Prof. Didier SalmonMSc Cristiane S. Lessa

ENZIMAS(PARTE 2)

Dezembro 2015

Bioquímica para Enfermagem

07/12/15

2

Relembrando...• O que são enzimas?

– Catalisadores biológicos• Natureza das enzimas

– Aminoácidos• Estrutura das enzimas

– primária, secundária, terciária e quaternária• Como as enzimas funcionam

– cofatores, coenzimas e grupo prostético• Classificação das enzimas

– Óxido-redutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases, ligases

• Importância das enzimas – Industria, medicina...

Cinética EnzimáticaO que é cinética ?

É o estudo da velocidade das reações

químicas

O que é cinética enzimática?

É o estudo da velocidade das reações

químicas catalisadas por enzimas

- Quantidade de produto formado por unidade de tempo

-Quantidade de substrato transformado por unidade de tempo

Pode ser medido por:

ou

Cinética de Michaelis -MentenAtividade enzimática pode ser medida pela velocidade da

reação catalisada, onde:

Km = [ ] do substrato que é

correspondente à ½ Vmax

Vmax = equivale ao ponto de

saturação das moléculas de

enzima pela [ ] de substrato presente

e quantidade de produto formado

Cinética de Michaelis -Menten

Velocidade da reação é proporcional a [ ] S

Vmax - Substrato satura todasas moléculas de enzima

= [ ] S

Metade das enzimas

disponíveis se encontram

‘preenchidas’ por substratos

[ ] crescentes

do substrato

Vmax alcançada

Nível de saturação máxima

O nível de saturação é atingido pois as enzimas possuem

sítios catalíticos limitados e neste ponto estão todos preenchidos

Cinética de Michaelis -Menten1913 – Leonor Michaelis e Maud Menten hipotetizam um modelo dado

pela equação:

V0 – Velocidade InicialEstado estacionário – [ES] constanteEntão Formação de [ES] = Degradação de [ES]

Vo = K2 [ES] [Et]=[E] + [ES]

V de Formação de ES = K1 [E] [S] V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]

Já que Formação de [ES] = Degradação de [ES]

K1 ([Et]-[ES]) [S] = K –1[ES] + K2 [ES] K1[S][Et] - K1[S][ES] = (K –1+ K2) [ES]

[ES] = [Et] [S] [S] + (K –1+ K2) / k1)

Km

é a constante de velocidade da reação

𝓀1

𝓀1 𝓀2𝓀−1

Cinética de Michaelis -Menten

O estado de transição ES formado poderá adquirir estabilidade e catalisar a conversão em produto com a constante de velocidade

ou dissociar em E+S, pela constante de velocidade

Quando houver a formação do produto e o equilíbrio químico for alcançado, o complexo ES pode ser refeito, quando constante de velocidade

𝓀2𝓀−1

𝓀−2

[ES] = [Et] [S] Se, V0 = k2 [ES] Km + [S]

Então: V0 = k2 [Et] [S] Km +[S]

Em V máxima [Et] = [ES]

Então V max = k2 [Et]

Sendo assim, 𝑽𝒐=𝑽𝒎𝒂𝒙 [𝑺 ]𝑲𝒎+[𝑺 ] Equação de Michaelis Menten da reação com um

único substrato, catalisada por uma enzima.

Gráfico de Lineweaver- BurkDupla recíproca

Uma alteração algébrica da equação de Michaelis-Menten para determinar valores de Km e Vmax antes do avanço tecnológico

É a forma mais comum, e simples, de mostrar os dados cinéticos

Figura 8.12 Bioquímica (Stryer)

=

Valores de Km e algumas enzimasEnzima Substrato Km (μM)

Quimiotripsina Acetil –L-triptofanamida

5000

Lisozima Hexa-N-acetilglicosamina

6

Β-galactosidase Lactose 4000Piruvato Carboxilase Piruvato

HCO3-ATP

400100060

Hexocinase (cérebro) ATPD-glicose

0.40.05

Reações em que há 2 substratos envolvem a transferência de átomos ou grupos funcionais de um substrato para o outro

Reações enzimáticas com mais de um substrato

Reações sequenciais - todos os substratos devem estar ligados à enzima para que

ocorra a liberação de qualquer produto

Na reação com dois substratos, há a formação do complexo ternário e são classificados

como ordenados ou aleatórios.

Reações enzimáticas com mais de um substrato

Reações sequenciais – realizar as reações uma-depois-da-outra

Reações enzimáticas com mais de um substrato

Reações duplo deslocamento – um ou mais produtos são

dissociados antes da ligação de todos os substratos à enzima

Motivo? Há um intermediário enzimático

O cofator PLP (pirodoxalfosfato)

orienta a transaminação entre os grupos

Inibidores

Ligação de pequenas moléculas e íons específicos

Reduzir ou parar a atividade enzimática

Controle de sistemas biológicos

Causam a inibição específica de determinada enzima, permitindo aplicações farmacológicas no combate às infecções bacterianas

ex. Sulfonamidas (sulfadoxina, sulfisoxazol, sulfacetamida...)

• Pneumonia a pneumocystis (Pneumocystis jirovici, P. carinii)

• Infecções oportunistas em pacientes HIV +

• Infecção do trato urinário

• Shigelose (Desinteria)• Algumas infecções por

protozoários (Plasmodium falciparum)

InibidoresIrreversíveis

Reversíveis

Competitiva

Acompetitiva

Não-competitiva

Mista

InibidoresIrreversíveis

Dissocia-se lentamente da enzima-alvo

União estável com a enzima (covalente ou

não-covalente)

Ligam-se covalentemente ou destroem um grupo funcional da enzima

essencial à atividade da enzima ou então formam

uma associação não covalente estável

O ataque da Serina (Ser) à porção amida do anel leva a um produto acil-enzima que é praticamente irreversível

InibidoresIrreversíveis

Ex. substâncias β-lactâmicas como a penicilina modificam

covalentemente a enzima transpeptidase, impedindo a síntese da

parede bacteriana e sendo rompida devido à

pressão osmótica - morte das bactérias

β-lactâmicos

InibidoresIrreversíveis

Ex 2. O ácido acetilsalicílico presente em diversos fármacos

modifica de forma covalente a enzima

cicloxigenase, reduzindo a síntese das moléculas

responsáveis pela sinalização durante a

inflamação

InibidoresIrreversíveis

PGE2

⊺

o sítio ativo é incapaz de fixar o substrato

Ácido acetilsalicílico doa grupo acetil (CH3-

CH2), se ligando à região Ser da enzima

Alteração estrutural da enzima

InibidoresIrreversíveis - SUICIDAS

Classe especial de inibidores irreversíveis

Compostos não reativos até que se liguem ao sítio ativo de uma enzima específica

Passa pelas primeiras etapas químicas da reação enzimática, mas em vez de ser transformado em produto normal, é convertido em um composto muito reativo que se combina irreversivelmente com a enzima.

Também chamados de inativadores com base no mecanismo, pois sequestram o mecanismo normal da reação para inativar a enzima.

InibidoresIrreversíveis - SUICIDAS

Alfa1-antitripsina

Tripsina (elastase)

Ex. A proteína alfa1-antitripsina se liga à

região tripsina da enzima elastase,

inativando-a

É conhecido como SUICIDA, pois a

proteína, uma vez associada à elastase, é

degradada junto à enzima

Elastase – causa dano aos alvéolos

Quando há deficiência da proteína, haverá

um quadro de enfisema pulmonar

InibidoresReversíveis - Competitiva

Inibidores reversíveis – rápida dissociação do

complexo enzima-substrato

Enzima liga-se ao substrato (complexo ES)

OUao inibidor (complexo

EI)

Nunca se liga em ambos ao mesmo

tempo

• Estrutura semelhante à do substrato

• Liga-se ao Sítio Ativo da enzima• Aumento da [substrato] diminui a inibição • Vmax NÃO se altera• Km da enzima AUMENTAna presença do inibidor

Inibidores Reversíveis - Competitiva

0 1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

Sem inibidor

Com inibidor

Substrato (mM)

V 0(m

ol.L

-1.m

in-1

)

Substrato (mM) V0 (sem inibidor) mmol.L-1.min-1

V0 (com inibidor) mmol.L-1.min-1

0.2 5 3 0.4 7.5 5 0.8 10.0 7.5 1.0 10.7 8.3 2.0 12.5 10.7 4.0 13.6 12.5 6.0 13.5 13.5

v

V

V/2

1/V Km Km s -1/Km -1/Km

1/s

Com inibidorSem inibidor

InibidoresReversíveis - Acompetitiva

Inibidor se liga SOMENTE quando há o complexo enzima-substrato formado

Sítio de ligação formado somente após a ligação do

substrato à enzima

Não é alterada com adição de mais

substrato

• Vmax menor na presença do inibidor• Reduzido valor de Km

• Para manter o equilíbrio entre E e ES, maior quantidade de S se liga à E

• Vmax não pode ser alcançada, mesmo com altas [ ] do substrato

InibidoresReversíveis - Acompetitiva

InibidoresReversíveis -

Não-competitiva

Inibidor e substrato ligam-se ao mesmo tempo à enzima, em

sítios de ligação diferentes •Inibidor não tem semelhança

estrutural com o substrato•NÃO se liga no sítio ativo da enzima•Aumento da [substrato] não diminui a inibição •Km da enzima NÃO se altera •A VMAX DIMINUI na presença do inibidor

Inibidores

v

V

V V/2 1/V

V/2 1/V

km s -1/Km 1/s

1/v

Km 1/Km [1/s]

V 1/V

[s]

Com inibidorSem inibidor

Reversíveis - Não-competitiva

InibidoresReversíveis - Mista

Padrão complexo

Produzido quando um único inibidor dificulta

a formação do complexo enzima-

substrato

Redução da renovação do número de enzimas

Enzimas Regulatórias

Enzimas Regulatórias

Podem aumentar ou diminuir a atividade catalítica com base em

substâncias modulatórias associadas à enzima

Podem ser:

1. Ativadas por deleção de segmentos peptídicos

(irreversíveis)

2. Enzimas alostéricas (ligações

reversíveis)

3. Alterações covalentes

Enzimas Regulatórias

Conversão da L-treonina a L-leucina é catalisada pela

sequência de cinco enzimas, cujo produto final leva à regulação da primeira

enzima

O resultado final é a regulação da velocidade em que os produtos são gerados

e que varia conforme a necessidade da célula

Inibição por retroalimentação

Enzimas Alostéricas

Enzimas AlostéricasNem todas as enzimas seguem o padrão definido pela equação de

Michaelis-Menten

São as enzimas alostéricas, que apresentam múltiplos sítios ativos e compostos por diversas subunidades (oligoméricas)

Pequenas moléculas

regulatórias (efetores) podem

ligar-se e modificar a atividade

catalítica destas enzimas

Atividade enzimática pode ser alterada pelos efetores

por dois caminhos: aumento ou diminuição da Vmax ou aumento ou diminuição da

Km

Relação entre V0 e [S] diferente da cinética de Michaelis-Menten

Enzimas Alostéricas

Michaelis-Menten Enzimas alostéricas

Apresentam perfil sigmoide (aspecto em S) com relação à velocidade em que a reação ocorre e a concentração

do substrato

Enzimas Alostéricas

Podem ser tanto inibidor quanto

ativador da enzima

Enzimas Alostéricas

A atividade enzimática é regulada pela ligação de substâncias aos sítios regulatórios da enzima.

Essa ligação altera a

conformação da enzima e o

formato do sítio ativo

Essas ligações podem tanto inibir quanto

ativar

Modificação Covalente

Fosforilação é o tipo mais comum de modificação

covalente

Há gasto de ATP

Na proteína podem haver diversos

sítios fosforiláveis

Exemplos de enzimas regulatórias Fosfofrutokinase –1 (PFK-1):

ALOSTERIA MODIFICAÇÃO COVALENTE

ALOSTERIA

Glicogênio Fosforilase

O que a desregulação do sistema pode ocasionar?

Como a velocidade da reação pode ser afetada?

pH Presença de inibidores/ativadores

Temperatura Modificações químicas: adenilação,

fosforilação...Concentração de

substratosConcentração da enzima

Concentração de cofatores