Prémio Thomé Villar/Boehringer Ingelheim 2004 em doentes ... · 108 Repercussão da imunoterapia...

R E V I S T A P O R T U G U E S A D E P N E U M O L O G I A

Vol XII N.º 2 Março/Abril 2006

107

Repercussão da imunoterapia específica na população T1 e T2 de linfócitos periféricosem doentes atópicosManuela Rebordão, Luís Delgado, Helena Pinto, Augusto Remédios, L Taborda-Barata

Repercussão da imunoterapia específica na população T1e T2 de linfócitos periféricos em doentes atópicos

Specific immunotherapy effect on peripheral blood T1/T2lymphocytes in atopic patients

Manuela Rebordão1

Luís Delgado2

Helena Pinto3

Augusto Remédios4

L Taborda-Barata5

ResumoResumoResumoResumoResumoA coordenação das características humorais ecelulares da resposta alérgica, sabe-se hoje, estádependente da regulação por linfócitos T. Asvacinas de alergénios são uma terapêutica queconsegue modular a resposta das células T, e cujosmecanismos imunológicos permanecem incomple-tamente esclarecidos.Objectivo: Avaliar o efeito da imunoterapia, apósum ano de tratamento, na expressão de citocinas

AbstractAbstractAbstractAbstractAbstractAllergen-specific immunotherapy has been usedfor successful treatment of atopic diseases. Theymay act by modifying the patterns of cytokinesproduced by T cells. However, the precise mecha-nism by which it accomplishes these effects is stillincompletely understood.Objective: To evaluate the effect of one year im-munotherapy on cytokines profiles T1 and T2 ofperipheral blood lymphocytes in atopic patients.

* Trabalho vencedor ex-aequo (Secção A)1 Técnica Superior de Saúde. Assistente principal. Serviço de Análises Clínicas do Hospital Militar de Belém/Senior Health Technician. Senior assistant. Belém

Military Hospital Analysis Clinic2 Professor Associadoda Faculdade de Medicina da Universidade do Porto. Serviço e Laboratório de Imunologia, Faculdade de Medicina da Universidade do

Porto, Hospital de São João, Porto/Associate Professor at Porto University Medical School. Immunology Unit and Laboratory, Porto University Medical School,Hospital de São João, Porto

3 Tenente-coronel médica – Directora do Serviço de Pneumologia do Hospital Militar de Belém/Medical Lieutenant Colonel – Director of Pulmonology Unit, BelémMilitary Hospital

4 Tenente-coronel farmacêutico – Director do Serviço de Análises Clínicas do Hospital Militar de Belém/Pharmacist Lieutenant Colonel – Director of Analysis Clinic,Belém Military Hospital

5 Professor Auxiliar de imunologia clínica, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior. Director do Serviço de Imunoalergologia do HospitalPêro Covilhã/Assistant Professor Immunology Unit, Beira Interior University Health Sciences School. Immunoallergologist, Director of Immunoallergology Unit,Pêro Covilhã Hospital

Recebido/aceite para publicação/received/accepted for publication: 05.11.12

Prémio Thomé Villar/Boehringer Ingelheim 2004*

Thomé Villar/Boehringer Ingelheim Award 2004 *



108

Repercussão da imunoterapia específica na população T1 e T2 de linfócitos periféricosem doentes atópicos

Manuela Rebordão, Luís Delgado, Helena Pinto, Augusto Remédios, L Taborda-Barata

de perfil T1 e T2 em linfócitos de sangue periféricode doentes atópicos.Material e métodos: Estudaram-se dez doentesatópicos sensibilizados a aeroalergénios comuns afazerem vacinas de alergénios num período médiode um ano. Dentre estes, seis foram estudados antese após a vacina. Como controlo estudou-se umgrupo atópico sem imunoterapia constituído por14 doentes também sensibilizados a aeroalergénioscomuns e um grupo de indivíduos não atópicos,saudáveis, constituído por 7 elementos. A activaçãodos linfócitos T fez-se com PMA, ionomicina ebrefeldina e estudaram-se as citocinas intracitoplas-máticas IFN-γ, IL-4, IL-5 e IL-10 por citometria defluxo. Procedeu-se a análise estatística por testesnão paramétricos (Teste de Mann-Whitney U eWilcoxon), considerando-se significativo p≤0,05.Resultados: A expressão de IL-4 e IL-5 nas célulasT, caracteristicamente aumentada nos doentesatópicos, respectivamente 13,8 (3,1-31,8) e 6,7%(1,0-20,4), é significativamente mais baixa no grupoque realizou a imunoterapia [5,4 (2,9-15,6) p= 0,007e 2,1% (0,6-4,8) p=0,035] não diferindo do grupocontrolo não atópico [5,1 (4,1-6,9) e 1,0 (0,4-2,1)].Os níveis de IFN-γ não variaram significativamenteentre os três grupos estudados, mas a razão IFN-γ//IL-4 nos linfócitos T CD4 aumentou significati-vamente nos doentes submetidos a imunoterapia.Por outro lado, houve um aumento da expressãode IL-10 nas células T circulantes do grupo sobimunoterapia, comparativamente a controlos nãoatópicos [1,9 (1,0-4,9) versus 1,4% (0,9-1,4) p=0,02],sendo mais evidente nos linfócitos T CD8. A IL-10correlacionou-se de forma significativa com todasas citocinas de perfil T2 (IL-4 e IL-5) e com ofenótipo Tc2.Conclusão: Após um ano de imunoterapia, aresposta das células T do sangue periférico a umaestimulação policlonal evidenciou uma diminuiçãoda expressão das citocinas (IL-4 e IL-5),

Methods: We studied 10 atopic patients sensitisedto common environmental allergens receiving im-munotherapy over one year mean period. Six ofthese patients were studied before and after immu-notherapy. Fourteen atopic patients untreated and7 non-atopic subjects were used as control groups.Intracellular cytokine production (IFN-γ; IL-4; IL-5; IL-10) was determined by flow cytometry fol-lowing stimulation with phorbol myristate acetate(PMA), ionomycin and brefeldin. Mann-WhitneyU and Wilcoxon non-parametric tests were utilizedfor the statistical analysis.Results: The expression of IL-4 and IL-5 in T cells,characteristically increased in atopic patients, res-pectively 13.8 (3.1 – 31.8) and 6.7% (1.0 -20.4), wassignificantly lower in the immunotherapy group[5.4 (2.9 -15.6) p=0.007 and 2.1% (0,6 – 4.8)p=0.035] and similar in the non-atopic controlgroup. The levels of IFN-γ did not differ betweenthe studied groups but the ratio IFN-γ / IL-4 pro-duced by CD4+ T lymphocytes increased signifi-cantly in the patients receiving immunotherapy.In addition, there was an increase in the expres-sion of IL-10 by T cells of the immunotherapygroup compared to the non-atopic controls [1.9 (1.0– 4.9) versus 1.4% (0.9 – 1.4) p=0.02], being moreevident in CD8+ T lymphocytes. IL-10 correlatedsignificantly with all the profile T2 cytokines (IL-4and IL-5) and with the phenotype Tc2.Conclusion: After one year of immunotherapy theperipheral T cells response to a polyclonal stimu-lation revealed a reduction in IL-4 and IL-5 pro-duction, characteristically increased in atopic di-sease. The increase of IL-10 that we found in ourstudy suggested the existence of a profile T2 regu-latory population, more evident in CD8+Tlymphocytes.



109


caracteristicamente aumentadas na doença alérgica.O aumento da IL-10, que também verificámos,sugere a existência de uma população reguladora deperfil T2, sendo mais evidente nos linfócitos T CD8.

Rev Port Pneumol 2006; XII (2): 107-130

Palavras chave: Imunoterapia, linfócitos T1 e T2,razão IFN-γ / IL-4, IL-10.

Rev Port Pneumol 2006; XII (2): 107-130

Keywords: Immunotherapy, T1 and T2lymphocytes, ratio IFN-γ / IL-4, IL-10.

IntroduçãoA doença atópica caracteriza-se por umaresposta inflamatória com um padrão par-ticular dependente da síntese aumentadade IgE e activação de células efectorascaracterísticas – mastócitos e eosinófilos1.Actualmente, sabe-se que a coordenaçãodas características humorais e celulares daresposta alérgica está dependente daregulação por linfócitos T2. Assim, oslinfócitos T2 produtores de IL-4 poten-ciam a síntese de IgE e o aumento daexpressão vascular de moléculas de adesãoe selectinas, responsáveis pelo recruta-mento selectivo de eosinófilos, enquantoos linfócitos T2 produtores de IL-5influenciam a produção, maturação,activação e sobrevida dos eosinófilos3,4,5.Em contraste, os linfócitos que expressamcitocinas T1 inibem o desenvolvimentoda diferenciação de células T2 e dasrespostas alérgicas através da produção deIFN-γ6. Também, reciprocamente, ascélulas T2 inibem as T1 através da IL-47.Em trabalhos anteriores, em que ava-

IntroductionAn atopic disease has a particular patternof inflammation depending on increasedIgE synthesis and activation of the cha-racteristic effectors cells – mastocytes andeosinophils1. It is known that humoral andcellular characteristics of the allergic re-sponse is regulated by T lymphocytes2.Thus, the IL-4 producer lymphocytesincrease IgE synthesis and vascular expres-sion of the molecules of adhesion andselectins, responsible for the selective re-cruitment of eosinophils, while the IL-5producer lymphocytes influence the pro-duction, maturation, activation and sur-vival of the eosinophils3,4,5. In contrast, theT1 cytokines expression lymphocytes in-hibit the differentiation of T2 cells andthe allergic responses through the produc-tion of IFN-γ6. In addition, the T2 cellsreciprocally inhibit the T1 through theIL-47.In former studies we used flow cytometryto evaluate the expression of T1 and T2cytokines in circulating lymphocytes in

Sabe-se que acoordenação dascaracterísticashumorais e celularesda resposta alérgicaestá dependente daregulação porlinfócitos T



110



liámos por citometria de fluxo a expressãode citocinas T1 e T2 em linfócitos circu-lantes de doentes atópicos, pudemosverificar a existência de uma expressão deIL-4 quer em linfócitos T CD4 (Th2) e TCD8 (Tc2), enquanto a expressão de IL-5foi predominante nas células T CD8 (Tc2).Além disso, o número de células T pro-dutoras de IL-4 correlacionou-se com a IgEsérica destes doentes, enquanto as Tc2(IL-5) com o número de eosinófiloscirculantes e ECP sérica.Uma das terapêuticas moduladoras daresposta alérgica utilizada desde longa dataé a vacinação com alergénios8. Apesar dalonga experiência clínica com este tipo deterapêutica, os mecanismos imunológicosque lhe são subjacentes permanecem aindadesconhecidos. Se, nos estudos iniciais, seatribuiu essencialmente um papel modu-lador à IgG9, os estudos mais recentes têmapontado para uma modulação doslinfócitos T através de um possível meca-nismo de anergia (as células T deixam deresponder ao alergénio)10,11 ou/e desvioimune (a expressão de citocinas das célulasT muda de um perfil T2 para um perfilT1)12,13,14,15. Em relação à modificação doperfil de citocinas induzida pela imuno-terapia, os resultados são variáveis, estandodescritos aumentos de IFN-γ com dimi-nuição das citocinas de perfil T216,aumentos de IFN-γ sem modificação dosníveis de IL-417, decréscimo de ambas ascitocinas18 e ainda decréscimo de IL-4 semmodificação dos níveis de IFN-γ19. Naavaliação da expressão destas citocinas temsido referida a razão IFN-γ/IL-4 como umbom índice de avaliação do tratamentocom imunoterapia por traduzir o balançoT1/T220. Por outro lado, mais recente-

atopic patients and were able to verify theexistence of expression of IL-4 both inCD4 (Th2) and CD8 (Tc2)T lymphocytesof IL-5 expression however, was predomi-nant in CD8 (Tc2) T cells. In addition,the number of IL4 producer T cells cor-related with the serum IgE of these pa-tients while the Tc2 (IL-5) correlated withthe number of circulating eosinophils andthe serum level of eosinophil cationic pro-tein (ECP).One of the treatments to allergic responsewith a long-standing history is allergenvaccination8. Despite a long clinical expe-rience with this type of treatment, thesubjacent immunological mechanisms re-mains unknown. While earlier studies at-tributed a modulator role to IgG9, morerecent studies have pointed to T lym-phocytes through a possible anergymechanism (T cells stopped respondingto allergen)10,11 and/or immune deviation(a change in T cells cytokines expressionfrom a T2 to a T1 profile)12,13,14,15. Theresults of cytokines profiles modificationinduced by immunotherapy are variable.Increases of IFN-γ with decrease in T2cytokines profile16, increases of IFN-γwithout change in IL-417 levels, a decreasein both cytokines18 and a decrease in IL-4with no change in IFN-γ levels19 are des-cribed evaluating cytokines express in theIFN-γ/IL-4 ratio has been cited as a goodindex in the immunotherapy evaluationsince it translate the T1/T2 balance20. Onthe other hand, IL-10 has been more re-cently studied as an immunoregulatorcytokine21. Akdis refers to a large increasein this cytokine expression in an autocrineform, in the specific antigen T cells, as-sociated with anergy and inflammatory

Uma das terapêuticasmoduladoras daresposta alérgicautilizada desde longadata é a vacinaçãocom alergénios



111


mente, a IL-10 tem sido também estudadacomo uma citocina imunorreguladora21.Akdis refere um grande aumento na ex-pressão desta citocina, de forma autócrina,nas células T específicas de antigénio,estando associada à anergia e à inibição dereacções inflamatórias10.Neste estudo procurámos avaliar as popu-lações T1 e T2 de doentes atópicossubmetidos à imunoterapia há pelo menosum ano. Estudámos, por citometria defluxo, a expressão de citocinas dos linfó-citos circulantes estimulados policlonal-mente, avaliando o IFN-γ, a IL-4, a IL-5, aproporção relativa IFN-γ/IL-4 e umacitocina predominantemente supressora:a IL-10.

Material e métodosMaterial e métodosMaterial e métodosMaterial e métodosMaterial e métodos

PopulaçãoEstudámos dez indivíduos atópicos, sendosete sensíveis a ácaros do pó da casa(Dermatophagoides pteronyssinus) e três sensíveisa pólens de gramíneas. Apresentavam umamédia de idades de 27,5 (13-54) anos, sendoseis do sexo masculino e quatro do sexofeminino. Cinco tinham asma brônquicaassociada a rinite, três rinite alérgica e doisasma brônquica. Todos os doentes estavama fazer vacinas de alergénios, com ex-tractos estandardizados biologicamente,adsorvidos em hidróxido de alumínio oufosfato de cálcio (3 casos), com um tempomédio de tratamento de 19 (6-57) meses.Seis destes doentes foram estudados antesdo tratamento (avaliação basal) e após 12(6-19) meses. Os doentes mantiveram a suaterapêutica habitual durante o período doestudo: todos utilizavam corticosteróidestópicos nasais, oito também corticos-

inhibition reactions10.This study evaluates the T1 and T2populations of atopic patients who havebeen undergoing immunotherapy for atleast one year. We used flow cytometryto study the cytokines expression of the cir-culating lymphocytes with polyclonalstimulation, evaluating IFN-γ, IL-4, IL-5,IFN-γ/IL-4 ratio and a predominantlysuppressor cytokine: IL-10.

Methods

PopulationWe studied ten atopic patients. Seven weresensitive to house dust mites (Dermato-phagoides pteronyssinus) and three sensitive tograss pollen. Their mean age was 27.5 (13-54) years; six were male. Five had bron-chial asthma associated with rhinitis; threehad allergic rhinitis and two had bronchialasthma. All the patients were receivingallergen vaccination with biologicallystandardised extracts, absorbed in alu-minium hydroxide or calcium phosphate(3 cases). Mean length of treatment was19 (6-57) months.Six of these patients had been studied be-fore treatment (basal evaluation) and af-ter 12 (6-19) months. Patients continuedwith their usual treatment during the pe-riod of the study. All of them used topi-cal nasal corticosteroids, eight also usedinhaler corticosteroids (associated withinhalers bronchodilator in two patients)and oral anti-histamines when necessaryin four patients.The atopic control group consisted of 14patients sensitive to house dust mites(Dermatophagoides pteronyssinus), four ofwhom were also sensitive (to a lesser de-

Procurámos avaliaras populações T1 eT2 de doentesatópicos submetidosà imunoterapia hápelo menos um ano



112



teróides inalados, associados a broncodi-latadores inalados em dois doentes e anti--histamínicos orais, quando necessário, emquatro doentes.O grupo atópico era constituído por 14indivíduos sensíveis a ácaros do pó da casa(Dermatophagoides pteronyssinus), sendo 4também sensíveis (em menor grau) apólens de gramíneas. Apresentavam umamédia de idades de 22,3 (13-58) anos, sendo9 do sexo masculino e 5 feminino. Onzetinham asma brônquica e três rinitealérgica.Cinco destes doentes estavam a fazercorticosteróides de inalação oral, oitocorticosteróides de inalação nasal, doisbroncodilatadores e três anti-histamínicos.Todos eram seguidos na consulta deAlergologia do Hospital Militar de Belém.O grupo não atópico era constituído porsete indivíduos, com idade média de 25,6(20-38) anos, sendo cinco do sexo mas-culino e dois do sexo feminino. Foramrecrutados no Hospital Militar de Belémcom aceitação voluntária de participaçãono estudo e tendo como critérios deexclusão qualquer doença concomitante,local ou sistémica, que afectasse o sistemaimunitário (neoplasia, doença auto-imuneou inflamatória crónica, insuficiência re-nal crónica, diabetes mellitus, atopia,imunodefeciência). A todos foram feitasprovas de sensibilidade cutânea, dosea-mentos de IgE total e específica, avaliaçãoda função renal, hepática e radiografia detórax.

gree) to grass pollen. The mean age was22.3 (13-58) years old. Nine subjects weremale. Eleven had bronchial asthma andthree allergic rhinitis.Five of these patients were taking inhaledcorticosteroids; eight nasally inhaledcorticosteroids, two bronchodilators andthree anti-histamines. All these patientswere having Allergology consultations atBelém Military Hospital.The non-atopic control group consistedof by seven individuals. Their mean agewas 25.6 (20-38) years. Five were male andtwo female. They were recruited at BelémMilitary Hospital and voluntarily ac-cepted to participate in the study. Exclu-sion criteria included any concomitantlocal or systemic disease that interferedwith immune system (neoplasy, au-toimmune disease or chronic inflamma-tion, chronic renal insufficiency, diabetesmellitus, atopia, immunodeficiency). Allunderwent subcutaneous sensitivity tests,total and specific IgE measurements eva-luation of renal and hepatic function andchest radiography.

Study of the cytokines expression in Tlymphocytes

StimulationEqual parts of RPMI 1640 (GibcoBRL)enriched with L-glutamin 200mM(GibcoBRL) were added to total bloodcollected in heparin. This was stimulatedwith Brefeldin A (Sigma) in a concentra-tion of 10µg/mL with PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) (Sigma) in a finalconcentration of 25 ng/mL and iono-mycin (Sigma) in a concentration of 1µg/mL. A blood sample incubated with all



113


Estudo da expressão de citocinas emlinfócitos T

ActivaçãoAo sangue total colhido em heparinajuntou-se, em partes iguais, RPMI 1640(GibcoBRL) enriquecido com L-gluta-mina 200mM (GibcoBRL). A activaçãofez-se em presença de brefeldina A (Sigma)na concentração de 10µg/mL com PMA(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) (Sigma)na concentração final de 25 ng/mL eionomicina (Sigma) na concentração de1µg/mL. Utilizou-se como controlonegativo da activação uma amostra de san-gue incubada com tudo o descrito ante-riormente, excepto PMA e ionomicina.A activação fez-se durante 4 horas a 37ºCem atmosfera húmida e com 5% de CO2.

Marcação de superfícieOs linfócitos foram estudados usandocomo marcadores de superfície o anti-corpo monoclonal CD3 marcado com ofluorocromo PC5 - ficoeritrina-cianina 5,1(excitação a 486-580 nm e emissão a 660--680 nm), e o anticorpo monoclonal CD8marcado com FITC – isotiocianato defluoresceína (excitação a 486-580 nm eemissão a 504-541 nm), ambos da Immuno-tech (Izasa). As células foram incubadasdurante 15 minutos à temperatura am-biente com 10µL de anticorpo monoclonalCD3 e 20µL de CD8.

Fixação e permeabilizaçãoEfectuou-se a fixação e permeabilizaçãodos linfócitos T de acordo com as instru-ções do produtor (Fix e Perm, CaltagLaboratories). Após a marcação de super-fície, lavaram-se as células com um tampão

the abovementioned except PMA andionomycin was used as a negative controlstimulation. Stimulation was for 4 hoursat 37ºC in a humid atmosphere and with5% CO2.

Surface markersThe lymphocytes were studied using assurface markers the monoclonal antibodyCD3 marked with the fluorocrome PC5- phycoerythrin cyanin 5.1 (excitation at486-580nm and emission at 660-680nm),and the monoclonal CD8 antibodymarked with FITC – fluorescein isothio-cyanate (excitation at 486-580nm andemission at 504-541nm), both from Immu-notech (Izasa). The cells were incubatedfor 15 minutes at room temperature with10µL of the monoclonal CD3 antibodyand 20µL of CD8.

Fixation and permeabilizationThe T lymphocytes underwent fixationand permeabilization in accordance withthe manufacturer’s instructions (Fix andPerm, Caltag Laboratories). After surfacemarking, the cells were washed with aphosphate-buffered-saline (PBS) for 5 mi-nutes at 2,000 rpm. After fixation for 15minutes at room temperature, the per-meabilization and marking of the intra-cellular cytokines was carried out.

Marking of the intra-cellular cytokinesHuman anti-cytokines monoclonal anti-bodies IFN-γ, IL-4, IL-5 and IL-10(PharMingen), all conjugated with thefluorochrome PE - phycoerythrin (PE)(excitation at 486-575nm and emission at568-590) were used. The intra-cytoplas-matic expression of CD69 PE (Becton



114



fosfato salino (PBS) durante 5 minutos a2000 rpm. Após fixação durante 15minutos à temperatura ambiente, fez-se apermeabilização e a marcação das citocinasintracelulares.

Marcação de citocinas intracelularesUtilizaram-se anticorpos monoclonaisanti-citocinas humanas IFN-γ, IL-4, IL-5e IL-10 (PharMingen), todas conjugadascom o fluorocromo PE - ficoeritrina(excitação a 486-575 nm e emissão a 568--590). Para avaliação da activação in vitroestudou-se também a expressão intracito-plasmática de CD69 PE (Becton Dickin-son). A quantidade de anticorpos usadosfoi de 3µL para as citocinas e 20µL para oCD69. O tempo de incubação foi de 15minutos à temperatura ambiente, seguin-do-se lavagens para posterior análise.

Análise por citometria de fluxoPara a análise por citometria de fluxoutilizou-se um citómetro de fluxoEpics®Elite equipado com um laser de 15mW e com filtros apropriados para leiturade FITC (525nm), PE (575nm) e PC-5(675nm). O número de células adquiridofoi de 20 000 e a informação computo-rizada foi guardada em listmode para maistarde ser avaliada de acordo com o softwarede análise do próprio equipamento. Osresultados foram expressos em percenta-gem de células (linfócitos T totais ou CD4ou CD8) que coraram de forma positivapara uma dada citocina. O gate de linfócitosfoi feito a partir do CD3 PC-5. Os linfó-citos T CD4+ foram identificados comoCD3+CD8- devido à diminuição daexpressão do CD4 nos linfócitos T napresença de esteres do phorbol 22,23. Foram

Dickinson) was also studied for the eva-luation of the in vitro stimulation. 3µLcytokine antibodies and 20µL at CD69were used. Incubation time was 15 min-utes at room temperature, followed bywashes for posterior analysis.

Analysis by flow cytometryAn Epics®Elite Flux Cytometer equippedwith a 15 mW laser and filters suitable forreading FITC (525nm), PE (575nm) andPC-5 (675nm) was used for the flowcytometry analysis. 20,000 cells were ac-quired and the computer information wasstored in “listmode” to be evaluated laterin accordance with the equipment’s ownsoftware analysis. The results were ex-pressed in % of cells (total T lymphocytesor CD4 or CD8) which colour in a posi-tive way for a specific cytokine. Thelymphocyte gate was determined by theCD3 PC-5. The CD4+T lymphocyteswere identified as CD3+CD8- due to thedecrease in the expression of CD4 on theT lymphocytes in the presence of phorbolesters22,23. The non-stimulated lympho-cytes were used as negative controls.

Statistical studyStatistical analysis were performed byusing the Mann-Whitney U test (compari-son of a variable between 2 groups) andthe Wilcoxon-Signed Rank Test (compari-son of a variable in the same group). TheSpearman correlation test was used tostudy the correlations. Value of p less than0.05 was considered significant. Results areexpressed in median, maximum and mini-mum values.



115


utilizados como controlos negativos oslinfócitos não estimulados.

Estudo estatísticoApós análise estatística descritiva e veri-ficação da distribuição não normal dosdados, foram utilizados testes nãoparamétricos para avaliação dos resulta-dos: Mann-Whitney U test (comparação deuma variável entre 2 grupos) e Wilcoxon-Signed Rank Test (comparação de umavariável no mesmo grupo). Para o estudodas correlações usou-se o teste de corre-lação de Spearman. O valor de p foi consi-derado significativo quando inferior a0,05. Os resultados são expressos emmedianas, valor máximo e mínimo.

ResultadosResultadosResultadosResultadosResultados

Expressão de interferão gama (IFN-γγγγγ)A percentagem de linfócitos T CD3produtores de IFN-γ no grupo submetidoa imunoterapia é discretamente mais baixado que no grupo-controlo e também doque no grupo atópico, não havendo dife-renças significativas entre os três grupos(Fig.1). O mesmo se verifica quando se faza análise das subpopulações linfocitáriasT CD4 e T CD8.

Expressão de IL-4A expressão de IL-4 nos linfócitos T CD3no grupo com imunoterapia foi muitosemelhante ao do grupo-controlo, respec-tivamente 5,4 (2,9-15,6) e 5,1% (4,1-6,9),não diferindo estatisticamente (p=0,92).No entanto, verifica-se uma expressãosignificativamente mais baixa quando secompara com o grupo atópico: 13,8% (3,1--31,8) (Fig. 2).

Results

Expression of interferon gama (IFN-γγγγγ)The percentage of IFNI producer T CD3lymphocytes in the immunotherapygroup is slightly lower than in the con-trol normal group and also lower than inthe atopic group. There were no signifi-cant differences between the three groups(Fig. 1). The same was seen in analysingthe CD4 and CD8 T lymphocyte subpo-pulations.

Expression of IL-4The expression of IL-4 by CD3 Tlymphocytes was very similar to the con-trol group, 5.4 (2.9-15.6) and 5.1% (4.1-6.9) respectively. There was no significantdifference (p=0.92). It was, however,markedly lower than in the atopic group:13.8% (3.1-31.8) (Fig. 2).In the CD4 lymphocyte, a significant de-crease in production of IL-4 - 2.5% (1.7--7.8) was seen in the immunotherapygroup as compared to the control group -4.2% (3.1-5.6) - and the atopic group - 6.0%(2.0-9.1).In the CD8 T lymphocyte the expressionof IL-4 was 3.3% (6-7.8) only differed sig-nificantly in the control group - 1.3% (0.9-1.8). A great dispersion of results was seenin the atopic patients not undergoing im-munotherapy : between 0.5 and 22.7%(Fig. 2).

Expression of IL-5The expression of IL-5 by CD3 Tlymphocytes of the atopic patients is sig-nificantly higher than in non-atopic con-trol population: 6.7% (1.0-20.4) versus 1.0%(0.4-2.1) respectively, p=0.087. This ex-



116



Na subpopulação linfócitária T CD4verificou-se, no grupo com imunoterapia,uma diminuição significativa da produçãode IL-4 - 2,5% (1,7-7,8) – quer comparati-vamente ao grupo controlo – 4,2% (3,1-5,6)– quer com o grupo atópico - 6,0% (2,0-9,1).Já na subpopulação T CD8, a expressãode IL-4 foi de 3,3% (6-7,8), apenas diferindosignificativamente do grupo-controlo –1,3% (0,9-1,8) –, verificando-se nos doentesatópicos sem imunoterapia uma grandedispersão de resultados: entre 0,5 a 22,7%(Fig. 2).

Expressão de IL-5Nos linfócitos T CD3 dos doentes ató-picos, a expressão de IL-5 é significati-vamente mais elevada do que na população--controlo, não atópica: respectivamente6,7% (1,0-20,4) versus 1,0% (0,4-2,1),p=0,087. Já no grupo submetido a imuno-terapia verifica-se que essa expressão sereduz significativamente para 2,1% (0,6-4,8),

pression reduces significantly in the groupundergoing immunotherapy to 2.1% (0.6-4.8), p=0.035, coming close to and notdiffering from the non-atopic controlgroup (Fig. 3).In the CD8 T lymphocytes, an expressionof IL-5 close to that of the total (CD3) Tpopulation was detected, i.e. an increasein the expression of the atopic population(Fig. 3) decreasing in the patients under-going immunotherapy, although thisgroup continued above the values of thecontrol group: 1.9 (0.5-4.5) versus 0.3% (0.1-1.3), p=0.011.In the CD4 T lymphocyte the expressionof IL-5 was very small in all the groupsstudied (Fig. 3), and a significant decreasewas seen in the immunotherapy groupwhen compared to the atopic group: 0.3(0.1-1.0) versus 0.85% (0.3-1.9), p=0.001.

Fig. 1 – Expressão de IFN-γ nos linfócitos T periféricos. O grupo submetidoa imunoterapia expressou valores mais baixos, mas não diferindosignificativamente do grupo atópico e controlo, em todas as populaçõeslinfocitárias; ns=p≥0,05.

Fig. 1 – Expression of IFN-γ in the peripheral T lymphocytes. The groupundergoing immunotherapy showed lower values, but did not differ sig-nificantly from the atopic and control groups in all the lymphocytepopulations; ns=p≥0.05.

Expression of IFN-γγγγγ

Control Atopic Immunotherapy Median

Expressão de IFN-γγγγγ



117


p=0,035, aproximando-se e não diferindodo grupo-controlo, não atópico (Fig. 3).Na subpopulação de linfócitos T CD8verificou-se uma expressão de IL-5

Expression of T1 and T2 cytokinesafter beginning immunotherapyIt was possible to compare the ex-pression of T1 and T2 cytokines in

Fig. 2 – Expressão de IL-4 nos linfócitos T circulantes. Os linfócitos TCD3 do grupo com imunoterapia apresentam, comparativamente aosatópicos, uma redução da expressão de IL-4, aproximando-se dosvalores do grupo-controlo. Nos linfócitos T CD4, a expressão de IL-4após a imunoterapia desce abaixo dos valores do grupo-controlo,enquanto os linfócitos T CD8 permanece com níveis que não diferemdo grupo atópico.

Fig. 3 – Expressão de IL-5 em linfócitos T periféricos. A IL-5 expressanos linfócitos T CD3 diminui significativamente no grupo a fazerimunoterapia comparativamente ao grupo dos atópicos e não diferindodo grupo-controlo. Apenas nos linfócitos T CD8 a expressão estáaumentada em relação ao controlo em oposição aos linfócitos T CD4,cujo valor de IL-5 está abaixo do grupo-controlo.

Fig. 2 – Expression of IL-4 in the circulating T lymphocytes. TheCD3 T lymphocytes of the group undergoing immunotherapy show areduction in the expression of IL-4 as compared to the atopic group,coming close to that of the control group. The expression of IL-4 inthe CD4 T lymphocytes after immunotherapy decreases to belowthe values of the control group while the CD8 T lymphocytes remainat levels which are not different from the atopic group.

Fig. 3 – Expression of IL-5 in peripheral T lymphocytes. The IL-5 ex-pressed in the T CD3 lymphocytes decreased significantly in the groupundergoing immunotherapy as compared to the atopic group and did notdiffer from the control group. Only in the CD8 T lymphocytes is the ex-pression increased in relation to the control group as opposed to theCD4 T lymphocytes whose IL-5 value is lower than the control group.


Control Atopic Median Immunotherapy

Expression of IL-4

Expression of IL-5



118



próxima da população T total (CD3), i.e.,o aumento da expressão na populaçãoatópica (Fig. 3) diminui nos doentessubmetidos a imunoterapia, embora nestegrupo se mantenha acima dos valores--controlo: 1,9 (0,5-4,5) versus 0,3% (0,1-1,3),p=0,011.Na subpopulação de linfócitos T CD4 aexpressão de IL-5 foi muito reduzida emqualquer dos grupos estudados (Fig. 3),verificando-se uma diminuição significa-tiva no grupo com imunoterapia compara-tivamente ao grupo atópico: 0,3 (0,1-1,0)versus 0,85% (0,3-1,9), p=0,001.

Evolução da expressão de citocinas T1 eT2 após início da imunoterapiaNum grupo de seis doentes atópicos foipossível comparar a expressão de citocinasT1 e T2 de linfócitos circulantes em si-tuação basal e após um período de 12 (6-19) meses de imunoterapia. Verificou-seuma redução significativa das citocinas T2(IL-4 e IL-5) em qualquer das subpopulaçõeslinfocitárias estudadas sem variaçãosignificativa na expressão do IFN-γ (Fig. 4)

Razão IFN-γγγγγ/IL-4 e IL-10A avaliação da razão IFN-γ/IL-4 nos lin-fócitos T circulantes revela uma dimi-nuição na população atópica, comparati-vamente com os controlos, particularmentena subpopulação CD8. Já no grupo sub-metido a imunoterapia verificámos umasubida da razão IFN-γ/IL-4 que deixa dediferir significativamente do grupo-con-trolo (Fig. 5).

Expressão de IL-10O estudo da expressão da IL-10 foi feitono grupo controlo e no grupo a fazer

circulating lymphocytes at basal situationand after 12 (6-19) months of immuno-therapy. A significant reduction of the T2(IL-4 and IL-5) cytokines in all thelymphocyte subpopulations studied wasobserved with no significant variation inIFN-γ expression (Fig. 4).

IFN-γγγγγ/IL-4 ratio and IL-10The evaluation of the IFN-γ/IL-4 ratio incirculating T lymphocytes showed a de-crease in the atopic population when com-pared to the control, particularly in theCD8 subpopulation. A rise in the IFN-γ/IL-4 ratio was seen in the immunotherapygroup that did not differ significantly fromthe control group (Fig. 5).

Expression of IL-10We studied IL-10 expression in the con-trol and immunotherapy groups. Therewas a significant and higher expression ofIL-10 CD3 T lymphocytes in the immu-notherapy group: 1.9 (1-4.9) versus 1.4%(0.9-1.4), p=0.02. This difference was seenin CD8 subpopulation (Fig. 6) while inCD4 T lymphocytes the expression of IL-10 did not differ statistically in the twogroups.In the immunotherapy group the IL-10expressed by CD3 T lymphocytes corre-lated significantly with the expression ofIL-4 (rs=0.72, p=0.03) and IL-5 (rs=0.80,p=0.01) by CD3T lymphocytes. This cor-relation was even more significant inCD8T lymphocytes: IL-4 (rs=0.88;p=0.002) and IL-5 (rs=0.98; p=0.001).This was however not seen in the CD3 Tlymphocytes of the non-atopic controlgroup: IL-4 (rs=-0.45; p=0.30) and IL-5(rs=0.03; p=0.95).



119


0

5

10

15

20

25

30

35

Linf

ócito

s (%

) ex

pres

sam

IL-4

p=0 ,028

p=0,046

p=0,028

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50Li

nfó

cito

s (%

) ex

pres

sam

IFN

- γ

ns

ns

ns

0

5

10

15

20

25

CD 3 CD 4 C D 8

Lin

fóci

tos

(%)

expr

essa

m IL

-5

A ntes An tes AntesPós-IT Pós-IT Pós-IT

p=0,028

p=0,028

p=0,028

Fig. 4 – Expressão de IFN-γ, IL-4 e IL-5 nos linfócitos T circulantes de seis doentes atópicos estudados em situação basal(Antes) e após um ano de imunoterapia (Pós-IT). Em todas as populações de linfócitos, as citocinas IL-4 e IL-5, mas nãoIFN-γ, baixam significativamente com o tratamento. ns=p≥0,05.



120



0

5

10

15

20

25

30

35

Linf

ócito

s (%

) ex

pres

sam

IL-4

p=0 ,028

p=0,046

p=0,028

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Lin

fóci

tos

(%)

expr

essa

m IF

N- γ

ns

ns

ns

0

5

10

15

20

25

CD 3 CD 4 C D 8

Lin

fóci

tos

(%)

expr

essa

m IL

-5

A ntes An tes AntesPós-IT Pós-IT Pós-IT

p=0,028

p=0,028

p=0,028

Fig. 4 – Expression of IFN-γ, IL-4 and IL-5 in circulating T lymphocytes in the six atopic patients studied before (Before)and after one year of immunotherapy (Post-IT). The IL-4 and IL-5 cytokines but not IFN-γ lowered significantly with treat-ment. ns=p≥0.05.

IL-5

esp

ress

ing

lym

phoc

ytes

(%)

IFN

-γ e

spre

ssin

g ly

mph

ocyt

es

Before IT Post-IT Before IT Post-IT Before IT Post-IT

IL-4

esp

ress

ing

lym

phoc

ytes

(%)



121


imunoterapia. Constatou-se uma expressãosignificativa e mais elevada nos linfócitosT CD3 na população a fazer a imuno-terapia: 1,9 (1-4,9) versus 1,4% (0,9-1,4),p=0,02. Esta diferença verificou-se nasubpopulação CD8 (Fig. 6) enquanto noslinfócitos T CD4 a expressão de IL-10 nosdois grupos estudados não diferiu estatisti-camente.No grupo de doentes atópicos com imu-noterapia, a IL-10 expressa nos linfócitosT CD3 correlacionou-se de forma sig-nificativa com a expressão de IL-4 (rs=0,72,p=0,03) e de IL-5 (rs=0,80, p=0,01) noslinfócitos T CD3. Esta correlação foi aindamais significativa nos linfócitos T CD8:IL-4 (rs=0,88; p=0,002) e IL-5 (rs=0,98;p=0,001). O mesmo não se verificou noslinfócitos T CD3 do grupo-controlo nãoatópico: IL-4 (rs=-0,45; p=0,30) e IL-5(rs=0,03; p=0,95).

DiscussãoDiscussãoDiscussãoDiscussãoDiscussãoNeste estudo, em que avaliámos citocinasT1 e T2 em linfócitos circulantes de

DiscussionThis study evaluated the cytokines T1 andT2 in circulating lymphocytes of atopicpatients one year after specific immuno-therapy. In the study we saw significantmodifications in this expression whencompared to healthy controls and atopicpatients not undergoing immunotherapy.Thus, in contrast with the IFN-γ whichdid not differ significantly, the expressionof IL-4 and IL-5 in the T cells (typicallyincreased in atopic patients) is significantlylower in the group undergoing immuno-therapy. This reduction of IL-4 was seenin a more expressive way in the CD4+(Th2) subpopulation, where the typical in-crease seen in the atopic patients becamelower than the control group (Fig. 2).In the same way, the analysis of the IFN-γ/IL-4 ratio of immunotherapy groupcome close to the profile characteristic ofthe control group. It did not differ signifi-cantly from these and was in clear con-trast to the atopic patients not undergo-ing immunotherapy (Fig. 5).

Fig. 5 – Expressão da razão IFN-γ/IL-4 em linfócitos T periféricos. No gruposubmetido à imunoterapia, a razão aumenta comparativamente à atopiaaproximando-se dos valores dos controlos não atópicos, dos quais nãodiferem significativamente.

Fig. 5 – Expression of the IFN-γ/IL-4 ratio in peripheral T lymphocytes.The ratio rose in the group undergoing immunotherapy compared to theatopic group, coming close to the values of the non-atopic control group,from which they did not differ significantly.


IFNγγγγγ/IL-4IFN-γγγγγ/IL-4



122



doentes atópicos um ano após imuno-terapia específica, verificámos modifica-ções significativas dessa expressão, quandocomparada com a de controlos saudáveise doentes atópicos sem imunoterapia.Assim, em contraste com o IFN-γ que nãovaria significativamente, a expressão deIL-4 e IL-5 nas células T (caracteristica-mente aumentada nos doentes atópicos) ésignificativamente mais baixa no grupoque realizou imunoterapia. Esta reduçãode IL-4 verifica-se de forma mais expressivana subpopulação CD4+ (Th2), onde o au-mento característico observado nos doentesatópicos passa a níveis inferiores ao dogrupo-controlo (Fig. 2).Do mesmo modo, a análise pela razãoIFN-γ/IL-4 nos doentes atópicos subme-tidos a imunoterapia mostra uma apro-ximação ao perfil característico do grupo--controlo, não diferindo significativa-mente destes, e em claro contraste com osatópicos não tratados (Fig. 5).Finalmente, verificámos também que a ITaumenta a expressão de IL-10 nas célulasT circulantes, comparativamente a con-trolos não atópicos, variação essa queapenas se observou na subpopulação CD8(Fig. 6).O estudo da expressão das citocinasintracelulares de linfócitos de sangueperiférico por citometria de fluxo, apósum estímulo inespecífico, tem demons-trado ser um método bastante rápido esensível, permitindo a avaliação dos níveisde citocinas produzidas e acumuladas, aomesmo tempo que se identifica o fenótipodas células que as expressam. Este métodotem sido utilizado por vários autores nainvestigação da imunoterapia por alergé-nios20,24 e, nalguns deles, é demonstrado

Finally, we also saw that immunotherapyincreases IL-10 expression by circulatingT cells when compared to the non-atopiccontrol subjects. This variation was onlyseen in the CD8 subpopulation (Fig. 6).Using flow cytometry to study the expres-sion of intra-cellular cytokines of peri-pheral blood lymphocytes following anunspecific stimulation proved to be a rela-tively quick and sensitive method. It al-lowed the measurement of cytokines pro-duced and accumulated and at the sametime identified the cells phenotypes thatexpressed them. Some authors have usedthis method in researching allergen immu-notherapy20,24 and some of them haveshown that the use of mitogens to acti-vate the expression of cytokines in peri-pheral lymphocytes is extremely similarto stimulation performed with a specificallergen15,24,25. In addition to this, some au-thors claim that polyclonal stimulation al-lows anergic cells to be studied as thesestop responding to the allergen11.We have some reservations over the in-terpretation of our results because of thedesign of the study. The decision to startimmunotherapy, the type of extract usedand the time of analytical evaluation de-pended exclusively on the clinical criteriaof the patients own doctors. The lack of aplacebo group also limited the results in-terpretation.The reduction of T2 cytokines expressionseen in our atopic patients after one yearof immunotherapy cancelled out thecharacteristic increase seen in the atopicdisease26,27, bringing the expression levalclose to the non-atopic control subjects.Many studies have reported a decrease inIL-4 and IL-5 levels after treatment with

Em contraste com oIFN-γγγγγ que não variasignificativamente, aexpressão de IL-4 eIL-5 nas células T (...)é significativamentemais baixa no grupoque realizouimunoterapia



123


que a utilização de mitogénios na activaçãoda expressão de citocinas em linfócitosperiféricos traduz de forma muito idênticaa estimulação feita por um alergénioespecífico15,24,25. Além disso, alguns autoresdefendem que a estimulação policlonalpermitirá fazer o estudo de células anér-gicas- uma vez que estas deixam de res-ponder ao alergénio11.A interpretação dos resultados queobtivemos coloca-nos certas reservas, poralgum viés do desenho deste estudo.Assim, a decisão de iniciar a imunoterapia,o tipo de extracto utilizado e a cronologiada avaliação analítica foi exclusivamentedependente do critério clínico dos mé-dicos que acompanhavam estes doentes.A inexistência de um grupo com placebotambém limita a interpretação dos resulta-dos.A diminuição da expressão de citocinasT2 que verificámos nos nossos doentesatópicos após um ano de imunoterapiaanulou o aumento caracteristicamente

allergenic vaccines15,18,19,20. All these studieswere made on samples of peripheral bloodusing lymphocytes and mitogens as acti-vators and specific allergens15,18,19, withhouse dust mites vaccines, (extracts ofhouse dust mites absorbed to aluminiumhydroxide20, standardised extracts ofDermatophagoides farinae18) of pollens15, (birchextracts) synthetic peptides19 (of cat hair).They had a variable treatment time: oneyear20, 8 months18, 5 months15 and 6weeks19.IFN-γ expression did not vary signifi-cantly in T lymphocyte subpopulationsafter immunotherapy. Majori used a simi-lar methodology to that used in our eva-luate to study an atopic asthmatic groupundergoing allergenic immunotherapy.After one year he also found no signifi-cant differences in the expression of IFN-γ in CD4 and CD8 T lymphocytes20. Li-terature results are conflicting. In a studymade on lymphocytes cultures of periph-eral blood of patients with allergic rhini-

Fig. 6 – Expression of IL-10 in the peripheral T lymphocytes. Theimmunotherapy group had a higher expression of IL-10 in the CD3 Tlymphocytes, particularly in CD8+, when compared with controls.

Fig. 6 – Expressão de IL-10 nos linfócitos T periféricos. O grupocom imunoterapia teve uma expressão mais elevada de IL-10 noslinfócitos T CD3, particularmente à custa dos CD8+, comparativa-mente com os controlos.

Control Immunotherapy Median

Expression of IL-10



124



observado na doença atópica26,27, colo-cando o nível de expressão próximo doscontrolos não atópicos.São vários os estudos que invariavelmentetêm apontado para uma diminuição dosníveis de IL-4 e IL-5 após o tratamentocom vacinas de alergénios15,18,19,20. Todosestes estudos foram feitos em amostras desangue periférico sendo utilizados comoactivador linfocitário mitogénios20 e aler-génios específicos15,18,19, com vacinas deácaros, (extractos de ácaros adsorvidos emhidróxido de alumínio20, extractos estan-dardizados de Dermatophagoides farinae18) depólens5 (extractos de vidoeiro), péptidossintéticos19 (de pêlo de gato) e com tempovariável de tratamento: um ano20, 8 meses18,5 meses15 e 6 semanas19.Em relação ao IFN-γ, a sua expressão nãovariou significativamente nas subpopu-lações de linfócitos T após a imunoterapia.Majori, utilizando uma metodologia seme-lhante à nossa, estudou um grupo atópicoasmático a fazer imunoterapia alergénicae, ao fim de um ano, também não encon-trou diferenças significativas na expressãode IFN-γ, nos linfócitos T CD4 e CD820.No entanto, os dados da literatura sãomuito variáveis. Num estudo feito emculturas de linfócitos de sangue periféricode doentes com rinite alérgica, em pre-sença do alergénio específico (Dermato-phagoides farinae), os valores de IFN-γ forammais baixos após o tratamento com imu-noterapia18. Bellinghausen e colaboradores,usando técnicas diferentes (citometria defluxo, ELISA e PCR) para fazer o do-seamento do IFN-γ após a administraçãoda dose de manutenção da vacina aler-génica (veneno de abelha), constatou nosmesmos doentes um aumento da pro-

tis, in the presence of a specific allergen(Dermatophagoides farinae) the IFN-γ levelswere lower after immunotherapy treat-ment18. Bellinghausen et al used differenttechniques (flow cytometry, ELISA andPCR) for the IFN-γ measurement afteradministration of an allergenic vaccine(bee venom). This produced an increaseproduction of this cytokine by T CD8 Tlymphocytes in these patients24.This different results led us to study themodifications of the IFN-γ/IL-4 ratio astranslators of the dynamic T1/T2 balance,as other authors have suggested20,26. Thus,examining the IFN-γ/IL-4 ratio, we sawthat after one year of treatment with spe-cific immunotherapy, CD4 T cells in-creased to levels close to the control, sig-nificantly different from the atopicpopulation levels. These data showed analteration in the T1/T2 balance expressedby CD4 lymphocytes in favour of a ma-jor increase in the cytokine profile expres-sion in detriment of Th2. The expressionof IFN-γ/IL-4 ratio by CD8 T lym-phocytes, revealed great levels that favoura major expression of Tc1 cytokines butdid not differ significantly from the atopicgroup. However, and despite being levelsproduced after one year of treatment,these results could suggest a ‘normalisa-tion’ of T1/T2 cytokines balance.Equally, Majori studied cytokines produc-tion in CD4 and CD8 T lymphocytes ofperipheral blood at different time points(basal, 3 months after immunotherapy andat the end of one year) and the IFN-γ/IL-4ratio was always increased in CD4 Tlymphocytes. In CD8 T lymphocytes, asin our study, no significant differenceswere found20. Benjaponpitak recently



125


dução desta citocina associada aos linfó-citos T CD824.Esta variabilidade de resultados fez-nosestudar as modificações da razão IFN-γ//IL-4 como tradutoras da dinâmica doequilíbrio T1/T2, tal como foi sugeridopor outros autores20,26. Assim, quandoolhámos para a razão IFN-γ/IL-4, consta-támos que ao fim de um ano de tratamentocom imunoterapia específica o valor nascélulas T CD4 aumentou para níveispróximos do controlo, distanciando-sesignificativamente do valor da populaçãoatópica. Estes dados mostraram umaalteração do equilíbrio T1/T2 expressopelos linfócitos CD4 no sentido de umamaior expressão de citocinas de perfil Th1,em detrimento das Th2. A expressão darazão IFN-γ/IL-4 nos linfócitos T CD8,apesar de também ter revelado valoresaumentados no sentido de uma maiorexpressão de citocinas Tc1, não se distan-ciou de forma significativa do grupoatópico. No entanto, e apesar de seremvalores após um ano de tratamento, estesresultados poderão sugerir uma “normali-zação” do equilíbrio das citocinas T1/T2.Da mesma forma, Majori estudou aprodução de citocinas em linfócitos TCD4 e CD8 de sangue periférico em váriostempos (basal, 3 meses após imunoterapiae ao fim de um ano), e o valor da razãoIFN-γ/IL-4 foi sempre crescente noslinfócitos T CD4. Nos linfócitos T CD8,tal como no nosso estudo, não encontroudiferenças significativas20. Benjaponpitakinvestigou recentemente em seis doentesalérgicos a cinética da razão IFN-γ/IL-4em células T CD4 periféricas durante otratamento com diferentes vacinas dealergénios (extractos aquosos de ácaros

studied the kinetic of IFN-γ/IL-4 ratio inperipheral CD4 T lymphocytes in six al-lergic patients during treatment with dif-ferent allergen vaccines (aquose extractsof house mite dust – Dermatophagoides farinae/ pteronyssinus and aquose extracts of pol-len – Lolium perenne). He saw that in theinitial phase and during the period of in-creasing allergen dose (6-10 months) therewas a decrease in the value of the IFN-γ/IL-4 ratio levels. This increased after amaintenance dose (10-53 months), with asignificant increase when compared withthe basal level, as our results showed28. XiYang contested that the ratio was a goodparameter in evaluating the efficacy of im-munotherapy13.The mechanism by which immuno-therapy modifies the production ofcytokines is not known. It has been saidthat the allergen exposure methode in ad-dition to its properties may determine thecytokines T cells response. A greater con-centration of allergen may alter the inter-action between antigen presentation andT cells12. In immunotherapy, allergendoses are high and administered subcuta-neously, making monocytes antigens pre-senting cells stand out over dendriticcells24. The change of cytokines T2 pro-file to T1 has been underlined, as has theinducing of the tolerance by specific al-lergen cells. Recent studies have demon-strated the presence of regulator IL-10 pro-ducers cells in peripheral blood ofindividuals who have acquired toleranceto a particular allergen11. Akdis investi-gated the response of T cells after immu-notherapy to bee venom and stated thatthere was an increase in CD4 T cells ex-pressing six times more IL-10 after 28 days



126



Dermatophagoides farinae/pteronyssinus eextractos aquosos de poléns Lolium perenne)e verificou que na fase inicial e durante operíodo de dose crescente do alergénio (6--10 meses) houve uma diminuição do valorda razão IFN-γ/IL-4, tornando-se cres-cente após a dose de manutenção (10-53meses), com um aumento significativoquando comparado com o valor basal, talcomo os nossos resultados28. Xi Yangaponta a razão como um bom parâmetrona avaliação da eficácia da imunoterapia13.O mecanismo pelo qual a imunoterapiamodifica a produção de citocinas é desco-nhecido. Foi referido que a via de expo-sição ao alergénio, assim como as suaspropriedades, podem determinar a respostadas células T à produção de citocinas. Umamaior concentração de alergénio poderáalterar a natureza da interacção entre ascélulas apresentadoras de antigénio e ascélulas T12. No caso da imunoterapia, asdoses de alergénio são elevadas e adminis-tradas por via subcutânea fazem destacar omonócito como célula apresentadora deantigénio, ao invés das células dendríticas24.Aponta-se para uma modificação do perfilde citocinas T2 para T1, a par da induçãode tolerância nas células específicas dealergénio. Neste sentido, estudos recentestêm revelado a presença de célulasreguladoras produtoras de IL-10 no sangueperiférico, de indivíduos que adquiremtolerância a um alergénio particular11.Akdis investigou a resposta das células Tapós imunoterapia a veneno de abelha econstatou, após 28 dias de tratamento, umaumento de células T CD4 que expres-savam seis vezes mais IL-1029. Verificou, invitro, que a anergia das células T pelaimunoterapia específica era revertida pela

of treatment29. It has been seen in vitro thatanergy of the T cells to specific immuno-therapy was reversed by the addition ofanti IL-10 antibodies, suggesting that thepresence of these cells in peripheral bloodis connected to tolerance to the specificallergens. Another study characterisedthe immune deviation as a suppression ofTh1 (IFN-γ) and Th2 (IL-4 and IL-5)cytokines cells producers and an increasein IL-10 and TGF-β T cells producersnamely the regulator/suppressor T cells21.Recent evidence indicates that in vitro andin vivo regulator T cells suppress the effec-tor T cells simultaneously with the anti-gen presenting cells30. In our study, theexpression of IL-10 after one year of im-munotherapy treatment was significantlyhigher than in the CD3 T lymphocytesas compared to the non-atopic group. Thisdifference was attributed to CD8 Tlymphocytes (Fig. 6). Curiously, the IL-10 expressed in the CD3 T lymphocytesshowed a positive correlation with theexpression of all the profile T2 cytokinesin the CD3+, and the correlation waseven tighter in the CD8 T lymphocytesubpopulation. From this data it emergedthat at the end of one year of immuno-therapy, the IL-10 producer cells may beassociated with regulator profile Tc2 phe-notype. Tanchot et al studied the induc-tion of tolerant cells to high concentra-tions of specific antigens (in an animalmodel and using clones of CD8 T cells)and showed the appearance of a great pro-duction of IL-10, specifically associatedwith cells that became tolerant31. Inanother more recent study it was shownthat IL-10 produced by CD8 T cells repre-sented the inhibitory soluble factor, ca-



127


adição de anticorpos anti IL-10 sugerindoque a presença destas células no sangueperiférico estaria relacionada com atolerância aos alergénios específicos. Outroestudo caracteriza o desvio imune como asupressão da proliferação das células Tprodutoras de citocinas Th1 (IFN-γ) e Th2(IL-4 e IL-5) e aumento das células Tprodutoras de IL-10 e TGF-β, designadascélulas T reguladoras/supressoras21.Evidências recentes indicam que in vitro e invivo as células T reguladoras suprimem ascélulas T efectoras em conjugação simul-tânea com as células apresentadoras deantigénio30. No nosso estudo, a expressãode IL-10 ao fim de um ano de tratamentocom imunoterapia foi significativamentesuperior nos linfócitos T CD3, comparati-vamente com o grupo não atópico, sendoesta diferença atribuída aos linfócitos TCD8 (Fig. 6). Curiosamente, a IL-10expressa nos linfócitos T CD3 correlacio-nou-se positivamente e de forma significa-tiva com a expressão de todas as citocinasde perfil T2 nas CD3+, melhorando estacorrelação na subpopulação de linfócitosT CD8. Estes dados sugerem que ao fim deum ano de imunoterapia as células pro-dutoras de IL-10 poderão estar associadas aum fenótipo regulador de perfil Tc2.Tanchot e colaboradores estudaram a in-dução de células tolerantes a elevadasconcentrações de antigénios específicos(num modelo animal e a partir de clonesde células T CD8) e evidenciaram o apare-cimento uma grande produção de IL-10,especificamente associado às células que setornaram tolerantes31. Num outro estudomais recente, foi demonstrado que a IL-10produzida pelas células T CD8 represen-tava o factor inibitório solúvel capaz de

pable of changing the proliferative andcytolic capacity of these cells, transform-ing them into regulator or immunosup-pressor cells. In the study there was inaddition a functional similarity of the IL-10 CD8 T cells producers to CD4 T cells,also producers of IL-1032.On the other hand, there is evidence thatin vivo immunotherapy not only decreasesthe reactivity to the allergen itself but alsoprevens ‘new sensitivities’ to other aller-gens not included in the vaccine33. Thisdata suggests that immunotherapy inducesregulatory mechanisms not limited to theallergen involved. This could in part de-pend on IL-10. This cytokine has immu-noregulatory characteristics and is knownto be able to suppress the response pre-senting T cells antigens through inhibi-ting the co-stimulatory signals34 and sup-pressing the proliferation of T cells byinhibiting the production of IL-2 and theexpression of its receptor35.In conclusion, one year of immuno-therapy with allergens induced significantmodifications in the cytokines profile ofperipheral T lymphocytes of atopic pa-tients. These changes are characterised bya decrease in IL-4 and IL-5 expression anda greater relative proportion of T1 cyto-kines profile (an increase in the IFN-γ/IL-4 ration). We also saw an increase inIL-10 regulator cytokine expression,which is associated with a Tc2 phenotype.Further studies should be carried out tobetter define these regulatory mechanismsin allergen immunotherapy in well se-lected patient groups.



128



alterar a capacidade proliferativa e citolíticadestas células, transformando-as em célulasreguladoras ou imunossupressoras. Esteestudo sugere ainda uma semelhançafuncional das células T CD8 produtoras deIL-10 com as células T CD4, tambémprodutoras de IL-1032.Por outro lado, há evidência de que aimunoterapia in vivo não só diminui areactividade ao próprio alergénio, comoprevine “novas sensibilizações” a outrosalergénios não incluídos na vacina33. Estesdados sugerem que a imunoterapia induzmecanismos reguladores que não estãoapenas limitados ao alergénio envolvido,o que poderá em parte depender da IL-10.Esta citocina com características imunor-reguladoras sabe-se que tem a capacidadede suprimir a resposta das células T àscélulas apresentadoras de antigéniosatravés da inibição dos sinais co-estimu-latórios34 e da supressão da proliferaçãodas células T por inibição da produção deIL-2 e da expressão do seu receptor35.Em conclusão, a imunoterapia com aler-génios induziu ao fim de um ano modifi-cações significativas no perfil de citocinasdos linfócitos T periféricos de doentesatópicos. Estas alterações caracterizaram--se por uma diminuição da expressão deIL-4 e IL-5 e uma maior proporção relativade citocinas de perfil T1 (aumento do rácioIFN-γ/IL-4). Simultaneamente, eviden-ciámos um aumento da expressão da cito-cina reguladora IL-10, que verificámosassociar-se a um fenótipo Tc2. Novosestudos deverão ser perspectivados nosentido de melhor caracterizar estesmecanismos reguladores na imunoterapiacom alergénios em grupos de doentescriteriosamente seleccionados.

Bibliografia/Bibliografia/Bibliografia/Bibliografia/Bibliografia/BibliographyBibliographyBibliographyBibliographyBibliography1. Lemanske R, Busse W. Asthma. J Allergy ClinImmunol 2003; 111: 5502-19.2. Becky-kelly E, Busse W, Jarjour N. A comparisonof the airway response to segmental antigenbronchoprovocation in atopic asthma and allergicrhinitis. J Allergy Clin Immunol 2003; 111: 79-86.3. Shi HZ, Deng JM, Xu H et al. Effect of inhaledinterleukin-4 on airway hyperreactivity in asthma-tics. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157: 1818-1821.4. Menzies-Gow A, Flood-Page P, Schmi K et al. AntiIL-5 (mepolizumab) therapy induces bone marroweosinophil maturational arrest and decreases eosinophilprogenitors in the bronchial mucosa of atopic asth-matics. J Allergy Clin Immunol 2003; 111: 714-9.5. Krug N, Madden J, Redington A E et al. T – cellcytokine profile evaluated at the single cell level inBAL and blood in allergic asthma. Am J Respir CellMol Biol 1996;14:319-326.6. Albas AK, Murphy KM, Sher A. Functional di-versity of helper T lymphocytes. Nature 1996; 383(6603): 787-93.7. Maggi EP, Parronchi P, Manetti R, Simonelli C,Piaccini M, Rugin FS, De Carli M, Rcci M, Ro-magnani S. Reciprocal regulatory effects of IFN-γ andIL-4 on the in vitro development of human Th1 andTh2 clones. J Immunol 1992; 148: 2142-2148.8. Freeman J. Further observation on the treatmentof hay fever by hypodermic inoculations of pollenvaccine. Lancet 1911; 2: 814.9. Neerven RJJ, Wikborg T, Lund G, Jacobsen B,Brinch – Nielsen A, Arnved J, Ipsen H. Blocking an-tibodies induced by specific allergy vaccination pre-vent the activation of CD4+ T cells by inhibitingserum IgE facilitated allergen presentation. J Immunol1999; 163: 2944-2952.10. Akdis C, Blaser K. IL-10 induced anergy in pe-ripheral T cell and reactivation by microenvi-ronmental cytokines: two key steps in specific im-munotherapy. FASEB J 1999; 13:603-609.11. Levings M, Roncarolo MG. T- regulatory 1 cells:A novel subset of CD4+ T cells with immunore-gulatory properties. J Allergy Clin Immunol 2000;106: 5109-12.12. Akdis CA, Blaser K. Mechanisms of allergen-spe-cific immunotherapy. Allergy 2000; 55: 522-530.13. Yang X. Does allergen immunotherapy alter the



129


measurement of intracellular cytokines. J ImmunolMethods 2000; 243:107-124.24. Bellinhausen J, Metz G, Enk A, Christmann S,Krop J, Salog J. Insect venom immunotherapy inducesinterleukin – 10 production and Th2 to Th1 shift andchanges surface marker expression in venom – allergicsubjects. Eur J Immunol 1997; 27: 1131-1139.25. O’Brien RM, Xu H, Rolland JM, Byron KA, Tho-mas WR. Allergen-specific production of interfe-ron-γ by peripheral blood mononuclear cells andCD8+ T cells in allergic disease and following im-munotherapy. Clin Exp Allergy 2000; 30: 333-340.26. Rebordão MM, Silva M, Remédios A, Alvares E,Pinto H, Alfarroba E. Estudo de citocinas deLinfócitos T e de Imunoglobulinas E e G em doentesatópicos candidatos a imunoterapia. Rev PortImunoalergologia 2003; XI (4):370-379.27. Rebordão MM, Delgado L, Pinto HP, RemédiosA, Taborda-Barata L. Citocinas T1 e T2 na doençaatópica: avaliação do contributo relativo de diferentessubpopulações celulares T periféricas. Rev PortImunoalergologia 2005 (a aguardar publicação).28. Benjaponpitak S, Oro A, Maguire P et al. The ki-netics of change in cytokine production by CD4 Tcells during conventional allergen immunotherapy.J Allergy Clin Immunol 1999; 103(3Pt 1):468-75.29. Akdis CA, Blesken T, Akdis M, Wuthrich B,Blaser K. Role of interleukin 10 in specific immuno-therapy. J Clin Invest 1998; 102:98-106.30. Leon K, Peréz R, Lage A, Carneiro J. ModellingT-cell-mediated suppression dependent on interac-tions in multicellular conjugates. J Theor Biol 2000;207:231-254.31. Tanchot C, Guillaume S, Delon J, Bourgeois C,Franzke A, Sarukhan A, Trautmann A, Rocha B.Modifications of CD8+ T cell function during invivo memory or tolerance induction. Immunity 1998;8:581-59032. Gilliet M, Liu YJ.Generation of human CD8 Tregulatory cells by CD40 ligand-activated plasmacy-toid dendritic cells.J Exp Med 2002; 195(6):695-704.33. Roches A, Paradis L, Menardo JL et al. Immuno-therapy with a standardized Dermatophagoidespteronyssinus extract:VI. Specific immunotherapyprevents the onset of new sensitizations in children.J Allergy Clin Immunol 1997; 99(4):450-3.34. Moore KW, Malefyt RW, Coffman RL, O’Garra

natural course of allergic disorders? Drugs 2001; 61(3):366-374.14. Durham S, Till S. Immunologic changes associatedwith allergen immunotherapy. J Allergy ClinImmunol 1998; 102:157-64.15. Gabrielsson S, Soderlund A, Paulie S, KraanTCM, Blomberg M, Rak S. Specific immunotherapyprevents increased levels of allergen specific IL-4 andIL-13 producing cells during pollen season. Allergy2001; 56: 293-300.16. Jutel M, Pickler WJ, Skrbic D, Urmyler A,Dahindeu C and Meller U. Bee venom immuno-therapy results in decrease of IL-4 and IL-5 and in-creased of IFN-g secretion in specific allergen–stimu-lated T cell cultures. The J of Immunol 1995; 154:4187-4194.17. Durham SR, Ying S, Varney VA et al. Grass pol-len immunotherapy inhibits allergen-induced infiltra-tion of CD4+ T lymphocytes and eosinophils in thenasal mucosa and increase the number of cells ex-pressing messenger RNA for IFN-γ. J Allergy ClinImmunol 1996; 97: 1356-65.18. Tanaka A, Ohashi Y, Kakinoki Y and Nakai.Immunotherapy suppresses both Th1 and Th2 re-sponses by allergen stimulation, but suppression ofthe Th2 response is a more important mechanismrelated to the clinical efficacy of immunotherapy forperennial allergic rhinitis. Scand J Immunol 1998; 48:201-211.19. Pene J, Desroches A, Paradis L et al. Immuno-therapy with Fel d1 peptides decreases IL-4 releaseby peripheral blood T cells of patients allergic to cats.J Allergy Clin Immunol 1998; 102: 571-8.20. Majori M, Caminati A, Corradi M, Briante E,Scarpa S, Pesci A. T–cell cytokine pattern at threetime points during specific immunotherapy for mite- sensitive asthma. Clin Exp Allergy 2000; 30:341-47.21. Jutel M, Akdis M, Budak F, Casaulta C, WrzyszczM, Bkaser K, Akdis C. IL-10 and TGF-β cooperatein the regulatory T cell response to mucosal aller-gens in normal immunity and specific immuno-therapy. Eur J Immunol 2003; 33: 1205-1214.22. Pieker LJ, Singh MK, Zdraveski Z et al. Directdemonstration of cytokine synthesis heterogeneityamong human memory effector T cells by flowcitometry.Blood.1995; 86:1408-1419.23. Pala P, Hussell T, Openshaw P. Flow cytometric



130



A. Interleukin-10 and the Interleukin-10 receptor.Annu Rev Immunol 2001; 19:683-765.35. Becker JC, Czerny C, Brocker EV. Maintenance

of clonal anergy by endogenously produced IL-10.International Immunol 1994; 6(10):1605-1612.

Prémio Thomé Villar/Boehringer Ingelheim 2004 em doentes ... · 108 Repercussão da imunoterapia...

Documents

Transcript of Prémio Thomé Villar/Boehringer Ingelheim 2004 em doentes ... · 108 Repercussão da imunoterapia...