Prtica Laboratorial 3

Separao das protenas do soro de coelho por electroforese em acetato de celulose

Trabalho Realizado Por:Beatriz Lopes Dias Vieira da Silva 45517Cludia Filipa Abreu Miranda-44813Hugo Daniel dos Santos Videira-44804ndice1. Resumo32. Apresentao, Tratamento e Discusso dos Resultados43. Bibliografia74. Questes a Desenvolver8

1. ResumoNesta atividade experimental efetuou-se a separao das protenas do soro de coelho pelo mtodo de eletroforese. Esta tecnica muito utilizada em bioqumica como meio auxiliar de diagnstico e tem como base o facto de protenas diferentes possuirem carga e massa diferentes, pelo que podem ser separadas por ao de um campo eltrico.Prentendeu-se separar as seguintes proteinas: albumina e as globulinas (1, 2, e ). Deste modo, prever-se-ia que a tira eletrofortica apresentasse 5 bandas distintas, correspondentes aos 5 grupos de protenas presentes maioritariamente no soro de coelho.A albumina a protena que existe em maior concentrao no plasma e tem uma massa molecular relativamente baixa.aAps retirar as tiras do tampo e de se ter realizado a eletroforese, procedeu-se colorao dos resultados, conferindo-lhes uma tonalidade rosada. Em seguida, as tiras foram passadas por cido actico 5% (v/v) em metanol para remover o excesso de corante e fixar as protenas s tiras. Para permitir distinguir as bandas nas tiras estas foram introduzidas em metanol puro anidro e depois numa soluo contendo metanol, cido actico e glicerol. Por ultimo procedeu-se secagem das bandas usando uma estufa. A secagem foi feita durante um curto espao de tempo de modo a evitar a desnaturao das proteinas.Apesar de na amostra existirem 5 proteinas diferentes no resultado da eletroforese aparecem apenas 4 bandas. Este facto deve-se a haver preoteinas com massa e/ou cargas muito semelhantes, dificultando assim a separao das mesmas. Neste caso, as protenas que no foram separadas na totalidade foram as globulinas e .A intensidade das bandas tem relao com a concentrao das protenas na amostra, sendo assim, quanto maior a intensidade da banda, maior a concentrao da respetiva protena.

2. Apresentao, Tratamento e Discusso dos Resultados.A electroforese o movimento de espcies carregadas em soluo sob a aco de um campo eltrico. Neste caso as espcies carregadas so as protenas, e estas vo-se movimentar consoante a sua carga global: as protenas que tm carga global positiva, ou seja, quando o pH da soluo inferior ao seu ponto isoelctrico mover-se-o no sentido do ctodo (eltrodo negativo), as protenas que tm carga global negativa, ou seja, quando o pH da soluo superior ao seu ponto isoelctrico mover-se-o no sentido do nodo (eltrodo positivo). Se o valor de pH for igual ao ponto isoelctrico, as protenas no se movero, porque a sua carga global ser nula.A presena de carga nas protenas deve-se ionizao dos grupos amina e carboxilo terminais e tambm da cadeia lateral de cada aminocido. A carga que se obtm, varia com o pH do meio e com o pka de cada um dos grupos ionizveis.Para alm da carga, a velocidade de migrao das molculas depende: do tamanho e forma da molcula, da intensidade do campo elctrico, da natureza do meio de suporte e da temperatura da operao.Existe uma grandeza que relaciona estes factores e definida como mobilidade electrofortica, , e igual velocidade de migrao, v, por unidade de intensidade de campo eltrico aplicado, E. Esta grandeza diretamente proporcional carga, q, e inversamente proporcional ao tamanho da molcula e viscosidade do meio, , em que se processa a eletroforese. No caso de a molcula ser esfrica, com um raio r, vlida a relao:

As protenas constituiem a maior parte dos slidos do plasma e compreendem trs grupos principais: albumina, globulinas e fibrinognio. Aps a coagulao sangunea, a fase lquida que se obtm constitui o soro, que no possui factores de coagulao (incluindo o fibrinognio) que esto normalmente presentes no plasma.No soro de coelho normal esto presentes 15 protenas que influenciam o modelo electrofortico. No entanto, como apresentam mobilidades semelhantes geralmente apresentam apenas cinco bandas distintas: Albumina; Globulinas 1; Globulinas 2; Globulinas ; Globulinas .Neste caso utilizou-se uma soluo tampo de pH igual a 8,6 e portanto superior ao ponto isoelctrico de todas as protenas em soluo, logo todas tm carga global negativa e moveram-se para o nodo (elctrodo negativo).Os nicos factores que influenciam na separao das protenas so a massa relativa e o ponto isoelctrico, os outros factores (intensidade do campo elctrico, natureza do meio de suporte, temperatura da operao, forma) so iguais para todas as protenas.

Quadro 1. Propriedades das protenas presentes no soro do coelhoProtenasNvel do plasma (g dm-3)MrpI aproximado

Albuminas40,0660004,9

Globulinas 14,5040000 - 60000-

Globulinas 26,50100000 4000004,9-6,3

Globulinas 8,50110000 120000-

Globulinas 11,0150000 - 4000006,3-7,6

Com base no quadro 1, possvel interpretar o electroforama obtido.

Ctodo (elctrodo negativo)

Ponto de aplicao

4.Globulina e

3.Globulinas 2

2.Globulinas 1

1.Albumina

nodo (elctrodo positivo)

A banda n1 corresponde albumina, pois esta a protena com menor massa molecular relativa e com o PI mais afastado do pH da soluo, logo moveu-se com maior velocidade em direco nodo visto ter uma maior carga global negativa encontrando-se mais afastada do ponto de aplicao. Como a protena que tem uma maior concentrao no plasma, tambm apresenta a banda com maior intensidade.As bandas n2 e 3 correspondem, respectivamente, s Globulinas 1 e Globulinas 2, pois tem massas moleculares relativas maiores que a albumina, sendo que a Globulina 1 tem uma menor massa e por isso moveu-se mais. O seu ponto isoelctrico encontra-se mais prximo do pH da soluo, por isso moveram-se com menor velocidade em direco ando encontrando-se mais prximas do ponto de aplicao. A intensidade das duas muito semelhante, mas muito menor que a da albumina, porque o seu nvel no plasma muito mais baixo, sendo que as Globulinas 1 e Globulinas 2 distam apenas de 2 unidades de concentrao.A banda n4 corresponde s Globulinas e as Globulinas que no forem separadas de forma eficaz. Estas protenas tm um ponto isoelctrico muito prximo do valor do pH da soluo, por isso moveram-se com uma menor velocidade e so as mais prximas do ponto de aplicao. A separao no foi eficaz, porque as protenas no foram submetidas tempo suficiente electroforese.Na electroforese, necessrio existir uma diferena de potencial para os compostos migrarem ao longo das tiras, por isso ligou-se os elctrodos da tina fonte de alimentao e regulou-se a diferena de potencial para 200V. Verificou-se que houve um aumento no valor da intensidade da corrente ao longo da electroforese.Este aumento pode ser justificado com o aumento de temperatura que ocorreu durante a experincia devido dissipao de energia, que provocou uma diminuio da viscosidade da soluo tampo, o que se traduz numa diminuio da resistncia, pela lei de Ohm (V=RI , sendo que V corresponde ao potencial elctrico, R resistncia e I intensidade da corrente). Como a resistncia inversamente proporcional intensidade da corrente, quanto menor a resistncia, maior ser a intensidade da corrente.

Imagem 1- Frmula estrutural da soluo de Ponceau S.Quando se retirou as tiras de acetato de celulose, no final da electroforese, estas foram mergulhadas em soluo de Ponceau S. Este reagente tem carga negativa e por isso liga-se aos grupos carregados positivamente presentes nas protenas: o grupo amina terminal e os grupos das cadeias laterais, e tambm se liga s regies apolares. Deste modo estes grupos ficam com uma colorao avermelhada sendo possvel identificar e distinguir as bandas. Como j foi referido anteriormente as bandas com colorao mais intensa correspondem as protenas que esto em maior concentrao no plasma.3. Bibliografia Lehninger Principles of Biochemistry , 6th Edition David L. Nelson, Michael M. Cox Quintas, A., Halpern, M.J., Freire, A.P. Eds., Bioqumica Organizao Molecular da Vida, Lidel, Lisboa, 20084. Questes a Desenvolver

As instrues para a realizao de uma eletroforese em papel indicam que a amostra deve ser aplicada numa tira de papel 10 x 10 cm, previamente impregnada de uma soluo tampo de fosfatos de sdio (pH 6,5) 1mM, e sujeita depois a 10 mA durante 1 hora a 0 C. Preveja as consequncias das seguintes aes, justificando: Por engano, usou-se um tampo de fosfatos de sdio (pH 6,5) a 100 mM na separao;A soluo tampo mantm o valor de pH da soluo dentro de valores de pH ideais para a protena em anlise. Deste modo assegurada a estabilidade do meio e por conseguinte a estrutura e a funo da protena em estudo. Porm, a concentrao da soluo tampo tem de estar em conformidade com a concentrao da protena no meio. Se for utilizada uma soluo tampo de sdio de concentrao molar 100 mM de (pH 6,5), ento est a ser utilizada uma concentrao muito superior desejada. A alterao da concentrao da soluo altera a fora inica, pois esta depende da concentrao dos ies presentes em soluo. A fora inica I, representada pela equao 1., expressa metade do somatrio da concentrao molar Ci, de todas as espcies inicas presentes em soluo respetivamente multiplicada pela carga Zi, ao quadrado desse mesmo io.

Equao 1. A fora inica expressa metade do somatrio da concentrao molar de todas as espcies inicas presentes em soluo respetivamente multiplicada pela carga ao quadrado desse mesmo io.Deste modo, se a concentrao da soluo tampo aumentar, a fora inica da soluo tambm vai aumentar, uma vez que a concentrao dos ies presente em soluo aumenta. Este aumento provoca um aumento da condutividade eltrica da soluo, ou seja, um aumento da intensidade da corrente, que leva a que os ies migrem mais rapidamente para os polos de carga oposta sua. A eletroforese uma tcnica que depende da existncia de dois polos, um polo positivo ou nodo para o qual vo migrar os ies de carga negativa e um polo negativo ou ctodo, para o qual vo migrar os ies de carga positiva. Quando os ies negativos migram para o nodo ocorre uma reao cido-base com a soluo tampo formando-se base fraca e sendo libertados para o meio protes (H). De igual modo, quando ies positivos migam para o ctodo ocorre uma reao cido-base com a soluo tampo formando-se cido conjugado (HA) e libertando-se para o meio ies (OH). Portanto, as protenas comeam a migrar mais lentamente para os polos, pois no conseguem competir com os ies em soluo, que recebem uma maior frao da corrente eltrica.Por outro lado, ao mesmo tempo que a intensidade da corrente eltrica aumenta, a um aumento da energia no sistema, ou seja, a energia fornecida ao sistema ou se transforma em energia til ou em energia dissipada. A energia til a energia que eficazmente transferida ao sistema e transformada em energia que utilizada na execuo do objetivo desse sistema, enquanto a energia dissipada energia que ao ser transferida ao sistema no transformada em energia til, mas noutra forma de energia que no participa na execuo do objetivo do sistema. Neste caso, a energia dissipada transformada em calor que afeta a capacidade de migrao das protenas. O aumento da temperatura do sistema leva a uma diminuio da resistncia do sistema que est diretamente relacionada com a viscosidade, isto , a viscosidade diminui. A diminuio da viscosidade por sua vez inversamente proporcional velocidade de migrao das protenas, aumentando a sua velocidade de migrao para os polos. Embora a temperatura tenha o efeito oposto do aumento da concentrao dos ies em soluo, no suficiente para contrabalanar a diminuio da velocidade de migrao das protenas na eletroforese causada pelo aumento da intensidade da corrente eltrica. Assim, conclumos que a velocidade de migrao das protenas diminui significativamente, o que torna o resultado da eletroforese pouco fivel. Por engano, no se ligou o sistema de refrigerao do aparelho;O aparelho de eletroforese possui um sistema de refrigerao para evitar o sobreaquecimento e a consequente deturpao dos resultados da experincia em causa. Se por lapso no se ligar o sistema de refrigerao do aparelho, ento ocorre um aquecimento indesejado. Este aquecimento pode ter diversas consequncias, tais como a evaporao da soluo tampo de fosfatos ou a desnaturao das protenas que eram objeto de estudo da experincia. Um compartimento do aparelho de eletroforese tinha um volume maior de soluo tampo do que o outro.Se um compartimento do aparelho de eletroforese tiver um volume superior de soluo tampo do que o outro compartimento, ento existe uma diferena no nmero de moles na concentrao dos dois compartimentos, o que leva a uma diferena de presses.O compartimento que tiver um volume superior de soluo tampo ter um maior nmero de moles em soluo, mas uma concentrao molar menor, do que o compartimento com menor volume de soluo tampo. O compartimento com menor volume de soluo tampo ter um menor nmero de moles em soluo, mas uma concentrao molar maior.Esta diferena de volumes gera presso, pois os sistemas tendem a atingir estados de maior estabilidade e equilbrio. Esta tendncia para equilibrar os volumes dos compartimentos cria uma migrao dos ies da soluo tampo de maior presso para o compartimento de menor presso. A migrao dos ies, em resposta diferena de presses entre os compartimentos afeta o resultado da eletroforese. Se os ies migrarem no sentido de deslocao das protenas vo provocar um aumento da velocidade de migrao das mesmas, o que resulta numa maior disperso das protenas e diminuio da cor das bandas, bem como o aumento da distncia entre as bandas. Por outro lado, se os ies da soluo tampo migrarem no sentido oposto ao da migrao das protenas, a velocidade de deslocao destas ser afetada. A diminuio da velocidade de migrao das protenas pode resultar numa diminuio do espao entre as bandas, num aumento da cor das bandas e numa maior dificuldade em distinguir uma banda da outra.

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