Prtica Laboratorial 5

Reaes caractersticas dos glcidos

Trabalho Realizado Por:Beatriz Lopes Dias Vieira da Silva 45517Cludia Filipa Abreu Miranda-44813Hugo Daniel dos Santos Videira-44804

ndice

Sumrio1. Resumo32. Apresentao, Tratamento e Discusso dos Resultados42.1. Testes de identificao de glcidos42.2. Doseamento de glcidos redutores numa farinha alimentar7Reao do mtodo do dinitrosalicilato8Clculo da concentrao de glucose83. Bibliografia11Lehninger Principles of Biochemistry, 6th Edition David L. Nelson, Michael M. Cox, Macmillan, International Edition, 2013.114. Questes a desenvolver11

1. Resumo

2. Apresentao, Tratamento e Discusso dos Resultados

2.1. Testes de identificao de glcidos

2.1.1. Chave dicotmica de identificao de glcidos

2.1.2. Quadro-resumo dos resultados obtidos.

2.1.3. Discusso dos resultados obtidosEstrutura qumica dos glcidos utilizados:

Glucognio (uma molcula est entre parntesis rectos)Amido

Teste BenedictO reagente de Benedict uma soluo alcalina de CuSO4 com Na2Co3 e citrato de sdio (Na3C6H5O7 ). O io citrato forma um complexo com o io Cu2+, impedindo que este precipite da soluo sob a forma de Cu(OH)2 (de cor azul) ou CuO (de cor preta). O Cu2+ do reagente de Benedict oxida os glcidos redutores presentes numa soluo, originando uma variedade de produtos ao mesmo tempo que Cu2+ reduzido a Cu+ .Os glcidos que contm grupos hemiacetlicos esto em equilbrio na forma de um agente redutor muito activo enodiol. A sua presena garante a reduo dos ies Cu2+ a Cu+ levando a formao de hidrxido cuproso que por aquecimento se transforma em xido cuproso que se identifica por ser insolvel e de cor vermelha. Para umm glcido ser redutor a extremidade do carbono anomrico (C1 para as hexoses e C2 para as pentoses) pode estar ou no livre, ou seja, pode ou no, devido sua reatividade, ter funes de aldedo (capacidade que a ligao dupla tem de ceder um par de eletres). Foram testados sete glcidos diferentes, sendo o tubo controlo da reao, o tubo de ensaio contendo gua destilada e reagente de Benedict. Analisando os resultados obtidos, apenas as solues de xilose, glucose, frutose e lactose reagiram, o que foi possvel observar pelas alteraes de cor e formao de precipitado, por isso conclui-se que so os nicos glcidos redutores. No caso da glucose, frutose e xilose verifica-se que apresentam a extremidade do carbono anomrico livre, o que as torna potenciais glcidos redutores, fazendo com que o resultado da reao com o reagente de Benedict seja positivo. Verificou-se que, nessas solues ocorreu uma mudana de colorao do azul para laranja avermelhada, assim como a formao de precipitado, donde se conclui que os carbonos anomricos livres reduziram o cobre do reagente. Estes resultados experimentais permitem afirmar que tanto a xilose, como a glucose e a frutose so oses redutoras.Observou-se, tambm, a formao de um precipitado e alterao de cor para laranja avermelhado no tubo que continha a lactose, que um disido. Apesar de ser um disido composto por duas oses (a galactose e a glucose), a lactose um glcido redutor, uma vez que o carbono anomrico da glucose se encontra em condies de reduzir o cobre do reagente (livre).Quanto aos restantes tubos, estes tiveram reaes negativas (tubos que continham sacarose, amido e glucognio) porque os grupos hemiacetlicos fazem parte das ligaes entre os monmeros, ficando assim indisponveis, como no caso da sacarose ou ento os grupos redutores encontram-se no interior dos polisidos (estrutura em hlice) ou ocupados a fazer ligaes glucosdicas ficando no reativos, no caso do amido e do glucognio.

Teste de BarfoedAs oses e os disidos redutores tm velocidades de reao distintas quando em contacto com o reagente de Barfoed (soluo de acetato de cobre em cido actico) pelo que se podem distinguir por este mtodo. A capacidade redutora de oses e disidos diminuda em meio cido ao contrrio do que acontece no teste de Benedict. No entanto, tal como no mtodo antes referido, ocorre a oxidao das oses e o Cu2+ reduzido a Cu+, precipitando sob a forma de xido cuproso de cor vermelha.As mesmas sete solues foram testadas com este mtodo, utilizando-se novamente como controlo negativo o tubo que continha gua destilada, no entanto aqui j foram utilizados controlos positivos, sabendo-se que as solues que as solues de xilose, glucose e frutose continham oses redutoras. Pelos resultados do Quadro , conclui-se que os resultados obtidos foram os es-perados: resultados positivos para os tubos que continham solues de xilose, glucose e frutose oses redutoras (resultado do teste anterior), negativos para a lactose e a sacaro-se disidos, com capacidades de oxidao do grupo carboxilo do carbono onomrico significativamente inferiores que as das oses e tambm negativos para o amido e o glu-cognio visto que os ltimos dois so polisidos, assim sendo no ocorre reao e o Cu2+ no reduzido.

Teste do IodoO Teste do Iodo permite identificar a presena de polisidos em soluo, mais ou menos ramificados, devido formao de um composto corado com cores diferentes para os diferentes glcidos. Deste modo, polisidos ramificados com hlices interrompidas originam complexos castanhos e polisidos muito ramificados com pequenos segmentos helicoidais formam complexos castanho-avermelhados.Depois de aplicado este mtodo a todos os tubos, comprovou-se que o teste apenas deu positivo na presena de polisidos, o amido e o glucognio.Teoricamente, uma vez que tanto o amido como o glicognio so polisidos ramificados, na presena do reagente KI, forma-se um complexo de iodo, conferindo soluo uma colorao varivel, de acordo com o grau de ramificao. Uma vez que o amido um polisido pouco ramificado, apresenta uma colorao menos intensa do que o glicognio, que um polisido mais ramificado. Este ltimo apresenta uma colorao mais intensa. de salientar que a sacarose, que tal como o amido e o glucognio tinha dado resultado negativo nos outros dois testes, neste teste no obteve um resultado positivo pois no se observou qualquer alterao, uma vez que esta um disido e no tem capacidade de reagir com o iodo. Nos restantes tubos, como era esperado, obtiveram-se resultados negativos, pois para ocorrer um resultado positivo necessrio que o glcido apresente mais de 35 resduos de glucose da que com os sidos e os disidos se obtenha um resultado negativo.2.2. Doseamento de glcidos redutores numa farinha alimentar

Fluxograma comentado

Pesar 80 mg de farinha alimentar e reduzir a p fino com o auxlio de um almofariz Pesar aproximadamente 50 mg de amostra e registar a massa at ao dcimo de mg Transferir o material pesado para um tubo de ensaio e adicionar10mL de H2SO4 1,5MAquecer o tubo de ensaio num banho de gua em ebulio durante 20min na hotte, agitando de vez em quandoArrefecer o tubo torneira e transferir o contedo para um erlenmeyer de 50mL com rolhaLavar o tubo cuidadosamente com 12mL de NaOH a 10% e transferir para o mesmo erlenmeyer Aquecer ligeiramente o erlenmeyer e filtrar enquanto quente para um balo de 50mL Lavar o erlenmeyer com gua destilada quente e adicion-la ao papel de filtro para transferir todo o hidrolisado Prefazer o volume do balo at 50 mL. Agitar bem.

necessrio reduzir a farinha a p fino para evitar a pesagem de ar que existe entre os flocos e assim diminuir o erro experimental, e tambm aumentar a superfcie de contacto para faciltiar a reaco de hidrlise. necessrio registar o valor da massa at ao dcimo de mg para o clculo mais da quantidade de glcidos redutores que esto presentes na farinha ser feito de forma mais rigorosa e precisa evitando assim um desvio maior relativamente ao vlaor real.A adio de cido sulfrico permitiu a hidrolisao cida de polisidos, obtendo-se oses redutoras. Alm disso, o H2SO4 desnatura as protenas. O aquecimento deve ser feito na hotte, porque o cido encontra-se concentrado e com a evaporao ocorre libertao de gases txicos.A adio de NaOH neutralizar o cidoem excesso e tornar o meio alcalino para que a reao com DNS ocorra.A filtrao mais rpida se a soluo estiver quente, permitindo assim a recolha de oses redutoras enquanto que os polisidos no hidrolisados ficam retidos no papel de filtro.Com o aquecimento o DNS reduzido na presena de glcidos redutores e a soluo adquire uma cor castanho-avermelhada.Reao do mtodo do dinitrosalicilatoEm presena de um glcido redutor, o cido 3,5dinitrosaliclico reduzido a cido 3-amino-5-nitrosalicilato, por perda de 2 tomos de oxignio ( um dos grupos NO2 do cido inicial passa a NH2, existindo no cido final apenas um grupo NO2) e entrada de 2 hidrognios, medida que os grupos aldedo do glcido redutor so oxidados a grupos carboxilo, como mostrado na figura (). O cido 3-amino-5-nitrosalicilato tem uma cor castanho-avermelhada e pode ser doseado espectrofotometricamente a 540 nm.Figura 1-Esquema da reaco qumica do mtodo do dinitrosalicilatoClculo da concentrao de glucose Para a realizao do clculo da concentrao de glucose nos tubos de ensaio, comeou-se por calcular a concentrao final dos tubos de ensaio que continham glucose a 5 mg/mL, com volumes iniciais diferentes e volume final de 25 mL. Tubo 1

Para os restantes tubos, os clculos foram iguais, variando s o volume inicial.

Tubo n.0123456

Concentrao final0,000,020,040,060,080,100,14

Absorvncia 0,0070,0590,1130,1760,2170,2270,309

Tabela 1 - Registo dos valores das concentraes finais das solues que contm Glucose 5,0 mg/mL.Com estes valores possvel fazer a recta de calibrao e depois determinar a concentrao de glucose. A absorvncia do tubo 0(controlo), foi subtrada a todos os valores de absorvncia de modo a que a recta passe na origem.

Grfico 1-Absorvncia vs ConcentraoA recta de calibrao y=2,2908x + 0,0006 sendo que y a absorvncia e x a concentrao. A partir desta recta possvel calcular os valores de absorvncia dos tubos 7,8 e 9.Tubo 7Abs540= 0,004y=2,2908x + 0,0006 0,004 = 2,2908x + 0,0006 x = 1,48 x10-3 mg/mLEste valor corresponde concentrao final nos 25 mL. Mas a amostra foi diluida at perfazer o valor de 50 mL e depois desse volume foram retirados volumes diferentes de soluo aos quais foi adicionado o reagente. 1,48 x10-3 mg/mL

Massa de glucose na soluo:Vi=50 mL501,4 mgPara os outros os tubos, os clculos efectuados foram os mesmos. A seguir apresenta-se um quadro com os resultados obtidos.Tubo n789

Absorvncia (540nm)0,0040,0060,008

Concentrao (mg/mL)1,48 x10-32,36 x10-3 3,23 x10-3

Volume de hidrosilado (mL)1,31,62

Massa de glucose (mg)1,41,842,02

Mdia de concentrao:(1,48 x10-3 +2,36 x10-3 + 3,23 x10-3)/3 = 2,35 x10-3mg/mLMassa mdia de glucose:(1,4+ 1,84 + 2,02)/3 = 1,75 mgPercentagem (m/m):%(m/m) = (massa final/massa hidrosilado) x 100 %(m/m) = (1,75/50,2) x 100 %(m/m) = 3,49%%(m/m) Nestum=84,7% O rendimento desta experincia foi muito baixo. Conclui-se que houve uma srie de erros na experincia que contribuiram para um decrscimo do rendimento: erros na medio de volumes, a hidrlise cida pode no ter sido totalmente eficaz, a filtrao tambm no foi totalmente eficaz e houve perda de glcidos na transferncia do reagente de um recipiente para o outro.

3. BibliografiaQuintas, A., Halpern, M.J., Freire, A.P. Eds., Bioqumica Organizao Molecular da Vida, Lidel, Lisboa, 2008.Lehninger Principles of Biochemistry, 6th Edition David L. Nelson, Michael M. Cox, Macmillan, International Edition, 2013.

4. Questes a desenvolver4.1. A forma predominante da glucose em soluo a estrutura em anel representada pela projeo de Haworth. Porque que a glucose d um resultado positivo, reagindo completamente, nas reaes caractersticas da sua forma em cadeia aberta?A projeo de Haworth representa os glcidos na sua forma cclica. Em soluo a glucose encontra-se predominantemente na sua forma cclica, em anis de cinco ou seis carbonos que so as estruturas mais estveis, e em menor quantidade na sua forma em cadeia aberta ou linear, que ajuda a estabilizar as formas cclicas. Contudo, quando introduzido um reagente especfico para a estrutura de glucose em cadeia aberta na soluo, a glucose vai reagir completamente, perturbando o equilbrio. Segundo o princpio de Le Chatelier, o sistema vai evoluir no sentido de contrariar esta perturbao e fazer aumentar a concentrao de glucose em cadeia aberta. A glucose reage completamente nas reaes caractersticas da sua forma em cadeia aberta, porque o sistema est continuamente a manter o equilbrio das espcies no meio, ou seja, permite que quando a concentrao de glucose diminua, o sistema evolua no sentido de formar mais glucose em cadeia aberta. Assim, toda a glucose em cadeia aberta acaba por reagir e estas reaes caractersticas so positivas. 4.2. Apesar de possurem uma extremidade redutora, o amido e o glucognio do um resultado negativo nos testes de deteo de glcidos redutores. Justifique.O amido e o glucognio so polisidos, ou seja so constitudos por muitos resduos de oses. O amido constitudo por glucose, amilose e amilopectinas. Enquanto o glucognio constitudo por polmeros de glucose. O amido constitudo por amilose, que uma macromolcula linear de estrutura helicoidal, ou seja constituda por resduos de D-glucopiranose ligados entre si por ligaes glucosdicas -1,4. A amilopectina e o glucognio so polmeros ramificados de -glucose unidos por ligaes glucosdicas. Contudo, o glucognio tem uma estrutura mais ramificada do que a amilopectina e s tem uma extremidade redutora.A amilose, a amilopectina e o glucognio efetuam ligaes pela extremidade redutora de cada resduo osdico, o que significa que cada polisido tem apenas uma extremidade redutora, que pertence ao ltimo resduo. Porm, no amido, a extremidade redutora do ltimo resduo est virada para dentro da molcula, no interior da hlice estrutural. Deste modo, os agentes oxidantes no so capazes de atacar o interior da molcula, uma vez que os grupos no redutores esto virados para fora, impedindo o contacto.O amido e o glucognio do um resultado negativo no teste de Benedict de deteo de glcidos redutores, porque a extremidade redutora est no interior da molcula e nunca chega a estar em contacto com o (Cu), o agente oxidante. O amido uma molcula de grande dimenso, por isso existem muitos resduos de glucose que esto ligados e que no possuem uma extremidade redutora, em relao aos resduos que possuem essa extremidade. Se a concentrao de amido e glucognio em soluo baixa, ento no esto em soluo molculas suficientes para que o resultado do teste de Benedict seja positivo.4.3. Como explica a obteno de um falso resultado positivo se efetuar um aquecimento prolongado de algumas solues de glcidos no teste de Barfoed?O teste de Barfoed oxida as oses atravs do io (Cu) e permite a identificao de oses numa soluo e ainda a distino entre ose e disido. As oses e os disidos tm uma velocidade de reao distinta com uma soluo de acetato de cobre em cido actico. As oses reagem mais depressa do que os disidos.Quando se efetua um aquecimento de um glcido ocorrem ruturas das ligaes glucosdicas, quebrando os sidos e originando resduos de oses mais pequenos. Nos glcidos a extremidade redutora responsvel pela ligao glucosdica, quando esta ligao quebrada, a extremidade redutora fica livre em soluo, podendo reagir com agentes oxidantes no teste de Barfoed. As oses aparecem mais rapidamente que os disidos, permitindo a sua deteo em primeiro lugar e a presena de oses em soluo constitui um resultado positivo no teste de Barfoed. Porm, quando se efetua um aquecimento prolongado de um glcido, os disidos comeam a ser hidrolisados e a reagir com os ies (Cu) presentes em soluo. Quando isto ocorre obtm-se um falso positivo, pois esto a reagir disidos quando apenas se pretendem detetar oses. Um falso positivo torna um teste no fivel pois adultera os resultados da experincia e neste caso, impossibilita a anlise da presena ou no de oses em glcidos.4.4. Por que foi necessrio proceder hidrlise cida da farinha alimentar previamente aplicao do mtodo do DNS?O DNS ou 3,5-dinitrosalicilato, quando aquecido e em meio bsico reage com glcidos redutores para formar o 3-amino-5-nitrosalicilato. Este mtodo oxida os grupos redutores dos glcidos, tais como os aldedos e cetonas das oses permitindo quantificar uma amostra.A farinha alimentar composta principalmente por amido e resduos de glucose, molculas que no so redutoras e por isso no so capazes de reagir com o DNS. Para fazer a farinha alimentar reagir com o DNS necessrio torna-la numa molcula redutora capaz de reagir com o composto, que oxidante. A farinha alimentar sofre uma hidrlise cida que vai quebrar as ligaes glucosdicas e permitir que se formem oses cujas extremidades redutoras passam a estar em contacto com a soluo, em vez de estabelecerem ligaes com outras oses. Aps o aparecimento das oses em soluo, estas j so capazes de reagir com o DNS, pois as extremidades redutoras das oses vo ser oxidadas pelo DNS e permitir a realizao do mtodo.

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