PREVALÊNCIA DA INFEÇÃO POR LEISHMANIA · conta na avaliação clínica de um gato, e que é...
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PEDRO MIGUEL FAUSTINO PINTO PREVALÊNCIA DA INFEÇÃO POR LEISHMANIA SP. EM GATOS RESIDENTES NO CONCELHO DE CASCAIS Orientadora: Doutora Carla Maia Co-orientador: Dr. Filipe Martinho UNIVERSIDADE LUSÓFONA DE HUMANIDADES E TECNOLOGIAS FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA Lisboa 2013
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PEDRO MIGUEL FAUSTINO PINTO
PREVALÊNCIA DA INFEÇÃO POR LEISHMANIA
SP. EM GATOS RESIDENTES NO CONCELHO DE
CASCAIS
Orientadora: Doutora Carla Maia
Co-orientador: Dr. Filipe Martinho
UNIVERSIDADE LUSÓFONA DE HUMANIDADES E
TECNOLOGIAS
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
Lisboa
2013
1
PEDRO MIGUEL FAUSTINO PINTO
PREVALÊNCIA DA INFEÇÃO POR LEISHMANIA
SP. EM GATOS RESIDENTES NO CONCELHO DE
CASCAIS
UNIVERSIDADE LUSÓFONA DE HUMANIDADES E
TECNOLOGIAS
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
Lisboa
2013
DISSERTAÇÃO APRESENTADA PARA A
OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM
MEDICINA VETERINÁRIA NO CURSO DE
MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA
VETERINÁRIA CONFERIDO PELA
UNIVERSIDADE LUSÓFONA DE
HUMANIDADES E TECNOLOGIAS
ORIENTADORA: DOUTORA CARLA MAIA
CO-ORIENTADOR: DR. FILIPE MARTINHO
1
Epígrafe
Adoramos a Perfeição
porque não a podemos ter,
repugná-la-íamos se a tivéssemos.
O Perfeito é desumano porque o
Humano é Imperfeito.
Fernando Pessoa
2
Dedicatória
O produto final de 24 anos de
investimento é dedicado aos meus
mecenas Mãe e Pai.
3
Agradecimentos
Quero iniciar pelo Professor Filipe Martinho, o professor das disciplinas de
Parasitologia e Clinica das Doenças Parasitárias I e II, agora co-orientador e no futuro colega,
que apesar de eu não ter sido a excelência na área dos parasitas piolhos, pulgas, “mosquitos” e
afins quero agradecer-lhe por ter possibilitado conhecer a Professora Carla Maia com o
projeto que permitiu desenvolver a minha ideia de tese de mestrado. De seguida vem a
Professora Doutora Carla Maia, que aceitou a minha participação num dos seus projetos,
proporcionando que conhecesse a parte laboratorial que um veterinário pode fazer e também
desenvolver a tese de mestrado. Quero agradecer-lhe pela paciência, tempo e horas de sono
que dispensou para que desenvolvesse o meu projeto, pois sei que não tenho um feitio fácil,
muito menos quando as coisas não correm bem. Apesar da minha impaciência e dos percalços
que o estudo teve, um grande obrigado pela possibilidade que me deu e espero no futuro ouvir
muitas vezes a sua voz dizer “Olá Pedro é a Carla Maia, olha não me arranjas amostras de
gatos ou cães, assim uns parasitas para a minha coleção, achas que consegues?”.
Agora devo agradecer ao grupo das leishmanias do IHMT chefiado pela Professora
Doutora Lenea Campino à qual devo agradecer a autorização para o meu estágio voluntário.
Um agradecimento à Sofia Cortes, Andreia Albuquerque e ao José Cristovão pela ajuda diária
que me deram, quando as malditas PCR’s não funcionavam e nas serologias, que me punham
de “olhos em bico”. E também aos intervalos onde se contavam histórias hilariantes e dos
projetos desenvolvidos. Agradeço à Professora Doutora Maria Odete Afonso pela
disponibilidade na identificação entomológica dos insetos capturados. Agradeço a
participação no projeto "The role of domestic cats in the epidemiology of zoonotic
leishmaniasis" financiado pelo Centro de Malária e outras Doenças Tropicais. Agradeço
igualmente ao Dr. Clément Bordier por ter fornecido os kit’s comerciais de ELISA e pelos
soros de gatos de região não endémica para uma boa obtenção de cut-off. Agradeço ao
Professor Mauro Bragança pela ajuda prestada na utilização do SPSS para a análise estatística
e interpretação dos dados obtidos.
Tenho um agradecimento especial para a Presidente do Grupo de Socorro Animal de
Portugal – SOSAnimal, Sandra Cardoso. Para além de uma grande colaboradora, também
uma grande amiga, permitiu que fizesse da clínica de Caparide a minha “base” de colheitas de
sangue para o estudo de leishmaniose felina. Um grande obrigado pela ajuda e mais-valia para
este estudo, crescimento pessoal e profissional e por mostrar como a interação homem-animal
pode ser diferente e como este dueto é importante quer a nível pessoal quer social.
4
À equipa do Hospital do Gato um grande obrigado por tudo o que me ensinaram e
pelo que vos pude também ajudar no âmbito dessa grande espécie o GATO. Ainda tenho um
agradecimento especial à Dr.ª Maria João por me ter aceitado como seu estagiário de forma
célere num momento tão delicado. À “Ana” Rita Delgado um obrigado pelas aulas de
ecografia e por me ter deixado usar o teu ecógrafo para treinar nos gatinhos internados e a
salvar/manter algumas vidas. Às “malucas” Joana Valente, valente de nome e de trabalho, a
verdadeira mulher do norte e à Sofia Bagarrão ou Bagarão ou Bagulho consoante o cliente,
um obrigado pelas noites trabalhosas mas hilariantes, pelas vidas que perpetuámos, pelos
moribundos que aliviámos e pelos prolongamentos da vida que conseguimos. À Filipa Santos
não me posso esquecer da “aceleração física” de decibéis que ouvi durante todo o meu
estágio. Não esquecendo a verdadeira mulher de valores Margarida Figueiredo, muitas horas
naquela receção a tentar perceber as contas das “burras” que se enganavam com tudo no Qvet.
Aos meus pais já agradeci dedicando-lhes este trabalho. Aos meus avós um
agradecimento do coração pois se sou uma pessoa que defende os valores antes do proveito
próprio a vocês o devo. Um grande obrigado aos meus “bebés” de quatro patas (Sininho e
Tunga), principalmente à Sininho que tem servido de cobaia há 8 anos.
Quero agradecer a alguém muito especial que só agora descobri e puxou e puxa
todos os dias a uma pessoa de grande coração, agradeço à minha namorada Joana Gomes
pelas horas que me aturou até aqui. Foste o ombro em que me apoiei nos momentos baixos
deste trabalho e que quis nos momentos altos. Um obrigado pelo amor que foi, que é e espero
que seja dedicado no futuro.
Aos amigos que estiveram presentes sempre, um grande obrigado ao Pedro
Rodrigues, à Cátia Neto e Ana Zorro, os quais formávamos o famoso quarteto do secundário.
Tal como me desejaram, e desejam, desejo-vos o maior sucesso possível em todos os
momentos da vossa vida pessoal e profissional, mesmo que não esteja presente para vos
felicitar.
Por fim também tenho de dar um agradecimento à Maria Catarina Fernandes que
aceitou participar comigo nesta aventura, “tramada por sinal”, tu com os cães, eu com os
gatos e os dois com os flebótomos que durante 6 meses, loucos na estrada dos “walking
dead”, fugiam de nós como “o diabo da cruz”, obrigado pela ajuda e companheirismo.
A todos os que não mencionei que passaram, estão ou virão a estar na minha vida um
obrigado e que sejam bem-sucedidos na vida profissional e mais do que tudo na vida pessoal.
5
Com o apoio e financiamento de:
6
Resumo
A leishmaniose, causada pelo protozoário Leishmania infantum é uma doença
parasitária transmitida por vetores flebotomíneos. Apesar de ser uma infeção que,
tipicamente, afeta canídeos domésticos e silváticos, há cada vez mais relatos de casos clínicos
e deteção, quer de anticorpos anti-Leishmania quer de material genético de Leishmania sp. em
gatos (Felis catus domesticus). Apesar de nos cães esta parasitose ser muito conhecida é, na
maioria das vezes, subestimada nos felídeos domésticos por desconhecimento quer de clínicos
quer dos proprietários.
O objetivo principal deste estudo foi determinar a prevalência de infeção por
Leishmania sp. na população de gatos no concelho de Cascais. Para isso, foi estudada uma
amostra de 204 gatos (domésticos e errantes), com mais de seis meses de idade.
A prevalência de infeção por Leishmania sp. obtida neste estudo foi de 9,8%
(20/204). Tendo em conta os valores obtidos, verifica-se que é necessário alertar a
comunidade veterinária de que a leishmaniose felina é um diagnóstico diferencial a ter em
conta na avaliação clínica de um gato, e que é essencial a aplicação de medidas profiláticas
para salvaguardar a saúde animal e a saúde pública.
Palavras-chave: Leishmania infantum, gatos, prevalência, Cascais.
7
Abstract
Leishmaniasis caused by a protozoan, Leishmania infantum is a parasitic disease
transmitted by Phlebotomine sand flies. Despite being a disease that typically affects domestic
and wild canids, there are increasing reports of clinical cases and detection of either anti-
Leishmania antibodies or genetic material of Leishmania sp. in cats (Felis catus domesticus).
Although this parasite is really known in dogs, is often underestimated in domestic felines by
either veterinarians or by the owners.
The main objective of this study was to determine Leishmania sp. prevalence in cats
from Cascais county. For this purpose 204 (domestic and stray) cats older than six months
were studied.
The prevalence of Leishmania sp. infection in cats obtained in this study was 9,8%
(20/204). Data obtained stress the need to alert the veterinary community to add leishmaniosis
to the differential diagnosis of feline infections, and that it is essential to apply preventive
measures to safeguard animal and public Health.
Palavras-chave: Leishmania infantum, cats, prevalence, Cascais.
8
Lista de abreviaturas
ADN – Ácido desoxirribonucleico
ATP – Adenosina trifosfato
BetFel – β-actina felina
BID – Duas vezes por dia (do latim “Bis In
Die”)
CAMV – Centro de Atendimento Médico
Veterinário
CFSPH – Center for Food Security and
Public Health
CMC - Câmara Municipal de Cascais
D – Doméstico
DAT – Técnica de aglutinação directa
d.C. – Depois de Cristo
E – Errante
ELISA – Ensaio imunoenzimático (do
inglês enzyme-linked imunossorbent
assay)
FeLV – Vírus da Leucemia Felina
FIV – Vírus da Imunodeficiência Felina
g – grama
g – Unidade de força G
H – hora
IFI – Imunofluorescência indireta
IFN-γ –Interferão gama
IgG – Imunoglobulinas G
IHMT – Instituto de Higiene e Medicina
Tropical
IL-2 – Interleucina 2
kDNA – ADN cinetoplastideal
Kg – Quilograma
Km – Quilometro
Km – Quilómetro
L. infantum – Leishmania infantum
LCan – Leishmaniose canina
LFel – Leishmaniose felina
m – Minutos
mA – Miliampere
mg – Miligrama
Mg2+
- Magnésio
MgCl2 – Cloreto de magnésio
MHC – Complexo Major de
Histocompatibilidade
mL – Mililitro
mm – Milímetro
mM – Milimolar
Nm – Nanómetro
N-PCR – nested-PCR
OIE – Organização Mundial para a Saúde
Animal
OMS – Organização Mundial de Saúde
OPD – Substância Quimica (C6H4(NH2)2)
pb – Pares de base
PCR – Reacção em cadeia da polimerase
(do inglês Polymerase Chain Reaction)
pmol – Picomole
PO – via oral (do latim “per os”)
qPCR – PCR em tempo real (do inglês
“real-time PCR”)
ARN – Ácido ribonucleico
rz – Razão
s – Segundo
SC – Subcutâneo
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SID – Uma vez ao dia (do inglês “Solo In
Day”)
TNF α – Factor de necrose tumoral alfa
UI – Unidades internacionais
X – unidade de número de diluições
µg – Micrograma
μl – Microlitro
μm – Micrómetro
Lista de símbolos
β - Beta
α - Alfa
γ – Gamma
2 – Unidade ao quadrado
ºC - Graus Celsius
% - Percentagem
® – Marca Registada
10
Índice geral
Epígrafe ...................................................................................................................................... 1
Dedicatória.................................................................................................................................. 2
Abstract ....................................................................................................................................... 7
Lista de abreviaturas ................................................................................................................... 8
Lista de símbolos ........................................................................................................................ 9
Índice geral ............................................................................................................................... 10
Índice de figuras ....................................................................................................................... 13
I. Introdução.......................................................................................................................... 14
1. Dados Históricos ............................................................................................................... 16
2. Leishmaniose ..................................................................................................................... 17
3. Etiopatogenia ..................................................................................................................... 17
3.1. Leishmania sp. ............................................................................................................... 17
3.2. Morfologia do parasita ................................................................................................... 18
4. Hospedeiros ....................................................................................................................... 19
4.1. Hospedeiro vertebrado ................................................................................................... 19
4.2. Hospedeiro invertebrado ................................................................................................ 20
5. Ciclo de vida...................................................................................................................... 20
5.1. Desenvolvimento do parasita no hospedeiro vertebrado ............................................... 21
5.2. Desenvolvimento do parasita no hospedeiro invertebrado ............................................ 22
6. Formas de transmissão sem vetor flebotomíneo ............................................................... 23
7. Resposta imune ................................................................................................................. 24
8. Epidemiologia ................................................................................................................... 25
8.1. Leishmaniose no Mundo ................................................................................................ 25
8.2. Leishmaniose em Portugal ............................................................................................. 26
9. Leishmaniose felina........................................................................................................... 28
9.1. Prevalência e incidência clínica de leishmaniose felina ................................................ 28
9.2. Sinais clínicos de leishmaniose felina............................................................................ 29
9.2.1. Lesões cutâneas .................................................................................................. 29
9.2.2. Sinais oculares .................................................................................................... 30
9.2.3. Alterações hematológicas e bioquímicas ............................................................ 31
10. Métodos de diagnóstico ................................................................................................. 31
10.1. Métodos parasitológicos .............................................................................................. 31
11
10.2. Técnicas moleculares ................................................................................................... 32
10.3. Técnicas serológicas .................................................................................................... 33
10.3.1. Técnica da imunofluorescência indireta (IFI) .................................................... 34
10.3.2. Ensaio imunoenzimático (ELISA)...................................................................... 34
10.3.3. Técnica de aglutinação direta (DAT) ................................................................. 34
10.4. Outras metodologias utilizadas no diagnóstico de leishmaniose ............................. 35
11. Tratamento ..................................................................................................................... 35
11.1. Antimoniato de N-metilglucamina .............................................................................. 35
11.2. Alopurinol .................................................................................................................... 36
11.3. Miltefosina ................................................................................................................... 36
12. Esquemas terapêuticos utilizados na leishmaniose felina ............................................. 36
13. Profilaxia ....................................................................................................................... 37
II. Rastreio de Leishmaniose felina no concelho de Cascais, distrito de Lisboa ............... 39
1. Objetivos ........................................................................................................................... 39
2. Materiais e métodos .......................................................................................................... 39
2.1. Caracterização da área geográfica ............................................................................. 39
2.2. População-alvo ........................................................................................................... 41
3. Colheita e processamento do sangue periférico e tecidos ................................................. 42
3.1. Extração de ADN de sangue periférico e tecidos ...................................................... 42
4. Técnicas Moleculares ........................................................................................................ 43
4.1. Reação de PCR - amplificação de β-Actina Felina .................................................... 43
4.2. Reação de PCR - amplificação de ADN cinetoplastideal (kADN) de Leishmania sp.
....................................................................................................................................44
4.3. Reação de Nested PCR - amplificação de ADN ribossomal de Leishmania sp. ........ 45
5. Técnicas serológicas .......................................................................................................... 46
5.1. Técnica de Aglutinação Direta (DAT) ....................................................................... 46
5.2. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ....................................................... 47
5.2.1. Kit Comercial Bordier ........................................................................................ 47
5.2.3. Kit Comercial LeisScan – LEISHMANIA ELISA TEST .................................. 48
5.4. ELISA in house .......................................................................................................... 49
5.5. Teste de Imunofluorescência indireta (IFI)................................................................ 51
12
6. Análise estatística .............................................................................................................. 53
7. Resultados ......................................................................................................................... 54
7.1. Caracterização da amostra ......................................................................................... 54
7.2. Rastreio de Leishmania sp. em Felis catus domesticus ............................................. 59
7.3. Determinação da prevalência de Leishmania sp. ....................................................... 60
7.4. Caraterização dos gatos infetados por Leishmania sp. .............................................. 61
7.5. Determinação da Sensibilidade, especificidade, Valor Preditivo Positivo (VPP) e
Valor Preditivo Negativo (VPN) das técnicas serológicas utilizadas. .................................. 62
8. Discussão ........................................................................................................................... 63
8.1. Limitações do estudo ................................................................................................. 68
9. Conclusão .......................................................................................................................... 69
10. Bibliografia .................................................................................................................... 70
Apêndice I – Termo de responsabilidade e certificado de autorização. ......................................I
Apêndice II – Panfleto informativo entregue a cada proprietário participante. ........................ II
Apêndice III – Inquérito realizado aos proprietários dos animais testados para a infeção por
Leishmania sp. .......................................................................................................................... IV
Apêndice IV – Tabela de resultados das técnicas serológicas e moleculares aplicadas aos 204
felinos testados. ......................................................................................................................... V
Apêndice V – Captura de Flebótomos no concelho de Cascais. .............................................. XI
Apêndice VI – Biótopos do concelho de Cascais onde se colocaram as armadilhas luminosas
CDC. ....................................................................................................................................... XII
Anexo I – Protocolo de extração de ADN a partir de papel de filtro impregnado com sangue
periférico ................................................................................................................................ XIII
Anexo II – Protocolo de Purificação de ADN a partir de tecidos ......................................... XIV
Anexo III – Protocolo de controlo de extração por amplificação de β-actina Felina ............. XV
Anexo IV – Protocolo de preparação de gel de agarose e eletroforese dos produtos de PCR.
............................................................................................................................................... XVI
Anexo V – Protocolo de amplificação de ADN cinetoplastideal (kDNA) de Leishmania sp.
por PCR ............................................................................................................................... XVII
Anexo VI – Protocolo de amplificação de ADN nuclear e ribossomal de Leishmania sp. por
nested-PCR ......................................................................................................................... XVIII
Anexo VII – Técnica de Aglutinação Direta (DAT) .............................................................. XX
Anexo VIII – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit Bordier Affinity Products
............................................................................................................................................... XXI
Anexo IX – In house Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ............................................ XXII
13
Anexo X – LeisScan – LEISHMANIA ELISA TEST ....................................................... XXIII
Anexo XI – Teste Imunofluorescência indireta (IFI) ......................................................... XXIV
Índice de figuras
Figura 1: Morfologia dos parasitas do género Leishmania.......................................................18
Figura 2: Ciclo de vida do parasita...........................................................................................21
Figura 3: Esquema representativo da localização intravetorial do parasita no aparelho
digestivo do flebótomo ............................................................................................................. 23
Figura 4: Mapa ilustrativo da distribuição de leishmaniose no mundo .................................... 25
Figura 5: Mapa de prevalência de leishmaniose canina em Portugal de 1981 a 2005..............27
Figura 6: Fotografias ilustrativas dos tipos de lesões cutâneas que se observam em gatos com
leishmaniose ............................................................................................................................. 30
Figura 7: Fotografia representativa de lesão ocular (uveíte) associado a infeção por
Leishmania sp. .......................................................................................................................... 30
Figura 8: Mapa representativo das freguesias do concelho de Cascais .................................... 40
Figura 9: Ilustração representativa da Técnica de aglutinação direta ....................................... 47
Figura 10: Imagem representativa do kit de ELISA Bordier Affinity Products ....................... 48
Figura 11: Imagem representativa do kit de LeisScan Leishmania ELISA test ....................... 49
Figura 12: Imagem representativa da técnica ELISA in house.................................................51
Figura 13: Imagens ilustrativas da técnica de IFI ..................................................................... 52
Figura 14: Distribuição da amostra entre gatos domésticos e errantes ..................................... 54
Figura 15: Distribuição da amostra por freguesia ..................................................................... 54
Figura 16: Distribuição da amostra entre machos e fêmeas ..................................................... 55
Figura 17: Distribuição da amostra entre animais inteiros ou esterilizados ............................. 55
Figura 18: Distribuição da amostra por faixa etária ................................................................. 55
Figura 19: Distribuição da amostra entre as raças referidas no inquérito ................................ 56
Figura 20: Distribuição da amostra de acordo com o tamanho da pelagem. ............................ 56
14
Figura 21: Distribuição da amostra de acordo com o estilo de vida...........…………………..56
Figura 22: Prevalência de retroviroses (FIV e FelV) na amostra.....…………………..……..57
Figura 23: Fotografia de lesões cutâneas de um gato doméstico fêmea (D29)........................58
Figura 24: Imagem representativa de amplificação de β-actina felina.....................................60
Figura 25: Imagem representativa da deteção de material genético por eletroforese após
técnica de nested-PCR..............................................................................................................60
Figura 26: Fotografias dos locais de colocação de armadilhas luminosas de captura de
flebótomos tipo CDC...............................................................................................................XII
Figura 27: Mapa ilustrativo da distribuição dos locais de colocação de armadilhas luminosas
do tipo CDC.............................................................................................................................XII
Índice de tabelas
Tabela 1: Classificação taxonómica do género Leishmania…...……….....……….……....…17
Tabela 2: Prevalências nacionais da infeção por Leishmania sp. em gatos..............................28
Tabela 3: Esquematização de sinais clínicos apresentados pelos gatos da amostra estudada
...............................................…………………………………………………………..….…58
Tabela 4: Sensibilidades, Especificidades e Valores preditivos negativos e positivos das
técnicas serológicas utilizadas...............................................................................................62
I. Introdução
15
Nas últimas décadas os animais de companhia têm beneficiado das alterações
socioeconómicas e da alteração de mentalidade dos humanos em relação ao facto de trazer
para sua casa cães ou gatos. Com esse aumento potenciaram-se, também, os cuidados médico-
veterinários tornando estes animais membros da família com uma longevidade que
dificilmente alcançariam. Todavia, o abandono animal continua a existir e a alimentar
populações de animais errantes que, ao não auferirem nenhum cuidado médico-veterinário,
podem tornar-se reservatórios e disseminadores de algumas patologias (Taylor et al., 2001;
Otranto & Dantas-Torres, 2010). A leishmaniose zoonótica é uma doença causada pelo
parasita Leishmania infantum e transmitida por insetos vetores flebotomíneos, que tem como
principal hospedeiro definitivo e reservatório o cão. No entanto, na última década têm vindo a
ser reportados com maior frequência casos clínicos de leishmanisose felina e um aumento de
prevalência de infeção no gato doméstico (Felis catus domesticus) em países endémicos. A
deteção destes parasitas no gato doméstico estimulou a realização de novas pesquisas para
averiguar qual o seu papel na epidemiologia desta zoonose (Maia & Campino, 2012a, 2012b).
Como tal, o tema escolhido para esta dissertação foi dirigido à população felina do concelho
de Cascais, uma zona considerada endémica de leishmaniose canina.
16
1. Dados Históricos
Na antiguidade já existiam relatos e documentos que descreviam situações
compatíveis com leishmaniose cutânea em humanos, remontando estes relatos ao séc. I d.C.,
na Ásia Central. As alterações observadas nos doentes recebiam designações consoante a
região de onde estes provinham tais como: doença de ferida de “Balkh” aos doentes de uma
cidade no norte do Afeganistão; “botão de Aleppo”, na Síria e, “botão de Bagdad”, no Iraque,
o que mais tarde passou a ser conhecida pelos viajantes como “botão-do-Oriente”. Na
América do Sul, a documentação mais antiga data da época pré-colombiana (400 a 900 d.C.)
em obras arqueológicas de cerâmica equatoriana e peruana exibindo faces humanas com
deformidades nas narinas e lábios, semelhantes às lesões provocadas pela forma mucocutânea
da parasitose. As primeiras descrições clínicas remontam ao século XVI, fazendo alusão a
uma doença que destruía o nariz e cavidade oral dos índios da Cordilheira dos Andes. Em
1764 Bueno publicou observações mostrando que no Peru a leishmaniose cutânea era
transmitida pela picada de insetos flebotomíneos. Em 1885 Cunningham, na Índia, fez a
primeira observação dos parasitas em casos de “Kala-azar” humano. Na América Latina, há
suspeitas da ocorrência de leishmaniose cutânea já no início do século XIX, na região
amazónica. (revisto por Simões-Mattos, 2005).
Em 1900, William Leishman descobriu num macerado de baço de um soldado que
morrera com “Kala-azar” organismos que classificou como Leishmania. Cerca de três anos
depois, Donovan também encontrou os mesmos organismos numa punção de baço. Em 1903,
Ross criou o género Leishmania e no mesmo ano Wright descobriu o agente etiológico do
botão-do-Oriente, incluindo-o no mesmo género e classificando-o como Leishmania tropica.
Em 1904 Rogers demostrou as formas flageladas deste agente em culturas laboratoriais mas
só em 1941 Adler e Ber demonstraram a relação das formas promastigostas do agente e a sua
transmissão por vetores flebotomineos e desenvolvimento da doença nos hospedeiros
definitivos (Bowman et al., 2002; Simões-Mattos, 2005; Faria, 2008). Em 1908 Comte
encontrou o protozoário em cães domésticos na Tunísia e, sucessivamente em várias regiões
do Mundo outros investigadores verificaram que os Mamíferos eram um grupo de animais
frequentemente afetados pelo agente, como é o caso dos canídeos. Com o tempo verificou-se
que, em regiões endémicas, outras espécies como o gato doméstico eram também afetadas
(Bowman et al., 2002; Simões-Mattos, 2005; Faria, 2008).
17
Tabela 1: Classificação taxonómica do género Leishmania, adaptado de Faria, (2008)
2. Leishmaniose
As leishmanioses são doenças causadas por um protozoário intracelular pertencente
ao género Leishmania. Estes parasitas são transmitidos pela picada de insetos flebotomíneos,
a várias espécies de animais, incluindo seres humanos, em regiões tropicais, subtropicais e
temperadas dos quatro continentes, à exceção da Oceânia (Organização Mundial de Saúde
(OMS), 2010). No caso da doença em humanos, o tropismo do parasita e quadro clínico são
divididos em três grupos: os que causam leishmaniose visceral (LV), responsáveis pelo
aparecimento de sintomatologia sistémica podendo em casos graves levar à morte do
hospedeiro, os que causam leishmaniose cutânea (LC) menos grave e de mais fácil tratamento
e os que causam leishmaniose mucocutânea (MC) levando à formação de lesões na mucosas
(OMS, 2010; 2012).
3. Etiopatogenia
3.1. Leishmania sp.
Todas as espécies do género Leishmania pertencem à ordem Kinetoplastida e à
família Trypanossomatidae (Tabela 1)
As espécies mais frequentemente implicada nos casos de LV são Leishmania
donovani ou L. infantum. As leishmanioses cutâneas do Velho Mundo são causadas por L.
tropica ou L. major, enquanto no Novo Mundo são causadas por exemplo por L. braziliensis,
já a mucocutânea é causada por L. braziliensis ou L. panamensis (OMS, 2010).
Reino Protista
Filo Sarcomastigophora
Classe Zoomastigophora
Ordem Kinetoplastida
Família Trypanosomatidae
Género Leishmania
18
Figura 1: As diferentes formas do parasita. 1 - Forma promastigota (adaptado de
http://www.leishrisk.net/Default.aspx?Menu=MenuMain&MIID=34&WPID=40&L =E); 2 -
Forma amastigota, intra-macrofágica, assinalado por setas (adaptado de
http://patclinveterinaria.blogspot.pt/ 2011_07_01_archive. html).
3.2. Morfologia do parasita
Como todos os membros da ordem Kinetoplastida, Leishmania apresenta um
cinetoplasto, um núcleo e um único flagelo. Todas as espécies de Leishmania têm duas
formas no seu ciclo de vida: uma forma promastigota, no hospedeiro invertebrado, e uma
forma amastigota, no hospedeiro vertebrado. As formas promastigotas são formas móveis,
com 10-20 micrómetros (µm) de comprimento e 1,5-3,0 µm de largura, possuem um flagelo
livre, de comprimento variável, que emerge do corpo basal na extremidade anterior da célula,
conferindo mobilidade ao parasita. O núcleo encontra-se numa posição central e o
cinetoplasto localiza-se entre o núcleo e a extremidade anterior da célula (Figura 1); após
inoculados no hospedeiro vertebrado, os promastigotas são fagocitados por células dos
sistema reticuloendotelial (macrófagos) diferenciando-se em amastigotas. As formas
amastigotas são estruturas ovóides de 2 a 6 micras de comprimento, sem flagelo livre (Figura
1) (Rosa, 2009).
19
4. Hospedeiros
4.1. Hospedeiro vertebrado
Os mamíferos são o grupo de animais mais afetados pela infeção por Leishmania sp.
(Campino & Maia, 2010).
Um hospedeiro pode ser considerado um reservatório se não for capaz de eliminar o
parasita e se for responsável pela transmissão do mesmo a indivíduos da mesma ou de outra
espécie. Contudo, quando várias espécies de hospedeiro suscetíveis à infeção, habitam o
mesmo biótopo é difícil determinar qual delas se comporta como reservatório, primário e
secundário ou são apenas acidentais (revisto por Maia & Campino, 2011). Em algumas
ocasiões existem dois reservatórios, como no caso de ciclos de transmissão peridoméstica e
silvática ligadas pelo mesmo vetor responsável pela transmissão do parasita em ambos. Este
fenómeno é observável em algumas áreas endémicas de L. infantum onde os cães representam
o papel de reservatório peridoméstico e as raposas de reservatório silvático (Abranches et al.,
1984). Nos últimos anos tem sido sugerido que o gato possa desempenhar algum papel na
epidemiologia da leishmaniose zoonótica causada por L. infantum.
De acordo com Campino & Maia (2012), em áreas endémicas de leishmaniose, os
gatos, tal como os cães, são suscetíveis à infeção por Leishmania sp.. Estes animais cumprem
vários requisitos necessários para poderem ser considerados reservatórios tais como: (i) estar
em estreito contato com o vetor, se tiver acesso ao exterior durante o pôr-do-sol e o
amanhecer, (ii) pela sua tendência territorial e deslocações perto de vegetação rateira, zonas
húmidas e resguardadas, locais ideiais para o crescimento do vetor; (iii) coabitação com o
homem; (iv) apresentar parasitas no sangue periférico e pele e (v) capacidade de transmitir os
parasitas aos vetores (Maroli et al., 2007; Silva et al., 2010)
Contudo, apesar de diferentes autores definirem o gato como hospedeiro acidental ou
reservatório, primário ou secundário, da infeção por L. infantum, é difícil determinar qual o
seu papel na manutenção e disseminação desta parasitose principalmente porque os gatos
partilham a mesma área geográfica do que os cães, a única espécie animal comprovadamente
reservatória da leishmaniose visceral humana (Mancianti, 2004; Gramiccia & Gradoni, 2005;
Martin-Sánchez et al., 2006; Solano-Gallego et al., 2007; Maia et al., 2008).
20
4.2. Hospedeiro invertebrado
Os flebótomos são insetos pertencentes à Ordem Díptera, Família Psychodidae e à
Subfamília Phlebotominae. Entre os 13 géneros atualmente aceites, apenas dois apresentam
importância quer na medicina humana quer na veterinária, nomeadamente Phlebotomus sp. no
Velho Mundo, e Lutzomyia sp. no Novo Mundo. Das 700 espécies de flebótomos conhecidas,
50 são capazes de atuar como vetores de Leishmania sp.. Têm também a capacidade de
transmitir outros agentes nocivos, quer ao humano quer aos animais, como vírus (Arbovírus)
ou bactérias (Bartonella bacilliformis) (Afonso & Alves-Pires, 2008).
Tanto os machos como as fêmeas alimentam-se de sucos e açucares vegetais e de
secreções de outros insetos como afídeos, mas no caso das fêmeas, estas são também
hematófagas, tendo necessidade de efetuar uma refeição sanguínea num hospedeiro
vertebrado para que se dê a maturação ovárica. A atividade dos flebótomos adultos é
crepuscular ou mesmo noturna, variando em grande medida com a época do ano estando
descrito em Portugal de maio a outubro. A presença e atividade do homem são determinantes,
para a presença e disseminação dos flebótomos, pois a mão humana leva à criação de biótopos
como fendas em muros ou paredes, áreas com muita matéria orgânica ou acumulações de
madeira, podendo ser utilizados por estes insetos para ovopostura e continuação do
desenvolvimento do ciclo biológico do inseto (Afonso & Alves-Pires, 2008).
5. Ciclo de vida
O ciclo de vida do parasita no hospedeiro vertebrado inicia-se pela picada de uma
fêmea de flébotomo infetada aquando da realização da refeição sanguínea para maturação e
postura de ovos. Dependendo do tropismo de cada espécie de Leishmania e do sistema
imunitário do hospedeiro, os parasitas fagocitados podem permanecer no tecido subcutâneo,
dando origem às formas clínicas de LC, ou invadir as células do sistema mononuclear
fagocítico, como o baço, fígado, medula óssea, gânglios linfáticos e outros órgãos linfóides,
causando LV (Bowman et al., 2002; Maia & Campino 2011).
21
Figura 2: Ciclo de vida de Leishmania sp.. 1 – Alimentação do flebótomo fêmea
(adaptado de http://www.stanford.edu/class/humbio103/ParaSites2006/
Leishmaniasis/TandLC.htm) no hospedeiro vertebrado com inoculação de
promastigotas metacíclicos; 2 – Fagocitose dos promastigotas pelas células fagocitárias;
3 – Encapsulação em fagolisossomas das formas promastigotas e transformação em
amastigotas (estruturas roxas) com posterior multiplicação do protozoário; 4,5 – Lise
dos macrófagos e infeção de outras células fagocitárias com posterior multiplicação; 6 –
Alimentação de flebótomo fêmea com ingestão de macrófagos infetados; 7 – Libertação
dos amastigotas no intestino do vetor; 8 – Diferenciação e multiplicação dos
promastigotas em formas infetantes metacíclicas.
Pedro Pinto
5.1. Desenvolvimento do parasita no hospedeiro vertebrado
As formas promastigotas metacíclicas de Leishmania sp. inoculadas, pelo vetor
utilizam as capacidades de fagocitose das células dendríticas e dos macrófagos que se situam
no tecido cutâneo, diferenciando-se assim nas formas amastigotas (Figura 2). O parasita
permite a sua fagocitose por estas células mas interfere com os mecanismos microbicidas das
mesmas (Love et al., 1998). As formas amastigotas multiplicam-se no interior das células
hospedeiras e, após a lise do macrófago ou por exocitose migram para outras células do
sistema reticuloendotelial iniciando novamente o mesmo ciclo de proliferação e lise celular.
No interior destas células o protozoário aloja-se em organelos específicos como os
fagolisossomas, nos quais têm os nutrientes necessários ao desenvolvimento e proliferação
(Burchmore & Barrett, 2001; Naderer & McConville, 2008).
22
5.2. Desenvolvimento do parasita no hospedeiro invertebrado
Após ingestão das formas amastigotas intracelulares estas diferenciam-se em
promastigotas procíclicas flageladas no interior do aparelho digestivo do flebótomo,
iniciando-se assim os ciclos de multiplicação intravetorial (Figura 3). Os parasitas encontram-
se junto do epitélio gástrico, no interior da membrana peritrófica, sendo resistentes aos sucos
gástricos do inseto (Afonso & Alves-Pires, 2008).
Ao fim de 48 a 72 horas, as formas procíclicas diferenciam-se nas formas
nectomonas (mais compridas e delgadas), que se libertam da membrana peritrófica, migrando
para a porção anterior do estômago onde se ligam às células epiteliais. Em quatro a sete dias
dá-se uma segunda multiplicação diferenciando-se nas formas leptomonas. Passados cinco a
sete dias, diferenciam-se nas formas haptomonas e promastigotas metacíclicas na região da
válvula estemodeal do estômago. As formas metacíclicas são móveis e bem adaptadas à
infeção do hospedeiro vertebrado; as haptomonas criam um “rolhão” na válvula estemodeal
que leva à sua degenerescência permitindo assim uma fácil passagem das formas metacíclicas
aquando da refeição sanguínea (Afonso & Alves-Pires, 2008).
Assim, o tempo necessário para se diferenciarem em formas infetantes no agente
vetor ronda os seis a nove dias, consoante as condições ambientais e condições intravetoriais.
A perda da funcionalidade da válvula estemodeal, juntamente com a oclusão do lúmen
intestinal causada pelos parasitas e por uma matriz de fosfoglicanos secretada pelas formas
leptomonas, impedem o inseto de realizar refeições completas. Este facto obriga o vetor a
picar vários hospedeiros, na tentativa de obter a quantidade de sangue de que necessita. Isso
parece explicar que num determinado foco, se verifique uma elevada prevalência de
leishmaniose apesar de uma baixa taxa de infeção flebotomínica, pois um flebótomo infetado
pode picar vários animais numa noite, pela dificuldade em alimentar-se, potenciando assim a
contaminação dos mamíferos presentes (Maroli et al., 2007; Afonso & Alves-Pires, 2008).
23
6. Formas de transmissão sem vetor flebotomíneo
Apesar da transmissão vetorial ser a única comprovadamente importante na
epidemiologia de Leishmania sp. existem descrições de casos de leishmaniose canina (LCan)
transmitidos por contacto direto, por transmissão vertical (Mancianti & Sozzi, 1995; Rosypal
et al., 2005; Magno da Silva et al., 2009), por via sexual (Nauche & Lorentz, 2012) e por
transfusão sanguínea (Freitas et al., 2006).
A deteção de ADN de L. infantum em ixodídeos (Rhipicephalus sanguineus) e pulgas
(Ctenocephalides felis) levanta a hipótese destes artrópodes terem algum papel na transmissão
do parasita atuando como vetores mecânicos (Dantas-Torres et al., 2010).
Embora não existam até ao momento casos reportados de leishmaniose de
transmissão independente do vetor flebotomíneo em gatos residentes em zonas endémicas
estes devem ser testados para Leishmania sp. antes de serem utilizados como reprodutores ou
dadores de sangue (Martins, 2011).
Figura 3: Esquema representativo da multiplicação intravetorial do parasita no aparelho
digestivo do flebótomo (adaptado de http\\:www.fcfrp.usp.br/). 1 – Formas Procíclicas
flageladas; 2 – Nectomonas; 3 – Leptomonas; 4 – Haptomonas; 5 – Formas Metacíclicas.
24
7. Resposta imune
A resposta imunitária ao parasita tem um forte impacto no desenvolvimento ou na
supressão da doença. A infeção por Leishmania pode resultar em dois tipos de resposta
imunitária associadas à atividade dos linfócitos: a resposta humoral, não protetora, associada à
suscetilidade à doença, e a resposta celular, promotora da resistência à infeção (Maia, 2008).
A infeção por L. infantum nos cães pode manifestar-se de forma subclínica, doença auto-
limitante, doença não limitante e em doença grave com manifestações clínicas de doenças
sistémicas (Greene, 2006).
Nos cães, a resposta imune caracteriza-se por uma imunidade protetora mediada
pelas células T CD4, pela libertação de interferão gama (IFN-γ), interleucina 2 (IL-2) e
fatores de necrose tumoral alfa (TNF-α) que induzem a actividade microbicida dos
macrófagos (Greene, 2006; Alexander & McFarlane, 2008; Day, 2011).
A doença clínica pode manifestar-se desde uma ligeira dermatite papular associada à
imunidade celular específica e baixa resposta humoral a uma doença grave caracterizada por
danos renais com glomerulonefrite devidos à deposição de complexos imunes associados com
uma maciça resposta humoral e elevadas cargas parasitárias (Greene, 2006).
Hervás et al. (2002) realizaram o único estudo efetuado em gatos até ao momento
sobre a resposta imunitária local à infeção por Leishmania sp.. Nesse estudo, caracterizou-se
imunohistoquimicamente o infiltrado celular e as citocinas associadas à infeção por
Leishmania nas lesões cutâneas, oculares e orais de um gato co-infectado pelo vírus da
imunodeficiência felina (FIV). Nas reações nodulares granulomatosas houve um número
elevado de linfócitos CD3+ e células plasmáticas libertadoras de IgG
+ associados a uma
elevada expressão de Ag-MHC classe II por numerosos linfócitos e células macrofágicas,
indicando uma boa resposta imunitária local (tipo IV) a qual terá sido, possivelmente, a
responsável pela não disseminação sistémica da infeção (Rosa, 2009).
25
Figura 4: Mapa ilustrativo da distribuição de leishmaniose no Mundo (áreas a azul claro disseminação de leishmaniose e escuro disseminação de leishmaniose
com co-infecção em humanos com VIH), adaptado de OMS.
http://www.who.int/ csr/resources/ publications/ CSR_ISR_2000_1leish/en/
OMS
8. Epidemiologia
8.1. Leishmaniose no Mundo
As leishmanioses são endémicas em 98 países (Figura 4) sendo diagnosticados 0,2 a
0,4 casos e 0,7 a 1,2 milhões de casos por ano de LV e LC, respetivamente (OMS, 2012). A
grande maioria dos casos de LV ocorre em seis países (Bangladesh, Brasil, Etiópia, India,
Sudão, Sudão do Sul). A LC está amplamente disseminada pelas América Central e do Sul,
bacia mediterrânica, Médio Oriente, Ásia ocidental e central sendo o Afeganistão, Argélia,
Brasil, Colômbia, Costa Rica, Etiópia, Irão, Peru, Síria, Sudão do Norte, os países com 70 a
75% da incidência mundial. Os dados relativos à mortalidade associada são mais escassos que
os dados das prevalências mas, a OMS estima que a taxa global ronde os 10% com uma
estimativa preliminar de 20.000 a 40.000 mortes por LV/ano (OMS, 2010; 2012). A
leishmaniose é uma das doenças mais negligenciadas do mundo, afetando em grande parte as
camadas sociais mais carenciadas. Principalmente nos países em desenvolvimento, estima-se
que 350 milhões de pessoas estejam em risco de contrair esta doença. Nos últimos 10 anos,
grandes avanços científicos foram feitos no tratamento, prevenção e diagnóstico de
leishmaniose, e os preços de vários medicamentos essenciais ao seu tratamento foram
reduzidos. Estes desenvolvimentos têm facilitado a implementação de estratégias nacionais e
regionais e, criado programas sustentáveis de controlo; no entanto, os programas em
funcionamento ainda são raros, e a mortalidade e morbilidade por leishmaniose em todo o
mundo mostra uma preocupante tendência crescente (OMS, 2010; 2012).
26
A LCan causada por L. infantum é endémica na bacia do Mediterrâneo, Asia,
América do Sul e, também, na América do Norte (Maia & Campino, 2008; 2012). Muitos
cães infetados acabam por morrer devido aos efeitos secundários provocados pela infeção.
Noutros casos, com acompanhamento veterinário, é possível que estes atinjam uma maior
longevidade, com qualidade de vida. O cão, devido às suas características fisiológicas e
comportamentais (acesso frequente ao exterior), permite que seja das espécies mais afetadas
e, por sua vez, com maior número de relatos epidemiológicos e clínicos de infeção e doença.
Inúmeros trabalhos têm sido desenvolvidos com o intuito de conhecer as verdadeiras
prevalências e a evolução da infeção na população de canídeos domésticos ou silváticos (Maia
& Campino, 2008; 2012).
Infeções por Leishmania sp. em gatos domésticos têm sido reportadas em vários
países da bacia mediterrânica e no Brasil, onde esta parasitose é endémica (Maia et al., 2010).
8.2. Leishmaniose em Portugal
Em Portugal, o primeiro caso de leishmaniose humana foi descrito por Dyonísio
Alvares em 1910, numa criança de nove anos de idade, residente em Lisboa. Desde então, nos
vários centros hospitalares e centros de diagnóstico são frequentemente reportados, casos de
leishmaniose humana em crianças e adultos, sendo uma doença subnotificada apesar de ser de
declaração obrigatória. Em 1911, Alvares & Silva apresentaram o resultado de um inquérito
em 300 cães da região de Lisboa, dos quais oito encontravam-se parasitados. O número de
casos de LCan tem vindo a aumentar no nosso país, estando esta zoonose incluída, desde
2002, no grupo das infeções de notificação obrigatória durante as campanhas de vacinação
antirrábica (revisto por Campino & Maia, 2010).
Estudos efetuados entre 1986 a 1989 na região do Alto Douro apontavam para uma
prevalência da infeção canina entre 10% e 12,4% (Figura 5). Posteriormente, em 2000,
Cardoso et al. (2004) verificaram uma seroprevalência de 18,7%. No inquérito
epidemiológico canino realizado por Cortes et al. (2007) na área urbana/suburbana da grande
Lisboa encontraram uma prevalência da infeção de 19,2%. A prevalência da infeção canina
encontrada no Algarve, em 1994, foi de 7%. Em 2006, realizou-se na região do Algarve, um
novo estudo de seroprevalência da LCan tendo-se detetado valores significativos de
anticorpos em 16% dos animais. Trabalhos mais recentes demonstram que a LCan está
distribuída por todo o país com elevadas prevalências, variando de 0,88 a 16,16% (Cortes et
27
Figura 5: Mapa de prevalência de leishmaniose canina em Portugal entre 1981 e 2005,
(adaptado de Observatório Nacional de Leishmanioses – Onleish, 2013, www.onleish.org)
al., 2007; Cardoso et al., 2012). Nesta última década foram realizados em Portugal vários
estudos epidemiológicos sobre a infeção por Leishmania sp. em gatos, tendo a prevalência
variado de 0 a 30,4% (Tabela 2) (Maia & Campino, 2012).
28
Tabela 2: Prevalências de Leishmania sp. em gatos obtidas em inquéritos
epidemiológicos realizados em Portugal.
9. Leishmaniose felina
9.1. Prevalência e incidência clínica de leishmaniose felina
O primeiro caso de leishmaniose felina (LFel) datado em 1912, foi relatado num gato
que coabitava com um cão e com uma criança ambos com leishmaniose visceral, (revisto por
Maia & Campino, 2011). Apesar da prevalência da doença ser baixa, o número de casos
clínicos de leishmaniose felina e de infeções por Leishmania reportados em países endémicos
tem aumentado devido ao incremento de estudos epidemiológicos, à melhoria das técnicas de
diagnóstico e à sensibilização de profissionais (Rosa, 2009).
Prevalência de infeção (%)
Amostra (n) Técnicas Serológicas Moleculares Referências
316 DAT, ELISA 2,8 n.r. Cardoso et al., 2010
180 IFI 0,6 n.r. Duarte et al., 2010
75 IFI 0 n.r. Faria, 2008
23 IFI, PCR 20 30,4 Maia et al., 2008
142 IFI, PCR 1,32 20,3 Maia et al., 2010
70 IFI 0 n.r. Rosa, 2009
97 IFI 1,03 n.r. Vaz et al., 2005
95 DAT, PCR 6,3 2,2 Carreira, 2012
217 DAT, PCR 4,1 0,5 Ramos, 2012
80 IFI, qPCR 18,8 10 Garrido, 2012
320 qPCR n.r. 0,3 Vilhena et al., 2013
DAT: Técnica de aglutinação direta; ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay; IFI:
Imunofluorescência Indireta; PCR: Reação em Cadeia da Polimerase; qPCR: Reação em
cadeia da polimerase em tempo real; n.r.: Não realizado.
29
9.2. Sinais clínicos de leishmaniose felina
O diagnóstico clínico de LFel não é fácil pois nem sempre faz parte dos diagnósticos
diferenciais a considerar perante um caso clinico sendo confundida muitas vezes com outras
patologias (Center for Food Security and Public Health (CFSPH), 2009).
Tal como nos cães, a maioria dos gatos não desenvolvem sintomatologia específica.
Quando presente, o quadro clínico observado é geralmente inespecífico sendo a febre,
anorexia, perda de peso, estomatite, desidratação, vómitos, icterícia e diarreia alguns dos
primeiros sinais a serem observados (Pennisi, 2002). Cerca de metade dos casos de LFel
relatados apresentavam linfadenomegalia, maioritariamente generalizada e, em menor
número, localizada (Simões-Mattos, 2005; Gramiccia & Gradoni 2007; CFSPH, 2009).
Existem relatos de gatos que apresentaram sintomatologia compatível com a
disseminação visceral do parasita para a medula óssea, o baço, o fígado, e/ou os linfonodos
(Greene, 2006). Dos casos de LFel com envolvimento sistémico descritos na literatura o
agente causal foi L. infantum zimodemo MON-1 (Maia & Campino, 2011).
9.2.1. Lesões cutâneas
Dos casos relatados de LFel com manifestações cutâneas, as mais frequentes foram
lesões ao nível da trufa, pavilhões auriculares, cavidade bucal, lábios e pálpebras. Num menor
número de casos também foram descritas lesões ao nível dos membros, pescoço, região dorso-
lombar, tórax, abdómen e cauda (Simões-Mattos, 2005; Rufenacht et al., 2005; CFSPH,
2009).
As lesões cutâneas são, essencialmente, caracterizadas por úlceras e/ou nódulos
hemorrágicos ou ulcerados principalmente localizados sobre o focinho. Alguns animais
apresentam alopécias localizadas ou difusas e/ou crostas. Com menos frequência observam-se
eritema, pápulas e pústulas. Sinais como descamação e seborreia também se encontram
relatados (Figura 6) (Craig et al., 1986; Simões-Mattos, 2005; Trainor et al., 2010).
30
Figura 6: Fotografias ilustrativas dos tipos de lesões cutâneas que se observam
em gatos com leishmaniose. 1 e 2 - adaptado de Vides et al., 2011; 3 e 4 -
adaptado de Rufenacht et al., 2005; 5 - adaptado de Pocholle et al., 2012.
9.2.2. Sinais oculares
Os sinais oculares mais frequentemente observados, são as uveítes uni ou bilaterais
podendo estar associadas a queratites e/ou corioretinites (Figura 7) (Verneuil, 2013).
Figura 7: Fotografia representativa de lesão ocular (uveíte) associada a infeção
por Leishmania sp. (Verneuil, 2013).
31
9.2.3. Alterações hematológicas e bioquímicas
Apesar de grande parte dos gatos com leishmaniose não apresentarem alterações
hematológicas, as mais comuns são: anemia, muitas das vezes não regenerativa, leucocitose,
com eosinofilia, linfocitose e monocitose ou leucopenia, caraterizada sobretudo por
neutropenia e/ou linfopenia (Simões-Mattos, 2005).
Foram também descritas alterações bioquímicas, nomeadamente hiperglobulinémia
com elevação das gama e beta-globulinas, assim como alterações nos parâmetros hepáticos e
renais, os quais, em casos extremos podem indicar uma insuficiência renal, tal como acontece
por vezes nos cães (Ozon et al., 1998; Rufenacht et al., 2005).
10. Métodos de diagnóstico
O diagnóstico precoce da infeção por Leishmania sp. é de elevada importância, de
forma a travar o desenvolvimento da doença ou mesmo a morte do doente e como medida de
controlo (Schallig & Oskam, 2002). Existem vários métodos de diagnóstico: (i) os
parasitológicos, que permitem realizar um diagnóstico definitivo, através da observação do
parasita; (ii) os moleculares que permitem amplificar e detetar o ADN de Leishmania e (iii) os
métodos serológicos, que tiram partido da elevada produção de anticorpos produzidos em
resposta ao parasita. Os resultados do diagnóstico laboratorial devem ter sempre em conta o
contexto clínico e epidemiológico do animal (Simões-Mattos, 2005).
10.1. Métodos parasitológicos
Os métodos clássicos do diagnóstico parasitológico da leishmaniose consistem na
pesquisa dos parasitas por exame direto ou por exame cultural, efetuados a partir do material
biológico infetado. Na maioria dos casos o exame é efetuado a partir de punções aspirativas
de lesões cutâneas, linfonodos, ou da medula óssea. O exame direto consiste na observação,
ao microscópio ótico, de preparações do material biológico, após coloração. A visualização de
uma só célula parasitada é patognomónica da infeção por Leishmania (Maia, 2008).
32
O exame cultural é mais sensível que o exame direto, aumentando a probabilidade de
sucesso do diagnóstico. Apesar de ser 100% específico, a obtenção do resultado é demorada
(pode demorar cinco semanas) e condicionada pela ausência de contaminação bacteriana e
fúngica. É também necessário ter em conta que nem todos os isolados crescem em meio de
cultura e que um resultado negativo com suspeita clínica não significa que o animal não se
encontre infetado pois a distribuição dos parasitas nos tecidos e nos diferentes órgãos não é
homogénea (Simões-Mattos, 2005; Maia & Campino, 2008). Nos casos de LFel em que foi
efetuada histopatologia observaram-se lesões inflamatórias granulomatosas associadas ou não
à presença de formas amastigotas de Leishmania sp. visíveis nos macrófagos (Ozon et al.,
1998; Navarro et al., 2010).
10.2. Técnicas moleculares
As técnicas baseadas na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) têm vindo a ser
cada vez mais utilizadas para a deteção de Leishmania. A técnica da PCR baseia-se na
amplificação do ADN específico pelo uso de sequências iniciadoras “primers” a partir dos
ácidos nucleicos de uma amostra biológica. A sensibilidade e especificidade da técnica
dependem dos “primers”, do número de cópias da sequência alvo, do método de extração de
ADN, do produto biológico utilizado e do protocolo de PCR (Alvar et al., 2004; Cortes et al.,
2004). A sua sensibilidade tem vindo a aumentar com o uso de sequências iniciadoras que
amplificam sequências de ADN genómicas altamente repetitivas. No caso da leishmaniose,
essas sequências incluem, entre outros, os genes que codificam para a pequena subunidade de
RNA ribossómico (SSU rRNA) (Eys et al., 1992) e os minicírculos de ADN cinetoplastideal
kADN (Cortes et al., 2004).
A utilização da técnica da PCR no diagnóstico da LCan é fiável, relativamente rápida
e reproduzível, muito mais sensível que os métodos parasitológicos convencionais e
serológicos na deteção da infeção tanto em cães sintomáticos como assintomáticos. A deteção
do parasita através desta técnica é mais sensível a partir de amostras de medula óssea e de
linfonodo, do que a partir de sangue periférico (Maia & Campino, 2008).
33
Desde a criação da técnica de PCR, muitas outras variantes foram criadas, tornando-
as cada vez mais específicas e sensíveis. A técnica de PCR em tempo real “real-time PCR ou
qPCR” permite uma avaliação quantitativa e uma monitorização do material genético
específico durante a amplificação. Esta técnica permite avaliar/estimar a quantidade de
Leishmania ou de material genético presente nos tecidos ou sangue. As vantagens da qPCR
comparativamente à PCR convencional, incluem a redução do tempo de ensaio necessário e
redução do risco de contaminações, aumentando a sensibilidade. Esta técnica, para além de
ser usada como meio de diagnóstico pode ser utilizada na monitorização da carga parasitária
durante um protocolo de tratamento, permitindo avaliar a sua eficácia (Maia & Campino,
2008; Vilhena et al., 2013).
10.3. Técnicas serológicas
O diagnóstico serológico é dos exames complementares mais usado para deteção de
anticorpos anti-Leishmania (Greene, 2006; Maia & Campino, 2008; Rosa, 2009). A grande
maioria dos testes serológicos tem sido usada em estudos epidemiológicos, no diagnóstico
clinico e na monitorização terapêutica. Os diferentes antigénios e suas formas de apresentação
levam a uma grande variedade da diluição utilizada como limiar de significância ou cut-off, o
que origina resultados inconsistentes e dificulta a uniformização das técnicas e comparação de
resultados (Greene, 2006; Maia & Campino, 2008; Rosa, 2009).
Por outro lado, as técnicas serológicas apresentam alguns problemas, tais como a
persistência dos anticorpos específicos após uma fase de recuperação, e a possobilidade de
ocorrerem reações cruzadas com outros agentes como Ehrlichia canis (Greene, 2006; Maia &
Campino, 2008; Rosa, 2009).
Níveis elevados de sensibilidade e especificidade são necessários para evitar os
resultados falsos negativos, os quais subestimam o verdadeiro número de indivíduos infetados
assim como os resultados falsos positivos, que levam ao tratamento desnecessário ou ao abate
desnecessário de animais não infetados (Greene, 2006; Maia & Campino, 2008; Rosa, 2009).
34
10.3.1. Técnica da imunofluorescência indireta (IFI)
A técnica de imunofluorescência indireta utiliza como antigénio a totalidade do
parasita sendo considerada a técnica serológica de referência para deteção da infeção em cães,
apresentando uma sensibilidade de 96% e uma especificidade de 98% (OIE, 2008).
Contudo necessita de equipamento dispendioso (microscópio de fluorescência) e
experiência na visualização ao microscópio. Outra das desvantagens prende-se com a
realização de diluições seriadas o que num elevado número de amostras pode ser muito
moroso (Maia & Campino, 2008).
10.3.2. Ensaio imunoenzimático (ELISA)
A técnica de ELISA pode ser efetuada em soro ou em sangue total. As vantagens
deste método prendem-se com a rapidez de realização e com a possibilidade de testar
simultaneamente um número elevado de amostras sendo frequentemente utilizada em estudos
seroepidemiológicos em condições de campo (OIE, 2008). Apresenta ainda a vantagem de
poder ser utilizada com uma ampla gama de antigénios (Maia & Campino, 2008). A
sensibilidade desta técnica varia entre 94 a 100% em cães assintomáticos e sintomáticos,
respetivamente (Maia & Campino, 2008).
10.3.3. Técnica de aglutinação direta (DAT)
O antigénio usado na DAT consiste em promastigotas integrais em suspensão ou
numa forma liofilizada. Após preparação do antigénio, realizam-se diluições seriadas do soro
a testar ficando a incubar durante 18 horas à temperatura ambiente, para que posteriormente o
resultado seja lido visualmente contra um fundo branco. Esta técnica apresenta uma
sensibilidade de 100% e 98,9% de especificidade quando aplicada no diagnóstico da LCan
(OIE, 2008; Maia & Campino, 2008). Schalling et al. (2002) desenvolveram o teste rápido de
aglutinação (FAST), que requer uma única diluição de soro e cuja leitura do resultado é feita
após três horas de incubação. Apesar dos resultados serem qualitativos este teste pode ser
utilizado como triagem, especialmente em áreas endémicas. Na maioria das vezes a técnica
em canídeos é iniciada na diluição de 1:100, sendo usado um cut-off de 1:400 (Cardoso et al.,
2010). No gato, por não ser expectável uma produção tão intensa de anticorpos inicia-se as
diluições de 1:25 sendo o cut-off utilizado de 1:100 (Cardoso et al., 2010).
35
10.4. Outras metodologias utilizadas no diagnóstico de leishmaniose
Outros métodos laboratoriais de diagnósticos utilizados para detetar casos de
leishmaniose incluem o teste de hemaglutinação indireta, testes imunocromatográficos, o
Western-blot e a Nested-PCR (Cruz et al., 2006; OIE, 2008; Maia & Campino, 2008).
11. Tratamento
A LCan apresenta maior resistência ao tratamento do que a leishmaniose humana, em
indivíduos imunocompetentes, sendo difícil eliminar completamente o agente parasitário do
cão com os fármacos disponíveis no mercado. Apesar dos antimoniais pentavalentes serem
utilizados como fármaco de “primeira linha” no tratamento da LCan a miltefosina, o
alopurinol, antifúngicos (anfotericina B, o itraconazol, o fluconazol e o cetoconazol) e
antibióticos aminoglicosídeos (pentamidina, paramomicina, aminosidina) também têm sido
usados (Greene, 2006). Os protocolos de tratamento variam entre autores e entre profissionais,
muitas vezes adaptando-se caso a caso e de acordo com o sucesso obtido em casos anteriores
(Maia & Campino, 2012).
11.1. Antimoniato de N-metilglucamina
O antimoniato de meglumina apresenta um mecanismo de ação não totalmente
conhecido mas, por testes laboratoriais demostra atuação ao nível da síntese de adenosina
trifosfato (ATP) durante o processo de glicogenólise e interferência no metabolismo dos
ácidos gordos levando à morte do parasita. A absorção a nível intestinal é nula pelo que a sua
administração é por via parenteral intravenosa ou, mais frequentemente, por via intramuscular
ou subcutânea. A eliminação do fármaco faz-se essencialmente por via renal, o que pode
contribuir para alterações da função renal em conjunto com a deposição de imunocomplexos
nos glomérulos renais (Faria, 2008).
As desvantagens desta molécula são: (i) o risco de diminuição de sensibilidade do
parasita ao antimoniato de meglumina após várias séries de tratamento, produzindo-se um
reservatório de parasitas resistentes, (ii) o tratamento ser doloroso, nefrotóxico e dispendioso
e (iii) as recidivas serem frequentes (Faria, 2008).
36
11.2. Alopurinol
O alopurinol é um análogo da hipoxantina e é administrado oralmente, sendo
hidrolisado pelo parasita numa molécula aberrante idêntica à inosina. É incorporado no lugar
da ATP durante a síntese do ácido ribonucleico (ARN) parasitário, levando a alterações da
síntese proteica. Este princípio ativo tem apenas efeitos leishmanioestáticos. A baixa
toxicidade para o hospedeiro, o baixo custo e a possibilidade de administração oral tornou esta
molécula uma boa escolha no tratamento de manutenção da LCan (Greene, 2006).
Infelizmente, não existe a confirmação de uma melhoria clínica significativa com o
uso isolado de alopurinol. Além disso, o término do tratamento desencadeia, após algumas
semanas, recidivas em muitos dos cães infetados. O interesse do alopurinol advém da
possibilidade de o combinar com antimoniais pentavalentes ou com a miltefosina, diminuindo
a duração do tratamento, e consequentemente reduzindo os efeitos secundários associados. Os
efeitos secundários são pouco frequentes, apesar da formação de urólitos de xantina possa
ocorrer, particularmente em cães com doença hepática (Faria, 2008).
11.3. Miltefosina
O princípio ativo hexadecilfosfocolina foi originalmente desenvolvido para terapias
anticancerígenas por via oral. Este fármaco leishmanicida apresenta como efeitos secundários,
alterações gastro-intestinais (anorexia, vómito, diarreia e náusea) auto-limitantes e efeitos
teratogénicos pelo que a sua administração em animais deve ser bem esclarecida aos
proprietários (OMS, 2010; Virbac, 2013).
12. Esquemas terapêuticos utilizados na leishmaniose felina
Não existe terapêutica específica para o tratamento da LFel, sendo os fármacos e
protocolos adaptados da LCan. O alopurinol, o antimoniatos de meglumina e o cetoconazol
foram utilizados em alguns animais levando à remissão dos sinais clínicos e à normalização
dos parâmetros bioquímicos (Durão et al., 1994; Penissi, 2002; Leiva et al., 2005; Rufenacht
et al., 2005; Navarro et al., 2010). De acordo com Greene (2006) nos casos de leishmaniose
cutânea, muito frequente nos felinos, em que há formação de granulomas e/ou ulcerações de
difícil cicatrização, deve-se remover cirurgicamente o tecido lesionado e associar terapia
sistémica com alopurinol ou antimoniato de meglumina.
37
13. Profilaxia
Dos diversos repelentes e inseticidas utilizados na prevenção da picada do inseto
vetor os piretróides sintéticos são os mais comuns pois combinam uma elevada eficácia com
uma baixa toxicidade para os cães. Os produtos utilizados nos animais distinguem-se pelo seu
modo de aplicação. Existem produtos de libertação lenta como as coleiras, os spot-on e as
apresentações de libertação mais rápida como os sprays. As coleiras impregnadas com
deltametrina apresentam uma libertação lenta de inseticida, obtendo uma atividade ótima uma
semana após a colocação com efeito a longo termo, durante pelo menos seis meses. As
formulações de aplicação tópica têm uma duração de ação inferior às coleiras, com uma
duração de 21 dias como no caso de spot-on de permetrina combinado com imidacloprid. As
soluções em spray, constituídas por permetrina, têm uma atividade imediata e prolongada por
três a quatro semanas. Os diferentes períodos de ação associados às diferentes formulações
devem ser tidos em conta aquando da escolha do produto, tendo também em conta o ambiente
onde o animal se encontra. Donos que planeiem efetuar uma viagem com o seu animal de
zonas não endémicas para zonas endémicas deverão ter em conta que os produtos só iniciam a
sua atividade após 24 horas ou uma semana, pelo que a sua aplicação deve ser pensada com
antecipação. Devido à curta duração da atividade ectoparasiticida, os spot-on e sprays
requerem uma aplicação periódica e constante e o comprometimento dos proprietários; no
caso das coleiras, não é necessário uma aplicação tão frequente, bastando a sua substituição
duas vezes ao ano ou apenas uma, se estivermos em regiões de baixa presença do vetor ou
fora do principal período de atividade dos insetos. É essencial a proteção de animais saudáveis
que vivam ou visitem áreas endémicas. Já os animais que se encontrem infetados também têm
de ter o mesmo tipo de tratamento, não só para evitar a possibilidade de re-infeção, mas
também para evitar a infeção de flebótomos vetores e impedir a transmissão do parasita a
outros animais, e/ou humanos (Alexander & Maroli, 2003; Afonso & Alves-Pires, 2008;
Gramiccia, 2011).
Para controlo ambiental, os proprietários que não queiram a utilização de substâncias
ativas nos animais, é possível a utilização de inseticidas quer pela pulverização do ambiente
quer pela impregnação de redes mosquiteiras. As sustâncias que são utilizadas nestes métodos
são iguais ou semelhantes às utilizadas nas formulações a aplicar aos animais (OMS, 2010).
38
É preciso ressalvar que, apesar de existirem vários inseticidas/repelentes no mercado,
todos eles são tóxicos para os gatos, pelo que as únicas medidas de prevenção aplicações em
felinos que vivam em zonas endémicas será impedir o acesso ao exterior por estes animais nas
horas de maior atividade flebotominica (entre o anoitecer e o amanhecer), e fazer um controlo
do ambiente onde estes permanecem com inseticidas ou redes mosquiteiras (Maia &
Campino, 2011).
De acordo com Maroli et al. (2012), a leishmaniose é considerada a parasitose com
maior probabilidade de ser controlada por protocolos vacinais, uma vez que a resolução da
leishmaniose em humanos resulta numa forte resistência à re-infeção. Apesar da
complexidade genética do agente existem atualmente três vacinas registadas para a prevenção
da LCan, duas no Brasil (Leishmune® e Leish-tec®) e a CaniLeish®, comercializada nos
países europeus. Os dados publicados relativos à aplicação da imunoprofilaxia no Brasil
mostram que áreas em que a vacinação foi amplamente praticada, as prevalências da infeção
canina e humana diminuíram (Gotijo, 2004; Palatnik-de-Sousa, 2012; Virbac, 2013).
39
II. Rastreio de Leishmaniose felina no concelho de Cascais, distrito de Lisboa
1. Objetivos
A presente dissertação teve como objetivo determinar a prevalência de infeção por
Leishmania sp. em gatos domésticos (Felis catus domesticus) no concelho de Cascais, através
da:
a) Deteção de ADN de Leishmania sp. no sangue periférico;
b) Deteção e quantificação da presença de anticorpos anti-Leishmania sp., por
diferentes técnicas serológicas;
c) Avaliação de sinais clínicos compatíveis com leishmaniose felina;
d) Avaliação dos fatores que podem potenciar a infeção do hospedeiro;
e) Determinação da sensibilidade, especificidade e valores preditivos negativos e
positivos das técnicas utilizadas.
2. Materiais e métodos
2.1. Caracterização da área geográfica
O concelho de Cascais encontra-se dividido em seis freguesias: Parede, São
Domingos de Rana, Cascais, Estoril, Alcabideche e Carcavelos (Figura 8). Cascais é sede de
um município com 99,07 km² de área e 206 479 habitantes. O município é limitado a Norte
pelo município de Sintra e a Este por Oeiras e a Sul e a Oeste tem costa no Oceano Atlântico.
O território é moldado de acordo com o maciço de Sintra, dando a este concelho
características muito específicas a nível climático, geológico e orográfico. Este concelho tem
temperaturas médias (anuais) que rondam os 23º a 25ºC, podendo atingir os 30º a 34ºC junto
ao sopé da serra de Sintra. Os ventos desta região são influenciados pela serra de Sintra. O
vento que atravessa a serra adquire uma forte aceleração no seu movimento descendente em
direção ao sopé Sudoeste da serra de Sintra (Guincho), onde encontra os extensos areais
aquecidos (com vento quente ascendente), e os ventos que contornam o Cabo da Roca,
intensificando desta forma os ventos que chegam às praias do Guincho. Em relação à
pluviosidade, pode-se constatar que em janeiro, em média, chove durante cerca de um terço
do mês, com uma precipitação média de 109 mm. No mês de agosto a precipitação é muito
menos intensa com apenas dois dias de precipitação acima dos 0.1 mm. Em janeiro a
40
Figura 8: Mapa representativo das freguesias do concelho de Cascais. 1 -
Alcabideche; 2 - Cascais; 3 - Estoril; 4 - São Domingos de Rana; 5 - Parede e 6 –
Carcavelos; adaptado de http://www.rea.pt/forum/index.php?topic=20303.0.
quantidade de humidade relativa do ar é muito mais elevada, do que em agosto, embora haja
algumas zonas, próximo do mar que no verão sofrem da advecção matinal de ar marítimo, o
que faz aumentar os valores da humidade do ar. O concelho de Cascais é também
caracterizado por uma extensa rede hidrográfica, com vários cursos de água que atravessam
zonas de habitação e zonas desabitadas como campos de vegetação baixa ou zonas mais
arborizadas. Nas zonas habitadas muitas vezes essas linhas de água são canalizadas ou estão a
céu aberto junto a habitações ou propriedades. O concelho de Cascais apresenta ainda muitas
zonas não construídas com diversos tipos de vegetação desde campos mais arenosos com ou
sem vegetação, a terrenos com maior teor em materiais terrosos e maior densidade vegetal e
de elevada arborização (Câmara Municipal de Cascais, 2013).
41
2.2. População-alvo
A população em estudo foi constituída por gatos do concelho de Cascais, sendo a
amostra retratada por animais “domésticos”, ou seja, que se apresentaram com proprietário no
centro de atendimento médico veterinário (CAMV) e “errantes”, ou seja, que não
apresentavam dono ou que foram recolhidos da rua para posterior adoção.
O rastreio foi realizado no período compreendido entre dezembro de 2011 e
novembro de 2012. Os proprietários dos animais, bem como os responsáveis dos
gatis/sociedades protetoras aderentes, foram informados acerca do estudo e das técnicas a
executar a cada animal tendo sido assinado um consentimento informado autorizando a
participação dos gatos no mesmo (Apêndice I). Para os proprietários de todos os animais
domésticos foi ainda entregue um panfleto informativo (Apêndice II).
O estudo foi aprovado pelas comissões de ética do Instituto de Higiene e Medicina
Tropical (IHMT), Universidade Nova de Lisboa (UNL) e da Faculdade de Medicina
Veterinária, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias (ULHT).
Os animais selecionados para este estudo tinham como único requisito terem mais de
6 meses de idade. As colheitas de sangue periférico foram realizadas pelos médicos
veterinários na sequência da realização de análises clinicas ou de ato cirúrgico em que o
animal estava sedado/anestesiado. O clínico preencheu um inquérito adaptado do Projeto –
“The role of domestic cats in the epidemiology of zoonotic leishmaniasis” a decorrer no
Centro de Malária e outras Doenças Tropicais, IHMT/UNL, onde constavam as informações
relativas a cada animal (idade, sexo, raça, local de residência e deslocações, estilo de vida,
contacto com outros animais, etc.) (Apêndice III). As amostras dos gatos errantes foram
recolhidas aquando da sua entrada nas sociedades protectoras. Os inquéritos foram também
preenchidos pelos clínicos responsáveis com as informações disponíveis. Durante o exame
clínico, e sempre que presentes, os sinais compatíveis com leishmaniose, tais como: lesões
cutâneas, linfadenopatia, perda progressiva de peso, atrofia muscular, anorexia, hipertermia,
letargia, intolerância ao exercício, lesões oculares, epistáxis, onicogrifose, palidez de
mucosas, poliúria/polidipsia, vómito e/ou diarreia e claudicação eram assinaladas.
42
Nos animais eutanaziados, para além de sangue recolheram-se amostras de tecidos
(pele do plano nasal, linfonodo poplíteo, fígado e baço), para pesquisa de ADN parasitário. As
amostras foram retiradas, aleatoriamente, de forma a incluírem quer porções superficiais quer
profundas do órgão.
3. Colheita e processamento do sangue periférico e tecidos
As amostras de sangue periférico foram obtidas a partir de venopunção de veias
periféricas (veia cefálica, veia femoral ou veia jugular), com os cuidados gerais de assepsia. O
volume de sangue recolhido encontrou-se, regra geral, entre os um a dois mililitros (ml), dos
quais, um pequeno volume serviu para impregnar uma área equivalente a 25 mm de diâmetro
de papel de filtro (Whatman® número 3), e o restante foi colocado em tubo sem
anticoagulante para obtenção de soro. As alíquotas de soro e os papéis de filtro referentes a
cada amostra foram devidamente identificados e guardados a -20ºC e a +4ºC, respetivamente,
até posterior utilização. As alíquotas com os fragmentos de tecidos obtidos após necrópsia
foram devidamente identificados e guardados a -20ºC até posterior utilização.
3.1. Extração de ADN de sangue periférico e tecidos
Para a extração do ADN a partir de sangue impregnado em papel de filtro utilizou-se
um método rápido comercial (Kit de extração de ADN genómico Citogene®, Citomed), de
acordo com as instruções indicadas pelo fabricante. Deste modo, utilizaram-se dois discos do
papel de filtro, na zona impregnada de sangue, com uma dimensão de quatro mm de diâmetro
cada, os quais foram a incubar em 150 microlitros (μl) de tampão de lise e 1,5 μl de
Proteinase K, em tubo próprio, durante 15 minutos a +65ºC em banho-maria, seguida de uma
incubação a +55ºC durante duas horas, em placa térmica, invertendo os tubos,
periodicamente, durante essa incubação. Terminada a incubação, retiraram-se os tubos da
placa térmica deixando arrefecer o lisado à temperatura ambiente. Após remoção dos discos,
adicionaram-se 100 μl da solução precipitadora de proteínas, passando o tubo pelo vortex a
velocidade elevada durante 20 segundos para uma boa homogeneização. A mistura foi então
centrifugada a 20817g (Eppendorf Centrifuge 5810 R), durante 15 minutos, a +4ºC,
formando-se um “pellet” compacto de proteína na extremidade do tubo. O sobrenadante
(cerca de 200 μl) foi transferido para uma nova alíquota contendo 300 μl de Isopropanol a
100%. A mistura depois de invertida 50 vezes foi centrifugada a 20817g, 5 min, a +4ºC, e o
sobrenadante dispensado. Adicionaram-se 300 μl de etanol a 70% e, de modo a garantir a
43
lavagem do pellet de ADN, procedeu-se à inversão suave da mistura num total de 20 vezes
posteriormente à qual se realizou uma nova centrifugação a 20817g, por um minuto, a +4ºC.
O sobrenadante foi rejeitado e a alíquota foi colocada aberta, em posição invertida, sobre
papel absorvente, na estufa a +52ºC até que todo o ADN estivesse completamente seco.
Juntaram-se 30 μl de tampão de hidratação de ADN a cada uma das amostras, que foram
mantidas à temperatura ambiente, durante a noite. Na manhã seguinte, o ADN foi guardado a
-20ºC até posterior utilização (Anexo I).
No caso dos tecidos o protocolo de extração iniciou-se com uma pré-preparação da
amostra, nomeadamente a maceração de um fragmento do tecido com um a dois mm de
comprimento em um ml de solução tampão de PBS, com posterior maceramento e
homogeneização da amostra. Em seguida adicionou-se 100 μl do macerado em 500 μl do
tampão de lise e 3 μl de Proteínase K. Após este passo, todos os que se seguiram foram iguais
aos anteriormente descritos para a extração de ADN de amostras de sangue periférico (Anexo
II).
4. Técnicas Moleculares
4.1. Reação de PCR - amplificação de β-Actina Felina
De modo a descartar a presença de fatores de inibição da PCR e/ou de degradação de
ADN utilizou-se como controlo positivo da execução técnica de extração a amplificação do
gene constitutivo codificador da β-actina felina, uma das proteínas do citoesqueleto. O
desenho das sequências de iniciação “primers”, efetuado pela Doutora Sofia Cortes,
investigadora do grupo das leishmanioses da unidade de Parasitologia Médica, IHMT, foi
baseado numa sequência parcial do gene da β-actina da espécie Felis catus (GenBank,
número de acesso: GQ848333) usando o Programa Primer 3 (Whitehead Institute,
Massachusetts Institute of Technology, USA), obtendo assim o “primer” 5’ – Bet-Fel1:
5’CCATTTTCTGTTCCGCCTTA3’, e o “primer” 3’ – Bet-Fel2:
3’CAACGGGCTCCTTAGTCAGA5’, com uma identidade máxima de 100%.
Preparou-se para cada amostra (3 μl de ADN), 22 μl de uma mistura de reação
constituída por 12,3 μl de água ultrapura, 5 μl de tampão de reação, 2 μl de uma solução de
Mg2+
(25mM MgCl2), 0,5 μl de dNTPs (10mM), 1 μl de primers Bet Fel1 e 1 μl de Bet Fel2
(10 picomol (pmol)/μl, cada), e 0,2 μl da enzima polimerase de ADN Taq (5U/μl). Em todas
as amplificações utilizou-se como controlo positivo 3 μl de ADN obtido a partir de uma
44
amostra de baço de gato, e como controlo negativo, água ultrapura em substituição do ADN.
As condições ótimas para as amplificações por PCR foram: desnaturação inicial a +95ºC,
durante 5 min e 35 ciclos de 30 segundos, 30 segundos a +56ºC, (ligação dos primers), 30
segundos (extensão) a +72ºC, e uma extensão final a +72ºC, durante 5 minutos. A
amplificação foi realizada num termociclador (Termocycler Px2) (Anexo III).
Os produtos de amplificação, constituídos por 229 pares de base (pb), foram
visualizados num gel de agarose a 1,5 % em 1X tampão Tris-Acetato-EDTA corado com 0,2
μg/ml de brometo de etídio após eletroforese a 120 volts e 400 miliamperes (mA), durante 60
minutos. Foi aplicado no gel 10 µl da amostra e um marcador de massa molecular de 100 pb
de ADN (Anexo IV).
4.2. Reação de PCR - amplificação de ADN cinetoplastideal (kADN) de
Leishmania sp.
As sequências iniciadoras escolhidas para a pesquisa de ADN de Leishmania foram
os “primers” MC1: 5’GTTAGCCGATGGTGGTCTTG3’ e MC2:
5’CACCCATTTTTCCGATTTTG-3’, desenhados a partir de uma sequência de ADN
cinetoplastideal de L. infantum, e que originam um produto de amplificação de 447 pb (Cortes
et al., 2004).
Preparou-se, para cada amostra (5 μl de ADN), 20 μl de uma mistura de reação
constituída por 5,3 μl de água ultrapura, 5 μl de tampão de reação, 3 μl de uma solução de
Mg2+
(25mM MgCl2), 0,5 μl de dNTPs (10mM), 3 μl de primers MC1 e 3 μl de MC2 (5
pmol/μl, cada), e 0,2 μl da enzima polimerase de ADN Taq (5U/μl). Em todas as
amplificações utilizou-se como controlo positivo 3 μl de ADN genómico de L. infantum e
como controlo negativo água ultrapura em substituição do ADN. As condições ótimas para as
amplificações por PCR foram: desnaturação inicial a +94ºC, durante 2 minutos; seguida de
uma amplificação de 30 ciclos com desnaturação (+94ºC; 20 segundos), ligação dos
“primers” (+60ºC; 20 segundos), e extensão (+72ºC; 30 segundos). Depois do último ciclo a
extensão final decorreu a +72ºC, durante 5 minutos (Anexo V). Os produtos de amplificação
foram visualizados num gel de agarose a 1,5 % como descrito anteriormente. Todas as
preparações das reações de PCR foram realizadas numa área independente, de forma a obviar
possíveis contaminações.
45
4.3. Reação de Nested PCR - amplificação de ADN ribossomal de Leishmania
sp.
As sequências iniciadoras escolhidas para a pesquisa de ADN de Leishmania na
técnica de Nested-PCR na primeira reação foram os “primers” R221:
5’GGTTCCTTTCCTGATTTACG3’ e R332: 5’GGCCGGTAAAGGCC GAATAG3’ e, na
segunda fase os “primers” R223: 5’TCCCATCGCAACCTCGGTT3’ e R333:
5’AAAGCGGGCGCGGTGCTG3’. Estes foram desenhados a partir de uma sequência de
ADN nuclear e ribossomal, respetivamente, de L. infantum, e originam um produto de
amplificação final, após a primeira reação de 603 pb e, após a segunda reação, um produto
final de 358 pb (Eys et al., 1991; Cruz et al., 2002; Di Muccio et al., 2012). Estes “primers”
foram escolhidos atendendo à sua capacidade para aumentar a especificidade e sensibilidade
de deteção de ADN de Leishmania sp..
Para a primeira amplificação preparou-se, para cada amostra (10 μl de ADN), 20 μl
de uma mistura de reação constituída por 8,72 μl de água ultrapura, 6 μl de tampão de reação,
2,4 μl de uma solução de Mg2+
(25mM MgCl2), 0,6 μl de dNTPs (10mM), 1 μl de “primers”
R221 e R332 (10 pmol/μl, cada), e 0,28 μl da enzima polimerase de ADN Taq (5U/μl). Nas
amplificações da primeira fase de Nested-PCR utilizou-se como controlo positivo 5 μl de
ADN genómico de L. infantum e como controlo negativo 10 µl de água ultrapura em
substituição do ADN. As condições ótimas para as amplificações por Nested-PCR foram:
desnaturação inicial a +94ºC, durante 5 minutos; seguida de uma amplificação de 35 ciclos
com desnaturação (+94ºC; 30 segundos), ligação dos “primers” (+60ºC; 30 segundos), e
extensão (+72ºC; 30 segundos). Depois do último ciclo a extensão final decorreu a +72ºC,
durante 10 min. Os produtos de amplificação foram utilizados para uma segunda reação.
Após a primeira fase de amplificação, procede-se à diluição de 1:200, do material
genético obtido (1 μl de produto da primeira amplificação em 199 μl de água ultrapura).
Para a segunda amplificação preparou-se, para cada amostra (5 µl da diluição do
produto da primeira PCR), 20 µl de uma mistura de reação de PCR constituída por 10,36 μl
de água ultrapura, 5 μl de tampão de reação, 2 μl de uma solução de Mg2+
(25mM MgCl2), 0,5
μl de dNTPs (10mM), 1 μl de “primers” R223 e R333 (10 pmol/μl, cada), e 0,14 μl da enzima
polimerase de ADN Taq (5U/μl). Na segunda fase do Nested-PCR utilizou-se como controlo
positivo a diluição do controlo positivo da reação anterior (5 μl) e, dois controlos negativos,
46
um da reação anterior (5 μl) e um novo constituído por 20 μl de mistura e 5 μl de água
ultrapura. As condições ótimas para as amplificações por Nested-PCR foram as seguintes:
desnaturação inicial a +94ºC, durante 5 minutos; seguida de uma amplificação de 35 ciclos
com desnaturação (+94ºC; 30 segundos), ligação dos “primers” (+65ºC; 30 segundos), e
extensão (+72ºC; 30 segundos). Depois do último ciclo a extensão final decorreu a +72ºC,
durante 10 minutos (Anexo VI). Os produtos de amplificação foram visualizados num gel de
agarose a 1,5 % como descrito anteriormente.
A preparação das reações de PCR e a diluição dos produtos de PCR obtidos na 1ª
PCR foram realizadas em áreas independentes, de forma a obviar possíveis contaminações.
5. Técnicas serológicas
5.1. Técnica de Aglutinação Direta (DAT)
Ao antigénio liofilizado (5x107 parasitas/ml) (Kit Biomedical Research) adicionou-
se 5 ml da solução de soro fisiológico a 0,9%. A execução do teste passou pela adição de 100
μl/poço da solução de diluição (0,9 g NaCl/100ml H2O contendo 0,780 µl de 2-
mercaptoetanol), na primeira coluna das microplacas de 96 poços com fundo cónico, e de 50
μl/poço nas colunas seguintes. Após adição de 4 μl do soro a testar (1:25) no primeiro poço de
cada linha, realizaram-se diluições seriadas de 1:2 (1:25, 1:50; 1:100; 1:200) nos quatro poços
seguintes. Os poços de G9-G12 e H9-H12 foram utilizados como controlo positivo e
negativo, respetivamente, usando soros com titulação previamente conhecida. Depois de
efetuadas todas as diluições, foram adicionados 50 μl do antigénio reconstituído a cada poço.
Após 18 horas de incubação à temperatura ambiente, os resultados foram lidos a olho nú
sobre um fundo branco. Consideram-se positivos os soros com reação de aglutinação na
diluição igual ou superior a 1:100 (Cardoso et al., 2010) (Figura 9).
Nas amostras em que se obtiveram títulos iguais ou superiores a 1:100 fez-se uma
segunda DAT desta vez até à diluição 1:800. A avaliação da reação foi realizada como
descrita anteriormente (Anexo VII).
47
5.2. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
5.2.1. Kit Comercial Bordier
A técnica de ELISA foi realizada de acordo com as instruções fornecidas (Bordier
Affinity Products SA) (Figura 10). Antes de se aplicarem os soros a testar, procedeu-se à
incubação dos 96 poços de fundo plano da placa, previamente sensibilizada com antigénio
solúvel de L. infantum, com tampão TBS-Tween previamente diluído 1:10, durante 15
minutos à temperatura ambiente. Após remoção do tampão foram adicionados 100 µl das
amostras padrão (controlo negativo, controlo com fraca positividade e controlo fortemente
positivo fornecidos pelo fabricante e três soros de gatos residentes em regiões não endémicas
de leishmaniose) e das amostras a testar diluídas 1:200 em TBS-Tween. As amostras foram
incubadas durante 30 minutos a +37ºC. Depois de 4 lavagens, foram adicionados 100 µl/poço
de proteína alcalina A marcada com fosfatase, diluída a 1:50 em TBS-Tween. Após incubação
durante 30 minutos a +37ºC, procedeu-se a 4 lavagens e à adição e incubação durante 30
minutos do substrato. A reação foi então bloqueada com a adição de 100 µl de solução de
bloqueio (K3PO4) e a absorvância lida a 405 nm em espectrofetómetro de microplacas
Figura 9: Ilustração representativa do Teste de aglutinação direta. Círculos
vermelhos indicam a localização do controlo positivo e os círculos amarelos indicam
o controlo negativo; Quadrado verde indica uma amostra positiva e o quadrado lilás
indica uma amostra negativa.
Pedro Pinto
48
Figura 10: Imagem representativa do kit de ELISA Bordier
Affinity Products.
Pedro Pinto
(Anthos 2010) (Anexo VIII). Considerou-se como valor de significância, cut-off, a média das
absorvâncias dos soros de gatos residentes em regiões não endémicas mais 4 vezes o desvio
padrão.
5.2.3. Kit Comercial LeisScan – LEISHMANIA ELISA TEST
O teste comercial LeisScan (Figura 11) é um ensaio imunoenzimático útil para
deteção de infeção em cães assintomáticos ou no controlo da variação de anticorpos
circulantes em animais sob terapêutica. Para este ensaio, foram selecionados, aleatoriamente,
soros de felinos considerados positivos nas outras técnicas serológicas (DAT, ELISA kit
Bordier Affinity products) com o objetivo de avaliar a eficácia do teste na deteção de
anticorpos anti-Leishmania em gatos.
A técnica de ELISA foi realizada de acordo com as instruções fornecidas (LeisScan®
LEISHMANIA ELISA TEST - Esteve). O procedimento iniciou-se com a adição de 100 μl de
amostra e controlos previamente preparados, na diluição de 1:20 (10 µl de soro em 190 µl de
solução de diluição fornecida pelo kit), incubando-se em seguida as amostras 10 minutos à
temperatura ambiente. Em seguida procedeu-se a 5 lavagens, com solução de lavagem
49
Figura 11: Imagem representativa do kit de LeisScan Leishmania
ELISA test.
Pedro Pinto
fornecida pelo fabricante. De seguida adicionou-se a solução de conjugado. Após incubação
durante 5 minutos à temperatura ambiente procedeu-se a 5 lavagens e à adição e incubação
durante 10 minutos de 100 µl/poço de substrato à temperatura ambiente, sob proteção da luz.
Por fim bloqueou-se a reação, com solução stop, fornecida com o kit e, de seguida fez-se a
leitura das absorvâncias num espectrofotómetro a 450 nm. O resultado é obtido através da
razão da absorvância da amostra dividida pela absorvância do controlo positivo fraco sendo
positivo se a razão for superior a 1,1 e negativo se inferior a este valor (Anexo X).
5.4. ELISA in house
Para a preparação de antigénio figurado foram utilizadas formas promastigotas da
estirpe MHOM/PT/88/IMT151 de Leishmania infantum MON-1.
De forma a obter um número elevado de formas promastigotas, os parasitas foram
cultivados em meio líquido de alto rendimento, incubando a +24ºC: meio Schneider (Sigma),
suplementado com soro fetal bovino (Biochrom) a 20% (v/v), previamente inativado pelo
calor (30 minutos a +56ºC), e gentamicina 50 mg/ml (Sigma). O antigénio foi preparado a
partir das culturas a uma concentração de 108
parasitas/ml. A contagem de parasitas foi
efetuada em hemacitómetro de Neubauer ao microscópio ótico e os promastigotas foram
recolhidos na fase estacionária de crescimento e centrifugados a 925g 15 minutos a +4ºC. O
sedimento de promastigotas foi ressuspendido em 1 ml de PBS e conservado a -20ºC até
utilização.
50
Previamente à preparação das placas procedeu-se à centrifugação dos parasitas a
20817g durante 10 minutos a +4ºC e, após rejeição do sobrenadante, ressuspendeu-se o pellet
em 10 ml do tampão de carbonato-bicarbotnato (pH 9,6).
O ensaio de ELISA in house foi realizado em placas Maxisorp de 96 poços de fundo
plano, as quais forma sensibilizadas com 1x106 parasitas/poço. Após incubação durante duas
horas a +37ºC adicionaram-se 100 µl/poço de tampão de bloqueio (leite em pó magro em
PBS-Tween a 6%). Após se rejeitar a solução anterior, foram adicionados nos poços de A-1 a
G-11 100 µl das amostras a testar (na diluição de 1:200). Nos poços H-11 a B-12
adicionaram-se soros de gatos de uma região não endémica e nos poços F-12 a H-12
adicionaram-se os controlos negativo, de positividade fraca e positividade forte do kit
Bordier. Os poços C-12 a E-12 foram utilizados como controlo de reação. Todas as amostras
diluídas a 1:200 (em leite magro em PBS-Tween a 2%) foram incubadas durante 1 hora a
+37ºC. Depois de 3 lavagens, foram adicionados 100 µl/poço do conjugado (AntiCat IgG,
AbDserotec, 1mg/ml) e, após incubação durante 1 hora a +37ºC procedeu-se a 4 novas
lavagens.
De seguida adicionaram-se 100 μl/poço do substrato, constituído por uma solução de
Na2HPO4.12H2O e C6H8O7 (pH 5,5) à qual se adicionou o-Phenylenediamine dihydrochloride
(OPD) e H2O2 a 30%, e incubou-se a placa no escuro durante um período máximo de 5
minutos. A reação foi então bloqueada com a adição de 100 µl de ácido sulfúrico a 10% e a
absorvância lida a 492 nm em espectrofotómetro de microplacas (Bio Rad Model 550
microplate reader) (Figura 12) (Anexo IX). O valor de significância foi calculado como
descrito anteriormente.
51
Figura 12: Imagem representativa da técnica de ELISA in house; A1 – H10
amostras a testar, H11 – B12 controlos negativos (soros felinos provenientes de uma
região não endémica), C12 – E12 controlos de reação (poços em branco), F12 – H12
controlos negativo, positivo fraco e positivo forte respetivamente.
Pedro Pinto
5.5. Teste de Imunofluorescência indireta (IFI)
O antigénio figurado foi preparado a partir de formas promastigotas de L. infantum
em cultura como descrito anteriormente (em 5.4 ELISA).
Após centrifugação a 925g durante 10 minutos a +4ºC e lavagem com soro
fisiológico 0,9%, os parasitas foram contados em hemacitómetro de Neubauer e a suspensão
foi ajustada de modo a se obter uma concentração de 1x107 promastigotas/ml. O antigénio, no
volume de 25 µl/círculo, foi depositado nas lâminas de imunofluorescência com 10 círculos
(Biomérieux), que se colocaram em estufa a +37ºC na presença de um ventilador, para
facilitar a evaporação rápida do líquido, mantendo a distribuição uniforme dos promastigotas
no círculo.
52
Após secagem do antigénio as lâminas sensibilizadas foram conservadas a -80ºC.
Anteriormente à sua utilização, as lâminas foram colocadas à temperatura ambiente, sendo
posteriormente mergulhadas em acetona por 10 minutos para fixação do antigénio. De seguida
foram removidas da acetona e secas ao ar. Os soros a testar e os controlos positivo e negativo,
com titulação previamente conhecida, foram diluídos (1:8) em progressão geométrica em PBS
a pH7.2, aplicados a cada poço (25 µl) e incubados a +37ºC, em câmara húmida, durante 30
minutos. Após se retirar as lâminas da estufa, rejeitaram-se as gotas de soros diluídos por
meio de jato de tampão, emergindo-se de seguida as lâminas no tampão de PBS durante 10
minutos, após os quais foram secas ao ventilador. Depois de secas, colocou-se 25 µl de
conjugado (AntiCat IgG FITC, Sigma) diluído em solução azul de Evans (Sigma) (1:100000
de azul de Evans em PBS) em cada poço. Procedeu-se à lavagem e incubação em câmara
húmida, durante meia hora, finda a qual se rejeitou o excesso de conjugado e colocou-se em
PBS durante 10 minutos. Após montagem com glicerina tamponada (1:10) e lamela,
procedeu-se à leitura em microscópio de fluorescência (Nikon 80i) com filtro ultravioleta
(objetiva de 40X), no comprimento de onda 475 nm, em que no caso de reação positiva os
promastigotas mostram fluorescência verde (Figura 13). A ausência de anticorpos anti-
Leishmania carateriza-se por um campo ótico obscurecido, promastigotas pouco visíveis e/ou
avermelhados. Para a realização desta técnica era essencial um controlo positivo da reação
mas, como a seroteca do IHMT não possuía um soro de gato com elevado título, foi
necessário utilizar um controlo positivo de um cão com elevado título de cerca de 1:2048
tendo-se utilizado como conjugado um anticorpo anti-canino (AntiDog IgG FITC, Sigma)
(Anexo XI). Consideraram-se positivas as amostras de gato que demonstraram fluorescência
verde, uma vez que não existe um limiar de positividade definido.
Figura 13: Imagens ilustrativas da técnica IFI. 1 – Diluição de 1:257 e 2 –
Diluição de 1:512.
Pedro Pinto
53
6. Análise estatística
O cálculo para a amostra desta pesquisa foi realizado de acordo com Thrusfield,
(2005). A análise estatística foi realizada usando o programa SPSS 20.0 para o Windows. O
teste não paramétrico Qui-quadrado foi o teste escolhido para relacionar os resultados
serológicos e moleculares com as variáveis em estudo origem (doméstico ou errante), idade,
sexo (Macho/Fêmea/Inteiro/Castrado), raça, pelagem, estilo de vida, convivência com outros
animais, deslocações, uso de inseticidas, desparasitações, vacinação, sinais clínicos, infeção
por FIV/FeLV. Todavia, quando não estavam reunidas as condições para a realização do
mesmo, o Teste Exato de Fisher foi utilizado, usando um nível de significância de 5% (p
<0,05).
Foram também determinadas a sensibilidade e a especificidade das técnicas utilizadas
usando como “gold standard” o nested-PCR assim como valores preditivos positivo e
negativo das mesmas.
54
10,8%
8,8%
23,0%
21,6%
13,2%
22,5% Alcabideche
Carcavelos
Cascais
Estoril
Parede
São Domingos de Rana
Figura 15: Distribuição dos gatos por freguesia (frequência relativa n=204)
7. Resultados
7.1. Caracterização da amostra
A amostra em estudo corresponde a um total de 204 gatos provenientes do concelho
de Cascais, 100 (49,0%) domésticos e 104 (51,0%) errantes (Figura 14).
A distribuição geográfica da amostra pelas 6 freguesias do concelho está organizada
do seguinte modo: Alcabideche é representada por 22 (10,8%) animais, Carcavelos por 18
(8,8%), Cascais por 47 (23,0%), Estoril por 44 (21,6%), Parede por 27 (13,2%) e São
Domingos de Rana por 46 (22,5%) gatos (Figura 15).
49,0%
51,0%
Domésticos
Errantes
Figura 14: Distribuição da amostra entre gatos domésticos e
errantes (frequência relativa n=204).
55
44,6%
43,6%
8,8% 2,9%
Jovem
Adulto
Sénior
Desconhecido
Figura 18: Distribuição da amostra por faixa etária, “jovem”, “adulto”, “sénior”
(frequência relativa n=204).
Relativamente ao género, 54,4% (111/204) dos animais eram do sexo feminino e
45,6% (93/204) eram do sexo masculino (Figura 16); 68,5% das fêmeas e 65% dos machos
eram inteiros, 30,6% das gatas e 28% dos gatos encontravam-se esterilizados e em 3 animais,
uma fêmea e dois machos não se conhecia o seu estado fértil (Figura 17).
As idades doa animais foram agrupadas em intervalos, de acordo com o descrito por,
Cardoso et al. (2010), correspondendo à categoria “jovem” os animais com idade
compreendida entre os 6 meses e 12 meses de idade, a “adulto” os animais de 1 ano até aos 7
anos, e a “sénior” os animais com mais de 7 anos. O intervalo de idades da população em
estudo variou entre os 6 meses e os 192 meses (16 anos). A distribuição da amostra pelas
faixas etárias descritas foi a seguinte, 44,6% (91/204) ao grupo “jovem”, 43,6% (89/204) ao
“adulto” e 8,8% (18/204) ao “sénior”. Em 2,9% (6/204) não foi possível estimar a idade
(Figura 18).
54,4%
45,6% Fêmeas
Machos
Figura 16: Distribuição da amostra
entre géneros (frequência relativa
n=204).
68,5%
30,6%
0,9%
65,0%
28,0% 2,1%
Fêmeas inteiras
Fêmeas esterilizadas
Fêmeas ND
Machos inteiros
Machos esterilizados
Machos ND
Figura 17: Distribuição da amostra por estado fértil
(frequência relativa n=204); ND – Não determinado.
56
A raça Europeu Comum foi a mais representativa da amostra com 186 (91,2%)
exemplares, sendo os outros animais pertencente às raças Bosques da Noruegua (n=1; 0,5%),
Persa (n=9; 4,4%) e Siamês (n=8; 3,9%) (Figura 19). Dez (4,9%) animais apresentavam
pelagem comprida, 14 (6,9%), pelagem média e 152 (74,5%) pelo curto, não estando esta
informação disponível nos questionários de 28 (13,7%) dos gatos (Figura 20).
Relativamente ao estilo de vida 57 (27,9%) dos animais permaneciam
exclusivamente no interior de casa (casa), 19 (9,3%) vivia maioritariamente no interior das
habitações com algum acesso ao exterior (casa + rua), 15 (7,4%) permaneciam igual tempo no
interior e no exterior (casa = rua), seis (2,9%) passavam mais tempo no exterior (rua + casa) e
103 (50,5%) viviam exclusivamente no exterior (rua). Em quatro (2,0%) dos animais não foi
referido o seu estilo de vida (Figura 21).
91,2%
0,5% 4,4% 3,9%
Europeucomum
Bosque danoruegua
Persa
Siamês
Figura 19: Distribuição da amostra entre
as raças referidas no inquérito (frequência
relativa n=204).
4,9% 6,9%
74,5%
13,7% Pelagemcomprida
Pelagemmédia
Pelagemcurta
Não definido
Figura 20: Distribuição da amostra de
acordo com o tamanho de pelagem
(frequência relativa n=204).
27,9%
9,3%
7,4% 2,9%
50,5%
2,0%
Casa
Casa + Rua
Casa = Rua
Rua + Casa
Rua
Desconhecido
Figura 21: Distribuição da amostra de acordo com o estilo de vida
(frequência relativa n=204).
57
146 (71,6%) dos gatos em estudo contatavam com outros animais da mesma espécie
ou de outras espécies, 26 (12,7%) não conviviam com nenhum outro animal e em 32 (15,7%)
animais não foi possível obter esta informação.
No que respeita a desparasitações, 75 (36,8%) dos animais não realizavam qualquer
tipo de profilaxia antiparasitária (interna e/ou externa), quatro (2,0%) faziam apenas
desparasitação interna, 84 (41,2%) faziam quer desparasitação interna quer externa e em 41
(20,1%) dos gatos não foi possível obter os dados relativos às desparasitações.
Em relação à vacinação conclui-se da amostra de gatos domésticos que, 54 (54,0%)
dos animais recebiam vacinação trivalente (panleucopenia, rinotraqueíte, calicivirose), 10
(10,0%) faziam vacinação trivalente e Chlamydophila e cinco (5,0%) faziam a vacinação
profilática para a leucemia felina – FelV. Apenas um (1,0%) animal fazia a vacinação anti-
rábica. Dos animais errantes não se conhecem possíveis históricos de vacinações.
Relativamente à presença de vírus imunossupressores felinos, 113 (55,4%) dos
animais não tinham FIV nem FelV, 10 (5,4%) animais tinham FIV, três (2,0%) FelV e, um
(0,5%) encontrava-se co-infetado com ambas retroviroses. 77 (37,7%) dos felinos não foram
testados ou não tinham informação em relação a estas patologias (Figura 22).
Oito dos 204 animais apresentaram sinais clínicos, nomeadamente lesões cutâneas
(Figura 23), alopécia, linfadenomegália, vómitos e diarreia como descritos na tabela 3.
4,9% 1,5% 0,5%
55,4%
37,7%
FIV
FelV
FIV+FelV
S/ Doença
S/ Teste
Figura 22: Prevalência de retroviroses (FIV e FelV) na amostra
(frequência relativa n=204).
58
Tabela 3: Sinais clínicos apresentados pelos gatos da amostra.
Figura 23: Fotografia de lesões cutâneas observadas num gato doméstico fêmea (D91) que passava a maior parte do tempo fora de casa.
Ped
ro P
into
Identificação Sinais clínicos Caraterização das lesões / Diagnóstico
D14 Alopecia /
Linfadenopatia
Alopecia generalizada e linfadenomegalia submandibular.
D52 Alopecia Dermatite miliar abdominal.
D54 Alopecia Alopecia auricular com massa na extremidade do pavilhão
diagnosticado como carcinoma.
D55 Alopecia Alopecia auricular com presença de feridas e crostas.
D57 Vómito / diarreia
D64 Alopecia / Linfadenopatia Alopecia auricular com presença de feridas e crostas.
D79 Linfadenopatia /
Diminuição do apetite /
Febre / Intolerância ao
exercício / vómito /
diarreia
Diagnóstico de colangiohepatite, pancreatite e pneumonia.
D91 Alopecia / Linfadenopatia /
Letargia
Perda de pelo e feridas exuberantes ao nível do pescoço de difícil
cicatrização.
D: doméstico
59
Em termos de movimentações apenas foi possível obter esta informação em oito
(3,9%) dos animais, três (1,5%) deslocaram-se para a Marinha Grande, um (0,5%) para o
Algarve e um (0,5%) para Pombal. Em três (1,5%) animais não foi possível determinar qual o
local para onde se deslocavam.
7.2. Rastreio de Leishmania sp. em Felis catus domesticus
Através da DAT detetaram-se anticorpos anti-Leishmania sp. em 23 (11,3%) dos
soros felinos tendo o título variado entre 100 e 800 (100, n=7; 200, n=14; 400,n=1; 800, n=1)
(Apêndice IV).
Através da técnica de ELISA Bordier®, e ELISA in house detetaram-se anticorpos
específicos anti-parasita em 24 (11,8%) e seis (2,9%) dos gatos, respetivamente, enquanto
através do kit LeisScan®, após seleção de gatos positivos noutras ténicas, um dos seis animais
testados foi considerado positivo (Apêndice IV).
A presença de anticorpos fluorescentes foi observada em 25 (12,3%) dos animais
tendo o título variado entre 8 e 32 (8, n=2; 16, n=21; 32,n=2) (Apêndice IV).
O gene da β-actina felina foi amplificado em todas as amostras (Figura 24). Não se
amplificou o ADN de Leishmania através da PCR convencional, enquanto a técnica de
Nested-PCR permitiu a deteção de ADN do parasita em dez (4,9%) animais (Figura 25). Dois
dos animais apresentavam positividade a mais do que uma técnica serológica.
Devido ao tropismo viscero-cutâneo de L. infantum, nos animais eutanaziados (D79 e
E83) forma recolhidos amostras de linfonodo, baço, fígado, pele e sangue (Alvar et al., 2004;
Maia, 2008; revisto por Maia & Campino, 2008), que apesar de melhorarem a sensibilidade
na deteção de material genético não se verificou qualquer presença de ADN ou anticorpos
anti-Leishmania nestes gatos.
Pedro Pinto
60
Figura 24: Imagem representativa de amplificação de β-actina felina, a demonstrar o
sucesso das extrações de ADN dos papéis de filtro. MM: marcador molecular 100 pb; 1 a
15: amostras; CN: controlo negativo; CP: controlo positivo.
Pedro Pinto
Figura 25: Imagem representativa da deteção de material genético por eletroforese após a
técnica de nested-PCR. MM: marcador molecular 100 pb; GD12 a 80 e GE7 a 98
amostras; CN2: controlo negativo da 2ª reação de n-PCR; CN1: controlo negativo 1ª
reação; CP: controlo positivo.
Pedro Pinto
7.3. Determinação da prevalência de Leishmania sp.
A prevalência global da infeção por Leishmania sp. obtida neste estudo foi de 9,8%
(20/204), considerando como positivos todos os gatos com duas técnicas serológicas e/ou
PCR positivas.
61
7.4. Caraterização dos gatos infetados por Leishmania sp.
Pela técnica de Nested-PCR amplificou-se o ADN do parasita em 10 animais, quatro
domésticos e seis errantes. Desta amostra sete eram fêmeas (quatro inteiras e três
esterilizadas), e três machos inteiros. Três dos animais infetados tinham menos de um ano,
seis animais tinham idades compreendidas entre um e sete anos e um gato mais de 7 anos.
Todos os animais pertenciam à raça Europeu Comum, sete apresentavam pelagem curta e um
pelagem média; em dois dos animais não foi possível obter esta informação. Nove dos felinos
conviviam com outros gatos e cães e um não contatava com nenhum outro animal.
Relativamente ao estilo de vida, dois dos animais em que se detetou ADN de Leishmania no
sangue periférico viviam exclusivamente em casa, sete tinham acesso ao exterior por longos
períodos de tempo enquanto num deles não foi possível obter informação acerca do seu modo
de vida. Dos animais supracitados, quatro eram desparasitados interna e externamente com
regularidade, três não recebiam qualquer terapia antiparasitária e três não apresentavam
elementos sobre o uso de ecto ou endoparasiticidas. Três dos gatos encontravam-se vacinados
contra a panleucopenia, herpesvírus e calicivírus, quatro não recebiam imunoprofilaxia e
outros três não apresentavam dados relativos ao esquema vacinal. Dos dez animais apenas um
(D78) estava co-infetado com FIV. Nenhum dos animais apresentava sinais clínicos
(sistémicos ou localizados) compatíveis com infeção por Leishmania sp..
Dos 10 animais com duas técnicas serológicas positivas, sete eram domésticos e três
eram errantes. Desta amostra sete eram fêmeas (seis esterilizadas e uma inteira) e três machos,
um inteiro e dois esterilizados. As idades dos animais seropositivos compreendiam entre os
oito meses e os 10 anos. Nove dos gatos pertenciam à raça Europeu Comum com pelagem
curta e um à raça Persa com pelagem comprida. Seis dos felinos conviviam com outros gatos
e com animais de outra (s) espécie (s), um não contatava com nenhum animal e em três gatos
não foi possível obter essa informação. Relativamente ao estilo de vida, quatro dos felinos
permaneciam unicamente em casa, um tinha acesso ao exterior passando a maioria do tempo
no interior, dois permaneciam igual período em casa e no exterior e três viviam unicamente
no exterior. Dos animais supracitados, seis eram desparasitados interna e externamente com
regularidade, um apenas recebia profilaxia antiparasitária interna, um outro não recebia
qualquer terapia antiparasitária e dois não apresentavam elementos sobre o uso de ecto ou
endoparasiticidas. Dois dos gatos encontravam-se vacinados contra a panleucopenia,
herpesvírus e calicivírus, um fazia vacinação contra panleucopenia, herpesvírus, calicivírus,
62
Tabela 4: Sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo e negativo das técnicas
serológicas utilizadas.
Chlamydophila e leucemia felina, quatro não recebiam imunoprofilaxia e outros três não
apresentavam dados relativos ao esquema vacinal. Em nenhum dos animais existiam dados
relativos a co-infeção com FIV ou FelV. Não foram observados sinais clínicos (sistémicos ou
localizados) compatíveis com infeção por Leishmania sp. nos 10 animais seropositivos.
Após avaliação estatística não se encontraram associações significativas (p<0,05)
entre a variável infeção por Leishmania (Nested-PCR ou duas técnicas serológicas) e as
demais variáveis analisadas nomeadamente, origem (doméstico ou errante), idade, género
(macho/fêmea/inteiro/esterilizado), raça, pelagem, estilo de vida, convivência com outros
animais, deslocações, uso de inseticidas, desparasitações, vacinação, sinais clínicos e infeção
por FIV/FeLV.
7.5. Determinação da Sensibilidade, especificidade, Valor Preditivo Positivo
(VPP) e Valor Preditivo Negativo (VPN) das técnicas serológicas
utilizadas.
Utilizando a técnica de Nested-PCR como referência, determinou-se a sensibilidade,
a especificidade, o VPP e o VPN das diferentes técnicas de Nested-PCR e serológicas (Tabela
4).
Técnicas DAT EK EIH IFI
Sensibilidade
9% 13% 17% 4%
Especificidade
96% 96% 95% 95%
VPP
20% 30% 10% 10%
VPN
89% 89% 97% 89%
DAT: Técnica de aglutinação direta; EK: ELISA kit comercial; EIH: ELISA in house; IFI:
imunofluorescência indireta; VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo.
63
8. Discussão
A leishmaniose zoonótica causada por L. infantum é um grave problema de Medicina
Veterinária e de Saúde Pública na bacia do Mediterrâneo e na América do Sul. Apesar do cão
ser considerado o principal hospedeiro e reservatório doméstico da leishmaniose visceral
humana, nos últimos anos o número de casos de LFel tem aumentado levantando questões
acerca da importância dos gatos na epidemiologia da doença. Segundo alguns autores, os
felinos domésticos e peridomésticos podem atuar como reservatórios em áreas endémicas.
(Maroli et al., 2007; Silva et al., 2010; Campino & Maia, 2012)
De modo a conhecer a prevalência da infeção por Leishmania em gatos residentes no
concelho de Cascais foi estudada uma amostra de 204 animais (domésticos e errantes) com
mais de seis meses de idade através de técnicas serológicas (DAT, ELISA, IFI) e de técnicas
moleculares (PCR convencional e Nested-PCR). O kits comerciais LeisScan® e Bordier®
utilizados no diagnóstico de LCan foram também avaliados de modo a verificar se poderiam
ser utilizado no diagnóstico da infeção por Leishmania em gatos.
Neste estudo foram testadas duas ELISA comerciais (Bordier®, Leisscan®) utilizadas
no diagnóstico de LCan. O kit comercial Bordier® ao utilizar o conjugado a proteína A,
permitiu a deteção de anticorpos séricos em diferentes espécies animais, permitindo assim
avaliar a sua performance na deteção de anticorpos específicos em gatos. Os resultados
obtidos demonstram que ambas as técnicas são capazes de detetar a produção de anticorpos
felinos anti-Leishmania de forma eficiente.
O diagnóstico precoce das infeções por Leishmania sp. é de elevada importância, uma
vez que permite evitar o desenvolvimento de sinais clínicos ou mesmo a morte do paciente e
serve também como medida de controlo (Maia, 2008).
Hoje em dia, as organizações de saúde pública recomendam a realização de pelo
menos dois testes serológicos, com base em metedologias diferentes, para a deteção e
confirmação de infeção por Leishmania sp., uma vez que não existe um teste 100% sensível e
específico (OMS, 2010). Como tal, neste trabalho apenas se consideraram positivos os
animais com uma técnica molecular e/ou duas técnicas serológicas positivas tendo-se obtido
uma prevalência global da infeção por Leishmania sp. de 9,8% (20/204).
64
Nove das dez amostras onde se amplificou ADN parasitário provinham de gatos cujas
colheitas das amostras tinham sido efetuadas fora do período de transmissão do parasita, entre
maio a outubro, pelo que se poderá considerar que estes animais se encontravam
“verdadeiramente” infetados. Por outro lado, a décima amostra considerada positiva por PCR,
correspondia à amostra de sangue do gato D78 colhida em agosto (isto é, durante o período de
atividade flebotomínica), pelo que a presença de ADN de Leishmania durante o período de
transmissão do parasita poderá apenas significar contaminação natural ou infeção transiente.
Nos sete animais (D80, D12, E7, E9, E91, E96 e E98) em que apenas se detetou
material genético do parasita, pode considerar-se a hipótese de se tratar de infeções recentes,
em que ainda não tenha havido produção de anticorpos específicos, ou que estes não sejam
detetáveis pelas técnicas utilizadas. A não produção ou o baixo nível de anticorpos poderá
estar ainda relacionada com o fato da forma clínica mais comum em gatos ser a cutânea e não
a visceral, evitando a disseminação sistémica dos parasitas e a consequente produção de
anticorpos (Solano-Gallego et al., 2007; Cardoso et al., 2010; Maia & Campino, 2011).
Os outros três animais em que se amplificou ADN do parasita (D32, D78 e E16), eram
seropositivos, sugerindo que a infeção já não seria muito recente ou que teriam contato
frequente com o agente no ambiente onde viviam.
Neste trabalho detetaram-se anticorpos anti-Leishmania sp. em 23 dos animais pela
técnica de DAT, 25 por IFI, 23 por ELISA comercial e seis por ELISA in house. Embora a
produção de anticorpos em resposta à presença do parasita por parte do sistema imunitário
felino não seja tão exuberante como nos cães, não se pode descartar a hipótese dos animais
deste estudo que apenas foram seropositivos não se encontravam infetados, uma vez que, tal
como referido anteriormente, o sangue periférico não ser a amostra mais sensível para detetar
Leishmania. Por outro lado, a deteção de anticorpos num animal não significa que este esteja
infetado, demonstra apenas que teve contato com o agente (Martín-Sanchez et al., 2006). Há
ainda a possibilidade de terem ocorrido reações cruzadas pela presença de anticorpos para
outros agentes, vacinas ou outras patologias não observáveis.
65
Pela mesma razão, ou seja, a não necessidade de utilização de um anticorpo anti-
espécie específico faz com que a DAT seja uma técnica frequentemente utilizada na
determinação de anticorpos anti-parasita em diferentes espécies de hospedeiros vertebrados.
Neste estudo, o número de animais considerados positivos através desta técnica foi superior
ao dos trabalhos realizados por outros autores (Cardoso et al., 2010; Carreira, 2012; Ramos,
2012). Embora a técnica ELISA in house, não tenha sido tão sensível na deteção dos animais
considerados seropositivos pelas outras técnicas, a produção do antigénio em condições
laboratoriais torna-a mais económica que testes comerciais, potenciando a sua utilização em
trabalhos epidemiológicos futuros, em que a amostra seja de grande dimensão. Relativamente
à IFI, os resultados obtidos foram bastante diferentes nos obtidos por outros autores, (Faria,
2008; Duarte et al., 2010; Garrido, 2012); dos 25 soros que apresentaram fluorescência,
apenas dois apresentavam uma titulação (1:32) considerada como positiva nos outros estudos
evidenciando a necessidade de otimizar o valor de significância desta técnica de modo a
permitir a comparação de resultados entre laboratórios.
A prevalência obtida neste estudo é superior à observada por Cardoso et al. (2010)
para a região Norte de 2,8% e às prevalências de 4,6%, 8,4% obtidas nas regiões de Olhão,
Lisboa, respetivamente (Carreira, 2012; Ramos 2012). Contudo é inferior ao obtido por
Garrido (2012) de 16,8% no conjunto Lisboa/Viseu. A discrepância entre as prevalências
observadas entre os estudos, todos realizados em regiões endémicas de leishmaniose, poderá
estar relacionada com a sensibilidade e especificidade das diferentes metodologias utilizadas
na deteção de anticorpos e/ou do parasita. Por outro lado, a prevalência da infeção oscila ao
longo dos anos estando relacionada com a atividade flebotomínica (diretamente
condicionadas pelas condições climáticas) e com o número de vetores infetados.
Após a avaliação estatística não foi possível aferir fatores de risco associados à
infeção por Leishmania sp. Contudo, o fato do número de gatos domésticos considerados
positivos (n=11) ser superior ao número de animais errantes (n=9), poderá estar relacionado
com o estilo de vida dos gatos com proprietário, que tinham acesso ao exterior por longos
períodos de tempo ou períodos específicos do dia, potenciando assim o contato com o vetor e,
por conseguinte com Leishmania sp.. Embora a maioria dos autores não encontre relação
entre a prevalência da doença e o género (Solano-Gallego et al., 2007; Diaknou et al., 2009),
14 dos gatos infetados eram fêmeas e seis eram machos corroborando os resultados obtidos
66
por Pennisi (2002). Contudo, a maior suscetilidade do sexo feminino verificada neste estudo
poderá estar relacionada com o fato de amostra ser constituída predominantemente por fêmeas
(111/204). Cinco dos animais tinham menos de doze meses, 12 tinham entre um e sete anos e
os outros dois tinham mais de sete anos. De fato, os animais mais velhos (i.e. com mais de
dois anos de idade) têm maior probabilidade de serem infetados por Leishmania, uma vez que
tiveram mais tempo, que os animais jovens, de exposição ao inseto vetor (Cardoso et al.,
2010; Maia & Campino, 2011). Para uma melhor averiguação da influência do sexo, idade, e
origem (doméstico ou errante), será necessário saber a distribuição dos géneros na população
e a amostra estudada deverá ser representativa da população de onde provém. 186 dos animais
pertenciam à raça Europeu comum e apresentavam pelagem curta, possivelmente porque esta
raça foi a mais prevalente na amostra, e porque os flebótomos preferem alimentar-se em zonas
glabras do corpo (Killick-Kendrick, 1999). O efeito protetor da permanência, em casa não
pôde ser avaliado pois a maioria dos animais da amostra tinham acesso ao exterior. Alguns
autores (Rufenacht et al., 2005; Martin-Sanchez et al., 2006) referem que fatores
imunodepressores tais como FIV e FelV estão associados ao aparecimento da doença, mas
neste estudo apenas um animal estava co-infetado com FIV (D78) e, outros animais da
amostra infetados ou co-infetados com FIV, FelV foram negativos para a pesquisa de
Leishmania.
Neste estudo foram também calculados os valores de sensibilidade e especificidade
das técnicas (utilizando a Nested-PCR como referência), de modo a determinar a eficácia das
técnicas serológicas na deteção de anticorpos anti-Leishmania dos gatos da amostra. De um
modo geral, as técnicas serológicas demonstraram uma baixa sensibilidade da deteção dos
animais verdadeiramente positivos (i.e. que contataram/estão infetados com o parasita) mas
uma elevada especificidade, detetando os animais verdadeiramente negativos (i.e. que não
contataram com o agente).
Por conseguinte, os resultados obtidos neste estudo estão de acordo com o descrito
na literatura (Solano-Gallego et al., 2007; Diakou et al., 2009; Cardoso et al., 2010),
nomeadamente no que diz respeito à resposta humoral dos felinos à infeção por Leishmania
não ser tão elevada como a observada nos cães. Como tal as técnicas serológicas aplicadas à
deteção de anticorpos anti-Leishamania em gatos parecem pouco sensíveis, ao contrário do
que ocorre em canídeos que permite boas avaliações da infeção no indivíduo e da
67
seroprevalência de uma população em estudo (Cardoso et al., 2004; Maia & Campino, 2008;
Maia et al., 2010).
Sendo a infeção no cão caraterizada pela excessiva produção de anticorpos e
consequente sintomatologia associada à deposição de imunocomplexos com o aparecimento
de uveítes, poliartrites, glomerulonefrites, torna os canídeos um hospedeiro frágil para a
perpetuação do ciclo biológico da Leishmania. Contrariamente ao cão, a não produção
exacerbada de anticorpos poderá ser uma das razões dos gatos não apresentarem tantos sinais
clínicos associados à deposição de imunocomplexos permitindo a multiplicação e
disseminação do parasita, pelo sangue e células linfóides do organismo sem causar danos
irreversíveis que levem à morte do hospedeiro (Greene, 2006). De fato, nenhum dos animais
com PCR positiva apresentava sinais clínicos, o que reforça a hipótese dos gatos poderem ser
considerados reservatório da doença, mantendo-se infetados entre épocas de atividade
flebotomínica, atuando como transmissores do parasita aos vetores. Por outro lado, os oito
gatos que apresentavam sinais clínicos foram negativos para Leishmania, o que demonstra
que, tal como observado na LCan, não existem sinais patognomónicos de LFel e destes serem
compatíveis com outras patologias.
A captura de flebótomos e avaliação dos seus biótopos (Apêndice V e VI) é essencial
para se averiguar a sua presença em determinada área (Alexander & Maroli, 2003; Dujardin et
al., 2008; Maroli et al., 2012). Como tal, e de modo a determinar a densidade flebotomínica,
nas seis freguesias do concelho de Cascais, colocaram-se por mês e durante três dias
consecutivos armadilhas luminosas do tipo CDC durante a época de atividade flebotomínica
(maio a autubro). Contudo apenas se capturaram um macho e uma fêmea Phlebotomus
perniciosus. O período de captura foi caraterizado por alguns episódios de chuva fraca,
variações de temperatura e vento que pode ter influenciado significativamente a atividade dos
flebótomos. Em trabalhos entomológicos futuros aconselha-se a colocação por períodos de
tempo superiores, num maior número de biótopos.
68
8.1. Limitações do estudo
Os objetivos propostos para este trabalho foram, de um modo geral, cumpridos. O
objetivo principal, i.e. a determinação da prevalência da infeção por Leishmania sp. em gatos
do concelho de Cascais, utilizando técnicas serológicas e, quer moleculares, foi
completamente atingido pelo estudo de uma amostra relativamente grande da população felina
residente cascais. A divulgação da parasitose e a sensibilização de clínicos e proprietários
para o tema foi conseguida pela abordagem feita aos proprietários e representantes de
associações que aceitaram participar no estudo, e pelas parcerias com os CAMV.
No decorrer da investigação constatou-se que era difícil obter todas as informações
pedidas nos inquéritos, quer por dificuldade de entendimento da doença pelos proprietários,
quer por desconhecimento dos clínicos, apenas recolhendo parte da informação.
Adicionalmente, o fato de metade da amostra ser constituída por animais errantes, limitou o
conhecimento de alguns dos dados que se pretendiam obter.
Devido ao fato da LFel não ser do conhecimento geral do público, torna-se difícil
pedir ao proprietário a autorização para efetuar a recolha destas amostras em animais que não
demonstrem qualquer tipo de sinal clinico compatível. Por este motivo, a recolha de sangue
periférico, menos invasiva, permitiu simultaneamente a obtenção de soro e a impregnação de
papel de filtro para a pesquisa de material genético.
69
9. Conclusão
Este estudo veio agora documentar pela primeira vez, tanto quanto se sabe, a
existência da infeção por L. infantum na população felina residente no concelho de Cascais.
De um modo geral os resultados obtidos neste estudo verificam algumas das evidências
revistas por Maia & Campino (2011) necessárias para o gato poder ser considerado como
reservatório alternativo ao cão, nomeadamente: (i) a prevalência da infeção na população
estudada; (ii) o caráter assintomático da infeção e (iii) a presença de parasitas em tecidos
(sangue periférico) que facilitam a sua transmissão aos vetores. E deteção de animais
positivos reforça a ideia de que a LFel deve ser sempre tida em consideração no diagnóstico
diferencial de patologias felinas, principalmente em áreas endémicas, como é a região de
Cascais. Este trabalho demonstra ainda a necessidade de se realizarem estudos longitudinais
que possibilitem a deteção e acompanhamento dos gatos durante um largo período de tempo e
que este período inclua épocas de transmissão. Embora não existam produtos profiláticos
aplicáveis à população felina (isto é, vacinas e repelentes não tóxicos eficazes contra os
flebótomos), que evitem a infeção por Leishmania sp. ou contato com os vetores as
prevalências de infeção por L. infantum observadas em gatos residentes em regiões endémicas
de leishmaniose devem fomentar o desenvolvimento de medidas profiláticas passiveis de
serem utilizados nesta espécie animal. Por último, este estudo vem realçar a necessidade de
alertar a comunidade veterinária, farmacêutica e os proprietários para o risco de infeção da
população felina por este parasita, e a necessidade de impletar medidas profiláticas para
proteger a saúde animal e pública.
70
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les /specie.xsl&select=PRODUCT%5B@ID$eq$PRODUCT_36%5D&affp=&.
I
Apêndice I – Termo de responsabilidade e certificado de autorização.
Pedro Pinto
II
Apêndice II – Panfleto informativo entregue a cada proprietário participante.
Apêndice I – Panfleto informativo, inquérito, documento de consentimento informado entregue a cada proprietário participante.
Pedro Pinto
III
Apêndice II – Panfleto informativo entregue a cada proprietário participante.
Apêndice I – Panfleto informativo, inquérito, documento de consentimento informado entregue a cada proprietário participante.
Pedro Pinto
IV
Apêndice III – Inquérito realizado aos proprietários dos animais testados para a infeção
por Leishmania sp.
Pedro Pinto
V
Apêndice IV – Tabela de resultados das técnicas serológicas e moleculares aplicadas aos
204 felinos testados.
Identificação NPCR DAT EK EHM IFI LC
D1
D2
1:16
D3
D4
D5
1:100
D6
D7
1:200
1:32
D8
D9
D10
D11
D12 +
D13
D14
D15
1:200
1:16
D16
1:200
D17
1:100
1:16
D18
D19
D20
D21
D22
D23
D24
D25
D26
D27
D28
D29
1:400 0,190
0,508
D30
1:100
D31
1:16
D32 + 1:200 0,198
0,608
D33
D34
0,205
D35
D36
VI
D37
D38
D39
D40
D41
D42
D43
D44
D45
0,203
D47
0,185
D48
1:16
D49
1:100
D50
1:16
D51
1:200
0,482
D52
D53
D54
0,962
D55
D56
1:200
D57
0,240
D58
1:200
D59
1:16
D60
1:16
D61
0,193
D62
D63
0,214
D64
1:200
D65
D66
1:200
1:16
D67
1:200
1:16
D68
D69
D70
D71
D72
D73
1:16
D74
0,221
D75
0,181
D76
1:200
D77
D78 +
0,179
VII
D79
D80 +
D81
D82
D83
1:200
D84
D85
1:08
D86
D87
D88
0,983 1:16
D89
1:16
D90
D91
1:32
D92
D93
1:16
D94
1:16
D95
0,182
D96
D97
D98
D99
D100
E1
E2
E3
1:200
E4
E5
E6
E7 +
E8
E9 +
E10
E11
E12
E13
E14
E15
1:100
E16 + 1:800 0,366 1,622 1:16 2,590
E17
E18
E19
VIII
E20
E21
0,24
E22
E23
E24
1,148
E25
E26
E27
1:100
E28
E29
E30
E31
E32
E33
E34
1:08
E35
E36
E37
E38
1:100
E39
E40
E41
E42
E43
E44
E45
E46
E47
1:200 0,346
E48
E49
E50
E51
E52
E53
E54
0,219
E55
0,179
E56
E57
E58
E59
E60
IX
E61
E62
0,193
1:16
E63
0,196
E64
0,183
0,549
E65
E66
E67
E68
E69
0,18
E70
0,240
1:16
E71
E72
E73
E74
E75
0,932
E76
E77
E78
E79
1:16
E80
E81
E82
E83
0,532
E84
E85
E86
0,240
1:16
E87
1:16
E88
1,142
E89
E90
E91 +
E92
E93
E94
E95
E96 +
E97
E98 +
E99
E100
E101
X
E102
E103
0,183
E104
NPCR: nested PCR; DAT: Teste de aglutinação direta; EK: ELISA kit Bordier; HM: ELISA
in house; IFI: Imunofluorescência indireta; LC: LeisScan Teste; : Técnica não executada;
Ausência de valor: Negativo para a técnica.
XI
Apêndice V – Captura de Flebótomos no concelho de Cascais.
A determinação da densidade e diversidade flebotomínica assim como o seu papel
vetorial é essencial para se averiguar a possível presença da infeção por Leishmania em
determinada área. Geralmente a infeção dos flebótomos na natureza é baixa, podendo existir
poucos insetos infetados, mas pelos efeitos causados pelo protozoário na alimentação das
fêmeas flebotomineas, é possível um único inseto afetar muitos mamíferos numa só noite.
A captura de flebótomos decorreu entre maio e outubro de 2012 utilizando
armadilhas luminosas do tipo CDC, durante três dias consecutivos por mês, sendo colocadas
ao entardecer e recolhidas ao amanhecer. Os locais de colocação foram selecionados de
acordo com os biótopos mais propícios para o desenvolvimento dos flebótomos (Figura 26)
(Alexander & Maroli, 2003; Dujardin et al., 2008; Maroli et al., 2012). Para uma boa
abrangência do concelho foram colocadas armadilhas, em todas as freguesias, perfazendo
doze armadilhas no concelho (Figura 27). Estes biótopos foram quase todos classificados
como domésticos, pois encontravam-se ao lado de habitações humanas, exceto um, que foi
classificado como peri-doméstico, por ser especificamente utilizado para animais de abrigo.
Em cada um, foram registadas as condições climáticas (temperatura, humidade e velocidade
do vento), a vegetação dominante, a composição da fauna existente e as coordenadas.
Os insetos capturados eram recolhidos diariamente, conservados em etanol a 70% à
temperatura ambiente sendo, posteriormente, transportados para o IHMT, de modo a serem
identificados morfologicamente pela Professora Doutora Maria Odete Afonso, do grupo de
Entomologia da Unidade de Parasitologia Médica.
Tendo em conta que apenas se capturaram dois exemplares de Phlebotomus
perniciosus, um macho e uma fêmea ingurgitada no biótopo nº 10, não foi possível determinar
qual/quais as espécies flebotomínicas vetoras de L. infantum, podendo-se apenas concluir que
a espécie P. perniciosus se encontra presente no concelho.
XII
Apêndice VI – Biótopos do concelho de Cascais onde se colocaram as armadilhas
luminosas CDC.
Figura 27: Mapa ilustrativo da distribuição dos locais de colocação
de armadilhas luminosas do tipo CDC pelo concelho de Cascais,
adaptado de http://www.rea.pt/forum/index.php?topic=20303.0.
Figura 26: Fotografias dos locais de colocação de armadilhas luminosas de captura de flebótomos tipo CDC: 1 - Biótopo doméstico localizado em São Domingos de Rana; 2 - Biótopo doméstico
localizado em São Domingos de Rana; 3 - Biótopo doméstico localizado em Carcavelos; 4 –
Biótopo doméstico localizado em Estoril; 5 – Biótopo doméstico localizado em Cascais; 6 - Biótopo
doméstico localizado em Alcabideche; 7 – Biótopo doméstico localizado em Cascais; 8 – Biótopo
doméstico localizado em São Domingos de Rana; 9 – Biótopo doméstico localizado em Parede; 10 -
Biótopo doméstico localizado em Alcabideche; 11 – Biótopo peri-doméstico localizado em
Alcabideche; 12 - Biótopo doméstico localizado em Cascais.
Pedro Pinto
XIII
Anexo I – Protocolo de extração de ADN a partir de papel de filtro impregnado com
sangue periférico
1. Com um furador tirar 2 a 3 “confettis” do papel de filtro impregnado com o sangue
periférico e, com auxílio de uma pinça coloca-los num eppendorf.
2. Adicionar 150 µl de Tampão de lise e 1,5 µl de Proteínase K (20mg/ml). Agitar
manualmente.
3. Incubar a +65ºC durante 15 minutos, verificando que os confettis ficam submersos
no líquido.
4. Incubar a +55ºC durante 2 horas. Inverter o tubo periodicamente durante a
incubação. (Preparar tubos passo 9, ou seja, adicionar o isopropanol e identificar a
amostra).
5. Arrefecer o lisado à temperatura ambiente.
6. Adicionar 100 µl da solução Pecipitadora de Proteínas.
7. Agitar no vortex a velocidade elevada durante 20 segundos.
8. Centrifugar a 14000 rpm durante 15 minutos a +4ºC par que se forme um pellet
compacto de proteína. Repetir o passo caso o pellet não seja visível.
9. Pipetar o sobrenadante (DNA) (cerca de 220-230 µl) para um novo tubo (1,5 ml)
contendo 300 µl de Isopropanol a 100%.
10. Misturar por inversão 50x.
11. Centrifugar 5 minutos a 14000 rpm.
12. Dispensar o sobrenadante e escorrer com cuidado o tubo para um papel absorvente.
13. Adicionar 300 µl de Etanol a 70% e inverter o tubo suavemente várias vezes para
garantir a lavagem do pellet de ADN
14. Centrifugar 1 minuto a 14000 rpm. Deitar fora o sobrenadante com cuidado, pois o
pellet pode estar solto.
15. Após rejeitar o sobrenadante, colocar o tubo aberto, em posição invertida, sobre
papel absorvente na estufa a +52ºC até que todo o líquido seque.
16. Adicionar 30 µl de Solução de hidratação de ADN a cada tubo.
17. Incubar as amostras durante a noite à temperatura ambiente.
18. Armazenar o ADN a -20ºC a té realização da PCR.
XIV
Anexo II – Protocolo de Purificação de ADN a partir de tecidos
19. Adicionar um fragmento de 1 a 2 mm do tecido num tubo (1,5 ml) com 1 ml de
solução tampão PBS e, macerar.
20. Adicionar a 100 µl de macerado tissular ou punção medular 500 µl de Tampão de
lise e 3 µl de Proteínase K (20mg/ml). Agitar manualmente.
21. Incubar a +65ºC durante 15 minutos, verificando que os confettis ficam submersos
no líquido.
22. Incubar a +55ºC durante 2 horas. Inverter o tubo periodicamente durante a
incubação. (Preparar tubos passo 9, ou seja, adicionar o isopropanol e identificar a
amostra).
23. Arrefecer o lisado à temperatura ambiente.
24. Adicionar 100 µl da solução Protein Precipitation.
25. Agitar no vortex a velocidade elevada durante 20 segundos.
26. Centrifugar a 14000 rpm durante 15 minutos a +4ºC par que se forme um pellet
compacto de proteína. Repetir o passo caso o pellet não seja visível.
27. Pipetar o sobrenadante (ADN) (cerca de 220-230 µl) para um novo tubo (1,5 ml)
contendo 300 µl de Isopropanol a 100%.
28. Misturar por inversão 50x.
29. Centrifugar 5 minutos a 14000 rpm.
30. Dispensar o sobrenadante e escorrer com cuidado o tubo para um papel absorvente.
31. Adicionar 300 µl de Etanol a 70% e inverter o tubo suavemente várias vezes para
garantir a lavagem do pellet de ADN
32. Centrifugar 1 minuto a 14000 rpm. Deitar fora o sobrenadante com cuidado, pois o
pellet pode estar solto.
33. Após rejeitar o sobrenadante, colocar o tubo aberto, em posição invertida, sobre
papel absorvente na estufa a +52ºC até que todo o líquido seque.
34. Adicionar 30 µl de Solução de hidratação de ADN a cada tubo.
35. Incubar as amostras durante a noite à temperatura ambiente.
36. Armazenar o DNA a -20ºC a té realização da PCR.
XV
Anexo III – Protocolo de controlo de extração por amplificação de β-actina Felina
1. Identificar os tubos de 0,2 ml para as diferentes amostras, incluindo o controlo
positivo e negativo.
2. Adicionar os seguintes reagentes, pela respetiva ordem, num eppendorf de 1,5 ml:
Mix Concentração na “mix” Mix/amostra (µl)
Água bidestilada 12,3
Tampão de reacção 5x 1 x 5
MgCl2 2 mM 2
dNTP’s 0,2 mM 0,5
Primer BetFel1 10 pmol 1
Primer BetFel2 10 pmol 1
Taq Polimerase 1 U 0,2
Total 22
3. Colocar 22 µl de mix em cada tubo de PCR.
4. Adicionar 3 µl das amostras de ADN a cada tubo (no tubo do controlo positivo
adicionar 1-3 µl de ADN do controlo positivo, no tubo de controlo negativo adicionar 3 µl de
água bidestilada).
5. Colocar os tubos no termociclador e seguir as seguintes etapas da PCR:
Etapa Temperatura (+ºC) Tempo
Desnaturação inicial 95 5 minutos
Desnaturação* 95 30 segundos
Ligação dos primers* 56 30 segundos
Extensão* 72 30 segundos
Extensão final 72 5 minutos
*Os três processos repetem-se por 35 ciclos
Produto de amplificação de 229 pb.
XVI
Anexo IV – Protocolo de preparação de gel de agarose e eletroforese dos produtos de
PCR.
1. Adicionar a 2,25 g de agarose 150 ml de tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE) 1X,
num balão “Erlenmeyer”.
2. Colocar no microondas (cerca de 3 minutos) até que a agarose se apresente
transparente.
3. Arrefecer um pouco a agarose e posteriormente adicionar 7,5 µl (0,02 µg/ml) de
brometo de etídio.
4. Colocar a agarose no suporte do gel, já com o pente colocado.
5. Aguardar cerca de 15 minutos, para que o gel polimerize
6. Depois de polimerizado, colocar o suporte na tina de eletroforese, tendo o cuidado do
gel ficar completamente submerso pelo tampão de eletroforese (tampão TAE 1X).
7. Retirar as amostras do frigorífico (+4ºC), Caso o tampão de reação seja incolor
adicionar a cada amostra 5 µl de corante Orange G.
8. Aplicar no primeiro poço o marcador molecular de 100 pb.
9. Nos poços seguintes aplicar 10 µl de cada amostra
10. Por fim aplicar os controlos positivos e negativos.
11. Iniciar eletroforese com 120 volts, 400 mA durante 60 segundos
12. Após a eletroforese, retirar o gel da tina e observar no transiluminador e fotografar
no sistema UVIDOC.
XVII
Anexo V – Protocolo de amplificação de ADN cinetoplastideal (kDNA) de Leishmania
sp. por PCR
1. Identificar os tubos de 0,2 ml para as diferentes amostras, incluindo o controlo
positivo e negativo.
2. Adicionar os seguintes reagentes, pela respetiva ordem, num eppendorf de 1,5 ml:
Mix Concentração na “mix” Mix/amostra (µl)
Água bidestilada 5,3
Tampão de reacção 5x 1 x 5
MgCl2 3 mM 3
dNTP’s 0,2 mM 0,5
Primer MC1 15 pmol 3
Primer MC2 15 pmol 3
Taq Polimerase 1 U 0,2
Total 20
3. Colocar 20 µl de mix em cada tubo de PCR.
4. Adicionar 5 µl das amostras de ADN a cada tubo (no tubo do controlo positivo
adicionar 2-3 µl de ADN do controlo positivo, no tubo de controlo negativo adicionar 5 µl de
água bidestilada).
5. Colocar os tubos no termociclador e seguir as seguintes etapas da PCR:
Etapa Temperatura (+ºC) Tempo
Desnaturação inicial 94 2 minutos
Desnaturação* 94 20 segundos
Ligação dos primers* 60 20 segundos
Extensão* 72 30 segundos
Extensão final 72 5 minutos
*Os três processos repetem-se por 30 ciclos
Produto de amplificação de 447 pb.
XVIII
Anexo VI – Protocolo de amplificação de ADN nuclear e ribossomal de Leishmania sp.
por nested-PCR
1. Identificar os tubos de 0,2 ml para as diferentes amostras, incluindo o controlo positivo e
negativo para a primeira fase.
2. Adicionar os seguintes reagentes, pela respetiva ordem, num eppendorf de 1,5 ml:
Mix Concentração na “mix” Mix/amostra (µl)
Água bidestilada 8,72
Tampão de reacção 5x 1 x 6
MgCl2 3 mM 2,4
dNTP’s 0,2 mM 0,6
Primer R221 10 pmol 1
Primer R332 10 pmol 1
Taq Polimerase 1 U 0,28
Total 20
3. Colocar 20 µl de mix em cada tubo de PCR.
4. Adicionar 10 µl das amostras de ADN a cada tubo (no tubo do controlo positivo
adicionar 5 µl de ADN do controlo positivo mais 5 µl de água bidestilada, no tubo de
controlo negativo adicionar 10 µl de água bidestilada).
5. Colocar os tubos no termociclador e seguir as seguintes etapas da PCR:
Etapa Temperatura (+ºC) Tempo
Desnaturação inicial 94 5 minutos
Desnaturação* 94 30 segundos
Ligação dos primers* 60 30 segundos
Extensão* 72 30 segundos
Extensão final 72 10 minutos
*Os três processos repetem-se por 35 ciclos
XIX
Anexo VI – Protocolo de amplificação de ADN nuclear e ribossomal de Leishmania sp.
por nested-PCR
6. Identificar os tubos de 0,2 ml para as diferentes amostras, com 199 µl de água
bidestilada.
7. Retirar 1 µl de produto de n-PCR da primeira fase para o eppendorf de 0,2 ml com 199
µl, obtendo uma solução de 200 µl.
8. Identificar os tubos de 0,2 ml para as diferentes amostras, incluindo o controlo
positivo e os dois negativos para a segunda fase.
9. Adicionar os seguintes reagentes, pela respetiva ordem, num eppendorf de 1,5 ml:
Mix Concentração na “mix” Mix/amostra (µl)
Água bidestilada 10,36
Tampão de reacção 5x 1 x 5
MgCl2 3 mM 2
dNTPs 0,2 mM 0,5
Primer R221 10 pmol 1
Primer R332 10 pmol 1
Taq Polimerase 1 U 0,14
Total 20
10. Colocar 20 µl de mix em cada tubo de PCR.
11. Adicionar 5 µl das amostras da diluição a cada tubo (no tubo do controlo positivo e
negativo adicionar 5 µl de diluição respetiva, no segundo tubo de controlo negativo adicionar
5 µl de água bidestilada).
12. Colocar os tubos no termociclador e seguir as seguintes etapas da PCR:
Etapa Temperatura (+ºC) Tempo
Desnaturação inicial 94 2 minutos
Desnaturação* 94 30 segundos
Ligação dos primers* 65 30 segundos
Extensão* 72 30 segundos
Extensão final 72 5 minutos
*Os três processos repetem-se por 35 ciclos
Produto de amplificação de 358 pb.
XX
Anexo VII – Técnica de Aglutinação Direta (DAT)
1. Adicionar 100 µl de solução de diluição na 1ª, 5ª e 9ª coluna (exceto H9 onde
só se adiciona 50 µl) e juntar 4 µl de soro a testar em cada poço.
2. Encher cada uma dos poços das outras colunas (da 2ª à 4ª) com 50 µl da
solução de diluição.
3. Transferir 50 µl do soro diluído (da diluição 1:25) da 1ª coluna para a 2ª coluna
(1:50); misturar 3 vezes e transferir 50 µl para a 3ª coluna. Misturar 3 vezes e transferir 50 µl
para a 4ª coluna. Depois de misturar descartar 50 µl. Diluições a testar (1:25; 1:50;
1:100;1:200). Utilizar os poços G9-G12 para controlo positivo e os poços H9-H12 para
controlo negativo.
4. Adicionar 50 µl do antigénio diluído a cada um dos poços e percutir com
cuidado todos os lados da placa.
5. Deixar à temperatura Ambiente, de um dia para o outro (cerca de 18h), em
superfície plana e horizontal.
6. Observar as placas contra um fundo branco e verificar os resultados. Pontos
azuis compactos são considerados resultado negativos, enquanto círculos azuis difusos são
considerados resultados positivos. O titulo limite é o reciproco da ultima diluição de soro que
ainda revela aglutinação.
Notas: Em amostras iguais ou superiores ao cut-off, continuar a diluição mas
colocando 1 µl de soro em 100 µl de solução de diluição segundo o mesmo esquema de
execução. Diluições a testar (1:100; 1:200: 1:400; 1:800).
Para amostras felinas considera-se como cut-off a diluição de 1:100.
XXI
Anexo VIII – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit Bordier Affinity
Products
1. Bloqueio
Preencher os poços com 200 µl de solução TBS-Tween; Incubar as placas 15 minutos
à temperatura ambiente; Remover a solução TBS-Tween agitando a placa e sacudindo a
mesma, secando o excedente em papel absorvente.
2. Incubação das amostras de soro
Preencher os poços com 100 µl das diluições de soro, previamente preparadas na
diluição de 5 µl (amostra) em 1000 µl (solução diluição). E colocar 100 µl de controlos
positivos e negativos nos respetivos poços, o poço “branco” apenas recebe 100 µl de PBS-
Tween. Incubam-se a 37ºC por 30 minutos, seguindo-se 4 lavagens com solução de lavagem.
3. Incubação com conjugado
Distribuir por cada poço 100 µl de conjugado (Proteina A-alkalina fosfatase),
incubando-se de seguida por 30 minutos a +37ºC. Termina com 4 lavagens com solução de
lavagem.
4. Incubação com substrato
Distribuir 100 µl de substrato a cada poço. Cobrir os poços com parafilm e incubar a
37ºC por 30 minutos. Após retirada da estufa adicionar 100 µl de solução stop para paragem
de reação.
5. Avaliação das absorvências
Avaliar a absorvência dos poços em leitor automático a 405 nm.
XXII
Anexo IX – In house Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
1. Colocar 100 µl de solução carbonato-bicarbonato Na2CO3 (1,325g/250ml) /NaHCO3
(1,05g/250ml) com antigénio numa concentração de 107/ml (Leishmania sp.) e incubar a
+37ºC durante 2 horas.
2. Bloqueio
Retirar as placas da estufa e lavar 3 vezes com PBS-Tween (250 µl + 500ml PBS 1x).
Adicionar 100 µl por poço de uma solução de leite em pó magro a 6% (leite + PBS-Tween).
Incubar a +37ºC durante 45 minutos.
3. Incubação das amostras de soro
Lavar as placas 3 vezes com solução de PBS-Tween. Adiconar a cada poço 100 µl das
soluções de soro diluídas (1:200) com solução de leite magro em pó a 2%. Incubar 1 hora a
+37ºC.
4. Incubação com conjugado
Lavar as placas 4 vezes com PBS-Tween. Adicionar 100 µl por poço da solução
diluída de IgG com leite a 2% (1:5000). Incubar a +37ºC durante 1 hora.
5. Incubação com substrato
Preparar a solução de substrato com 5 mg de OPD sigma P2, 392-8 para 10 ml de
substrato (3,94 g Na2HPO4.12H2O em 9,6 g de C6H8O7)/por cada placa, adicionar 10 µl de
H2O2 a 30% Lavar as placas 5 vezes com solução PBS-Tween. Adicionar a cada poço 100 µl
de solução de substrato e proteger a placa da luz até que os poços iniciem a mudança de cor
para laranja (cerca de 1 minuto e 30 segundos depois).
6. Avaliação das absorvâncias
Avaliar a absorvência dos poços em leitor automático a 492 nm.
XXIII
Anexo X – LeisScan – LEISHMANIA ELISA TEST
1. Retirar pelicula protetora aquando da utilização das placas. Colocar por poço
100 µl da amostra diluída ou controlo em cada poço. Agitar suavemente durante 15 segundos.
2. Incubar diluições de soros e controlos 10 minutos à temperatura ambiente.
3. Eliminar o conteúdo dos poços e lavar 5 vezes com aproximadamente 300 µl
por poço de solução de lavagem. Adicionar 100 µl de conjugado (frasco nº 2) a cada poço.
Agitar suavemente 15 segundos. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente.
4. Eliminar o conteúdo dos poços e lavar 5 vezes com aproximadamente 300 µl
por poço de solução de lavagem. Adicionar 100 µl de substrato (frasco nº 3) a cada poço.
Agitar suavemente durante 10 segundos. Incubar 10 minutos à temperatura ambiente.
5. Por fim adicionar 100 µl de solução STOP (frasco nº 4) a cada poço. Ler as
densidades óticas num leitor ELISA com um filtro de 450 nm.
Cálculo de resultados:
Razão (Rz) da amostra = D.O amostra / D.O controlo positivo baixo
Razão (Rz) da amostra Resultado Correspondência IFI
Razão de amostra > 0,5
0,5 < Rz < 0,7
0,7 < Rz < 0,9
0,9 < Rz < 1,1
1,1 < Rz < 1,5
1,5 < Rz
Negativo
Negativo
Negativo
Duvidoso
Positivo baixo
Positivo
Negativo
1:20 a 1:40
1:40 a 1:80
1:80
1:80 a 1:160
> 1:160
XXIV
Anexo XI – Teste Imunofluorescência indireta (IFI)
1. Traçar num papel, um esquema indicando a disposição sobre as lâminas dos
soros a testar.
2. Retirar do congelador as lâminas e dispô-las num tabuleiro e secas ao ar.
3. Fixar o antigénio com acetona, mergulhando as lâminas em acetona durante 10
minutos à temperatura ambiente.
4. Retiram-se as lâminas da acetona e secam-se ao ar. Em seguida numeram-se
segundo o esquema estabelecido.
5. Diluir os soros em progressão geométrica de 2, em PBS com pH 7,2 (iniciar
com uma diluição de 1:8). Utilizar um soro positivo de titulação conhecida e um soro
negativo como controlos.
6. Dispõem-se as diluições dos soros sobre as lâminas, 25 µl, começando sempre
da diluição mais diluída para a mais concentrada.
7. As lâminas são colocadas num suporte em câmara húmida, na estufa a +37ºC
durante 30 minutos.
8. Retiram-se as lâminas da estufa e imediatamente rejeitam-se as gotas dos soros
diluídos, por meio de um jacto de tampão. Em seguida colocam-se imersas em tampão
durante 10 minutos. Retiram-se e secam-se ao ventilador.
9. Diluir o conjugado fluorescente da espécie animal em causa na solução de
trabalho de Azul de Evans, de acordo com o título anteriormente determinado. Esta
preparação só deve ser feita na altura da utilização.
10. Colocar 25 µl do conjugado diluído em cada círculo.
11. Repetir os paços 7 e 8.
12. No momento da leitura, montar as lâminas com glicerina tamponada e lamela.
13. Leitura realizada num microscópio ótico na objetiva 40X com filtro UV.
XXV
Nota: Se a leitura não for imediata colocar as lâminas, por montar, em ambiente escuro
a +4ºC para não perder fluorescência. Reação Positiva: Promastigotas com fluorescência
verde; Reação Negativa: Campo obscurecido, promastigotas avermelhados ou pouco visíveis.
Para esta técnica utilizaram-se lâminas de 10 poços de 6 mm de diâmetro, resistentes à
acetona da marca (Biomerieux® SA) sem antigénio, promastigostas de Leishmania infantum
no seu interior, solução tampão de PBS (tampão fosfato pH 7), solução corante de Azul de
Evans, solução de conjugado com anticorpos anti-gato, (SIGMA Anti-Cat IgG – FITC)
anticorpo produzido em ovelha, e anti-cão, (SIGMA Anti-Dog IgG – FITC) anticorpo
produzido em coelho marcados com fluorocromo e, solução de glicerina tamponada.
