Práticas de Microbiologia2010

Olga Martins Marques (Prof a UFPE - DEQ)Glória Maria Vinhas(Prof a UFPE - DEQ)

Alexandra Amorim Salgueiro (Prof a UNICAP -DQ)Maria Alice Gomes de Andrade Lima (Prof aUFPE-DEQ)Maria de Los Angeles Peres Palha (Prof a UFPE - DEQ)

Sonia Ma Souza Cavalcante de Albuquerque (Prof a UFPE -DEQ)

Recife - Pernambuco

1998

Apresentação

A inexistência de um texto de práticas de Microbiologia Geral adaptado às nossas condições do nosso laboratório, e destinado aos cursos superiores de Engenharia Química, Química Industrial e outros, nos motivaram à realização deste manual. Os experimentos foram selecionados de modo a englobar a maioria dos assuntos contidos no programa referente à primeira unidade do curso e podem ser facilmente efetuados em laboratórios de recursos l imitados.

Cada experimento poderá ser efetuado por um grupo de dois ou mais alunos. Muitas vezes o experimento pode ser dividido entre vários grupos da classe, sendo que cada grupo deve fazer o experimento numa determinada condição. Neste caso, o instrutor dever fazer uma discussão a posteriores e globais do problema apresentado.

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PRÁTICA N1

OBJETIVOS:

Discriminar as funções e/ou aplicações Limpar Acondicionar

1. FUNÇÕES E/OU APLICAÇÕES DO MATERIAL DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

1.1. Material Permanente

a. Autoclave - câmara de vapor com parede dupla, equipada com dispositivos que permitem o enchimento da câmara com vapor saturado e sua manutenção em determinadas temperatura e pressão por quaisquer períodos de tempo. O autoclave é um equipamento indispensável ao laboratório de microbiologia na esterilização de meios de cultura, água, suspensões etc.(ver modo de operação)

b. Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - esteril iza a seco toda vidraria convenientemente acondicionada, a temperatura de 170 a 200 o C por 1-2 horas.

c. Refrigerador - util izado na conservação de culturas de microrganismos sob baixa temperatura, diminuindo o tempo de geração

d. Estufa bacteriológica - favorece o crescimento de microrganismos pela incubação na temperatura adequada.

Incubação = manutenção do meio semeado em determinadas condições para promover o desenvolvimento dos microrganismos.

e. Mesa agitadora (rumbeira) - favorece o crescimento de microrganismos aeróbios, pela dissolução do oxigênio no meio, através da agitação da mesa, em movimentos rotatórios.

f . Cabine de fluxo laminar - câmara asséptica, dotada de exaustor e lâmpada fluorescente, sendo utilizada em repiques de microrganismos

g. Fermentador - equipamento onde ocorrem as fermentações, podendo ser dotado de sistemas de agitação, aeração, refrigeração.

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1.2. Vidraria

a. Tubo de ensaio (tubo de cultura) - util izado no cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio e na conservação de culturas puras de microrganismos.

b. Placa de Petri - facilita o isolamento de microrganismos devido à grande superfície de crescimento que apresenta, possibil itando o aparecimento de colônias separadas.

Colônia = aglomerado de células em meio sólido, geralmente originadas de uma única célula progenitora.

c. Pipeta - para diluir preparações diversas e inocular culturas líquidas

Inocular = inserir, introduzir.

Inoculo (ou semente) = concentração de células suficientes para cultivar uma de meio com bom rendimento

d. Pipeta Pasteur - é um tubo de vidro espichado em capilar, utilizada para transportar pequenos volumes de líquido

e. Alça de Drigalsky - obtida a partir de uma pipeta Pasteur longa, dobrada em ângulo reto e depois em 45 C na chama. É utilizada para espalhar microrganismos em meio de cultura sólida.

f . Balão de fundo chato - util izado geralmente para guardar meios de cultura.

g. Erlenmeyer - util izado para propagação celular de microrganismos em meio líquido sob agitação em mesa agitadora.

h. Fernbach - idem

i . Lâmina - para examinar microrganismos ao microscópio Lâmina Escavada - possui uma ou duas depressões possibilitando

observar a mobilidade de microrganismos suspensos numa gota de líquido (Ensaio em gota pendente)

j . Lamínula - util izada para recobrir preparações microscópicas “in vivo

1.3. Materiais utilizados em titulações, destilações, preparações de solução e de meios de cultura - Béquer, bastão de vidro, bureta, funil, proveta, balão volumétrico, condensador dentre outros.

1.4. Diversos

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a.Lápis dermatográfico - util izado para escrever em superfície de vidro

b.Algodão bruto (ou cardado) - serve para proteger o material esteril izado, do contato com o ar ambiente.

c.Cabo de Kolle - feito com material isolante, adaptado em três formas (círculo, ele, agulha). Serve de suporte para um fio de platina ou uma liga níquel-cromo, sendo utilizado em inoculação de microrganismos.

2. DESINFECÇÃO

a. Desinfecção do ar:

- através da vaporização de uma solução de hipoclorito de sódio a 1%;

- pelo uso de lâmpadas de luz ultravioleta.

- pode ser feita periodicamente com a vaporização de uma solução de formalina (formol a 40%), no entanto, esta solução não se pode usar para a desinfecção de ambientes ocupados;

b. Desinfecção da bancada: Antes da realização de um determinado trabalho de

microbiologia, a bancada deve ser limpa com uma solução detergente seguida de uma solução alcoólica a 70%.

c. Desinfecção da vidraria:

- vidraria contaminada - deverá ser inicialmente esterilizada em autoclave para que toda flora presente seja destruída e, em seguida lavada com uma solução detergente ou sabão neutro;

- vidraria sem contaminação - idem ao anterior, porém sem necessidade de autoclavação.

Observação: não é costume se utilizar solução sulfocrômica na lavagem dos materiais do laboratório de microbiologia, uma vez que esta solução contém cromo que é um metal que pode intoxicar as células vivas e também por ser de difícil remoção no material

3. ACONDICIONAMENTO

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a. Placas de Petri - embrulhadas com papel, geralmente formando conjunto de 3 unidades. A quantidade depende da necessidade do trabalho.

b. Pipetas - obtura-se as boquilhas com mecha de algodão (1cm) para filtrar o ar soprado e para proteger o operador durante a manipulação; em seguida são enroladas uma a uma com papel, anotando a capacidade de cada uma.

c. Tubos de ensaio, balões de fundo chato, Erlenmeyers, fernbachs - são preparados introduzindo-se um tampão de algodão cardado na boca do recipiente. Esse tampão deve ser feito, enrolando o algodão no sentido da fibra em quantidade suficiente para facilitar o manuseio, isto é, não deve ser nem muito apertado, nem muito frouxo.

d. Lâminas - mergulhadas em solução alcoólica, f icam aptas a serem util izadas a qualquer momento, evitando paralelamente que sejam arranhadas.

ATENÇÃO: Toda vidraria util izada no laboratório de microbiologia antes de ser preparada para esteril ização deverá estar limpa e seca.

ESTERILIZAÇÃO EM AUTOCLAVE

Operação: l igar o aparelho à rede elétrica. Após a colocação do material dentro do autoclave, a tampa é fechada e a torneira de remoção de ar ou vapor é deixada aberta para remover todo o ar. Quando todo o ar for removido, deixe que um fluxo de vapor fluente persista por cerca de 5 minutos, antes de fechar a torneira. A partir de então a pressão internamente irá aumentar e chegar à pressão de esteril ização usada, que é de 15 lb/pol 2 , ou 1atm, ou 1 kgf/cm 2 , correspondendo a uma temperatura de 121 0C. O tempo de exposição do material no interior deste equipamento irá depender do volume de líquido a ser esterilizado. Para pequenos volumes, até 3 li tros, podem ser esterilizados durante 20 a 30 minutos a uma pressão de 15 lb/pol 2 . Com relação a maiores volumes, será necessária, uma exposição mais prolongada. Quando a temperatura requerida para a esteril ização é alcançada, deve-se começar a contar o tempo, usando um relógio de laboratório (com alarme). Decorrido o tempo desliga-se o aparelho da corrente elétrica e mantém-se a autoclave e a torneira de ar e vapor fechados, até o manômetro voltar ao ponto zero, pois quando a pressão da autoclave é aliviada rapidamente, os líquidos dentro dos tubos e frascos fervem violentamente, fazendo com que os tampões sejam arremessados para fora dos mesmos.

Concluída a esterilização, abre-se a torneira de vapor; em seguida a tampa do autoclave é levantada.

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PRÁTICA N 2

OBJETIVOS:

Trabalhar assepticamente

Cultivar microrganismos

Diferenciar macroscopicamente fungos, leveduras, bactérias.

INTRODUÇÃO

O homem no seu meio ambiente convive com inúmeras formas de vida. Os microrganismos ocupam lugar de destaque tanto pelos benefícios como pelos malefícios que proporcionam ao homem, sendo encontrados na natureza em abundância e variedade de formas. Para que os mesmos sejam cultivados artificialmente é necessário conhecer suas exigências nutricionais e suas condições físicas de crescimento, trabalhar com material esterilizado e obedecer às normas de prática asséptica.

Dependendo da finalidade da operação, os microrganismos podem ser cultivados em: lâminas, placas, tubos, balões, fernbach ou recipientes de maior capacidade. O cultivo em lâmina é util izado quando se deseja acompanhar microscopicamente o crescimento e reprodução de um microrganismo. Emprega-se o cultivo em placas quando se quer isolar espécies microbianas distintas, devido à extensa área de superfície que apresenta. Porém, devido à pequena quantidade de meio em exposição ao ar, com frequência ocorre ressecamento e/ou aparecimento de contaminações.

Cultivando os microrganismos em tubos, há facilidade de manipulação das culturas, além da vantagem de economizar meio e espaço físico. Para se obter grandes volumes de cultura, o microrganismo é cultivado inicialmente em balões, fernbach, para depois ser transferido para recipiente maior, cuja capacidade é função da necessidade do trabalho.

NORMAS DE PRÁTICA ASSÉPTICA

1. Não trabalhar em corrente de ar, nem ambiente agitado pelo acúmulo de pessoas;

2. Não falar nem respirar em frente ao recipiente aberto contendo material de estudo;

3. Abrir o recipiente inclinado junto à chama, onde o ar está rarefeito de formas vivas;

4. Retirar o tampão de algodão com o dedo mínimo e a palma da mão sem tocar na boca do recipiente e sem encostar o tampão em lugar algum;

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5. Flambar a boca do recipiente sempre que for iniciar uma inoculação, para que uma corrente de ar quente seja formada de dentro para fora;

6. Introduzir o mais rápido possível a alça ou pipeta sem tocar nas paredes do recipiente;

7. Ao terminar a inoculação, f lambar a boca do recipiente e ajustar o tampão, conservando o material ao abrigo da poeira e umidade.

PROCEDIMENTO PRÁTICO

Limpar a bancada; Marcar todo material (placa e tubos), especificando o tipo de meio e

a fonte da inoculação; Fundir dois meios de cultura diferentes (por exemplo, AN e CZ); Distribuir os meios em placas de Petri e tubos (inclinar); Esperar solidificar; Fazer inoculações nas superfícies dos meios distribuídos em placas;

Incubar na temperatura ambiente por 2 a 5 dias, não esquecendo de guardar placas sem inocular, uma de cada meio utilizado para controle da esterilização e da eficácia da técnica utilizada.

FONTES: água poluída, fermento de padaria, ar , garganta, mãos, cabelo, suor etc.

DIFERENCIAÇÃO MACROSCÓPICA DOS MICRORGANISMOS

Os microrganismos crescem e reproduzem quando cultivados e inoculados adequadamente. Podemos fazer avaliação dos grupos aos quais eles pertencem, por observações das característ icas das colônias nos meios em que eles foram cultivados. O crescimento em meio líquido pode ser evidenciado pela turvação, pela formação de pequena massa de célula que flotam (velo) ou por sedimentação das células. Em placas de Petri estuda-se o crescimento dos microrganismos em meio sólido, observando-se o aparecimento de colônias cujos aspectos macroscópicos auxiliam na diferenciação de grupos microbianos.

I) Descrição de colônias em placas de Petri:

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Após o período de incubação preestabelecido as colônias de microrganismos cultivados em placas de Petri podem ser descritas de acordo com os seguintes critérios:

a. forma:

circular r izoide irregular f i lamentosa

b. quanto à dimensão

puntiforme com menos de 1 mm de diâmetro

c. cromogênese

-cor do pigmento-pigmento solúvel ou insolúvel no meio

d. superfície

plana ,elevada, convexa, lisa, rugosa, seca, brilhante, translúcida, opaca, pregueada, pulverulenta

II) Descrição da cultura em caldo nutriente

O crescimento em caldo de cultura pode apresentar-se sobre diferentes formas.

a. turbidez: mais ou menos acentuada

b. forma da película: uma massa de células que flutua à superfície do caldo

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c. sedimento: depósito de células no fundo do tubo.

Observação:

. As colônias de fungos são geralmente grandes e f ilamentosas, algumas vezes ocupam toda a placa onde estão cultivadas.

. As colônias de leveduras são pequenas e leitosas, enquanto as de bactérias são menores e brilhantes sendo algumas tão pequenas que se denominam puntiformes.

PRÁTICA N 3

OBJETIVOS:

Distinguir os diversos componentes de um microscópio ótico composto Focalizar “in vivo”: células de leveduras em suspensão, microrganismos (algas, protozoários e bactérias móveis em água)

COMPONENTES DE UM MICROSCÓPIO ÓTICO COMPOSTO

I - PARTE MECÂNICA:

1. Base ou pé - dispositivo de tamanho e peso suficiente para assegurar o equilíbrio estável do instrumento, evitando trepidações;

2.Corpo, braço ou coluna - haste destinada a sustentar o tubo microscópico e conter os mecanismos de movimento; alguns apresentam articulação, facilitando a observação do pesquisador;

3.Tubo ou canhão microscópico - cilindro oco que serve de suporte para os dois sistemas de lentes (oculares e objetivas);

4. Revólver - peça giratória onde ficam fixadas as lentes objetivas, permitindo que cada lente possa ser colocada em foco ( uma de cada vez),isto é, em coincidência com o eixo ótico;

5. Platina - plataforma horizontal com uma abertura circular no centro por onde passam os raios luminosos. Existem platinas móveis;

6. Pinça ou presilhas - alças flexíveis e ajustáveis, si tuadas na platina. São utilizadas para fixar a lâmina;

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7. “Charriot”- dispositivo facultativo que permite a movimentação da lâmina em dois sentidos: horizontal e vertical, pela manipulação de dois parafusos;8. Sistema de cremalheira - peça munida de dentes, controlada pelos parafusos macrométrico e micrométrico;

a) Macrométrico - ocasiona diferentes aproximações entre a objetiva e a preparação, variando a distância vertical de vários centímetros. Serve para trazer o objeto ao foco aproximado;

b) Micrométrico - permite mínimos deslocamentos verticais da ordem de centésimos de milímetros, sendo utilizado na focalização final;

Observação: Nos microscópios mais modernos existe um único parafuso que oferece o controle destes dois movimentos.

II - PARTE ÓTICA

1. Fonte luminosa:

1.1. Natural - luz solar1.2. Artificial - lâmpada1.2.1. Direta - quando a lâmpada está fixada no eixo ótico1.2.2. Indireta - quando se utiliza fonte luminosa anexa ao microscópio. 2. Espelho - girando em torno de um eixo, é utilizado para refletir os raios luminosos; pode ser côncavo ou plano, aumentando ou diminuindo a intensidade da luz, respectivamente;

3. Diafragma - controla a extensão angular do feixe luminoso, reduzindo o ângulo do cone de luz, de modo que não exceda o diâmetro da objetiva após atravessar o objeto; 4. Condensador - conjunto de lentes convergentes que projeta sobre a preparação o feixe de luz em forma de um amplo cone; por deslocamentos verticais diminui ou concentra a luz no objeto; 5. Lentes objetivas - são as lentes que ficam próximas ao objeto, formando na parte superior do tubo microscópico uma imagem invertida e ampliada do objeto. Podem ser: a) a seco - quando o meio entre o objeto e a lente é o ar, podendo ser de pequeno, médio ou grande aumento; b) de imersão - quando a lente f ica mergulhada numa camada de líquido;

6. Sistema de lentes oculares - apresenta um conjunto de lentes: lente de campo (corretora) que corrige a esfericidade da imagem e a lente

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ampliadora que atua em conjunto com o observador como uma simples lente de aumento, aumentando a imagem formada pela objetiva.

MANIPULAÇÃO DO MICROSCÓPIO

1. Instalação do aparelho

Retirar o microscópio da caixa ou armário pelo braço e colocá-lo na mesa apropriada (chumbada e nivelada); a seguir l igar a fonte luminosa e dispor a objetiva no revólver e regular a altura do banco, de maneira a permitir um trabalho confortável.

2. Iluminação de campo

Se a luz utilizada é uma luz natural, usar a face plana do espelho, caso contrário, a face côncava. Em qualquer caso, a luz deve cobrir completamente a superfície do espelho e este deve estar centrado de maneira que o cone luminoso refletido atravesse completamente o condensador (que deve estar completamente levantado, com o diafragma aberto) bem como a abertura da platina, de tal sorte que o campo do microscópio (isto é, o espaço da platina visualizado com a ocular) f ique totalmente iluminado.

3. Adaptação da preparação

Colocar a lâmina contendo a preparação sobre a platina e prendê-la, depois, com o auxílio do Charriot, deslocar o conjunto de tal forma que a preparação contida na lâmina, f ique sobre a abertura da platina, perfeitamente i luminada pelo cone luminoso.

4. Escolha da objetiva

a) preparações a fresco (“In vivo”): trabalhar apenas com objetivas a seco, começando pela de menor aumento;

b) preparações coradas (“In vitro”):

- focalizar inicialmente com a objetiva a seco de menor aumento;

- girar o revólver de maneira que nenhuma das objetivas fique em uso;

- colocar sobre a preparação uma pequena gota de óleo de imersão;

- colocar no eixo ótico a objetiva de maior aumento (imersão)

5. Iluminação da preparação

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Para as preparações coradas que dão imagens por absorção, usar o máximo de iluminação com o condensador completamente elevado e o diafragma totalmente aberto. Para as preparações a fresco, que dão imagens por refração, iluminar menos a f im de que o fenômeno seja mais perceptível. Começar descendo o condensador, a uns dois terços da sua abertura, depois olhando pela ocular, regular o cone luminoso, fechando aos poucos o diafragma.

6. Focalização

É a operação que consiste em trazer o objeto para o foco da objetiva, formando a imagem que, ampliada pela ocular, será vista pelo observador. A focalização consta das seguintes etapas:

a) girar o revólver colocando a objetiva de menor aumento no eixo ótico;

b) ajustar a iluminação de campo; c) centralizar a preparação;

d) aproximar ao máximo a preparação, da objetiva de menor aumento, por meio do mecanismo de movimento. Durante este trabalho deverá ser observada a aproximação diretamente com a vista, não devendo ser util izado a ocular;

e) observando então pela ocular, imprimir movimento moderado de afastamento entre a preparação e a objetiva, até que seja distinguida a imagem do objeto;

f) movimentar o micrométrico para focalização final;

g) regular o diafragma e o condensador para visualizar com mais nitidez;

h) para trocar de objetiva basta o revólver e em seguida ajustar o foco imprimindo movimentos lentos no micrométrico;

i) ao término da observação, girar o revólver até a menor objetiva e apagar a luz. Retirar a lâmina e colocar num recipiente com detergente.

OBSERVAÇÃO: Quando o microscópio é binocular deve-se ajustar a distância inter-ocular de tal forma que o observador visualize um só campo de luz. Trabalhando com microscópio monocular, procurar manter ambos os olhos abertos, a f im de evitar fadiga.

7. Causas de erro na observação

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a) Obscuridade total do campo - má centralização do aparelho de iluminação

b) Obscuridade parcial - revólver mal centrado, verificar se o ponto em que há resistência não foi atingido ou foi ultrapassado.

c) Falta de nitidez da imagem

- preparação invertida ou com sujos;

- ocular suja - verificar se rodando-a, o sujo acompanha o movimento; limpar a objetiva;

- objetiva suja ou com arranhão - l impar com mistura xilol-éter;

- aparelho de iluminação - falta de centralização, poeiras depositadas ou objetos estranhos interpostos na marcha dos raios;

d) Dificuldade subjetiva

Corpúsculos de forma diversa que parecem deslocar-se no campo. Com alguma prática, verifica-se que eles são independentes da preparação, e provêm do observador; repousar um pouco e repetir a operação;

e) Movimento Brauniano

Quando os microrganismos deslocam-se num só sentido devido à correntes líquidas formadas por evaporação da água durante a observação nas preparações “In vivo”. Salientando que o movimento dos microrganismos é aleatório.

8. Conservação dos microscópios

O aparelho deve estar sempre protegido, seja com capa plástica, seja com caixa própria e guardada em ambiente provido de luz artificial para evitar o crescimento de fungos. A cada utilização o pó do microscópio deverá ser removido com um pano limpo.

Evitar a ação de vapores ácidos e contato com reativos; só manuseá-lo com mãos limpas; só observar preparações l impas e ter o cuidado de não deixar escorrer nada sobre a platina ao adaptar a preparação. Se isto ocorrer, l impar imediatamente, se necessário com água destilada, enxugando a seguir.

As oculares devem ser limpas externamente com papel de seda e internamente, por um técnico, só quando necessário.

A objetiva de imersão é limpa com papel de fi ltro ou algodão umedecido com uma mistura de xilol e éter na proporção de 1:1, que deve ser imediatamente removido com papel ou algodão limpo.

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A permanência de xilol sobre a lente causa desvitr ificação da mesma.

Nunca deixe ficar óleo na lente, pois ali resinifica e depois para limpar, exige excesso de dissolvente, podendo este penetrar no sistema, dissolvendo o bálsamo que l iga as diversas partes.

As objetivas a seco são limpas com um linho macio e ocasionalmente, com papel umedecido com água destilada.

A parte interior das objetivas não deve ser l impa usualmente e quando é feito deverá ser praticada por pessoa habili tada. Deve-se remover a objetiva e passar suavemente um pincel macio ou uma bucha de pano macio na extremidade de uma haste. Não se deve assoprar para evitar a umidade. Esta operação deverá ser feita com muito cuidado para não descentralizar as objetivas.

As lentes do aparelho de iluminação são limpas como as demais, com freqüência, pois delas depende a boa iluminação fornecida.

A parte mecânica é l impa e polida com uma flanela e a cremalheira com óleo detergente fino.

Para uma boa conservação do microscópio o operador deverá seguir uma rotina diária que vai desde uma simples remoção do pó até uma lubrificação mensal de todas as partes móveis com um óleo fluido. A cada trimestre o aparelho deve ser enviado a um técnico especializado para uma inspeção rigorosa, l impeza e lubrificação geral.

PRÁTICA N 4

OBJETIVOS:

Realizar coloração simples Observar microrganismos diferentes sob objetiva de imersão Diferenciar leveduras de bactérias considerando o tamanho celular

OBSERVAÇÕES “IN VITRO”

Os microrganismos são usualmente transparentes, tornando difícil o estudo de detalhes morfológicos quando são examinados em seu estado natural, assim torna-se necessário a util ização de técnicas de coloração.

As observações microscópicas “in vitro” são realizadas com o microrganismo previamente fixado ã lâmina. Nestas condições as células microbianas são observadas mortas.

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Após a f ixação, submete-se a preparação à etapa de coloração pela adição de soluções adequadas em função da técnica de coloração desejada.

As técnicas de coloração não só facilitam a visibilidade das células microbianas, como também, propiciam a visualização de determinadas estruturas celulares em função de afinidades específicas com determinados corantes, e facil itam identif icação de microrganismos devido a comportamento diferentes frente à ação de soluções diferenciadoras.

A menos que algum aspecto morfológico específico, dependente de idade da cultura, deva ser demonstrado, o microbiologista deve usar sempre cultura nova nas observações microscópicas. As células com o tempo de cultivo modificam o metabolismo, alterando a afinidade com muitos corantes. Excluindo os organismos que têm um tempo de geração especialmente grande, uma cultura com 24 horas de cultivo dará sempre bons resultados.

SUBSTÂNCIAS CORANTES

Segundo Langeron, corantes são substâncias coradas que gozam da propriedade de transmitir cor a outros corpos.

Muitas são as substâncias corantes empregadas na rotina diária dos laboratórios, a maioria derivados da anilina, podendo ser classificados em naturais e artif iciais. Entre os naturais destacam-se: o carmim, a hematoxilina. Os artificiais são agrupados em função dos grupos químicos presentes e da afinidade com estruturas celulares, podendo ser:

a) Básicos ou nucleares : violeta de genciana, cristal violeta, verde de malaquita, azul de metileno, fucsina básica, azul de toluidina, verde de metila etc.

b) Ácidos ou citoplasmáticos : eosina, f luoresceína, fucsina ácida, orange G, vermelho congo, ácido picrico etc

c) Neutros: eosinato de azul de metileno e de azul AZUR, giensa etc.

PREPARAÇÃO E FIXAÇÃO DE ESFREGAÇO

Em processos de coloração de rotina, uma boa observação microscópica depende tanto da preparação do esfregaço como de sua fixação à lâmina.

TÉCNICA

. Flambar a alça de platina (“em círculo”) ao rubro, deixar esfriar , conservando-a próxima à chama;

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. Depositar com o auxílio da alça, gotas da suspensão microbiana na lâmina, se for o caso, suspender a amostra da cultura na própria lâmina;

. Espalhar bem o material na lâmina, empregando movimentos rotacionais na alça de platina (do centro para a periferia), a f im de se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme;

. Secar a f ina película do material (esfregaço) ao ar ou pela passagem na chama do bico de Bunsen;

. Fixar o esfregaço, passando o dorso da lâmina três vezes ou mais na chama, a fim de que o material f ique bem aderido à lâmina;

. Deixar a preparação esfriar ao ar e corar.

A fixação do esfregaço com água pode formar aerossóis (partículas projetadas durante a fervura de l íquidos); evita-se introduzindo a lâmina no cone azul da chama (parte redutora, a mais quente), permanecendo alguns instantes a f im de secar o material.

A preparação e fixação do esfregaço requer cuidados evitando-se tratamentos bruscos, para que as células da amostra a serem observadas não fiquem aglomeradas dificultando a observação, como também não tenham seus arranjos característ icos destruídos.

COLORAÇÃO SIMPLES

Denomina-se de coloração simples à coloração em que se adiciona qualquer solução corante ao esfregaço fixado durante um determinado tempo (30s a 3 min) em função do corante utilizado. Depois se lava a lâmina em água corrente, seca-se e observa-se usando a objetiva de imersão.

Essa coloração tem a finalidade de nos dá uma visão da forma, do tamanho e dos arranjos das células, bem como de outros detalhes estruturais.

TÉCNICA 1. Preparar e f ixar o esfregaço;2. Cobrir com algumas gotas de uma solução corante (azul de metileno, cristal violeta, fucsina, safranina);3. Deixar o corante agir por 60s;4. Lavar em água corrente;5. Secar cuidadosamente na chama ou com papel absorvente;

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6. Observar com a objetiva de imersão (não esquecer de colocar 1 gota de óleo de imersão antes de adaptar a referida objetiva no eixo ótico).

Obsevação: Não se deve facilitar com os papéis absorventes usados, especialmente se os microrganismos em estudo forem patógenos.

PRÁTICA N 5

OBJETIVOS:

Realizar coloração Diferencial de Gram Observar ao microscópio sob imersão as preparações

in vitro

Diferenciar as formas de bactérias (cocos, bacilos) e arranjos celulares ( em cadeia, tétrades, cúbicos, em cachos).

COLORAÇÕES DIFERENCIAIS

As colorações diferenciais distinguem grupos de microrganismos entre si , devido à diferenças químicas existentes entre as células microbianas.

Nesta técnica de coloração utiliza-se inicialmente soluções de corantes e mordentes; numa segunda etapa um agente diferenciador; para finalmente realizar outra coloração que contrasta com a primeira.

COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM

Em 1884, CHRISTIAN GRAM descobriu um método de coloração, baseado no fato de que, quando certas bactérias são coradas pelo cristal de violeta e depois tratadas pelo iodo (solução iodo-iodetada, dita lugol),forma-se um composto de coloração escura entre o iodo e o corante, o qual é fortemente removido pelo tratamento subsequente com álcool (diferenciador). São as bactérias Gram positivas, as que tomam o corante de Gram (cristal violeta). Outras bactérias, ditas Gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo álcool. Assim sendo, se após a ação do álcool, f izermos uma coloração de fundo pela safranina ou pela fucsina básica, as bactérias Gram negativas aparecerão vermelhas.

MECANISMO DA COLORAÇÃO DE GRAM

As bactérias Gram positivas e Gram negativas interagem com o corante cristal violeta devido às ligações iônicas entre os grupos básicos dos corantes e grupos ácidos dos constituintes celulares. O iodo em solução penetra nos dois tipos de células e forma um precipitado com o corante. O agente descorante (álcool etíl ico ou acetona) nas células Gram negativas passa facilmente através da membrana celular

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dissolvendo o complexo corante-iodo, deixando a célula incolor. Nas células Gram positivas o álcool penetra com dificuldade e a dissolução do complexo é lenta. A maior parte do complexo corante-iodo permanece na célula que retém assim a sua coloração. Pela adição do contracorante (safranina ou fucsina básica) as células Gram positivas permanecem violetas enquanto as Gram negativa interagem com o mesmo, ficando vermelhas.

As diferenças químicas entre os constituintes da parede celular das bactérias são responsáveis pela retenção ou não do cristal violeta.

Todas as células desprovidas de parede celular (certos protozoários), bem como as células artif icialmente despojadas de parede celular (mesmo que sejam Gram positivas), comportam-se como Gram negativas.

As bactérias Gram negativas contêm uma concentração elevada de lipídeos, e suas paredes são também mais delgadas com relação às bactérias Gram positivas. O descoramento extrai os l ipídeos aumentando a porosidade ou permeabilidade da parede favorecendo a retirada do complexo cristal violeta-iodo.

As paredes celulares das bactérias Gram. positivas em virtude de sua composição diferente (menos conteúdo lipídico, presença de ácido teicóico, maior quantidade de peptoglicano (mucocomplexo) cujos aminoácidos encontram-se mais intercruzados, deixando a parede mais compacta), tornam-se desidratadas durante o tratamento com o descorante; a porosidade diminui, a permeabilidade se reduz e o complexo cristal violeta-iodo não é extraído.

O método de Gram é dentre os processos de coloração para bactérias, o mais importante.

Todas as leveduras quando submetidas a esta coloração comportam-se como Gram positivas, enquanto os fungos filamentosos e para os protozoários, geralmente não se aplica esta técnica por não ser conveniente.

REGRAS GERAIS DA COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM

1 - Os cocos, são geralmente Gram-positivos, com exceção dos pertencentes ao gênero Neisseria (Gonococos , Meningococos ) .

2 - Os bacilos, são geralmente Gram-negativos, excetuando-se os pertencentes aos gêneros: Corynebacterium (bacilo diftérico); Bacillus

(B. subtilis ) , B. antracis (do carbúnculo) e Clostridium (bacilo do tétano

Cl . tetani ; Cl. botulinum (do botulismo).

TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM

1. Preparar um esfregaço;2. Depois de frio cobrir o esfregaço com solução de cristal de violeta

(1 minuto);

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3. Cobrir com solução de lugol (mordente) - 1 minuto;4. Lavar em água corrente;5. Descorar pelo álcool absoluto (evitar o descoramento deficiente ou

em excesso);6. Lavar em água corrente;7. Contrastar, rapidamente com safranina (30 segundos);8. Lavar em água corrente;9. Secar com papel f ino;10. Examinar com objetiva de imersão.

AMOSTRAS:

Bacillus subtilis Escherichia coli Aerobacter aerogenes Staphylococcus aureus Sarcina lutea Micrococcus

PRÁTICA N 6

OBJETIVOS:

Realizar coloração Especial de esporos Observar ao microscópio sob imersão as preparações coradas

COLORAÇÃO DE ESPOROS

Os esporos são células de resistência, não sendo característica predominante de todos os microrganismos. Algumas bactérias são capazes de formar esporos, como por exemplo: bactérias do gênero Bacillus e Clostridium.

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TÉCNICA

1. Preparar o esfregaço e fixar;2. Cobrir o esfregaço com papel de fil tro;3. Adicionar o corante verde malaquita;4. Aquecer até emissão de vapores;5. Repetir as operações 3 e 4 por 3 minutos;6. Lavar em água corrente;7. Adicionar safranina (0,5 a 1 minuto);8. Lavar em água corrente;9. Secar e observar em imersão.

RESULTADO: Os esporos coram-se em verde e o resto da célula em vermelho.

PRÁTICA N 7

OBJETIVOS:

Preparar meios de cultura de usos em práticas microbiológicas Distribuir convenientemente, esterilizar em autoclave.

PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

Meios de cultura são associações de substâncias que permitem o cultivo dos microrganismos fora do seu meio natural.

Nas preparações dos meios de cultura todos os nutrientes devem ser dissolvidos em água para que possam ser absorvidos pelas células microbianas.

Nos laboratórios geralmente util iza-se água desti lada no preparo destes meios, no entanto nas unidades industriais costuma-se uti lizar água de rios ou poços. A água deve ter boa origem e composição química constante; quando necessário, deve ser devidamente tratada.

Como constituinte básico dos meios de cultura, além da água, pode-se especificar: as fontes de carbono, as fontes de nitrogênio, os sais. Em meios de cultura solidificados, além destes componentes deve-se introduzir agar, gelatina ou sílica gel com a função específica de solificar esses meios.

NORMAS DE PREPARAÇÃO

Pesagem dos componentes: os diversos componentes dos meios de cultura podem ser pesados separadamente, ou consecutivamente num único recipiente (Béquer). Para quantidades inferiores a 1g uti liza-se uma balança analítica (semianalítica).

O Agar-agar geralmente é pesado separadamente, sendo o valor da pesagem em função da quantidade do meio a ser distribuído nos recipientes. Utiliza-se de 10 a 20g deste agente solidificante em pó para cada l itro de solução nutriente.

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Solubilização dos componentes: adicionar os nutrientes previamente pesados a um Béquer contendo água destilada em quantidade suficiente para dissolvê-los. Os extratos de carne e de leveduras podem ser aquecidos ligeiramente para facili tar a solubilização. Deve-se evitar o uso de fogo direto e prolongado para não haver queima do material e consequente escurecimento do meio.

O Agar não é solúvel a frio, devendo se necessário ser solubilizado em um banho-maria ou em autoclave a vapor fluente.

Ajuste do pH nos meios: deve-se deixar resfriar ao máximo os meio líquidos, antes de acertar o pH. No caso dos meios solidificados ajustar na menor temperatura em que não haja solidificação.

São empregadas para ajuste do pH soluções de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico a 0,1 N, conforme o caso. Na maioria dos casos pode-se verificar o pH através do uso de um papel de tornassol.

Em meios solidificados, o pH ácido só deverá ser ajustado depois da esteril ização para evitar a hidrolise do Agar quando em temperatura elevada. Neste caso o pH ácido é ajustado com uma solução estéril de ácido lático.

Clarificação: em alguns casos há necessidade de clarificação dos meios que durante o preparo tornam-se turvos. A clarificação pode ser feita simplesmente pelo calor ou pelo uso de clara ou albumina de ovo, aquecendo em seguida até ebulição e f iltrando-se em gaze ou algodão hidrófilo.

Distribuição, esterilização e conservação: os meios de cultura depois de preparados são distribuídos em recipientes adequados (tubos, balões, Erlenmeyeres), especificando o respectivo nome ou sigla e a data do preparo dos mesmos. Terminada a distr ibuição, os tubos, balões ou Erlenmeyers são arrolhados com algodão ou tampas metálicas especiais, acondicionados em cestas e levados à esterilização em autoclave. A temperatura e o tempo de exposição neste equipamento dependem da composição e da quantidade de meio de cultura recipiente (vide esterilização).

Após a esterilização, os meios são resfriados espera-se 72 horas antes de usá-los ou estocá-los em geladeira, a fim de que se possa detectar algum tipo de contaminação, ou falha de esterilização.

COMPOSIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

AGAR NUTRITIVO

Extrato de carne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g

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Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0gAgar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0gÁgua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000mlpH = 6,8 - 7,0

BATATA GLICOSE AGAR - BGA

Batatas descascadas e cortadas em fatias . . . . . 300gÁgua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml

As batatas devem ser manuseadas com o mínimo de exposição ao ar. Aquecer em 500ml de água até completamente cozidas. Filtrar através de gaze, completar o volume para 1000ml e adicionar:

Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15,0gGlicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0g

pH = 6,8 - 7,0

CZAPECK (CZ)

NaNO3 (nitrato de sódio). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0gK2HPO4 (fosfato monoácido de potássio). . . . . . 1,0gMgSO4 (sulfato de magnésio). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5gKCl (cloreto de potássio). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5gFeSO4 (sulfato ferroso). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,01gSacarose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30,0gAgar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0gÁgua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1000mlpH = 6,6

CALDO GLICOSADO

Extrato de carne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0gPeptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0gGlicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10,0gÁgua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1000mlpH = 6,8 - 7,0

CALDO LACTOSADO

Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0gExtrato de carne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0gLactose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0gÁgua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1000mlpH = 6,8 - 7,0

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GODOY

Peptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0gCaldo de cana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500gAgar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15g

Juntar ao caldo de cana uma clara de ovo batida. Aquecer até fervura, fi l trar completando o volume até 1000ml. Juntar a peptona e o Agar.

GLICOSE LEVEDURA (GL)

Peptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0gExtrato de carne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0gNaCl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0gExtrato de levedura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0gGlicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0gAgar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12-15gÁgua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000mLpH 6,9 -7,1

EMB

Peptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0gLactose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0gSacarose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0gK2HPO4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0gAgar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12-15gÁgua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000mL

Dividir em balões de 250 mL, 100mL e 200mL de meio. Esterilizar a 120 o C por 20 minutos.

Quando for distr ibuir em placas para uso, fundir e adicionar para cada 100 mL de meio, 1mL de solução estéril de eosina (4%) e 1mL de solução estéril de azul de metileno (0,65%). As placas podem ser guardadas por uma semana em refrigerador.

GLICOSE AGAR (GA)

Extrato de carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0gPeptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0gGlicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0gÁgua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml

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pH = 6,8 - 7,0

VERDE-BRILHANTE

Peptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0gLactose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0gBile de boi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0gVerde brilhante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0133gÁgua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000mLpH = 7,2

Autoclavar a 115 oC por 15 min. Para adicionar o verde brilhante pode-se preparar uma solução a 0,1% em água destilada (0,1g de verde brilhante em 100mL de água destilada) e dela juntar 13,3 mL ao meio de cultura.

Distribuir 10mL do caldo em tubos grande com tubinhos de Duhran.

SORO DE LARANJA

Triptona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0gExtrato de leveduras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0gGlicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,0gFosfato dipotássico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15,0gSoro de laranja. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200,0mlÁgua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .800,0ml

Preparar o soro de laranja aquecendo 1 l itro do suco recém-extraído, a aproximadamente 93 C. Adicionar 30g de diatomácea e misturar. Filtrar com sucção através de um funil de Buchner usando papel de fi ltro grosseiro recoberto com o auxílio de fil tração. Refiltrar os primeiros milil i tros. Ajustar o pH a 5,5 , distr ibuir em recipientes adequados.

PRÁTICA N 8

OBJETIVOS:

Isolar bactérias, fungos filamentosos e leveduras de ambientes diversos

Identificar morfologicamente as espécies isoladas

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Os microrganismos em seus ambientes naturais (água, solo, ar etc.) existem como uma população mista. Para que possamos estudar uma determinada espécie de microrganismo nas suas características morfológicas e bioquímicas individuais é necessário separá-la das diversas espécies contidas nessa população, obtendo uma cultura pura e é formada por microrganismos derivados de uma única célula original.

O isolamento de microrganismos requer técnicas adequadas de inoculação destes microrganismos em meios de cultura adequados que possibilitem o seu rápido crescimento, l ivre de contaminações.

Para o cultivo, em condições laboratoriais, de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutri tivas e das condições físicas requeridas. Extensas pesquisas determinaram exigências nutrit ivas de muitas espécies de microrganismos e esta informação resultou no desenvolvimento de numerosos meios de cultura. Por causa da grande variedade das necessidades nutritivas dos microrganismos há, também, grandes diferenças na composição dos meios utilizados. Do mesmo modo, existem amplas variações no que se refere ao ambiente físico que favorece seu crescimento. Alguns microrganismos, por exemplo, crescem abaixo de 0 C; outros exigem temperatura acima de 45 C e podem desenvolver-se até mesmo a 70 C. certas bactérias necessitam do oxigênio atmosférico; outras são indiferentes ou inibidas pelo oxigênio.

MÉTODO DE ISOLAMENTO DE CULTURAS PURAS

Técnica de sementeira em superfície e de esgotamento do inóculo:

- Com o uso de uma alça de platina, coloca-se uma porção de

espécime na superfície de um meio de cultura com Agar.

- Espalhar a amostra de lado a lado, na superfície da placa, traçando linhas de acordo com as figuras 1 e 2, de modo que as bactérias individuais se separem umas das outras.

- Incubar as placas na temperatura adequada

- Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas

- Selecionar uma colônia característica da espécie estudada e anotar seus aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, forma, consistência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigmento solúvel etc.

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- Transferir com a ajuda de uma alça de platina, material da colônia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar à temperatura e tempo adequados.

- Examinar as característ icas do microrganismo através de observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações específicas utilizando para isso um microscópio ótico luminoso.

Técnica da placa derramada (pour-plate): O princípio da técnica é o da diluição do material em tubos de Agar liquefeito.

- Transfere-se uma alça de platina da suspensão original para o tubo A (Agar fundido). O tubo é rolado entre as mãos, permitindo a mistura completa do inoculo com o meio. Transferências similares são efetuadas do tubo A para o B e, deste, para o C.

- Os conteúdos de cada tubo são derramados em placas separados

- Incubar as placas na temperatura e período de tempo adequado

- Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas

- Selecionar uma colônia característica da espécie estudada e anotar seus aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, forma, consistência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigmento solúvel etc.

- Transferir com a ajuda de uma alça de platina, material da colônia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar à temperatura e tempo adequados.

- Examinar as característ icas do microrganismo através de observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações específicas utilizando para isso um microscópio ótico luminoso.

Técnica das diluições sucessivas: se o microrganismo suspeito, numa população mista, está presente em número maior do que outros germes podem ser obtidos em cultura pura por meio de uma série de diluições em meios apropriados.

- Transfere-se 1 mL ou 1g do material a ser examinado para um Erlenmeyer A contendo 99ml de água estéril . Homogeneizar-se permitindo a mistura completa do inoculo com a água. A parir daí, transfere-se 1mL para um tubo B com 9ml de água estéril , agita-se e repete a operação para os tubos restantes (C, D, E). Obtém-se assim uma série de diluições decimais.

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- De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 1

mL, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio fundido e resfriado a 45 oC;

- Incubar as placas na temperatura e período de tempo adequado;

- Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas.

Maiores detalhes sobre esta técnica estão no esquema apresentado na figura 2.

FIGURA 2 - Esquema de diluição da técnica das diluições sucessivas.

Visando facili tar o entendimento e treinar os alunos nas técnicas de isolamento acima referidas, foram selecionadas de algumas técnicas sobre bactérias, bolores e leveduras. Estas técnicas deveram ser realizadas em grupo de três alunos e realizadas num período de 1 a 2 semanas.

ISOLAMENTO DE Streptomyces sp. DO SOLO

MATERIAL

Amostra de terra secaErlenmeyer com 99 ml de água estéril4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril1 balão com meio de Czapeck (CZ)Placas de Petri esterilizadasTubos de ensaio com meio CzPlaca com meio AVP

TÉCNICA

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1o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que contém água estéril . Agitar para obter uma suspensão dos microrganismos existentes.Transferir com pipeta estéril , 1 ml da suspensão para um dos tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente sendo realizada uma série de diluições 10 - 2 , 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 -

6 .De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 1 ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de CZ fundido e resfriado a 45 oC.

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar à temperatura ambiente durante 5 a 7 dias.

2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de Streptomyces: pequenas, secas, de cores variadas. Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, características da superfície da colônia, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ e para uma placa com AVP, fazendo nesta últ ima uma estria no centro com auxílio de uma alça em L. Incubar.

3o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura. Testar a atividade antimicrobiana da cepa utilizando a placa de AVP que apresenta uma estria central; inocular diferentes germes (bactérias, leveduras) fazendo estrias perpendiculares à estria central, começando a 30 mm da estria central e terminando junto à mesma. Fazer placas testemunhas inoculando apenas as estrias de microrganismos-testes. Incubar as placas a 30 oC ou 37 oC dependendo da temperatura dos microrganismos-testes.

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4o DIA - Observar se houver inibição e medir (o halo correspondente) a distância em milímetros do crescimento do microrganismo-teste até a estria de Streptomyces.

OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega do relatório e do tubo de cultura isolada.

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ISOLAMENTO DE BACILOS ESPORULADOS DO SOLO

MATERIAL

Amostra de terra seca1 Erlenmeyer com 99 ml de água estéril1 tubos de ensaio contendo 10ml de caldo glicosado4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)Placas de Petri esterilizadasTubos de ensaio com meio AN

TÉCNICA

1o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no erlenmeyer que contém água estéril . Agitar para obter uma suspensão dos microrganismos existentes.Transferir com pipeta estéril , 1 ml da suspensão para um tubo de caldo glicosado. Imergir o tubo em água fervente pelo espaço de tempo de 5 minutos. Resfriar e transferir 1 ml do caldo para um tubo com 9ml de água estéril , agitar para homogenizar e repetir a operação para mais 3 tubos. Obtém-se assim uma série de diluições decimais 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45 oC.

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar à temperatura ambiente durante 48 horas.

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2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de bacilos esporulados: grandes, com bordos irregulares, de superfície rugosa. Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e incubar à temperatura ambiente.

3o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer lâmina “in vivo” para observar se há movimento. Realizar uma coloração de Gram e uma de esporos.


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ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE ÁGUA

MATERIAL

Amostra de água poluída1 Erlenmeyer com 99 ml de água estéril4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)Placas de Petri esterilizadasTubos de ensaio com meio AN

TÉCNICA

1o DIA - Pesar 1 mL da amostra e suspender no Erlenmeyer que contém 99mL de água estéril . Agitar para obter uma suspensão dos microrganismos existentes.Transferir com pipeta estéril , 1 ml da suspensão para um dos tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente sendo realizada uma série de diluições 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45 oC.

Agitar para homogeneizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar à temperatura ambiente durante 48 horas.

2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias

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t ípicas de bactérias. Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, característ icas da superfície da colônia brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e incubar à temperatura ambiente.



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ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE SORVETE

MATERIAL

Amostra de sorvete1 Erlenmeyer com 90 ml de água estéril4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)Placas de Petri esterilizadasTubos de ensaio com meio AN

TÉCNICA

1o DIA - Pesar 10 mL da amostra e suspender no Erlenmeyer que contém 90 mL de água estéril . Agitar para obter uma suspensão dos microrganismos existentes.Transferir com pipeta estéril , 1 ml da suspensão para um dos tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente sendo realizada uma série de diluições 10 - 2 ,10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de 1 ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45 oC.

Agitar para homogeneizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar à temperatura ambiente durante 48 horas.

2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias

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t ípicas de bactérias. Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, característ icas da superfície da colônia brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e incubar à temperatura ambiente.



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ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS COLIFORMES

MATERIAL

Amostra de água de banheiro, ou pedaço de queijo coalho ou carne de sol;Tubos com meio de verde brilhante lactose bile (VB)Tubos de ensaio contendo caldo lactosado1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN)Placas de Petri com meios diferenciais (EMB ou Endo ou TTC)Tubos de ensaio com meio AN

TÉCNICA

1o DIA - Inocular o tubo de Verde-brilhante com o material a ser pesquisado, incubar a 35 oC por 48 horas.

2o DIA - Inocular o tubo fermentado em placas de Petri com meio diferencial seguindo um dos esquemas abaixo.

Incubar à 35 oC durante 48 horas.

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3o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de coliformes. Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e para um tubo com caldo lactosado (CL) incubar à 35 oC.

4o DIA - Observar se o tubo de caldo lactosado fermentou e então se o tubo tiver dado resultado positivo (presença de bolha de ar) prosseguir a análise com o tubo de cultura com o meio de Agar nutrit ivo (AN). Realizar uma coloração de Gram e uma de esporos. Anotar os resultados e comparar com a l iteratura.


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ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DO IOGURTE (Lactobacillus e Streptococcus)

MATERIAL

Uma amostra de Iogurte natural

Placa de Petri com meio de Agar glicose levedura (GL) Tubos de ensaio com meio de leite desengordurado Tubos de ensaio com meio de Agar glicose levedura (GL)

TÉCNICA

1o DIA - Fundir e resfriar o meio de cultura; em seguida distr ibuir em placas de Petri . Quando o meio solidificar fazer estrias com o material pesquisado na superfície de cada uma das placas.Cada aluno deverá realizar a técnica de esgotamento util izando apenas uma placa, segundo o desenho abaixo:

ou então, com uma alça em L fazer estrias paralelas a partir da gota depositada na primeira placa e continuando em mais duas placas do mesmo meio, segundo o esquema abaixo:

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Agitar para homogeneizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar em condições anaeróbicas ou sob tensão de CO 2 (por exemplo, utilizando uma lata cuidadosamente no fundo da lata e a seguir fechar bem, por um período de 48 a 72 horas.

2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias distintas.Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com meio de GL e para um tubo com meio de leite (o qual pode conter um corante indicador). Incubar.

3o DIA - Observar o se há coagulação no tubo com meio de leite. Verificar se há crescimento no tubo de GL e realizar uma coloração de Gram. Incubar. Comparar com os dados obtidos na prática com os fornecidos pela li teratura.


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ISOLAMENTO DE BOLORES DO SOLO

MATERIAL

Uma amostra de terra seca

Um Erlenmeyer com 99 ml de água estéril4 tubos com 9 ml de água estérilUm balão com meio de Czapeck (CZ) fundido8 placas de Petri estéreis4 tubos e quatro placas com meio de Czapeck

TÉCNICA

1o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que contém água estéril . Agitar para obter uma suspensão dos microrganismos existentes.Transferir com pipeta estéril , 1 ml da suspensão para um dos tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente sendo realizada uma série de diluições 10 - 2 , 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 -

6 .

De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de CZ fundido e resfriado a 45 oC.

Agitar para homogenizar e incubar à temperatura ambiente durante 5 a 7 dias.

2o DIA - ( 5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de bolores: f ilamentosas, grandes, de

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cores variadas.Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara úmida. Incubar

4o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de hifas, t ipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o gênero do fungo em estudo


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ISOLAMENTO DE BOLORES DO MATERIAL MOFADO

MATERIAL

Uma amostra de pão, queijo, fruta ou outro material mofado.

Placa de Petri com meio de Czapeck (CZ) e Batata-glicose-agar (BGA) Tubos de ensaio com meio de CZ e BGA

1o DIA - Fundir e resfriar os meios de BGA e CZ; em seguida acidificar com ácido lático a pH 3,5. Distribuir em placas de Petri . Esperar solidificar. Com o auxílio de uma alça em agulha incubar material mofado no centro de cada um dos meios contidos em placas. Incubar à temperatura ambiente durante 5 dias.

2o DIA - (5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de bolores: f ilamentosas, grandes, de cores variadas.Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara úmida. Incubar

4o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de hifas, t ipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o gênero do fungo em estudo

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ISOLAMENTO DE FUNGOS DO AÇÚCAR CRISTAL

MATERIAL

Açúcar cristal

Erlenmeyer com 99 ml de água estérilBalão com batata-glicose-agar (BGA) acidificado a pH 3,5Balão com meio de Czapeck (CZ)Placas de Petri estéreisTubos de ensaio com BGA e CZ

TÉCNICA

1o DIA - Pesar 11g de açúcar e transferir para o Erlenmeyer com água estéril , agitando bem para dissolver.Transferir porções de 1 e 2 ml para placas de Petri .Os meios de cultura CZ e BGA devem ser fundidos, resfriados a 45 oC e em seguida acidificados com ácido lático a pH 3,5.

Adicionar os meios de cultura às placas. Deixar esfriar para solidificar (2 a 3minutos) e incubar à temperatura ambiente durante 5 a 7 dias.

2o DIA - (5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e escolher colônias t ípicas de bolores: f ilamentosas, grandes, de cores variadas.Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar.

3o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara

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úmida. Incubar4o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de

hifas, t ipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o gênero do fungo em estudo.


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ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE FRUTA

MATERIAL

Fruta (uva, maçã, abacaxi, mamão, cajá etc.)

Erlenmeyer com 50 ml de caldo glicosado (CG)Meio de glicose Agar (GA)Ácido láticoPlacas de Petri estéreisTubos de ensaio estéreisTubos de ensaio para fermentação com caldo glicosado

TÉCNICA

1o DIA - Acidificar o caldo glicosado com ácido lático a pH 3,5.Cortar a fruta com casca e macerar com ajuda de uma faca. Transferir para o Erlenmeyer com o meio acidificado, agitar e incubar à temperatura ambiente, durante 48 a 72 horas.

2o DIA - Adicionar os meios de cultura às placas. Deixar esfriar em repouso para solidificar. Com uma alça de platina, depositar uma gota do caldo na superfície do meio contido na placa de Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo o esquema abaixo:

ou então, com uma alça em L fazer estrias paralelas a partir da gota depositada na primeira placa e continuando em mais duas placas do mesmo meio, segundo o esquema a seguir:

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Incubar à temperatura ambiente por 48 horas.

3o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de leveduras.Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com GA e para um tubo com meio de CG. Incubar.

4o DIA - Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e observar se a levedura é fermentativa. Realizar uma observação “in vivo” e com coloração simples. Anotar os aspectos microscópicos do microrganismo em estudo, tais como: t ipo de reprodução (fissão, gemulação, esporulação), presença de grânulos, de vacúolos.


I

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ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE CALDO-DE-CANA

MATERIAL

Caldo de cana fermentado (24horas)

Meio de glicose Agar (GA)4 Placas de Petri estéreisTubos de ensaio estéreisTubos de ensaio para fermentação com caldo glicosado

TÉCNICA

1o DIA - Adicionar os meios de cultura às placas. Deixar esfriar em repouso para solidificar. Com uma alça de platina, depositar uma gota do caldo na superfície do meio contido na placa de Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo um dos esquemas abaixo:

Incubar à temperatura ambiente por 48 horas.

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2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de leveduras.Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com GA e para um tubo com meio de CG. Incubar.

3o DIA - Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e observar se a levedura é fermentativa. Realizar uma observação “in vivo” e com coloração simples. Anotar os aspectos microscópicos do microrganismo em estudo, tais como: t ipo de reprodução (fissão, gemulação, esporulação), presença de grânulos, de vacúolos.


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PRÁTICA N 9

OBJETIVOS:

Determinar a densidade celular por turbidimetria Obter o número de células por contagem em placa Confeccionar uma curva de calibração de uma espécie microbiana

Um cultivo de bactérias ou leveduras em meio líquido, atua como uma suspensão coloidal, refletindo ou pondo obstáculos a passagem da luz através do mesmo. Até certo ponto, a luz que foi absorvida ou refletida é proporcional a concentração de células presentes na suspensão. A turvação que apresenta um tubo de ensaio contendo uma cultura em crescimento é provocada pela absorção e reflexão da luz. Portanto, ao se medir a percentagem de absorção da luz (turbidimetria) ou a reflexão da luz (nefelometria) se pode estimar a concentração de células presentes. Ficaremos restritos ao primeiro caso.

Para as medidas turbidiméricas da massa celular, podem ser util izados instrumentos como um espectrofotômetro ou foto colorímetro.

Na turbidimetria, a capacidade do cultivo para deter a luz, se expressa como percentagem de luz transmitida, sendo esta percentagem inversamente proporcional à concentração de células. A percentagem da transmitância (T) é igual a I /I 0 , sendo I 0 , a intensidade da luz incidente e I , a intensidade da luz transmitida.

Para verificar a relação direta proporcional entre a concentração de células e a absorbância da luz (Densidade Ótica, DO = log I 0 /I) , vamos medir a turbidez de várias diluições (Figura 3) de uma suspensão de uma cultura de E.coli e proceder a contagem em placa destas diluições.

Material

- Microrganismos: Escherichia coli (bactéria) Saccharomyces cerevisiae (levedura)

- Meios de cultura:

Caldo lactosado Caldo glicosado

- Equipamentos: Agitador magnético Espectrofotômetro

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- Diversos:

Tubos ou cubetas para o espectrofotômetro Pipetas de 5 ml esterilizadas

Métodos

- Fazer a diluição das culturas, conforme mostra a f igura 3.

- Calibrar o espectrofotômetro, util izando luz com comprimento de onda variando entre 500 e 600nm. Colocar no aparelho um tubo contendo 5ml de meio de caldo lactosado ou caldo glicosado estéril . Com este tubo (“branco”) o espectrofotômetro é ajustado para D.O. igual a zero, ou transmitância igual a 100%;

- retirar o “branco” do aparelho e colocar o tubo da cultura. Fazer a leitura da D.O. e anotar o resultado. Imediatamente proceder a contagem em placa, da cultura no tubo que foi feita a leitura no espectrofotômetro.

- repetir o mesmo procedimento para os demais tubos da cultura diluída, ajustando sempre o espectrofotômetro contra o “branco”, a cada leitura, e agitando bastante o tubo com a cultura;

- para a contagem em placa, dos tubos contendo a cultura de E.coli e S. cerevisiae fazer diluições até 1x10 - 7 e plaquear em duplicata 1 ml das diluições de 1x 10 - 4 a 1x10 - 7 .

FIGURA 3 . Diluição da cultura para leitura no espectrofotômetro

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Resultados

Anotar na tabela, os resultados das leituras das densidades óticas e das correspondentes contagens em placas.

Após obter o número de células por contagem em placa, das diluições, relacionar num gráfico, os valores da D.O. das diversas diluições na ordenada, contra os números de microrganismos correspondentes que se determinou. Assim, obtemos uma curva de calibração para o referido microrganismo nas condições do experimento.

Diluições da cultura(ml)

Densidade Ótica (D.O)

Concentração celular(células/ml)

1/21/41/8

1/161/321/64

PRÁTICA N 10

OBJETIVOS:

Obter a concentração de células de leveduras pelo uso de câmara de contagem (câmara de Neubauer).

A contagem direta por microscópio é a mais rápida, e é levada a efeito com a contagem de organismos num volume conhecido da cultura. Esta enumeração é feita com o auxílio de lâminas espessas, conhecidas como câmaras de contagem. As mais comuns são as de Petroff-Hausser, Neubauer e as de Helber. Estas câmaras apresentam uma área reticulada, com pequenos quadrados de superfície conhecida. Fazendo parte do conjunto, existe uma lamínula que recobre os pequenos quadrados, de modo que a altura destes à lamínula é conhecida.

No nosso experimento, as leveduras serão contadas numa câmara de Neubauer, que apresenta uma área dividida em quadrados com 1/400 mm2 ; a câmara é coberta com uma lamínula, deixando uma altura de 1/10 mm, i .é. , de cada quadrado à lamínula. Assim sendo o volume que fica acima de cada quadrado é de 1/4000 mm 3 .

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Esta contagem inclui organismos viáveis e mortos, sendo denominada de contagem total de células.

Este método de contagem direta, tem a vantagem de fornecer um resultado quase imediato, no entanto tem a desvantagem de não se ter a distinção entre células vivas e mortas.

Material

- Microrganismo:Cultura de Saccharomyces cervisiae

- Reagentes:Solução salina fisiológica (0,85% NaCl)

-Equipamentos:

Microscópio ótico comumCâmara de contagem de NeubauerBico de Bunsen

- Diversos:Pipeta Pasteur

Métodos

-Adicionar com uma pipeta Pasteur ou similar, uma gota da suspensão da cultura de levedura sobre a área reticulada da câmara;

-colocar a lamínula sobre a gota. Alternativamente, pode-se colocar primeiro a lamínula, e deixar-se que a suspensão do microrganismo, que sai da pipeta, escorra por ação capilar sob a lamínula;

- esperar cerca de dez minutos, até que o material sedimente;- usando a objetiva de 40-45X, contar as leveduras em cerca de

10 quadrados dispostos em “X” (ver f igura 2).

Resultados

- Calcular o número de leveduras/mL, contidas em uma suspensão uti liza-se a seguinte fórmula.

Concentração Celular (leveduras/mL) = n x 25000 x diluição

onde n= número de células dos quadrados

Exemplo:

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n = 232

diluição 1:100

Concentração celular = 232 x 25000 x 100 = 5,8 x 10 8 células/mL

PRÁTICA 11

OBJETIVO: Determinar uma curva de calibração para a determinação da concentração da levedura Saccharomyces cerevisiae a partir do fermento prensado.

INTRODUÇÃO:

A partir do conhecimento do teor de matéria seca em fermento prensado comercial é possível preparar uma suspensão padrão de leveduras, de determinada concentração, com bastante confiabilidade. Através de uma série de diluições convenientes dessa suspensão padrão são obtidas novas suspensões de concentrações conhecidas. Finalmente, a turbidez provocada no meio pelas diferentes suspensões de leveduras é medida através de um instrumento adequado e os valores obtidos são relacionados com as respectivas concentrações por intermédio de uma expressão matemática.

As diluições adequadas são obtidas através de tentativas de forma a abranger um intervalo de concentrações que atenda as seguintes condições:

1 a . ) Deve haver uma correlação linear entre a concentração e o logaritmo da transmitância e;

2 a) Os valores das transmitâncias obtidas devem estar situadas na região de maior sensibilidade na escala do instrumento util izado.

TÉCNICA:

1. Em um copo de Béquer de 50 ml pesar, em balança semianalítica, 2g de fermento prensado, anotando o valor exato. Diluir em um pouco de água e transferir , analiticamente, para um balão de 1000 ml. Completar o volume e homogeneizar;

2. A partir da concentração da suspensão padrão escolher os valores para as concentrações, de forma a cobrir uma determinada faixa de concentrações;

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3. Realizar uma série de diluições com um conjunto de pipetas e balões volumétricos adequados. Utilizar como sugestão os valores da tabela abaixo.

Suspensão número

Conc. da diluição,

X (g/l)

Fator de diluição

Modo de preparo

(ml da susp. padrão)

1 0,1 20x 25 até 5002 0,2 10x 25 até 2503 0,3 6,67x 15 até 1004 0,4 5x 20 até 1005 0,5 4x 50 até 2006 0,6 3,33x 15 até 50 7 0,8 2,5x 20 até 508 1,2 1,67x 15 até 25

4. Homogeneizar cada suspensão e transferir para um tubo de espectrofotômetro previamente ajustado ao comprimento de onda de 610 nm.

5. Realizar, pelo menos, duas leituras do valor da absorbância para cada concentração. O espectrofotômetro é calibrado antes de cada leitura, com um “branco” de água destilada.

6. Construir um gráfico, colocando no eixo das ordenadas os valores da concentração X (g/l) e no eixo da abscissa os valores da absorbância (D.O).

7. Fazer uma regressão linear com o auxílio de um programa de computador ou util izando o método dos mínimos quadrados.

8. Calcular o coeficiente de correlação, r , e determinar o intervalo de concentrações, X 1 X2 , no qual a expressão é válida.

Observação: A curva de calibração obtida pelos pontos descritos é válida apenas para o fermento prensado utilizado na sua confecção.

PRÁTICA 12

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OBJETIVOS:

Avaliar o crescimento de um microrganismo em diferentes meios de cultivo;

Confeccionar a curvas de crescimento celular, utilizando o método turbidimétrico;

Calcular o tempo de geração (G) e a velocidade específica máxima de crescimento (m á x) e a produtividade celular (P) em cada meio de cultivo.

INTRODUÇÃO:

O crescimento microbiano pode ser definido em termos, tanto da massa, como também do número de células. Em condições de crescimento exponencial, massa celular e número de células permanecem proporcionais, embora a relação entre estes dois valores possa variar em determinadas condições de cultivo. O crescimento de um microrganismo em diferentes meios de cultivo, por exemplo, pode ser avaliado pela determinação da massa celular que, por sua vez, pode ser medida indiretamente pela turvação de uma suspensão.

A evolução do crescimento pode ser avaliada uti lizando um cultivo em batelada em condições de incubação controladas. Com leituras da densidade óptica (absorbância) de uma série de amostras retiradas a intervalos de tempo regulares, e com auxílio da curva padrão de calibração, é possível confeccionar uma curva de crescimento relacionando a concentração celular (ordenada) com o tempo de cultivo (abscissa). Nesta curva são, então, identificadas as diferentes fases do crescimento microbiano.

Durante a fase exponencial de crescimento pode-se então determinar o tempo de geração (G) e a velocidade específica máxima de crescimento (M Á X .) .

Pode-se ainda determinar a produtividade celular (P) que é a relação entre a variação da concentração celular pela variação do tempo de cultivo. Este valor deverá ser determinado pela seguinte equação:

P= (X f - Xo)/(t f - t o) )

Onde: X o = Concentração celular inicial , (g/l) X f = concentração celular f inal , (g/l) t f = tempo final, (h) t o = tempo inicial , (h)

MATERIAL

- Microrganismo Saccharomyces cerevisiae

- Meios de cultura

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Caldo nutrit ivo suplementado com 1% de açúcar (glicose, frutose e sacarose)

- Equipamentos: Espectrofotômetro Mesa agitadora (rumbeira) Balança semianalít ica

- Diversos: Cubetas do espectrofotômetro Tubos de ensaio estéreis 3 Erlenmeyers, 1000 ml Pipetas, 10 ml MÉTODOS

1. Preparar 1,5 li tros de caldo nutritivo, distribuir 500 ml em 3 Erlenmeyers de 1000 ml de capacidade. Adicionar no primeiro 5g de glicose, no segundo 5 g de sacarose e no terceiro 5 g de frutose, homogeneizar e esterilizar a 121 oC por 15 minutos. Deixar esfriar;

2. Retirar uma amostra de 5-10 ml de cada meio para servir como um branco;

3. Colocar os Erlenmeyers na balança semi-analítica e inocular esterilmente cerca de 0,2 a 0,4 g do microrganismo Saccharomyces cerevisiae (fermento prensado) ;

4. Retirar 3 ml de amostra com uma pipeta estéril , imediatamente após a inoculação, correspondente, portanto, ao tempo zero. Efetuar a leitura da Absorbância (ou densidade óptica). Anotar o resultado;

5. Colocar os Erlenmeyers na mesa agitadora, tendo o cuidado de fixá-los bem. Ligar a agitação a 9000 rpm. Deixá-los sobre agitação durante todo o cultivo;

6. Retirar amostras de 3 ml a intervalos de 1 hora, até que se observe um mínimo de três valores idênticos, ou muito próximos, de densidade óptica (DO). Anotar os resultados;

7. Construir um gráfico para cada meio de cultivo, colocando no eixo das ordenadas os valores do tempo (h) e no eixo das abscissas concentração X (g/l) ;

1. Calcular a velocidade específica máxima de crescimento ( m á x) o tempo de geração (G) e a produtividade celular (X/ t) em cada meio de cultivo;

1. Comparar os resultados obtidos e tirar conclusões a respeito do meio mais adequado ao crescimento.

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Modelo de registro tabular Meio de Cultivo:

Tempo (h)

Densidade Óptica(DO)

ConcentraçãoX(g/l)

012345678

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Práticas de Microbiologia2010

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