Reação em cadeia da Polimerase

Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR - “Polymerase Chain Reaction”

(Reação em cadeia da polimerase)

• Fator limitante para biologia molecular pequena quantidadede material disponível (DNA)

• Replicação in vitro de DNA – amplifica regiões específicas deDNA (exponencialmente), gerando milhares de cópias domolde de interesse

• Termocicladores: ciclos de altas e baixas temperaturas

APLICAÇÕES:

•Isolamento de DNA genômico

•Diagnósticos de doenças

•Amplificações de regiões de

interesse

•PCR (reação em cadeia da polimerase)

•PCR: amplificação enzimática de um fragmento de DNAlocalizado entre 2 iniciadores (primers ou oligonucleotídeos)

•Ciclos repetidos de desnaturação pelo calor, hibridização deiniciadores e síntese de DNA amplificação exponencial do DNAalvo

•Capaz de gerar quantidades suficientes de DNAs específicos apartir de pouca amostra para a análise de mutações, por ex.

•Amplificação a partir de poucas células bucais, embrião com 3dias, esperma de vagina de uma vítima de estupro, gota desangue seco

Antigamente: banho-maria

com diversas temperaturas

Atualmente:

termocicladores

Componentes e reagentes:

• DNA molde: contém a região a ser amplificada

• Primers: complementares às regiões 5´ e 3´ da molécula alvo

• dNTPs: nucleotídeos livre a serem incorporados às novas fitas

• Tampão: fornece meio ótimo para atividade e estabilidade da Taq

• Mg+2: cofator da enzima

• Enzima: Taq DNA polimerase

•Enzima isolada da bactéria Thermus aquaticus,

presente em regiões vulcânicas do Yellowstone

National Park, EUA (águas quentes 70C)

•Bactéria termófila – organismos que vivem e se

reproduzem em altas temperaturas

•Taq DNA polimerase termoestável – suporta

altas temperaturas

Taq DNA polimerase

Yellowstone National Park, EUA BactériaThermus aquaticus

Estrutura tridimensional da

enzima Taq DNA polimerase

Taq polimerase

Primers

Tampão

Água

94ºC

DENATURAÇÃO

72ºC

EXTENSÃO

57ºC

ANELAMENTO

ETAPAS DO PCR1. Adição de reagentes

2. Alternância de temperaturas

(Termociclador)

25-40 (35) CICLOS

DNA

dATP

dCTP

dGTP

dTTP(nucleotídeos)

1. Detecção de deleções / inserções produtos amplificados que

apresentam alterações em seu tamanho.

2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de bases)

geram polimorfismos genéticos que podem ser determinadas pela

ação das enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.

3. Diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional para doenças herdadas

4. medicina forense (DNA fingerprint).

5. Diagnóstico de doenças infecciosas por agentes patogênicos diversos.

Aplicações do PCR

(DNA com carga negativa corre em direção à eletrodo com carga positiva)

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