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MODELAGEM DE PROCESSO INDUSTRIAL DE FERMENTAO ALCOLICA CONTNUA COM REATORES

DE MISTURA LIGADOS EM SRIE

Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Engenharia Qumica

Departamento de Processos Biotecnolgicos

MODELAGEM DE PROCESSO INDUSTRIAL DE FERMENTAO ALCOLICA CONTNUA COM REATORES

DE MISTURA LIGADOS EM SRIE

Autora: Lia de Mendona Porto Orientador: Slvio Roberto Andrietta

Tese apresentada Faculdade de Engenharia Qumica da Universidade Estadual de Campinas para obteno do ttulo de Doutor em Engenharia Qumica.

Campinas SP Dezembro de 2005

i

Dedico, com muito carinho, este trabalho s irms

Regina, pela ajuda financeira e sua alegria que sempre me encorajou, Fabiana, que nunca me deixou passar dificuldades e pelo seu carinho, e

Liliana, pelo exemplo profissional e toda a ajuda tanto monetria quanto intelectual que me deu durante o doutorado.

Mame, Lria, que se eu fosse escrever os motivos ficariam maiores que minha tese, ela est nesta lista s por existir.

Ao papai, Fbio, por me ajudar a ser quem eu sou.

iii

Agradecimentos

Este doutorado me mostrou o quanto eu posso contar com as pessoas, o que faz com que seja difcil expressar todos os agradecimentos necessrios. Resolvi, ento, faz-lo em texto contnuo, de acordo com a cronologia.

Ao final do meu mestrado na UFMG, conversei com o Prof. Dr. Elozio Ribeiro, da UFU, sobre o doutorado. Ele me indicou a Unicamp e entrei em contato com o Departamento de Processos Biotecnolgicos daqui. Fui aceita como orientada pelo Prof. Dr. Slvio Andrietta, mudando-me para Campinas no incio de 2002, quando preparamos o projeto para pleitear bolsa. O momento de crise na poca enfrentado pela FAPESP levou a que no consegussemos ajuda financeira desta instituio. Com o auxlio de minha famlia, a quem devo tanto, fiquei aqui at fevereiro de 2003. Durante este tempo, fiz grandes amigos no laboratrio do CPQBA, onde desenvolvi a parte prtica do trabalho cito aqui as pesquisadoras Dra. Maria da Graa Stupiello e Dra. Cludia Stroppa e, em especial, Milene, que me auxiliou em muitas etapas, rica Ferreira, que me ajudou na realizao de vrias anlises, e as colegas de ps rika Duro, Gisele Tosetto e o casal Nayara Zago e Jos Antnio Bassetto Jnior, de quem fui madrinha de casamento. No incio de 2003, a fim de enfrentar a falta de verbas, consegui um emprego na Fundao Educacional do Vale do Jequitinhonha (FEVALE) por intermdio do Prof. Acio Miranda, tornando-me professora do curso superior de Matemtica da Faculdade de Filosofia e Letras de Diamantina (FAFIDIA). Mudei-me para esta cidade e morei com Liliana, minha irm, na casa de Seu Jos, Dona Carmem, Silm, Madalena e Raquel, com quem tive momentos especiais de convivncia. Nesta mesma poca Conceio Maria do Socorro vila, diretora executiva da FEVALE, me ofereceu o cargo de coordenadora do processo seletivo das duas faculdades onde esta instituio a fundao mantenedora FAFIDIA e FCJ. As atividades em Diamantina me proporcionaram a possibilidade de vir regularmente a Campinas para dar continuidade ao doutorado. Em fevereiro de 2004, percebi a necessidade de um contato mais contnuo com o CPQBA na fase final do doutorado, e resolvi retornar para c no segundo semestre. Planejei me sustentar aqui durante o tempo que restava com as economias que fiz em Diamantina. De volta aluguei um kitnet, quando, em outubro, tive todas as minhas coisas roubadas, inclusive o computador no qual desenvolvia o programa deste trabalho. Para minha sorte j tinha bons amigos aqui: me mudei para a Repblica

iv

Malditos, onde os rapazes me receberam sem nenhuma ressalva mesmo se tratando de uma repblica masculina. Fiquei por l uns quinze dias at que conversei com uma amiga, Lucia Mattiello, que me convidou para morar com ela numa repblica feminina. J nesta casa fui me reestruturando e voltei a trabalhar com o programa. Percebi algumas dificuldades, pois no tinha muito domnio do Delphi. Foi quando procurei o Prof. Dr. Rubens Maciel, que me indicou um orientado dele para me dar aulas, Agremis Guinho Barbosa. No consegui um professor e sim um grande amigo, que me ajudou muito com a programao. Hoje estou terminando este doutorado graas a todas estas pessoas e muitas outras. Agradeo a todos que de forma direta ou indireta me ajudaram a me tornar doutora.

v

Resumo

Este trabalho consiste em determinar o modelo que melhor descreve a fermentao alcolica industrial, em sistemas contnuos de reatores de mistura em srie. Para determinao dos parmetros cinticos foi desenvolvido um programa utilizando os dados de anlises feitas em amostras retiradas de usinas em operao. Dos modelos testados, o Tosseto (2002), Lee; Pagan; Rogers (1983) e Levenspiel (1980), no apresentaram incoerncia fsica nem problema de convergncia sendo estes indicados para descrever a cintica da fermentao alcolica. Os parmetros cinticos comuns aos modelos

apresentaram valores semelhantes, onde o parmetro sK , limitao pelo substrato, foi de

4,00,3 , o valor da concentrao limite pelo produto inibidor, mxP , foi 992 e o fator

exponencial de inibio pelo produto, NY , foi 9,03,5 . O fator de inibio pelo substrato

do modelo Tosseto (2002), iK , foi 527 . O parmetro mxX , inibio pela massa celular, e MY , fator exponencial desta inibio, para o modelo Lee; Pagan; Rogers (1983) foram

1100 e 1,09,0 , respectivamente. A escolha pelo modelo Tosetto (2002) para implementao do programa de simulao do processo foi devido tentativa de uma maior abrangncia na obteno das constantes cinticas devido possibilidade de inibio pelo

substrato. A simulao em regime permanente trata-se da resoluo equaes algbricas dos balanos de massa do sistema e capaz de dimensionar a etapa de fermentao de novas plantas a serem implantadas, enquanto que a simulao em regime transiente, tem o

intuito de avaliar modificaes durante a operao da usina e as equaes diferenciais obtidas a partir dos balanos de massa devem ser resolvidas por mtodo numrico, que

neste caso foi utilizado o Runge-Kutta de quarta ordem.

vii

Abstract

This work aimed to determinate a model that best describes the industrial scale alcoholic fermentation in continuous serial mixing reactors. Software was developed in

order to establish the kinetics parameters, using analysis data performed on samples from operating plants. The models described by Tosseto (2002), Lee; Pagan; Rogers (1983) and Levenspiel (1980), did not display physical incoherence or even convergence problems that described alcoholic fermentation kinetics. The kinetics parameters shown in all models

presented similar values, like sK (substrate limitation) was 4,00,3 , mxP (limited product concentration) was 992 and NY (product inhibition power factor) was 9,03,5 . The iK (substrate inhibition) studied by Tosseto (2002) was 527 . mxX (cell mass inhibition) and MY (cell mass inhibition factor power) were respectively 1100 and 1,09,0 to Lee; Pagan; Rogers (1983). The kinetics parameters abranger due the substrate inhibition obtained by Tosetto (2002) this model was chosen in order to implement the simulating software. The stady state simulation is about systems mass balance algebric equations

resolution and is capable to dimension the fermentation step in new plants to be implanted while the unstady state simulation have the intention to evaluate modifications during the

plant operation and the differential equations obtained from mass balance must be resolved by numerical methods, in this case, was used the fouth order Runge-Kutta.

ix

Sumrio

1- Reviso Bibliogrfica ..................................................................................................... 3 1.1. Questes Ambientais da Agroindstria Canavieira................................ 3

1.2. Etanol...................................................................................................... 5

1.3. Processos Fermentativos ...................................................................... 10

1.3.1. Batelada ............................................................................................. 11

1.3.2. Batelada Alimentada ......................................................................... 12

1.3.3. Processo Contnuo............................................................................. 12

1.4. Bioqumica da Fermentao Alcolica ................................................ 15

1.5. Cintica da Fermentao ...................................................................... 17

1.5.1. Constantes Cinticas.......................................................................... 22

1.6. Simulao ............................................................................................. 22

1.7. Dinmica da Populao de Cepas em Processos Industriais ................ 24

1.7.1. Mtodo de Identificao de Leveduras ............................................. 24

2- Material e Mtodos....................................................................................................... 27 2.1. Usina de Acar e lcool..................................................................... 27

2.2. Ensaios Industriais................................................................................ 29

2.3. Anlises Laboratoriais .......................................................................... 31

2.3.1. Massa Seca ........................................................................................ 31

2.3.2. Acares Redutores Totais................................................................ 31

2.3.3. Etanol................................................................................................. 32

2.4. Desenvolvimento do Programa ............................................................ 32

2.4.1. Ajuste dos Modelos Cinticos........................................................... 33 2.4.2. Simulao .......................................................................................... 34

- Estado Estacionrio (Permanente)............................................................ 34

x

- Estado Transiente ..................................................................................... 36

2.5. Utilizao do Programa ........................................................................ 38

2.5.1. Ajuste dos Modelos Cinticos........................................................... 39 2.5.2. Simulao .......................................................................................... 41

- Estado Estacionrio .................................................................................. 41

- Estado Transiente ..................................................................................... 43

2.6. Classificao das Cepas Dominantes ................................................... 45

2.6.1. Plaqueamento .................................................................................... 45

2.6.2. Cariotipagem ..................................................................................... 45

2.7. Capacidade Fermentativa das Cepas Dominantes ................................ 46

3- Resultados e Discusso ................................................................................................ 49 3.1. Anlises Laboratoriais .......................................................................... 49

3.1.1. Massa Seca ........................................................................................ 49

3.1.2. Acares Redutores Totais................................................................ 51

3.1.3. Etanol................................................................................................. 53

3.2. Classificao das Cepas Dominantes ................................................... 56

3.2.1. Plaqueamento .................................................................................... 56

3.2.2. Cariotipagem ..................................................................................... 59

3.2.3. Capacidade Fermentativa das Cepas Dominantes............................. 60

3.3. Ajuste dos Modelos Cinticos .............................................................. 62 3.4. Modelagem Matemtica ....................................................................... 72

3.4.1. Estado Estacionrio ........................................................................... 72

3.4.2. Estado Transiente .............................................................................. 77

4- Concluses.................................................................................................................... 83 5- Referncias ................................................................................................................... 87 6- Apndices ..................................................................................................................... 93

xi

Lista de Figuras

Figura 1: Seqncia de reaes enzimticas pela fermentao alcolica de carboidratos

endgenos (glicognio e trealose) ou exgenos (sacarose e maltose), conduzida por Saccharomyces cerevisiae (LIMA; BASSO; AMORIM, 2001). ........................................ 16

Figura 2: Esquema da etapa de fermentao de uma usina de lcool................................... 27

Figura 3: Biorreatores da usina Clealco. .............................................................................. 28

Figura 4: Foto da Usina Alvorada. ....................................................................................... 28

Figura 5: Biorreatores da usina Alvorada............................................................................. 29

Figura 6: Foto do ponto de coleta do mosto na Usina Alvorada. ......................................... 30

Figura 7: Tanque de inculo (fermento) para o processo de produo de lcool................. 30

Figura 8: Vlvula lateral para retirada de amostra do biorreator.......................................... 30

Figura 9: Fluxograma da implementao do programa para o ajuste das constantes cinticas dos modelos no-estruturados e no segregados. ......................................................... 33

Figura 10: Fluxograma da implementao do programa para a simulao do modelo

Tosetto(2002) para 4 reatores de mistura em srie com reciclo de clulas. ................. 34

Figura 11: Tela de entrada dos dados para simulao em regime permanente. ................... 36

Figura 12: Tela de inicializao do programa. ..................................................................... 38

Figura 13: Tela de entrada dos dados experimentais para cada um dos biorreatores........... 38

Figura 14: Tela de escolha do modelo para estudo do ajuste cintico. ................................ 39 Figura 15: Tela de entrada dos intervalos das constantes cinticas dos modelos e dos dados

de operao da usina..................................................................................................... 40

Figura 16: Tela de valores das constantes cinticas, desvio de ajuste associado ao modelo e representao grfica deste resultado. .......................................................................... 41

Figura 17: Tela de entrada das constantes cinticas e dados de produo para simulao do

processo em regime permanente................................................................................... 42

Figura 18: Tela de sada das concentraes obtidas na simulao do estado estacionrio. . 42

Figura 19: Tela de entrada das constantes cinticas do modelo Tosetto (2002). ................. 43

xii

Figura 20: Tela de entrada das condies do sistema em regime permanente, antes da

perturbao do sistema. ................................................................................................ 44

Figura 21: Tela de entrada dos valores que podem ser perturbados no processo de produo

de lcool........................................................................................................................ 44

Figura 22: Grfico da concentrao de massa seca nos reatores do ensaio na usina Alvorada

em agosto de 2002. ....................................................................................................... 50

Figura 23: Grfico do perfil de concentrao de massa seca nos reatores do ensaio na usina

Clealco em agosto de 2002........................................................................................... 50

Figura 24: Grfico da concentrao de massa seca no fermento dos ensaios experimentais

das usinas Alvorada e Clealco. ..................................................................................... 51

Figura 25: Grfico da concentrao de ART no mosto durante os ensaios nas usinas. ....... 52

Figura 26: Grfico da concentrao de ART nos biorreatores durante o ensaio na usina Alvorada em agosto de 2002. ....................................................................................... 52

Figura 27: Perfil de concentrao de etanol em cada um dos biorreatores durante as oito horas de ensaio na usina Alvorada em outubro de 2002. ............................................. 53

Figura 28: Perfil de concentrao de ART na entrada do primeiro biorreator e etanol na sada do quinto biorreator, Alvorada, agosto de 2002.................................................. 53

Figura 29: Perfis de concentrao de etanol durante o ensaio da usina Alvorada onde (a) ensaio de agosto e (b) ensaio de outubro. ..................................................................... 54

Figura 30: Perfis de concentrao de etanol durante o ensaio da usina Clealco, onde (a) ensaio de julho e (b) ensaio de agosto. ......................................................................... 55

Figura 31: Perfis cromossmicos de isolados dominantes da safra 2002 da usina Alvorada....................................................................................................................................... 60

Figura 32: Perfis cromossmicos de isolados dominantes da safra 2002 da usina Clealco. 60

Figura 33: Ajuste do modelo Levenspiel (1980) para dados da usina Clealco, agosto de 2002, com alto desvio de ajuste ocasionado por intervalo de ajuste inadequado......... 63

xiii

Figura 34: Tela de sada dos parmetros cinticos ajustados para: (a) Levenspiel, (b) Tosetto, (c) Ghose, (d) Jin, (e) Lee e (f) Sevely, com dados da Usina Alvorada, coleta de julho de 2002, e do desvio associado ao ajuste........................................................ 64

Figura 35: Tela de sada dos parmetros cinticos ajustados para: (a) Levenspiel, (b) Tosetto, (c) Ghose, (d) Jin, (e) Lee e (f) Sevely, com dados da Usina Alvorada, coleta de agosto de 2002, e do desvio associado ao ajuste. .................................................... 65

Figura 36: Tela de sada dos parmetros cinticos ajustados para : (a) Levenspiel, (b) Tosetto, (c) Ghose, (d) Jin, (e) Lee e (f) Sevely, com dados da Usina Alvorada, coleta de setembro de 2002, e do desvio associado ao ajuste. ................................................ 66

Figura 37: Tela de sada dos parmetros cinticos ajustados para: (a) Levenspiel, (b) Tosetto, (c) Ghose, (d) Jin, (e) Lee e (f) Sevely, com dados da Usina Alvorada, coleta de outubro de 2002, e do desvio associado ao ajuste. .................................................. 67

Figura 38: Tela de sada dos parmetros cinticos ajustados para: (a) Levenspiel, (b) Tosetto, (c) Ghose, (d) Jin, (e) Lee e (f) Sevely, com dados da Usina Clealco, coleta de julho de 2002, e do desvio associado ao ajuste. ........................................................... 68

Figura 39: Tela de sada dos parmetros cinticos ajustados para: (a) Levenspiel, (b) Tosetto, (c) Ghose, (d) Jin, (e) Lee e (f) Sevely, com dados da Usina Clealco, coleta de agosto de 2002, e do desvio associado ao ajuste. ......................................................... 69

Figura 40: Problema de ajuste dos parmetros cinticos do modelo Sevely para os dados da Usina Alvorada no ensaio de agosto de 2002............................................................... 70

Figura 41: Tela de entrada dos dados para a simulao em regime permanente da usina

Clealco com os dados do ensaio de julho de 2002 em regime permanente.................. 73 Figura 42: Tela de sada da simulao em regime permanente, com dados do ensaio de

julho de 2002 da usina Clealco..................................................................................... 73 Figura 43: Tela de entrada dos dados para a simulao, em regime permanente, da usina

Alvorada, com os dados do ensaio de setembro de 2002 porm com diminuio do volume dos biorreatores................................................................................................ 74

xiv

Figura 44: Tela de sada da simulao em regime permanente, com dados do ensaio de

setembro de 2002 da usina Alvorada, porm com diminuio do volume dos biorreatores. .................................................................................................................. 75

Figura 45: Tela de entrada dos dados para a simulao, em regime permanente, da usina Alvorada, com os dados do ensaio de setembro de 2002 e vazes de mosto e fermento

duplicadas. .................................................................................................................... 75

Figura 46: Tela de sada da simulao em regime permanente, com dados do ensaio de setembro de 2002 da usina Alvorada e vazes de mosto e fermento duplicadas. ........ 76

Figura 47: Curvas dos componentes presentes nos biorreatores de dados experimentais e

simulados: (a) Usina Alvorada, setembro de 2002, (b) Usina Clealco, julho de 2002. 76 Figura 48: Tela de entrada das constantes cinticas para simulao em regime transiente. 78

Figura 49: Tela de entrada das condies do processo em regime permanente anterior modificao do sistema, da usina Clealco em julho de 2002. ...................................... 78

Figura 50: Tela de entrada de novos valores para condies operacionais do processo de fermentao alcolica para uma usina em operao. ................................................... 79

Figura 51: Tela de sada de dados da simulao do regime transiente................................. 79

Figura 52: Tela de entrada de dados do regime permanente anterior modificao do sistema, com dados do ensaio da usina Alvorada de julho de 2002............................. 80

Figura 53: Tela de entrada de novos valores para condies operacionais do processo de fermentao alcolica para uma usina em operao .................................................... 81

Figura 54: Tela de sada dos resultados da simulao.......................................................... 81

xv

Lista de Tabelas

Tabela 1: Emisso de carbono pelo setor sucroalcooleiro (MACEDO(1996) citado por MACEDO; CORTEZ, 2005)................................................................................................ 4

Tabela 2: Quantidade de etanol adicionado gasolina entre 1979 e 2005 para cada litro comercializado................................................................................................................ 7

Tabela 3: Produo de cana de acar no Brasil, de 1998 2004, em milhes de toneladas 8

Tabela 4: Produo de lcool, de 1998 2004, em milhes de m3 ........................................ 9

Tabela 5: Modelos matemticos no-estruturados e no-segregados propostos para a fermentao alcolica, suas condies e autores.......................................................... 20

Tabela 6: Autores e parmetros cinticos de modelos baseados na cintica convencional de Michaelis-Menten......................................................................................................... 22

Tabela 7: Condies da cariotipagem das cepas .................................................................. 46

Tabela 8: Composio do meio de fermentao utilizado nos testes das cepas presentes nos

biorreatores das usinas Alvorada e Clealco na safra de 2002....................................... 47

Tabela 9: Pontuao e limites das faixas de variao dos parmetros utilizados na classificao das leveduras( ANDRIETTA; MIGLIARI; ANDRIETTA, 1999) ..................... 47

Tabela 10: Contagem e aparncia das cepas dominantes do processo da usina Clealco nas

datas de amostras coletadas, na safra de 2002.............................................................. 57

Tabela 11: Contagem e aparncia das cepas dominantes do processo da usina Alvorada nas

datas de amostras coletadas, na safra de 2002.............................................................. 58

Tabela 12: Valores de rendimento em clulas (Yx/s g massa seca/g ART consumido), velocidade de consumo de substrato (VCS g de ART/L.h), nvel de converso de substrato (NCO - %), produtividade (PROD g de etanol/L.h) e rendimento em etanol (Yp/s g de etanol/g de ART consumido) das leveduras isoladas das usinas Alvorada (A) e Clealco (CL)........................................................................................................ 61

Tabela 13: Mdia das concentraes de ART, etanol e massa celular das trs primeiras horas de ensaio da usina Alvorada em agosto de 2002 ................................................ 62

xvi

Tabela 14: Anlises laboratoriais das amostras coletadas na Usina Alvorada em julho de 2002 ............................................................................................................................ 106

Tabela 15: Anlises laboratoriais das amostras coletadas na Usina Alvorada em agosto de 2002 ............................................................................................................................ 107

Tabela 16: Anlises laboratoriais das amostras coletadas na Usina Alvorada em setembro de 2002 ....................................................................................................................... 109

Tabela 17: Anlises laboratoriais das amostras coletadas na Usina Alvorada em outubro de

2002 ............................................................................................................................ 111

Tabela 18: Anlises laboratoriais das amostras coletadas na Usina Clealco em julho de 2002 ............................................................................................................................ 113

Tabela 19: Anlises laboratoriais das amostras coletadas na Usina Clealco em agosto de 2002 ............................................................................................................................ 115

Tabela 20: Concentraes dos componentes ART, etanol e clulas nos biorreatores e

volume dos biorreatores durante o ensaio de julho de 2002 na usina Alvorada ........ 117 Tabela 21: Concentraes dos componentes ART, etanol e clulas nos biorreatores e

volume dos biorreatores durante o ensaio de agosto de 2002 na usina Alvorada ...... 118


volume dos biorreatores durante o ensaio de setembro de 2002 na usina Alvorada .. 119


volume dos biorreatores durante o ensaio de outubro de 2002 na usina Alvorada .... 120


volume dos biorreatores durante o ensaio de julho de 2002 na usina Clealco ........... 121 Tabela 25: Concentraes dos componentes ART, etanol e clulas nos biorreatores e

volume dos biorreatores durante o ensaio de agosto de 2002 na usina Clealco......... 122

xvii

Nomenclatura

A usina Alvorada

CL usina Clealco

1iF vazo de entrada no biorreator i (m3/h)

iF vazo de sada do biorreator i (m3/h)

h passo de integrao do mtodo Runge-Kutta

k constante da taxa de reao

1k , 2k , 3k , 4k parmetros do mtodo Runge-Kutta

iK constante de inibio pelo substrato (g/L)

MK fator de limitao pelo substrato (constante de Monod) (g/L)

PK constante de inibio pelo produto (g/L)

1K fator exponencial de inibio pelo produto (L/g)

2K fator exponencial de inibio pelo substrato (L/g)

NCO nvel de converso de substrato

iP concentrao de produto no biorreator i (g/L)

maxP concentrao mxima de produto (g/L)

PROD produtividade

iS concentrao de substrato no biorreator i (g/L)

T tempo de residncia hidrulico (h)

iX concentrao de clulas no biorreator i (g/L)

iV volume do biorreator i (m3)

VCS velocidade de consumo de substrato

Yp/s rendimento em etanol

xviii

Yx/s rendimento em clulas

NY fator potncia de inibio pelo produto

MY fator potncia de inibio pela massa celular

velocidade especfica de reao (h-1)

max velocidade especfica mxima de reao (h-1)

c velocidade especfica de reao com atraso linear (h-1)

tempo de residncia (h)

1

Introduo

O Brasil , mundialmente, o pas com a maior tecnologia de processo da fermentao alcolica para produo de lcool e possui mercado garantido, devido ao

lcool anidro adicionado gasolina, obrigatrio por lei nacional em substituio ao chumbo, ou hidratado como combustvel. O desenvolvimento do motor multicombustvel,

iniciado em 1994, aumenta ainda mais o mercado nacional. A indstria sucroalcooleira ecologicamente interessante, pois reduz os gases do efeito estufa provenientes da queima de

combustveis fsseis no pas numa taxa prxima de 20%.

O processo contnuo de produo comeou a ser utilizado a partir da dcada de 80.

Reatores do tipo tubular foram testados laboratorialmente, porm o desprendimento de dixido de carbono provoca uma mistura imperfeita no sistema, o que abaixa velocidade da

reao, assim como em reator de mistura perfeita, devido inibio provocada pelo etanol. Contudo, reatores de mistura podem ser arranjados em srie possibilitando uma fermentao mais eficiente, diminuindo este efeito de inibio.

Usinas de lcool implantadas com o processo contnuo no passaram por um

planejamento rigoroso de cintica, otimizao e controle. O estudo cintico de processos biotecnolgicos foi nfase de trabalhos de vrios

autores que desenvolveram modelos para condies especficas e microrganismos distintos. Este trabalho tem como um dos objetivos avaliar, dentro dos modelos j desenvolvidos, aquele que melhor descreve a cintica de uma usina em operao.

As coletas de amostras foram feitas em usinas durante o perodo de safra de 2002

em condies especficas de operao previamente ajustadas. As usinas estudadas possuem processo contnuo com reatores em srie e reciclo de clulas. As amostras foram retiradas

de cada um dos biorreatores, do mosto e do fermento e foram analisadas quanto concentrao de acares redutores totais, etanol e clulas. Ainda foram retiradas as cepas

do fermento e estas analisadas quanto quantidade, capacidade fermentativa e cariotipagem.

Os resultados das anlises, juntamente com os dados de operao no momento das coletas, foram utilizados como dados de entrada para verificao do ajuste dos modelos e o clculo dos parmetros cinticos associados a eles.

2

A obteno do modelo cintico mais adequado viabiliza, ento, a execuo do

outro objetivo deste trabalho que o desenvolvimento de um programa que seja capaz de simular uma usina de lcool em operao.

A caracterizao das cepas foi importante para uma melhor compreenso do processo devido variedade de microrganismos no processo industrial. importante perceber que o modelo que melhor descreveu o processo como um todo poderia ser diferente se estivesse presente somente um tipo de levedura.

Este trabalho possui uma reviso bibliogrfica, onde so apresentadas algumas consideraes relevantes para o desenvolvimento do mesmo, alm de teoria sobre

fermentao alcolica, cintica de fermentao, metabolismo de levedura, simulao e dinmica de populao no processo. Em seguida esto os procedimentos utilizados nas

usinas, no laboratrio e no desenvolvimento do programa. Sendo ento feita a apresentao e discusso dos resultados experimentais e da simulao possibilitando a concluso geral do

trabalho. Seguem-se as referncias bibliogrficas e nos apndices esto todos os dados obtidos no laboratrio e a sntese da programao desenvolvida.

3

1- Reviso Bibliogrfica

Inicialmente sero apresentados os pontos relevantes ao desenvolvimento deste trabalho e conhecimentos tericos da cintica e do processo de produo de lcool por via

fermentativa, a partir de bibliografia disponvel.

1.1. Questes Ambientais da Agroindstria Canavieira O Protocolo de Quioto, assinado em dezembro de 1997 em Quioto, no Japo,

estabeleceu obrigaes de reduo de emisses de gases de efeito estufa a serem cumpridas

pelos pases desenvolvidos. Estados Unidos, Europa e Japo assumiram o compromisso de reduzir as emisses desses gases em 5,2% (em mdia) relativamente aos nveis emitidos em 1990. A efetiva contabilizao dessas redues, entretanto, dever ocorrer no perodo de 2008 a 2012 (OMETTO, 2001).

Para que o projeto de determinado pas em desenvolvimento possa dar origem a um certificado de reduo de emisses, necessrio, em primeiro lugar, estabelecer uma linha de base correspondente situao que ocorreria se o projeto no fosse realizado. Dessa forma, seriam contabilizadas as emisses do projeto da linha de base, relativamente mesma produo. A diferena obtida, conceituada como adicionalidade, que determina o

volume de reduo de emisses a ser atribudo ao projeto (OMETTO, 2001). Neste contexto, a substituio de combustveis fsseis por lcool se mostrou uma

estratgia importante na citada reduo. Com efeito, o lcool reconhecido mundialmente por suas vantagens ambientais, na medida que contribui para reduzir a poluio atmosfrica

nos grandes centros (COBRA, 2001).

Submetido aos pases na reunio de Julho de 2001, em Bonn, na Alemanha, o

Protocolo de Quioto no foi ratificado pelos Estados Unidos. Por outro lado, importantes pases confirmaram o seu apoio, como as naes da Unio Europia, Japo, Canad,

Austrlia, Nova Zelndia e pases em desenvolvimento, como o Brasil (OMETTO, 2001).

As plantas acumulam anualmente, atravs da fotossntese, cerca de 17 vezes mais

energia do que a humanidade consome hoje, alm disso, a fonte vegetal, por ser renovvel, possibilita uma alternativa de combustvel cuja produo contnua no ameaada. A

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produo do lcool a partir da cana oferece uma grande alternativa para os pases tropicais

e semitropicais (LIMA; MARCONDES, 2002).

A indstria do acar e do lcool controla satisfatoriamente os impactos

ambientais. Seus principais efluentes, a vinhaa, a torta de filtro e as cinzas das caldeiras, so usados como fertilizantes nas plantaes de cana. Os processos empregados geralmente

so fceis de serem mantidos limpos: as temperaturas no so muito altas, as emisses no so txicas, no h emisses de produtos qumicos e os exaustores das caldeiras no

liberam enxofre (MACEDO; CORTEZ, 2005).

As principais vantagens da adio de etanol gasolina (em substituio ao chumbo) so notrias sendo uma delas a reduo dos nveis de emisso de CO2. A agroindstria canavieira no Brasil, por meio do lcool combustvel e do bagao da cana-de-

acar, tem proporcionado, pela substituio de derivados de combustveis fsseis, a reduo de emisses para a atmosfera de 12,7 milhes de toneladas ao ano. Isso equivale a

aproximadamente 20% de todas as emisses de carbono provenientes da queima de combustveis fsseis no pas (OMETTO, 2001). A Tabela 1 apresenta o detalhamento da reduo de emisses de carbono pelo setor sucroalcooleiro, para o ano de 1996 (MACEDO; CORTEZ, 2005).

Tabela 1: Emisso de carbono pelo setor sucroalcooleiro (MACEDO(1996) citado por MACEDO; CORTEZ, 2005)

106 tC (equiv.)/ano

Uso de combustveis fsseis na agroindstria +1,28

Emisses de metano na queima da cana +0,06

Emisses de N2O +0,24

Substituio de gasolina por etanol -9,13

Substituio de leo combustvel por bagao -5,20

Contribuio lquida (reduo na emisso de carbono) -12,74

Para se ter uma noo da magnitude relativa envolvida, basta lembrar que os pases desenvolvidos assumiram em Quioto o compromisso de reduzir suas emisses em 5,2%. Ou seja, o setor sucroalcooleiro permitiu ao Brasil reduzir suas emisses de gases de

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efeito estufa, no setor energtico, em uma proporo quatro vezes maior do que as

obrigaes assumidas pelos pases desenvolvidos (OMETTO, 2001).

O setor automobilstico vem investindo no desenvolvimento de tecnologia para

uso do bicombustvel (lcool/gasolina), absorvendo, assim, o aumento da oferta de lcool no mercado. Estudos para utilizao do bicombustvel, no Brasil, deram incio na empresa

Bosch, em 1994, que vislumbrou a possibilidade de os veculos flex-fuel substiturem os veculos exclusivamente a lcool, que, na ocasio, apresentavam declnio de vendas

(DEIMLING; BORILLI, 2005).

Poucos setores da atividade econmica apresentam potencial comparvel ao da

agroindstria canavieira atravs das fontes geradoras de energia renovveis lcool e bagao para reduo de emisso de gases de efeito estufa. Nesse sentido, os incentivos

reduo de emisses devero constituir um estmulo adicional ao crescimento do setor (OMETTO, 2001).

Com a nova legislao, criada em 1997, algumas reas tero que eliminar as queimadas que antecedem colheita, proporcionando uma grande quantidade excedente de

biomassa. Se as queimadas forem eliminadas em 55% da rea total usada para a plantao de cana-de-acar, em um perodo de 8 a 12 anos, a quantidade adicional de biomassa

disponvel seria de 20 bilhes de toneladas por ano (matria seca). Um programa abrangente para a avaliao e desenvolvimento de sistemas de coleta e preparo da palha da

cana, bem como processos de utilizao de palha, tm sido conduzidos e indicam excelentes oportunidades para os prximos anos (MACEDO; CORTEZ, 2005).

1.2. Etanol

A indstria de lcool industrial desenvolveu-se na Europa, em meados do sculo 19; no ltimo quarto desse sculo iniciou-se a produo de etanol no Brasil, com as sobras de melao da indstria de acar, que ampliava sua capacidade produtiva (LIMA; BASSO; AMORIM, 2001).

Os brasileiros conheciam a possibilidade de utilizao do lcool como combustvel desde 1925. Nesta poca, porm, a gasolina era abundante, barata e consumida em pequena escala, no havendo interesse no aperfeioamento das pesquisas que conduzissem a uma melhor utilizao e explorao do lcool como combustvel. No entanto, j na dcada de

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vinte, existiam veculos movidos combustvel composto, 75% de lcool e 25% de ter (SILVA; SILVA, 1997).

Em 1929 a grande crise internacional colocou em xeque as economias de todos os pases e, no Brasil, a indstria aucareira no ficou a salvo. Sobrava acar e faltavam divisas para a aquisio de combustvel lquido. A primeira destilaria de lcool anidro foi

instalada e o Governo Federal, em 1931, estabeleceu a obrigatoriedade da mistura de 5% de etanol gasolina Decreto 19.717 , como medida de economia na importao de combustvel e para amparar a lavoura canavieira. Por muitos anos no houve lcool suficiente para misturar a todo o combustvel consumido (LIMA; BASSO; AMORIM, 2001). A fim de enfrentar esta situao, foi criado o Instituto do Acar e lcool IAA , em 1933, fazendo com que a produo brasileira fosse crescente desde ento.

Na segunda guerra, para conviver com a escassez de gasolina, o Brasil utilizava o lcool adicionado a ela ou mesmo isoladamente em motores convertidos para esta

finalidade (SILVA; SILVA, 1997).

No incio da dcada de 1970, o Brasil j se preocupava com o fornecimento de petrleo mundial e vrias crises estavam apontando (LIMA; MARCONDES, 2002).

Os ministros da Organizao dos Pases Exportadores de Petrleo OPEP , em

1970 e 1973, assumiram, ao mesmo tempo, o controle dos preos e da produo. Com isso, o preo do petrleo chegou a ter um aumento de 100% em poucas semanas. Frente a esta

situao, o programa nacional do lcool foi inicialmente apresentado pelo II Plano Nacional de Desenvolvimento II PND, em 1974, apontando este combustvel como opo energtica a ser implantado no pas (LIMA; MARCONDES, 2002).

Em outubro de 1975, foi anunciado o Programa Nacional do lcool, Prolcool, quando foram definidos os mecanismos legais do plano, visando a produo de lcool para fins carburantes. Em novembro de 1975, o Decreto de nmero 76.593, datado de 14 de novembro de 1975, define o elenco de medidas, as metas do programa e os objetivos da poltica econmica (LIMA; MARCONDES, 2002).

O Prolcool passou por duas fases distintas, sendo que a primeira visava produzir lcool anidro com o objetivo de adicion-lo gasolina propiciando economia do petrleo importado, como pode ser visto na Tabela 2. A segunda fase visava produzir lcool suficiente para abastecer os veculos movidos lcool hidratado (SILVA; SILVA, 1997).

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Tabela 2: Quantidade de etanol adicionado gasolina entre 1979 e 2005 para cada litro comercializado

Ano Volume de lcool (L) Volume de gasolina (L) Porcentagem de etanol na

gasolina (%)

1979 0,14 0,86 14

1980 0,17 0,83 17

1981 0,12 0,88 12

1982-1986 0,20 0,80 20

1987-2002 0,22 0,78 22

2002-2005 0,24 0,76 24

Fonte: UNICA (2005)

O ideal para o pas que a mistura seja de 24%, para evitar a alta taxa de contaminao atmosfrica, pela presena do chumbo tetraetila ou do MTBE, notadamente nas grandes cidades. Porm, esta mistura s atende grande So Paulo, sendo que, no

restante do pas, a mistura mdia de 15 a 18% (LIMA; MARCONDES, 2002).

O Brasil foi o pas que mais investiu no desenvolvimento das tcnicas de produo

de lcool nas ltimas dcadas e o maior produtor de lcool por via fermentativa. Apesar disso, uma grande parte de suas unidades produtoras, ainda, apresenta possibilidade de

melhoras tanto de projeto quanto operacionais (ANDRIETTA, 1994). O Brasil , hoje, o nico pas a oferecer um leque de opes ecologicamente

corretas: prev a adio de lcool anidro gasolina, desenvolveu o carro a lcool puro e,

desde 2003, domina com extrema competncia a tecnologia multicombustvel. Segundo dados da Associao Nacional dos Fabricantes de Veculos Automotores (Anfavea), em 2004 foram vendidas 379.328 unidades de carro a lcool. Desse total, 328.774 eram equipadas com sistema bicombustvel (gasolina-lcool) ou tricombustvel (gasolina-lcool-gs natural veicular), genericamente chamado de Flex Fuel. O tricombustvel pode funcionar de quatro formas: alimentado s por gs natural, s por lcool, s por gasolina ou

mistura de lcool/gasolina (O SUCESSO, 2005).

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A produo nacional de lcool etlico entre 1987 e 1995 oscilou entre 11,4 e 12,9 bilhes de litros. Nos dois anos seguintes a produo cresceu at atingir um mximo de 15,5 bilhes de litros em 1997 (BAJAY; FERREIRA, 2005).

Na safra de 1997-1998, foram produzidos aproximadamente 15 bilhes de litros de etanol (equivalente a 220 mil barris de petrleo por dia) para serem usados como combustvel de carros e mais de 1,6 bilho de litros destinados a usos no energticos. A produo de etanol anidro como combustvel foi de 5,3 bilhes de litros e da forma hidratada foi de 9,6 bilhes de litros (HALL; HOUSE; SCRASE, 2005).

A evoluo da produo de cana no Brasil a partir da safra 1998/1999 at 2004/2005 est apresentada na Tabela 3 e a produo de lcool neste mesmo perodo est apresentado na Tabela 4. E com base em dados analisados em conjunto com o Inpe (Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais) e CTC (Centro de Tecnologia Canavieira), a nica Unio da Agroindstria Canavieira de So Paulo estima que a safra de cana-de-acar 2005/2006 da Regio Centro-Sul do Pas ir atingir as 345 milhes de toneladas, nmero que se situa num patamar inferior ao de todas as previses disponveis no mercado

(CARVALHO, 2005).

Tabela 3: Produo de cana de acar no Brasil, de 1998 2004, em milhes de toneladas

Safras Local de produo

98/99 99/00 00/01 01/02 02/03 03/04

Centro/Sul 269,52 263,97 207,10 244,22 268,55 298,60

- So Paulo 199,31 194,23 148,26 176,57 190,63 207,57

-Demais cidades do

Centro/Sul 70,21 69,74 58,84 67,65 77,92 91,03

Norte/Nordeste 45,14 36,44 49,29 47,70 50,46 60,194

BRASIL 314,66 300,41 256,39 291,92 319,01 358,79

Fonte: UNICA (2005)

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Tabela 4: Produo de lcool, de 1998 2004, em milhes de m3

Safras Local de produo

98/99 99/00 00/01 01/02 02/03 03/04

lcool 13,912 12,780 10,572 11,493 12,595 14,764

Centro/Sul 12,281 11,634 9,076 10,157 11,154 13,024

Norte/Nordeste 1,631 1,146 1,496 1,336 1,441 1,740

Fonte: UNICA (Centro/Sul) e DATAGRO (Norte/Nordeste) - 2005

As vantagens da utilizao de etanol com relao a outros combustveis so

(HALL; HOUSE; SCRASE, 2005):

- combustvel lquido conhecido;

- emisses orgnicas com menos reatividade que as emisses da gasolina (mas mais reativas que as do metanol);

- menor emisso de poluentes txicos;

- maior eficincia do motor;

- produzido a partir de fontes domsticas;

- veculo de transio multicombustvel disponvel;

- produo baseada em enzima a partir de madeira est sendo desenvolvida.

Em contrapartida, as desvantagens so (HALL; HOUSE; SCRASE, 2005):

- custo mais alto do que o da gasolina;

- competio com combustvel/alimentos em nveis de produo mais altos;

- fornecimento limitado;

- faixa de rendimento 20% menor;

- tanques de combustveis maiores.

Inmeras razes de cunho ambiental, social, tecnolgico e estratgico justificaram a criao do Prolcool. Em uma eventual retomada do programa, como tem sido advogado por alguns, deveria haver um esforo conjunto do governo, produtores de lcool, fabricantes de carros e institutos de pesquisa ligados ao setor sucroalcooleiro para fomentar

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ainda mais a competio entre os produtores e preparar o terreno para um novo ciclo de

crescimento. Essa terceira fase do programa seria caracterizada por altos nveis de produtividade e baixos custos de produo, bem como por ganhos adicionais no que

concerne s questes ambientais e sociais. Os preos do petrleo relativamente elevados nos ltimos anos e leis de proteo ambiental mais rigorosas devem favorecer a retomada

do Prolcool (BAJAY; FERREIRA, 2005).

A agroindstria canavieira do Brasil foi pioneira na utilizao, em larga escala, do

lcool combustvel, oferecendo um exemplo prtico de desenvolvimento sustentvel ao combinar contribuio melhoria do meio ambiente, explorao de vocaes econmicas

locais e gerao descentralizada de emprego e renda (SZWARC, 2004 citado por DEIMLING;BORILLI, 2005). Esta indstria ostenta um dos maiores ndices de empregabilidade nacional, o setor absorve um contingente de mo-de-obra que se aproxima de 1,5 milho de pessoas e movimenta R$12,7 bilhes por ano, entre faturamentos diretos e indiretos, o que corresponde a 2,3% do PIB brasileiro (COBRA, 2001).

O panorama internacional ressalta os ganhos de competitividade da produo

brasileira no mercado mundial, pois nos USA o gasto de produo de um galo de lcool vai de US$1,05 a US$1,20, na Europa de US$2,00 a US$2,20 enquanto no Brasil fica entre US$0,57 a US$0,64 (SZWARC, 2004 citado por DEIMLING;BORILLI, 2005).

1.3. Processos Fermentativos

Denominam-se biorreatores, reatores bioqumicos, ou ainda, reatores

biolgicos, os reatores qumicos nos quais ocorrem uma srie de reaes qumicas catalisadas por biocatalisadores, os quais podem ser enzimas ou clulas vivas

(SCHIMIDELL; FACCIOTTI, 2001).

A partir do ano de 1950, ocorreu um maior desenvolvimento da rea de reatores, encontrando a mesma, desde ento, um formidvel avano, sendo responsvel pelo sucesso de muitos processos fermentativos, obviamente ao lado dos demais desenvolvimentos das

reas mais bsicas, por exemplo, a microbiologia destes processos (SCHIMIDELL; FACCIOTTI, 2001).

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Um reator biolgico pode ser operado de forma descontnua, com um inculo por

tanque ou por sistema de cortes, semicontnua, descontnua alimentada ou contnua, todos podendo trabalhar com ou sem recirculao celular (SCHIMIDELL; FACCIOTTI, 2001).

Quando o Programa Nacional do lcool foi estabelecido no Brasil todas as novas destilarias foram montadas baseadas no processo convencional de fermentao em batelada

alimentada (ZARPELON; ANDRIETTA, 1992), conhecido como Melle-Boinot.

Segundo o Centro de Tecnologia Canavieira (2005), 75 a 85% das usinas de produo de lcool no Brasil utilizam o processo batelada alimentada, enquanto 15 a 25% o processo contnuo.

1.3.1. Batelada

O processo descontnuo simples pode ter uma descrio tpica do tipo: prepara-se um certo meio de cultura que seja adequada nutrio e desenvolvimento do microrganismo, bem como o acmulo do produto desejado; coloca-se este meio de cultura em um biorreator (fermentador); adiciona-se o microrganismo responsvel pelo processo biolgico (inculo) e se aguarda que o processo ocorra. Aps um determinado tempo de fermentao, retira-se o caldo fermentado do reator e executam-se as operaes unitrias

necessrias para a recuperao do produto (SCHIMIDELL; FACCIOTTI, 2001).

Este processo o mais seguro quando se tem problema de manuteno e condies

de assepsia, pois ao final de cada batelada imagina-se que o reator deva ser esterilizado juntamente com o novo meio de cultura, recebendo um novo inculo, o qual poder sofrer todos os controles necessrios, a fim de assegurar a presena nica do microrganismo responsvel pelo processo (SCHIMIDELL; FACCIOTTI, 2001). Alm de menores riscos de contaminao, este processo apresenta grande flexibilidade de operao, devido ao fato de poder utilizar os fermentadores para a fabricao de diferentes produtos, a possibilidade de

realizar fases sucessivas no mesmo recipiente, condio de controle mais estreito da estabilidade gentica do microrganismo, assim como a capacidade de identificar todos os materiais relacionados quando se est desenvolvendo um determinado lote de produto

(CARVALHO; SATO, 2001a).

A fermentao descontnua pode levar a baixos rendimentos e/ou produtividades,

quando o substrato adicionado de uma s vez no incio da fermentao exerce efeitos de

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inibio, represso, ou desvia o metabolismo celular a produtos que no interessam

(CARVALHO; SATO, 2001a).

O biorreator batelada ser sempre usado como base para as comparaes de

eficincias atingidas com relao aos outros processos, mas a sua baixa eficincia estimula o surgimento de formas alternativas (SCHIMIDELL; FACCIOTTI, 2001).

1.3.2. Batelada Alimentada

O processo batelada alimentada, tambm conhecido como Melle-Boinot, um processo onde o substrato alimentado sob condies controladas at atingir o volume do

biorreator. importante enfatizar que a despeito de ser um processo antigo, o sistema Melle-Boinot muito conveniente e satisfatrio quanto a operao e eficincia de

converso dos acares a lcool, que muitos dos processos contnuos desenvolvidos eram to inferiores que foram abandonados (ZARPELON; ANDRIETTA, 1992).

Basicamente, o processo descontnuo alimentado definido como uma tcnica em processos microbianos, onde um ou mais nutrientes so adicionados ao fermentador durante

o cultivo e em que os produtos a permanecem at o final da fermentao. A vazo de alimentao pode ser constante ou variar com o tempo, e a adio de mosto pode ser de

forma contnua ou intermitente (CARVALHO; SATO, 2001b).

Devido flexibilidade de utilizao de diferentes vazes de enchimento dos

reatores com meio nutriente, possvel controlar a concentrao de substrato no fermentador, de modo que, por exemplo, o metabolismo microbiano seja deslocado para uma determinada via metablica, levando ao acmulo de um produto especfico (CARVALHO; SATO, 2001b).

1.3.3. Processo Contnuo

O processo de fermentao contnuo caracteriza-se por possuir uma alimentao

contnua de meio de cultura a uma determinada vazo constante, sendo o volume de reao mantido constante atravs da retirada contnua de caldo fermentado (FACCIOTTI, 2001).

As principais vantagens do processo contnuo sobre os descontnuos so (EDUARDO, 1991 & FACCIOTTI, 2001):

menores equipamentos;

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tempo de uso otimizado ou maior capacidade de fermentao com os mesmos

equipamentos;

- rendimento mdio alto;

- tempo de fermentao e paradas minimizadas;

- obteno de caldo fermentado uniforme;

- menores gastos com mo de obra;

- maior facilidade no emprego de controles avanados.

Porm, tambm h desvantagens como (FACCIOTTI, 2001):

- possibilidade presente de infeco;

- possibilidade de ocorrncia de mutaes genticas espontneas;

- possibilidade de seleo de mutantes menos produtivos;

- dificuldades de operao em estado estacionrio.

A manuteno de volume constante de lquido no reator de primordial

importncia, a fim de que o sistema atinja a condio de estado estacionrio ou regime permanente, condio na qual as variveis de estado (concentrao de clulas, de substrato limitante e de produto) permanecem constantes ao longo do tempo de operao do sistema. Entretanto, a manuteno de volume constante no reator significa teoricamente a

necessidade de se contar com vazes idnticas de alimentao e de retirada de meio, o que praticamente impossvel na prtica (FACCIOTTI, 2001).

Apesar dos problemas acima mencionados, a utilizao do processo contnuo de fermentao encontra grande aplicao prtica (FACCIOTTI, 2001).

A utilizao de reatores do tipo tubular para fermentao alcolica afetada pela mistura causada pelo desprendimento de dixido de carbono e, ento, um fluxo tubular

difcil de ser realizado na prtica e, assim, o efeito de mistura abaixa velocidade da reao, devido inibio provocada pelos produtos finais. Contudo, reatores de mistura completa

podem ser arranjados em srie e, assim, fermentao mais rpida pode ser obtida (ZARPELON; ANDRIETTA, 1992).

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O processo contnuo com reatores ligados em srie pode ser descrito de duas

formas: quando a velocidade de desenvolvimento do microrganismo praticamente independente da concentrao de substrato, onde no h vantagem trabalhar com mais de

um biorreator, ou quando a velocidade de desenvolvimento no primeiro fermentador maior que no segundo e esta que na terceira e assim por diante, sendo vantagem trabalhar

com reatores ligados em srie, pois a reduo do tempo de permanncia do material no sistema acarretar, para uma dada produo, menor capacidade total dos fermentadores. Tal

condio de trabalho pode existir no caso particular da fermentao alcolica contnua com diversos biorreatores ligados em srie, uma vez que o teor alcolico nos ltimos

biorreatores acarreta uma reduo na velocidade de reproduo do microrganismo (BORZANI, 1960), permitindo a obteno de elevados rendimentos, bem como elevadas produtividades do processo (FACCIOTTI, 2001).

As fermentaes de mltiplos estgios tm facilidades operacionais esgotamento

total do mosto, possibilidade de trabalhos com altos teores alcolicos, no intoxicao da levedura e tambm complicaes como controles de muitos estgios, que podem ser

solucionadas com 3 a 5 estgios (EDUARDO, 1991). Alm disso, mais estvel, uma vez que somente nos ltimos estgios os efeitos dos produtos de inibio so relevantes. Por

esta razo, a produtividade (etanol produzido/h) muito mais alta (ZARPELON; ANDRIETTA, 1992).

Industrialmente, sistemas com grande nmero de estgios no so considerados viveis. Alm da produtividade, os aspectos econmico e operacional devem ser levados

em conta em um projeto (ANDRIETTA, 1994). O uso de tcnicas de otimizao determinou que quatro fermentadores em srie

so razoavelmente equivalentes a um fermentador tubular, no que concerne a aplicao industrial em si (ZARPELON; ANDRIETTA, 1992). O sistema constitudo de 4 reatores de mistura perfeita, ligados em srie, possui o menor nmero de reatores possvel e o sistema subseqente, com cinco reatores, no apresenta ganhos apreciveis na produtividade

(ANDRIETTA, 1994).

A operao do sistema contnuo, ainda, pode ser feita com recirculao de clulas

que tem como objetivo a obteno de alta densidade celular no reator, aumentando-se assim

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consideravelmente as velocidades e, portanto, em ltima anlise, a produtividade do

processo (FACCIOTTI, 2001).

A utilizao de fermentao contnua implica numa reduo de 57% no investimento de capital fixo nas destilarias quando comparado ao daquelas que usam batelada. Redues ainda maiores, da ordem de 68 a 71%, so obtidas para os processos com reciclo de clulas e operao a vcuo, respectivamente (CYSEWSKI; WILKE, 1978).

1.4. Bioqumica da Fermentao Alcolica

As leveduras so organismos eucariticos e formam uma das classes mais importantes dos fungos. As do tipo Saccharomyces so as mais utilizadas na produo de

etanol e apresentam-se normalmente na forma unicelular e com 2 a 8 micrmetros de dimetro. Estas se reproduzem basicamente por gemao (brotamento), onde a clula me, aps um perodo de unio entre os citoplasmas, d origem a uma nova clula (STECKELBERG, 2001).

A fermentao alcolica a ao de leveduras sobre acares fermentveis contidos em uma soluo/suspenso. um processo biolgico no qual a energia formada por reaes de oxidao parcial pode ser utilizada para o crescimento de leveduras e a oxidao parcial anaerbia da hexose na produo de lcool e CO2 (LIMA; MARCONDES, 2002).

A transformao do acar em etanol e CO2, envolve 12 reaes em seqncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especfica, conforme apresentado na Figura

1. Tal aparato enzimtico est confinado no citoplasma celular, sendo, portanto, nessa regio da clula que a fermentao alcolica se processa (LIMA; BASSO; AMORIM, 2001).

A simplificao se d em trs etapas (LIMA; MARCONDES, 2002):

1- Via aerbia

- C6H12O6 respirao CO2+H2O (crescimento celular rpido)

2- Via anaerbia

- C6H12O6 fermentao C2H5OH+CO2 (crescimento celular lento)

- C6H12O6+2ADP+PO4-3 2C2H5O+ 2CO2+2ATP+H2O.

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Figura 1: Seqncia de reaes enzimticas pela fermentao alcolica de carboidratos endgenos (glicognio e trealose) ou exgenos (sacarose e maltose), conduzida por

Saccharomyces cerevisiae (LIMA; BASSO; AMORIM, 2001).

Entre as matrias aucaradas, costuma-se distinguir as diretamente fermentescveis

e as no diretamente fermentescveis. As primeiras so as que contm monossacardeos e se limitam aos sucos de frutas. As no diretamente fermentescveis so as que contm

dissacardeos, que fermentam aps uma hidrlise, qual se d o nome de inverso, e que

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realiza naturalmente por ao da invertase, enzima produzida pelo agente de fermentao.

A sacarose a representante mais importante dos componentes da cana-de-acar e dos melaos (LIMA; BASSO; AMORIM, 2001).

As hexoses so reagentes primrios no metabolismo da fermentao alcolica. Estequiometricamente, o rendimento do processo fermentativo 0,511g/g de hexose, porm ocorrem, juntamente com a fermentao alcolica, reaes secundrias, resultando na reduo de rendimento terico. Quando se trabalha com substratos (mosto) complexos, em processos industriais, notadamente na presena de corpos estranhos ao meio (fibras, gomas, leveduras selvagens, etc) observa-se a gerao de novos subprodutos e o rendimento industrial reduzido para at 90% (LIMA; MARCONDES, 2002 & LIMA; BASSO; AMORIM, 2001).

O objetivo primordial da levedura, ao metabolizar anaerobicamente o acar, gerar uma forma de energia (ATP, adenosina trifosfato) que ser empregada na realizao dos diversos trabalhos fisiolgicos (absoro, excreo e outros) e biossnteses, necessrias manuteno da vida, crescimento e multiplicao, para perpetuar a espcie. O etanol e o

CO2 resultantes se constituem, to somente, de produtos de excreo, sem utilidade metablica para a clula em anaerobiose. Entretanto, o etanol, bem como outros produtos

de excreo (como o glicerol e cidos orgnicos) podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas apenas em condies de aerobiose (LIMA; BASSO; AMORIM, 2001).

1.5. Cintica da Fermentao

A cintica de fermentao alcolica um assunto altamente estudado e pesquisado

nos centros de pesquisa especializados, tendo em vista seu potencial industrial e econmico (LIMA; MARCONDES, 2002).

O objetivo bsico do estudo da cintica de processos microbianos quantificar a taxa de crescimento celular, consumo de substrato, formao de produtos e demais

parmetros relacionados (VIEGAS, 2003).

Os modelos cinticos normalmente usados em fermentaes podem ser divididos

em:

18

- No-estruturados e no segregados, nos quais as clulas de microrganismos so

consideradas como soluto;

- Estruturados e no segregados, onde as clulas so tratadas como seres individuais

de mltiplos componentes, porm com composio mdia semelhante;

- No-estruturados e segregados, onde as clulas so tratadas como seres individuais

distintos porm descritos por um nico componente; e

- Estruturados e segregados, onde as clulas de microrganismos so consideradas

como indivduos distintos e formados por mltiplos componentes (BAILEY;OLLIS, 1986).

A complexidade da descrio cintica que requerida e apropriada depende das situaes fsicas e da aplicao pretendida. No possvel ou praticvel a formulao de

um modelo que inclua todas as caractersticas e detalhes celulares. O modelo deve ser formulado a partir de algumas aproximaes (STREMEL, 2001).

O tipo de modelo mais encontrado na literatura para descrever a fermentao alcolica do tipo no-estruturado e no-segregado. A equao mais simples e popular para

descrever o crescimento microbiano a equao de Monod, que assume a presena de substrato como limitante para o crescimento. A cintica de Monod est apresentada na

Equao 1 (HAN;LEVENSPIEL, 1988).

SKSS

+= max ( 1)

sabido que a equao de Monod s aplicvel onde a presena de produtos metablicos txicos no acontece (LUONG, 1985). Porm, constatou-se que alm da limitao pelo substrato, h tambm efeitos inibidores na cintica da fermentao

(HAN;LEVENSPIEL, 1988).

Na fermentao alcolica o rendimento de biomassa com a levedura Saccharomyces cerevisiae diminui, de 0,156 para 0,026, com o aumento da concentrao de etanol, de 0 107 g/L, indicando uma relao entre o rendimento da biomassa e a inibio pelo produto (THATIPALAMA; ROHANI; HILL, 1992).

O efeito inibidor do etanol deve apresentar um termo de descrio cintica no competitiva atividade de fermentao das clulas (AIBA; SHODA; NAGATANI, 1968).

19

O etanol comea a ter efeito inibitrio na taxa de crescimento celular acima de 15 g/L. A concentrao mxima de etanol permitida, acima da qual as clulas no crescem, foi predita em 112 g/L. A capacidade de produo de etanol onde as clulas so

completamente inibidas foi de 115 g/L de etanol (LUONG, 1985).

A cintica da fermentao alcolica foi estudada por vrios autores que

formularam modelos que esto apresentados na Tabela 5, levando em conta a limitao pelo substrato e a possvel inibio pelo produto, substrato e concentrao celular.

Apesar dos vrios trabalhos que tratam da cintica de fermentao, pouca influncia estes tiveram sobre o arranjo das plantas industriais instaladas no Brasil. No entanto, o projeto rigoroso de uma planta de fermentao tem que passar, obrigatoriamente, por uma modelagem detalhada do processo, utilizando modelos cinticos precisos,

possibilitando a obteno de condies timas de operao. Por outro lado, a manuteno destas condies vai depender da escolha de uma estratgia de controle adequada que s

possvel conhecendo-se o comportamento do processo. Isto pode ser adequadamente realizado pelo estudo prvio de modelagem da planta e simulao em computador

(ANDRIETTA, 1994).

A utilizao de modelos matemticos na otimizao de um processo de grande

importncia, pois minimiza o custo e o tempo aplicado de estudo (ANDRIETTA, 1991).

Outro fator a ser avaliado a limitao relacionada ao crescimento microbiano e

ao substrato, alm da inibio provocada pela presena de etanol. Ainda pode haver a inibio provocada pelas altas concentraes de substrato, ou clulas ou mesmo outras

substncias presentes no meio (HAN; LEVENSPIEL, 1987).

A inibio pelo substrato mais txica quando comparada inibio pelo produto

e desativa importantes enzimas alm de modificar o caminho metablico que vital sobrevivncia da levedura. O efeito inibidor provocado pelo substrato na fermentao

alcolica ocorre quando a concentrao supera 150 g/L (THATIPALAMA; ROHANI; HILL, 1992).

20

Tabela 5: Modelos matemticos no-estruturados e no-segregados propostos para a fermentao alcolica, suas condies e autores

Modelo Condio Autores

++

=

mx

i

i

isi

imxi P

P

KS

KS

S 12

-Substrato limitante

-Inibio pelo substrato

-Inibio linear pelo produto

GHOSE E TYAGI (1979)

+

=

is

iY

mx

imxi SK

SPP N1


-Sem inibio pelo substrato

-Inibio de potncia pelo produto

LEVENSPIEL (1980)

+

+=

mx

i

Pi

p

is

imxi P

PKP

KSK

S 1



-Inibio parablica pelo produto

SEVELY ET AL. (1980)

citado por DOURADO (1987)

+=

is

iSKPKmxi SK

Se ii 21


-Inibio exponencial pelo substrato

-Inibio exponencial pelo produto

JIN ET AL. (1981) citado por

DOURADO (1987)

MN Y

mx

iY

mx

i

is

imxi X

XPP

SKS

+= 11




-Inibio por altas concentraes de biomassa

LEE; PAGAN; ROGERS (1983)

NY

mx

i

i

isi

imxi P

P

KS

KS

S

++

= 12


-Inibio pelo substrato


TOSETTO (2002)

A fermentao alcolica produz etanol mesmo aps a parada do crescimento das

leveduras a nveis superiores a mLclulas810 . O fato que o etanol, a concentraes

21

relativamente baixas (20%), inibidor da atividade metablica da levedura (AIBA; SHODA; NAGATANI, 1968).

A fermentao alcolica, alm de efeitos inibidores, tambm afetada pela temperatura do biorreator, onde o rendimento alcolico maior em temperaturas mais baixas, 15C e 20C, porm apresentam uma demora para obteno da populao mxima. Quando a temperatura no biorreator 25C e 30C a taxa inicial de fermentao maior e a temperaturas superiores a 35C decresce a viabilidade celular (TORIJA et al., 2003).

O modelo no-estruturado e no-segregado no indicado para descrever o comportamento dinmico do processo, devido a fase lag resultante de uma mudana do meio (DUNN;MOR, 1975), tornando-se mais vantajosa a utilizao de um modelo mais complexo para descrever o sistema biolgico transiente. O modelo estruturado pode ser utilizado diretamente na representao da cintica das rotas bioqumicas da clula. Similarmente, caractersticas do ciclo celular podem ser incorporadas e usadas para validar a faixa do modelo cintico para uma populao celular pelo uso de uma aproximao segregada. Todavia uma funo de atraso para a velocidade de crescimento especfico do microrganismo pode adequar este modelo no-estruturado e no-segregado para o estudo dinmico (ONEIL;LYBERATOS,1990). A equao de atraso linear para a velocidade especfica pode ser baseada na concentrao de ART em cada reator devido a maior sensibilidade desta varivel em alteraes nas variveis de entrada do processo, como pode ser visto na Equao 2 (ANDRIETTA, 1994):

=

depois

antesc ART

ART. ( 2)

Esta equao tem por objetivo considerar o tempo que o microrganismo leva para se adaptar s novas condies do meio, ou seja, acredita-se que quando as condies do meio se alteram bruscamente, a resposta do microrganismo a estas no imediata. Entretanto, simulaes realizadas utilizando os modelos com e sem correo, no mostram diferenas significativas para alguns processos. Mas, mesmo no encontrando diferenas significativas, a correo do modelo deve ser mantida, pois pode ser uma ferramenta importante para ajustes posteriores do modelo (ANDRIETTA, 1994).

22

1.5.1. Constantes Cinticas

A multiplicidade de modelos cinticos que descrevem o crescimento microbiano devido ao fato destes serem construdos para uma levedura especfica, em condies experimentais pr-definidas (DOURADO et al., 1987).

Alguns modelos cinticos com aproximao convencional baseada na cintica de Michaelis-Menten, apresentados na Tabela 5, possuem constantes cinticas com valores especficos apresentados pelos seus autores, de acordo com os experimentos feitos por eles, apresentadas na Tabela 6.

Tabela 6: Autores e parmetros cinticos de modelos baseados na cintica convencional de Michaelis-Menten

Autores Ks max Pmax Xmax YN YM Ki Kp K1 K2

GHOSE E TYAGI (1979) 0,48 0,40 87 - 1 - 203,49 - - -

LEVENSPIEL (1980) 0,222 0,42 87,5 - 0,41 - - - - -

SEVELY ET AL. (1980) citado por DOURADO

(1987) 5 0,3 85 - 1 - - 4,5 - -

JIN ET AL. (1981) citado por DOURADO (1987)

0,22 0,453 - - - - - - 0,06035 0,0055

LEE; PAGAN; ROGERS (1983)

1,6 0,24 90 100 1 1 - - - -

TOSETTO (2002) 21 0,5 88 - 0,7 - 15,5 - - -

1.6. Simulao

Modelagem matemtica a rea do conhecimento que estuda maneiras de desenvolver e implementar modelos matemticos de sistemas reais (AGUIRRE, 2004).

A modelagem matemtica de processos fermentativos pode ser definida como a tentativa de representar, por equaes matemticas, os balanos de massa para cada componente nos biorreatores, associados s complexas transformaes bioqumicas que ocorrem no processo e s velocidades com que essas transformaes se processam (BONOMI; SCHMIDELL, 2001).

23

Uma vez obtido um modelo matemtico, necessrio verificar se o comportamento de tal modelo equivale ao do sistema real e quais so os limites de validade. A fim de avaliar o desempenho de um modelo, necessrio simul-lo, ou seja, necessrio resolver as equaes que compem o modelo. Portanto, a forma de simular vai depender da representao utilizada (AGUIRRE, 2004).

A simulao de modelos contnuos normalmente envolve a resoluo de equaes

diferenciais do tipo ),( txfx =

. Na maioria dos casos, obter uma soluo analiticamente

impossvel e, portanto, resolve-se a equao diferencial, de forma aproximada, por mtodos numricos (AGUIRRE, 2004).

Os mtodos de Runge-Kutta so muito utilizados para a integrao de sistemas de equaes diferenciais ordinrias devido sua simplicidade, alta preciso e versatilidade de aplicaes (CUNHA, 2003).

O Runge-Kutta de quarta ordem mais utilizado tem a forma das Equaes de 3 a 7(CUNHA, 2003):

( )43211 226 KKKKhyy jj ++++=+ ( 3)

( )jj yxfK ,1 = ( 4)

++= 12 2

,

2KhyhxfK jj ( 5)

++= 23 2

,

2KhyhxfK jj ( 6)

( )34 , hKyhxfK jj ++= ( 7)

O erro de truncamento deste mtodo )(!5

)(5

Vj yh = , jj xx

24

no trivial obter um modelo cuja simulao se aproxime das observaes. Por ser relativamente simples, tal procedimento muito comum (AGUIRRE, 2004).

1.7. Dinmica da Populao de Cepas em Processos Industriais

Os microrganismos mais importantes na obteno do lcool por via fermentativa so as leveduras, especialmente a Saccharomyces cerevisiae, da qual foram selecionadas vrias linhagens, tidas por muito tempo como espcies: Saccharomyces ellipsoideus, S.carlsbergensis e S.uvarum. O desempenho do processo fermentativo enormemente afetado pelo tipo de levedura que o executa (LIMA; BASSO; AMORIM, 2001).

As fermentaes se iniciam com uma determinada levedura, com culturas puras fornecidas por instituies especializadas. As culturas puras so apenas isoladas ou obtidas atravs de melhoramento gentico. Com o tempo, as linhagens que do incio ao processo, que tm durao efmera, so substitudas por leveduras comuns regio das destilarias, comumente denominadas de leveduras selvagens (LIMA; BASSO; AMORIM, 2001).

A identificao da levedura importante ao processo fermentativo devido a uma modificao da populao nos biorreatores. Sob condies inadequadas, algumas leveduras com baixa produtividade em etanol podem dominar o processo de fermentao, causando srios prejuzos indstria (ANDRIETTA et al., 1997).

A realizao de um controle da dinmica de populaes, que associa tcnicas de identificao com a avaliao do desempenho fermentativo de cada uma das cepas de levedura dominantes, pode fornecer informaes valiosas para o aumento da produtividade dos processos de fermentao alcolica. As informaes obtidas podem ser utilizadas na seleo de leveduras nativas com alto potencial fermentativo e na adequao dos processos s suas necessidades atravs da elaborao e melhoramento de projetos e tambm da correo de condutas operacionais inadequadas (STROPPA, 2002).

1.7.1. Mtodo de Identificao de Leveduras

Sistemas clssicos de identificao de leveduras baseiam-se em caractersticas morfolgicas e fisiolgicas e so incapazes de distinguir facilmente algumas espcies e, sobretudo, cepas de uma mesma espcie (STROPPA, 2002).

25

Meios seletivos tm sido desenvolvidos com o objetivo de selecionar e diferenciar espcies de leveduras em processos fermentativos. O meio WLN gar contm um indicador de pH, o verde bromocresol, que colore diferencialmente as colnias como resultado dos graus variveis de afinidade entre os microrganismos e o corante (LEWIS; YOUNG, 1998). Entre os mtodos utilizando meios de cultivos diferenciais para diferenciar cepas de leveduras pertencentes ao gnero Saccharomyces, o meio WLN o mais utilizado por ser um mtodo simples e eficiente para reconhecer similaridades ou diferenas entre os isolados de levedura, apesar de no fornecer a sua identidade (CAMPBELL (1999), citado por (STROPPA, 2002)).

O meio WLN gar possibilita a discriminao e/ou recuperao de linhagens do gnero Saccharomyces (CASTRO, 1995).

Mtodos moleculares tm sido desenvolvidos recentemente com o propsito de apresentar um nico padro de DNA fingerprinting, sendo eles: PCR Reao em cadeia da polimerase, PFGE Eletroforese em gel de campo pulsado, RAPD DNA polimrfico amplificado ao acaso e RFLP Polimorfismo de tamanho de fragmento restrito. Entre estas tcnicas, as mais utilizadas para identificao de cepas de levedura esto: PCR e RFLP de DNA mitocondrial e nuclear (Freizer & Dubourdieu, 1992; Ness et al., 1993).

Estudos comparativos de alguns mtodos de caracterizao de cepas de levedura demonstram que a anlise eletrofortica de cromossomos capaz de diferenciar cepas de Saccharomyces cerevisiae (DEGR et al. (1989), CASEY; PRINGLE; ERDMANN (1990), QUEROL; BARRIO; RAMN (1992) e MANI; DLAUCHI; DAK (1998)).

Em uma eletroforese em gel de agarose convencional, o DNA move-se atravs de um campo eltrico uniforme e molculas de DNA maiores que 50KDalton, como cromossomos, migram independente do seu tamanho e, portanto, no so separadas. Com a aplicao de duas orientaes de campos eltricos alternados (pulsos), os cromossomos menores respondem mais rapidamente s mudanas de carga eltrica e movem-se mais rapidamente atravs do gel produzindo a separao dos cromossomos por tamanho. Depois de corado com brometo de etdio e visualizado sob luz UV, o gel exibe bandas que correspondem aos cromossomos inteiros (MEADEN, 1990).

27

2- Material e Mtodos

Este trabalho passou por fases distintas, na primeira foram realizadas as coletas em usinas de produo de lcool em operao, por isto h uma descrio das usinas e dos ensaios industriais. A partir das amostras coletadas foram feitas as anlises laboratoriais, que juntamente com os dados de operao das usinas, foram utilizados para determinao dos valores das constantes cinticas para os modelos do processo de fermentao alcolica, citados na Tabela 5. Obtidos estes valores, passou-se para a fase de implementao computacional, para simulaes de dimensionamento e de alteraes na etapa de fermentao do processo, que tem o seu fluxograma apresentado na Figura 2.

Figura 2: Esquema da etapa de fermentao de uma usina de lcool.

2.1. Usina de Acar e lcool As usinas Clealco, localizada em Clementina SP, e a Alvorada, em Arapor

MG, foram implantadas segundo esquema proposto por ANDRIETTA (1994), diferindo somente no nmero de reatores e no tamanho dos mesmos.

A usina Clealco possui quatro biorreatores em srie, que podem ser vistos na Figura 3, sendo o volume deles 601,8 m3, 413,8 m3, 331,8 m3 e 262,1 m3, consecutivamente.

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Figura 3: Biorreatores da usina Clealco.

A usina Alvorada, Figura 4, possui cinco biorreatores, sendo o primeiro de 353,95m3 e os quatro seguintes de 304,18 m3. Na foto dos reatores, Figura 5, pode-se ver a diferena de tamanho entre o primeiro biorreator e os seguintes. Note que o gs produzido na fermentao segue pela tubulao superior de um biorreator para o seguinte. O quinto biorreator apesar do mesmo tamanho dos trs anteriores, possui a particularidade de na sada do gs produzido durante a fermentao possuir o tratamento para descarte na atmosfera.

Figura 4: Foto da Usina Alvorada.

29

Figura 5: Biorreatores da usina Alvorada.

O volume til dos biorreatores depende da produo, no sendo utilizada sempre 100% de sua capacidade.

2.2. Ensaios Industriais

As coletas foram feitas nas unidades fermentativas da Usina Alvorada Acar e lcool, localizada em Arapor, MG, no perodo de julho a outubro do ano de 2002 e Usina Clealco Usina Clementina de Acar e lcool, localizada em Clementina, SP, nos meses de julho e agosto de 2002. Cada ensaio teve a durao de dois dias e consistiu em estabilizar o processo nas condies desejadas, utilizando a malha de controle j implantada, e coletar amostras dos reatores, em intervalos de uma hora. O tempo de ensaio foi de dezoito horas, sendo que as dez primeiras foram para a estabilizao do sistema, nas trs horas seguintes foram retiradas amostras no regime permanente, quando ento era aumentada a vazo de mosto em 10%, na entrada do primeiro reator e amostras continuaram sendo coletadas durante as cinco horas finais do ensaio. No ensaio de julho da usina Alvorada houve coleta somente em regime permanente.

Nas oito horas de coleta foram retiradas amostras de mosto, fermento e meio de fermentao em cada um dos biorreatores e imediatamente congeladas em gelo seco e transportadas para o CPQBA, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas, Biolgicas e

30

Agrcolas, onde seriam feitas as anlises. A Figura 6 mostra o ponto de coleta de mosto na Usina Alvorada.

Figura 6: Foto do ponto de coleta do mosto na Usina Alvorada.

A amostra de fermento foi retirada diretamente do tanque de inculo, Figura 7, e os contedos dos biorreatores retirados por uma abertura de vlvula que est representada pela Figura 8.

Figura 7: Tanque de inculo (fermento) para o processo de produo de lcool.

Figura 8: Vlvula lateral para retirada de amostra do biorreator.

31

2.3. Anlises Laboratoriais

As anlises laboratoriais tiveram duas aplicaes, uma primeira no processo industrial, feita nas amostras coletadas nas usinas, e outra para determinao da capacidade fermentativa das leveduras.

No estudo do processo industrial a anlise de massa seca foi feita para clculo das concentraes de massa celular em cada um dos biorreatores e no reciclo do processo. As concentraes de acares redutores totais e etanol tiveram como objetivo avaliar a quantidade de substrato e produto nos biorreatores, no mosto e no reciclo para a produo de lcool. O plaqueamento de amostras do reciclo, tambm denominado fermento, possibilitou o isolamento de cepas dominantes do processo industrial.

As cepas dominantes foram estudadas quanto capacidade fermentativa, onde foram feitas anlises de concentraes de acares redutores totais e etanol antes e depois do processo fermentativo e de massa seca. As cepas ainda passaram por um mtodo de cariotipagem para identificao das leveduras dominantes do processo fermentativo industrial em operao.

2.3.1. Massa Seca

As amostras foram descongeladas e 25 mL centrifugados durante 5 minutos 3000 rpm. O sobrenadante foi reservado para a determinao de acares redutores totais e etanol enquanto a massa depositada no tubo da centrfuga submetida a duas lavagens com gua destilada e nova centrifugao, s ento transferida para placas de petri e colocadas em estufa a 45C at adquirir peso constante (ALTERTHUM, 2001).

2.3.2. Acares Redutores Totais

O mosto de alimentao do biorreator para produo do lcool possui sacarose, glicose e frutose. A sacarose constituda por uma molcula de glicose e outra de frutose, devendo passar por hidrlise cida sendo convertida em acares redutores. A metodologia utilizada para determinao dos acares redutores totais (ART) foi o mtodo qumico DNS (MILLER, 1959), modificado. Devido a toxicidade do fenol utilizado, foi feita uma modificao na metodologia retirando esta substncia e o sulfito de sdio e adicionando tartarato de sdio e potssio tetrahidratado para a composio da soluo de cor a ser

32

utilizada, sendo assim, para produo de 100 mL do reagente de cor foi utilizado 1 g de cido dinitrossaliclico, 40 mL de hidrxido de sdio 1,0 N, 30 g de tartarato de sdio e potssio tetrahidratado.

O mtodo DNS indireto, sendo feita a leitura da absorbncia no espectrofotmetro com comprimento de onda de 546 nm. Para determinao dos acares redutores totais necessrio a construo de uma curva padro para correlacionar a absorbncia da amostra com o sua concentrao de acar. Esta curva feita para concentraes de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 g/L de glicose. Para a utilizao desta curva padro as amostras coletadas nas usinas foram diludas: do mosto de 1:100, do primeiro biorreator de 1:25 e dos outros reatores 1:10.

Esta mesma anlise foi utilizada em amostras das fermentaes em batelada utilizadas para determinao da capacidade fermentativa das cepas dominantes dos processos nas usinas, com diluio de 1:100 para o mosto e 1:10 para o meio aps a fermentao.

2.3.3. Etanol

A determinao da concentrao de etanol nas amostras foi feita pelo mtodo qumico do Dicromato de Potssio (SALIK; POVH, 1993).

O preparo das amostras para essa anlise foi feito com alquotas de 25 mL que foram destiladas, por arraste de vapor, sendo coletados 50 mL na sada do destilador, para garantir que todo o etanol fosse retirado nesta etapa. O mtodo do dicromato correlaciona a absorbncia da amostra a um comprimento de onda de 600nm no espectrofotmetro concentrao de etanol presente. A curva padro desta anlise feita com solues de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 GL.

2.4. Desenvolvimento do Programa

O ambiente desenvolvido em Delphi se baseia em uma extenso orientada a objetos da linguagem de programao Pascal, tambm conhecida como Object Pascal. As linguagens de programao mais modernas fornecem suporte para a programao orientada a objetos que se baseiam em trs conceitos fundamentais: o encapsulamento, em geral implementado com as classes, a herana, e o polimorfismo ou ligao tardia (CANT, 2003). O programa foi desenvolvido em linguagem Delphi na verso 7.0.

33

A vantagem do desenvolvimento deste programa nesta linguagem a interface bastante simples e a facilidade de utilizao, no precisando ser especialista no processo, pois suas caractersticas esto embutidas na programao.

O programa pode funcionar para qualquer processo microbiolgico devendo passar pelas etapas de escolha do modelo que melhor descreve a cintica naquelas condies especficas e de simulao, que neste trabalho foi feita para produo contnua de quatro reatores de mistura em srie.

H uma grande variedade de modelos cinticos. Apesar de somente seis terem sido implementados neste trabalho, a escolha de outro modelo pode ser feita e implementada da mesma forma, assim como o design do processo.

2.4.1. Ajuste dos Modelos Cinticos Os modelos cinticos citados na Tabela 5 foram implementados no programa e o

fluxograma do ajuste das constantes cinticas est apresentado na Figura 9. Os resultados das anlises laboratoriais das amostras e as condies de operao da usina durante os ensaios industriais foram utilizados como dados de entrada. Para o ajuste de parmetros deve-se fazer a escolha do modelo a ser testado e determinar os intervalos a serem estudados para cada uma das constantes cinticas. Os intervalos foram definidos, inicialmente, para cada uma das constantes do modelo de acordo com valores citados em literatura Tosetto (2002), Dourado (1987) e foram sendo alterados com o intuito de se obter os menores erros de ajuste sem causar inconsistncia fsica.

Figura 9: Fluxograma da implementao do programa para o ajuste das constantes cinticas dos modelos no-estruturados e no segregados.

34

A implementao do programa para o modelo Tosetto (2002) est apresentada e comentada no Apndice 1, sendo semelhante para os outros modelos.

2.4.2. Simulao

A simulao do processo de produo de lcool em biorreatores de mistura em srie foi desenvolvida segundo Andrietta(1994), com quatro reatores em srie e reciclo celular. O programa foi implementado segundo o fluxograma apresentado na Figura 10.

Figura 10: Fluxograma da implementao do programa para a simulao do modelo Tosetto(2002) para 4 reatores de mistura em srie com reciclo de clulas.

- Estado Estacionrio (Permanente) A soluo da modelagem matemtica em estado estacionrio possui soluo

algbrica que foi implementada diretamente no ambiente Delphi 7.0.

Em estado estacionrio a vazo de entrada e sada no sistema constante, logo os volumes dos reatores no so alterados. O balano de massa para cada biorreator

35

semelhante e resulta em equaes algbricas que ao serem solucionadas geram valores para cada uma das variveis existentes.

Os biorreatores esto em srie, sendo assim, a concentrao que entra em um reator a que saiu do anterior, como pode ser visto na Figura 2. No primeiro reator deve-se fazer os clculos lembrando que a vazo do processo a soma da vazo de mosto e da vazo de reciclo. A composio do mosto no apresenta etanol (produto), e no reciclo no h ART (substrato).

Balano de massa dos componentes de interesse para simulao do processo em regime permanente, sendo a Equao (8) o balano global de massa e as Equaes (9), (10) e (11) os balanos de substrato, produto e clulas, respectivamente.

01 = ii FF ( 8)

01/

11 = iiiSX

iiii VXYFSFS

( 9)

0/

/11 =+ iii

SX

SPiiii VXY

YFPFP

( 10)

011 =+ iiiiiii VXFXFX

( 11)

No programa o passo de avaliao de resultado foi de 10-3horas e o mtodo utilizado foi a comparao entre o tempo de residncia hidrulico (T ), apresentado na Equao (12), e tempo de residncia ( ) do reator, Equao (13), onde i o tem

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