseli, R.G. Oliveira, D.C. Masui, R.P.M. Furriel, F.A. Leone, B. Maggio, M.E.D.

Zaniquelli, Langmuir 21 (2005) 4090.[52] L. Caseli, D.C. Masui, R.P.M. Furriel, F.A. Leone, M.E.D. Zaniquelli, Colloids Surf.

B Biointerfaces 46 (2005) 248.[53] D. Marsh, Biochim. Biophys. Acta 1279 (1996) 119.[54] R.A. Demel, Y. London, W.S.M. Geurts van Kessel, F.G.A. Vossenberg, L.L.M. van

Deenen, Biochem. Biophys. Acta 311 (1973) 507.

Q1

Original text:

Inserted Text:

MCC

Original text:

Inserted Text:

Pratical

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas










http://www.livrosgratis.com.br/cat_1/administracao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_2/agronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_3/arquitetura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_4/artes/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_5/astronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_6/biologia_geral/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_8/ciencia_da_computacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_9/ciencia_da_informacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_7/ciencia_politica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_10/ciencias_da_saude/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_11/comunicacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1















http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1







Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

http://www.livrosgratis.com.br/cat_28/literatura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_30/literatura_de_cordel/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_29/literatura_infantil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_32/matematica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_33/medicina/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_34/medicina_veterinaria/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_35/meio_ambiente/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_36/meteorologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_45/monografias_e_tcc/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_37/multidisciplinar/1





http://www.livrosgratis.com.br/cat_38/musica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_39/psicologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_40/quimica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_41/saude_coletiva/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_42/servico_social/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_43/sociologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_44/teologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_46/trabalho/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_47/turismo/1







Proteínas ancoradas por GPI de promastigotas de ...livros01.livrosgratis.com.br/cp086569.pdf4.5...

Documents

Transcript of Proteínas ancoradas por GPI de promastigotas de ...livros01.livrosgratis.com.br/cp086569.pdf4.5...