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Mestrado Integrado em Medicina Dentária da Universidade do Porto Artigo de Revisão Bibliográfica “Perfis de microRNA – deteção e aplicação no diagnóstico de cancro oral” Bohdana Petrivna Holub Porto, 2020
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Mestrado Integrado em Medicina Dentária da Universidade do Porto
Artigo de Revisão Bibliográfica
“Perfis de microRNA – deteção e aplicação no
diagnóstico de cancro oral”
Bohdana Petrivna Holub
Porto, 2020
2
“ Perfis de microRNA – deteção e aplicação no diagnóstico de
cancro oral”
Unidade Curricular “Monografia de Investigação / Relatório de
Atividade Clínica”
Artigo de Revisão Bibliográfica
Bohdana Petrivna Holub
Aluna do 5º Ano do Mestrado Integrado em Medicina Dentária da Faculdade de
Medicina Dentária da Universidade do Porto
Orientadora
Prof. Doutora Paula Cristina dos Santos Vaz Fernandes
Professora Auxiliar com Agregação da Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do
Porto
Coorientador:
Dr. Nuno Teixeira Tavares
Mestre em Medicina pela Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Especialista em Oncologia Médica
Porto, 2020
1
Resumo
Introdução: A oitava neoplasia maligna mais frequente a nível mundial é o Cancro da Cabeça
e do Pescoço (CCP). O prognóstico, em estádios não iniciais, é ainda desfavorável, apesar
dos avanços no diagnóstico e terapêutica. Diversos estudos reconhecem a associação entre a
desregulação dos miRNAs e o aparecimento de neoplasias malignas orais. Em biópsia líquida
estas moléculas evidenciam elevado potencial no diagnóstico do cancro oral, sugerindo que
elevados níveis de miRNAs desregulados presentes em fluídos humanos possam ser detetados
e correlacionados com desenvolvimento inicial de cancro oral.
Objetivos: Objetiva-se efetuar uma abordagem concisa sobre as diversas técnicas de deteção
de miRNAs e sobre aplicabilidade dos mesmos no diagnóstico de neoplasias malignas orais.
Material e Métodos: Para a realização desta tese foram efetuadas pesquisas de artigos
científicos na base de dados PubMed® (National Library of Medicine, National Center for
Biotechnology Information) com o limite temporal 2009 a 2019. Foram considerados artigos
redigidos em inglês, a partir dos seus títulos, resumos e com base na relevância para o tema.
Esta pesquisa foi posteriormente complementada com a consulta de artigos relacionados com
os das pesquisas originais. Obtiveram-se 469 artigos, dos quais foram selecionados 246 e 126
foram incluídos.
Desenvolvimento: Os seguintes conceitos foram explorados individualmente: mecanismos
de desregulação dos miRNAs, as suas funções no cancro oral, as diversas técnicas de deteção
dos miRNAs e a aplicabilidade dos mesmos para o diagnóstico do cancro oral.
Conclusão: O miRNAs possuem um papel determinante a nível das vias celulares na
patogénese do cancro oral. No entanto, são necessários estudos futuros no sentido de se
esclarecer melhor o mecanismo de ação do miRs no desenvolvimento do cancro oral. Existem
diversos métodos válidos de deteção dos miRNAs, embora na generalidade apresentem
vantagens e limitações. A saliva é cada vez mais usada como uma “biópsia líquida”, uma vez
que constitui uma fonte de biomarcadores para o diagnóstico do cancro oral.
Palavras-Chave: miRNA, cancro oral, biomarcadores de diagnóstico, deteção dos miRNAs.
2
Abstract
Introduction: Head and Neck Carcinoma is the eighth most common kind of human cancer
worldwide. Even if diagnostic and therapeutic methods cntinue evolving, the prognosis of
oral cancers in non-initial stages is still poor. Many studies found a strong association between
the development of oral cancer and deregulated miRNAs profiles. Recently, using liquid
biopsy, numerous studies confirmed the potential diagnostics value of miRNAs in oral cancer.
This suggests that deregulated miRNAs when detected in human fluids can be linked to the
initial development of oral cancer.
Objective : This article aims at performing a literature review on the recent advances in
miRNA detection and their use in diagnosis of oral carcinomas.
Material and Methods: Article search was conducted in PubMed database, including articles
published from 2009 to 2019. Only papers written in English were included based on their
abstracts and relevance to the theme. The original keyword-based search was further
complemented by references cited in the former articles. A total of 469 publications were
obtained, with 246 being selected for this review and 126 being included.
Development: The dysregulation mechanisms of miRNAs, their functions in oral cancer,
different detection techniques of miRNAs and their use in oral cancer diagnosis are explored
individually. A discussion analyzing all of the concepts mentionned above is also presented.
Conclusion: Numerous studies demonstrated the role of miRNAs in cellular processes of oral
cancer. However, future studies are necessary in order to discover new processes used by
miRNAs in the developpment of oral cancer. MiRNAs are important candidates for the
controll of oral cancer, so, one of the most popular investigation fields is the analysis of the
newest miRNAs detection methods. Various methods and techniques were studied and each
of them has their advantages and limitations. The saliva, out of all human fluids, is the most
often used in the liquid biopsy as a biomarker for the oral cancer diagnosis even if it still has
some limitations mentioned in this review.
Keywords: miRNA, oral cancer, diagnostic biomarkers, miRNA detection.
3
Índice
Resumo ...................................................................................................................................... 1
Abstract ..................................................................................................................................... 2
Índice ......................................................................................................................................... 3
Índice de Tabelas ...................................................................................................................... 4
Índice de Figuras ...................................................................................................................... 5
Lista de Abreviaturas ............................................................................................................... 6
1.Introdução .............................................................................................................................. 9
2.Material e métodos .............................................................................................................. 11
3.Mecanismos de desregulação dos miRNAs ....................................................................... 12
3.1.Mecanismos genéticos: .............................................................................................. 13
3.2.Mecanismos epigenéticos: ........................................................................................ 15
3.3.Alterações no processamento dos miRNAs: ........................................................... 16
4.Perfis de miRNAs alterados no cancro oral ...................................................................... 17
4.1.Carcinoma Oral de Células Escamosas (COCE) ................................................... 17
4.2.Carcinoma Adenóide Cístico Salivar (CACS) ........................................................ 21
4.3.Lesões prémalignas ................................................................................................... 22
5.Estratégias recentes de imagiologia molecular usadas na deteção da expressão
diferencial dos diversos miRNAs no cancro oral ................................................................. 24
5.1.Imagiologia de Bioluminescência (IBL) .................................................................. 25
5.2.Ressonância Magnética (RM) .................................................................................. 26
5.3.Imagiologia Cerenkov ............................................................................................... 27
5.4.Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos ......................................................... 27
5.5.Deteção dos miRNAs recorrendo a nanoparticulas de ouro ................................. 32
6.miRNAs – marcadores biológicos auxiliares no diagnóstico do cancro oral. Perspetiva
da biópsia líquida ................................................................................................................... 32
6.1.MiRNAs circulantes no sérum/plasma como biomarcadores do cancro oral ..... 34
6.2.MiRNAs salivares como biomarcadores de cancro oral........................................ 36
7.Discussão .............................................................................................................................. 39
8.Conclusão ............................................................................................................................. 41
Referências .............................................................................................................................. 42
Anexo 1 – Declaração de Autoria da Monografia ............................................................... 53
Anexo 2 – Parecer do Orientador para entrega definitiva do trabalho apresentado ...... 54
Anexo 3 – Parecer do Coorientador para entrega definitiva do trabalho apresentado .. 55
4
Índice de Tabelas
Tabela I - Interações entre os microRNAs e os genes relacionados com o COCE. ................ 19
Tabela II - Lista de microRNAs adicionais com poder de diagnóstico do CEL. .................... 34
Tabela III - MicroRNAs reportados por apresentarem concentrações desreguladas nos fluídos
corporais, relevantes para o diagnóstico do cancro oral ........................................................... 38
5
Índice de Figuras
Figura 1 - Danos produzidos pela radioterapia num paciente com CCP. ............................................... 9
Figura 2 - Esquematização da pesquisa e da seleção das referências bibliográficas. ........................... 12
Figura 3 - Esquema ilustrativo de diversos mecanismos de desregulação dos miRNAs. .................... 13
Figura 4 - Esquema ilustrativo sobre o silenciamento epigenético e sub-expressão dos miRNAs com
função supressora tumoral. .................................................................................................................... 15
Figura 5 - Esquema ilustrativo da regulação do miR-34a pelas proteínas p53e SIRT1 por feedback
negativo. ................................................................................................................................................ 16
Figura 6 - Imagem ilustrativa de COCE da mucosa bucal. .................................................................. 18
Figura 7 - Esquema ilustrativo sobre a a ação do miR-21 no desenvolvimento do COCE. ................. 18
Figura 8 - Carcinoma escamoso da língua. .......................................................................................... 20
Figura 9 - Mecanismo de ação dos miRs sobre-expressos, no desenvolvimento e prognóstico do CEL.
............................................................................................................................................................... 20
Figura 10 - Tumefação extra-oral da glândula salivar submandibular esquerda. ................................. 21
Figura 11 - Imagem histopatológica com coloração com hematoxilina e eosina de um CACS (10x).
(Hipermagnificação de 100x no canto superior direito). ....................................................................... 21
Figura 12 - Esquematização dos diferentes miRNAs desregulados no CACS..................................... 22
Figura 13 - Diferentes tipos de LO. ...................................................................................................... 23
Figura 14 - Método de deteção de células cancerígenas testado em ratos recorrendo a IBL. .............. 25
Figura 15 - Esquema ilustrativo dos microRNAs desregulados nos pacientes com glioblastoma
multiforme. ............................................................................................................................................ 26
Figura 16 - Ilustração sobre o esquema de ação do let-7 e a emissão de fotões de luz visível. ........... 27
Figura 17 - Amplificação de Círculo Rolante. ..................................................................................... 28
Figura 18 - Deteção do miR-21 pela DSN. .......................................................................................... 29
Figura 19 - Esquema ilustrativo do modo de ação do LAMP. ............................................................. 30
Figura 20 - Esquema ilustrativo do modo de ação do SDA. ................................................................ 31
Figura 21 - A biópsia líquida auxilia na deteção precoce do cancro oral. ............................................ 33
Figura 22 - Esquema sobre os microRNAs desregulados no plasma, de pacientes com COCE/CEL,
apresentando elevado potencial na deteção do cancro oral. .................................................................. 34
Figura 23 - Esquema ilustrativo dos microRNAs salivares com utilidade no diagnóstico do COCE. . 36
Figura 24 - Ilustração de microRNAs salivares desregulados. ............................................................. 37
Figura 25 - Esquema ilustrativo dos microRNAs salivares detetados em pacientes com LPO. .......... 38
6
Lista de Abreviaturas
AUC - Área abaixo da curva ROC
Bim - Bcl-2-like protein 11
CACS - Carcinoma adenóide cístico salivar
CAMK2N1 - Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase II Inhibitor 1
CCP - Carcinomas da Cabeça e do Pescoço
CDC73 - Cell Division Cycle 73
Cdk6 - Cyclin Dependent Kinase 6
CDKN1B - Cyclin-dependent Kinase Inhibitor
CDKN1C - Cyclin-dependent kinase inhibitor 1C
CEL - Carcinoma escamoso da língua
c-Myc - MYC Proto-Oncogene, BHLH Transcription Factor
COCE - Carcinoma Oral de Células Escamosas
Dicer-1 - endoribonuclease Dicer
DKK2 - Dickkopf-related protein 2
DND1 - Dead end protein homolog 1
DSN - Amplificação baseada na Nuclease Específica de Duplexos
Drosha - drosha ribonuclease III
E2F1 - E2F Transcription Factor 1
F-PNA - péptidos fluorescentes de ácido nucléico
Fluc - Firefly luciferase
Gluc - Gaussia Luciferase
hNIS - Human Sodium-Iodide symporter
IBL - Imagiologia de bioluminescência
K-ras - KRAS Proto-Oncogene, GTPase
LAMP - Amplificação Isotérmica Mediada por Alça
LLC - leucemia linfocítica crónica
7
LO - leucoplasia oral
LOAR - lesões orais de alto risco
LPO- liquen plano oral
MET - MET Proto-Oncogene, Receptor Tyrosine Kinase
miRNAs / miRs - microRNAs
Myc - MYC proto-oncogene, bHLH transcription factor
p53 - tumor protein p53
PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PDCD4 - Programmed Cell Death 4
PDIA3P - Protein Disulfide Isomerase Family A Member 3 Pseudogene 1
pri-miRNAs - miRNAs primários
pre-miRNAs - precursores dos miRNAs
PTEN - Phosphatase and tensin homolog
RAS - gene codificador da Ras GTPase
RCA - amplificação de círculo rolante
RCAHR - RCA hiper-ramificado
RCAP - produtos amplificados de ácidos nucleicos criados por RCA
RECK - Reversion-inducing cysteine-rich protein
RISC - complexo de silenciamento induzido por RNA
Rluc - Renilla luciferase
RM - ResonÂncia Magnética
SDA - Amplificação de Deslocamento de Cadeia
SDS - Síntese pelo Deslocamento da Cadeia
SIRT1 - NAD-dependent deacetylase sirtuin-1
SOX7 - SRY-Box Transcription Factor 7
Sp1 - Sp1 Transcription Factor
8
TIMP1 - TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1
TIMP3 - TIMP metallopeptidase inhibitor 3
UBE2B - Ubiquitin Conjugating Enzyme E2 B
9
1.Introdução
O cancro oral é o tipo mais comum dos Carcinomas da Cabeça e do Pescoço (CCP). (1)
Constitui a oitava neoplasia maligna humana com maior prevalência de morte (Figura 1). Com
220 000 novos casos que surgem anualmente, apresenta uma elevada frequência global (5%).
(2)
Figura 1 - Danos produzidos pela radioterapia num paciente com CCP. Fonte: http://www.headandneckcancerpatient.com/radiation-damage.html
(Adaptado e sem autorização do autor)
O Carcinoma Oral de Células Escamosas (COCE) integra um conjunto de neoplasias com
origem na mucosa de recobrimento oral. É, por isso, a entidade que se considera como o
representante major do cancro oral, constituindo 90% de todos os tipos de neoplasias malignas
orais. (3) Diversos fatores de risco estão associados ao COCE, entre os quais, um dos mais
relevantes, é a infeção pelo papilomavirus humano (HPV). Uma das razões desta associação é
a elevada afinidade do vírus pelos queratinócitos. (4)
10
O exame clínico é o primeiro meio de deteção clínica do COCE, complementado pela biópsia
incisional para caraterização histopatológica.
Devido à pequena sensibilidade do exame visual, o COCE é comummente detetado em estadios
avançados. Consequentemente, o prognóstico torna-se desfavorável, por metastizar
rapidamente e recorrer frequentemente, apresentando uma taxa de sobrevivência a 5 anos de
47%. (5) (6)
Assim, a investigação centra-se muito na pesquisa de biomarcadores fiáveis para o diagnóstico
simplificado e precoce do cancro oral. Os microRNAs (miRNAs) apresentam-se como
potenciais candidatos destes biomarcadores.
Os miRNAs são cadeias simples de RNAs (com cerca de 22 nucleótidos) que não codificam
proteínas, mas são uns dos principais reguladores negativos da expressão génica. O genoma
humano contém aproximadamente 2500 miRNAs, que interagem com cerca de 60% de todos
os genes, ligando-se às sequências complementares das extremidades não traduzidas 3´ dos
RNAs mensageiros (mRNAs) alvos. (7) (8)
O miRNA, uma vez ligado ao mRNA alvo, anula a expressão deste último, degradando-o ou
suprimindo a sua translação, permitindo a regulação de genes supressores tumorais e de
oncogenes. Diversos mRNAs constituem o alvo de um só miRNA o que resulta na regulação,
por este último, de numerosas vias biológicas implicadas na génese do cancro (de que
constituem exemplo a proliferação, diferenciação, migração e apoptose celular). (6)
No núcleo celular, os miRNAs são transcritos, a partir dos pri-miRNAs, que são sequências
localizadas entre os intrões, nos genes, e nas regiões intergénicas. A polimerase II ou III de
RNA é a enzima responsável pela catalisação da transcrição. (8)
Os pri-miRNAs são processados pelo complexo RNAase III endonuclease Drosha. Os pre-
miRNA são formados por sequências de 60-110 nucleótidos (9), que são exportadas para o
citoplasma, sendo recortados em duplas-cadeias, curtas, de miRNAs e desenrolados por
helicases específicas, formando os miRNAs maduros. No entanto, estes últimos não são capazes
de exercer as suas funções até serem incorporados com as proteínas Argonaute no RISC. Uma
vez incorporados, regulam o mRNA por processos mencionados anteriormente. (8) (6)
A desregulação dos miRNAs deve-se principalmente a fatores externos, nomeadamente
substâncias químicas ambientais, stress celular, às modificações ocorridas durante a transcrição
11
e aos defeitos de processamento dos miRNAs. Isto leva ao metabolismo anómalo dos miRNAs
alvos, desregulando assim os genes que controlam a génese do cancro. (7)
A presença de determinados miRNAs circulantes nos fluídos humanos, associa-se com o
desenvolvimento e a manifestação de uma variedade de cancros orais. Estes dados sugerem o
potencial dos miRNAs na biópsia líquida para a deteção inicial das neoplasias malignas orais.
(10)
A partir deste conhecimento, acerca dos miRNAs, diversas técnicas inovadoras de deteção
destes tem vindo a ser desenvolvidas.
Esta dissertação tem como objetivo apresentar de forma concisa a base das funções oncogénicas
e supressoras tumorais dos miRNAs no cancro oral, bem como efetuar uma abordagem sobre
algumas técnicas, consideradas atuais, na deteção destas biomoléculas e sobre o seu potencial
como biomarcadores no diagnóstico do cancro oral, recorrendo à biópsia líquida.
2.Material e métodos
Para a realização desta revisão bibliográfica procedeu-se a uma pesquisa na base de dados
PubMed®, com as palavras chave combinadas e com os marcadores booleanos AND e OR:
MicroRNA, oral cancer, diagnostic biomarkers e MicroRNA detection com limitação temporal
de 2009 a 2019 e ao idioma inglês. Foram também utilizadas algumas referências de artigos
específicos pela relevância da temática abordada nas mesmas.
Um dos critérios de inclusão de artigos foi a presença de informação relevante para o
conhecimento sobre os mecanismos de desregulação dos miRNAs, sobre técnicas inovadoras
de deteção dos miRs e sobre o uso destes como biomarcadores biológicos no diagnóstico do
cancro oral. Como critérios de exclusão utilizou-se: rejeição de artigos com idioma diferente
do inglês e de artigos não relacionados com COCE/CCP/cancro oral e/ou miRNA.
Apresentando-se em esquema uma súmula dos resultados obtidos (Figura 2)
12
Figura 2 - Esquematização da pesquisa e da seleção das referências bibliográficas.
3.Mecanismos de desregulação dos miRNAs
Muitos cancros orais e outras patologias que afetam a cavidade oral estão associados à
expressão desregulada dos miRNAs. (7) Diferentes miRNAs podem atuar como supressores
tumorais ou como promotores tumorais, participando no início e na progressão dos vários
cancros orais. Alterações na expressão dos miRNAs poderão estar na origem da patogénese,
metástase e quimioresistência do cancro oral. (8)
Um miRNA pode participar em diferentes vias moleculares, provocando diversos efeitos
biológicos em células e tecidos variáveis. Cada miRNA pode igualmente alterar a função
supressora/oncogénica de qualquer outro miRNA. (11)
Vários mecanismos podem estar na base desta desregulação e estão agrupados em quatro
principais categorias. A Figura 3 esquematiza estes mecanismos. (7)
13
Figura 3 - Esquema ilustrativo de diversos mecanismos de desregulação dos miRNAs.
3.1.Mecanismos genéticos:
Os miRNAs podem atuar como genes supressores tumorais (quando localizados em regiões
cromossómicas ausentes na neoplasia maligna) ou como oncogenes (quando estão em áreas
amplificadas na neoplasia maligna), dependendo dos genes alvos que regulam. (12)
O ganho ou perda de material cromossómico nos genes codificadores de miRNAs (Figura 3),
portanto em mutações, pode ocorrer com bastante facilidade devido à fragilidade dos locais
onde estes genes estão presentes, alterando a expressão dos miRNAs. (8)
Um estudo efetuado por Mohammad e colaboradores, demostrou que a perda da expressão no
gene CDC73 (Cell Division Cycle 73) estimulava a proliferação das células da linha KB (linha
celular implicada no COCE). Como a sobrexpressão do miR-155 (miRNA oncogénico) levava
a sub-expressão do gene CDC73, estes resultados indicam que o miR-155 regula a expressão
14
do gene CDC73 interagindo especificamente com a região 3′-UTR. As mutações nesta região
podem levar à uma alteração do processo no qual o miRNA visa o gene alvo. (13)
Um outro estudo determinou diferentes padrões de expressão dos miRNAs nas amostras de
pacientes com COCE, tendo-se verificado que o cluster do miR-17-92 estava desregulado,
sobre-expresso, sub-regulando os genes supressores tumorais PTEN (phosphatase and tensin
homolog), E2F1 (E2F Transcription Factor 1) e Bim (Bcl-2-like protein 11). (14)
Este cluster consiste em seis miRNAs (miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b1 e miR-
92-1). A região cromossómica que codifica este cluster encontra-se amplificada numa grande
variedade de tumores sólidos humanos, e, consequentemente, leva a sobre-expressão deste
cluster.
Os miRNAs deste cluster promovem proliferação celular, inibem a apoptose e induzem a
angiogènese tumoral, entre outras ações. Outros miRNAs sobre-expressos numa variedade de
tumores humanos, atuam sobre genes supressores tumorais importantes, diminuindo a sua
expressão. Por exemplo, o miR-21 atua diretamente sobre os genes PTEN, PDCD4
(Programmed Cell Death 4), TIMP1 (TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1) e o miR-221/222,
atua sobre os genes PTEN, CDKN1B (cyclin-dependent kinase inhibitor), CDKN1C (Cyclin-
dependent kinase inhibitor 1C) e TIMP3 (TIMP metallopeptidase inhibitor 3). (15)
Os miRNAs com a função supressora tumoral apresentam deleções ou mutações nos genes
codificadores, participando no aparecimento de vários cancros humanos como é o caso do miR-
16 que se encontra sub-expresso no cancro oral. (15) (16)
Os membros da família let-7 (let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, let-7i, miR-98 e
miR-202) diminuem a expressão do oncogene RAS (gene codificador da Ras GTPase), que está
na origem de vários cancros humanos, incluindo o carcinoma oral. A deleção parcial ou total
desta família, resulta na sobre-expressão do oncogene. (17)
É importante referir que certos miRNAs podem atuar como oncogenes ou como supressores
tumorais, dependendo do tecido onde atuam. Consequentemente, antes de classificar um
microRNA como um oncogene ou um supressor tumoral, é necessário especificar em que célula
ou tecido é exercida essa função. (15) Um exemplo ilustrativo seria o caso do COCE, onde
asalterações no cromossoma 11 são das mais comuns. A perda de uma parte do braço do
cromossoma 11 (11q), está presente em mais de 50% de COCE e a amplificação da banda
cromossómica 11q13 ocorre em 45 % dos COCE. (18)
15
3.2.Mecanismos epigenéticos:
A Figura 3 ilustra os principais mecanismos epigenéticos implicados na desregulação dos
miRNAs. (7)
A desregulação epigenética mais frequentemente encontrada em neoplasias malignas, é a
hipermetilação do DNA dos genes supressores tumorais (Figura 4). A hipometilação do DNA
dos oncogenes também pode ser observada em certas neoplasias malignas, embora menos
frequentemente. (19) O consequente silenciamento epigenético contribui para a proliferação e
invasão das células neoplásicas orais. (8) (20)
Figura 4 - Esquema ilustrativo sobre o silenciamento epigenético e sub-expressão dos
miRNAs com função supressora tumoral.
O silenciamento dos seguintes miRNAs: miR-34b, miR-100, miR-125b miR-137, miR193a e o
miR-203 encontra-se na base e na progressão do COCE. A hipermetilação dos genes
codificadores destes miRs é uma das causas, como é o caso do miR-137, associado a taxas de
sobrevivência baixas no COCE. (19)
A família genética miR-34 (miR-34a, miR-34b e miR-34c), quando presente nas células
neoplásicas induz sua apoptose através da ação inibidora sobre o grupo génico Myc (MYC
proto-oncogene, bHLH transcription factor). Porém, os promotores dos genes codificadores do
16
miR-34b e miR-34c são alvo da hipermetilação da região CpG em vários cancros, incluindo o
cancro oral. (8)
3.3.Alterações no processamento dos miRNAs:
As consequências dos defeitos do processamento dos miRNAs (Figura 2) podem ser severas,
nomeadamente defeitos na organogénese. Como constituem exemplo, os defeitos no
processamento de genes efetores da via de formação dos miRNAs, tais como Drosha (drosha
ribonuclease III) e Dicer-1 (endoribonuclease Dicer), que alteram significativamente o fluxo
dos miRNAs. Várias alterações, nomeadamente a diferenciação celular terminal, podem ser
explicadas pela deleção do Dicer-1 do epitélio dentário. A deleção heterozigótica de Drosha e
Dicer-1 está associada à transformação celular e tumoregénese em ratos, e a deleção
hemizigótica de um ou de ambos genes é comum em numerosos cancros humanos. (7)
O mecanismo de inibição por feedback, regula a expressão de alvos transcripcionais do gene
da p53 (tumor protein p53), nomeadamente o miR-34a. A Figura 5 exemplifica este mecanismo.
Figura 5 - Esquema ilustrativo da regulação do miR-34a pelas proteínas p53e SIRT1 por
feedback negativo. Fonte: https://www.researchgate.net/figure/Cytology-of-apoptosis-The-different-stages-of-apoptotic-cell-death-
start-by-cellular_fig3_274013152
(Adaptado e sem autorização do autor)
17
Mutações no gene da p53 e/ou do STIR1 impedem a biogénese eficaz do miR-34a nos
queratinócitos, contribuindo para o desenvolvimento do COCE (Figura 5). (21)
4.Perfis de miRNAs alterados no cancro oral
A cavidade bucal constitui uma das 10 localizações mais frequentes de neoplasias malignas.
Três casos sobre quatro afetam a população mundial. (7)
Nas últimas décadas, vários estudos foram realizados com o objetivo de encontrar os padrões
de miRNAs mais frequentemente desregulados em diferentes tipos de cancro oral. Centenas de
miRNAs foram identificados, e dados como certos, repetindo-se em vários estudos. Isto
justifica a diversidade de miRs encontrados e, do mesmo modo, explica o porquê de
determinados miRNAs serem identificados em determinados trabalhos e ausentes noutros.
Torna-se, assim, pertinente realçar que diferentes miRNAs podem ser encontrados em
diferentes carcinomas orais e variar a sua expressão. (22)
4.1.Carcinoma Oral de Células Escamosas (COCE)
Os COCEs representam mais de 90% de todos os cancros orais (Figura 6). (23) Diversos estudos
analisaram os principais miRNAs envolvidos no aparecimento e progressão deste tipo
histológico de neoplasia maligna. Os seguintes miRs sobre-expressos foram os mais
frequentemente encontrados: o miR-21, miR-7, miR-34, miR-155, miR-182 e miR-185.
Numerosos miRNAs sub-regulados foram igualmente detetados, dos quais se destacam: a
família let-7, miR-23b, miR-125a, miR-125b e miR-145. (7) (24)
18
Figura 6 - Imagem ilustrativa de COCE da mucosa bucal. Fonte: https://www.merckmanuals.com/professional/ear,-nose,-and-throat-disorders/tumors-of-the-head-and-
neck/oral-squamous-cell-carcinoma
(Adaptado e sem autorização do autor)
A Figura 7 esquematiza os diversos mecanismos de ação do miR-21 no desenvolvimento do
COCE e do Carcinoma associado a fibroblastos. (6) (25) (26) (24)
Figura 7 - Esquema ilustrativo sobre a a ação do miR-21 no desenvolvimento do COCE.
19
A Tabela I esquematiza os diversos genes e miRs implicados no desenvolvimento do COCE e
como estes se relacionam.
Tabela I - Interações entre os microRNAs e os genes relacionados com o COCE.
miR-34a expressão do gene do
receptor da interleucina 6
Fenótipo mais
agressivo do COCE
(27)
miR-155 expressão do gene
CDC73 Fenótipo mais
agressivo do COCE
(6)
miR-182-5p expressão do CAMK2N1
(Calcium/Calmodulin
Dependent Protein Kinase
II Inhibitor 1)
Proliferação celular
menos agressiva
(28)
expressão do PDIA3P
(Protein Disulfide
Isomerase Family A
Member 3 Pseudogene
1)
expressão do miR-185-5p Fenótipo mais
agressivo do COCE
(29)
família let-7 expressão do oncogene
RAS
Fenótipo mais
agressivo do COCE
(15) (17)
miR-23 expressão do MET (MET
Proto-Oncogene, Receptor
Tyrosine Kinase)
Diminuição da
migração e invasão
neoplásica
(30)
miR-145 expressão do proto-
oncogéne c-Myc (MYC
Proto-Oncogene, BHLH
Transcription Factor) e do
gene Cdk6 (Cyclin
Dependent Kinase 6)
Pior prognóstico do
COCE
(31)
4.1.1.Carcinoma Escamoso da Língua (CEL)
A localização preferencial do COCE é a língua (Figura 8). (23) O CEL é um dos tumores
malignos mais frequentes e possui rápida capacidade de invasão e de metástase. (32) Existem
numerosas alterações dos miRNAs observadas neste cancro, o que o torna quase como uma
entidade independente do COCE. É, por isso, importante dedicar uma parte desta revisão à sua
análise.
20
Figura 8 - Carcinoma escamoso da língua. Fonte: https://www.webmd.com/cancer/tongue-cancer-facts#1
(Adaptado e sem autorização do autor)
O miR-184, miR-21 e o miR-24 mostraram-se frequentemente sobre-expressos neste tipo de
cancro (Figura 9), ao contrário do miR-100, miR-125, miR-138, miR-159, miR-740, miR-133a
e miR-133b que foram detetados em défice. (7) (33) (34) (32) (35)
Figura 9 - Mecanismo de ação dos miRs sobre-expressos, no desenvolvimento e prognóstico
do CEL.
21
Em contraste, a expressão reduzida dos miRNAs, com a função supressora tumoral, tais como
o miR-100, miR-125, miR-138, miR-159, miR-740, miR-133a e miR-133b regula a migração,
invasão e progressão das células malignas. A expressão diminuída destes miRNAs pode
desencadear vários mecanismos biológicos que estimulam a carcinogénese. (7) (36)
4.2.Carcinoma Adenóide Cístico Salivar (CACS)
O Carcinoma Adenóide Cístico Salivar (CACS) é um carcinoma muito comum das glândulas
salivares (Figura 10,11). (7)
Figura 10 - Tumefação extra-oral da glândula salivar submandibular esquerda. Fonte: https://www.researchgate.net/figure/Lateral-view-of-the-left-side-of-neck-showing-swelling-in-left-submandibular-
gland_fig1_301676209
(Adaptado e sem autorização do autor)
Figura 11 - Imagem histopatológica com coloração com hematoxilina e eosina de um CACS
(10x). (Hipermagnificação de 100x no canto superior direito). Fonte: https://www.researchgate.net/figure/Hematoxylin-and-Eosin-stained-HP-section-10x-of-Adenoid-cystic-
carcinoma-solid_fig3_301676209
(Adaptado e sem autorização do autor)
22
A Figura 12 esquematiza a ação de diversos miRNAs, desregulados no CACS. (37) (7)
Figura 12 - Esquematização dos diferentes miRNAs desregulados no CACS.
As desregulações dos miRNAs mencionados (Figura 12) parecem estar associadas ao
comportamento mais invasivo do CACS, encontrando-se implicadas várias vias genéticas e
biológicas, embora nem todas as funções oncogénicas / supressoras tumorais destes miRs sejam
conhecidas. (7) (38)
A título de exemplo, o miR-375 tem as proteínas Sp1 (Sp1 Transcription Factor) e ciclina D1
como alvos e funciona inibindo a proliferação celular. O miR-455 infraregula o gene supressor
tumoral UBE2B (Ubiquitin Conjugating Enzyme E2 B). (22)
O estudo de Shin e colaboradores, em contrapartida, detetou o miR-181a como estando sub-
expresso no carcinoma oral. Neste estudo, a interação deste com o gene K-ras (KRAS Proto-
Oncogene, GTPase) inibia a proliferação celular. (39)
4.3.Lesões prémalignas
A leucoplasia oral (LO) (Figura 13) é a manifestação mais comum de lesões prémalignas orais,
tendo como principais fatores de risco o tabaco, o álcool, infeções por HPV e a predisposição
genética. (7)
23
Figura 13 - Diferentes tipos de LO.
a - Leucoplasia Homogénea
b - Leucoplasia Ulcerada
c - Leucoplasia Nodular
d - Leucoplasia Proliferativa Verrugosa Fonte: https://cdn.technologynetworks.com/ep/pdfs/potentially-malignant-disorders.pdf
(Adaptado e sem autorização do autor)
Huan e colaboradores, realizaram um estudo afim de identificar e comparar os diferentes
padrões de expressão dos miRNAs entre os tecidos com leucoplasia oral e os tecidos onde esta
lesão se transformou em COCE (LO-COCE) e conseguiram identificar diferenças
significativas. Foram encontrados 3 miRNAs-padrão: miR-129-5p, miR-296-5p e miR-450b-5p.
O miR-129-5p e o miR-296-5p estavam sub-regulados nos tecidos com LO-COCE atuando
como supressores tumorais, ao contrário do miR-450b-5p que se apresentava sobre-expresso,
justificando a sua função oncogénica. (40)
Tecidos com LO, comparativamente com os tecidos sãos, apresentavam sobre-regulação do
miR-21 e do miR-181b. Histologicamente, detetou-se um aumento do rácio núcleo/citoplasma,
do número de figuras mitóticas e hipercromatismo. (41)
24
As diferenças na expressão dos miRNAs entre a LO e LO-COCE determinam o
desenvolvimento da neoplasia maligna, a partir da leucoplasia, o que contribui ao diagnóstico
precoce do COCE. (40)
5.Estratégias recentes de imagiologia molecular usadas na deteção
da expressão diferencial dos diversos miRNAs no cancro oral
No cancro oral, certos miRNAs estão significativamente sobre-regulados e são estimuladores
da progressão do cancro silenciando os genes supressores tumorais, nomeadamente os genes
indutores de apoptose. Consequentemente, verifica-se um aumento da proliferação, da invasão
e da metástase no cancro oral. Os miRNAs podem servir de biomarcadores, uma vez que a
análise da sua expressão poderá auxiliar no diagnóstico precoce. (42)
É possível monitorizar os miRNAs, nas LO e nos estádios iniciais do cancro oral, recorrendo a
diferentes métodos. Os métodos mais convencionais incluem a sequenciação computacional do
DNA, métodos baseados na amplificação tais como o PCR em tempo real, a análise molecular
por Northern Blot e técnicas baseadas em hibridização tais como os microarrays e a hibridização
in situ.
Os métodos supracitados apresentam limitações, visto que são principalmente usados na
deteção in vitro dos miRNAs e não monitorizam as funções dinâmicas dos miRs. (43) (44)
Descobertas recentes mostraram que as técnicas de imagiologia molecular não invasiva podem
vir a constituir alternativas aos métodos anteriores, na monitorização in vivo de miRNAs. (45)
Estas, podem mesmo constituir uma nova via de diagnóstico precoce do cancro oral.
Assim, neste capítulo, estão resumidas as principais técnicas inovadoras de deteção dos
miRNAs e são discutidas as suas vantagens e eventuais limitações. De realçar que cada vez
mais se recorre à identificação destes biomarcadores clínicos à partir dos líquidos biológicos.
(45) (44) (46)
25
5.1.Imagiologia de Bioluminescência (IBL)
A IBL apresenta grande sensibilidade nas análises imagiológicas in vivo devido à ausência de
reflexão dos sinais bioluminescentes.
Figura 14 - Método de deteção de células cancerígenas testado em ratos recorrendo a IBL. Fonte: https://www.nanowerk.com/news/newsid=14179.php
(Adaptado e sem autorização do autor)
As luciferases catalisam a energia química em energia luminosa (Figura 14) e possuem elevada
especificidade para o seu substrato. (44) Os genes Fluc (Firefly luciferase), Rluc (Renilla
luciferase) e Gluc (Gaussia Luciferase) codificam 3 destas enzimas bioluminescentes e,
consequentemente, são amplamente usados em IBL. O Fluc oxida o seu substrato e emite luz
no comprimento de onde de 562 nm, enquanto que o Rluc e o Gluc emitem no comprimento de
onda de 480 nm após a interação com o seu substrato. (47)
Ko e colaboradores realizaram um protocolo, usando o gene “reporter” Gluc, afim de medir a
atividade de miR-124a . O Gluc estava ligado à extremidade 3′UTR do miR-124a, no entanto
recorrendo à via do RNA de interferência, via esta, que inibe a expressão do Gluc separando-o
do miRNA alvo, com a sobre-expressão do miR-124a, concorrendo para a diminuição da
atividade do Gluc. (48)
Um outro exemplo ilustrativo do uso da IBL na deteção da expressão dos miRNAs é a
investigação efetuada por Li e colaboradores. Foi estudada, recorrendo a IBL, a interação
oncogénica ou supressora tumoral entre o miR-214 e o seu alvo, Uma sobre-expressão do miR-
214 e uma sub-expressão do seu alvo, foram detetadas no cancro oral. (49)
26
Outros sistemas baseados na mesma técnica, demostraram uma atenuação do sinal na presença
do miR-21, pela repressão dos genes codificadores das luciferases por este miRNA. Assim,
verifica-se que é possível a monitorização e a deteção in vivo dos miRNAs envolvidos na
proliferação e diferenciação celular cancerígena. (50)
A principal limitação da IBL é a impossibilidade de detetar miRNAs localizados numa
profundidade superior a 2 mm. Trata-se de uma limitação quando há necessidade de recolher
as amostras de tecido tumoral, para diagnosticar o cancro oral. (51)
5.2.Ressonância Magnética (RM)
Este método utiliza nanopartículas magnéticas na deteção dos miRNAs.
Ainda não foram publicados muitos estudos sobre a aplicação desta técnica na deteção dos miRs
envolvidos no cancro oral.
Li e colaboradores, estudaram a relação entre as características cancerígenas detetadas por RM
e a expressão diferencial dos miRNAs em pacientes com glioblastoma multiforme. Cada uma
das cinco características analisadas estava associada com a desregulação de certos miRNAs, de
entre elas (Figura 15): (52)
Figura 15 - Esquema ilustrativo dos microRNAs desregulados nos pacientes com
glioblastoma multiforme.
Visto que certos miRNAs estudados se encontram igualmente desregulados no cancro oral, isto
sugere que esta técnica imagiológica também possa ser aplicada no estudo de neoplasias
malignas orais. No entanto, até ao momento de realização desta dissertação, não se encontratam
estudos, relacionando expressões de miRNAs com propriedades óticas da RM, aplicadas no
cancro oral.
27
Singh e colaboradores avaliaram o uso da RM no estadiamento das lesões orais malignas
(recorrendo aos parâmetros T1 e T2) e correlacionaram os resultados com as características
clínicas presentes. (53) A principal limitação era a relativamente baixa sensibilidade desta
técnica em relação ao custo dos equipamentos necessários. (51)
5.3.Imagiologia Cerenkov
A Imageria Luminescente Cerenkov é usada na deteção de biomoléculas na cirurgia de
neoplasias malignas, guiada por imagiologia. Consiste na deteção de fotões ópticos Cerenkov
emitidos pelos agentes da tomografía de emissão de positrões. (54) O estudo de Yang e
colaboradores descreve este tipo aplicabilidade. O gene hNIS (Human Sodium-Iodide
symporter) regula a absorção do ião iodo, e como tal tem vindo a ser usado na imagiologia radio
nucleica (Figura 16). (55)
Figura 16 - Ilustração sobre o esquema de ação do let-7 e a emissão de fotões de luz visível.
A verdade que os métodos convencionais impossibilitam a repetição da técnica e, a
complexidade dos procedimentos gera facilmente falsos-positivos. Assim, os novos métodos
tecnológicos, com o objetivo de melhorar a sensibilidade e especificidade de deteção dos
miRNAs, foram desenvolvidos.
5.4.Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
Nestas técnicas são necessárias quantidades relativamente pequenas de miRNAs nos tecidos e
nos fluídos humanos para serem eficazmente detetados. Estas técnicas incluem a amplificação
de círculo rolante (RCA), a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), a amplificação
baseada na nuclease específica de duplexos (DSN) e a amplificação de deslocamento de cadeia
28
(SDA). Estas técnicas permitem a deteção em tempo real usando corantes fluorescentes. No
entanto, estes corantes podem reduzir a eficácia de amplificação. Consequentemente, a
combinação destas técnicas torna-se útil de forma a evitar certas limitações destes métodos,
quando usados isoladamente.
5.4.1. Amplificação de Círculo Rolante (RCA)
Esta técnica está, na maioria dos casos, combinada com outros métodos de deteção. A expressão
dos miRNAs é detetada quantificando os RCAP (produtos amplificados de ácidos nucleicos
criados por RCA). (56)
Xu e colaboradores desenvolveram um método de deteção do let-7 que inclui o RCA. (57) Esta
técnica consiste na criação de sondas “padlock”. Estas últimas são moléculas de DNA com uma
cadeia que apresenta dois segmentos complementares ao miRNA-alvo pesquisado. As sondas
“padlock” com configuração circular (ssDNA) são formadas após a combinação complementar
DNA-miRNA pela enzima ligase de RNA T4. A polimerase de DNA permite a amplificação
repetitiva da sequência deste ssDNA e, consequentemente, da sequência do miRNA alvo. Por
ultimo, o miRNA ligado é separado permitindo novas interações (Figura 17). Os RCAP podem
então ser detetados por uma variedade de métodos. (56) (58)
Figura 17 - Amplificação de Círculo Rolante. Fonte: Ye, Xu et al, 2019
(Adaptado e sem autorização do autor)
29
Hong e colaboradores criaram um protocolo simples para detetar os RCAP: foram criados F-
PNA (péptidos fluorescentes de ácido nucleico) complementares ao miRNA alvo. Quando
ocorria a formação do duplexo F-PNA/RCAP devido à presença do miRNA-alvo, o quenching
fluorescente era atenuado, aumentando o sinal luminoso. O oposto ocorria na ausência do
miRNA-alvo. (59)
5.4.2. Nuclease Específica de Duplexos (DSN)
O estudo de Le e colaboradores testou a possibilidade de detetar quantidades muito reduzidas
do miR-21 recorrendo ao DSN (Figura 18). A sonda criada apresentava sequência
complementar ao miRNA, um sinal fluorescente, pela transferência de energia não-radioativa
entre o fluoróforo dador e o recetor, e, um quencher. (60) (61)
A interação com o miR-21 formava um duplexo e o sinal fluorescente aumentava devido a
interação entre os fluoróforos e o quencher (deslocamento de “Stokes”). O sinal fluorescente
intensificava-se quando a enzima DSN eliminava a sonda do miRNA preservando-o intacto. O
miR-21 hibridizava com novas sondas, permitindo a amplificação do sinal. Assim, a deteção
com elevada sensibilidade do miR-21 foi demostrada. (61)
Figura 18 - Deteção do miR-21 pela DSN.
dApy : fluoróforo azul
dTFam : fluoróforo verde
dTTAMRA : fluoróforo vermelho Fonte: Le, Nguyen et al., 2018
(Adaptado e sem autorização do autor)
30
5.4.3. Amplificação Isotérmica Mediada por Alça (LAMP)
Li e colaboradores usaram o let-7 como iniciador de uma reação LAMP. Foi criado um
protocolo simples que permitia a deteção de quantidades muito reduzidas de miRNAs (até 1.0
amol), em 90 minutos. (62) (63)
Foi criada uma cadeia-modelo de DNA que continha uma sequência complementar ao miRNA
alvo e sequências complementares aos primers externos e internos. Na extremidade 3´da cadeia,
o let-7 foi extendido pela DNA polimerase e hibridizava com o primer interno. Iniciava-se a
síntese pelo deslocamento da cadeia (SDS) de DNA. Após a criação de uma alça na extremidade
5´ da nova cadeia sintetizada, iniciava-se a SDS na extremidade oposta. A cadeia resultante
continha a sequência do let-7. A amplificação continuava com os mesmos passos de
prolongamento e as cadeias amplificadas, apresentando a sequência do let-7, eram detetadas
por corantes fluorescentes (Figura 19). (64)
A principal desvantagem do LAMP é o uso de reveladores indiretos das sequências
amplificadas que podem criar falsos-positivos. (56)
Figura 19 - Esquema ilustrativo do modo de ação do LAMP. Fonte: Li, Li et al., 2011
(Adaptado e sem autorização do autor)
31
5.4.4. Amplificação de Deslocamento de Cadeia (SDA)
O SDA consiste na amplificação de cadeias com a sequência do miR e sequência complementar
ao miRNA alvo baseando-se em dois ciclos que se repetem.
O estudo de Shi e colaboradores utilizou o let-7a como miRNA complementar ao primer 1
criado. Pelos processos de hibridização, extensão e corte ocorria a polimerização e produção de
uma cadeia simples de DNA(T*), com sequência complementar ao let-7a. O T* hibridizou com
o primer 2 e, pelos processos supracitados formava-se uma cadeia simples de DNA(T), com a
mesma sequência do let-7a (só ocorria a troca entre os nucleótidos U-T). O aumento das cadeias
T e T* criava cadeias duplas hibridizadas, detetadas pelo corante SYBR Green I (Figura 20)
(65)
Figura 20 - Esquema ilustrativo do modo de ação do SDA. Fonte: Shi, Liu et al., 2014
(Adaptado e sem autorização do autor)
Zhang e colaboradores desenvolveram um método que combinava SDA com RCAHR (RCA
hiper-ramificado). A reação de RCAHR era iniciada pelos primers dos ciclos de SDA e o SYBR
32
Green I corava os produtos. Esta combinação detetou quantidades de 1.8 × 10−13 M de let-7a.
(66)
5.5.Deteção dos miRNAs recorrendo a nanoparticulas de ouro
As principais vantagens do método de deteção dos miRNAs recorrendo a nanoparticulas de
ouro são, além da sensibilidade, uma melhor absorção de luz, emissões óticas otimizadas e
propriedades óticas lineares, devido ao pequeno tamanho das partículas. (67)
Este método baseia-se na deteção por emissões fluorescentes. Foram construídas sondas de
DNA, complementares aos miRNAs-alvos, ligados à um fluoróforo e as nanoparticulas de ouro.
Na ausência de hibridização com o miRNA-alvo, o fluoróforo e as nanoparticulas estavam
próximos ocorrendo silenciamento do sinal fluorescente. O sinal acentuava-se na presença do
miRNA-alvo. (68) Huang e colaboradores, quantificaram até 50 pM do miR-21. (69)
6.miRNAs – marcadores biológicos auxiliares no diagnóstico do
cancro oral. Perspetiva da biópsia líquida
A deteção tardia do cancro oral associa-se ao baixo nível de sobrevivência dos doentes. O
exame clínico, seguido pela biópsia tumoral e a análise histopatológica da amostra são usados
no diagnóstico. (70)
As limitações da biópsia convencional são a dificuldade de acesso, as complicações como a dor
e a necessidade de profissionais experientes. (71) (72)
Em 2010, falava-se pela primeira vez no termo “biópsia líquida” no cancro humano. Neste
estudo, as células tumorais circulantes foram propostas como alternativas à biópsia
convencional do cancro da mama. (73)
33
As biópsias líquidas auxiliam a deteção dos estadios iniciais do cancro e podem contribuir a
monitorização da sua progressão, analisando secreções e fluídos (urina, saliva e sangue). (74)
(75)
Figura 21 - A biópsia líquida auxilia na deteção precoce do cancro oral. Fonte: https://directorsblog.nih.gov/2018/01/30/new-liquid-biopsy-shows-early-promise-in-detecting-cancer/
(Adaptado e sem autorização do autor)
Os RNAs estão presentes nos fluídos corporais de todos os indivíduos apresentando padrões de
expressão variáveis consoante o estadio da doença. A biópsia líquida torna-se um método
minimamente invasivo ou totalmente não invasivo, no diagnóstico do cancro oral. (71) (72)
Os miRNAs são excretados nos fluídos corporais primariamente recorrendo às vesículas
transportadoras de moléculas, os exossomas. (76) (77) (78)
A resistência dos miRNAs à Rnase e a elevados níveis de pH no sérum/plasma confere-lhes
estabilidade. (78) Estudos recentes sugeriram que 10% dos miRNAs estão protegidos da ação
das RNases graças a sua encapsulação nos exossomas e os restantes são protegidos pelo
complexo ribonucleoprotéico Ago2-miRNA. Consequentemente, os microRNAs circulantes
apresentam estabilidade significativa o que as torna potenciais biomarcadores para a deteção
do cancro oral. (79)
O “miRNeasy Serum/Plasma Kit” (Qiagen®) preconiza a extração dos miRNAs do
plasma/serum e o “miRNA isolation kit” (mirVana, ThermoFisher Scientific, CA, USA) da
saliva. (80)
34
6.1.MiRNAs circulantes no sérum/plasma como biomarcadores do cancro oral
Diversos estudos demostraram a capacidade de diagnóstico dos miRNAs presentes no plasma
no COCE (Figura 22). Em ratos afetados, foram detetados níveis aumentados do miR-21, miR-
31 e miR-146a em amostras de dois fluidos corporais, entre os quais o plasma, participando no
processo de carcinogénese do CEL. Segundo Hung e colaboradores o miR-146a foi detetado
com especificidade de 92% e com potencial de desenvolver metástases no pescoço. (81) (82)
(83) (84) (85) (86) (81) (87)
Figura 22 - Esquema sobre os microRNAs desregulados no plasma, de pacientes com
COCE/CEL, apresentando elevado potencial na deteção do cancro oral.
É de notar que, a sub-expressão do miR-184 em tecidos afetados pelo COCE foi igualmente
revelada, por outros autores. (88) (89)
Tabela II - Lista de microRNAs adicionais com poder de diagnóstico do CEL.
Amostra Organismo Potencial de
diagnóstico
Referências
miR-184 Plasma Rato Diagnóstico (82)
miR-139-5p Saliva Humano Diagnóstico (90)
miR-24 Plasma Humano e
estudos in vitro
Dignósico (86)
35
miR-21, miR-31
e miR-146a
Plasma,
saliva
Rato Diagnóstico
precoce
(82)
Nos últimos anos, outros miRNAs circulantes associados aos tumores orais, foram apontados
como biomarcadores não invasivos no diagnóstico do cancro oral.
Tachibana e colaboradores investigaram os miRs circulantes no plasma de cinco pacientes com
cancro oral e de pacientes sãos. Recorrendo aos “microarrays”, foram medidos os padrões de
expressão de 1211 miRNAs humanos circulantes. 16 miRNAs estavam sobre-regulados e 4
miRNAs estavam sub-regulados em amostras de plasma dos pacientes com o COCE gengival.
Determinados miRs sobre-expressos, nomeadamente o miR-31, diminuíam após a remoção do
tumor. Estes resultados demostram o potencial de determinados miRNAs na deteção e no
seguimento pós-operatório do COCE. (91) (92)
O miR-223 estava sobre-expresso no plasma de pacientes com cancro (67.7% de sensibilidade
e 61.3 % de especificidade). No entanto, o miR-223 é conhecido por exercer a função supressora
tumoral. Esta discrepância era devida à libertação deste miRNA no plasma pelos tecidos
normais que rodeiam os tecidos com cancro. (91)
Cinpolat e colaboradores testaram a expressão diferencial de 95 miRNAs entre os tumores
malignos das glândulas salivares, os tumores benignos e tecidos glandulares saudáveis servindo
de grupo controlo. O miR-199a aparecia com níveis significativamente elevados (p – 0.042) em
amostras de plasma proveniente de tumores malignos e o miR-30e apresentava-se sobre-
expresso em amostras de plasma de tumores malignos em comparação com os tumores
benignos. Em contrapartida, o miR-23a apresentou-se como potencial supressor tumoral nestas
neoplasias orais, aparecendo sub-regulado no plasma proveniente de tumores malignos, em
comparação com o grupo controlo. Com objetivo de confirmar a aplicabilidade de miRNAs no
diagnóstico de cancro de glândulas salivares, tornam-se necessários estudos adicionais, visto
que os estudos publicados permanecem limitados e, devido ao tamanho limitado das amostras,
apresentam dificuldades em criar uma lista padronizada de perfis dos miRNAs utilizáveis no
diagnóstico de cancro das glândulas salivares. (93)
O estudo de MacLellan e colaboradores comparou os níveis séricos de diversos miRNAs de
pacientes com LOAR (lesões orais de alto risco) com os níveis do grupo controlo. 55 miRs
apresentavam-se desregulados nas LOAR. Cinco miRs (miR-16, let-7b, miR-338-3p, miR-223
36
e miR-29a) mostraram-se como biomarcadores particularmente úteis na deteção de cancro oral.
A combinação destes perfis de miRNA com técnicas de deteção mais atuais, melhoraria de
modo significativo a deteção do cancro oral. (94) (95)
6.2.MiRNAs salivares como biomarcadores de cancro oral
A saliva é usada como fluído de biópsia líquida em diversos campos científicos, incluindo
doenças orais. (96) A saliva é considerada um filtro do sangue, o que explica a presença na
saliva de moléculas circulantes no sangue. A análise deste fluído é uma oportunidade para
detetar biomarcadores associados com o início e o desenvolvimento do cancro oral. (97) (98)
Adicionalmente, as vantagens de uso da saliva como meio de diagnóstico incluem a
simplicidade, o facto de não ser um método invasivo e ser relativamente económico.
Diversos microRNAs apresentaram-se desregulados em diversos estudos de COCE (Figura 23).
(99) (100) (101) (92) (19) (102)
Figura 23 - Esquema ilustrativo dos microRNAs salivares com utilidade no diagnóstico do
COCE.
37
Uma variedade de miRs adicionais salivares foram igualmente pesquisados na tentativa de os
confirmar como biomarcadores de diagnóstico de cancro oral (Figura 24). (103) (104)
Figura 24 - Ilustração de microRNAs salivares desregulados.
Rapado-Gonzáles e colaboradores realizaram uma meta-análise, em 2019, com o objetivo de
avaliar a exatidão do uso de miRNAs presentes na saliva e no sangue como identificadores de
COCE nos estadios iniciais. 22 miRNAs presentes em biópsias líquidas estavam desregulados
e os miRNAs sanguíneos e salivares evidenciaram uma exatidão de 91% no diagnóstico precoce
do COCE. Esta meta análise confirmou a importância clínica, estatisticamente significativa,
destas biomoléculas na deteção inicial do cancro oral. (105)
Um outro estudo, analisou a expressão diferencial de miRNAs na saliva de pacientes com
neoplasias malignas da parótida comparativamente a pacientes com neoplasias benignas desta
glândula. Nove miRNAs estavam mais sobre-expressos em pacientes com cancro da parótida
relativamente aos de pacientes com tumores benignos. De entre estes nove, quatro miRs (miR-
132, miR-15b, miR-140 e miR-223), quando pesquisados em combinação, apresentaram
potencial discriminatório entre amostras salivares de tumores malignos da parótida versus
tumores benignos (sensiblidade de 69% e especificidade de 95% com AUC de 0.90). Apesar
dos resultados apresentarem caráter preliminar, são promissores relativamente à aplicabilidade
dos miRNAs no diagnóstico precoce de cancro das glândulas salivares. (106) (107)
A utilidade do uso de miRNAs salivares como biomarcadores de controlo da transformação
maligna de lesões orais foi demonstrada no estudo de Yang e colaboradores. Leucoplasias orais
com semelhanças histopatológicas mas com diferentes características clínicas, foram
analisadas. Perfis de expressão de determinados miRs foram detetados em leucoplasias de baixo
38
grau com posterior progressão para o elevado grau e até em carcinoma in situ ou COCE. A
maioria de miRNAs desregulados nas leucoplasias de baixo grau progressivas foram os mesmos
identificados nos casos com COCE (sub-regulação do let-7, miR-145, miR-99 e sobre-regulação
do miR-708, miR-10b, miR-26a e miR-30e). O miR-181c e miR-181b estavam sub-expressos
em leucoplasias progressivas e sobre-expressos em leucoplasias não progressivas. Isto sugere
que determinados miRNAs, nomeadamente a família miR-181 (miR-181a/b/c/d), atuam como
oncogenes ou supressores tumorais dependendo do tipo tecidular. Uma das conclusões do
estudo foi a aplicabilidade potencial de miRNAs salivares na deteção não invasiva de lesões
orais pré-malignas e uma melhoria no diagnóstico histológico das mesmas. (85)
A capacidade de diagnóstico dos miRNAs estende-se à deteção das lesões orais pré-malignas e
à predição da transformação maligna destas lesões como no caso do Líquen Plano Oral (LPO)
(Figura 25). (97)
Figura 25 - Esquema ilustrativo dos microRNAs salivares detetados em pacientes com LPO.
A tabela III inclui miRNAs úteis no diagnóstico do cancro oral.
Tabela III - MicroRNAs reportados por apresentarem concentrações desreguladas nos fluídos
corporais, relevantes para o diagnóstico do cancro oral.
miRNA(s) Desregulação Fonte da amostra Referências
miR-181 Sobre-regulação Plasma (6)
miR-196a Sobre-regulação Plasma (6)
miR-191 Sobre-regulação Saliva (7)
miR-203 Sobre-regulação Saliva (7)
miR-182 Sobre-regulação Sangue e Saliva (22)
39
miR-34a Sub-regulação Sangue e Saliva (22)
miR-16 Sobre-regulação Soro (78)
miR-9 Subre-regulação Soro e Saliva (108)
miR-92a Sobre-regulação Soro (78)
miR-25 Sobre-regulação Soro (78)
miR-195 Sobre-regulação Soro (78)
miR-624 Sobre-regulação Soro (78)
miR-331-3p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-603 Sobre-regulação Plasma (109)
miR-1303 Sobre-regulação Plasma (109)
miR-660(-5p) Sobre-regulação Plasma e Saliva (109)
miR-212-3p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-194-5p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-214-3p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-335-5p Sobre-regulação Plasma (78)
miR-18a-5p Sobre-regulação Plasma (78)
miR-205-5p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-192-5p Sub-regulação Plasma (109)
miR-150-5p Sub-regulação Plasma (78)
miR-601 Sub-regulação Plasma (109)
miR-375 Sub-regulação Plasma (110)
miR-187 Sobre-regulação Plasma (111)
miR-200b-3p Sobre-regulação Plasma (78)
miR-134 Sobre-regulação Plasma (78)
miR-372 Sobre-regulação Plasma (78)
miR-19a Sobre-regulação Soro (78)
miR-148a Sobre-regulação/Sub-
regulação
Plasma/Saliva (104)
miR-451 Sobre-regulação Soro e Saliva (112)
miR-3651 Sobre-regulação Soro (113)
miR-483-5p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-486-5p Sobre-regulação/Sub-
regulação
Soro/Plasma (95) (110)
miR-197 Sub-regulação Saliva (85)
7.Discussão
O cancro oral mais frequente é o COCE. A sua frequência mundial significativa (2-4%) e mau
prognóstico, se não for detetado precocemente, tornam importante a sua investigação. (114)
(115)
40
Consequentemente, grande parte dos estudos e investigações dedicam-se a este tipo de cancro
oral. O COCE apresenta grande heterogeneidade intra e inter-tumoral e torna-se mais agressivo
ao longo do tempo. As estratégias de diagnóstico precoce do cancro oral estão
consequentemente em constante evolução. (116) (117)
Nas últimas décadas diversas técnicas de biologia molecular promoveram uma nova
compreensão acerca das vias genéticas e moleculares na base oncológica. E, como tal, surgiram
novos meios auxiliares no diagnóstico precoce do cancro oral. É o caso dos MicroRNAs que
regulam até 30% de todos os genes exercendo as suas ações como oncogenes ou supressores
tumorais. Adicionalmente apresentam estabilidade na sua expressão e são de fácil acesso. Os
miRNAs têm a capacidade de diferenciar os subtipos de cancro por apresentarem padrões de
expressão específicos. (118) (119) (120) (7)
A descoberta dos microRNAs representou, assim, uma nova ferramenta auxiliar no diagnóstico
do cancro oral. No entanto, existem ainda muitos aspetos mal elucidados, tais como, a
quantidade de microRNAs que está realmente envolvida na carcinogénese, o número total de
genes-alvo para cada um desses microRNAs, a variabilidade de expressão dos miRNAs
segundo a localização do tumor, o grau histológico deste e a presença de expressões
contraditórias do mesmo miRNA em grupos populacionais diferentes. (121) (122) É, por isso,
necessário, além de outras medidas, formular protocolos standard de análise destes
biomarcadores de forma a melhorar a reprodutibilidade dos resultados. (78)
Neste contexto, os investigadores têm desenvolvido técnicas mais inovadoras de deteção destas
biomoléculas tendo como objetivo melhorar a especificidade das técnicas mais convencionais,
como a PCR. (123) Os sistemas imagiológicos recentes de deteção dos miRNAs, também não
requerem manipulação complexa das amostras e permitem estudos in vivo. No entanto, estas
novas gerações, apresentam desvantagens porque necessitam de modificações genéticas em
indivíduos estudados, para exercer as suas funções de deteção. Exigem igualmente
equipamentos mais recentes, limitando, assim, o seu uso na prática clínica. (45)
No contexto da inovação, numerosos miRNAs desregulados foram detetados na saliva e no
sangue de pacientes com cancro oral, recorrendo à biópsia líquida. As vantagens deste método
são a estabilidade e resistência à degradação dos miRNAs e a classificação dos padrões de
expressão dos miRNAs que corresponde à classificação clinico-patológica do tumor. (107)
(124)
41
Contudo, desafios persistem. As infeções contribuem à desregulação da expressão dos miRNAs
e os miRNAs circulantes usados na biópsia líquida, podem originar-se de outras células, além
das tumorais. A comunidade científica deve construir protocolos com resultados reprodutíveis,
quando são analisadas amostras idênticas, entre diversos laboratórios. Assim são necessários
métodos “standard” na colheita de amostras, armazenamento e isolamento dos miRNAs, na
sequenciação e na avaliação de dados. Adicionalmente, é necessário determinar o fluído
corporal mais adequado (saliva vs sangue/plasma) para a análise dos miRNAs. (107)
Alguns estudos mencionaram que a saliva, por ser fácil de usar, de aceder, de contactar com as
células da mucosa oral e de apresentar grupos específicos de miRNAs, permanece um dos
fluídos corporais mais adequado para ser usado na biópsia liquida. Porém, as limitações como
a heterogeneidade temporal, tumoral, a variabilidade intra e inter-paciente, o preço das
tecnologias de análise e de deteção e ausência de protocolos standard, persistem. (125) (102)
(126) Novos horizontes devem ser investigados de forma a atribuir informação estável e segura
ao médico, com base nos miRNAs e na sua aplicabilidade no diagnóstico precoce do cancro
oral.
A contínua investigação de tecnologias de sequenciação, deteção e quantificação dos
microRNAs terá como desfecho mais provável um aumento da nossa compreensão e
conhecimento acerca do papel destas biomoléculas no cancro oral. Auxiliará igualmente a
deteção precoce e diferencial das neoplasias orais. Auxiliará igualmente a deteção precoce e
diferencial das neoplasias orais. O grande desafio consistirá, sobretudo, na escolha do método
de deteção e do material de biópsia mais adequados para determinados microRNAs e cancros
orais. Dito isto, será razoável afirmar que os miRNAs, hoje em dia, permanecem como potencial
ferramenta auxiliar no diagnóstico precoce do cancro oral. Contudo, os exames clínico e
histopatológico continuam a ser os métodos de escolha para o diagnóstico de neoplasias
malignas orais.
8.Conclusão
Nesta revisão bibliográfica, foram sumarizados os diferentes aspetos da contribuição dos
miRNAs para o diagnóstico do cancro oral.
42
Diversos estudos demostraram o papel dos miRNAs nas vias celulares do cancro oral. No
entanto, estudos futuros são necessários para descobrir vias novas. A desregulação dos
miRNAs é um fator de risco significativo de desenvolvimento de cancro oral. De forma a se
alcançar um maior controlo do aparecimento e da progressão das neoplasias orais, vário estudos
analisaram a capacidade dos miRNAs contribuírem no diagnóstico destas. Diversos padrões de
expressão destas biomoléculas em tecidos com cancro oral e tecidos sãos são constantemente
investigados.
Esta revisão analisou igualmente tecnologias imagiológicas de deteção dos miRNAs que foram
reportadas nos últimos oito a dez anos. Visto que os miRNAs são candidatos importantes no
controlo do cancro oral, um dos focos da investigação foi o desenvolvimento de métodos de
deteção destes miRNAs. Diversos métodos e técnicas foram abordados, sendo que cada um
destes apresenta as suas vantagens e limitações. No entanto, destacam-se as técnicas de
amplificação de ácidos nucleicos, porque revelam quantidades relativamente pequenas de miRNAs
nos tecidos e nos fluídos humanos permitindo uma deteção eficaz destas biomoléculas.
Relativamente ao material humano para biópsia do cancro oral, a saliva é cada vez mais usada
como biópsia líquida, uma vez que é uma fonte de biomarcadores (apesar de também apresentar
limitações). A dificuldade na quantificação, na escolha do melhor método de deteção dos
miRNAs na saliva, etc.) confere aos microRNAs potencialidade como método complementar
de diagnóstico do cancro oral mas em simultâneo exige que sejam efetuadas mais investigações
de forma a poderem substituir os métodos de diagnóstico convencionais.
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Anexo 1 – Declaração de Autoria da Monografia
54
Anexo 2 – Parecer do Orientador para entrega definitiva do
trabalho apresentado
55
Anexo 3 – Parecer do Coorientador para entrega definitiva do
trabalho apresentado
