PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO GÊNERO...

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO GÊNERO Prunus spp.

PAULO SÉRGIO GOMES DA ROCHA

Tese apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação da Profa. Dra. Márcia Wulff Schuch, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Agronomia, Área de Concentração: Fruticultura de Clima Temperado, para obtenção do título de Doutor em Ciências (Dr.).

PELOTAS RIO GRANDE DO SUL – BRASIL

MARÇO DE 2006

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Tese apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação da Profa. Dra. Márcia Wulff Schuch, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Agronomia, Área de Concentração: Fruticultura de Clima Temperado, para obtenção do título de Doutor em Ciências (Dr.).

PELOTAS RIO GRANDE DO SUL – BRASIL

MARÇO DE 2006

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TESE

Submetida como parte dos requisitos para obtenção do grau de

DOUTOR EM CIÊNCIAS

Programa de Pós-graduação em Agronomia Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel

Pelotas – RS, Brasil

Comitê de Orientação: Profª. Drª. Márcia Wulff Schuch – Orientadora - FAEM/UFPel Prof. Dr. Valmor João Bianchi – Co-orientador - IB/UFPel

Homologada em: ______/______/ 2006

Comissão Julgadora: Profª. Drª. Eugênia Jacira Bolacel Braga – IB/UFPel Prof. Dr. Valmor João Bianchi – IB/UFPel Prof. Dr. Valdecir Carlos Ferri – FAEM/UFPel Prof. Dr. Leo Rufato – UDESC Profª. Drª. Andrea De Rossi – FAEM/UFPel (Suplente)

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TESE

Submetida como parte dos requisitos para obtenção do grau de

DOUTOR EM CIÊNCIAS

Programa de Pós-graduação em Agronomia Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel

Pelotas – RS, Brasil

APROVADA EM: 21 de fevereiro de 2006. Homologada em: ____/____/ 2006 Por:

Profª. Dra. Andrea De Rossi Prof. Dr. Valdecir Carlos Ferri

Prof. Dr. Leo Rufato

Profª. Drª. Márcia Wulff Schuch (Orientadora)

Prof. Dr. Valmor João Bianchi (Co-orientador)

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Dados de catalogação na fonte:

(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744) Biblioteca de Ciências Agrárias

“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”

R672p Rocha, Paulo Sérgio Gomes da Propagação in vitro de porta-enxertos do

gênero Prunus spp. / Paulo Sérgio Gomes da Rocha ; orientadora Márcia Wulff Schuch. – Pelotas, 2006. –101 f.: il.

Tese (Doutorado). Fruticultura de Clima

Temperado. Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2006.

1. Pessegueiro 2. Qualidade de luz 3. Cultura

de tecido 4. Porta-enxertos I .Schuch, Márcia Wulff (orientadora) II. Título.

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O pessimista se queixa do vento, o otimista espera

que ele mude e o realista ajusta a vela.

(Willian George Ward)

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AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq), pela concessão da bolsa de estudos.

À Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel,

pela oportunidade de realização do Curso.

À Professora Drª. Márcia Wulff Schuch, pela orientação, conhecimentos

científicos e subsídios para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao professor Dr. Valmor João Bianchi, pela co-orientação, ensinamentos e

estímulo.

À Deus, pela sua presença em todos os momentos.

A minha mãe, por ter me possibilitado uma boa formação acadêmica e

pessoal.

A todos os colegas e amigos do curso de Pós-Graduação com que convivi

durante este período.

A minha namorada Clarice, pelo companheirismo, compreensão e incentivo.

Aos professores da FAEM, pelos conhecimentos científicos durante a

realização do curso.

Finalmente, minha gratidão sincera a todas as pessoas que de forma direta

ou indireta me ajudaram.

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ÍNDICE Página

SUMÁRIO....... ...................................................................................................... xvi

SUMMARY.......................................................................................................... xviii

1- INTRODUÇÃO GERAL....................................................................................... 1

2- CAPÍTULO 1 ....................................................................................................... 4

ESTABELECIMENTO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE PORTA-ENXERTO DE Prunus spp. ....................................................... 4

2.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 4

2.2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 9

2.2.1 MATERIAL VEGETAL.............................................................................. 9

2.2.2 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de quatro porta-enxertos de Prunus spp.................................................... 10

2.2.3 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5 ........................................... 11

2.2.4 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5........................................................... 12

2.2.5 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e BAP no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de pessegueiro cv. Tsukuba........................................................................................... 13

2.2.6 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio.......................... 14

2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 15

2.3.1 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de quatro porta-enxertos de Prunus spp.................................................... 15

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2.3.2 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5 ........................................... 18

2.3.3 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5........................................................... 23

2.3.4 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e BAP no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de pessegueiro cv. Tsukuba ...................................................................... 26

2.3.5 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio .............. 29

2.4 CONCLUSÕES ............................................................................................ 31

3- CAPÍTULO 2 ..................................................................................................... 33

MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE PORTA-ENXERTO DE Prunus spp. ..................................................... 33

3.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 33

3.2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 38

3.2.1 Diferentes meios e concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos porta-enxertos de Prunus cvs. Sírio e Mr. S. 2/5 ............... 38

3.2.2 Efeito das concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos porta-enxertos de Prunus cv. Tsukuba.......................................... 39

3.2.3 Influência da qualidade da luz e concentrações de BAP na multiplicação do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5...................... 40


3.3.1 Diferentes meios e concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos porta-enxertos de Prunus cvs. Sírio e Mr. S. 2/5 ............... 42

3.3.2 Efeito das concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos porta-enxertos de Prunus cv. Tsukuba.......................................... 46

3.3.3 Influência da qualidade da luz e concentrações de BAP na multiplicação do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5.................... 49

3.4 CONCLUSÕES ............................................................................................ 54

4- CAPÍTULO 3 ..................................................................................................... 55

ENRAIZAMENTO IN VITRO DO PORTA-ENXERTO DE Prunus spp. cv. Mr. S. 2/5......................................................................................... 55

4.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 55

4.2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 59

4.2.1 Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 .................................................... 59

4.2.2 Qualidade da luz e diferentes concentrações de AIB no enraizamento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5.......................... 60


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4.3.1 Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 .................................................... 62

4.3.2 Qualidade da luz e diferentes concentrações de AIB no enraizamento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5.......................... 67

4.4 CONCLUSÕES ............................................................................................ 73

5- CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................. 74

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 75

APÊNDICE............................................................................................................ 87

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LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Página TABELA 1- Principais características dos porta-enxertos de Prunus.

UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................... 7

TABELA 2- Características dos filtros de luz utilizados. UFPel, Pelotas- RS, 2006............................................................................................ 8

TABELA 3- Percentagem de estabelecimento in vitro dos explantes provenientes de duas diferentes porções de ramos de porta-enxertos de Prunus spp. UFPel, Pelotas-RS, 2006................ 16

TABELA 4- Percentagem de estabelecimento dos explantes da cv. Mr. S. 2/5 ao final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006............................................................................. 19

TABELA 5- Percentagem de oxidação dos explantes da cv. Mr. S. 2/5 ao final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................................................. 20

TABELA 6- Percentagem de vitrificação dos explantes de Mr. S. 2/5 ao final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ........... 21

TABELA 7 - Comprimento médio das brotações (mm) e número médio de folhas em brotações da cv. Mr. S. 2/5 formadas a partir de gema e segmento nodal ao final de 30 dias de cultivo, em função do agente solidificante. UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................................................. 22

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TABELA 8- Efeito de diferentes tipos de filtros sobre o comprimento médio das brotações (mm), número de gemas e número de folhas das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, aos 35 dias de estabelecimento. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ............ 25

TABELA 9- Percentagens de contaminação, estabelecimento e comprimento médio das brotações observados aos 30 dias de cultivo na fase de estabelecimento in vitro do porta-enxerto cv. Tsukuba, em função do meio de cultura. UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................. 26

TABELA 10- Percentagem de estabelecimento dos explantes provenientes de duas diferentes regiões dos ramos do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio. UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................................................. 29

CAPÍTULO 2

TABELA 1- Percentagem de brotações e número médio de brotações formadas ao final de 30 dias de cultivo in vitro, em função do meio de cultura . UFPel, Pelotas-RS, 2006 ................................ 43

TABELA 2- Comprimento médio das brotações dos porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio formadas ao final de 30 dias de cultivo em meio MS e QL. UFPel, Pelotas-RS, 2006.................................. 45

TABELA 3- Percentagem de brotação e número médio de brotações formadas a partir de ápice caulinar e segmento nodal isolado do porta-enxerto Tsukuba, aos final de 28 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ........................................ 46

CAPÍTULO 3

TABELA 1- Percentagem de enraizamento e número de raízes formadas pelas brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em meio MS acrescido de ágar ou vermiculita. UFPel, Pelotas-RS, 2006............................................................................. 63

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LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1

Página

FIGURA 1- Brotações da cv. Mr. S. 2/5 estabelecidas em meio líquido (1), phytagel (2) e ágar (3) a partir de segmento nodal (esquerda) e gema (direita), ao final de 30 dias de cultivo. UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................. 23

FIGURA 2- Aspecto das brotações do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5, provenientes do cultivo em meio MS e diferentes filtros de luz: SF (sem filtro); verde (nº 088 Lime green), azul (nº 115 Jas blue), azul (nº 724 Ocean blue) e verde (nº 738 Jas green). Pelotas-RS, 2006.......................................................... 25

FIGURA 3- Aspecto da brotação do porta-enxerto de Prunus cv. Tsukuba estabelecida in vitro, ainda ligado ao segmento nodal da planta matriz, aos 30 dias de cultivo. UFPel, Pelotas-RS, 2006............................................................................. 27

FIGURA 4- Comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba, aos 30 dias de cultivo in vitro em diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006. ......................... 28

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CAPÍTULO 2

FIGURA 1- Número médio de brotações formadas ao final de 30 dias, pelos porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio, cultivados em diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................................................. 44

FIGURA 2- Aspectos das brotações do porta-enxerto Tsukuba proveniente da fase de multiplicação, formadas a partir do segmento nodal (A) e ápice caulinar (B). UFPel, Pelotas-RS, 2006.......................................................................................... 47

FIGURA 3- Comprimento médio das brotações (mm), a partir de ápice caulinar do porta-enxerto cv. Tsukuba, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes concentrações de BAP, aos final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................................................. 48

FIGURA 4- Número médio das brotações formadas do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006. ......................... 50

FIGURA 5- Brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 proveniente da fase de multiplicação, em meio de cultura acrescido de 0,5; 1,0; e 2,0 mg L-1 de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006................. 50

FIGURA 6- Comprimento médio das brotações formadas pelo porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................................................. 51

FIGURA 7- Número médio de folhas formadas por brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes concentrações de BAP e diferentes qualidades de luz. UFPel, Pelotas-RS, 2006. .................................................... 53

CAPÍTULO 3

FIGURA 1- Percentagem de enraizamento do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 cultivado no meio MS, com diferentes concentrações de sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ........................................... 64

FIGURA 2- Número médio de raízes formadas das brotações do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 provenientes do cultivo em meio MS com diferentes concentrações de sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006............................................................................. 65

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FIGURA 3- Comprimento médio de raízes formadas pelo porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 cultivado no meio MS, acrescido de vermiculita ou ágar, em diferentes concentrações de sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006. ............................................... 66

FIGURA 4- Brotações de Mr.S. 2/5 provenientes do cultivo em meio de cultura MS com ágar ou vermiculita (esquerda/direita). UFPel, Pelotas-RS, 2006................................................................. 67

FIGURA 5- Percentagem de enraizamento in vitro das brotações do cv. Mr. S. 2/5, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes concentrações de AIB. UFPel, Pelotas-RS, 2006............................ 68

FIGURA 6- Número médio de raízes formadas por brotações do cv. Mr. S. 2/5, em meio MS acrescido de diferentes concentrações de AIB e cultivadas sob diferentes filtros de luz. UFPel, Pelotas-RS, 2006............................................................................. 70

FIGURA 7- Comprimento médio das raízes das brotações do cv. Mr. S. 2/5, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes concentrações de AIB. UFPel, Pelotas-RS, 2006............................ 71

FIGURA 8- Aspecto das brotações enraizadas do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5, provenientes do cultivo em meio MS acrescido por diferentes concentrações de AIB e cultivadas sob luz branca. UFPel, Pelotas-RS, 2006.................................................... 72

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SUMÁRIO

ROCHA, PAULO SÉRGIO GOMES DA, Universidade Federal de Pelotas, março de 2006. Propagação in vitro de porta-enxertos do Gênero Prunus spp. Orientadora: Drª. Márcia Wulff Schuch. Co-orientador: Dr. Valmor João Bianchi.

Na cultura do pessegueiro, a implantação de um sistema moderno e tecnificado

de produção de mudas é determinante para a obtenção de frutos de qualidade e

uma alta produtividade. Desta forma, a qualidade genética e sanitária do material

propagativo é imprescindível para alcançar o sucesso no empreendimento

agrícola. Com o objetivo de adequar uma metodologia de propagação e de

redução dos custos para a produção de mudas, foram desenvolvidos uma série de

experimentos com porta-enxertos de Prunus spp. nas fases de estabelecimento,

multiplicação e enraizamento in vitro. Os experimentos foram realizados na

Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel durante o período de 2003 a 2005. Para a

fase de estabelecimento foram utilizados os porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5, Sírio,

Tsukuba, Nemaguard, Nemared e Flordaguard. Nesta fase foram testados os tipos

de explantes, solidificantes do meio de cultura, qualidade da luz através da

utilização de filtros, efeito da localização da gema no ramo, tipos de meio de

cultura e diferentes concentrações de BAP. Na segunda fase, a de multiplicação,

para os porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5, Sírio e Tsukuba, avaliou-se a qualidade da

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luz, diferentes concentrações de BAP, tipos de explantes e meios de cultura. Na

terceira, a de enraizamento in vitro, avaliou-se a qualidade da luz, a vermiculita

como substituto do ágar no meio de cultura, diferentes concentrações de sacarose

e AIB no enraizamento do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5. Na fase de

estabelecimento observou-se que o melhor tipo de explante é o segmento nodal e

o ágar foi o melhor solidificante, pois, o phytagel causou vitrificação. Em relação à

qualidade da luz, o filtro verde nº 088 favoreceu a morfogênese das brotações do

porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. A melhor região no ramo para a coleta dos explantes

pode variar de acordo com o porta-enxerto. Na fase de multiplicação verificou-se

que a qualidade da luz não influenciou a formação das brotações. Não houve

formação de brotações adventícias no porta-enxerto cv . Tsukuba cultivado no

meio acrescido de até 1,2 mg L-1 de BAP. Dos explantes testados na cv . Tsukuba,

aquele contendo o ápice proporcionou o maior crescimento dos explantes. O meio

de cultura MS foi o que apresentou os melhores resultados na multiplicação. Para

a fase de enraizamento verificou-se que a adição de sacarose no meio de cultura

é imprescindível e que a vermiculita pode substituir o ágar no meio. Os filtros

utilizados para modificar as condições de luz não contribuíram para aumentar o

percentual de enraizamento in vitro das brotações da cv. Mr. S. 2/5.

xviii

xviii

SUMMARY

ROCHA, PAULO SÉRGIO GOMES DA, Universidade Federal de Pelotas, March 2006. In vitro propagation of Prunus spp. rootstocks. Adviser: Drª. Márcia Wulff Schuch. Co-adviser: Dr. Valmor João Bianchi.

To obtain peach plants that produce fruits of high quality and to obtain high

productivity, it is necessary a modern and tecnified nursery plant production. The

objective for this study was to establish an appropriated and low cost methodology

for production of nursery Prunus plants. The experiments were carried out at the

“Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel – Universidade Federal de Pelotas” during

the period from 2003 to 2005. For the in vitro establishment phase were used

explants of peach rootstocks cvs. Mr. S. 2/5, Sírio, Tsukuba, Nemaguard, Nemared

and Flordaguard. The variables evaluated on the establishment phase were: type

of explant; culture medium solidifiers; light quality; bud location; type of culture

medium; and different BAP concentrations in the media culture. Regarding to the in

vitro multiplication phase, the peach rootstocks cultivars tested were: Mr. S. 2/5;

Sírio; and Tsukuba, which were evaluated about the effects of the following

variables: light quality; BAP concentrations; type of explant; and type of culture

medium. Regarding to the in vitro rooting phase, the peach rootstock tested was

the cv. Mr. S. 2/5, which was evaluated about the following variables: light quality;

vermiculite as a substitute of agar in culture media; and sucrose and AIB

xix

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concentrations in culture medium. In the phase of in vitro establishment it was

observed that: in general the best explant was nodal segment; the best culture

medium solidifier was agar; the culture medium solidifier phytagel caused explants

vitrification; and the nº 088 green filter for light promoted shoot morfogenesis on

rootstock cv. Mr. S. 2/5. On the in vitro multiplication phase it was observed that:

light quality had no effect on sprouting; addition of BAP 1,2 mg L-1 to the culture

media had no effect on adventitious shooting in the Tsukuba rootstocks; the

sprouts from shoot tip explants had more growth; and the MS culture medium gave

the best results. On the in vitro rooting phase it was observed that: sucrose was

essential for in vitro rooting; vermiculite substituted for agar in medium without

affecting in vitro rooting; and the different light filters did not increase the

percentage of in vitro shoot rooting on the cv. Mr. S. 2/5.

1

1- INTRODUÇÃO GERAL

O Pessegueiro [Prunus persica (L.) Batsch], cultura originária da China e

pertencente à família Rosaceae, é uma das principais frutíferas de clima

temperado cultivadas na região Sul do Brasil, perdendo em área plantada apenas

para a videira e o citros (IBGE, 2005; Tofanelli et al., 2002).

Segundo dados do IBGE (2005), a área plantada com pessegueiro no

Brasil, nos últimos quatro anos, tem expandido em média 4% ao ano. Acredita-se

que, em nível comercial, se houvesse disponibilidade de mudas de pessegueiro

com qualidade genética, fitossanitária e fitotécnica, possivelmente ocorreria

elevação da produtividade.

A forma de propagação do pessegueiro na região Sul do país é,

tradicionalmente, realizada através da enxertia de borbulhas sobre os porta-

enxertos obtidos a partir de sementes provenientes de fábricas de conservas, as

quais não possuem garantia de qualidade genética e sanitária (Tofanelli et al.,

2001). Essa prática, possivelmente vem ocorrendo ao longo dos anos porque tem

como vantagem a facilidade de se obter caroços nas várias fábricas de conservas

de pêssego da região Sul do Estado do RS.

2

Entretanto, esse método de propagação de porta-enxerto apresenta

algumas desvantagens, entre as mais importantes, pode-se destacar a

segregação genética, a qual poderá ocasionar perdas de características

agronômicas desejáveis, desuniformidade das plantas no pomar e morte precoce

das plantas (Fachinello, 2000; Tofanelli et al., 2003).

Sendo assim, a propagação do pessegueiro por meio de estacas, tanto

para as cultivares de porta-enxerto quanto para as cultivares copa, é apontada por

alguns autores (Dutra et al., 2002; Miranda et al., 2003) como uma prática

promissora para a produção de mudas homogêneas, com baixo custo, rapidez no

processo de produção de mudas e manutenção das características agronômicas

importantes. Entretanto, mesmo sendo a produção de mudas por estaquia um

método bastante interessante, apresenta entraves e não tem sido uma alternativa

viável para a maioria das cultivares de importância econômica, devido ao baixo

percentual de enraizamento (Chalfun & Hoffmann, 1997; Rufato & Kersten, 2000).

Embora sejam utilizadas algumas técnicas, tais como o uso de reguladores

de crescimento (ácido indolbutírico - AIB), visando potencializar este método de

propagação e maximizar o percentual de estacas enraizadas, os resultados

obtidos não têm sido satisfatórios (Tofanelli et al., 2002).

Diante deste contexto, faz-se necessário buscar técnicas mais eficientes

para a produção de porta-enxertos. A técnica de cultura de tecidos tem ocupado

uma posição de destaque e se mostrado como uma alternativa viável de clonagem

de espécies lenhosas, para a formação de pomares clonais ou produção comercial

de mudas (Assis & Teixeira, 1998).

A qualidade genética e sanitária da muda são consideradas características

de fundamental importância para o sucesso da implantação de um pomar

comercial, uma vez que a fruticultura moderna está baseada em pomares

produtivos e o sucesso do empreendimento depende também da utilização de

mudas de qualidade (Fachinello, 2000).

3

Todavia, a possível substituição dos métodos tradicionais de produção dos

porta-enxertos de Prunus pela micropropagação requer que se tenha um domínio

da técnica de cultura de tecidos voltado para as cultivares de importância

econômica, para que possibilite a disponibilização do material propagado em

grande quantidade, principalmente para aos produtores de pessegueiro da região

Sul do Brasil.

A utilização da micropropagação para produção de mudas em escala

comercial visando atender as necessidades internas é uma realidade em alguns

países (Silva, 2004), principalmente em países da Europa, mais especificamente

na Itália onde boa parte da produção dos porta-enxertos é realizada por este

método de propagação (Loreti & Massai, 1995).

No Brasil, os trabalhos de micropropagação de cultivares de porta-enxerto

do gênero Prunus, especialmente para o pessegueiro, são relativamente

escassos. Recentemente, alguns autores demonstraram as dificuldades de

estabelecer in vitro os explantes (Rodrigues et al., 1999) e em multiplicar as

brotações estabelecidas dos porta-enxertos (Silveira et al., 2001).

O objetivo deste trabalho foi identificar nas fases de estabelecimento,

multiplicação e enraizamento o melhor meio de cultura, concentração de BAP, tipo

de explante, concentração de AIB e qualidade da luz para a propagação in vitro de

diferentes cultivares de porta-enxertos de pessegueiro.

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2- CAPÍTULO 1

ESTABELECIMENTO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE PORTA-ENXERTO DE Prunus spp.

2.1 INTRODUÇÃO

Em linhas gerais, o estabelecimento é uma das fases da micropropagação

que tem como objetivo estabelecer in vitro os explantes para os subseqüentes

experimentos de multiplicação e enraizamento.

Um dos principais problemas desta fase de cultivo é a contaminação dos

explantes por diversos organismos (fungos, bactérias e vírus), principalmente as

contaminações causadas por fungos e bactérias endógenas, que sendo de

crescimento lento, se difundem sobre os explantes após o material estar

estabelecido ou em fase de multiplicação (Couto et al., 2004; Mroginski et al.,

2002).

Outro fator que pode dificultar a fase de estabelecimento é a oxidação dos

explantes, ou seja, a liberação dos compostos fenólicos no meio de cultura,

através das células lesionadas pelo corte (Rodrigues et al., 1999). Em alguns

casos, além do escurecimento provocado no meio de cultura, tais compostos

5

podem causar toxidez, inibir o crescimento e ocasionar a morte do explante

(Grattapaglia & Machado, 1998). Algumas técnicas podem ser utilizadas

eficientemente no controle da oxidação, entre estas se destaca o uso de

substâncias anti-oxidantes como ácido ascórbico, carvão ativado, formulação de

meio de cultura mais diluído e o cultivo dos explantes no escuro por um período

máximo de uma semana. Entretanto, o uso de carvão ativado no meio de cultura

poderá dificultar a identificação de contaminação causada por bactéria (Silva,

2004; Rodrigues et al., 2003).

A contaminação dos explantes pode ser evitada ou minimizada através da

manutenção das plantas-matrizes cultivadas em vasos na casa-de-vegetação e a

realização do controle fitossanitário periódico com o uso de agroquímicos (Couto

et al., 2004).

As fontes de contaminações têm como origem a superfície ou o interior do

explante, falhas nos procedimentos de desinfestação e o próprio homem. Deste

modo, a correta identificação da fonte de contaminação e do tipo de

microorganismo são aspectos importantes para efetuar o controle e ter êxito no

estabelecimento; sendo a contaminação causada por fungo mais fácil de ser

controlada (Mroginski et al., 2002; Dantas et al., 2002).

Quanto ao meio de cultura para estabelecimento, de acordo com Andreu &

Marin (2005) podem ser utilizados diferentes tipos. Embora, o meio MS

(Murashige & Skoog, 1962) e suas diluições sejam os mais utilizados na

micropropagação, na fase de estabelecimento das espécies lenhosas os melhores

resultados foram obtidos com meios de culturas diluídos (Silva, 2004).

Ao meio de cultura podem ser adicionados fitorreguladores, visando suprir

as deficiências endógenas dos explantes isolados, estimular a multiplicação ou o

alongamento, mas nem sempre o uso destas substâncias na fase inicial de cultivo

é necessária (Rocha et al., 2004).

Para o estabelecimento in vitro, teoricamente, pode ser utilizado qualquer

tipo de explante da planta, em função da totipotência das células vegetais

(Grattapaglia & Machado, 1998). Mas, na maioria dos trabalhos envolvendo a

micropropagação de frutíferas os explantes escolhidos geralmente são gemas

6

apicais ou axilares (Erig & Fortes, 2002). De acordo com Silva (2004), o tamanho

do explante determina a sua sobrevivência e capacidade de crescimento. Se o

objetivo for somente o de propagar, é mais adequado iniciar o estabelecimento

com ápices ou segmentos caulinares contendo gemas axilares. No entanto, deve-

se considerar que a probabilidade de se isolar propágulos livres de agentes

contaminantes está relacionada com o tamanho do explante utilizado, pois, quanto

menor o explante maior a chance de obter brotações isentas de contaminantes e,

em conseqüência, menor a velocidade no desenvolvimento das mesmas (Torres

et al., 1998).

Os procedimentos de desinfestação, comumente utilizados, consistem em

uma dupla desinfestação mediante a imersão dos explantes em álcool (70% v/v)

durante 10-60 segundos, seguido de hipoclorito de sódio (1,0-2,5%) durante 5-30

minutos, com gotas de tensoativo (Tween-20) para favorecer a quebra da tensão

superficial. Em alguns casos, o hipoclorito de sódio é substituído pelo hipoclorito

de cálcio (6-12%) (Olmos et al., 2002; Mroginski et al., 2002).

Após a desinfestação, alguns patógenos podem permanecer latentes e se

proliferarem quando forem transferidos para um novo meio de cultura. Em geral,

estes patógenos podem ser controlados mediante o emprego de antibióticos

(ampicilina e rifampicina, entre outros) no meio de cultura, no entanto, devem ser

evitados porque alteram a composição do meio (Olmos et al., 2002).

Os explantes devem ser preferencialmente coletados a partir de brotações

novas e a época de coleta dos mesmos, em geral, deve ser realizada durante a

fase de crescimento ativo da planta, ou seja, após o final do período de

dormência, durante os meses mais quentes do ano (Grattapaglia & Machado,

1998). Pois, geralmente os órgãos jovens têm melhor resposta no estabelecimento

do que aqueles obtidos de materiais adultos. Entretanto, o melhor estádio de

desenvolvimento, ou época de coleta dos explantes, deve ser determinado para

cada espécie micropropagada (Willalobos & Torpe, 1991). Na tabela 1, são

apresentadas as principais características dos porta-enxertos utilizados neste

trabalho.

7

TABELA 1- Principais características dos porta-enxertos de Prunus. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Porta-enxerto

Origem genética

Propagação

Resistência

Flordaguard

Seleção de Nemaguard USA

Sementes

Meloidogyne incognita e M. javanica

Nemaguard Prunus pérsica e P. davidiana - USA

Sementes M. incognita e M. arenaria

Nemared Seleção de Nemaguard USA

Sementes M. incognita e M. javanica

Mr. S. 2/5 Prunus Cerasifera - Itália Estaquia e cultura de tecidos

Asfixia radicular

Sírio P. persica e P. amygdalus - Itália

Estaquia e cultura de tecidos

-

Tsukuba

P. persica - Japão

Sementes

M. incognita, M. javanica e M. mali

Fonte: Fachinello & Loreti (1995), Loreti (1994).

Em geral, os explantes na fase de estabelecimento são cultivados na

primeira semana em ambiente escuro, com temperatura de 25 + 2ºC, e

posteriormente transferidos para sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas

e densidade de fluxo de 25 µmol m-2 s-1 (Erig & Fortes, 2002; Rodrigues et al.,

1999).

Quanto à fonte de luz utilizada nas salas de crescimento dos laboratórios de

micropropagação, de acordo com Bula et al. (1991), embora as lâmpadas

fluorescentes sejam comumente usadas, este tipo de luz não é mais considerada

como ótima, por possuir e emitir diferentes comprimentos de ondas, sendo que,

atualmente, a melhor fonte de luz são os LEDs (Diodos Emissores de Luz), por

possuírem, dentre outras características, comprimento de onda específico e longo

período de vida útil. Entretanto, devido ao elevado custo, seu uso ainda é restrito.

8

Uma das alternativas utilizadas no estudo da qualidade da luz é a utilização

de filtros de luz, os quais são colocados sobre os frascos contendo os explantes, e

têm contribuído para a obtenção de bons resultados, como exemplo o

alongamento das brotações, número de entrenós e aumento da concentração de

clorofila (Piagnani et al., 2002; Muleo et al., 2001, Baraldi et al., 1988).

A função do filtro de luz é selecionar a transmissão ou bloquear a absorção

de elementos do espectro, emitido a partir de uma fonte de luz. As principais

características dos filtros de luz utilizados neste trabalho são apresentadas na

tabela 2.

Objetivou-se, neste trabalho, determinar o tipo de explante, posição do

explante no ramo, tipo de meio de cultura, concentração de BAP, solidificante do

meio de cultura e o filtro de luz mais adequado para o estabelecimento in vitro de

diferentes cultivares de porta-enxerto de Prunus spp.

TABELA 2- Características dos filtros de luz utilizados. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Comprimento de onda e Transmissão Tipo de Filtro

520 nm

670 nm

460 nm Verde Nº 088 69% 35% 2%

Azul Nº 115 70% 2% 35%

Azul Nº 724 45% 60% 35%

Verde Nº 738 18% 1% 0%

Fonte: Lee Filters® (2005), Rosco Color Filters® (2005).

9

2.2 MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micropropagação de

Plantas Frutíferas do Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia

Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas, durante o período de 2003 a

2005.

A fase de estabelecimento in vitro foi subdividida em cinco experimentos

independentes e a metodologia aplicada em cada um segue abaixo.

2.2.1 MATERIAL VEGETAL

Para os experimentos de estabelecimento foram utilizados os porta-

enxertos de Prunus spp. das cultivares Flordaguard, Nemaguard, Nemared, Mr. S.

2/5, Sírio e Tsukuba.

As plantas-matrizes destes porta-enxertos utilizadas como fonte de explante

foram cultivadas em vasos em casa-de-vegetação e, pulverizadas semanalmente

com Agrimicina® (2,4 g L-1 de Sulfato de estreptomicina) e Cercobin® (0,6 g L-1 de

Tiofanato metil) antes da coleta dos ramos.

10

2.2.2 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de quatro porta-enxertos de Prunus spp.

Este trabalho foi iniciado na segunda quinzena de dezembro de 2003 e teve

por objetivo identificar a melhor porção do ramo para isolamento dos explantes,

visando obter maior percentagem de estabelecimento.

Coletou-se dos porta-enxertos de Prunus spp., cvs. Flordaguard,

Nemaguard, Nemared e Mr. S. 2/5, ramos com 30 cm de comprimento, os quais

foram separados em dois grupos. O primeiro grupo foi retirado a partir do ápice do

ramo (0-15 cm – porção apical) e o segundo logo abaixo do ponto do corte (15-30

cm – porção basal).

A desinfestação dos ramos, após a desfolha, foi realizada em câmara de

fluxo laminar com álcool (70%) durante um minuto e hipoclorito de sódio (1,5%)

por 15 minutos, seguido da tríplice lavagem em água destilada autoclavada para

retirada dos resíduos de hipoclorito de sódio. Após a desinfestação, os ramos de

cada grupo (apical e basal) foram seccionados em segmentos nodais com

aproximadamente 10 mm de comprimento, em seguida foram inoculados em tubos

de ensaio com 8 mL de meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescido

de 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol, 0,75 mg L-1 de BAP, 0,5 mg L-

1 de GA3, 7,0 g L-1 de ágar e pH 5,8. Após a distribuição do meio de cultura nos

tubos de ensaio, estes foram autoclavados à temperatura de 121 ºC durante 15

minutos. Depois de inoculado, o material foi mantido durante sete dias em

ambiente escuro com temperatura de 25 + 1 ºC. Após este período, foi transferido

para sala de crescimento com mesma temperatura, fotoperíodo de 16 horas e

luminosidade de 25 µmol m-2 s-1.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em

esquema fatorial 4x2 (cultivar x porção do ramo), com quatro repetições por

tratamento, sendo a unidade experimental, em cada repetição, composta por seis

tubos de ensaio contendo um explante por tubo. As variáveis analisadas ao final

de 30 dias de cultivo foram: percentagem de contaminação bacteriana e fúngica e

percentagem de estabelecimento.

11

2.2.3 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5

Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de fevereiro de 2004, e teve

como objetivo avaliar o tipo de explante e solidificante. Os ramos coletados da

planta matriz cv. Mr. S. 2/5 foram desinfestados de acordo com a metodologia

descrita no item 2.2.2. Após a desinfestação, foram isolados a partir dos ramos

dois tipos de explantes: segmentos nodais com aproximadamente 10 mm de

comprimento e gemas axilares com tamanho de 5 mm.

Os explantes isolados foram cultivados em tubos de ensaio com 8 mL de

meio de cultura MS, acrescido de 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol,

0,75 mg L-1 de BAP, 0,5 mg L-1 de GA3, 0,05 mg L-1 de AIB e pH 5,8. Para a

solidificação do meio MS utilizou-se 6,5 g L-1 de ágar ou 2,5 g L-1 de phytagel. No

meio MS líquido utilizou-se uma ponte de algodão para suporte do explante.

Após a inoculação dos explantes nos meio de cultura estes foram

cultivados nas mesmas condições descritas no item 2.2.2.


esquema fatorial 2x3 (tipo de explante x tipo de solidificante), com quatro

repetições por tratamento, sendo a unidade experimental seis tubos de ensaio

contendo um explante cada.

As variáveis analisadas ao final dos 30 dias de cultivo foram: percentagem

de contaminação bacteriana e fúngica, percentagem de estabelecimento,

percentagem de oxidação, percentagem de vitrificação, comprimento médio das

brotações e número médio de folhas. Considerou-se como estabelecimento os

explantes que não apresentaram nenhuma contaminação e formaram brotação.

12

2.2.4 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5

Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de fevereiro de 2005 e teve

como objetivo avaliar o efeito de diferentes tipos de filtros de luz sobre o

estabelecimento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Os ramos coletados

foram desinfestados conforme a metodologia descrita anteriormente no item 2.2.2,

e depois seccionados em segmentos nodais com uma gema, medindo

aproximadamente 10 mm.

Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 8 mL de meio

de cultura MS reduzido a ¾ da composição normal dos sais, suplementado com

30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol, 7 g L-1 de ágar e pH 5,2. Em

seguida o material foi colocado em ambiente escuro com temperatura de 25 + 1

ºC, por sete dias. Transcorrido esse tempo, os tubos de ensaio com os explantes

foram transferidos para sala de crescimento com 16 horas de fotoperíodo,

luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e mesma temperatura. Sobre os tubos de ensaio

foram colocadas folhas de filtros da marca Lee Filters (Walworth Ind. Estate,

Andover, England): o filtro verde (nº 088 Lime green) permite, aproximadamente, a

transmissão de 69% da luz verde com comprimento de onda de 520 nm, 35% de

transmissão da luz vermelha com comprimento de onda de 670 nm e 2% de

transmissão da luz azul com comprimento de onda de 460 nm; o filtro azul (nº 115

Jas Blue) permite 35% de transmissão da luz azul, 70% da luz verde e 2% de luz

vermelha; o filtro azul (nº 724 Ocean Blue) permite 35% de transmissão da luz

azul, 45% de luz verde e 60% de luz vermelha; e o filtro verde (nº 738 Jas Green)

permite 18% de transmissão da luz verde, 1% da luz vermelha e 0% da luz azul.

No tratamento controle os tubos de ensaio permaneceram desprovidos da

cobertura, ou seja, sob luz fluorescente.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com

quatro repetições por tratamento, sendo os tratamentos, os tipos de filtros acima

citados, e cada repetição constituída por cinco tubos de ensaio contendo um

explante cada.

13

Após 35 dias de cultivo foram avaliadas as variáveis: percentagem de

contaminação bacteriana e fúngica, percentagem de oxidação, percentagem de

estabelecimento, comprimento médio das brotações, número médio de folhas e

número médio de gemas.

2.2.5 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e BAP no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de pessegueiro cv. Tsukuba

Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de março de 2004, com o

objetivo de identificar o melhor meio de cultura e concentração de BAP.

Segmentos nodais com uma gema e medindo aproximadamente 10 mm,

previamente desinfestados de acordo com a metodologia já descrita no item 2.2.2,

foram colocados em tubos de ensaio com 8 mL de meio de cultura. O meio de

cultura utilizado foi o meio MS com a concentração total dos sais e as reduções

em MS ¾ e MS ½. Os meios de cultura foram suplementados por 0,0; 0,4; 0,8 e

1,2 mg L-1 de BAP, 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol, 7,0 g L-1 de

ágar e pH 5,8. Em seguida o material foi colocado em ambiente escuro com

temperatura de 25 + 1 ºC, por sete dias. Após esse período, os tubos de ensaio

com os explantes foram colocados em sala de crescimento com fotoperíodo de 16

horas, luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e temperatura de 25 + 1 ºC.


esquema fatorial 3x4 (meio de cultura x concentração de BAP), com quatro

repetições por tratamento, sendo a unidade experimental seis tubos de ensaio

contendo um explante cada.

Após 30 dias de cultivo, avaliaram-se as percentagens de contaminação

(bacteriana e fúngica), percentagem de estabelecimento e comprimento médio das

brotações.

14

2.2.6 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio

Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de dezembro de 2004, e teve

por objetivo identificar a melhor porção do ramo para isolamento dos explantes e o

tipo de meio de cultura, visando obter maior percentagem de estabelecimento.

Após a desinfestação já descrita no item 2.2.2, segmentos nodais com uma

gema e 10 mm de comprimento foram retirados das porções do ramo de 0-15 e

15-30 cm, a partir do ápice. Os explantes foram inoculados em meio de cultura MS

(Murashige & Skoog, 1962), SH (Schenk & Hildebrant, 1972) e WPM (Lloyd &

McCown, 1980). Os meios de cultura foram acrescidos por 30 g L-1 de sacarose,

100 mg L-1 de mio-inositol, 7 g L-1 de ágar e pH 5,8.


esquema fatorial 2x3 (porção do ramo x meio de cultura), com quatro repetições

por tratamento, sendo a unidade experimental, em cada repetição, composta por

seis tubos de ensaio com um explante em cada tubo.

Após 35 dias de cultivo, avaliou-se à percentagem de estabelecimento,

percentagem de contaminação (fúngica e bacteriana) e comprimento médio das

brotações. Considerou-se como estabelecimento os explantes que não

contaminaram e formaram brotação.

Para análise estatística, os dados obtidos nos experimentos de

estabelecimento foram submetidos à análise de variância e alguns à análise de

regressão; as médias dos tratamentos foram comparadas estatisticamente pelo

teste de Duncan, através do Programa Estatístico Sanest (Zonta & Machado,

1992). Dados expressos em percentagem foram transformados em arco seno da

raiz quadrada de x/100.

15

2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.3.1 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de quatro porta-enxertos de Prunus spp.

Observou-se que os explantes iniciaram a brotação a partir do décimo dia

de cultivo. Esse rápido estabelecimento das brotações provavelmente esteja

relacionado à época de coleta, ou seja, verão, período em que a planta-matriz se

encontrava em ativo crescimento vegetativo. Este resultado está de acordo com

Rodrigues et al. (2003), que compararam o efeito da época de coleta dos

explantes no verão e outono e verificaram que os percentuais de estabelecimento

dos porta-enxertos Marianna e GF 677 foram maiores no verão.

Verificou-se que os segmentos nodais retirados da porção basal dos ramos

do porta-enxerto cv. Nemaguard apresentaram uma percentagem de

estabelecimento superior aos segmentos obtidos da porção apical da brotação da

planta matriz (Tabela 3). Possivelmente, na época de coleta (período de verão) as

gemas da porção apical do ramo não estavam completamente formadas e, desse

modo, interferiram negativamente na formação da brotação durante o

estabelecimento in vitro dos porta-enxertos.

16

De acordo com Villalobos & Thorpe (1991), o estado fisiológico da planta

influencia a capacidade morfogenética, de modo que o requerimento nutricional e

hormonal também é diferente em tecidos provenientes de diferentes idades

fisiológicas da planta. Outro fator importante é a posição relativa da gema.

Bressan et al. (1982) observaram que as gemas axilares de roseiras, obtidas da

parte média do ramo, desenvolveram-se mais rapidamente do que aquelas da

porção apical.

TABELA 3- Percentagem de estabelecimento in vitro dos explantes provenientes de duas diferentes porções de ramos de porta-enxertos de Prunus spp. UFPel, Pelotas-RS, 2006

*Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

Comparando-se o percentual de estabelecimento entre os porta-enxertos

observou-se que a cv. Mr. S. 2/5 apresentou a maior percentagem de brotações

estabelecidas, independente da porção do ramo de onde foram retirados os

segmentos (Tabela 3). Isto ocorreu provavelmente porque a formação e a

maturação das gemas nessa espécie são mais precoces e uniformes, para a

mesma época de coleta dos ramos, em relação às demais cultivares avaliadas,

contribuindo desta forma na maximização do estabelecimento in vitro das

brotações, não havendo interferência da porção do ramo.

Porta-enxerto Porção do ramo

Apical (0-15 cm) Basal (15-30 cm)

Mr. S. 2/5 100,00 aA 98,30 aA

Nemared 63,11 bA 80,55 aA

Flordaguard 19,80 cA 37,29 bA

Nemaguard 2,01 cB 80,54 aA

17

Os resultados obtidos permitiram inferir que a cv. Mr. S. 2/5 apresenta um

excelente potencial para micropropagação in vitro. Resultados semelhantes aos

obtidos com Mr. S. 2/5 foram observados nas cvs. Nemared e Nemaguard

quando utilizados os explantes retirados da porção basal do ramo (Tabela 3).

Os explantes da cv. Nemaguard, retirados da região apical, tiveram um

baixo percentual de estabelecimento (2%) quando comparados com os explantes

da porção basal (80%).

A menor percentagem de estabelecimento entre as cultivares foi obtida com

a cv. Flordaguard, fazendo exceção apenas os explantes da cv. Nemaguard

retirado da porção apical (Tabela 3). Nas condições em que se desenvolveu este

experimento, verificou-se que os porta-enxertos estudados possuem diferentes

potenciais para micropropagação. Além disso, a melhor região de coleta do ramo

pode variar para cada porta-enxerto.

A contaminação dos explantes durante a fase de estabelecimento foi baixa,

sendo verificado 1% de contaminação causada por bactéria e 2% causada por

fungo. Estes resultados são inferiores aos obtidos por Rodrigues et al. (2003), que

trabalhando com os porta-enxertos Mirabolano, Okinawa e Nemaguard, coletados

de plantas mantidas no campo, verificaram perdas por contaminação de 76%,

66% e 63%.

O reduzido percentual de contaminação comprova que o método utilizado

neste experimento (plantas mantidas em casa de vegetação e realização de

controle fitossanitário sistemático) é eficiente para obter baixo percentual de

contaminação dos explantes durante a fase de estabelecimento in vitro dos porta-

enxertos Flordaguard, Mr. S. 2/5, Nemaguard e Nemared. De acordo com

Grattapaglia & Machado (1998), a planta mantida em casa-de-vegetação e/ou

telado permite o maior controle de microorganismos e insetos, além de facilitar a

descontaminação dos explantes.

18

2.3.2 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5

A contaminação bacteriana e fúngica ocorrida durante os 30 dias da fase de

estabelecimento in vitro foi inferior a 1% e não houve diferença no percentual de

contaminação entre gema e segmento nodal. Os tratamentos fitossanitários das

plantas-matrizes mantidas em casa-de-vegetação, antes da coleta dos explantes,

associados ao processo de desinfestação mostram mais uma vez serem eficientes

no controle da contaminação durante a fase de estabelecimento in vitro de Mr. S.

2/5, evitando perdas de explantes. Silva et al. (2003) trabalhando com os porta-

enxertos Capdeboscq, GF677 e VP411, obtiveram 18,8% de contaminação dos

ápices caulinares e 29,8% das gemas.

Os segmentos nodais cultivados nos meios solidificados com ágar ou

phytagel apresentaram os maiores percentuais de estabelecimento em relação à

gema, porém não diferiram entre si (Tabela 4). O maior percentual de

estabelecimento observado com o segmento nodal provavelmente está

relacionado ao tamanho do explante e, conseqüentemente, a maior reserva

existente no material vegetal. Rodrigues et al. (1999), comparando o efeito da

gema e meristema no estabelecimento in vitro dos porta-enxertos cvs. Mirabolano

e Marianna, obtiveram apenas 2,8% de estabelecimento para gemas enquanto

que a partir de meristemas não conseguiram o estabelecimento.

De acordo com Grattapaglia & Machado, (1998), o tamanho do explante

utilizado está relacionado com a possibilidade de sobrevivência e capacidade de

crescimento. Portanto, verifica-se que apesar de serem maiores as possibilidades

de contaminação, os segmentos nodais proporcionaram a maior percentagem de

estabelecimento.

Com relação às gemas, as maiores percentagens de estabelecimento

ocorreram no meio solidificado com phytagel (50,2%) e no meio líquido (31,1%), e

o menor percentual de estabelecimento das gemas foi observado no meio de

cultura solidificado com ágar (Tabela 4). Esses resultados ocorreram,

principalmente, em função da oxidação das gemas ocorrida nesse último tipo de

meio (Tabela 5).

19

TABELA 4- Percentagem de estabelecimento dos explantes da cv. Mr. S. 2/5 ao final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Tipo de explante Agente solidificante

Gema

Segmento

Ágar 14,9 bB 99,6 aA

Phytagel 50,2 aB 98,3 aA

Líquido c/ algodão

31,1 aA 50,2 bA


Verificou-se que, nas condições que o experimento foi conduzido, a

oxidação dos explantes influenciou de forma determinante o percentual de

estabelecimento, principalmente aliado ao tipo de explante. Os maiores

percentuais de oxidação ocorreram nos explantes de menor tamanho, ou seja, nos

explantes tipo gema.

De acordo com Grattapaglia & Machado (1998), quanto menor o explante

maior a possibilidade de ocorrer à oxidação do mesmo. Além disso, a oxidação é

um sério problema em explantes isolados de espécies lenhosas, devido à

liberação de compostos fenólicos pelas células lesionadas. Assim sendo, quanto

mais baixa a relação entre a área do explante e a área da lesão maior vai ser a

quantidade de fenóis produzidos e maiores as possibilidades de falência do

explante. Segundo Rodrigues (2000), os diferentes fenóis presentes nos tecidos,

ao entrarem em contato com o oxigênio, sofrem reações de oxidação, cujos

produtos são tóxicos e causam o escurecimento e necrose do tecido vegetal.

Já, o segmento nodal teve percentuais de morte por oxidação iguais ou

próximos de zero, quando cultivado no meio acrescido com ágar ou phytagel. Mas,

quando cultivado no meio líquido as perdas por oxidação foram de 50,2% (Tabela

5).

20

TABELA 5- Percentagem de oxidação dos explantes da cv. Mr. S. 2/5 ao final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Tipo de explante Agente solidificante

Gema Segmento

Ágar 85,4 aA 0,0 bB

Phytagel 50,1 bA 0,5 bB

Líquido c/ algodão 68,1 aA 50,2 aA


A maior percentagem de vitrificação ocorreu com os segmentos nodais

cultivados no meio com phytagel. No meio acrescido de ágar a percentagem de

vitrificação foi nula para as gemas e segmentos nodais (Tabela 6). Resultados

semelhantes foram observados por Leite et al. (1993), que obtiveram, com a

pereira cv. Carrick cultivada em meio MS solidificado com ágar ou gelrite, 0% e

100% de vitrificação, respectivamente.

Possivelmente, essa diferença entre os dois agentes solidificantes, tenha

sido causada porque a utilização de 6,5 g L-1 de ágar no meio disponibilize menos

água para os explantes cultivados do que 2,5 g L-1 de phytagel. De acordo com

Ibrahim (1994) a vitrificação pode ser reduzida a zero com o aumento da

concentração do solidificante no meio de cultura.

Com relação às gemas cultivadas no meio líquido e com solidificante

observou-se que elas tiveram baixos percentuais de vitrificação ou iguais a zero.

De acordo com Zimmerman (1984), a vitrificação ou hiperhidricidade é uma

desordem fisiológica, que geralmente afeta a propagação vegetativa in vitro

ocasionando deformações nas folhas as quais se tornam translúcidas.

21

Além disso, as plantas vitrificadas apresentam baixos níveis de lignina e celulose,

e baixa resistência da parede celular (Cuzzuol et al. 1995). No entanto, a

vitrificação ocorrida nos explantes cultivados em meio semi-sólido pode ser

evitada ou minimizada através do aumento da concentração de ágar ou phytagel

no meio de cultura (Ibrahim, 1994).

TABELA 6- Percentagem de vitrificação dos explantes de Mr. S. 2/5 ao final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Tipo de explante Agente

solidificante Gema Segmento

Ágar 0,0 aA 0,0 cA

Phytagel 0,0 aB 75,1 aA

Líquido c/algodão

0,5 aB 19,8 bA

* Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

Para a variável comprimento médio das brotações formadas, explantes

constituidos por segmento nodal atingiram o maior comprimento, com exceção

daqueles cultivados no meio líquido com ponte de algodão (Tabela 7 e Figura 1).

Provavelmente o maior comprimento das brotações originadas destes explantes

esteja relacionada a maior quantidade de reservas nutricionais e hormonais

existentes no tecido vegetal. Entretanto, para os explantes originados de

segmentos nodais, cultivados no meio líquido, o comprimento médio da brotação

não diferiu daqueles originados a partir de gemas. Talvez as reservas de tecidos

do segmento nodal associadas a maior disponibilidade de nutrientes e reguladores

de crescimento proporcionados pelo meio líquido tenham possibilitado uma maior

absorção pelo explante. Possivelmente, esta condição de cultivo ocasionou um

desequilíbrio hormonal e, conseqüentemente, uma paralisação do crescimento.

22

Observou-se que as brotações formadas a partir de segmentos nodais

formaram o maior número de folhas, exceto para os segmentos cultivados no meio

líquido. Talvez a maior disponibilidade de reguladores de crescimento ocorrida no

meio líquido tenha provocado uma inibição no desenvolvimento da brotação e,

conseqüentemente, interferido no número de folhas formadas. O menor número

médio de folhas formadas ocorreu nas brotações formadas a partir de gemas

cultivadas no meio solidificado com ágar.

TABELA 7 - Comprimento médio das brotações (mm) e número médio de folhas em brotações da cv. Mr. S. 2/5 formadas a partir de gema e segmento nodal ao final de 30 dias de cultivo, em função do agente solidificante. UFPel, Pelotas-RS, 2006


Comprimento da brotação (mm) (c Número de folhas Agente solidificante

Gema Segmento Gema S Segmento

Ágar 2,3 aB 14,1 aA 0,6 bB 7,6 aA

Phytagel 3,1 aB 15,9 aA 3,2 aB 8,6 aA

Líquido c/algodão 3,0 aA 3,4 bA 3,9 aA 2,9 bA

23

FIGURA 1- Brotações da cv. Mr. S. 2/5 estabelecidas em meio líquido (1), phytagel (2) e ágar (3) a partir de segmento nodal (esquerda) e gema (direita), ao final de 30 dias de cultivo. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

2.3.3 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5

As perdas causadas pela contaminação fúngica (2,0%) e bacteriana (0,0%)

foram baixas (dados não apresentados). Estes resultados podem ser

considerados satisfatórios se comparados com os resultados obtidos por

Rodrigues et al. (2003), que trabalhando com os porta-enxertos de pessegueiro,

mantidos no campo, cvs. Mirabolano, Okinawa e Nemaguard, obtiveram perdas

por contaminação superiores a 50%.

O percentual de oxidação obtido neste trabalho (5%) pode ser considerado

alto quando comparado com 1,7% obtido por Rodrigues et al. (2003), que

trabalharam com o porta-enxerto cv. Mirabolano. Os mesmos autores citam que o

uso de substâncias antioxidantes, como ácido ascórbico e polivinilpirrolidona

(PVP), podem favorecer o controle da oxidação dos explantes. Sendo assim, o

percentual de oxidação do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 poderá ser minimizado ou

anulado com a utilização de antioxidantes no meio de cultura.

1 2 3 1 2 3

10 mm

24

Em relação ao percentual de estabelecimento observado (93%), este é

considerado alto. Resultados similares foram obtidos por Chaves et al. (2004) que,

trabalhando com diferentes concentrações de hipoclorito de sódio no

estabelecimento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, obtiveram 96% de

estabelecimento. Esse percentual de estabelecimento possivelmente deve estar

relacionado com a manutenção das plantas-matrizes sob condições controladas

(casa-de-vegetação) e às pulverizações regulares com os defensivos (fungicida e

bactericida).

Para a variável comprimento médio das brotações, verificou-se que os

explantes cultivados sob o filtro verde 088 (nº 088 Lime green) formaram

brotações com comprimento superior às brotações dos demais tratamentos e

visualmente não apresentaram sinais de amarelecimento e/ou vitrificação (Tabela

8 e Figura 2). Esse filtro também contribuiu para a formação de maior número de

gemas e número de folhas. Esses resultados reafirmam as observações feitas por

Silva et al. (1997) de que a qualidade da luz afeta o crescimento e a morfogênese

das brotações cultivadas in vitro.

Observou-se que a morfogênese das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S.

2/5 é influenciada pela qualidade da luz, ou seja, pelo comprimento de onda e a

percentagem de transmissão da luz ocorrida no tipo de filtro utilizado.

O alongamento das brotações cultivadas sob o filtro verde (nº 088 Lime

green) ocorreu devido à reflexão da luz verde transmitida pelo filtro (69%), pois, de

acordo com Salisbury & Ross (1994) a luz verde é refletida pelas plantas.

Possivelmente, a reflexão da luz verde estimulou o alongamento das brotações,

ocasionando efeito semelhante à condição de cultivo no escuro, onde as

brotações estiolam em busca de luz. Contudo, notou-se que visualmente as

brotações deste tratamento não apresentaram aspecto amarelado ou vitrificado.

Esses resultados observados confirmam que o filtro verde (nº 088 Lime green)

permite a transmissão de outros comprimentos de ondas além do verde, como o

vermelho e o azul (35 % e 2% de transmissão, respectivamente) e, possivelmente,

o valor de 35% de luz vermelha transmitida foi suficiente para evitar o

amarelecimento das brotações.

25

TABELA 8- Efeito de diferentes tipos de filtros sobre o comprimento médio das brotações (mm), número de gemas e número de folhas das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, aos 35 dias de estabelecimento. UFPel, Pelotas-RS, 2006

*Médias seguidas pela mesma letra, na linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade.

FIGURA 2- Aspecto das brotações do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5, provenientes do cultivo em meio MS e diferentes filtros de luz: SF (sem filtro); verde (nº 088 Lime green), azul (nº 115 Jas blue), azul (nº 724 Ocean blue) e verde (nº 738 Jas green). Pelotas-RS, 2006.

Tipo de Filtro

Variáveis analisadas Sem Filtro

Verde 088

Azul 115

Azul 724

Verde 738

Comprimento da brotação 5,0 b 15,0 a 5,0 b 6,0 b 7,0 b

Número de gemas 2,0 b 4,0 a 2,0 b 2,2 b 2,5 b

Número de folhas 6,0 b 9,0 a 4,0 c 5,0 bc 6,0 b

088 S/F 738 115

724

26

2.3.4 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e BAP no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de pessegueiro cv. Tsukuba

Na Tabela 9 pode ser observado que a maior percentagem de

contaminação foi causada por fungo. Os percentuais de contaminação obtidos no

presente trabalho foram inferiores aqueles obtidos por Silva et al. (2003) que

estabeleceram in vitro os porta-enxertos Capdeboscq, GF677 e VP411, e

obtiveram de 14,8% a 29,8% de contaminação. De modo geral, os valores da

contaminação observados neste trabalho podem ser considerados baixos e a

metodologia utilizada eficaz para o estabelecimento do porta-enxerto Tsukuba. Os

resultados obtidos no presente estudo de estabelecimento, somados aos obtidos

por Silva et al. (2003), reforçam a importância de se manter a planta-matriz em

condições controladas (telado ou casa-de-vegetação) e realizar o controle

fitossanitário periodicamente.

TABELA 9- Percentagens de contaminação, estabelecimento e comprimento médio das brotações observados aos 30 dias de cultivo na fase de estabelecimento in vitro do porta-enxerto cv. Tsukuba, em função do meio de cultura. UFPel, Pelotas-RS, 2006

* Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

Tipo de meio

Contaminação fúngica (%)

Contaminação bacteriana (%)

Estabelecimento (%)

Comprimento da brotação

(mm)

MS 2,13 a 0,35 a 96,67 a 4,32 a

MS ¾ 0,67 a 0,00 a 99,33 a 4,33 a

MS ½ 2,94 a 0,00 a 97,09 a 3,67 a

27

Para a variável percentagem de estabelecimento, de acordo com a análise

da variância, não existiu diferença entre os tratamentos utilizados (concentrações

de BAP e tipo de meio de cultura). Possivelmente, a existência de fontes de

reservas no tecido vegetal dos segmentos nodais seja suficiente para a formação

da brotação (Figura 3). Este resultado pode ser considerado satisfatório, pois

representa uma economia significativa, considerando que o BAP é um dos

constituintes mais caros da composição do meio de cultura.

FIGURA 3- Aspecto da brotação do porta-enxerto de Prunus cv. Tsukuba estabelecida in vitro, ainda ligado ao segmento nodal da planta- matriz, aos 30 dias de cultivo. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

As percentagens de estabelecimento obtidas com o porta-enxerto cv.

Tsukuba (Tabela 9), podem ser consideradas elevadas (superior a 96%) se

comparadas com 62,9% obtido por Silva et al. (2003) e 16,67% obtido por

Rodrigues et al. (1999) que trabalharam com os porta-enxertos de Prunus GF 677,

Mirabolano e Marianna. O alto percentual de estabelecimento obtido no presente

trabalho pode estar associado ao período de coleta dos explantes na planta-

matriz, pois, na época em que os explantes foram coletados (verão), as plantas

estavam em pleno desenvolvimento.

28

Com relação ao comprimento médio das brotações, verificou-se diferença

significativa para a concentração de BAP utilizada no meio de cultura. Pode-se

observar, por meio da figura 4, um comportamento quadrático do comprimento

médio das brotações com o aumento da concentração de BAP. Em termos

práticos, o BAP não foi significativo para esta variável, já que a diferença entre o

comprimento médio das brotações cultivadas no meio sem BAP e o maior

comprimento médio das brotações cultivadas no meio com BAP (0, 4 mg L-1) foi de

apenas 1,3 mm. Teixeira et al. (2004) que trabalharam com o porta-enxerto cv.

Carelli cultivado em meio de cultura QL acrescido de 0,0; 0,5; e 1,0 mg L.-1 de BAP

e observaram uma inibição do comprimento da brotação ( 16,2; 11,0 e 10,8 mm) à

medida que se elevava a concentração de BAP no meio de cultura. Silva et al.

(2003), trabalhando com o porta-enxerto VP 411, obtiveram brotações com

comprimento médio de 7,5 mm. Isso leva a confirmar que cada genótipo

responde de maneira diferente as condições de cultivo in vitro.

y = -3,478x2 + 4,21x + 3,53R2 = 0,91

0

1

2

3

4

5

6

7

0.0 0.4 0.8 1.2

Concentração de BAP (mg L-1)

Co

mp

rim

ento

méd

io

da

bro

taçã

o (

mm

)

FIGURA 4- Comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba, aos 30 dias de cultivo in vitro em diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

29

2.3.5 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio

A maior percentagem de estabelecimento (95%) ocorreu com os explantes

retirados da porção basal do ramo (15-30 cm), em relação aos explantes isolados

da porção de apical (54%) (Tabela 10). Possivelmente, na época em que se

coletou os explantes (verão), as gemas da porção apical do ramo não estavam

completamente formadas e, deste modo, não formaram brotação. Este resultado

reforça a afirmação de que os processos de formação e maturação das gemas

podem ser mais precoces e uniformes, de acordo com o com o material genético

utilizado ou a época de coleta dos ramos. Sendo assim, sugere-se eliminar a

extremidade do ramo do porta-enxerto cv. Sírio em que as gemas estão muito

pequenas ou mal formadas, contribuindo assim para a redução dos custos e maior

eficiência da fase de estabelecimento. Quanto ao tipo de meio de cultura,

observou-se que não houve diferença no percentual de estabelecimento.

TABELA 10- Percentagem de estabelecimento dos explantes provenientes de duas diferentes regiões dos ramos do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Porção do ramo Percentagem de estabelecimento

Basal (15-30 cm) 95,0 a

Apical (0-15 cm) 54,0 b

*Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

30

A percentagem de contaminação dos explantes, avaliada aos 35 dias de

cultivo, foi considerada baixa e não observou-se diferença significativa entre as

porções do ramo utilizadas para coleta dos explantes (0-15 cm e 15-30 cm).

Registrou-se 0,2% de contaminação causada por bactéria e 9% causada por

fungo. Estes resultados são similares aos obtidos por Chaves et al. (2004) que

verificaram 12,5% de contaminação fúngica.

O baixo percentual de contaminação obtido no porta-enxerto de Prunus

reforça que o cultivo das plantas-matrizes em casa-de-vegetação, associado com

o controle fitossanitário sistemático, é eficiente para obtenção do maior percentual

de explantes estabelecidos.

Para a variável comprimento médio das brotações avaliada aos 35 dias de

cultivo, não houve diferença significativa entre os tratamentos utilizados e o

comprimento médio observado foi 6 mm. Silva et al. (2003) que trabalharam com

os porta-enxertos de Prunus cvs. GF 677 e VP 411 obtiveram as brotações com

comprimentos médios de 9,0 mm e 7,5 mm, respectivamente. Esta diferença no

comprimento médio da brotação pode ser atribuída a características de ordem

genética, pois mesmo sendo da mesma espécie, os porta-enxertos de Prunus

podem ter comportamentos in vitro diferentes de acordo com a cultivar. Segundo

Silva et al. (2003), o comprimento da brotação é determinado pelo fator genético,

concentração do regulador de crescimento e tipo de meio de cultura.

31

2.4 CONCLUSÕES

1- Para o porta-enxerto cv. Nemaguard a melhor porção do ramo para coleta do

explante é a basal;

2- É possível obter o estabelecimento das brotações a partir das duas porções de

coleta dos ramos, com exceção da cv. Nemaguard.

3- A melhor forma física do meio é semi-sólido, o ágar é o melhor solidificante e o

segmento nodal é o melhor tipo de explante para o estabelecimento dos

explantes da cv. Mr. S. 2/5;

4- O meio solidificado com phytagel causa vitrificação nas brotações da cv. Mr. S.

2/5.

5- O filtro de luz verde nº 088 favorece a morfogênese e o crescimento das

brotações do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 durante a fase de estabelecimento.

6- O tipo de meio de cultura e concentração de BAP não influencia o percentual de

estabelecimento dos explantes da cv. Tsukuba.

32

7- A percentagem de estabelecimento do porta-enxerto cv. Sírio é influenciada

pelo local de coleta do explante no ramo, sendo a porção basal do ramo a

melhor para a coleta dos explantes.

8- Os tipos de meios de cultura utilizados não influenciam no percentual de

estabelecimento dos explantes da cv. Sírio.

9- Para os diferentes porta-enxertos BAP não é limitante durante a fase de

estabelecimento, não é necessário utilizar.

33

3- CAPÍTULO 2

MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE PORTA-ENXERTO DE Prunus spp.

3.1 INTRODUÇÃO

A micropropagação, ou propagação in vitro, tem sido recomendada como

uma alternativa viável para a propagação de mudas de algumas espécies

frutíferas lenhosas, por possuir como características principais maior rapidez

quando comparada aos métodos tradicionais de propagação, manutenção das

características genéticas e sanidade do material propagado (Couto et al., 2003).

A adoção desta técnica como forma de propagação de porta-enxerto de

macieira, a exemplo das cultivares M-7 (Silveira et al., 2001a) e Marubakaido

(Pereira & Fortes, 2001), tem possibilitado a obtenção de altas taxas de

multiplicação in vitro.

34

Esta técnica, quando aplicada em algumas espécies do gênero Prunus, tem

apresentado alguns problemas durante a fase de multiplicação, devido

principalmente ao baixo desenvolvimento das brotações e à pequena taxa de

multiplicação dos explantes (Rodrigues et al., 2003). Segundo Bennett (1994),

algumas espécies são mais difíceis de multiplicar do que outras, podendo variar

de acordo com o gênero ou a espécie.

Essa diferença de comportamento in vitro entre as duas espécies lenhosas

citadas acima ocorre porque cada espécie e/ou cultivar possuem características

genéticas próprias, deste modo, os explantes cultivados in vitro têm respostas

distintas (Pereira & Fortes, 2001). Sendo assim, é necessária a realização de mais

estudos para que os protocolos de multiplicação tornem-se mais eficientes para

cada espécie (Couto, 2003).

A taxa de multiplicação, número de brotações por explantes, é um

importante fator para determinar a viabilidade da técnica de cultura de tecidos

como um método de propagação massal de determinadas espécies frutíferas.

Entretanto, de acordo com Grattapaglia & Machado (1998), deve-se considerar

que conseguir altas taxas de multiplicação in vitro, pode não ser o ideal se houver

variação de explante para explante. Nesse sentido, o mais desejável é obter uma

taxa de multiplicação satisfatória e que apresente o mínimo de variação.

Para a determinação precisa da taxa de multiplicação in vitro, a

homogeneidade dos explantes no momento inicial de cultivo é de fundamental

importância (Pereira et al., 2005). Neste sentido, Pereira & Fortes (2001)

verificaram que explantes de origem basal, retirados de brotações estabelecidas

do porta-enxerto de macieira cv. Marubakaido, formaram maior número de

brotações por explante (12,04 brotos) do que os explantes apicais (7,4 brotos).

Resultados semelhantes foram obtidos por San-José et al. (1988), que

trabalhando com explantes apicais e basais de carvalho (Quercus robus),

observaram que os segmentos nodais produziram maior parte aérea do que os

explantes apicais.

35

Uma das formas de aumentar a taxa de multiplicação dos explantes é com

o ajuste do protocolo para cada espécie em estudo. Dentre os fatores mais

importantes para ajustes, destacam-se o tipo de meio de cultura, o tipo e a

concentração de citocinina (Silveira et al., 2001).

Embora um número considerável de porta-enxertos de Prunus spp. seja

multiplicado em meio de cultura MS e suas diluições, quando estes são cultivados

em outros tipos de meio de cultura os resultados da taxa de multiplicação são

similares ou superiores, de acordo com a cultivar ou espécie utilizada (Couto et

al., 2004; Andreu & Marín, 2005; Pérez-Tornero & Burgos, 2000).

Na composição do meio de cultura alguns fatores como tipo e concentração

dos reguladores de crescimento também são considerados importantes para a

obtenção do sucesso na propagação. Assim como o tipo de meio de cultura, a

determinação do tipo e concentração dos reguladores de crescimento também

depende da espécie ou cultivar estudada (Gürel & Gülsen, 1998).

Os reguladores de crescimento atuam estimulando, inibindo ou regulando o

crescimento das plantas (Mercier et al., 1997). O nível endógeno dos reguladores

de crescimento é controlado por vários processos como síntese, hidrólise,

mobilização de reservas e ativação, além da conjunção e degradação com outros

compostos (Moncaleán et al., 2003).

A utilização de uma fonte de citocinina no meio de multiplicação é

indispensável para promover a quebra da dominância apical do explante e induzir

à proliferação de gemas axilares (Pérez-Tornero et al., 2000). Estas duas

respostas promovidas pelas citocininas são resultantes de uma grande variedade

de processos bioquímicos tais como a absorção, distribuição e o metabolismo do

regulador de crescimento (Auer et al., 1992). Desse modo, estes processos

podem afetar a quantidade de citocinina livre no tecido vegetal cultivado. Além

disso, o metabolismo de transformação poderá dar origem a outros compostos

com atividades hormonais diferentes (Moncaleán et al., 2003).

36

Das citocininas utilizadas nos meios de multiplicação, a benzilaminopurina

(BAP) é a que tem contribuído eficientemente na indução de gemas adventícias e

multiplicação dos explantes, além de se destacar das demais por ser mais barata

(Grattapaglia & Machado, 1998).

As concentrações de citocinina (BAP) utilizadas nos meios de multiplicação

dos porta-enxertos de Prunus spp. podem variar de 0,1 à 4,0 mg L-1, de acordo

com a cultivar ou espécie (Couto et al., 2004; Teixeira et al., 2004). Porém, nem

sempre o aumento da concentração de BAP gera aumento do número de brotos

formados, pois, na multiplicação in vitro do porta-enxerto de Prunus spp. cv.

Carelli, observou-se que o número de brotos formados por explante permaneceu

homogêneo (3,3 a 3,4 broto/explante), a partir de 0,5 mg L-1 até 4,0 mg L-1 de

BAP. Notou-se, também, que nas maiores concentrações de BAP houve a

formação de brotos vitrificados (Teixeira et al., 2004). De acordo com Harada &

Murai (1996) e Pérez-Tornero & Burgos (2000), o uso de elevados níveis de BAP

no meio de cultura pode causar desordens fisiológicas como a inibição do

alongamento de folhas e caules, a formação de tufos e a vitrificação dos

explantes.

Alguns meios de multiplicação são acrescidos por outros reguladores de

crescimento, a exemplo das auxinas, visando anular o efeito inibitório do

alongamento causado pelas citocininas. Mas, segundo Silva (2004) a utilização de

uma fonte de auxina (AIA, ANA e AIB) no meio de multiplicação nem sempre é

necessária, devendo ser usada em concentrações menores que 0,5 mg.L-1, pois, o

excesso de um destes reguladores de crescimento pode induzir a formação de

calos ou de raízes indesejáveis nos explantes cultivados.

Embora, a propagação de plantas por meio da cultura de tecidos esteja

baseada na capacidade das citocininas quebrarem a dominância apical e

induzirem a multiplicação, existem estudos relatando que a qualidade da luz

(comprimento de onda) exerce influência na multiplicação e alongamento das

37

brotações, anatomia foliar, formação e comprimento das raízes

(Soontornchainakaeng et al., 2001; Muleo & Thomas, 1997; Noè & Eccher, 1994).

Assim como, outros estudos relatam a interação dos reguladores de crescimento

com a qualidade da luz (Kraepiel & Maginiac, 1997).

Uma forma significativa de modificar a qualidade da luz nas salas de cultivo

dos laboratórios de micropropagação, as quais são normalmente equipadas com

lâmpadas fluorescentes que emitem luz branca, é através da utilização de filtros

sob a fonte de radiação (Marks & Simpson, 1999).

De acordo com Bula et al. (1991), embora as lâmpadas fluorescentes sejam

comumente utilizadas nas salas de cultivo, esse tipo de fonte de luz não é mais

considerada como ótima por emitir diferentes comprimentos de ondas (350 a 750

nm). Atualmente a melhor fonte de luz são os LEDs, por possuírem comprimentos

de onda específico e longo período de vida útil.

O comprimento de onda da luz é inversamente proporcional à quantidade

de energia, sendo assim, a luz com comprimento de onda curto possui alta

energia. Para a realização da fotossíntese são utilizados fótons com comprimentos

de onda que variam entre 400 e 700 nm, sendo que a luz transmitida na faixa de

500 a 600 nm (luz verde) é refletida pelas folhas (Salisbury & Ross, 1994).

Nos últimos anos, realizaram-se vários trabalhos na área de cultura de

tecidos investigando o efeito da qualidade da luz (Baraldi et al., 1992; Piagnani et

al., 2002; De Rossi et al., 2004). Atualmente, é conhecido que a luz controla várias

etapas do ciclo de vida das plantas. A estrutura e a função de alguns

fotorreceptores estão relativamente bem caracterizadas, principalmente as dos

fotorreceptores que absorvem o vermelho e o vermelho-distante. Entretanto, a

seqüência de eventos que ocorrem após o sinal de percepção da luz, assim como

os mecanismos de tradução do sinal e os efeitos fisiológicos gerados, ainda são

poucos conhecidos (Kraepiel & Maginiac, 1997).

Este trabalho teve como objetivo determinar o melhor meio de cultura,

concentração de BAP, cultivar, tipo de explante e qualidade da luz na

multiplicação dos porta-enxertos de Prunus ssp.

38


Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micropropagação de

Plantas Frutíferas do Departamento de Fitotecnia da FAEM, Universidade Federal

de Pelotas, durante o período de 2003 a 2005.

A fase de multiplicação in vitro foi subdividida em três experimentos

independentes e a metodologia aplicada em cada um é apresentada abaixo.

3.2.1 Diferentes meios e concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos porta-enxertos de Prunus cvs. Sírio e Mr. S. 2/5

O objetivo deste trabalho foi determinar o melhor tipo de meio de cultura e

concentração de BAP para a multiplicação in vitro dos porta-enxertos cvs. Mr. S.

2/5 e Sírio.

Foram utilizados segmentos nodais sem o ápice, medindo aproximadamente

5 mm de comprimento, isolados das brotações estabelecidas in vitro, com 30 dias

de cultivo.

Para a inoculação foram utilizados dois meios de cultura, compostos por sais

e vitaminas do meio MS (Murashige & Skoog, 1962) e sais e vitaminas do meio QL

(Quoirin et al., 1977). Ambos os meios de cultura foram acrescidos de diferentes

39

concentrações de benzilaminopurina (0,0; 0,3; 0,6 e 0,9 mg L-1 de BAP), 20 g L-1

de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol e 7 g L-1 de ágar. O pH dos meios foi

ajustado para 5,8 antes da autoclavagem a 121 ºC de temperatura durante 15

minutos.

Os explantes isolados das brotações foram inoculados em frascos com 40

mL de meio de cultura, e após levados para sala de crescimento com temperatura

de 25 + 1 ºC, 16 horas de fotoperíodo e luminosidade de 25 µmol m-2 s-1.

O delineamento experimental adotado foi inteiramente casualizado com um

fatorial 2x2x4, sendo os fatores utilizados: porta-enxerto, meio de cultura e

concentração de BAP, com quatro repetições por tratamento, tendo como unidade

experimental, um frasco contendo cinco explantes. As variáveis analisadas após

30 dias de cultivo foram: percentagem de brotação, número médio de brotações

por explantes e comprimento médio das brotações.

3.2.2 Efeito das concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos porta-

enxertos de Prunus cv. Tsukuba

Objetivou-se neste trabalho determinar qual o tipo de explante e a

concentração de BAP que proporciona os melhores resultados na multiplicação in

vitro. Foram utilizados segmentos da porção apical e da porção basal, com

aproximadamente 7 mm de comprimento retirados de brotações com 35 dias de

cultivo.

Os explantes foram inoculados em frascos com 40 mL de meio de cultura

SH (Schenk & Hildebrandt, 1972), suplementados por 0,0; 0,4; 0,8 e 1,2 mg L-1 de

BAP, 7g L-1 de ágar e pH 5,8. Os frascos com o meio de cultura foram

autoclavados à temperatura de 121 ºC durante 15 minutos.

Após a inoculação, os frascos com os explantes foram transferidos para

sala de crescimento com temperatura de 25 + 1ºC, 16 horas de fotoperíodo e

luminosidade de 25 µmol m-2 s-1, permanecendo nestas condições por 30 dias.

40

O delineamento experimental adotado foi inteiramente casualizado com um

fatorial 2x4 (tipo de explante e concentração de BAP), com quatro repetições por

tratamento, sendo a unidade experimental, um frasco contendo cinco explantes.

Após 30 dias de cultivo, foram avaliadas as variáveis percentagem de

brotação, número médio de brotações e comprimento médio das brotações.

3.2.3 Influência da qualidade da luz e concentrações de BAP na multiplicação do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5

Este trabalho foi realizado com o objetivou de verificar o efeito da qualidade

da luz e BAP na multiplicação in vitro do cv. Mr. S. 2/5.

Foram utilizados como explantes segmentos caulinares, sem o ápice, com

duas gemas e tamanho aproximado de 7 mm. O meio de cultura utilizado foi o MS

acrescido por 100 mg L-1 de mio-inositol, 30 g L-1 de sacarose, 7 g L-1 de ágar,

suplementado com 0,0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg L-1 de BAP, 0,06 mg L-1 AIB e 0,5 mg L-1

de AG3. O meio de cultura foi distribuído em frascos com capacidade de 250 mL,

sendo que cada frasco recebeu 30 mL. O pH do meio foi ajustado para 5,2 antes

da adição do ágar e em seguida foi autoclavado a 121 oC por 15 minutos.

Após a inoculação, os frascos com explantes foram colocados em sala de

crescimento com 16 horas de fotoperíodo, luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e

temperatura de 25 ºC + 1 ºC. Sobre os frascos foram colocadas folhas de filtros da

marca Lee Filters (Walworth Ind. Estate, Andover, England): o filtro verde (nº 088

Lime green) transmite 69% da luz verde com comprimento de onda de 520 nm,

35% da luz vermelha com comprimento de onda de 670 nm e 2% da luz azul com

comprimento de onda de 460 nm; o filtro azul (nº 118 Light Blue) permite 22% de

transmissão da luz azul, 40% da luz verde e 0% de luz vermelha; e o filtro verde

(nº 738 Jas Green) permite 18% de transmissão da luz verde, 1% da luz vermelha

e 0% da luz azul. No tratamento controle os frascos permaneceram sem

cobertura.

41

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com

um fatorial 4x4 (concentração de BAP e filtro de luz), com quatro repetições por

tratamento, sendo a unidade experimental um frasco com cinco explantes.

Após 35 dias de cultivo, foram avaliados o número médio de brotação,

número médio de folha e comprimento médio da brotação.


multiplicação foram submetidos à análise de variância e as médias dos

tratamentos comparadas estatisticamente pelo teste de Duncan, ou analisados por

regressão polinomial, através do Programa Estatístico Sanest (Zonta & Machado,

1992). Dados expressos em percentagem foram transformados em arco seno da

raiz quadrada de x /100, e os dados de número médio de brotações por explante e

número médio de folhas foram transformados em raiz quadrada de x+0,5, onde x

é o número obtido.

42


3.3.1 Diferentes meios e concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos porta-enxertos de Prunus cvs. Sírio e Mr. S. 2/5

A maior percentagem de brotação foi obtida com o porta-enxerto cv. Mr. S.

2/5 o qual diferiu significativamente da cv. Sírio (Tabela 1). Nas condições deste

experimento pode-se afirmar que o porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 possui maior

capacidade em formar brotações axilares a partir do segmento nodal, do que o

porta-enxerto cv. Sírio. De acordo com Silva et al. (2003), o genótipo utilizado no

experimento de multiplicação é um dos fatores que exerce influência significativa

na taxa de multiplicação in vitro dos explantes. Os resultados obtidos neste

trabalho estão de acordo com a resposta esperada para cada cultivar, pois o

porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 é uma ameixeira e Sírio um híbrido entre pessegueiro

e amendoeira. A maior facilidade de propagação de espécies de ameixeira já

havia sido relatada em outros trabalhos (Rodrigues et al., 2003; Silveira et al.,

2001).

43

Com relação ao tipo de meio de cultura utilizado para multiplicar os porta-

enxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio, não se observou diferença significativa para a

percentagem de brotação formada.

Pode ser observado, na Tabela 1, que o porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5

também formou o maior número médio de brotações por explante em relação a cv.

Sírio. O porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 revelou-se superior à cv. Sírio para esta

variável, e o resultado obtido similar ao observado por Silveira et al. (2001), que

obtiveram 1,37 brotações por explante para os segmentos que foram cultivados no

meio MS ¾ e 1,07 brotações para os segmentos cultivados no meio MS. Estes

valores obtidos para a cv. Mr. S. 2/5 são considerados baixos quando comparados

à média de 5,5 brotações por explante, para o porta-enxerto de ameixeira cv.

Julior (Wagner Júnior et al., 2003).

TABELA 1- Percentagem de brotações e número médio de brotações formadas ao final de 30 dias de cultivo in vitro, em função do meio de cultura . UFPel, Pelotas-RS, 2006

Porta-enxerto Percentagem de brotação Número médio de brotações

Mr. S. 2/5 91,7 a 1,4 a

Sírio 68,6 b 1,0b

* Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem significativamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

Observou-se, também, que para esta variável os tipos de meios de cultura

não diferiram entre si. De maneira contrária, Rodrigues et al. (2003), analisando a

influência dos meio MS ¾ e SH em porta-enxertos de Prunus, observaram que o

maior número médio de brotações formadas ocorreu no meio de cultura MS ¾.

Com relação à concentração de BAP para multiplicação dos porta-enxertos

cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio, pode-se observar um comportamento linear na figura 1, e

que a concentração de 0,9 mg.L-1 de BAP foi a que contribuiu para a obtenção do

maior número médio de brotações por explante.

44

y = 0,068x + 1,21

R2 = 0,73

y = 0,204x + 1,28

R2 = 0,71

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

0 0,3 0,6 0,9


Nú

mer

o m

édio

de

bro

taçã

o

Sírio

Mr. S. 2/5

FIGURA 1- Número médio de brotações formadas ao final de 30 dias, pelos porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio, cultivados em diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

Com relação ao comprimento médio das brotações, observou-se que o

meio MS foi melhor que o meio QL para os dois porta-enxertos cultivados (Tabela

2). Rodrigues et al. (2003), comparando o efeito do meio MS ¾ e SH, observaram

que o maior crescimento das brotações dos porta-enxertos de Prunus ocorreu no

meio de cultura MS ¾. De acordo com Harada & Murai (1996); Pérez-Tornero et

al. (2000), o comprimento médio das brotações é uma variável determinada por

vários fatores e, dentre estes, destacam-se a concentração e o tipo de regulador

de crescimento, o tipo de meio de cultura e o genótipo.

45

Pode-se observar que o porta-enxerto cv. Sírio apresentou o maior

comprimento médio das brotações, quando cultivado no meio MS. Mas, quando

cultivado no meio QL, este não diferiu significativamente do porta-enxerto cv. Mr.

S. 2/5. Possivelmente, o maior comprimento médio observado nas brotações da

cv. Sírio (12,4 cm) foi influenciado pelo menor número de brotações formadas por

explante deste porta-enxerto e também pelo tipo de meio de cultura (Tabela 2).

TABELA 2- Comprimento médio das brotações dos porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio formadas ao final de 30 dias de cultivo em meio MS e QL. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Tipo de Meio Comprimento médio da brotação (mm) Sírio Mr. S. 2/5

MS 12,4 aA 7,5 bA

QL 5,3 aB 5,8 aB

* Médias seguidas de mesma letra, minúscula na linha e maiúscula na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

46

3.3.2 Efeito das concentrações de BAP na multiplicação in vitro dos porta-enxertos de Prunus cv. Tsukuba

Para a variável percentagem de brotação formada, de acordo com a análise

da variância, houve diferença significativa entre os tipos de explantes utilizados

para multiplicação do porta-enxerto Tsukuba. Pode-se observar, por meio da

Tabela 3, que o uso de ápices caulinares proporcionou o maior percentual de

brotações em relação ao segmento nodal (Figura 2). Provavelmente, o maior

percentual de brotação observado no explante ápice caulinar esteja relacionado

ao fato de este tipo de explante (ápice meristemático) possuir uma região capaz

de sintetizar citocinina, a qual é responsável pela quebra da dominância apical e

formação da brotação.

TABELA 3- Percentagem de brotação e número médio de brotações formadas a partir de ápice caulinar e segmento nodal isolado do porta-enxerto Tsukuba, aos final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006

*Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

Tipo de explante Percentagem de brotação

Número médio de brotação

Ápice caulinar 99,5 a 1,0 a

Segmento nodal 3,5 b 1,0 a

47

FIGURA 2- Aspectos das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba proveniente da fase de multiplicação, formadas a partir do segmento nodal (A) e ápice caulinar (B). UFPel, Pelotas-RS, 2006.

Foi observada, nos explantes que brotaram, a formação de uma única

brotação (Tabela 3). Silveira et al. (2001) trabalhando com os porta-enxertos cvs.

GF 677, Marianna, Mr. S. 2/5, Mirabolano e G x N22 cultivados no meio MS ¾,

obtiveram 1,07; 1,53; 1,37; 1,69 e 1,63 broto por explante. Teixeira et al. (2004)

trabalhando com o porta-enxerto cv. Carelli, obtiveram em média 10,4 broto por

explante. Nesse contexto, verifica-se que o número médio de brotos formados por

explante também é dependente de uma característica intrínseca da cultivar

utilizada. Além disso, possivelmente as concentrações de BAP utilizadas não

foram suficientes para quebrar a dominância apical e induzir à formação de

brotações adventícias.

Com relação ao comprimento médio da brotação, observou-se que houve

uma interação significativa entre os fatores concentração de BAP e tipo de

explante. A adição de BAP ao meio de cultura contribuiu para o crescimento das

brotações formadas pelo explante ápice caulinar. Pode-se observar, por meio da

figura 2, que o meio de cultura desprovido de BAP resultou no menor comprimento

das brotações formadas a partir do explante tipo ápice. O comprimento médio das

brotações formadas a partir do explante ápice caulinar foi superior ao do segmento

nodal. Observou-se, também, que as brotações originadas a partir do explante

A B

48

ápice eram mais vigorosas do que as brotações formadas a partir do segmento

nodal, contudo, ambas as brotações apresentaram uma perda de vigor muito

acentuada em relação às brotações da fase de estabelecimento, que

permaneciam ainda ligadas ao segmento retirado da planta matriz.

De modo geral, os comprimentos médios obtidos com os dois tipos de

explantes do porta-enxerto cv. Tsukuba podem ser considerados pequenos.

Silveira et al. (2001), trabalhando com os porta-enxertos GF 677, Marianna, Mr. S.

2/5, Mirabolano e G x N22, cultivaram os explantes com 5,0 mm de comprimento e,

ao final dos 35 dias de cultivo, obtiveram os seguintes comprimentos médios das

brotações 8,0; 9,9; 12,6; 11,6 e 15,1mm.

y = -4,66x2 + 6,71x + 7,3R2 = 0,84

y = -0,925x + 3,5R2 = 0,75

0123456789

10

0.0 0.4 0.8 1.2


Co

mp

rim

ento

méd

io d

as

bro

taçõ

es (m

m)

Ápice

Segmentonodal

FIGURA 3- Comprimento médio das brotações (mm), a partir de ápice caulinar do porta-enxerto cv. Tsukuba, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes concentrações de BAP, aos final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

49

3.3.3 Influência da qualidade da luz e concentrações de BAP na multiplicação do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5

Para o número médio de brotações, observou-se diferença significativa para

o fator concentração de BAP. Verificou-se que no meio de cultura sem BAP houve

a formação de uma brotação por explante, com exceção dos explantes cultivados

sob o filtro azul nº 118, os quais não formaram brotação. As concentrações de 1,0

e 2,0 mg L-1 de BAP foram aquelas que promoveram o maior número médio de

brotações (1,6 brotos) (Figura 4), sendo que, nas concentrações de BAP até 1,0

mg L-1 houve formação das brotações a partir das gemas axilares existentes em

cada explante (2 gemas). Entretanto, quando os explantes foram cultivados no

meio de cultura acrescido de 2 mg L-1 de BAP, observou-se a formação de brotos

adventícios, provenientes de regiões sem gemas (Figura 5). Os resultados

verificados mostram que o aumento da concentração de BAP no meio de cultura

induz a formação de brotações adventícias.

Silveira et al. (2001), também investigando o efeito do meio de cultura (MS

e MS ¾) e as diferentes concentrações de BAP (0,1; 0,3; 0,5 e 0,7 mg L-1) com

este mesmo porta-enxerto, obtiveram resultado semelhante, com 0,7 mg.L-1 de

BAP, sendo 1,37 brotos no meio MS ¾ e 1,07 brotos no meio MS. Teixeira et al.

(2004), trabalhando com o porta-enxerto de Prunus spp. cv. Cicarelli em meio de

cultura acrescido por até 4,0 mg L-1 de BAP, obtiveram 3,4 brotos como aumento

da concentração de BAP. Investigando o efeito dos filtros de luz e benziladenina

(BA) no porta-enxerto cv. GF 655-2, Baraldi et al. (1988) observaram que o maior

número médio de brotações (5,5 brotos) ocorreu com os explantes cultivados sem

filtro de luz (tratamento controle), e os explantes cultivados sob filtro azul e filtro

vermelho formaram 2,4 e 3,8 brotos, respectivamente.

50

y = -0,262x2 + 0,81x + 1,02

R2 = 0,98

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 0,5 1 1,5 2


Nú

mer

o m

édio

de

bro

taçõ

es d

e

Mr.

S. 2

/5

FIGURA 4- Número médio das brotações formadas do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

FIGURA 5- Brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 proveniente da fase de multiplicação, em meio de cultura acrescido de 0,5; 1,0; e 2,0 mg L-1 de BAP UFPel, Pelotas-RS, 2006.

51

Para o comprimento médio das brotações, observou-se interação entre os

fatores concentrações de BAP e tipos de filtros, entretanto, a regressão não foi

significativa para o filtro verde nº 088 e para o filtro verde nº 738.

Geralmente, o alongamento da brotação é menor/reduzido com o aumento

da concentração de BAP no meio de cultura, isto ocorre porque em alguns casos o

acréscimo de citocinina induz a um aumento do número de brotações formadas

por explante, aumentando a competição por nutrientes. No entanto, o menor

comprimento médio da brotação foi observado (3,6 mm) no meio de cultura sem

BAP (Figura 6). Isto ocorreu, possivelmente, porque não houve um grande número

de brotos formados por explante. Verificou-se, também, que o aumento da

concentração desta citocinina estimulou o alongamento das brotações. O maior

comprimento médio das brotações (7,1 mm) ocorreu no meio acrescido de 1 mg L-

1 de BAP, sob a condição de cultivo sem filtro (Figura 6).

y = 1,42x + 4,56R2 = 0,6

y = -3,06x2 + 8,07x + 0,61R2 = 0,75

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 0,5 1 1,5 2


Co

mp

rim

ento

das

bro

taçõ

es (

mm

)

Filtro 118

Controle

FIGURA 6- Comprimento médio das brotações formadas pelo porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

52

Estes resultados são semelhante aqueles obtidos por Wagner Júnior et al.

(2003) que, avaliando o efeito da concentração de BAP na multiplicação in vitro do

porta-enxerto de ameixeira cv. Julior, observaram que o aumento da concentração

de BAP contribuiu para o maior comprimento das brotações. Já Teixeira et al.

(2004) verificaram que o aumento da concentração de BAP (0,0; 0,5; 2,0 e 4,0

mg.L-1) no meio de cultura, inibiu o alongamento, a partir de 0,5 mg L-1, das

brotações do porta-enxerto de Prunus spp. cv. Carelli.

Em relação ao efeito da qualidade da luz no comprimento da brotação, os

resultados obtidos diferem daqueles obtidos por Baraldi et al. (1988) que

avaliaram o efeito da qualidade da luz e concentrações de BA no cultivo do porta-

enxerto de Prunus spp. cv. GF 655-2, e obtiveram as brotações de maior

comprimento sob o cultivo do filtro vermelho. Esse resultado difere daqueles

obtidos na fase de estabelecimento, em que utilizou-se os mesmos filtros de luz e

porta-enxerto do presente experimento e, no entanto, observou-se que o filtro

verde nº 088 foi aquele que favoreceu o maior comprimento das brotações. Neste

contexto, possivelmente o efeito da qualidade da luz apresente respostas

diferentes de acordo com a fase de cultivo do explante.

Houve interação significativa entre os fatores concentração de BAP e tipo

de filtro para o número médio de folhas. Como já era esperado, o maior número

de folhas ocorreu nas brotações de maior comprimento. Notou-se que o maior

número de folhas ocorreu nas brotações cultivadas na ausência de filtro. Este

resultado difere daqueles obtidos na fase de estabelecimento utilizando os filtros,

em que se observou o maior número de folhas nas brotações cultivadas sob o

filtro verde nº 088. Em relação ao efeito da concentração de BAP, verificou-se um

comportamento linear decrescente para as brotações cultivadas sob os filtros

verde nº 088 e verde nº 738, sendo o maior número de folhas no meio de cultura

sem BAP, com 2,5 e 2,0 folhas, respectivamente. Sob o filtro azul nº 118 e o

tratamento controle, observa-se um ajustamento quadrático para as

concentrações de BAP, sendo o menor número médio de folhas (0,7 e 1,6 folhas)

obtidas no meio de cultura sem BAP (Figura 7).

53

Embora alguns autores (Sootornchainakaeng et al., 2001) afirmem que a

qualidade da luz contribui para a formação do maior número de folhas, neste

trabalho de multiplicação, não houve a confirmação desta observação.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 0,5 1 1,5 2

Concentrações de BAP (mg L-1)

Nú

mer

o m

édio

de

fo

lhas

FIGURA 7- Número médio de folhas formadas por brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes concentrações de BAP e diferentes qualidades de luz. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

---- � Verde 088 y = -0,56x + 2,54 R2 = 0,83

― ▪ Azul 118 y = -0,65x2 + 1,61x + 0,85 R2 = 0,63 --- � Verde 738 y = -0,28x + 1,92 R2 = 0,83 .... � Controle y = -0,57x2 + 1,55x + 1,67 R2 = 0,89

54

3.4 CONCLUSÕES

1- O tipo de meio de cultura não influencia na formação do número de brotos por

explante, mas influenciou o comprimento médio das brotações dos porta-

enxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio;

2- A concentração de 0,9 mg L-1 de BAP induz a maior formação de brotação dos

porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio;

3- O porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 possui maior potencial de multiplicação que a cv.

Sírio.

4- A utilização de BAP no meio de cultura, em concentrações de até 1,2 mg L-1,

não induz a multiplicação dos explantes do porta-enxerto da cv. Tsukuba;

5- O percentual de brotação formada varia de acordo com o tipo de explante

utilizado; o segmento nodal da base da brotação, sem ápice caulinar apresenta

baixo percentual de brotação;

6- Os filtros de luz utilizados não aumentam o número de brotação formada por

explante da cv. Mr. S. 2/5; mas influencia positivamente no número de folhas.

55

4- CAPÍTULO 3

ENRAIZAMENTO IN VITRO DO PORTA-ENXERTOS DE Prunus spp. cv. Mr. S. 2/5

4.1 INTRODUÇÃO

A formação de raízes adventícias nas brotações obtidas por meio da

multiplicação in vitro permite a constituição de plantas completas para posterior

transferência às condições ex vitro (Radmann et al., 2002).

Embora existam brotações que formem raízes adventícias facilmente, como

por exemplo as brotações das espécies herbáceas, a mesma facilidade não ocorre

quando se trabalha com espécies lenhosas (Grattapaglia & Machado, 1998).

De acordo com Rogalski et al. (2003) e Assis & Teixeira (1998), a

rizogênese, ou seja, o processo no qual ocorre a formação de raízes adventícias,

é uma das etapas mais difíceis e que pode limitar a micropropagação das

espécies do gênero Prunus spp.

De acordo com Silva (2004), as diferentes respostas dos genótipos aos

meios de enraizamento podem ser atribuídas às diferentes exigências nos níveis

hormonais.

56

Para a indução de raízes in vitro, geralmente, os meios de cultura são

acrescidos de diferentes tipos e concentrações de auxinas, sendo estas as

variáveis que mais influenciam no sucesso do enraizamento. No entanto, os

resultados da rizogênese podem variar entre as espécies de um mesmo gênero

(Al-Bahrany, 2002).

De modo geral, para a fase de enraizamento in vitro são utilizadas diluições

de formulações básicas do meio de cultura. Entretanto, os meios de enraizamento

que apresentam diluições excessivas podem ocasionar deficiência mineral,

principalmente na parte aérea das brotações enraizadas (Grattapaglia & Machado,

1998). Além disso, meios de cultura muito ricos em sais minerais podem inibir o

enraizamento, mesmo que estes contenham uma fonte de auxina (Silva, 2004).

Também deve-se levar em consideração a qualidade da parte aérea da brotação a

ser enraizada, pois brotações muito pequenas apresentam problemas de

enraizamento.

As fontes de auxinas mais utilizadas nos meios de enraizamento são o

ácido indolbutírico (AIB), o ácido naftaleno acético (ANA) e o ácido 3-indolacético

(AIA), os quais podem ser utilizados sozinhos ou em combinação. A concentração

utilizada nos meios de enraizamento podem variar de acordo com a espécie e/ou

cultivar, entretanto, as concentrações mais usadas no enraizamento in vitro de

Prunus spp. oscilam entre 0,1 e 1,0 mg L-1 (Rogalski et. al., 2003; Bertazza et al.,

1995; Rossi et al., 1993).

De acordo com Rogalski et al. (2003), a percentagem de enraizamento e o

número de raízes formadas podem variar de acordo com a concentração de AIB e

a cultivar utilizada; estes autores ainda ressaltam que a utilização de elevados

níveis de AIB tendem a afetar negativamente o enraizamento e o crescimento das

raízes, além de contribuir para a formação de calo na base dos explantes.

Segundo Fachinello et al. (1995), a formação de calo na região onde ocorre o

enraizamento é indesejável, pois a qualidade das raízes pode ser afetada,

principalmente ao que se refere à conecção vascular da planta.

57

Em relação à adição de sacarose no meio de enraizamento, a concentração

deve ser entre 2 e 3%, pois de acordo com George (1996), para ocorrer a

formação de raízes in vitro há necessidade de energia e carboidratos, quer sejam

estas fornecidas por meio da fotossíntese ou através de uma fonte exógena

adicionada ao meio de cultura. O fornecimento de uma fonte de carbono no meio

de cultura exerce influência na fisiologia da planta, diferenciação dos tecidos e,

também, na indução e diferenciação de órgãos.

Segundo Leite et al. (2002), na fase de enraizamento in vitro podem ser

utilizados, como substitutos do ágar, substratos inertes, como a vermiculita

embebida em meio de cultura líquido, a qual pode ser uma alternativa mais barata

do que o ágar. De acordo com Caldas et al. (1990), o meio de cultura acrescido

com vermiculita favorece a formação das raízes, devido à elevada aeração

promovida por este tipo de substrato.

Embora o ágar seja citado em vários trabalhos de enraizamento de

brotações in vitro, tem-se observado que o sistema radicular formado nas

brotações cultivadas no meio semi-solidificado com ágar é quebradiço e não

possui pêlos radiculares. Além disso, dentre os componentes do meio de cultura, o

ágar é a substância de maior custo (Leite, 1995). Segundo Pasqual et al. (2000), a

ausência de pêlos absorventes nas raízes formadas no meio com ágar pode

acarretar a morte logo após o transplante.

A baixa funcionalidade do sistema radicular formado no meio de

enraizamento in vitro pode resultar num baixo percentual de sobrevivência das

brotações na fase de aclimatização (Lane et al., 1992). O insucesso na

aclimatização talvez esteja associado ao fato das raízes sem pêlos serem pouco

eficientes na absorção de água e nutrientes.

A condição de cultivo na fase de enraizamento, geralmente, é realizada em

ambiente com fotoperíodo de 16 horas fornecida por uma fonte de luz branca,

obtidas por lâmpadas fluorescentes. No entanto, este tipo de luz não é mais

considerada como ótima, por possuir vários comprimentos de ondas

desnecessários e de baixa qualidade (Kim et al., 2004). Vários autores

comprovaram o efeito da qualidade da luz em várias culturas in vitro e, entre os

58

resultados desses experimentos, destacam-se o alongamento de caules e folhas e

o aumento do comprimento da raiz (Zhou & Sing, 2002; Silva & Debergh, 1997).

Trabalhando com Prunus serotina, Fuernkranz et al. (1990) observaram que

a luz favoreceu a percentagem de enraizamento e o número de raízes formadas

por brotação. De acordo com Rossi et al. (1993), o mecanismo fisiológico pelo

qual a luz favorece o enraizamento ocorre devido à fixação de carbono, o qual

depende da eficiência da luz; os carbonos capturados pela eficiência da qualidade

da luz contribuem como uma fonte suplementar de carboidratos.

A qualidade da luz, ou seja, o comprimento de onda poderá ser alterado

pela utilização de diferentes filtros colocados sob a fonte de luz. A modificação

ocorre através da interceptação, absorção ou reflexo de determinados

comprimentos de onda (Li et al., 2000; Cerny et al., 2003). O ajuste do

comprimento de onda mais adequado, através do uso de filtros, poderá ser uma

alternativa importante na redução da concentração dos reguladores de

crescimento no meio de cultura.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de

sacarose e AIB, da utilização da vermiculita como substituto do ágar e de

diferentes filtros de luz no enraizamento in vitro de brotações do porta-enxerto de

Prunus cv. Mr. S. 2/5.

59


4.2.1 Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5

Objetivou-se neste trabalho avaliar o efeito de diferentes concentrações de

sacarose e a utilização de vermiculita como substituto do ágar no meio de

enraizamento in vitro das brotações.

Brotações estabelecidas in vitro, com quatro semanas de cultivo e medindo

aproximadamente 20 mm de comprimento, foram utilizadas para enraizamento in

vitro. O meio de cultura utilizado para indução do enraizamento constituiu de sais

e vitaminas do meio MS, acrescido de 0,0; 15; 30 e 60 g L-1 de sacarose, 100 mg

L-1 de mio-inositol e 1,2 mg L-1 de AIB. O pH do meio de cultura foi ajustado para

5,2 antes da adição de 7 g L-1 de ágar ou de 200 g L-1 de vermiculita. Após o

ajuste do pH, o meio de cultura acrescido de ágar foi dissolvido em água e, em

seguida, foi distribuído 30 mL de meio em frascos com capacidade de 250 mL.

Para os tratamentos com vermicula, primeiro realizou-se a distribuição do meio de

cultura líquido em frascos e, posteriormente, adicionou-se a vermiculita. Os

frascos foram autoclavados durante o intervalo de 15 minutos à temperatura de

120 ºC.

60

Em câmara de fluxo laminar, com o auxílio de pinça e bisturi, removeu-se o

primeiro par de folhas basais das brotações e, em seguida, as mesmas foram

inoculadas em frascos contendo o meio de cultura. Após a inoculação, os frascos

foram transferidos para sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas,

luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e temperatura de 25 + 1 ºC.

Após 30 dias, os explantes foram avaliados através dos seguintes

parâmetros: percentagem de enraizamento, número e comprimento médio de

raízes.

O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, em

esquema fatorial 2x4 (constituição do meio e concentrações de sacarose), com

quatro repetições. Cada repetição constituiu de um frasco com cinco brotações

cada.

4.2.2 Qualidade da luz e diferentes concentrações de AIB no enraizamento in

vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5

Este trabalho foi realizado com o objetivou de verificar o efeito da qualidade

da luz e AIB no enraizamento in vitro do cv. Mr. S. 2/5.

Foram utilizadas brotações provenientes da multiplicação in vitro e medindo

aproximadamente 20 mm. Em câmara de fluxo laminar, eliminou-se o primeiro par

de folhas basais das brotações e em seguida as mesmas foram inoculadas em

frascos contendo 40 mL de meio de cultura. O meio de cultura utilizado foi o meio

MS ¾ acrescido por 0,0; 0,3; 0,6 e 0,9 mg L-1 de IBA, 30 g L-1 de sacarose, 100

mg L-1 de mio-inositol, 7 g L-1 de ágar e pH 5,2. O meio de cultura foi autoclavado

a 121 ºC durante 15 minutos. Após a inoculação, os frascos com os explantes

foram transferidos para sala de crescimento com 16 horas de fotoperíodo,

luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e temperatura de 25 + 1 ºC. Sobre os frascos

foram colocadas folhas de filtros da marca Lee Filters (Walworth Ind. Estate,

Andover, England): o filtro verde (nº 088 Lime green) transmite 69% da luz verde

com comprimento de onda de 520 nm, 35% da luz vermelha com comprimento de

61

onda de 670 nm e 2% da luz azul com comprimento de onda de 460 nm; o filtro

azul (nº 118 Light blue) transmite 22% da luz azul, 40% da luz verde e 0% de luz

vermelha; e o filtro verde (nº 738 Jas green) transmite 18% da luz verde, 1% da

luz vermelha e 0% da luz azul. No tratamento controle, os frascos permaneceram

sem cobertura.

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em

esquema fatorial 4x4 (concentrações de AIB e tipos de filtros), com quatro

repetições por tratamento. Cada repetição constituiu de um frasco com cinco

explante cada.

Após 35 dias de cultivo foram analisadas as variáveis: percentagem de

enraizamento, número médio de raízes e comprimento médio das raízes (mm).


enraizamento foram submetidos à análise de variância e as médias dos

tratamentos comparadas pelo teste de Duncan ou analisados por regressão

polinomial, através do programa estatístico Sanest (Zonta & Machado, 1992). Os

dados expressos em percentagem de enraizamento foram transformados segundo

arco seno da raiz quadrada de x/100 e o número de raízes foram transformados

segundo raiz quadrada de (x+0,5), sendo x= número médio de raízes.

62


4.3.1 Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5

De acordo com os dados da análise da variância para a variável

percentagem de enraizamento, houve diferença nos dois fatores (constituição do

meio e concentração de sacarose), porém não houve interação entre eles. Pode-

se observar, por meio da Tabela 1, que a maior percentagem de enraizamento das

brotações ocorreu no meio de cultura MS acrescido com vermiculita. De acordo

com Maciel et al. (2002) e Caldas (1990), os suportes físicos porosos, utilizados

na fase de enraizamento contribuem, positivamente para o enraizamento devido à

elevada aeração, como é o caso da vermiculita.

63

TABELA 1- Percentagem de enraizamento e número de raízes formadas pelas brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em meio MS acrescido de ágar ou vermiculita. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Constituição do meio Percentagem de

enraizamento

Número de raízes

MS + Vermiculita 55,1 a 1,5 b

MS + Ágar 35,9 b 2,0 a

* Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan em nível de 5% de probabilidade.

Com relação à influência da sacarose sobre a percentagem de

enraizamento das brotações da cv. Mr. S. 2/5, observou-se que no meio de

cultura desprovido de sacarose não ocorreu formação de raízes (Figura 1). A

presença de carboidrato é essencial para que ocorra a formação das raízes em

muitas espécies cultivadas in vitro (Grattapaglia & Machado, 1998). Uma vez que

a formação de raízes é um processo que demanda energia (George, 1996). E para

muitas espécies cultivadas in vitro, a fotossíntese realizada nessas condições é

baixa e se faz necessário o fornecimento de uma fonte externa de carboidrato

(Leite et al., 2002). Entretanto, pode-se observar que a utilização de

concentrações de sacarose superiores a 34,45 g L-1 influenciaram negativamente

o enraizamento do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5.

64

FIGURA 1- Percentagem de enraizamento do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 cultivado no meio MS, com diferentes concentrações de sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Para a variável número médio de raízes, não ocorreu interação entre os

fatores, porém houve diferença significativa em função da constituição do meio de

cultura e a concentração de sacarose. Observa-se ainda, através da tabela 1, que

o maior número médio de raízes formadas ocorreu com as brotações cultivadas no

meio de cultura acrescido de ágar. Hoffmann et al. (2001), trabalhando com dois

porta-enxertos de macieira, observaram que o meio solidificado com ágar

proporcionou a maior formação de raízes no porta-enxerto Marubakaido, porém

para a cv. M-26 não houve diferença entre o meio solidificado com ágar e o meio

acrescido de ágar e vermiculita.

O número de raízes formadas foi nulo para as brotações do cv. Mr. S. 2/5

cultivadas no meio de cultura sem sacarose (Figura 2). Esses resultados reforçam

a afirmação feita por Leite et al. (2002), de que a presença de carboidratos no

meio de cultura in vitro é essencial para a indução de raízes. Observou-se que as

concentrações estimadas de sacarose no meio de cultura, acima de 38,89 g L-1

proporcionaram a indução de 2,91 raízes por brotação. Esses resultados diferem

y = -0,073x2+5,03x+5,19

R2= 0,92

0

102030

405060

708090

100

0 15 30 60

Concentração de sacarose (g L-1)

Bro

taçõ

es e

nra

izad

as (

%)

65

dos obtidos por Pio et al. (2002), que observam um efeito linear crescente no

número de raízes formadas quando as brotações de porta-enxerto de citrus

(Tangerina sunki x Trifoliata english 63-256) foram cultivadas no meio de cultura

acrescido por 0,0; 30 e 60 mg L-1 de sacarose e 2,0 mg L-1 de AIB. Entretanto,

com concentrações entre 15 e 60 g L-1 houve incremento em relação à

testemunha, porém sem diferença entre os demais tratamentos.

FIGURA 2- Número médio de raízes formadas das brotações do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 provenientes do cultivo em meio MS com diferentes concentrações de sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Para a variável comprimento médio de raízes formadas, ocorreu interação

significativa entre os fatores constituição do meio e concentração de sacarose. As

raízes de maior comprimento surgiram quando as brotações do porta-enxerto cv.

Mr.S. 2/5 foram cultivadas nos meios de cultura acrescidos de ágar (Figura 3 e 4).

Por meio da figura 3, verifica-se uma resposta linear crescente para a

variável comprimento médio de raízes, com o acréscimo das diferentes

concentrações de sacarose no meio de cultura solidificado com ágar. Contudo,

essa resposta não se repetiu com as brotações cultivadas no meio com

y = -0,0018x2+0,14x+0,19

R2= 0,89

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 15 30 45 60

Concentração de Sacarose (g L-1)

Nú

mer

o d

e ra

ízes

66

vermiculita, observando-se uma tendência de redução no comprimento médio de

raízes a partir da utilização de 35,05 g L-1 de sacarose. De acordo com

Grattapaglia & Machado (1998), as raízes mais curtas são as mais adequadas

para o transplantio, devido às mesmas se encontrarem em fase de crescimento

ativo, facilitarem a retirada do meio de cultura aderido e evitarem a quebra. O

comprimento da raiz mais adequado é de 20 a 30 mm, pois, dependendo do

diâmetro do frasco e número de explantes cultivados, as raízes começam a

enovelar entre si.

Os resultados obtidos neste experimento mostram que a sacarose exerceu

importante influência na formação das raízes in vitro. Entretanto, não foi

evidenciada importância da utilização de sacarose em concentrações muito acima

de 30 g L-1 no meio de enraizamento, exceto para o comprimento de raízes no

meio de cultura acrescido com ágar. Houve também, resultado satisfatório na

utilização da vermiculita no meio de cultura, podendo esta ser utilizada com

eficiência na substituição do ágar em meios de enraizamento.

FIGURA 3- Comprimento médio de raízes formadas pelo porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 cultivado no meio MS, acrescido de vermiculita ou ágar, em diferentes concentrações de sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

y = 0,55x + 7,5

R2= 0,80

y = -0,0107x2 + 7,5x +93 R2=0,89

05

101520

2530354045

0 15 30 60

Concentração de Sacarose (g L-1)

Co

mp

rim

ento

de

raíz

es (

mm

)

▪Vermiculita

� Ágar

67

FIGURA 4- Brotações de Mr.S. 2/5 provenientes do cultivo em meio de cultura MS com ágar ou vermiculita (esquerda/direita). UFPel, Pelotas-RS, 2006.

4.3.2 Qualidade da luz e diferentes concentrações de AIB no enraizamento in

vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5

Na figura 5 pode-se notar um comportamento linear crescente da

percentagem de enraizamento com o aumento da concentração de AIB no meio

de cultura. As maiores percentagens de enraizamento (95,7% e 85,6%) foram

observadas nas brotações cultivadas no meio de cultura acrescido por 0,9 e 0,6

mg L-1 de AIB. Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam a necessidade de

AIB para o enraizamento das brotações do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5,

pois as brotações cultivadas no meio de cultura sem AIB (tratamento controle) não

formaram raízes. Rogalski et al. (2003), trabalhando com o porta-enxerto de

Prunus cv. GF 677, obtiveram 40% e 60% de enraizamento com as brotações

cultivadas no meio de cultura acrescido por 1,0 e 0,5 mg L-1 de AIB,

respectivamente. Erig & Schuch (2004) verificaram que as brotações de

marmeleiro cv. ‘MC’ cultivadas no meio de cultura sem AIB não formaram raízes.

Campos (2005), trabalhando com o porta-enxerto cv. Mr. S. 1/8 no meio de cultura

sem AIB, obteve 5,3% de enraizamento. Segundo o mesmo autor, o enraizamento

observado no meio de cultura sem AIB ocorreu possivelmente devido à presença

de auxina endógena. Porém, a concentração de auxina endógena no explante

pode variar de acordo com a espécie ou, até mesmo, com a cultivar.

68

y = 89,80x + 4,1R2 = 0,95

0102030405060708090

100

0 0,3 0,6 0,9

Concentração de AIB (mg L-1)

Per

cen

tag

em d

e b

rota

ções

en

raiz

adas

da

cv. M

r. S

. 2/5

FIGURA 5- Percentagem de enraizamento in vitro das brotações da cv. Mr. S. 2/5, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes concentrações de AIB. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

A qualidade da luz não influenciou a variável percentagem de

enraizamento. Este resultado difere dos obtidos por Bertazza et al. (1995) que,

trabalhando com a pereira cv. Conference, verificaram que as brotações cultivadas

sob filtro vermelho tiveram a maior percentagem de enraizamento (90%) e maior

número de raízes. Antonopoulou et al. (2004), trabalhando com o porta-enxerto de

Prunus cv. GF 677, observaram que o percentual de enraizamento das brotações

cultivadas sob luz branca foi superior as demais (vermelho, azul, verde e amarelo).

Fuernkranz et al. (1990), trabalhando com Prunus serotina, obtiveram a maior

percentagem de enraizamento (97%) e número médio de raízes (5,7) utilizando o

filtro amarelo. Embora, a luz seja considerada um importante fator na formação de

raízes adventícias das plantas micropropagadas (Tyburski & Tretyn, 2004), esta

habilidade da planta em formar raízes depende da interação de muitos fatores

69

endógenos e exógenos (Molassiotis et al., 2003) e, portanto, os resultados

considerados ótimos em uma determinada espécie, não podem ser extrapolados

para outra, pois o efeito da luz na formação das raízes adventícias varia com a

espécie e cultivar (Bertazza et al., 1995).

Para a variável número médio de raízes houve interação entre os fatores

estudados. Pode-se observar na figura 6, um comportamento linear crescente do

número médio de raízes com o aumento da concentração de AIB, nas brotações

cultivadas sob o filtro azul nº 118, verde nº 738 e tratamento controle. Já para as

brotações cultivadas sob o filtro verde nº 088, observou-se um comportamento

quadrático (Figura 6). Tibola et al. (2004) verificaram que as brotações dos porta-

enxertos de Prunus cvs. Marianna e Mr. S. 2/5 cultivadas no meio de cultura

acrescido por 1,5 mg L-1 de AIB formaram 4,0 e 2,7 raízes. Rogalski et al. (2003)

verificaram a formação de 3,5 e 4,8 raízes nas brotações do porta-enxerto de

Prunus cv. GF 677 cultivadas no meio de cultura suplementado por 0,5 e 1,0 mg

L-1 de AIB.

Nota-se que o aumento da concentração de AIB no meio de cultura do

presente trabalho e também no de Rogalski et al. (2003) contribuiu para a

formação do maior número de raízes. No entanto, deve-se verificar para cada

genótipo a concentração de AIB mais adequada para evitar a formação de calo na

base do explante, o qual interfere negativamente na fase de aclimatação e na

inibição do enraizamento, devido à toxidade causada pelas altas concentrações.

Neste sentido, Ahmad et al. (2003) verificaram a formação de calo e a

inibição do desenvolvimento das raízes em brotações do porta-enxerto cv. GF 677

cultivado em meio de cultura acrescido por 4,0 mg L-1 de AIB. Caboni et al. (1997),

trabalhando com sete genótipos de Prunus (M49, M50, M51, M52, M53, M54 e

M55), verificaram que o número de raízes formadas por brotação no meio de

cultura acrescido por 1 mg L-1 de AIB variou entre 1,1 e 3,6 raízes,

respectivamente.

70

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,3 0,6 0,9

Concentrações de AIB (mg L-1)

Nú

mer

o m

édio

de

raí

zes

(mm

)

FIGURA 6- Número médio de raízes formadas por brotações da cv. Mr. S. 2/5, em meio MS acrescido de diferentes concentrações de AIB e cultivadas sob diferentes filtros de luz. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

Para a variável comprimento médio das raízes, obteve-se um

comportamento quadrático com o aumento da concentração de AIB no meio de

cultura. O maior comprimento médio das raízes (25 mm) foi observado nas

brotações cultivadas no meio de cultura contendo 0,3 mg L-1 de AIB (Figura 7). De

acordo com Radmann et al. (2002), as auxinas, quando utilizadas em baixas

concentrações no meio de cultura, estimulam o alongamento das raízes,

entretanto as altas concentrações de AIB inibem o crescimento das raízes devido

ao fato de esta substância também estimular a produção de etileno. Tibola et al.

(2004) verificaram o maior comprimento médio das raízes (24 mm) com as

brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 cultivadas no meio de cultura acrescido

por 1,5 mg L-1 de AIB.

Em relação ao efeito da qualidade da luz, observou-se que o comprimento

médio das raízes das brotações não foi influenciado por este tratamento (Figura

8). Estes resultados diferem dos obtidos por Bertazza et al. (1995) que,

-- � Verde 088 y = -2,20x2 + 2,98x + 0,73 R2 = 0,96

--- ▪ Azul 118 y = 1,25x + 0,85 R2 = 0,90

― � Verde 738 y = 1,49x + 0,75 R2 = 0,97 __

� Controle y = 1,05x + 0,86 R2 = 0,83

71

trabalhando com a pereira cv. Doyenne, observaram que as brotações cultivadas

sob filtro azul e controle formaram raízes com 24 mm e 21 mm, respectivamente.

Rossi et al. (1993), trabalhando com o porta-enxerto do cv. GF 655-2, observaram

o maior comprimento das raízes nas brotações cultivadas sob filtro vermelho (filtro

Lee 106). De acordo com Bielenin (2000), as condições ambientais (temperatura e

luz), os reguladores de crescimento e o meio de cultura entre outros, são fatores

importantes para o sucesso do enraizamento e que estas condições de cultivo

devem ser ajustadas de acordo com a espécie, ou mesmo, com a cultivar.

y = -6,76x2 + 7,98x + 0,16R2 = 0,86

0

5

10

15

20

25

30

0 0,3 0,6 0,9

Concentração de AIB (mg L-1)

Co

mp

rim

ento

méd

io d

as r

aíze

s (m

m)

FIGURA 7- Comprimento médio das raízes das brotações da cv. Mr. S. 2/5, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes concentrações de AIB. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

72

FIGURA 8- Aspecto das brotações enraizadas do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5, provenientes do cultivo em meio MS acrescido por diferentes concentrações de AIB e cultivadas sob luz branca. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

73

4.4 CONCLUSÕES

1- A presença de sacarose no meio de cultura é imprescindível para o

enraizamento in vitro de brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5;

2- Para o enraizamento das brotações do porta-enxerto cv Mr. S. 2/5 a vermiculita

pode substituir o ágar no meio de cultura;

3- Concentração de sacarose acima de 30 g L-1 no meio de cultura MS adicionada

a 200 g L-1 de vermiculita, não aumenta o comprimento das raízes;

4- Os filtros de luz testados não contribuíram para o aumento do percentual de

enraizamento in vitro das brotações.

74

5- CONSIDERAÇÕES FINAIS

i- O estabelecimento in vitro dos porta-enxetos de Prunus, a partir de plantas

mantidas em casa de vegetação e controle fitossanitário permitem o controle

da contaminação;

ii- Os porta-enxerto podem ser estabelecidos a partir de segmentos nodais em

meio de cultura desprovido de reguladores de crescimento (BAP);

iii- A brotação se estabelece bem, mas, ao separá-la do segmento da planta

matriz observa-se uma perda do vigor muito acentuada;

iv- Os ápices caulinares formam brotações, no entanto com o explante basal a

grande maioria morre;

v- Manter plantas em telados, renová-las devido perda do vigor;

vi- No experimento com filtro de luz, utilizar meio e concentração de regulador de

crescimento único, e testar um maior número de filtros. Há indicativo de que

para cada fase de cultivo existe uma faixa de onde a ser explorada, dentro de

cada cor.

75

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICE

TABELA 1A – Resumo da análise de variância para as variáveis da percentagem

de contaminação (fúngica e bacteriana) e percentagem de estabelecimento dos explantes dos porta-enxertos cv. Flordaguard, Nemaguard, Nemared e Mr. S. 2/5. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Quadrados médios Causa da variação

GL (%) Contaminação

fúngica (%) Contamina-ção bacteriana

(%) Estabeleci-

mento

Cultivar (A) 3 55,1196ns 167,3061ns 29913,3733** Explante (B) 1 0,0009ns 0,0073ns 15148,0055** A*B 3 111,9882ns 0,0011ns 8768,8285** Resíduo 181 84,3988 84,3918 1276,7964 Media Geral 1,1756 1,1801 53,0721 CV 781,42 778,45 67,33

TABELA 2A – Resumo da análise de variância para as variáveis da percentagem

de contaminação (fúngica e bacteriana), percentagem de estabelecimento e oxidação dos explantes do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL (%)

Contaminação fúngica

(%) Contamina-

ção bacteriana

(%) Estabeleci-

mento

(%) Oxidação

Solidificante (A) 2 0,0018ns 0,0002ns 7211,6573* 7214,9910* Explante (B) 1 56,6152ns 0,0019ns 50372,5930** 53755,9713** A*B 2 223,2862ns 0,0032ns 8228,0860* 10795,3875** Resíduo 135 167,0055 0,0046 1457,2506 1365,8956 Media Geral 2,1096 0,2321 52,5987 35,7687 CV 612,57 29,34 72,57 103,33 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

88

TABELA 3A – Resumo da análise de variância para as variáveis do comprimento médio das brotações, número médio de folhas e percentagem de vitifricação dos explantes dos porta-enxertos cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL Comprimento da

brotação Número de folhas (%)

Vitrificação Solidificante (A) 2 17,7014** 6,4795** 10729,7168** Explante (B) 1 96,4854** 40,5609** 27063,5936** A*B 2 18,8278** 11,0429** 10977,7850** Resíduo 135 0,6540 0,3750 588,4091 Media Geral 2,1689 1,8497 15,2062 CV 37,28 33,11 159,52 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

TABELA 4A – Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de contaminação (fúngica e bacteriana), percentagem de estabelecimento e oxidação dos explantes do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL (%)


(%) Contamina-

ção bacteriana

(%) Estabeleci-

mento

(%) Oxidação

Tipo de filtro 4 147,7588ns 0,0007ns 125,1661ns 21,8756ns Resíduo 15 137,4973 0,0035 302,5881 254,4336 Media Geral 6,7514 0,2538 75,34 9,6718 CV 173,68 23,61 23,08 164,92 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

89

TABELA 5A – Resumo da análise de variância para as variáveis número médio de folhas, comprimento médio das brotações e número de gemas do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL Número de folhas Comprimento

da brotação Número de

gemas Tipo de filtro 4 0,4454** 62,8985* 0,1863* Resíduo 15 0,0463 7,3052 0,0264 Media Geral 2,6938 7,5310 1,74 CV 7,98 35,89 9,32 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

TABELA 6A – Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de contaminação (fúngica e bacteriana), percentagem de estabelecimento e comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL (%)


(%) Contamina-

ção bacteriana

(%) Estabeleci-

mento

(mm) Comprimento da brotação

Meio (A) 2 113,0104ns 47,1859ns 163,2057ns 2,2409ns BAP (B) 3 365,4477 ns 47,4947 ns 455,4446 ns 5,3930* A*B 6 123,5463ns 47,2387 ns 163,3667ns 2,7302ns Resíduo 36 126,9437 15,8314 130,9529 1,6099 Media Geral 7,6636 1,2352 81,6716 4,1114 CV 147,02 322,13 14,01 30,86 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

90

TABELA 7A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba em função da concentração de BAP. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Causas da variação G.L Quadrado médio

Número de brotação

Regressão linear 1 0,0152ns Regressão quadrática 1 14,8630* Desvio de regressão 1 1,3009 Resíduo 36 1,6099 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

TABELA 8A – Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de

contaminação (fúngica e bacteriana), percentagem de estabelecimento e comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv. Sírio. Capítulo 1. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL (%)


(%) Contamina-

ção bacteriana

(%) Estabeleci-

mento

Comprimento da brotação

Posição/gema (A) 1 28,3963ns 28,0012ns 5277,1064** 0,1302ns Meio (B) 2 115,2718ns 28,7040ns 23,7300ns 2,8517ns A*B 2 115,7887ns 29,6284ns 24,9781ns 0,4428ns Resíduo 18 201,3857 28,7860 147,6141 0,6872 Media Geral 12,3368 1,3670 61,8501 6,3513 CV 115,03 392,48 19,64 13,05 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

91

TABELA 9A – Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de brotação, número médio de brotações, comprimento médio das brotação e número médio de folhas dos porta-enxertos cvs. Sírio e Mr. S. 2/5. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL (%) Brotação Número de

brotação Comprimento da brotação

Cultivar (A) 1 4794,9828** 0,2737** 0,9247* BAP (B) 3 175,8162ns 0,0546** 0,0758ns Meio (C) 1 1,2895ns 0,0021ns 2,7759** A*B 3 52,2624ns 0,0243* 0,1334ns A*C 1 1848,0458ns 0,0094ns 0,6422* B*C 3 561,5315ns 0,0138ns 0,0168ns A*B*C 3 119,5124ns 0,0085ns 0,1322ns Resíduo 48 291,7223 0,0078 0,0784 Media Geral 64,5720 1,3111 0,7622 CV 26,45 6,76 36,75 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo TABELA 10A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de

brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da concentração de BAP. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006



Regressão linear 1 0,1508** Regressão quadrática 1 0,0253ns Desvio de regressão 1 0,0375 Resíduo 48 0,0078 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

92

TABELA 11A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de brotações do porta-enxerto cv. Sírio em função da concentração de BAP. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006



Regressão linear 1 0,0169* Regressão quadrática 1 0,0052ns Desvio de regressão 1 0,0010 Resíduo 48 0,0078 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo TABELA 12A – Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem

de brotação, número médio de brotações, comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL (%) Brotação Número de

brotação Comprimento da brotação

Explante (A) 1 45800,4635** 1,0050** 494,8343** BAP (B) 3 262,9517ns 0,0757ns 6,2514* A*B 3 550,1167ns 0,0744ns 4,5732* Resíduo 24 128,8211 0,0193 0,8516 Media Geral 47,8887 1,0467 4,8714 CV 23,70 13,28 18,94 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

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TABELA 13A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento médio das brotações, a partir do explante ápice do porta-enxerto cv. Tsukuba em função da concentração de BAP. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Causa da variação GL Quadrado médio Regressão linear 1 3,9694** Regressão quadrática 1 8,9102* Desvio de regressão 1 2,4290 Resíduo 24 0,8516 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

TABELA 14A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento médio das brotações, a partir do explante segmento nodal do porta-enxerto cv. Tsukuba em função da concentração de BAP. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Causa da variação GL Quadrado médio Regressão linear 1 7,8012** Regressão quadrática 1 1,5600ns Desvio de regressão 1 7,8037 Resíduo 24 0,8516 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

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TABELA 15A – Resumo da análise de variância para as variáveis número médio de brotações, número médio de folhas e comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL Número de

brotação Número de

folhas Comprimento da brotação

BAP (A) 3 1,1710** 0,8588* 10,4143* Filtro/luz (B) 3 0,0468ns 2,3309** 15,2256* A*B 9 0,1375ns 0,7603* 10,9099* Resíduo 48 0,0209 0,1447 3,2694 Media Geral 1,3985 1,8528 4,8225 CV 10,34 20,53 37,49 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

TABELA 16A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de

brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da concentração de BAP. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Causa da variação GL Quadrado médio Regressão Linear 1 2,5873** Regressão Quadratica 1 0,8662** Desvio de regressão 1 0,0591 Resíduo 48 0,0291 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

95

TABELA 17A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da concentração de BAP e sob o cultivo dos filtros Verde Nº 088 e Azul Nº 118. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Quadrados médios Causa da variação GL Verde Nº 088 Azul Nº 118

Regressão Linear 1 10,2980ns 25,8374* Regressão Quadratica 1 0,1623ns 30,3574** Desvio de regressão 1 5,8743 18,3572 Resíduo 48 3,2694 3,2694 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo TABELA 18A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento

médio das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da concentração de BAP e cultivo sob o filtro Verde Nº 738 e o Controle. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Quadrados médios Causa da variação GL Verde Nº 738 Controle

Regressão Linear 1 8,6702ns 17,7270* Regressão Quadratica 1 0,3900ns 11,2446ns Desvio de regressão 1 0,5100 0,0086 Resíduo 48 3,2694 3,2694 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

96

TABELA 19A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de folhas do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da concentração de BAP e cultivo sob os filtros Verde Nº 088 e Azul Nº 118. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006


Regressão Linear 1 2,6221** 0,7062* Regressão Quadratica 1 0,0548ns 1,2803** Desvio de regressão 1 0,3751 0,9402 Resíduo 48 0,1447 0,1447 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo TABELA 20A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de

folhas do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da concentração de BAP e cultivo sob o filtro Verde Nº 738 e o Controle. Capítulo 2. UFPel, Pelotas- RS, 2006


Regressão Linear 1 0,6915* 1,0316* Regressão Quadratica 1 0,0245ns 1,2067** Desvio de regressão 1 0,1938 0,2921 Resíduo 48 0,1447 0,1447 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

97

TABELA 21A - Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de enraizamento, número médio de raízes e comprimento médio das raízes do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL (%) Enraizamento Número de raiz Comprimento

da raiz Solidificante (A) 1 986,5485* 0,1278* 1603,2241** Sacarose (B) 3 6993,8933** 2,0338** 833,3165** A*B 3 312,9454ns 0,0194ns 301,4932** Resíduo 24 113,4728 0,0275 19,8742 Media Geral 42,3801 1,4646 14,9786 CV 25,14 11,34 29,76 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo TABELA 22A - Análise de regressão polinomial para as variáveis percentagem de

enraizamento e número médio de raízes do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da concentração de sacarose. Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Quadrados médios Causa da variação GL (%) Enraizamento Número de raiz

Regressão linear 1 4049,2131** 2,8273** Regressão quadrática 1 15124,0710** 2,6349** Desvio de regressão 1 1808,3967 0,693 Resíduo 24 113,4728 0,0275 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

98

TABELA 23A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento

médio das raízes do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em função da concentração de sacarose no meio com ágar ou vermiculita. Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Quadrados médios Causa da variação GL Ágar Vermiculita

Regressão Linear 1 2417,9483** 50,8516ns Regressão Quadratica 1 563,0630* 299,9543** Desvio de regressão 1 32,6035 40,0084 Resíduo 24 19,8742 19,8742 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo TABELA 24A - Resumo da análise de variância para as variáveis percentagem de

enraizamento, número médio das raízes e comprimento médio das raízes do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS, 2006


GL (%) Enraizamento Número de raiz Comprimento

da raiz AIB (A) 3 20199,7842** 3,7938** 19,2720** Filtro/luz (B) 3 140,6704ns 0,0291ns 1,0927ns A*B 9 91,1396ns 0,0689* 0,4539ns Resíduo 48 111,1504 0,0224 0,2773 Media Geral 44,5091 1,3881 1,6259 CV 23,68 10,79 32,39 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

99

TABELA 25A - Análise de regressão polinomial para a variável percentagem de

enraizamento das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em função das concentrações de AIB. Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Causa da variação GL Quadrado médio Regressão linear 1 58071,4699** Regressão quadrática 1 1817,4949** Desvio de regressão 1 710,3812 Resíduo 48 111,1540 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo TABELA 26A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de

raízes formadas pelas brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em função das concentrações de AIB e cultivo sob os filtros Verde Nº 088 e Azul Nº 118. Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS, 2006


Regressão Linear 1 1,8089** 2,8146** Regressão Quadratica 1 0,6274** 0,2646** Desvio de regressão 1 0,0440 0,0349 Resíduo 48 0,0224 0,0224 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

100

TABELA 27A - Análise de regressão polinomial para a variável número médio de raízes formadas pelas brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em função das concentrações de AIB e cultivo sob o filtro Verde Nº 738 e o Controle. Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS, 2006


Regressão Linear 1 3,9966** 1,9785** Regressão Quadratica 1 0,0318ns 0,1351* Desvio de regressão 1 0,0011 0,0263 Resíduo 48 0,0224 0,0224 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo TABELA 28A - Análise de regressão polinomial para a variável comprimento meio

das raízes das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em função das concentrações de AIB. Capítulo 3. UFPel, Pelotas- RS, 2006

Causa da variação GL Quadrado médio Regressão linear 1 26,0684** Regressão quadrática 1 23,6901** Desvio de regressão 1 8,0575 Resíduo 48 0,2774 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F ns Não significativo

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