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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA Participação da noradrenalina do locus coeruleus na gênese do pico pré-ovulatório de gonadotrofinasMaria Izabel Martinez da Matta Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas RIBEIRÃO PRETO - SP 2012

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

“Participação da noradrenalina do locus coeruleus na

gênese do pico pré-ovulatório de gonadotrofinas”

Maria Izabel Martinez da Matta

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a

obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas

RIBEIRÃO PRETO - SP

2012

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

“Participação da noradrenalina do locus coeruleus na

gênese do pico pré-ovulatório de gonadotrofinas”

Maria Izabel Martinez da Matta

Orientadora: Profa. Dra. Janete A. Anselmo Franci

Co-orientadora: Dra. Cristiane Mota Leite

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a

obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas

RIBEIRÃO PRETO - SP

2012

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FOLHA DE APROVAÇÃO

Maria Izabel Martinez da Matta

Participação da noradrenalina do locus coeruleus na gênese do pico pré-ovulatório de

gonadotrofinas

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a

obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas

Orientadora: Profa. Dra. Janete A. Anselmo-Franci

Co-orientadora: Dra. Cristiane Mota Leite

Área de concentração: Fisiologia

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. ___________________________________________________________________________________________

Instituição: ________________________________________________ Assinatura __________________________

Prof. Dr. ___________________________________________________________________________________________

Instituição: _______________________________________________ Assinatura ___________________________

Prof. Dr. ___________________________________________________________________________________________

Instituição: _______________________________________________ Assinatura ___________________________

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Dedico este trabalho aos meus pais, Onivaldo da Matta Junior e Lêda

Martinez da Matta, os quais sempre lutaram para que eu pudesse realizar

meus sonhos e me apoiaram em todas as minhas escolhas. Obrigada por

serem minha fortaleza e pelo amor incondicional!

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AGRADECIMENTOS

Aos meus irmãos, Thiago, Gustavo e Marina pelo cuidado, proteção e amizade. Em

especial à minha sobrinha Laura, por conseguir me alegrar sempre com seu amor e

inocência, característicos de uma criança.

À minha orientadora, Profa. Dra. Janete A. Anselmo Franci, pelo apoio, paciência,

amizade e pelos ensinamentos de caráter científico e pessoal ao longo de nossa

convivência.

Aos meus colegas de laboratório Aline, Bruna, Cristiane, Leonardo, Nayara, Paulo e Talita

pela ajuda, amizade e convivência agradável no ambiente de trabalho, assim como nos

momentos de lazer. Agradeço em especial à Cristiane Mota Leite por sua constante

disposição e paciência em me ajudar e ensinar.

Ao Maicon, Ruither e Yan pelo apoio técnico no laboratório e pelas horas de

descontração.

Ao Prof. Celso Rodrigues Franci por disponibilizar seu laboratório para as dosagens

hormonais.

Aos meus amigos Aline, Diógenes, Laura, Luísa, Lívea, Nayara e Rafael, pela amizade

verdadeira, pelos momentos maravilhosos compartilhados, de alegria e diversão, e pelo

apoio presente em todos os momentos ao longo desses anos. Agradeço em especial à

Letícia pelas conversas em momentos difíceis, pelas risadas, pelos conselhos e pela

amizade sincera; e à Júlia pela ótima convivência e por vivenciar comigo, dia a dia,

minhas aflições a alegrias.

Ao Rafael por estar sempre presente, me guiando e incentivando nos momentos de

dificuldade, pela cumplicidade, carinho, afeto e amor dedicados de maneira única.

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Agradeço pela paciência, compreensão e pelos inesquecíveis momentos que

compartilhamos!

Aos animais pelo sacrifício.

À FAPESP pelo apoio financeiro.

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RESUMO

MATTA, M. I. M. Participação da noradrenalina do locus coeruleus na gênese do

pico pré-ovulatório de gonadotrofinas. 2012. Monografia. Faculdade de Filosofia

Ciências e Letras de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012.

O ciclo reprodutivo de ratas é caracterizado pela ocorrência de picos pré-

ovulatórios de gonadotrofinas induzidos pelos esteroides ovarianos. A noradrenalina é

um dos principais neurotransmissores envolvidos na regulação do eixo hipotalâmico-

pituitário-gonadal, sendo os neurônios noradrenérgicos importantes mediadores das

ações dos esteroides ovarianos que culminam com os picos de gonadotrofinas. Visto que

o locus coeruleus (LC) envia projeções para a área pré-óptica (APO), onde estão

localizados os neurônios produtores de hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH);

que os neurônios deste núcleo estão sob regulação dos esteroides ovarianos e que o

estradiol parece inibir o LC enquanto a progesterona o estimula, este trabalho tem o

objetivo de avaliar, em ratas ovariectomizadas, se a ativação dos neurônios do LC

induzida pelo tratamento com esteroides ovarianos e, consequentemente, dos neurônios

da APO, é prevenida mediante a aplicação de um antagonista de receptores de

progesterona (PR). Para tal, ratas ovariectomizadas foram tratadas com estradiol às 9 h

por três dias consecutivos (do 5º ao 7º dia pós-castração). No 8º dia, os animais

receberam uma injeção de progesterona ou óleo às 10 h. Duas horas antes do

tratamento com progesterona, os animais foram tratados com o bloqueador de PRs RU-

486 ou óleo de milho (Grupo controle). As ratas foram perfundidas às 11, 13 e 15 h.

Após a anestesia e imediatamente antes do início da perfusão, uma amostra de sangue

foi retirada do ventrículo para a dosagem de hormônio luteinizante (LH). Cortes

seriados de 30 μm da APO e do LC obtidos em criostato foram submetidos à

imunocitoquímica para FRA nas regiões AVPV e VMPO da APO e à dupla marcação

imunocitoquímica para FRA e tirosina hidroxilase (TH) no LC. A avaliação das alterações

na atividade dos neurônios nesses núcleos foi feita por meio da contagem do número de

neurônios marcados para FRA na APO e duplamente marcados para FRA/TH no LC. O

tratamento com progesterona em ratas ovariectomizadas estrogenizadas promove o

aumento da atividade do LC, seguido do aumento da atividade da APO, ocasionando a

amplificação do pico de LH induzido pelo estradiol. O bloqueio de PR pelo RU-486 foi

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capaz de bloquear o efeito deste esteroide ovariano, atenuando o pico de LH, o qual se

igualou àquele dos animais tratados apenas com estradiol. Os dados sugerem que a

progesterona amplifica o pico de LH induzido pelo estradiol por meio da ativação dos

neurônios do LC, o que resulta na liberação de noradrenalina na APO com consequente

aumento da atividade desta área que culmina com a amplificação da liberação de GnRH

resultando no pico pré-ovulatório de LH.

Palavras-chave: progesterona, RU-486, hormônio luteinizante, locus coeruleus, área

pré-óptica, imunohistoquímica.

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ABSTRACT

MATTA, M. I. M. Locus coeruleus noradrenaline participation on the genesis of

gonadotropins preovulatory surges. 2012. Monografia. Faculdade de Filosofia

Ciências e Letras de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012.

Rats’ reproductive cycle is characterized by the occurrence of gonadotropins

preovulatory surges induced by ovarian steroids. Noradrenaline is one of the major

neurotransmitter involved on the regulation of the hypothalamus-pituitary-gonadal axis,

being the noradrenergic neurons important mediators of ovarian steroids’ actions which

culminate with gonadotropins surges. Since locus coeruleus (LC) sends projections to

the preoptic area (APO), where gonadotropin-releasing hormone (GnRH) producers

neurons are localized; neurons from this noradrenergic nucleus are under ovarian

steroids control and estradiol seems to inhibit LC meanwhile progesterone stimulates it,

the aim of this study was to evaluate, in ovariectomized female rats, if the activation of

LC neurons induced by ovarian steroids treatment and, therefore, of APO neurons, is

prevented by the administration of a progesterone receptor’s (PR) antagonist. For this

purpose, ovariectomized female rats were treated with estradiol at 9 a.m. for three

consecutive days (from 5th till 7th days after castration). By the 8th day, the animals

received a single injection of progesterone or corn oil at 10 a.m. Two hours before

progesterone’s treatment, animals were treated with PRs antagonist RU-486 or corn oil.

Rats where perfused at 11 a.m., 13 p.m. and 15 p.m. After anesthesia and immediately

before the perfusion, a blood sample was collected from the cardiac ventricle for the

luteinizing hormone (LH) dosage. Serial slices of 30 μm from the APO and LC obtained in

criostate were submitted to immunohistochemistry for FRA on AVPV and VMPO regions

from the APO and double label for FRA and tyrosine hydroxylase (TH) at the LC. The

evaluation of changes on the activity of these nuclei neurons was performed by counting

the number of neurons immunoreactive to FRA at the APO and double labeled to

FRA/TH at the LC. The treatment with progesterone in ovariectomized estrogenized

female rats promotes the increase on LC activity, followed by increase on APO activity,

resulting on the amplification of the LH surge induced by estradiol. The block of PR by

RU-486 was able to block this ovarian steroid’s effect, attenuating the LH surge, which

was equal as the one presented by animals treated only with estradiol. The data suggest

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that progesterone amplifies estradiol-induced LH surge by activating LC neurons, this

results on noradrenaline release on the APO with consequent increase on this area

activity which culminates with the amplification of GnRH release resulting on LH

preovulatory surge.

Keywords: progesterone, RU-486, luteinizing hormone, locus coeruleus, preoptic area,

immunohistochemistry.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Pefil hormonal de ratas.............................................................................................................18

Figura 2: Perfil hormonal da secreção de LH em ratas ciclando e ratas ovariectomizadas

com ou sem injeções diárias de estradiol seguidas ou não da injeção de

progesterona......................................................................................................................................................20

Figura 3: Representação esquemática dos mecanismos envolvidos na retroalimentação

positiva do GnRH e gonadotrofinas pelos esteroides ovarianos..................................................21

Figura 4: Linha esquemática do desenho experimental.................................................................28

Figura 5: Fotomicrografias representativas de neurônios duplamente marcados para

FRA e TH no locus coeruleus de ratas OVEP-RU (A) e ratas OVEP (B) perfundidas às 13

h.............................................................................................................................. ..................................................35

Figura 6: Número de neurônios TH-ir que expressam FRA no LC de ratas OVE (A) e

OVEP (B) tratadas com óleo ou RU-486 no dia do experimento e perfundidas às 11 h, 13

h e 15 h..................................................................................................................................................................36

Figura 7: Número de neurônios duplamente marcados para TH e FRA de ratas

ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVE) e com estradiol, progesterona e RU-486

(OVEP-RU) nos três diferentes horários de perfusão.......................................................................36

Figura 8: (A) Diagrama esquemático demonstrando as regiões do AVPV e VMPO

analisados, de +0.12 a -0.12 mm do Bregma. A caixa representa a área selecionada para a

quantificação dos neurônios imunorreativos a FRA no AVPV. (B e C) Fotomicrografias

representativas de neurônios imunorreativos a FRA no AVPV de ratas OVEP (B) e OVEP-

RU (C) perfundidas às 15 h..........................................................................................................................37

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Figura 9: Número de neurônios que expressam FRA no AVPV (A e B) e no VMPO (C e D)

de ratas OVE (A e C) e OVEP (B e D) tratadas com óleo ou RU-486 no dia do

experimento e perfundidas às 11 h, 13 h e 15 h.................................................................................38

Figura 10: Número de neurônios imunorreativos a FRA no AVPV (A) e no VMPO (B) de

ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVE) e estradiol, progesterona e RU-486

(OVEP-RU) nos três diferentes horários de perfusão.......................................................................39

Figura 11: Concentração plasmática de LH de ratas ovariectomizadas tratadas (A) com

estradiol (OVE) e (B) com estradiol e progesterona (OVEP). No dia do experimento, os

animais foram tratados com RU-486 ou óleo às 8 h e perfundidos às 11 h, 13 h e 15

h................................................................................................................................................................................39

Figura 12: Concentração plasmática de LH de ratas ovariectomizadas tratadas com

estradiol (OVE) e estradiol, progesterona e RU-486 (OVEP-RU) nos três diferentes

horários.............................................................................................................................. ...................................40

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LISTA DE SIGLAS

ABC – do inglês “avidin-biotin complex” ou complexo avidina-biotina

APO – área pré-óptica

APOM – área pré-óptica medial

AVPV – do inglês “anteroventral periventricular nucleus” ou núcleo periventricular

anteroventral

BSA – do inglês “bovine serum albumin” ou albumina sérica bovina HPG – eixo

hipotálamo-hipófise-gonadal

DAB – 3,3’ diaminobenzidina

DBH – dopamina beta-hidroxilase

EDTA – do inglês “ethylenediamine tetraacetic acid” ou ácido etilenodiamino tetra-

acético

EM – eminência mediana

ERα – do inglês “estradiol receptor alpha” ou receptor para estradiol tipo alpha

ERß – do inglês “estradiol receptor beta” ou receptor para estradiol tipo beta

FRA – do inglês “Fos-related antigens” ou antígenos relacionados à Fos

FSH – do inglês “follicle-stimulating hormone” ou hormônio folículo estimulante

GABA – do inglês “gamma aminobutyric acid” ou ácido gama-aminobutírico

GnRH – do inglês “gonadotropin-releasing hormone” ou hormônio liberador de

gonadotrofinas

GR – do inglês “glucocorticoid receptor” ou receptor para glicocorticóide

H2O2 – peróxido de hidrogênio ou água oxigenada

HMB – hipotálamo médio basal

ICC – imunocitoquímica

LC – locus coeruleus

LH – do inglês “luteinizing hormone” ou hormônio luteinizante

NA – noradrenalina

NiSO4 – sulfato de níquel

OVX – ovariectomia

PB – do inglês “phosphate buffer” ou tampão fosfato

PR – do inglês “progestin receptor” ou receptor para progesterona

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PBS – do inglês “phosphate buffered saline” ou tampão fosfato salina

PFA – paraformaldeído

RIE – radioimunoensaio

TH – tirosina hidroxilase

TX-100 – Triton X-100

VMPO – do inglês “ventromedial preoptic nucleus” ou núcleo pré-óptico ventromedial

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SUMÁRIO

1 Introdução.................................................................................................................................................. 16

1.1 Controle neuroendócrino da secreção de gonadotrofinas ................................................ 17

1.2 Regulação noradrenérgica da secreção de gonadotrofinas .............................................. 22

1.2.1 Participação do locus coeruleus .......................................................................................... 23

2 Objetivos ..................................................................................................................................................... 25

2.1 Geral ....................................................................................................................................................... 26

2.2 Específicos ........................................................................................................................................... 26

3 Material e métodos ................................................................................................................................ 27

3.1 Planejamento experimental .......................................................................................................... 28

3.2 Animais ................................................................................................................................................. 29

3.3 Ovariectomia ....................................................................................................................................... 29

3.4 Tratamento hormonal ..................................................................................................................... 29

3.5 Tratamento com antagonista de receptores de progesterona ........................................ 29

3.6 Radioimunoensaio ............................................................................................................................ 30

3.7 Processamento do cérebro para imunocitoquímica ............................................................ 31

3.8 Imunocitoquímica ............................................................................................................................. 31

3.9 Análise quantitativa ......................................................................................................................... 32

3.10 Análise estatística ........................................................................................................................... 33

4 Resultados .................................................................................................................................................. 34

4.1 Efeito do RU-486 na expressão de FRA .................................................................................... 35

4.1.1 No LC .............................................................................................................................................. 35

4.1.2 Na APO ........................................................................................................................................... 37

4.2 Efeito do RU-486 na liberação de LH ......................................................................................... 39

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5 Discussão .................................................................................................................................................... 41

6 Conclusão .................................................................................................................................................... 48

7 Referências bibliográficas ................................................................................................................. 50

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Introdução

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Introdução 17

1 Introdução

O ciclo ovulatório é um processo complexo que envolve a coordenação de uma

série de eventos neuroendócrinos controlados pelo eixo hipotálmo-hipófise-gonadal

(HPG).

Há muitas décadas têm sido investigados os mecanismos pelos quais os

esteroides ovarianos induzem a ovulação e limitam este evento a um único período do

ciclo, conhecido como período periovulatório (Schwartz & McCormack, 1972; Wise et al.,

1981; Levine, 1997; Herbison, 1998). No entanto, embora estes mecanismos tenham

sido sistematicamente investigados ainda existem muitas lacunas que dificultam sua

total compreensão.

1.1 Controle neuroendócrino da secreção de gonadotrofinas

O principal evento no ciclo reprodutivo de animais que ovulam espontaneamente,

como a mulher e a rata, é o pico pré-ovulatório de gonadotrofinas – hormônios folículo

estimulante (FSH) e luteinizante (LH) –, o qual leva à ovulação. Os dois principais

eventos que mediam tal acontecimento são a neurossecreção do pico pré-ovulatório do

hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) e um aumento agudo na responsividade

da hipófise a essa neurossecreção, ambos dependentes de esteroides ovarianos (Levine,

1997).

A maior parte do conhecimento sobre o ciclo ovariano dos ovuladores

espontâneos se deve aos estudos realizados sobre o ciclo estral de ratas. Este animal é

um bom modelo experimental por apresentar ovulação espontânea e um perfil de

variação de gonadotrofinas bastante semelhante ao da mulher. O ciclo estral de ratas

dura, em média, de 4-5 dias. O dia do estro é o único período em que a fêmea é receptiva

ao macho e quando a ovulação e o coito ocorrem. Esta fase é precedida pelo dia de

proestro, no qual ocorrem os picos pré-ovulatórios de gonadotrofinas que induzem a

ovulação. Se não há concepção, o estro é seguido por dois dias de recuperação

denominados metaestro (ou diestro I) e diestro (ou diestro II). Segue-se a esta última

fase um novo proestro (Heape, 1992).

Durante o ciclo estral, a concentração plasmática de estradiol começa a aumentar

na tarde do diestro e alcança as maiores concentrações ao redor do meio dia do proestro

(Figura 1). No fim da tarde, estas caem rapidamente atingindo valores basais no início da

madrugada do estro. As concentrações de progesterona aumentam durante a tarde e

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Introdução 18

noite do proestro, quase simultaneamente com pico pré-ovulatório de LH, atinge o pico

juntamente com LH e retorna às concentrações basais na manhã do estro. Este pico de

progesterona é de origem folicular. Um segundo pico deste hormônio, de origem luteal,

inicia-se ao meio dia do metaestro, mantém-se na madrugada de diestro e diminui para

concentrações basais no início da manhã deste dia (Smith et al., 1975). As concentrações

plasmáticas de LH começam a aumentar rapidamente entre duas e três horas da tarde

do proestro alcançando o pico por volta das 5 às 6 horas da tarde. Este aumento rápido

de LH induz a ruptura do folículo e ovulação. Após o pico, há uma rápida queda nas

concentrações deste hormônio. O padrão de secreção de FSH no ciclo estral é

semelhante ao do LH, mas na madrugada do estro, por volta das 3 horas, ocorre um pico

secundário de FSH (Smith et al., 1975).

Figura 1: Pefil hormonal de ratas (Anselmo-Franci and Szawka, 2005; modificado de Smith et al., 1975).

Em ratos, os neurônios GnRH estão distribuídos ao longo da base do cérebro, se

estendendo do septo medial da banda diagonal de Broca, através da área pré-óptica

(APO) e no interior do hipotálamo (Kawano & Daikoku, 1981; Silverman et al., 1994).

Estudos mostraram que o sistema GnRH do cérebro de ratos é difuso, complexo e

multifuncional (Merchenthaler, 1984). A subpopulação da porção rostral da área pré-

óptica medial (APOM) – onde se localizam os núcleos periventricular anteroventral

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Introdução 19

(AVPV) e pré-óptico ventromedial (VMPO) – além de conter neurônios GnRH também

contém interneurônios que expressam receptores para estradiol e progesterona,

constituindo assim um local fisiologicamente importante para a ação destes esteroides

(Simonian et al., 1999; Herbison, 2008). De fato, lesões no AVPV resultaram na abolição

do pico de LH induzido por estradiol ou estradiol e progesterona (Wiegand & Terasawa,

1982), mostrando que este núcleo é um local crítico para a regulação dos picos de GnRH

e LH pelos esteroides ovarianos.

O GnRH é liberado no hipotálamo médio basal, no plexo capilar primário da

eminência mediana (EM) e, através dos vasos porta longos do sistema porta-hipofisário,

alcança a hipófise onde atua diretamente nos gonadotrofos. Esse neuro-hormônio é

liberado de maneira pulsátil e seus pulsos estão intimamente associados aos pulsos de

LH (Levine & Duffy, 1988). Durante a tarde do proestro, o pico pré-ovulatório de LH é

desencadeado pelo aumento da liberação de GnRH na EM (Levine & Ramirez, 1982).

A liberação de gonadotrofinas ao longo do ciclo estral é controlada por ações de

feedback exercidas pelos esteroides gonadais (Schwartz & McCormack, 1972). Na maior

parte do ciclo os estrogênios e a progesterona exercem uma ação de feedback negativo

na secreção de gonadotrofinas, o que é comprovado pelo aumento na concentração

plasmática de LH após a remoção dos ovários (Tapper et al., 1971). Por outro lado, o

pico pré-ovulatório de gonadotrofinas da tarde do proestro, depende de um feedback

positivo, resultado do aumento crescente das concentrações estrogênicas e

posteriormente de progesterona associado a um sinal neural circadiano (Levine, 1997).

A ação de feedback positivo de estrogênio tem sido demonstrada experimentalmente por

meio da administração de antagonista (Shirley et al., 1968) ou anticorpo (Neill et al.,

1971) contra estradiol, os quais bloqueiam os picos pré-ovulatórios de LH. Outro

modelo que corrobora essa hipótese é a ocorrência de um pico diário de LH no período

da tarde em ratas ovariectomizadas tratadas apenas com estradiol (Legan & Karch,

1975).

A administração de progesterona em ratas ovariectomizadas tratadas com

estradiol antecipa e amplifica o pico diário de LH e impede a ocorrência do pico do dia

seguinte (Krey et al., 1973), à semelhança do observado na tarde do proestro (Figura 2).

O bloqueio da ação da progesterona por meio da administração do antagonista do

receptor de progesterona, RU-486, resulta na manutenção do pico diário de

gonadotrofinas induzido apenas por estradiol (Sánchez-Criado et al., 1997). Em ratas no

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Introdução 20

proestro, a administração de RU-486 bloqueia o pico de LH endógeno (Sánches-Criado et

al, 1990 & Bauer-Dantoin et al., 1993) e inibe a expressão da proteína Fos (um marcador

de atividade neuronal) nos neurônios GnRH, indicando o papel estimulador da

progesterona nos neurônios GnRH (Lee et al, 1990a; 1990b).

Figura 2: Perfil hormonal da secreção de LH em ratas ciclando e ratas ovariectomizadas com ou sem injeções diárias de estradiol (E2) seguidas ou não da injeção de progesterona (P4). A secreção de LH permanece baixa ao longo do ciclo, aumentando agudamente na tarde do proestro, o que desencadeia a ovulação. A ovariectomia (OV) induz o aumento da secreção de LH, devido a perda do feedback negativo, que é revertido pela injeção de estradiol. A reposição de estradiol por, pelo menos, dois dias consecutivos, nas ratas ovariectomizadas, induz picos diários de LH, por volta das 17 h, de menor magnitude do que o do proestro. Uma injeção única de progesterona, nas ratas estrogenizadas, antecipa em uma hora e amplifica o pico circadiano induzido pelo estradiol. As barras escuras na abscissa indicam o período noturno (Anselmo-Franci & Szawka, 2005).

Embora a ação dos esteroides ovarianos sobre a liberação de GnRH e de

gonadotrofinas tenha sido comprovada por diferentes estudos, os mecanismos dessa

regulação ainda não estão bem estabelecidos. A ação direta dos esteroides sobre os

neurônios GnRH tem sido bastante questionada. Já na década de 80, Shivers e

colaboradores (1983) mostraram que o estradiol não se concentra nestes neurônios o

que sugeria que o estradiol não atuava diretamente sobre neurônios GnRH.

Posteriormente, utilizando-se a técnica de imunocitoquímica (ICC) para receptores de

estradiol do tipo (ER) foi demonstrado que estes receptores não eram expressos nos

neurônios GnRH da APOM de ratos machos ou de fêmeas (Herbison & Theodosis, 1992)

bem como de macacas (Herbison et al, 1995). Além disso, a presença de ER em

neurônios não-GnRH também sugerem uma ação indireta dos hormônios ovarianos

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Introdução 21

(Simonian et al., 1999). Não há também evidências da presença de receptor para

progesterona (PR) nesses neurônios (Fox et al., 1990). Desta forma, acredita-se que o

mecanismo regulatório dos esteroides gonadais sobre a ação dos neurônios GnRH se dê

de maneira transináptica (Figura 3), regulando outros neurônios da rede GnRH

(Herbison, 1998). Evidências experimentais indicam que esse papel modulatório pode

ser exercido por diferentes neurotransmissores, como catecolaminas (Herbison, 1998;

Lima et al., 2007), aminoácidos excitatórios (Herbison, 1998; Ottem et al., 2004), GABA

(Herbison, 1998; Ottem et al., 2004) e neuropeptídeo Y (Herbison, 1998; Rocha et al.,

2006), entre outros.

Figura 3: Representação esquemática dos mecanismos envolvidos na retroalimentação positiva do GnRH e gonadotrofinas pelos esteroides ovarianos. No final da fase folicular, o folículo dominante passa a secretar discretas quantidades de progesterona (P4), além da grande quantidade de estrógenos (E2). Nesse período, ocorre um aumento adicional da síntese de GnRH e sua liberação; o mesmo ocorre na adeno-hipófise com as gonadotrofinas. Os esteroides ovarianos parecem atuar em interneurônios produtores de neurotransmissores excitatórios e inibitórios da função dos neurônios GnRH, tais como GABA: ácido γ-aminobutírico, POE: peptídeos opióides endógenos, Da: dopamina, NT: neurotensina, NA: noradrenalina, NPY: neuropeptídeo Y, AAE: aminoácidos excitatórios. O resultado final (ativação ou inibição) depende da soma algébrica dos inputs excitatórios e inibitórios que alcançam os neurônios GnRH. A espessura das setas está relacionada com a quantidade de hormônio plasmático (adaptado de Anselmo-Franci & Szawka, 2005).

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Introdução 22

1.2 Regulação noradrenérgica da secreção de gonadotrofinas

Dentre as catecolaminas, a noradrenalina (NA) tem sido considerada o principal

neurotransmissor envolvido na liberação de GnRH. Os neurônios noradrenérgicos

parecem constituir um importante local de ação dos esteroides ovarianos no sistema

nervoso central, visto que esses neurônios expressam ER (Shughrue et al., 1997;

Haywood et al., 1999; Mitra et al., 2003; Helena et al. 2006) e PR (Haywood et al., 1999;

Helena et al., 2006). Além disso, foi demonstrado que o estrógeno estimula a expressão

do RNAm para a enzima tirosina hidroxilase (TH), enzima limitante para biossíntese de

noradrenalina nesses neurônios (Liaw et al., 1992; Thanky et al., 2002).

A inervação noradrenérgica do telencéfalo origina-se exclusivamente em

neurônios do tronco cerebral, dos quais partem dois importantes feixes ascendentes: o

feixe ventral – grupos celulares noradrenérgicos A1, A2, A5 e A7 – e o feixe dorsal –

grupo celular A6, também denominado locus coeruleus (LC) (Ungerstedt, 1971). Os

neurônios do núcleo A2 e do LC se projetam diretamente para corpos celulares dos

neurônios GnRH (Campbell & Herbison, 2007) sugerindo o controle direto da NA na

liberação de GnRH. De fato, foi demonstrado que o padrão de liberação de NA na rede

GnRH parece ser crítico na determinação dos parâmetros de liberação pulsátil de GnRH

(Brown et al., 1994).

Evidências experimentais indicam o envolvimento da neurotransmissão

noradrenérgica na gênese do pico pré-ovulatório de gonadotrofinas. O papel facilitador

da NA no pico de LH é indicado pelo aumento gradual de sua liberação no hipotálamo

médio basal (HMB) (ThyagaRajan et al., 1995) e na APOM (Mohankumar et al., 1994;

Szawka et al., 2007) durante o proestro. Além disso, a inibição seletiva de dopamina-ß-

hidroxilase (DBH), enzima chave na produção de NA, no diestro resulta no bloqueio do

pico de LH no proestro (Voogt & Carr, 1981). Em ratas ovariectomizadas estrogenizadas,

a infusão de antagonista α1-adrenérgico na APO bloqueia o aumento local do RNAm para

GnRH e o pico de LH (Weesner et al., 1993), enquanto a microinjeção

intracerebroventricular de NA estimula a liberação de GnRH e, consequentemente, de

LH no sangue porta-hipofisário (Ching & Krieg Jr, 1986), evidenciando a participação da

NA na gênese do pico pré-ovulatório. Os esteroides sexuais, por sua vez, modulam a

neurotransmissão noradrenérgica; por exemplo, o tratamento com estradiol, embora

agudamente iniba a liberação de NA, a longo prazo permite a ocorrência de um aumento

da liberação de NA na APOM (Demling et al., 1985) e do turnover desse

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Introdução 23

neurotransmissor em diferentes regiões hipotalâmicas (Wise et al., 1981), o que

coincide com o pico induzido de gonadotrofinas. Este aumento da liberação de NA é

fortemente amplificado pela progesterona e correlaciona-se diretamente com a

amplificação do pico de LH induzido por ambos esteroides ovarianos (dados não

publicados do nosso laboratório).

1.2.1 Participação do locus coeruleus

O envolvimento do LC no pico pré-ovulatório de LH foi primeiramente sugerido

com um estudo demonstrando que a lesão dessa área provocava o bloqueio do pico de

LH na tarde do proestro e em ratas ovariectomizadas com reposição hormonal (Franci &

Antunes-Rodrigues, 1985). Posteriormente, mostrou-se que em ratas ovariectomizadas

tratadas com estradiol, a estimulação elétrica do LC promovia o aumento na secreção de

LH (Gitler & Barraclough, 1987b), efeito dependente da ativação de receptores α1-

adrenérgicos (Gitler & Barraclaough, 1987a). Esses dados forneciam evidências de que o

estímulo do LC evocava a liberação de NA na APOM, a qual, via receptores α1-

adrenérgicos, aumentava a liberação de GnRH.

Trabalhos do nosso laboratório demonstraram que a lesão do LC na manhã do

proestro reduz as concentrações de NA na APOM e HMB, bloqueia os picos de

gonadotrofinas e promove o acúmulo de GnRH na APOM e EM, impedindo a ovulação

(Anselmo-Franci et al., 1997; Helena et al., 2002). Também demonstramos um aumento

da expressão de Fos nos neurônios do LC durante a tarde do proestro, o que indica

maior atividade neuronal no LC (Martins-Afferri et al., 2003) o qual, consequentemente,

deve ser responsável pelo aumento da liberação de noradrenalina na APO durante o pico

pré-ovulatório de LH. Tais resultados sugeriram que as projeções noredrenérgicas do LC

para o hipotálamo parecem estimular a liberação de GnRH e a consequente deflagração

do pico pré-ovulatório de gonadotrofinas.

Assim, o feedback positivo dos esteroides ovarianos, necessário para que o pico

pré-ovulatório de LH ocorra, parece acontecer, pelo menos em parte, via neurônios do

LC. Essa relação entre os esteroides ovarianos e os neurônios do LC foi reforçada por

Heritage e colaboradores (1980), que encontraram esteroides sexuais em tais neurônios.

Nesse sentido, também foram descritas variações do RNAm da TH neste núcleo após a

ovariectomia e reposição estrogênica (Liaw et al., 1992) e o aumento da expressão dos

genes para TH e DBH nesses neurônios, provocado pelo estradiol (Serova et al., 2002;

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Introdução 24

Thanky et al., 2002). Além disso, já mostramos que os neurônios do LC expressam ERα e

PR, expressão que varia ao longo do ciclo estral (Helena et al., 2006). Esses dados

reunidos confirmam que os neurônios desse núcleo são alvos das ações dos esteroides

ovarianos.

Em relação à forma de atuação dos esteroides ovarianos neste núcleo,

demonstramos em camundongos fêmeas que a administração de estradiol resulta em

um aumento da expressão de PR em neurônios do LC (Helena et al., 2009). Além disso,

demonstramos que o estradiol inibe a atividade dos neurônios desse núcleo (medida

pela expressão de Fos), enquanto a progesterona tem o efeito inverso, aumentando a

atividade dos mesmos (Szawka et al., 2009). Neste mesmo trabalho, demonstramos que

a frequência de potencias de ação dos neurônios do LC é diminuída pelo estradiol e

aumentada pela progesterona. Juntos, esse dados sugerem que durante o mecanismo de

feedback positivo, o papel principal do estradiol parece ser preparar esse núcleo

noradrenérgico para a ação estimulatória da progesterona.

Após todas as evidências explicitadas anteriormente, é possível considerar a NA

um importante neurotransmissor envolvido no controle do pico pré-ovulatório de LH e,

dentre os núcleos noradrenérgicos, o LC como sendo o principal núcleo envolvido nessa

regulação. Dessa maneira, considerando: 1) que o LC envia projeções para a APO, onde

estão localizados os neurônios produtores de GnRH; 2) que os neurônios deste núcleo

estão sob regulação dos esteroides ovarianos; 3) que o estradiol inibe a atividade desse

núcleo e 4) que a progesterona estimula os neurônios do LC de ratas pré-tratadas com

estradiol, nossa hipótese foi que no início período pré-ovulatório (manhã de proestro) o

aumento inicial da secreção de estradiol inibiria a atividade do LC, ao mesmo tempo em

que aumentaria a expressão de PR, tornando estes neurônios mais sensíveis à ação

posterior da progesterona, e que, no momento do pico pré-ovulatório de LH, a

progesterona ativaria o LC deflagrando este pico.

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Objetivos

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Objetivos 26

2 Objetivos

2.1 Geral

O objetivo do presente trabalho foi avaliar, em ratas ovariectomizadas

estrogenizadas, se a ativação dos neurônios do LC, e consequentemente, dos neurônios

da APO, induzida pelo tratamento com progesterona, é prevenida mediante a aplicação

de um antagonista de receptores de progesterona, o RU-486.

2.2 Específicos

Avaliar se o bloqueio dos receptores de progesterona pelo RU-486, em

ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol ou estradiol e progesterona, alterará a

expressão de FRA em neurônios da APO e de FRA/TH nos neurônios do LC.

Avaliar, por meio da dosagem de LH, se o tratamento com o bloqueador de

PR foi efetivo.

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Material e métodos

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Material e métodos 28

3 Material e métodos

3.1 Planejamento experimental

Ratas foram ovariectomizadas e tratadas, a partir do quinto dia pós-ovariectomia,

com cipionato de estradiol às 9:00 h, por três dias consecutivos. No 8º dia, receberam

injeções subcutâneas de RU-486 ou óleo às 8:00 h e de progesterona ou óleo às 10:00 h

(Grupo OVEP: tratados com óleo e progesterona. Grupo OVEP-RU: tratados com RU-486

e progesterona. Grupo OVE: tratados com óleo tanto às 8:00 h quanto às 10:00 h. Grupo

OVE-RU: tratados com RU-486 e óleo). Os animais foram perfundidos às 11 h, 13 h e 15

h. Após a perfusão, o cérebro de cada animal foi removido, congelado e processado

imunohistoquimicamente para FRA na APO e FRA/TH no LC. Antes do início da

perfusão, o sangue foi retirado do ventrículo cardíaco para dosagem de LH por

radioimunoensaio (RIE).

Figura 4: Linha esquemática do desenho experimental. OVX: ovariectomia, E2: estradiol, P4: progesterona, RIE: radioimunoensaio.

Dosagem de LH

por RIE

Cortes em

criostato da

APO e do LC

Imunohistoquímica

para FRA na APO e

FRA/TH no LC

Dia 1 Dia 5-7

Óleo

E2

Dia 8

OVX 10 h 8 h

RU 486

10 h 11 h 13 h 15 h

Óleo (OVE-RU)

P4 (OVEP-RU)

Perfusão

Amostra de

sangue do

ventrículo

Remoção

do cérebro

Óleo (OVE)

P4 (OVEP)

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Material e métodos 29

3.2 Animais

Foram utilizadas ratas Wistar adultas, pesando entre 260-280 g, mantidas em

caixas plásticas (1280 cm2) em grupos de 4 por caixa, em um ambiente de temperatura

(24 0,5 °C) e luz (12 horas claro/12 horas escuro; luzes acesas às 6:00h) controladas,

com água e ração ad libitum. Somente ratas com pelo menos três ciclos estrais regulares

e consecutivos foram utilizadas no experimento. Todos os protocolos utilizados nesse

projeto foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do campus de

Ribeirão Preto-USP, Protocolo N° 11.1.728.53.8/2011.

3.3 Ovariectomia

As ratas foram anestesiadas com uma solução de ketamina (Cloridrato de

cetamina 10%, Agener; 55 mg/Kg peso corporal, i.p.) associada a xilazina (Coopazine®,

Coopers; 10 mg/Kg peso corporal, i.p.). Os animais foram ovariectomizados

bilateralmente, segundo técnicas correntes em endocrinologia. Após esta cirurgia,

receberam tratamento profilático com antibiótico (Pentabiótico Veterinário, Fontoura-

Wyeth S.A.; 0,2 mL/animal, i.m.) e anti-inflamatório (Banamine, 2,5 mg/kg peso

corporal, Schering-Plough; 0,07 mL/rata, s.c.), sendo transferidos para caixas

individuais (570 cm2) onde permaneceram até o dia do experimento.

3.4 Tratamento hormonal

O cipionato de estradiol em veículo oleoso (Pfizer) foi injetado na dose de 10

g/0,2 mL/rata e a progesterona (Progesterona, Sigma, diluída em óleo de milho) na

dose de 2,5 mg/0,2 mL/rata, administrada 24 h após a última injeção de estradiol. A via

de administração foi subcutânea.

3.5 Tratamento com antagonista de receptores de progesterona

O RU-486, na dose de 5,2 mg/0,2 mL/rata (Mifepristona, Sigma) diluído em óleo

de milho, também foi administrado por via subcutânea, duas horas antes da

administração de progesterona. A dose do RU-486 utilizada baseou-se em experimentos

realizados pelo grupo de Sánchez-Criado (Sánchez-Criado et al., 1990, Bellido et al.,

1999), ajustando-se a dose ao peso dos animais do presente experimento.

Esse composto foi desenvolvido por pesquisadores do Russel-Uclaf em

Romainville, França, a partir da substituição do grupo 11ß na noretindrona – agonista da

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Material e métodos 30

progesterona – pelo grupo 4 dimetil-amino-fenil (Mahajan & London, 1997). O composto

recebeu o número serial da companhia RU-38486 – atualmente abreviado para RU-486

– e o nome genérico de mifepristona (Mahajan & London, 1997). Em experimentos de

ligação, o RU-486 mostrou ter elevada afinidade tanto para PR quanto para receptores

de glicocorticóide (GR) (Philibert, 1984), porém estudos mostraram que sua atividade

anticorticotrópica é observada apenas quando sua administração é crônica (Attardi et

al., 2004) ou muito elevada (Spitz & Bardin, 1993), o que não é necessário para obter um

efeito antiprogestágeno, além de não ter sido observada hipertrofia adrenal em estudos

nos quais foi utilizada a mesma dose de RU-486 do presente trabalho (Sánchez-Criado,

1990).

O RU-486 apresenta alta afinidade por PR e meia-vida metabólica prolongada;

além disso, exclui eficientemente o agonista correspondente de se ligar ao receptor,

sendo este eliminado da célula alvo ou metabolizado in situ (Mahajan & London, 1997).

Ao se ligar ao receptor, o antagonista irá fortalecer a ligação desse com suas chaperonas

associadas e irá provocar uma transconformação do domínio de interação com o ligante,

tornando-o inativo (Baulieu, 1991) e impedindo o complexo antagonista-receptor de

interagir com o DNA no elemento de resposta ao hormônio, consequentemente, não

ocorrerá a transcrição gênica (Mahajan & London, 1997).

3.6 Radioimunoensaio

Para confirmar o efeito dos esteroides ovarianos e correlacionar a atividade

central noradrenérgica com as concentrações de LH, estas foram determinadas por

radioimunoensaio de duplo anticorpo. O anticorpo primário (anti-rat LH-S11), e a

preparação padrão (LH-RP3) foram fornecidos pelo National Institute of Arthritis,

Diabetes, Digestive and Kidney Diseases (NIADDK, Baltimore, USA). O LH foi iodinado

pelo método da Cloramina T, com Iodo 125. Todas as diluições foram realizadas em

tampão fosfato gel com EDTA (pH=7.4). A fim de evitar erros inter-ensaio, todas as

amostras foram dosadas em um único ensaio. O erro intra-ensaio foi de 3,4% e o limite

mínimo de detecção de 0,04 ng/mL.

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Material e métodos 31

3.7 Processamento do cérebro para imunocitoquímica

Perfusão: Os animais foram anestesiados com ketamina e xilasina (como descrito

anteriormente), e após a anestesia e imediatamente antes do início da perfusão, uma

amostra de sangue foi retirada do ventrículo para posterior dosagem de LH. As ratas

foram perfundidas através da artéria aorta ascendente com 40 mL de tampão fosfato

salina 0,01M (PBS 0,01M: tampão fosfato 0,01M, pH 7,4, em solução de NaCl 0.9%)

contendo heparina (5UI/mL) à temperatura ambiente, seguido de 400 mL de

paraformaldeído 4% em tampão fosfato (PB) 0,1M (PFA 4%) a 4°C. Após a perfusão, os

cérebros foram pós-fixados em PFA 4% por 2 horas a 4°C.

Crioproteção: Após a fixação, os cérebros foram mergulhados em solução de

sacarose 30% diluída em tampão fosfato 0,1M (PB 0,1M), à temperatura de 4°C, até a

saturação.

Congelamento: Após a crioproteção, os cérebros foram mergulhados em

isopentano 99% (Vetec, C5H12), mantido entre -45 e -50°C de temperatura, durante 1

minuto. Logo após o congelamento, os tecidos foram armazenados a -70°C até o

momento da obtenção dos cortes em criostato.

Cortes em criostato: Foram obtidos cortes coronais seriados de 30 µm de toda a

extensão antero-posterior da APO, bem como do LC. Os cortes foram armazenados em

solução crioprotetora (Watson et al., 1986) a -20°C, onde permaneceram até a realização

da imunocitoquímica.

3.8 Imunocitoquímica

A imunocitoquímica foi realizada pelo método de “free-floating”. Antes do início

da imunocitoquímica os cortes foram lavados três vezes, por 5 minutos, em PBS 0,01M

para remoção da solução crioprotetora, na qual ficaram armazenados a –20°C após a sua

obtenção em criostato. Todos os passos de preparação do tecido foram realizados à

temperatura ambiente, com soluções diluídas em PBS 0,01M, pH=7.4, intercalados por

três lavagens com PBS durante 5 minutos.

Os cortes foram lavados rapidamente com glicina (0,1M) para eliminação do

excesso de PFA, incubados em Triton X-100 (TX-100 0,4%) por 30 minutos para

aumentar a permeabilidade celular, e incubados com água oxigenada (H202 1%), por 45

minutos, para a eliminação da peroxidase endógena. A seguir, os cortes foram lavados

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Material e métodos 32

com PBS até a eliminação da água oxigenada. As ligações inespecíficas foram bloqueadas

com a incubação por 60 minutos em albumina bovina (BSA 3%).

Incubação com os anticorpos: Os cortes foram incubados a 4°C por 40 h com

anticorpo policlonal produzido em coelho anti-FRA (k-25; Santa Cruz Biotechnology,

INC.), diluído 1:2000 em solução contendo TX-100 0,3% e BSA 1% em PBS 0,01M

(PBS+). Depois de lavados, os cortes foram incubados com um 2º anticorpo biotinilado,

uma anti-IgG de coelho produzida em cabra (BA-1000, Vector), diluído 1:600 em PBS+

durante 90 min. Após as lavagens com PBS, os cortes foram incubados com o complexo

Avidina-Biotina (KIT ABC Elite, Vectastain), por 60 minutos, diluição 1:100, à

temperatura ambiente. A seguir, foi adicionado o substrato cromógeno 3,3’-

diaminobenzidina (DAB) intensificado com sulfato de níquel (0,2 mg/mL DAB, Sigma; 25

mg/mL NiSO4, Sigma; e 1 L/mL de uma solução de H2O2 30%) em tampão acetato

0,05M (pH=7.5), por 8 minutos nos cortes da APO e 12 minutos nos do LC, e a reação foi

interrompida transferindo-se os cortes para o PBS. A seguir, somente os cortes do LC

foram lavados com H2O2 1% diluída em PBS 0,01M, durante 15 minutos, e lavados com

PBS 0,01M, quatro vezes, por 5 minutos, para posterior incubação com o anticorpo anti-

TH, produzido em camundongo (anti-TH 2, Sigma), diluído 1:500.000 em PBS+ por 40 h

a 4°C. Depois de lavados, os cortes do LC foram incubados com um 2º anticorpo

biotinilado, uma anti-IgG de camundongo produzida em cavalo (BA-2001, Vector),

diluído 1:600 em PBS+ durante 60 minutos. Após as lavagens com PBS, os cortes foram

incubados com o complexo Avidina-Biotina (KIT ABC Elite, Vectastain), por 60 minutos,

diluição 1:100, à temperatura ambiente. A seguir, foi adicionado o DAB (0,1 mg/mL DAB

e 1 L/mL de uma solução de H2O2 30%) em tampão Tris-HCl 0,05M (pH=7.6), por 15

minutos, e a reação foi interrompida transferindo-se os cortes para o PBS.

Os cortes imersos em PBS foram montados em lâminas gelatinizadas, secas à

temperatura ambiente, lavadas com etanol e xilol e cobertas com lamínulas utilizando-se

Entellan (Merck).

3.9 Análise quantitativa

As secções contendo a APO e o LC foram examinadas em um microscópio óptico

(Axioskop 2 plus, Zeiss, Germany) associado a um sistema para análise de imagens

(Axiovision 3.1, Zeiss, Germany).

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Material e métodos 33

Na APO, o número de neurônios imunorreativos ao FRA foi quantificado

bilateralmente por toda a extensão rostro-caudal do núcleo periventricular

anteroventral (AVPV) e do núcleo pré-óptico ventromedial (VMPO). No VMPO, a

contagem foi realizada de + 0.12 a - 0.12 mm do Bregma. No AVPV, foram utilizadas

caixas para delimitar a área a ser utilizada para a contagem dos neurônios. O tamanho

das caixas variou conforme o tamanho do AVPV, sendo que o tamanho utilizado a

aproximadamente + 0.12 mm do Bregma foi de 80 µm de largura (a partir da superfície

ventricular) x 160 µm de altura; ao nível do Bregma, foi de 80 µm x 240 µm e a – 0.12

mm do Bregma foi de 80 µm x 360 µm.

No LC, o número de neurônios imunorreativos a TH que expressavam FRA foi

quantificado bilateralmente por toda a extensão rostro-caudal desse núcleo, sendo a

contagem realizada de -9.48 a -10.32 mm do Bregma.

Para a contagem foi utilizado o Atlas de Paxinos e Watson (2007) como referência

para identificação das áreas analisadas.

3.10 Análise estatística

As diferenças estatísticas dos dados quantitativos obtidos foram determinadas

por análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias seguida do pós-teste de Newman-

Keuls para múltiplas análises. O nível crítico foi fixado em 5% (p<0,05) para se admitir

uma diferença de valores como estatisticamente significante.

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Resultados

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Resultados 35

4 Resultados

4.1 Efeito do RU-486 na expressão de FRA

4.1.1 No LC

A figura 5 apresenta fotomicrografias representativas do LC, com neurônios

duplamente marcados para FRA e TH em animais OVEP-RU (Figura 5A) e OVEP (Figura

5B) às 13 h. Uma vez que a maior parte do LC expressa TH (Pickel et al., 1975), a

marcação para esta proteína, observada somente no citoplasma dos neurônios, foi eficaz

na delimitação desse núcleo. Todos os neurônios imunorreativos a FRA o eram também

para TH, porém nem todos os neurônios imunorreativos a TH o eram para FRA.

Figura 5: Fotomicrografias representativas de neurônios duplamente marcados para FRA e TH no locus coeruleus de ratas OVEP-RU (A) e ratas OVEP (B) perfundidas às 13 h. Setas indicam neurônios duplamente marcados (marcação de TH é citoplasmática, enquanto a de FRA é nuclear). * Neurônios marcados apenas para TH. Escala: 50µm. 4V: quarto ventrículo.

Os animais tratados com estradiol apresentaram apenas uma tendência à

diminuição da atividade neuronal do LC. No grupo OVE-RU (Figura 6A), a atividade dos

neurônios do LC diminuiu significantemente às 13 h em relação às 11 h (P<0,05), e às 15

h, permaneceu igual às 13 h. No grupo OVEP (Figura 6B) foi observado um aumento no

número de neurônios imunorreativos a FRA e TH às 13 h, sendo que às 15 h este número

foi semelhante ao das 11 h, não havendo diferença significativa entre eles. O aumento do

4V 4V 4V

A B

*

*

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Resultados 36

número de neurônios duplamente marcados às 13 h foi bloqueado pelo RU-486

(P<0,05).

LC

11 13 150

10

20

30

40OVE

OVE-RU

#

#

Tempo (h)

mer

o d

e n

eurô

nio

s F

RA

/TH

-ir

LC

11 13 150

10

20

30

40OVEP

OVEP-RU*

#

Tempo (h)

mer

o d

e n

eurô

nio

s F

RA

/TH

-ir

Figura 6: Número de neurônios TH-ir que expressam FRA no LC de ratas OVE (A) e OVEP (B) tratadas com óleo ou RU-486 no dia do experimento e perfundidas às 11 h, 13 h e 15 h. Grupo OVE: 11 h (n=7), 13 h(n=6) e 15 h (n=6). Grupo OVE-RU: 11 h (n=9), 13 h (n=8) e 15 h (n=7); Grupo OVEP: 11 h (n=7), 13 h (n=7) e 15 h (n=7). Grupo OVEP-RU: 11 h (n=9), 13 h (n=6) e 15 h (n=8). Dados apresentados como média ± EPM. #P< 0,05 para 13 h e 15 h vs 11 h.

No grupo OVEP tratado com RU-486 o número de neurônios TH positivos

imunorreativos a FRA igualou-se àquele do grupo OVE tratado com óleo às 13 horas

(Figura 7). Nos outros horários também não houve diferença entre os dois grupos.

11 h 13 h 15 h0

5

10

15

20

OVE

OVEP-RU

LC

mer

o d

e n

eurô

nio

s F

RA

/TH

-ir

Figura 7: Número de neurônios duplamente marcados para TH e FRA de ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVE) e com estradiol, progesterona e RU-486 (OVEP-RU) nos três diferentes horários de perfusão. Dados apresentados como média ± EPM.

A B

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Resultados 37

4.1.2 Na APO

Na figura 8 são apresentados um diagrama esquemático mostrando a localização

do AVPV e do VMPO e fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos a

FRA no AVPV de ratas OVEP (Figura 8B) e OVEP-RU (Figura 8C) perfundidas às 15 h.

Figura 8: (A) Diagrama esquemático demonstrando as regiões do AVPV e VMPO analisados, de +0.12 a -0.12 mm do Bregma. A caixa representa a área selecionada para a quantificação dos neurônios imunorreativos a FRA no AVPV. (B e C) Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos a FRA no AVPV de ratas OVEP (B) e OVEP-RU (C) perfundidas às 15 h. Escala: 50 µm. 3V: terceiro ventrículo.

O número de neurônios imunorreativos a FRA do AVPV e no VMPO no grupo OVE

tratados com óleo permaneceu constante nos três horários estudados e não foi alterado

pelo tratamento com RU-486 (Figuras 9A e 9C).

Animais do grupo OVEP apresentaram às 15 h um aumento significativo (P<0,05)

do número de neurônios imunorreativos a FRA no AVPV quando comparados aos outros

dois horários (Figura 9B) e no VMPO quando comparado às 13 h (Figura 9D). Estes

aumentos de expressão de FRA foram totalmente bloqueados pelo RU-486 (P<0,05).

A B C

3V 3V

AVPV

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Resultados 38

AVPV

11 13 150

20

40

60

80OVE

OVE-RU

Tempo (h)

mer

o d

e n

eurô

nio

s F

RA

-ir

AVPV

11 13 150

20

40

60

80

*#

OVEP

OVEP-RU

Tempo (h)

mer

o d

e n

eurô

nio

s F

RA

-ir

VMPO

11 13 150

10

20

30

40

50OVE

OVE-RU

Tempo (h)

mer

o d

e n

eurô

nio

s F

RA

-ir

VMPO

11 13 150

10

20

30

40

50OVEP

OVEP-RU*†

Tempo (h)

mer

o d

e n

eurô

nio

s F

RA

-ir

Figura 9: Número de neurônios que expressam FRA no AVPV (A e B) e no VMPO (C e D) de ratas OVE (A e C) e OVEP (B e D) tratadas com óleo ou RU-486 no dia do experimento e perfundidas às 11 h, 13 h e 15 h. Número de animais utilizados: OVE 11 h (n=8), 13 h (n=9) e 15 h (n=8); OVE-RU 11 h (n=7), 13 h (n=7) e 15 h (n=7); OVEP 11 h (n=8), 13 h (n=7) e 15 h (n=6); OVEP-RU 11 h (n=9), 13 h (n=7) e 15 h (n=7).

Dados apresentados como média ± EPM. #P<0,05 15 h vs 11 e 13 h ; † P<0,05 15 h vs 13 h; *P<0,05 óleo vs RU-486 no mesmo horário.

No grupo OVE tratado com progesterona e RU-486 (OVEP-RU) o número de

neurônios imunorreativos a FRA no AVPV e no VMPO às 15 h foi semelhante àquele dos

animais tratados apenas com estradiol (Figuras 10A e 10B). Nos outros horários

também não houve diferença entre os dois grupos.

A B

C D

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Resultados 39

11 h 13 h 15 h0

10

20

30OVE

OVEP-RU

AVPVN

úm

ero

de

neu

rôn

ios

FR

A-i

rVMPO

11 h 13 h 15 h0

10

20

30OVE

OVEP-RU

mer

o d

e n

eurô

nio

s F

RA

-ir

Figura 10: Número de neurônios imunorreativos a FRA no AVPV (A) e no VMPO (B) de ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVE) e estradiol, progesterona e RU-486 (OVEP-RU) nos três diferentes horários de perfusão. Dados apresentados como média ± EPM.

4.2 Efeito do RU-486 na liberação de LH

Como esperado, o tratamento de ratas ovariectomizadas com estradiol (OVE)

provocou um aumento nas concentrações plasmáticas de LH às 15 h quando

comparadas às das 11 h e 13 h (P<0,05), o qual não foi alterado pelo RU-486 (Figura

11A).

O tratamento de ratas OVE com progesterona (OVEP; Figura 11B), induziu

aumento significante nas concentrações de LH já às 13 h, quando comparadas com os

animais das 11 h (P<0,05) e estas concentrações foram maiores às 15 h quando

comparadas às 13 h (P<0,05). O RU-486 diminuiu significantemente as concentrações de

LH tanto às 13 h, quanto às 15 h (P<0,05). Esta redução foi de 59,9% às 13 h e de

44,36% às 15 h em relação aos animais tratados com óleo.

11 13 150

2

4

6

8

10

12

14OVE

OVE-RU

#

#

Tempo (h)

LH

(n

g/m

L)

11 13 150

2

4

6

8

10

12

14OVEP

OVEP-RU

*

#

#

*#

Tempo (h)

LH

(n

g/m

L)

Figura 11: Concentração plasmática de LH de ratas ovariectomizadas tratadas (A) com estradiol (OVE) e (B) com estradiol e progesterona (OVEP). No dia do experimento, os animais foram tratados com RU-486 ou óleo às 8 h e perfundidos às 11 h, 13 h e 15 h. Número de animais utilizados: OVE 11 h (n=10), 13 h (n=7) e 15 h (n=12); OVE-RU 11 h (n=9), 13 h (n=9) e 15 h (n=12); OVEP 11 h (n=8), 13 h (n=11) e 15 h (n=10); OVEP-RU 11 h (n=8), 13 h (n=10) e 15 h (n=10). Dados apresentados como média ± EPM. #P<0,05 vs os dois outros horários dentro do mesmo grupo. *P<0,05 óleo vs RU-486 no mesmo horário.

A B

A B

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Resultados 40

No grupo OVE tratado com progesterona e RU-486 (OVEP-RU) as concentrações plasmáticas de LH tanto às 13 h como às 15 h foram semelhantes àquelas dos animais tratados apenas com estradiol (Figura 12).

11 h 13 h 15 h0

2

4

6

8OVE

OVEP-RU

LH

(n

g/m

L)

Figura 12: Concentração plasmática de LH de ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVE) e estradiol, progesterona e RU-486 (OVEP-RU) nos três diferentes horários. Dados apresentados como média ± EPM.

Page 42: Participação da noradrenalina do locus coeruleus na gênese do … · neurônios do LC, o que resulta na liberação de noradrenalina na APO com consequente aumento da atividade

Discussão

Page 43: Participação da noradrenalina do locus coeruleus na gênese do … · neurônios do LC, o que resulta na liberação de noradrenalina na APO com consequente aumento da atividade

Discussão 42

5 Discussão

Os resultados deste trabalho mostraram que o tratamento de ratas

ovariectomizadas com estradiol e progesterona promove o aumento da atividade dos

neurônios do LC às 13 h, seguido do aumento da atividade de neurônios da APO às 15 h

com concomitante aumento da secreção de LH às 15 h (início do pico pré-ovulatório). Os

dados também demonstraram que o bloqueio dos receptores para progesterona foi

capaz de bloquear o aumento da atividade do LC e da APO induzidos pela administração

de progesterona, bem como a amplificação do pico de LH induzido por estradiol.

O uso de técnicas sensíveis para mensurar a secreção hormonal, como o

radioimunoensaio, em conjunto com a técnica de imunohistoquímica para analisar a

ativação de genes que refletem a atividade neuronal permite a compreensão da

dinâmica da regulação neuroendócrina. Estas abordagens são de grande importância

para o estudo de eventos que apresentam variações rápidas e de considerável

magnitude, como é o caso dos picos pré-ovulatórios de secreção de gonadotrofinas.

A proteína expressa pelo gene c-Fos tem sido amplamente utilizada como

marcador de atividade neuronal devido sua expressão ser rapidamente ativada por

inúmeros estímulos que aumentam a atividade do neurônio (Hoffman e Lyo, 2002).

Neste sentido, o uso de antígenos relacionados à Fos (FRA) tem se mostrado ainda mais

importante, por possibilitar a avaliação tanto da atividade aumentada (Lerant et al.,

2001) quanto suprimida (Bailey et al., 2006) nos neurônios, além de neurônios em

atividade tônica (Hoffman et al., 1994). O fato da proteína expressa pelo gene c-Fos ser

nuclear permite a marcação dupla de neurônios ativados com a finalidade de determinar

a identidade de seu neurotransmissor (Hoffman e Lyo, 2002).

O anticorpo para FRA utilizado neste trabalho reconhece todos os membros

conhecidos da família Fos – c-Fos, Fos B, Fra-1 e Fra-2 (Szawka et al., 2009). Sua

utilização se mostrou essencial, visto que o tratamento com RU-486 provocaria uma

inibição da ação da progesterona em neurônios do LC. De fato, este anticorpo mostrou

ser útil na detecção de variações na atividade de neurônios do LC, mostrando o

envolvimento deste núcleo na regulação dos picos de prolactina (Szawka et al., 2005) e

de LH (Szawka et al., 2009), e na síndrome do ovário policístico induzida por estresse

por frio (Bernuci et al., 2008).

Estudos do nosso laboratório já demonstraram por meio da avaliação da

expressão de FRA, que na manhã e início da tarde do proestro, quando as concentrações

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Discussão 43

de estradiol aumentam, ocorre uma inibição dos neurônios do LC; este mesmo efeito

inibitório do estradiol foi observado em ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol

(Szawka et al., 2009). Estudos de eletrofisiologia demonstraram também que o estradiol

diminui a frequência dos potenciais de ação do LC, reforçando os dados anteriores que

sugeriam um efeito inibitório do estradiol sobre os neurônios do LC (Szawka et al.,

2009). Em estudos subsequentes demonstramos que o tratamento de ratas

ovariectomizadas apenas com estradiol inibe a secreção de NA no período da manhã,

mas induz um pico deste neurotransmissor partir das 15 h sugerindo que neurônios

noradrenérgicos sejam ativados a partir deste horário (dados não publicados). De fato,

no presente estudo, observamos um aumento significativo da secreção de LH neste

grupo às 15 horas, o que coincide com o período de aumento da liberação de NA na APO.

Por outro lado, a atividade deste núcleo foi constante nos três horários estudados. Uma

vez que a atividade dos neurônios do LC parece aumentar por volta das 15 h, seria

esperado que a marcação de um maior número de neurônio com FRA só fosse detectada

a partir das 17 h, o que não foi possível observar desde que o estudo foi realizado até às

15 horas. Como esperado, o bloqueio dos receptores de progesterona não interferiu na

atividade do LC como também não interferiu na magnitude ou no momento do aumento

de LH nas ratas tratadas apenas com estradiol.

Já está bem estabelecido que a progesterona amplifica e antecipa os picos de

gonadotrofinas em ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol (Everett, 1948; Krey

et al., 1973). De acordo com Levine (1997), o tratamento com estradiol induziria a

síntese de PR e a progesterona atuaria diretamente sobre eles, promovendo a

transativação de uma quantidade maior de receptores e, desta forma, amplificando as

respostas transcricionais que medeiam a síntese e liberação de GnRH e,

consequentemente de LH. Nós já demonstramos que o estradiol induz a síntese de PR

nos neurônios do LC (Helena et al., 2009) e a queda nas concentrações de LH em reposta

ao bloqueio dos PRs reforçam a ideia de que a ativação do PR é imprescindível para a

ocorrência dos picos pré-ovulatórios de gonadotrofinas.

Na tarde do proestro, quando há um aumento na secreção de progesterona, há

um aumento na expressão de FRA no LC, e a injeção de progesterona também é eficaz

em aumentar a atividade dos neurônios do LC em ratas ovariectomizadas e

estrogenizadas. Este efeito estimulador da progesterona foi confirmado em estudos de

eletrofisiologia onde foi demonstrado que este esteroide provoca um aumento da

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Discussão 44

frequência de potenciais de ação nos neurônios do LC de ratas OVE (Szawka et al., 2009).

Em estudos de microdiálise do nosso laboratório, foi observado um aumento da

liberação de NA na APO por volta das 14 horas do proestro, quando inicia-se o aumento

da secreção de progesterona (Szawka et al., 2007). Além disso, a injeção de progesterona

às 10 h em ratas OVE aumenta drasticamente a liberação de NA na APO entre 10 e 12 h,

confirmando o efeito estimulatório da progesterona em neurônios noradrenérgicos. Este

aumento antecipado e amplificado de NA também antecipa e amplifica o pico pré-

ovulatório de LH (dados não publicados).

Os resultados obtidos no presente trabalho reforçam estes dados uma vez que

um aumento da atividade neuronal no LC foi observado já às 13 h nas ratas

estrogenizadas nas quais a progesterona foi injetada às 10 h. A imunorreatividade de c-

Fos atinge seu máximo de 1 h a 2 h após a ativação neuronal, devido ao acúmulo de seu

RNAm no citoplasma por este período e posterior tradução das proteínas (Morgan &

Curran, 1989). Desde que, como citado acima, há um aumento na liberação de NA entre

10h e 12 h em ratas OVE tratadas com progesterona às 10 horas, é possível inferir que

este aumento na atividade do LC observado às 13 h em nosso estudo possivelmente

ocorreu por volta das 11-12 h, ou seja, logo após o tratamento com a progesterona.

Este aumento de atividade do LC parece ter sido responsável pela antecipação e

amplificação do pico de LH uma vez que já às 13 h houve um aumento significativo das

concentrações deste hormônio e que estas concentrações, às 13 e 15 h, foram

significantemente maiores do que aquelas do grupo OVE nos mesmos horários.

Adicionalmente, nossos resultados demonstram que a inibição dos PRs preveniu

o efeito estimulatório da progesterona no LC bem como na secreção de LH. As ratas

OVEP tratadas com antagonista de receptores para a progesterona exibiram número de

neurônios FRA positivos no LC e concentrações de LH similares ao grupo tratado apenas

com estradiol. Este dado sugere que o efeito da progesterona no LC seja responsável

pela amplificação e antecipação do pico de LH. De fato, em experimentos recentes do

nosso laboratório, foi demonstrado que o estradiol é capaz de estimular os neurônios do

grupo noradrenérgico A2 (mas não A1) enquanto a progesterona ativa os neurônios do

LC que se projetam para a APO, mas não os neurônios dos grupos A1 e A2. Estes dados

sugeriram que o grupo A2 (mas não o LC ou o A1) poderia estar envolvido com o pico de

LH induzido pelo estradiol, enquanto que a amplificação e antecipação do pico de LH

induzido pelo estradiol seriam atribuídas ao LC (dados não publicados). De fato injeção

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Discussão 45

intraventricular de DSP-4, uma substância que destrói seletivamente os terminais

noradrenérgicos do LC, aboliu a amplificação do pico e preservou o pico de LH da

magnitude daquele induzido apenas pelo estradiol (dados não publicados do nosso

laboratório). Estes dados demonstraram que, de fato, o estradiol induz um pico de LH

via ativação do A2 e a progesterona antecipa e amplifica este pico via ativação do LC.

Os dados do presente estudo corroboram esta ideia uma vez que após o bloqueio

dos receptores de progesterona pelo RU-486, o pico de LH induzido apenas pelo

estradiol parece ter sido preservado.

A análise da atividade neuronal das regiões do AVPV e do VMPO da APO mostrou

que não há variação da atividade destes neurônios nos animais tratados apenas com

estradiol nos horários estudados. No entanto, o tratamento de ratas OVE com

progesterona provocou um aumento da atividade neuronal às 15. O bloqueio deste

aumento de atividade pelo RU-486 indica que a progesterona seja essencial para a

estimulação destes neurônios.

A APO, que inclui as sub-regiões avaliadas neste estudo, AVPV e VMPO, concentra

grande parte dos neurônios GnRH (Simonian et al., 1999). Como citado anteriormente

não há expressão de ERα (Herbison e Theodosis, 1992) e de PR (Fox et al.1990) nos

neurônios GnRH. Portanto, a modulação de tais neurônios pelos esteroides ovarianos

ocorre de forma indireta. Na APO são encontrados não somente neurônios GnRH

positivos, que não expressam receptores para os esteroides ovarianos, mas também

interneurônios que expressam ER e PR, os quais modulam a atividade dos neurônios

GnRH. É Importante ressaltar que esta ação modulatória não se restringe somente aos

neurônios situados próximos aos neurônios GnRH. Neurônios localizados em regiões

distantes da APO podem também modular direta ou indiretamente a atividade dos

neurônios GnRH, como é o caso dos neurônios noradrenérgicos pontinos que enviam

projeções diretas aos neurônios GnRH e indiretas, para outros neurônios da APO

(Herbison, 1998). Além disso, estudos utilizando marcação retrógrada mostraram

projeções diretas de neurônios do LC para neurônios GnRH da porção rostral da APO de

camundongos (Campbell & Herbison, 2007). No entanto, este estudo não permite

identificar se o efeito estimulatório da NA do LC é exercido diretamente nos neurônios

GnRH ou indiretamente, via interneurônios.

Os resultados sugerem fortemente haver uma relação temporal entre os

parâmetros analisados. O aumento do número de neurônios da APO que expressam FRA

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Discussão 46

às 15 h nos animais OVEP sugere que estes neurônios devam ter sido ativados por volta

das 13 h, momento em que também se observa um aumento inicial das concentrações

plasmáticas de LH. Esta associação temporal entre o aumento na expressão de c-Fos na

APO e o pico de LH constituíram as primeiras evidências diretas de que a atividade

celular dos neurônios GnRH acompanha os picos de LH (Hoffman et al., 1993).

Uma vez que este aumento de atividade na APO (às 15 h) é observado

posteriormente àquele observado no LC (às 13 h), é possível que ele seja consequente à

estimulação do LC, cujos neurônios, sabidamente, se projetam para a APO. Por sua vez, a

atividade dos neurônios do LC é aumentada por ação da progesterona. Esta ação da

progesterona em deflagrar a liberação de LH por induzir a liberação de NA foi por nós

confirmada em experimentos de microdiálise reversa em ratas OVE, nos quais a NA

infundida diretamente na APO de animais OVE induziu um pico de LH com o mesmo

perfil e mesma magnitude daquele induzido pela progesterona, bem como um aumento

da atividade do AVPV (dados não publicados). Os dados sugerem, portanto, que a

progesterona ativa os neurônios do LC, que por sua vez estimulam neurônios da APO, os

quais rapidamente induzem o pico de LH.

Já está bem esclarecido na literatura, que o tratamento de ratas em proestro com

RU-486 provoca redução da amplitude do pico pré-ovulatório de LH (Rao & Mahesh,

1986; Lee et al., 1990b; Sánchez-Criado et al., 1990; Bauer-Dantoin et al., 1993). No

entanto, foi também mostrado que a administração do antagonista da progesterona,

ZK98299, em ratas ovariectomizadas estrogenizadas bloqueia o pico de LH induzido por

estradiol (Chappell & Levine, 2000). Esses autores associaram tal bloqueio com a

transativação de PR a partir de sinais neurais, os quais irão direcionar o início e, desta

forma, o momento apropriado para a ocorrência do pico de GnRH (Levine et al., 2001).

Nossos dados mostram que, na ausência da progesterona (grupo OVE), o bloqueio de PR

não modificou a liberação de LH, o que indica que, neste modelo experimental, a

ativação de PR foi exclusivamente dependente do ligante, não ocorrendo o mecanismo

de transativação de PR proposto por Levine et al. (2001). Por outro lado, nas ratas

tratadas com progesterona foi observada uma redução da amplitude do pico de LH pelo

RU-486. Esta redução foi precedida por uma diminuição da atividade dos neurônios da

APO, o que por sua vez parece ter sido consequência da redução de atividade dos

neurônios do LC. Portanto, o bloqueio do aumento de atividade dos neurônios

noradrenérgicos do LC aferentes aos interneurônios da APO que modulam a secreção de

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Discussão 47

GnRH pode ser um dos mecanismos pelos quais o RU-486 atenua o pico pré-ovulatório

de LH.

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Conclusão

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Conclusão 49

6 Conclusão

O conjunto de dados obtidos neste trabalho mostra que em ratas estrogenizadas

a progesterona, por meio de seus receptores localizados no LC, aumenta a atividade

deste núcleo por volta das 11 h; a noradrenalina liberada provoca o aumento da

atividade nos neurônios da APO por volta das 13 h, consequentemente aumentando a

secreção de GnRH o que, por sua vez, amplifica o pico de LH induzido por estradiol.

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Referências bibliográficas

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