Pedro Rondon HISTOLOGIA E HISTOPATOLOGIA DA SOLHA … · palavras -chave Alterações...

Universidade de Aveiro 2011

Departamento de Ambiente e Ordenamento

Pedro Rondon Werneck

HISTOLOGIA E HISTOPATOLOGIA DA SOLHA EM MEIO MARINHO E AQUACULTURA

Universidade de Aveiro 2011

Departamento de Ambiente e Ordenamento

Pedro Rondon Werneck

HISTOPATOLOGIA DA SOLHA EM MEIO MARINHO E AQUACULTURA

Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro pa ra cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestrr e em Ciências do Mar e das Zonas Costeiras, realizada sob a orientaç ão científica do Prof. Doutor Fernando Morgado, Professor Associado com Ag regação do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro e do Prof. Doutor Augusto Faustino Professor, Professor Associado do Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do P orto.

Dedico este trabalho à meus pais Maria Paulina Costa Rondon Werneck e Eduardo de Carvalho Werneck aos meus irmãos Max Rondon Werneck e Rodrigo Rondon Werneck, minhas cunhadas e irmãs Paula Baldassim Jorge e Fabiana e a minha querida sobrinha Isabel Baldassim Werneck, a minha avó Rosa Carolina Costa Rondon todos os amigos pelo incansável apoio e carinho.

Professora Doutora Filomena Maria Cardoso Pedrosa Ferreira Martins Professora Associada. Departamento de Ambiente e Ordenamento. Universidade de Aveiro.

Professora Doutora Maria da Graça Cunha Antunes Lopes Professora Auxiliar. Departamento de Clinicas Veterinárias. Insituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar. Universidade do Porto.

Professor Doutor Fernando Manuel Raposo Morgado Professor Associado com Agregação. Departamento de Biologia. Universidade de Aveiro.

Professor Doutor Augusto Manuel Rodrigues Faustino Professor Associado. Departamento de Patologia e Imunologia Molecular. Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar. Universidade do Porto.

Agradeço a todos aos professores e amigos Fernando Raposo Morgado e Augusto Faustino por todas as orientações e toda a ajuda que me foi dada durante todo este trabalho e toda a minha estada em Portugal. Agradeço a todos os amigos do Hilário Oliveira, Zoran Vujicic, Ricardo Garcia, Bruno Pimentel, André Pinto, Eduardo Granja, Marilia Moita, João Alves, Hélio Cravo, Luís Figueiredo, Helena Martins, Jorge Vieira, Rui Filipe, Sara Figueiredo, Solenn Huitric, José Santos, Vedrana Sciran e muitos outros que me ajudaram a me divertir nos jogos de volei e em varios outros momentos. Agradeço aos amigos da pastelaria fanepão pelo apoio e pelas oportunidades que me deram, Diana Sá, Freddy Rocha, Sandra e todos os outros que me ajudaram em todas as horas. A gradeço a todos os amigos e amigas que fiz nesta muito importante experiencia por terras europeias, Felipe Mossoleto, Felipe Baggio, Bárbara Abreu, Ana Carolina Fernandes, Michelle Alves, Paty Salvarani, Lucía Llamazares Días, . Agradeço também aos amigos Vinicios Fonz, Guilherme Carramaschi, Felipe Oliveira Ribas. Agradeço a Celia Lopes por toda a ajuda e amizade no laboratório do Porto e Aline Alvarenga da Rocha por toda a amizade e conversas no laboratório do Porto. Agradeço as minhas amigas Bruna Marque, Ana Rita Figueiredo e Luiz. Mas agradeço principalmente aos grandes amigos que fiz em Portugal, Nuno Miguel Mesia Lopes, Karlos Ribeiro de Moraes, Felipe Mossoleto, Silvio Sasaki, Marcela Vaz e Lucas Guardalben, Mya Fox ( Maria José Paiva) por toda a ajuda nos momento mais alegres e felizes e também nos momentos mais complicados de minha passagem por Portugal.

palavras -chave

Alterações histológicas, stress, brânquias, biomarcadores, Solea solea e Solea senegalensis.

resumo

As alterações histologicas nas brânquias foram utilizadas para comparar a saúde de peixes da espécie Solea solea e Solea senegalensis amostrados em ambiente natural e também de aquacultura. As brânquias são um bom biomarcador, pelo contato direto com a água e, portanto, também em contato com todos os tipos de contaminantes, parasitas e bacterias, o que pode refletir a quallidade do meio ambiente. Foram amostrados 40 espécimes de cada espécie, e colectadas 10 brânquias em cada um dos locais de amostragem. As amostragens decorreram entre Janeiro e Março de 2011 em duas lotas diferentes (Leixões e Aveiro) e em duas aquaculturas (Póvoa de Varzim e Torreira) em Portugal. As amostras de brânquias foram fixadas em ALFAC e processadas segundo os procedimentos de rotina histológica e coradas com Hematoxilina e Eosina, Alcian Blue e Ácido Periódico de Schiff. Os vários tipos de lesões foram frequentes nos animais provenientes de ambas as origens, no entanto as lesões foram mais evidentes nas brânquias dos peixes selvagens em comparação com as aquiculturas. As lesões encontradas foram fusões basais, fusões mediais, fusões totais, fusões apicais, edema apical, edema lamelar e a desorganização das células de muco. Estas alterações decorrem sobretudo da poluição da água do mar e do estresse ambiental. Mais estudos devem ser feitos para uma melhor e mais completa avaliação dos tipos e origem das lesões. A histopatologia mostrou ser um biomarcador muito apropriado para determinar este tipo de problemas ambientais associados com o estresse ecológico e os decorrentes da actividade pesqueira como sejam as técnicas de captura e ou armazenamento e as condições da produção em aquacultura que podem diminuir a qualidade e o valor dos pescados.

keywords

Histological changes, stress, gills, biomarker, Solea solea and Solea senegalensis.

abstract

The histological changes in the gills were used to compare the health of fish species Solea solea and Solea senegalensis sampled in the natural environment and also farmed. The gills are a good biomarker, by its direct contact with the water and therefore also in contact with all kinds of contaminants, parasites and bacteria, which may reflect the quality of the environment. It was sampled 40 specimens of each species, and collected 10 gills on each of the sampling sites. Sampling took place between January and March 2011 in two different marine locations (Leixões and Aveiro) and two fish farms (Póvoa de Varzim and Torreira) in Portugal. The gill samples were fixed in ALFAC and processed according to usual histological procedures and stained with Hematoxylin and Eosin, Alcian Blue and Periodic Acid-Schiff. The various types of injuries were frequent in animals from both sources but more abundant in populations from aquaculture; however, the lesions were more severe in the gills of wild fish compared to aquaculture. The lesions found were basal fusion, fusion medial, total fusion, fusion apical, apical edema, lamellar edema and disorganization of the lamellar cells of mucus. These changes are usually associated to sea water pollution and environmental stress. More studies should be made for a better and more complete assessment of the types and origin of the lesions. Histopathology showed to be a very suitable biomarker to determine this kind of environmental problems associated with environmental stress and fishery activities such as the techniques or capture and storage and the conditions of production in aquaculture that can decrease the quality and value of fished.

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INDICE Lista de Tabelas i Lista de Figuras iii Introdução 1 Objetivo Geral 6 Objetivos Especifico 6 Material e Métodos 8 Áreas de Coleta 8 Espécies Estudadas 9 Solea solea 10 Solea senegalensis 12 Amostragem dos peixes 14 Recolha das brânquias 14 Fixação das Brânquias 14 Procedimentos de Histológicos e de Histoquímicos 15 Tratamento das Fotos 15 Analises Estatísticas 15 Resultados 17 Tipo de lesão 17 Análise dos valores totais de lesões 17 Análise dos valores de cada tipo de lesão 18 Fusão Basal 19 Fusão Medial 22

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Fusão Total 25 Fusão Apical 28 Edema Apical 31 Edema Lamelar 34 Células de Muco 37 Discussão 41 Conclusão 45 Anexo 1 57 Anexo 2 61

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Lista de Tabelas Tabela 1: resultados do teste de significância (ANOVA) para os totais de cada tipo de lesão ocorridas nas brânquias dos peixes adquiridos nas lotas

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Tabela 2: resultados do teste de significância (ANOVA) para os totais de cada tipo de lesão ocorridas nas brânquias dos peixes adquiridos .nas pisciculturas

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Lista de Figuras

Figura 1: mapa indicando os locais de coleta das lotas e das aquiculturas 8 Figura 2: imagem da Solea solea foto de Karlos Ribeiro de Moraes 10 Figura 3: área em amarelo mostra as áreas de distribuição da espécie Solea solea 11 Figura 4: imagem da Solea senegalensi foto de Karlos Ribeiro de Moraes 12 Figura 5: mapa indica a distribuição da espécie Solea senegalensi 13 Foto 6: mostra a brânquia da Solea, foto de Karlos Ribeiro de Moraes 14 Figura 7: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão fusão basal para peixes selvagens e peixes de aquacultura

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Figura 8: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; B as setas indicam os locais de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

20 Figura 9: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; D as setas indicam os locais de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

20 Figura 10: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; F a seta indica o local de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina

20 Figura 11: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZD as setas indicam os locais de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

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Figura 12: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZF as setas indicam os locais de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina

21 Figura 13: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZH as setas indicam os locais de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina

21 Figura 14: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão fusão medial para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

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Figura 15: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; G as setas indicam os locais de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

23 Figura 16: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; H as setas indicam os locais de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

23 Figura 17: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; L a seta indica o local de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

23 Figura 18: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZI as setas indicam os locais de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

24 Figura 19: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZJ as setas indicam os locais de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

24 Figura 20: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZK as setas indicam os locais de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

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Figura 21: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão fusão total para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

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Figura 22: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; J as setas indicam os locais de presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

26 Figura 23: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; K as setas indicam os locais de presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

26 Figura 24: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; L a seta indica o local de presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

26 Figura 25: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZL as setas indicam os locais de presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

27 Figura 26: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZM as setas indicam os locais de presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

27 Figura 27: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZK a foto indica a presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

27 Figura 28: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão apical fusão para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

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Figura 29: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; M as setas indicam os locais de presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

29 Figura 30: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; N as setas indicam os locais de presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

29 Figura 31: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; O a seta indica o local de presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

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Figura 32: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZO as setas indicam os locais de presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

30 Figura 33: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZP as setas indicam os locais de presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

30 Figura 34: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZQ a foto indica a presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

30 Figura 35: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão Edema Apical para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

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Figura 36: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; P as setas indicam os locais de presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

32 Figura 37: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; Q as setas indicam os locais de presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

32 Figura 38: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; R, a seta indica o local de presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

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Figura 39: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZR as setas indicam os locais de presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

33 Figura 40: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZS as setas indicam os locais de presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

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Figura 41: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZT a foto indica a presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina. Figura 42: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão Edema lamelar para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

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34 Figura 43: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; P as setas indicam os locais de presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

35 Figura 44: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; Q as setas indicam os locais de presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

35 Figura 45: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; U, a seta indica o local de presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

35 Figura 46: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZU as setas indicam os locais de presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

36 Figura 47: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZV as setas indicam os locais de presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

36 Figura 48: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZX a foto indica a presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

36 Figura 49: gráfico mostra o resultado das analises descritivas das células de muco para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

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Figura 50: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea solea, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra V: mostra as células de muco das brânquias controle; X: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 4x – Azul de Alcian mais P.A.S.

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Figura 51: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea solea, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra Y: mostra as células de muco das brânquias controle; Z: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 10x – Azul de Alcian mais P.A.S..

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Figura 52: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea solea, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra ZA: mostra as células de muco das brânquias controle; ZB: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 100x – Azul de Alcian mais P.A.S..

38 Figura 53: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea senegalensis, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra ZY: mostra as células de muco das brânquias controle; ZW: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 4x – Azul de Alcian mais P.A.S.

39 Figura 54: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea senegalensis, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra ZZ: mostra as células de muco das brânquias controle; ZZA: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 10x – Azul de Alcian mais P.A.S..

39 Figura 55: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea senegalensis, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra ZZB: mostra as células de muco das brânquias controle; ZZC: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 100x – Azul de Alcian mais P.A.S..

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INTRODUÇÃO Os peixes são uma importante fonte de alimento, possuem um elevado valor economico e

significado social e contribuem como segurança alimentar em muitas regiões do mundo.

Existem paises muito populosos que passaram a utilizar o peixe como uma das principais

fontes de proteina animal representando em alguns casos cerca de 40%. Nas últimas

décadas as capturas têm aumentado substancialmente devido a uma maior demanda

decorrente do crecente aumento da população humana, ocasionando um aumento na

produção de alimento, crescimento tecnológico e simplificação de todos os processos

envolvidos na produção de peixes (capturas, processamento e distribuição). Em 2008 a

população humana consumiu aproximadamente 80% da produção de peixe do mundo

sendo um consumo por pessoa de 17.1 quilos e as projeções de consumo para 2030

apontam para um consumo de 20 quilos por pessoa por ano (FAO, 2011).

A biota aquática encontra-se actualmente constantemente exposta a um grande número de

substâncias tóxicas liberadas no ambiente por várias fontes antropogenicas, tais como

descarga de resíduos tóxicos dos efluentes industriais, dos processos de drenagem agrícola,

o derramamento acidental, ou não, de efluentes de produtos químicos e a liberação de

esgosto doméstico em rios e no mar, aspectos que contribuem para a contaminação dos

ecossistemas, despejando uma grande gama de agentes tóxicos como metais pesados,

pesticidas, compostos ôganicos, entre outros (VIRGENS, 2007). Em estudos de toxicidade,

biomarcadores em nível sub-orgânico (bioquímico, fisiológico e histológico) têm sido

utilizados e considerados mais viáveis para avaliar as respostas aos stressores. Estes

biomarcadores podem permitir uma avaliação mais rápida da saúde dos organismos e

podem ser indicadores da exposição ou dos efeitos dos poluentes (Mayer et al., 1992).

Atualmente biomarcadores histopatológicos vêm sendo utilizados para documentar e

quantificar tanto a exposição quanto o efeito dos poluentes (Winkaler et al., 2001;

Pacheco & Santos, 2002; Veiga et al., 2002; Meletti et al., 2003). As alterações

histopatológicas em tecidos de peixes são biomarcadores do efeito da exposição aos

estressores do meio ambiente. Esta categoria de biomarcadores permite um exame

específico dos órgãos e das células alvo, e como eles são afetados sob condições in vivo.

Além disso, em avaliação de campo, a histopatologia é um método eficaz para detectar os

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diversos efeitos da exposição aguda ou crônica nos vários tecidos e órgãos (Hinton et al.,

1992).

A maioria dos vertebrados aquáticos possui brânquias, que são evaginações da superficie

corporal, onde ocorrem as trocas de gases respiratórios. As brânquias dos peixes estão

incluidas nas bolsas faringeanas. O fluxo de água é geralmente unidirecional, entrando pela

boca e saindo pela proteções das brânquias (opérculo). As lamelas orais próximas da boca

e as lamelas mais próximas dos opéculos agem como válvulas para impedir o refluxo de

água. As superficies respiratórias das brânquias são projeções delicadas localizadas nos

arcos branquiais. Duas colunas de filamentos branquiais estendem-se em cada arco

brânquial. Com a saida da água da cavidade oral passa sobre os filamentos. A troca de

gases ocorre através das numerosas projeções microscópicas dos filamentos, chamados de

lamela secundária (POUGH, 1996). A avaliação das alterações na morfologia de órgãos

alvo tais como as brânquias é recomendada como uma ferramenta útil para determinar os

efeitos da poluição marinha nos peixes. Sob circunstâncias naturais, as brânquias dos

peixes são o primeiro alvo dos poluentes das águas contaminadas, por que são orgãos que

possuem grandes superficies e estãos expostos ao ataque das substâncias tóxicas

dissolvidas na água. As brânquias são também um órgão sensivel aos efeitos agudos da

exposição aos compostos tóxicos, porque reagem muito rapidamente às condições

desfavoraveis do ambiente considerando-se por isso geralmente que a intensidade das

alterações no tecido branquial vária de acordo com o nivel de poluentes encontrados no

ambiente (SENSINI, 2008).

Nos últimos anos foram muitos os estudos com peixes para análise do estress ambiental e

da saúde dos ecossistemas e acerca dos efeitos nos organismos e que envolveram vários

domínios de organização biológica e ferramentas ecotoxicológicas. MOTAIS, R. et. al.

(1969) estudou as mudanças e as adaptações da permeabilidade da água no epitelio das

brânquias dos teleosteos em relação a salinidade externa utilizando algumas espécies de

água doce Carassius auratus e Serranus cabrilla ou espécies de teleosteos eurialinos

marinhas Anguilla anguilla e Platichthys flesus. Este estudo analisou os canaliculos

aferentes e eferentes das brânquias observando o afastamento dos canalículos devido à

água tritiada. O estudo mostra ainda que a maioria do fluxo da águas difusional ocorre

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através das brânquias, medindo o fluxo difusional e os fluxos osmóticos da água em

espécies de água doce (Carassius), e marinhas estonealinas (Serranus) e eurialinas

(Platichtkys e Anguilla) adaptadas à água doce ou água do mar. O fluxo de água difusional

deduzido do volume THO é significativamente menor nos peixes de água salgada e o fluxo

de água osmótica apesar de um maior gradiente osmótico atavés das brânquias,

determinada indiretamente através da taxa de Hidestintagem de urina, ocorre em menor

quantidade nos peixes de água do mar. Os autores tentaram comparar as permeabilidades e

difusão osmótica das brânquias mas as respostas foram dificultadas pela falta de

conhecimento da extensão do soluto (sal) – e a interação entre o solvente e o epitélio.

Sugerem que as brânquias de peixes de água doce adaptadas são semipermeáveis, enquanto

que nos teleóteos de água do mar não podem ser, por causa das trocas iônicas muito grande

em toda a brânquia. A permeabilidade surpreendentemente baixa e a difusão osmótica do

epitélio brânquial dos peixes de água do mar pode ser possivelmente relacionadas com a

ausência de poros cheios de água. PAYNE, J.F. e PENROSE W.R. (1975) realizaram um

estudo com peixes marinhos Trutta salmo para verificar o efeito da indução do hidroxilase

arila hidrocarboneto (pireno [a] benzo) pelo petróleo. WRIGHT, P.A. e WOOD, C.M.

(1985) analisaram a excreção branquial da amônia na truta arco iris de água doce e os

efeitos da mudança de pH da água de captação ambiental. Os resultados levaram a concluir

que descontado a importância quantitativa de H4+ a difusão favoreceu uma combinação

flexível da difusão de NH3 e NA+ NH4+ na troca com os mecanismos principais.

DALLINGER, R. et al., (1987) fizeram um estudo realizado com o Salmo gairdneri sobre

a captação de metais pesados em alimentos contaminados. O estudo concluiu que em

ecossistemas aquáticos poluidos a transferência dos metais pesados através da cadeia

alimentar pode ser muito grande, podendo atingir concentrações prejudiciais aos tecidos

dos peixes. LIVINGSTONE, D. R. (1993) realizou um estudo biotecnológico de

monitoramento da poluição utilizadando biomarcadores moleculares em alguns organismos

aquáticos de águas salgadas. Este estudo concluiu que os biomarcadores podem ser

utilizados como parte de programa integrado no monitoramento da poluição, mas também

deve ser envolvido com outras formas de avaliação de danos biológicos e de saúde dos

organismos e também análise de contaminantes químicos na biota e do meio ambiente.

LICHTENFELS, A.J.F.C. et. al.. (1996) verificou os efeitos da poluição da água nas

brânquias dos peixes Tilapica do Nilo. Este estudo concluiu que os peixes de locais

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poluídos mostram um processo inflamatório crônico na região distal dos filamentos

branquiais, com hiperplasia epitelial e hipersecreção. A histoquímica analisou o volume de

mucina com Azul de Alcian a mostrar mucina positiva e o Ácido Peiródico de Schiff

positivo. A rigidez do muco nos peixes do local poluído foi aumentada, mas sem alterações

de viscosidade. HOGSTRAND, C. e WOOD, C. M. (1998) tentaram compreender a

fisiologia da biodisponibilidade e toxicidade da prata em peixes de água doce. Concluíram

que a contaminação aguda com prata resulta da deficiência do organismo em manter as

concentrações constantes de Nacl e de Cl2 no plasma do sangue. Em peixes de água doce a

prata exerce seus efeitos tóxicos no transporte de NaCl e de Cl2 através das brânquias, visto

que o intestino foi indicado com o local de maior toxicidade em peixes de águas salgadas.

NAES, K. et. al., (1999) verificaram a acumulação e os efeitos da união do aluminio

gerado pelos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos em invertebrados e peixes. CHOU,

HSIN-YIU et. al. (1999) estudaram os efeitos dos estressores de metais pesados e do

choque da salinidade na sustentabilidade de um conjunto de espécies Epinephelus spp.,

tendo observado a ocorrência de necrose pancreática devido a virus infecciosos. Os

resultados do estudo sugerem que o vírus da IPN com baixa patogenicidade pode causar

mortalidade elevada em garoupas, quando combinado com os estresse ambientais.

ARELLANO, (1999) no estudo histológico de acumulação de cobre no figado e nas

brânquias de Solea senegalensis verificou elevação e inchaço do epitelio lamelar.

STOFELLA, D. R. E. (2000) realizou um estudo com brânquias de peixes de água salgada

Oligoplites palometa (Carangidae), tendo estudado a morfologia e a atividade funcional

através de microscopia eletrônica e de varredura. Concluiu que os filamentos branquiais

das brânquias de peixes de água salgada Oligoplites palometa variam em tamanho de

acordo com sua localização no arco branquial e que as lamelas respiratórias são bem

desenvolvidas. BOECK, G. DE; VLAEMINCK, A. et. al. (2001) estudaram as mudanças

morfológicas e metabólicas na carpa comum, Cyprinus carpio, durante a exposição de

cobre e as interações entre o Cu2 e a elevação do cortisol do plasma, em geral. Os

resultados obtidos neste estudo argumentam contra um papel importante para o cortisol

como um intermediário para os efeitos tóxicos do cobre. SARASQUETE, C. (2001)

realizou um estudo com Solea solea e Solea senegalensis que teve com objetivo verificar

as células mucosas (digestiva, epidermal e branquial). O estudo utilizou o Ácido Periódico

de Schiff – P.A.S., diástase – P.A.S. e o Azul de Alcian tendo sido observadas pequenas

5

variações entre órgãos, tecidos e espécies. ARJONA, F. J. (2005) num estudo preliminar

sobre a adaptação de Solea senegalensis a um ambiente com variação salina verificou que

a atividade da NA+K+ATPase branquiais apresentava uma relação linear direta das

enzimas com a salinidade do ambiente e que a atividade da Na+ K+ rim ARPase não

mostrou nenhuma variação. Por outro lado, a análise plasmática nos níveis de iões

osmóticos mostrou diferenças significativas entre os diferentes grupos de cortisol e os

níveis de glicose e lactose plasmático aumentaram nas unidades adaptadas a maior

salinidade. MARTINHO, F. M. D. (2005) num estudo realizado no estuário do rio

Mondego sobre a ecologia e distribuição das larvas de Dicentrachus labrax, Platichthys

flesus e Solea solea mostrou que as larvas de Dicentrachus labrax apresentavam quatro

grupos etários diferentes, enquanto que as solhas (Platichthys flesus) e Linguado (Solea

solea) apresentaram três grupos etários. No entanto a taxa de crescimento das larvas do

grupo 0 foi descrita dentro das faixas para outros sistemas estuarinos Europeus.

CAMARGO, M. M. P. e MARTINEZ, C. B. R., (2007) num estudo realizado com

histologia de brânquias, rim e fígado de peixes neotropicais que foram engaiolados em um

córrego urbano descreveu como lesões mais comuns a elevação epitelial, hiperplasia e

hipertrofia do epitélio respiratório, fusão lamelar e aneurisma nas brânquias, alargamento

do glomérulo, redução do espaço de Bowman, oclusão do lúmen tubular, inchaço e

degeneração da hialina. TEIXEIRA, T. F. de A. (2007) verificou a diversidade genética e a

estrutura populacional de Solea senegalensis e Solea solea e suas relações com os padrões

de história de vida. Verificou que como resultado da análise demográfica bem como da

árvore haplóide em forma de estrela se aponta para uma expansão em termos de população

e do tamanho da população de ambas as espécies. COSTA, P. M. et. al. (2009) num

estudo com biomarcadores histológicos utilizando fígado e brânquias de juvenis de Solea

senegalensis expostos aos sedimentos estuarinos contaminados observou que em presença

de índices de contaminação elevados se verifica a ocorrência de corpos eosinofilos grandes

no fígado e degradação de células mucosas nas brânquias relacionadas com os

contaminantes orgânicos encontrados no sedimento. MORAES, A. C. T. (2009) analisou as

concentrações de metais pesados em músculo, brânquias, fígado e gônadas de peixes

teleósteos do rio Piracicaba, Minas Gerais, Brasil. Analisou também as alterações

histopatológicas em brânquias e fígado de Astyanax bimaculatus e Geophagus brasiliensis.

Os resultados mostram que as concentrações de Pb e Zn detectados no músculo dos peixes

6

coletados excederam os limites de segurança estabelecidos pelo Ministério da Saúde do

Brasil. ABALAKA, S. E., FATIHU, M. Y. et. al. (2010) estudaram as alterações

histopatológicas nas brânquias e pele de adultos de Clarias gariepinus expostos ao extrato

etanólico de vagens de Parkia biglobosa tendo verificado que as brânquias de peixes

expostos mostraram hiperemia e edema grave, com fusão das lamelas secundárias. A pele

dos peixes expostos mostrou hiperplasia na produção de células mucosas, epiderme e da

derme polimorfonucleares infiltrações leucocitária com áreas de necrose cutânea e

agregação de pigmentos de melanina. Uma vez que os peixes do grupo controle não

mostraram alterações histopatológicas concluíram que o extrato de P. biglobosa pods é

tóxico a adutos de Clarias gariepinus.

7

OBJETIVOS GERAIS Este estudo teve como objetivo comparar as histopatologias encontradas nas brânquias de

Solea solea e Solea senegalensis pertencentes a populações de selvagens e de cativeiro.

OBJETIVOS ESPECIFICOS Como objetivos específicos este estudo procurou verificar: (i) o tipo de histopatologias que

ocorreram nas brânquias de Solea solea e Solea senegalensis; (ii) comparar os tipos e a

frequência de lesões entre as populações selvagens e de aquacultura; (iii) comparar os tipos

e a frequência de lesões entre as populações de aquacultura em regime de sistema aberto e

sistema fechado.

MATERIAIS E MÉTODOS

Áreas de amostragem

Os peixes pertencentes a populações selvagens foram coletados nas lotas de Perafita,

localizada em Matosinhos, distrito do Porto e na lota de Aveiro. Os peixes pertencentes a

populações de aquacultura foram coletados nos complexos da Póvoa de Varzim (Rio Alto)

e da Vila de Torreira (Aveiro). Os métodos de dois sistemas de produção de aquicultura

apresentam diferenças técnicas significativas. A unidade industrial de aquicultura da Póvoa

de Varzim (Rio Alto) funciona com um sistema de fluxo onde a água do mar é bombeada

directamente para tanques após filtragem, sendo este um sistema de circulação contínua. A

água dos tanques é escoada para o mar limpa de matéria orgânica e de diversas impurezas

resultantes da alimentação artificial de escoamento final do sistema. A unidade de

8

produção da Vila de Torreira (Aveiro) utiliza um sistema de recirculação da água

totalmente fechado a qualquer exposição ao exterior aquando modo de produção. Os

peixes desenvolvem-se em grandes tanques e quando atingem o estado adulto são

transferidos para outros tanques mais largos e fundos. Em ambos casos são mantidas todas

as actividades e características biológicas (FLIMLIN, G. et. al., 2008). As excelentes

condições biofisicas da agua sao garantidas por um sistema especial de filtragem onde o

filtro principal, colocado na saida dos tanques, extrai todas as partículas de impurezas.

(FLIMLIN, G. et. al., 2008). Posteriormente a agua é direcionada para um filtro biológico

onde as impurezas resultantes da excreção são eliminadas por uma bactéria. (FLIMLIN, G.

et. al., 2008). Amonia tóxica e nitratos (NO2) sao convertidos em nitratos (NO3), este é um

processo não tóxico para os animais e a agua reentra nos tanques. A quantidade diária de

agua desperdiçada é baixa (< 5%) , como tal a adição suplementar de agua é proporcional.

Um sistema de indução de ar, bem como o sistema de filtragem, mantém níveis

adequados/otimos de oxigenação nos tanques de peixes. (FLIMLIN, G. et. al., 2008)

Figura 1: mapa indicando os locais de coleta das lotas e das aquiculturas.

9

Espécies estudadas

A família Soleidae, comunmente conhecidos como solha ou linguado, é caracterizada por

peixes-chatos, corpo oval chato e bem comprimido. Com o focinho arrendondado, boca

pequena, mais ou menos arqueada, olhos pequenos no lado direito (exceto em raros

individuos invertida); possui dentes pequenos, quase invisíveis às vezes ausentes. Pré-

opéculo coberto com pele e escamas, o seu lado posterior não é livre. Sem espinhos nas

nadadeiras; nadadeira caudal distinta, por vezes sem nadadeira dorsal ou anal e quando

existentes estas estão mais ou menos unidas. Possui linha lateral no lado que tem visao em

frente ao meio do corpo arqueado, ondulado ou indistintos da sua cabeça, tem estrias

intercranianas nas parte anterior, as estrias curvadas e mais curta do que a largura da zona

intracraniana ou somente um pouco sinuosa e mais do que a largura da zona intercraniana

(WHITEHEAD, P. J. P., et al., 1984). São bentônicos, habitam os fundos lamacentos de

mares temperados e tropicais. Alimentam-se principalmente de invertebrados (crustáceos,

vermes marinhos, etc) (WHITEHEAD, P. J. P., et al., 1984).

O gênero Solea possui narina anterior na lateral normal (grupo de Solea) ampliando (grupo

de Pegusa). Nadadeira dorsal com inicio na parte superior ou no perfil anterior da cabeça;

barbatanas peitorais em ambos lados, com pelo menos 7 raios. Raio lateral supratempora

que tem forma arredondada; escama retangular, estria intercranial um pouco sinuosa, mais

longa do que a largura da zona intercranial (WHITEHEAD, P. J. P., et al., 1984).

Solea solea

Reino: Animalia

Filo: Cordata

Classe: Actinopterygii

Ordem: Pleuronectiformes

Familia: Soleidae

Genero: Solea

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Espécie: Solea solea (Linnaeus 1758)

A primeira espécie a Solea solea tem o corpo oval. Olho superior menor do que o seu

próprio diâmetro, perfil dorsal da cabeça. A narina anterior no lado sem olhos não é

desenvolvida, sua distância da parte anterior da margem da cabeça 1,5 a 1,9 vezes a sua

distância da boca; narina anterior do lado do olho com um tubo para trás apontando ou

somente mal alcançando a borda dianteira do olho mais baixo. Barbatana dorsal começa no

perfil superior da cabeça, possuindo 69 – 97 raios nas nadadeiras; nadadeira peitoral do

lado do olho possuindo 9 – 10 raios nas nadadeiras, no lado sem olho são um pouco mais

curto; raios das nadadeiras da zona anal tem 53 – 79; a parte final da nadadeira caudal é

mais escura. Linha lateral com 116 – 165 escamas, a final supra-temporal tem uma forma

curva arredondada. Vértebras 46 – 52. Cor cinzento-acastanhado na zona periférica dos

olhos, com pontos escuros grandes e difusos; nadadeira peitoral no lado com olhos possui

manchas enegrecidas na extremidade posterior da nadadeira; a parte final da nadadeira

caudal é geralmente mais escura (WHITEHEAD, P. J. P., et al., 1984).

Figura 2: imagem da Solea solea foto de Karlos Ribeiro de Moraes.

Seu habitat é demersal, em fundos arenosos e lamacentos, habitam ate os 200m,

alimentam-se de vermes poliquetas, moluscos, pequenos crustaceos. Sua reprodução ocorre

entre os meses de janeiro – abril, com 2 picos em fevereiro (Mediterraneo), Dezembro –

11

Maio (Baia de Biscaia) ou Abril – Junho (mar do norte), distribuida no atlântico oriental

(sul do fjord de Trondheim, também no norte do mar e Báltico ocidental) e mediterraneo

(também mar do marmara, estreito de Bosforo e sudeste do mar negro) sul do Senegal

(WHITEHEAD, P. J. P., et al., 1984).

Figura 3: área em amarelo mostra as áreas de distribuição da espécie Solea solea.

Solea senegalensis

Reino: Animalia

Filo: Cordata

Classe: Actinopterygii

Ordem: Pleuronectiformes

Familia: Soleidae

Genero: Solea

Espécie: Solea senegalensis Kaup, 1858.

A outra espécie é Solea senegalensis tem o corpo oval. Olho superior menor do que o

próprio diâmetro do perfil dorsal da cabeça. Narina anterior no lado ventral não

desenvolvido, sua distância da margem da cabeça 2,0 – 2,5 vezes em sua distância da boca;

narina anterior no lado dos olhos com um tubo para trás não alcança a borda do olho mais

12

baixo. Nadadeira dorsal começa no perfil superior da cabeça, antes do lado anterior do olho

superior, com 72 – 95 raios das nadadeiras; nadadeira peitoral no lado dorsal com 8 – 12

raios de nadadeiras, no lado ventral com 8 – 10 raios nas nadadeiras; nadadeira anal com

61 – 75 raios; nadadeira caudal separada do último raio da nadadeira dorsal e anal. Linha

lateral com 120 – 138 escamas, o ramo final da supra temporal forma uma curva.

Vertebras: 43 – 46, cor: cinza marrom lateral dorsal, com os pontos azuis pequenos e

numerosos (tendendo a desaparecer na morte); nadadeira peitoral no lado dorsal com uma

membrana preta e uns raios das nadadeiras amarelado e brancos claros; nadadeira caudal

colorida uniformemente (WHITEHEAD, P. J. P., et al., 1984).

Figura 4: imagem da Solea senegalensi foto de Karlos Ribeiro de Moraes.

Seu habitat é demersal, habita na areia e na lama das lagoas Brackish e nas águas rasas,

vive da costa ate os 100m. Alimenta-se de uma larga escala de pequenos invertebrados

benticos, principalmente de poliquetas e de moluscos bivalve mas também de larvas do

chironomid e de pequenos crustáceos. Reprodução: Maio - Agosto com um pico em junho

(Peninsula Iberica, Golfo de Biscaia). Distribuição: Atlântica (sul do Golfo de Biscaia) e

Mediterraneo oriental. Em outras partes do sul de Senegal.

13

Figura 5: mapa indica a distribuição da espécie Solea senegalensi.

Amostragem dos peixes

Este trabalho foi realizado com um total de 40 peixes provenientes de duas lotas Cada área

de coleta forneceu 10 animais para este estudo. Os peixes foram colocados em gelo para o

sacrifício. Em cada local foi efectuada a identificação e medida dos peixes nomeadamente

do sexo, comprimento total, comprimento padrão, peso e local de coleta. O comprimento

total do animal é a medida que é realizada da ponta do nariz ate o final da nadadeira

caudal. O comprimento padrão do animal é a medida realizada da ponta do nariz do animal

ate o início da nadadeira caudal do animal.

Recolha das brânquias

A coleta das brânquias é realizada após a abertura do opérculo dos peixes, deixando a

brânquia exposta. Uma vez as brânquias expostas, foram cortados as bases dos arcos

branquiais sendo retiradas cada um dos arcos e colocados no fixador ALFAC.

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Foto 6: mostra a brânquia da Solea, foto de Karlos Ribeiro de Moraes

Fixação das brânquias

As brânquias coletadas dos peixes foram colocadas em solução fixadora chamada

de ALFAC, que é feita com 80 ml de álcool 80%, 15 ml de formol e 5 ml de ácido acético.

As Brânquias permaneceram nesta solução fixadora por um período de 24 horas, após as

24 horas a solução fixadora foi retirada e trocada por uma solução de transporte que é um

solução de álcool 70%, onde as brânquias permanecem por tempo indeterminado.

Procedimentos de histologia e de histoquímica

Os procedimentos histológicos e histoquímicos incluem o sacrifício dos animais.

Os tecidos coletados, passaram por um período de fixação, impregnação, inclusão, corte

dos blocos e coloração das lâminas. As brânquias coletadas foram levadas ao laboratório

de histopatologia do ICBAS da Universidade do Porto, onde foi realizada o processamento

histológico standard das amostras. As colorações seleccionadas neste estudo foram a

Hematoxilina e Eosina (protocolo no anexo 1) que foram utilizadas para verificar a

estrutura dos tecidos e verificar as possíveis lesões. A outra coloração seleccionada foi o

Azul de Alciam mais Ácido Periódico de Schiff (os protocolos das colorações estão no

anexo 1) que foi utilizada para verificar os tipos de muco libertado pelas células de muco

das brânquias.

15

Tratamento das fotos As laminas foram fotografadas no laboratório de histologia da Universidade de

Aveiro. As fotografias foram efectuadas com o microscópio de luz Olympus BX41,

acoplado com uma câmera digital Olympus C-5080. Em cada brânquia foram contadas 50

lamelas para cada tipo de lesão. Para as contagens das alterações das nas células de muco

foram contadas todas as células presentes em 25 lamelas branquiais.

Analises Estatística

Os resultados das contagens obtidos para os organismos das duas espécies e de

cada local estudado, foram comparados entre si utilizando-se teste paramétrico (ANOVA)

ou não paramétrico (Qui-Quadrado), dependendo da distribuição dos dados. Foram

considerados significativos valores de P <0,05.

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RESULTADOS

Tipo de lesões

A análise da totalidade das lãminas preparadas mostrou os seguintes tipos de lesões nas

brânquias dos peixes provenientes das populações selvagens e de aquacultura; (i) fusão

basal das lamelas secundarias; (ii) fusão medial das lamelas secundarias; (iii) fusão

medial das lamelas secundarias; (iv) fusão total das lamelas secundaria; (v) fusão apical

das lamelas secundarias; (vi) edema apical das lamelas secundárias; (vii) edema lamelar;

(viii) desorganização na quantidade das células de muco das lamelas secundárias.

A fusão basal das lamelas secundarias ocorre quando há uma formação de células na base

das lamelas secundarias das brânquias. Este tipo de lesão ocorre quando as lamelas estejam

fundidas até um terço do seu tamanho. A fusão medial das lamelas secundarias ocorre

quando há uma formação de células que se inicia no meio das lamelas secundarias das

brânquias. Este tipo de lesão ocorre quando as lamelas secundarias estejam fundidas até

metade do seu tamanho. A fusão total das lamelas secundarias ocorre quando há uma

formação de células que se inicia na região do ápice das lamelas secundarias das brânquias.

Este tipo de lesão ocorre quando a totalidade das lamelas secundárias estão fundidas. A

fusão apical das lamelas secundarias ocorre quando o ápice das lamelas secundarias está

fundida. Trata-se da última fase da fusão lamelar, a lamela está completamente fundida. O

edema apical ocorre devido a uma acumulação de células sanguíneas no ápice da lamela

secundaria causando um inchaço no ápice da lamela secundaria da brânquia. O edema

lamelar ocorre devido a um inchaço na parede da lamela secundaria, este inchaço provoca

um descolamento da parede da lamela, criando um espaço entre as células pilares

condutora do sangue e a parede celular da brânquia. No caso das células de muco ocorre

uma desorganização na quantidade das células de muco e também na quantidade de muco

liberado nas lamelas primarias e secundarias da brânquia.

Análise dos valores totais de lesões

18

Os resultados dos testes de significância (ANOVA) para os totais de cada tipo de lesão

observados nas brânquias das populações selvagens e de aquacultura encontram-se

descritos nas tabelas 1 e 2. Os resultados mostram que para o caso das populações

selvagens não foram encontradas diferenças significativas entre os números de lesões entre

as duas lotas (Póvoa de Varzim e Aveiro) (Tabela 1).

Tabela 1: resultados do teste de significância (ANOVA) para os totais de cada tipo de lesão ocorridas nas brânquias dos peixes adquiridos nas lotas.

Tipos de lesões F Sig. Significância

Fusão Basal - - - Fusão Medial - - - Fusão Total 1.887 0.192 ns Fusão Apical - - - Edema Apical 0.262 0.969 ns Edema lamelar 0.430 0.885 ns Células de Muco - - -

Os resultados mostram que para o caso das populações de aquaculturas não foram

encontradas diferenças significativas entre os números de lesões entre as dois sistemas

produtivos (Matosinhos-Rio Alto e Torreira-Aveiro) (Tabela 2).

Tabela 2: resultados do teste de significância (ANOVA) para os totais de cada tipo de lesão ocorridas nas brânquias dos peixes adquiridos .nas pisciculturas.

Tipos de lesões F Sig. Significância

Fusão Basal - - - Fusão Medial - - - Fusão Total 1.887 0.192 ns Fusão Apical 1.843 0.201 ns Edema Apical 0.262 0.969 ns Edema lamelar 0.430 0.885 ns Células de Muco 1.021 0.494 ns

Análise dos valores de cada tipo de lesão

Os resultados obtidos nas contagens padrão do total de lesões em 50 lamelas secundárias,

por tipo de lesão, encontram-se descritos nas figuras 7- 10. Foi dada indicação do valor

mínimo, máximo, soma, média e desvio padrão para cada tipo de lesão.

19

Fusão Basal

Os resultados da fusão basal das lamelas secundárias, tanto para as brânquias das

populações selvagens como para as brãnquias das populações de aquicultura, indicaram

que este tipo de lesão foi mais frequente nas populações provenientes das aquiculturas

(figura 7).

Figura 7: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão fusão basal para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

20

Figura 8: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; B as setas indicam os locais de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 9: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; D as setas indicam os locais de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 10: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; F a seta indica o local de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

21

Figura 11: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZD as setas indicam os locais de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 12: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZF as setas indicam os locais de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 13: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZH as setas indicam os locais de presença da lesão fusão basal; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

22

Fusão Medial Os resultados da fusão medial das lamelas secundárias, tanto para as brânquias das



(figura 14).

Figura 14: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão fusão medial para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

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Figura 15: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; G as setas indicam os locais de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 16: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; H as setas indicam os locais de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 17: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; L a seta indica o local de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

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Figura 18: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZI as setas indicam os locais de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 19: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZJ as setas indicam os locais de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 20: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZK as setas indicam os locais de presença da lesão fusão medial; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

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Fusão Total Os resultados da fusão total das lamelas secundárias, tanto para as brânquias das



(figura 21).

Figura 21: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão fusão total para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

26

Figura 22: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; J as setas indicam os locais de presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 23: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; K as setas indicam os locais de presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 24: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; L a seta indica o local de presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

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Figura 25: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZL as setas indicam os locais de presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 26: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZM as setas indicam os locais de presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 27: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZK a foto indica a presença da lesão fusão total; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

28

Fusão Apical Os resultados da fusão apical das lamelas secundárias, tanto para as brânquias das



(figura 28).

Figura 28: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão fusão apical para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

29

Figura 29: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; M as setas indicam os locais de presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 30: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; N as setas indicam os locais de presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 31: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; O a seta indica o local de presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

30

Figura 32: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZO as setas indicam os locais de presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 33: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZP as setas indicam os locais de presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 34: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZQ a foto indica a presença da lesão fusão apical; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

31

Edema Apical Os resultados da fusão total das lamelas secundárias, tanto para as brânquias das



(figura 35).

Figura 35: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão Edema Apical para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

32

Figura 36: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; P as setas indicam os locais de presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 37: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; Q as setas indicam os locais de presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 38: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; R, a seta indica o local de presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

33

Figura 39: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZR as setas indicam os locais de presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 40: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZS as setas indicam os locais de presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 41: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZT a foto indica a presença da lesão edema apical; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

34

Edema Lamelar Os resultados do edema lamelar das lamelas secundárias, tanto para as brânquias das



(figura 42).

Figura 42: gráfico mostra o resultado das analises descritivas da lesão Edema lamelar para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

35

Figura 43: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto A mostra uma brânquia normal; P as setas indicam os locais de presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 44: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto C mostra uma brânquia normal; Q as setas indicam os locais de presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 45: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea solea, adquiridas nas lotas, a foto E mostra uma brânquia normal; U, a seta indica o local de presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

36

Figura 46: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZC mostra uma brânquia normal; ZU as setas indicam os locais de presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 4x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 47: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZE mostra uma brânquia normal; ZV as setas indicam os locais de presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 10x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

Figura 48: mostra os resultados fotográficos das brânquias de Solea senegalensis, adquiridas nas aquiculturas, a foto ZG mostra uma brânquia normal; ZX a foto indica a presença da lesão edema lamelar; a foto tem uma escala de 100x – e coloração de Hematoxilina e Eosina.

37

Células de Muco Os resultados da desorganização das células do muco das lamelas secundárias, tanto para

as brânquias das populações selvagens como para as brãnquias das populações de

aquicultura, indicaram que este tipo de lesão foi mais frequente nas populações

provenientes das aquiculturas (figura 49).

Figura 49: gráfico mostra o resultado das analises descritivas das células de muco para peixes selvagens e peixes de aquacultura.

38

Figura 50: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea solea, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra V: mostra as células de muco das brânquias controle; X: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 4x – Azul de Alcian mais P.A.S.

Figura 51: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea solea, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra Y: mostra as células de muco das brânquias controle; Z: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 10x – Azul de Alcian mais P.A.S..

Figura 52: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea solea, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra ZA: mostra as células de muco das brânquias controle; ZB: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 100x – Azul de Alcian mais P.A.S..

39

Figura 53: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea senegalensis, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra ZY: mostra as células de muco das brânquias controle; ZW: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 4x – Azul de Alcian mais P.A.S.

Figura 54: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea senegalensis, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra ZZ: mostra as células de muco das brânquias controle; ZZA: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 10x – Azul de Alcian mais P.A.S..

Figura 55: o resultado das células de muco nas brânquias de animais Solea senegalensis, os peixes foram adquiridos nas lotas. As fotografias das brânquias, mostra ZZB: mostra as células de muco das brânquias controle; ZZC: as setas indicam o desorganização das células de muco e a liberação do muco pelas células. Escala de 100x – Azul de Alcian mais P.A.S..

41

DISCUSSÃO As zonas costeiras e muitos dos efluentes próximos das grandes áreas urbanas estão

contaminados com efluentes industriais, domésticos e agrícolas. O despejo indiscriminado

e a libertação de substâncias consideradas de risco dentro destas áreas podem levar a

distúrbios no ambiente aquático que podem ser considerados como uma grande fonte de

stress para a comunidade biótica. Os poluentes podem causar lesões nos tecidos e órgãos

dos peixes que vivem em ambientes degradados. Assim, as análises histopatológicas são

consideradas ferramentas sensíveis para detectar a presença e os efeitos de compostos

químicos em órgãos alvo. Biomarcadores histopatológicos vem sendo utilizados em

estudos de campo para avaliar o efeito tóxico dos poluentes no ambiente aquático, e têm a

capacidade de diferenciar lesões nos órgãos, induzidas por doenças e outros fatores do

meio ambiente, daquelas provocadas pela exposição aos poluentes (Schwaiger et al.,

1997). Alterações histopatológicas resultam de uma variedade de mudanças bioquímicas e

fisiológicas no organismo, que podem levar a formação de lesões nas células, nos tecidos

ou órgãos (Hinton & Laurén, 1990; Hinton et al., 1992).

As características histopatológicas são normalmente específicas de cada organismo e

podem expressar as condições de vida do animal e representar o impacto causado pelo

poluente no organismo. As mudanças histológicas são consideradas mais sensíveis que os

parâmetros relacionados apenas com o crescimento ou reprodução do indivíduo (Teh et al.,

1997). Os resultados obtidos neste estudo em relação à estrutura branquial mostraram a

organização da estrutura lamelar típica em peixes não tratados (FIGUEIREDO-

FERNANDES, A., et al., 2007; LIMA, F. B. De, et. al., 2009). As lesões mais

frequentemente encontradas nas brânquias da Solea solea e Solea senegalensis, tanto em

populações selvagens como de aquacultura, foram fusões basais, fusões médias, fusões

totais, fusões apicais, edemas apicais, edemas lamelares e desorganização das células de

muco lamelares. Quando se registaram apenas um ou vários tipos de lesões, os tipos de

lesões mais comuns foram as fusões apicais e edemas apicais, tendo sido descritas uma

grande quantidade e edemas nas lamelas secundárias e uma pequena quantidade de fusões

nas lamelas secundárias. Este tipo de lesões, fusões e edemas, e a sua distribuição pelas

lamelas branquiais, apresentaram dimensões e aspectos semelhantes aos resultados

descritos por outros autores

42

Fusões e edemas são lesões encontradas como resulado de testes de contaminações

anbientais tanto em estudos com organismos de água salgada como obtidos nos estudos de

(BHAGWANT, S. ELAHEE, K. B.2002; SESINI, C. et. al., 2008), como também são

encontrados estas mesmas lesões como resulado de testes de contaminações anbientais

tanto em estudos com organismos de água doce como foi verificado nos estudos realisados

por (LEONARDO, J. L. M. O. et. al, 2001; SILVA, A. das G., 2004; PANE, E. F. et. al.,

2004; OLOJO, E. A. A. et. al, 2005; ALBINAT, A. C. L., 2006; GARCIA-SANTOS, S. et.

al, 2007; PEREIRA, C.A. et. al., 2007; FIGUEIREDO-FERNANDES, A. et. al, 2007;;

BOTELHO, R.G. et. al., 2010; MONTES, A. da S., et. al., 2010).

As patologias encontradas neste estudo também foram descritas por vários outros autores

como resultantes de diferentes tipos de contaminantes (DOMINGUES, F. X. V., 2006;

RIBEIRO, E. A., 2007; Schwaiger, J. et. al., 2004; MARTINS, M. L., et. al., 1999). No

entanto, estas mudanças podem ocorrer para diversos tipos diferentes de contaminantes

(ARELLANO, 1999; De BOECK et al., 2001). COSTA, P. M. et. al. (2009) num estudo

com biomarcadores histológicos utilizando fígado e brânquias de juvenis de Solea

senegalensis expostos a sedimentos estuarinos contaminados observou que em presença de

índices de contaminação elevados se verifica a ocorrência de corpos eosinófilos grandes no

fígado e degradação de células mucosas nas brânquias relacionadas com os contaminantes

orgânicos encontrados no sedimento. Por outro lado, RODRIGUES, R.V. (2009) encontrou

como resultado de seu estudo edemas de lamelas como principal lesão, em contaminações

com petróleo. LICHTENFELS, A.J.F.C. et. al.. (1996) verificou os efeitos da poluição da

água nas brânquias dos peixes Tilapica do Nilo. Este estudo concluiu que os peixes de

locais poluídos mostram um processo inflamatório crônico na região distal dos filamentos

branquiais, com hiperplasia epitelial e hipersecreção. ARELLANO, (1999) num estudo

histológico de acumulação de cobre no figado e nas brânquias de Solea senegalensis

verificou elevação e inchaço do epitelio lamelar. STOFELLA, D. R. E. (2000) realizou um

estudo com brânquias de peixes de água salgada Oligoplites palometa (Carangidae), tendo

estudado a morfologia e a atividade funcional através de microscopia eletrônica e de

varredura. Concluiu que os filamentos branquiais das brânquias de peixes de água salgada

Oligoplites palometa variam em tamanho de acordo com sua localização no arco branquial

43

e que as lamelas respiratórias são bem desenvolvidas. ARJONA, F. J. (2005) num estudo

preliminar sobre a adaptação de Solea senegalensis a um ambiente com variação salina

verificou que a atividade da NA+K+ATPase branquiais apresentava uma relação linear

direta das enzimas com a salinidade do ambiente e que a atividade da Na+ K+ rim ARPase

não mostrou nenhuma variação. Por outro lado, a análise plasmática nos níveis de iões

osmóticos mostrou diferenças significativas entre os diferentes grupos de cortisol e os

níveis de glicose e lactose plasmático aumentaram nas unidades adaptadas a maior

salinidade. Estudos semelhantes têm também sido aplicados para organismos de água doce.

HOGSTRAND, C. e WOOD, C. M. (1998) tentaram compreender a fisiologia da

biodisponibilidade e toxicidade da prata em peixes de água doce. Concluíram que a

contaminação aguda com prata resulta da deficiência do organismo em manter as

concentrações constantes de Nacl e de Cl2 no plasma do sangue. Em peixes de água doce a

prata exerce seus efeitos tóxicos no transporte de NaCl e de Cl2 através das brânquias, visto

que o intestino foi indicado com o local de maior toxicidade em peixes de águas salgadas.

SANTOS, D.M.S. (2010) observou nas brânquias de animais de pisciculturas edemas e

fusões nas lamelas secundárias com tipologia semelhantes às descritas neste trabalho.

Um outro tipo de lesão observada traduziu-se na desorganização das células de muco das

brânquias. Este tipo de lesão manifesta-se pela proliferação de células de muco

verificando-se alterações no número e na atividade das células secetoras de muco. Este tipo

de histopatologia vem sendo descrita por diversos autores (TKATCHEVA, V. et. al., 2004;

PEREIRA, B. F., 2009; JAGOE & HAINES, 1997; JUNIOR et al., 2010.). No entanto

outros estudos têm mostrado uma patologia diferente traduzindo-se, pelo contrário, numa

quantidade decrescente de células de muco (RIBEIRO, E. A., 2007). Os resultados obtidos

para as duas espécies para os dois tipos diferentes de ecossistemas e os métodos utilizados

mostraram o seu grande valor no que concerne à verificação da qualidade do pescado. O

uso de brânquias como bioindicadores é bastante comum, pois estabelecem um contacto

directo e permanente com o ambiente físico externo ao corpo do animal, sofrendo forte

stress ambiental (SILVA, A. G. 2004; RODRIGUES, A. C. F., 2009; AU, D. W. T., 2004)

adquirindo por isso uma elevada importância na realização de monitoramento ambiental.

45

CONCLUSÃO Neste estudo da histopatologia de brânquias de duas espécies de soleas, Solea solea

(Linnaeus 1758), que é a espécie mais capturada pela industria pesqueira protuguesa e

Solea senegalensis (Kaup, 1858), espécie mais utilizada nas pisciculturas de portuguesas,

foram encontrados três grupos de lesões: (i) fusões; (ii) edemas e, (iii) desorganização das

células de muco. Na tipologia das fusões foram encontradas quatro tipos: (i) fusão basal;

(ii) fusão medial; (iii) fusão total e, (iv) fusão apical. Na tipologia dos edemas foram

encontrados dois tipos: (i) edema apical e, (ii) edema lamelar. As lesões encontradas neste

estudo ocorreram com a mesma frequência nas duas populações, populações selvagens e

de aquacultura. As lesões encontradas ocorreram em maior quantidade nas brânquias das

populações de Solea senegalensis que foram os animais adquiridos nas pisciculturas.

Porém, as lesões apresentaram maior degradação e gravidade nas brânquias da população

de Soela solea que foram adiquiridos nas lotas.

Este estudo mostrou-se adequado à questão proposta no inicio deste estudo através da

aplicação dos métodos histopatologicos em brânquias de solhas para monitoramento

ambiental e monitoramento da saúde dos organismos.

47

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57

ANEXO 1 (PROTOCOLOS DE COLORAÇÕES)

58

Hematoxilina e Eosina

1. Desparafinar dois banhos de 5 minutos.

2. Hidratar com banhos rápidos em álcool.

3. Lavar em água corrente ate que a lamina fique sem bolhas de álcool.

4. Corar com Hematoxilina por 2 minutos

5. Lavar em água corrente por 10 a 15 minutos ( estes passo pode ser precedido por

uma passagem em água Amoniacal a 0,4%, o que reduz o tempo de lavagem em

água)

6. Corar com Eosina por 5 minutos

7. Passar por álcool (no caso da Eosina não ser alcoólica, passar por água)

8. Diferenciar em álcool Absoluto 3 banhos rápidos

9. Desidratar em banhos em álcool

10. Colocar no xilol

11. Montar a lamina.

Demonstra:

Põe em evidência os principais elementos tecidulares: núcleo, citoplasma e

colágeno.

Resultado:

Núcleos: Azul

Citoplasma: Rosa

Sangue: Alaranjado

Fibras Conjuntivas: Rosa

59

Azul de Alcian mais Ácido Periódico de Schiff

1. Desparafinar dois banhos de 5 minutos

2. Hidratar com banhos rápidos em álcool

3. Lavar em água corrente ate que a lamina fique sem bolhas de álcool

4. Corar com solução de Azul de Alcian por 1 hora (pH 2,5 ou 2,6)

5. Passar por água destilada

6. Oxidar com Ácido periódico a 10% por 10 minutos

7. Lavar com água corrente

8. Corar com o reagente de Schiff por 15 minutos

9. Lavar em água de torneira por 15 minutos

10. Desidratar em banhos em álcool

11. Colocar em xilol

12. Montar as lamina

Azul de Alcian

Demonstra: mucossubstâncias ácidas fracamente sulfatadas ou não sulfatadas

Resultado: Mucossibstâncias ácidas – Azul turquesa

Ácido Periódico de Schiff

Demonstra: Glicogênio e mucossubstâncias neutras

Resultado: material PAS positivo - vermelho

: núcleo – Azul.

61

ANEXO 2 Tabelas de coletas

62

Peixe Sexo Comprimento total Comprimento padrão Peso Órgão

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