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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
“Participação da noradrenalina do locus coeruleus na
gênese do pico pré-ovulatório de gonadotrofinas”
Maria Izabel Martinez da Matta
Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a
obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas
RIBEIRÃO PRETO - SP
2012
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
“Participação da noradrenalina do locus coeruleus na
gênese do pico pré-ovulatório de gonadotrofinas”
Maria Izabel Martinez da Matta
Orientadora: Profa. Dra. Janete A. Anselmo Franci
Co-orientadora: Dra. Cristiane Mota Leite
Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a
obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas
RIBEIRÃO PRETO - SP
2012
FOLHA DE APROVAÇÃO
Maria Izabel Martinez da Matta
Participação da noradrenalina do locus coeruleus na gênese do pico pré-ovulatório de
gonadotrofinas
Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a
obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas
Orientadora: Profa. Dra. Janete A. Anselmo-Franci
Co-orientadora: Dra. Cristiane Mota Leite
Área de concentração: Fisiologia
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. ___________________________________________________________________________________________
Instituição: ________________________________________________ Assinatura __________________________
Prof. Dr. ___________________________________________________________________________________________
Instituição: _______________________________________________ Assinatura ___________________________
Prof. Dr. ___________________________________________________________________________________________
Instituição: _______________________________________________ Assinatura ___________________________
Dedico este trabalho aos meus pais, Onivaldo da Matta Junior e Lêda
Martinez da Matta, os quais sempre lutaram para que eu pudesse realizar
meus sonhos e me apoiaram em todas as minhas escolhas. Obrigada por
serem minha fortaleza e pelo amor incondicional!
AGRADECIMENTOS
Aos meus irmãos, Thiago, Gustavo e Marina pelo cuidado, proteção e amizade. Em
especial à minha sobrinha Laura, por conseguir me alegrar sempre com seu amor e
inocência, característicos de uma criança.
À minha orientadora, Profa. Dra. Janete A. Anselmo Franci, pelo apoio, paciência,
amizade e pelos ensinamentos de caráter científico e pessoal ao longo de nossa
convivência.
Aos meus colegas de laboratório Aline, Bruna, Cristiane, Leonardo, Nayara, Paulo e Talita
pela ajuda, amizade e convivência agradável no ambiente de trabalho, assim como nos
momentos de lazer. Agradeço em especial à Cristiane Mota Leite por sua constante
disposição e paciência em me ajudar e ensinar.
Ao Maicon, Ruither e Yan pelo apoio técnico no laboratório e pelas horas de
descontração.
Ao Prof. Celso Rodrigues Franci por disponibilizar seu laboratório para as dosagens
hormonais.
Aos meus amigos Aline, Diógenes, Laura, Luísa, Lívea, Nayara e Rafael, pela amizade
verdadeira, pelos momentos maravilhosos compartilhados, de alegria e diversão, e pelo
apoio presente em todos os momentos ao longo desses anos. Agradeço em especial à
Letícia pelas conversas em momentos difíceis, pelas risadas, pelos conselhos e pela
amizade sincera; e à Júlia pela ótima convivência e por vivenciar comigo, dia a dia,
minhas aflições a alegrias.
Ao Rafael por estar sempre presente, me guiando e incentivando nos momentos de
dificuldade, pela cumplicidade, carinho, afeto e amor dedicados de maneira única.
Agradeço pela paciência, compreensão e pelos inesquecíveis momentos que
compartilhamos!
Aos animais pelo sacrifício.
À FAPESP pelo apoio financeiro.
RESUMO
MATTA, M. I. M. Participação da noradrenalina do locus coeruleus na gênese do
pico pré-ovulatório de gonadotrofinas. 2012. Monografia. Faculdade de Filosofia
Ciências e Letras de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012.
O ciclo reprodutivo de ratas é caracterizado pela ocorrência de picos pré-
ovulatórios de gonadotrofinas induzidos pelos esteroides ovarianos. A noradrenalina é
um dos principais neurotransmissores envolvidos na regulação do eixo hipotalâmico-
pituitário-gonadal, sendo os neurônios noradrenérgicos importantes mediadores das
ações dos esteroides ovarianos que culminam com os picos de gonadotrofinas. Visto que
o locus coeruleus (LC) envia projeções para a área pré-óptica (APO), onde estão
localizados os neurônios produtores de hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH);
que os neurônios deste núcleo estão sob regulação dos esteroides ovarianos e que o
estradiol parece inibir o LC enquanto a progesterona o estimula, este trabalho tem o
objetivo de avaliar, em ratas ovariectomizadas, se a ativação dos neurônios do LC
induzida pelo tratamento com esteroides ovarianos e, consequentemente, dos neurônios
da APO, é prevenida mediante a aplicação de um antagonista de receptores de
progesterona (PR). Para tal, ratas ovariectomizadas foram tratadas com estradiol às 9 h
por três dias consecutivos (do 5º ao 7º dia pós-castração). No 8º dia, os animais
receberam uma injeção de progesterona ou óleo às 10 h. Duas horas antes do
tratamento com progesterona, os animais foram tratados com o bloqueador de PRs RU-
486 ou óleo de milho (Grupo controle). As ratas foram perfundidas às 11, 13 e 15 h.
Após a anestesia e imediatamente antes do início da perfusão, uma amostra de sangue
foi retirada do ventrículo para a dosagem de hormônio luteinizante (LH). Cortes
seriados de 30 μm da APO e do LC obtidos em criostato foram submetidos à
imunocitoquímica para FRA nas regiões AVPV e VMPO da APO e à dupla marcação
imunocitoquímica para FRA e tirosina hidroxilase (TH) no LC. A avaliação das alterações
na atividade dos neurônios nesses núcleos foi feita por meio da contagem do número de
neurônios marcados para FRA na APO e duplamente marcados para FRA/TH no LC. O
tratamento com progesterona em ratas ovariectomizadas estrogenizadas promove o
aumento da atividade do LC, seguido do aumento da atividade da APO, ocasionando a
amplificação do pico de LH induzido pelo estradiol. O bloqueio de PR pelo RU-486 foi
capaz de bloquear o efeito deste esteroide ovariano, atenuando o pico de LH, o qual se
igualou àquele dos animais tratados apenas com estradiol. Os dados sugerem que a
progesterona amplifica o pico de LH induzido pelo estradiol por meio da ativação dos
neurônios do LC, o que resulta na liberação de noradrenalina na APO com consequente
aumento da atividade desta área que culmina com a amplificação da liberação de GnRH
resultando no pico pré-ovulatório de LH.
Palavras-chave: progesterona, RU-486, hormônio luteinizante, locus coeruleus, área
pré-óptica, imunohistoquímica.
ABSTRACT
MATTA, M. I. M. Locus coeruleus noradrenaline participation on the genesis of
gonadotropins preovulatory surges. 2012. Monografia. Faculdade de Filosofia
Ciências e Letras de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012.
Rats’ reproductive cycle is characterized by the occurrence of gonadotropins
preovulatory surges induced by ovarian steroids. Noradrenaline is one of the major
neurotransmitter involved on the regulation of the hypothalamus-pituitary-gonadal axis,
being the noradrenergic neurons important mediators of ovarian steroids’ actions which
culminate with gonadotropins surges. Since locus coeruleus (LC) sends projections to
the preoptic area (APO), where gonadotropin-releasing hormone (GnRH) producers
neurons are localized; neurons from this noradrenergic nucleus are under ovarian
steroids control and estradiol seems to inhibit LC meanwhile progesterone stimulates it,
the aim of this study was to evaluate, in ovariectomized female rats, if the activation of
LC neurons induced by ovarian steroids treatment and, therefore, of APO neurons, is
prevented by the administration of a progesterone receptor’s (PR) antagonist. For this
purpose, ovariectomized female rats were treated with estradiol at 9 a.m. for three
consecutive days (from 5th till 7th days after castration). By the 8th day, the animals
received a single injection of progesterone or corn oil at 10 a.m. Two hours before
progesterone’s treatment, animals were treated with PRs antagonist RU-486 or corn oil.
Rats where perfused at 11 a.m., 13 p.m. and 15 p.m. After anesthesia and immediately
before the perfusion, a blood sample was collected from the cardiac ventricle for the
luteinizing hormone (LH) dosage. Serial slices of 30 μm from the APO and LC obtained in
criostate were submitted to immunohistochemistry for FRA on AVPV and VMPO regions
from the APO and double label for FRA and tyrosine hydroxylase (TH) at the LC. The
evaluation of changes on the activity of these nuclei neurons was performed by counting
the number of neurons immunoreactive to FRA at the APO and double labeled to
FRA/TH at the LC. The treatment with progesterone in ovariectomized estrogenized
female rats promotes the increase on LC activity, followed by increase on APO activity,
resulting on the amplification of the LH surge induced by estradiol. The block of PR by
RU-486 was able to block this ovarian steroid’s effect, attenuating the LH surge, which
was equal as the one presented by animals treated only with estradiol. The data suggest
that progesterone amplifies estradiol-induced LH surge by activating LC neurons, this
results on noradrenaline release on the APO with consequent increase on this area
activity which culminates with the amplification of GnRH release resulting on LH
preovulatory surge.
Keywords: progesterone, RU-486, luteinizing hormone, locus coeruleus, preoptic area,
immunohistochemistry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Pefil hormonal de ratas.............................................................................................................18
Figura 2: Perfil hormonal da secreção de LH em ratas ciclando e ratas ovariectomizadas
com ou sem injeções diárias de estradiol seguidas ou não da injeção de
progesterona......................................................................................................................................................20
Figura 3: Representação esquemática dos mecanismos envolvidos na retroalimentação
positiva do GnRH e gonadotrofinas pelos esteroides ovarianos..................................................21
Figura 4: Linha esquemática do desenho experimental.................................................................28
Figura 5: Fotomicrografias representativas de neurônios duplamente marcados para
FRA e TH no locus coeruleus de ratas OVEP-RU (A) e ratas OVEP (B) perfundidas às 13
h.............................................................................................................................. ..................................................35
Figura 6: Número de neurônios TH-ir que expressam FRA no LC de ratas OVE (A) e
OVEP (B) tratadas com óleo ou RU-486 no dia do experimento e perfundidas às 11 h, 13
h e 15 h..................................................................................................................................................................36
Figura 7: Número de neurônios duplamente marcados para TH e FRA de ratas
ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVE) e com estradiol, progesterona e RU-486
(OVEP-RU) nos três diferentes horários de perfusão.......................................................................36
Figura 8: (A) Diagrama esquemático demonstrando as regiões do AVPV e VMPO
analisados, de +0.12 a -0.12 mm do Bregma. A caixa representa a área selecionada para a
quantificação dos neurônios imunorreativos a FRA no AVPV. (B e C) Fotomicrografias
representativas de neurônios imunorreativos a FRA no AVPV de ratas OVEP (B) e OVEP-
RU (C) perfundidas às 15 h..........................................................................................................................37
Figura 9: Número de neurônios que expressam FRA no AVPV (A e B) e no VMPO (C e D)
de ratas OVE (A e C) e OVEP (B e D) tratadas com óleo ou RU-486 no dia do
experimento e perfundidas às 11 h, 13 h e 15 h.................................................................................38
Figura 10: Número de neurônios imunorreativos a FRA no AVPV (A) e no VMPO (B) de
ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVE) e estradiol, progesterona e RU-486
(OVEP-RU) nos três diferentes horários de perfusão.......................................................................39
Figura 11: Concentração plasmática de LH de ratas ovariectomizadas tratadas (A) com
estradiol (OVE) e (B) com estradiol e progesterona (OVEP). No dia do experimento, os
animais foram tratados com RU-486 ou óleo às 8 h e perfundidos às 11 h, 13 h e 15
h................................................................................................................................................................................39
Figura 12: Concentração plasmática de LH de ratas ovariectomizadas tratadas com
estradiol (OVE) e estradiol, progesterona e RU-486 (OVEP-RU) nos três diferentes
horários.............................................................................................................................. ...................................40
LISTA DE SIGLAS
ABC – do inglês “avidin-biotin complex” ou complexo avidina-biotina
APO – área pré-óptica
APOM – área pré-óptica medial
AVPV – do inglês “anteroventral periventricular nucleus” ou núcleo periventricular
anteroventral
BSA – do inglês “bovine serum albumin” ou albumina sérica bovina HPG – eixo
hipotálamo-hipófise-gonadal
DAB – 3,3’ diaminobenzidina
DBH – dopamina beta-hidroxilase
EDTA – do inglês “ethylenediamine tetraacetic acid” ou ácido etilenodiamino tetra-
acético
EM – eminência mediana
ERα – do inglês “estradiol receptor alpha” ou receptor para estradiol tipo alpha
ERß – do inglês “estradiol receptor beta” ou receptor para estradiol tipo beta
FRA – do inglês “Fos-related antigens” ou antígenos relacionados à Fos
FSH – do inglês “follicle-stimulating hormone” ou hormônio folículo estimulante
GABA – do inglês “gamma aminobutyric acid” ou ácido gama-aminobutírico
GnRH – do inglês “gonadotropin-releasing hormone” ou hormônio liberador de
gonadotrofinas
GR – do inglês “glucocorticoid receptor” ou receptor para glicocorticóide
H2O2 – peróxido de hidrogênio ou água oxigenada
HMB – hipotálamo médio basal
ICC – imunocitoquímica
LC – locus coeruleus
LH – do inglês “luteinizing hormone” ou hormônio luteinizante
NA – noradrenalina
NiSO4 – sulfato de níquel
OVX – ovariectomia
PB – do inglês “phosphate buffer” ou tampão fosfato
PR – do inglês “progestin receptor” ou receptor para progesterona
PBS – do inglês “phosphate buffered saline” ou tampão fosfato salina
PFA – paraformaldeído
RIE – radioimunoensaio
TH – tirosina hidroxilase
TX-100 – Triton X-100
VMPO – do inglês “ventromedial preoptic nucleus” ou núcleo pré-óptico ventromedial
SUMÁRIO
1 Introdução.................................................................................................................................................. 16
1.1 Controle neuroendócrino da secreção de gonadotrofinas ................................................ 17
1.2 Regulação noradrenérgica da secreção de gonadotrofinas .............................................. 22
1.2.1 Participação do locus coeruleus .......................................................................................... 23
2 Objetivos ..................................................................................................................................................... 25
2.1 Geral ....................................................................................................................................................... 26
2.2 Específicos ........................................................................................................................................... 26
3 Material e métodos ................................................................................................................................ 27
3.1 Planejamento experimental .......................................................................................................... 28
3.2 Animais ................................................................................................................................................. 29
3.3 Ovariectomia ....................................................................................................................................... 29
3.4 Tratamento hormonal ..................................................................................................................... 29
3.5 Tratamento com antagonista de receptores de progesterona ........................................ 29
3.6 Radioimunoensaio ............................................................................................................................ 30
3.7 Processamento do cérebro para imunocitoquímica ............................................................ 31
3.8 Imunocitoquímica ............................................................................................................................. 31
3.9 Análise quantitativa ......................................................................................................................... 32
3.10 Análise estatística ........................................................................................................................... 33
4 Resultados .................................................................................................................................................. 34
4.1 Efeito do RU-486 na expressão de FRA .................................................................................... 35
4.1.1 No LC .............................................................................................................................................. 35
4.1.2 Na APO ........................................................................................................................................... 37
4.2 Efeito do RU-486 na liberação de LH ......................................................................................... 39
5 Discussão .................................................................................................................................................... 41
6 Conclusão .................................................................................................................................................... 48
7 Referências bibliográficas ................................................................................................................. 50
Introdução
Introdução 17
1 Introdução
O ciclo ovulatório é um processo complexo que envolve a coordenação de uma
série de eventos neuroendócrinos controlados pelo eixo hipotálmo-hipófise-gonadal
(HPG).
Há muitas décadas têm sido investigados os mecanismos pelos quais os
esteroides ovarianos induzem a ovulação e limitam este evento a um único período do
ciclo, conhecido como período periovulatório (Schwartz & McCormack, 1972; Wise et al.,
1981; Levine, 1997; Herbison, 1998). No entanto, embora estes mecanismos tenham
sido sistematicamente investigados ainda existem muitas lacunas que dificultam sua
total compreensão.
1.1 Controle neuroendócrino da secreção de gonadotrofinas
O principal evento no ciclo reprodutivo de animais que ovulam espontaneamente,
como a mulher e a rata, é o pico pré-ovulatório de gonadotrofinas – hormônios folículo
estimulante (FSH) e luteinizante (LH) –, o qual leva à ovulação. Os dois principais
eventos que mediam tal acontecimento são a neurossecreção do pico pré-ovulatório do
hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) e um aumento agudo na responsividade
da hipófise a essa neurossecreção, ambos dependentes de esteroides ovarianos (Levine,
1997).
A maior parte do conhecimento sobre o ciclo ovariano dos ovuladores
espontâneos se deve aos estudos realizados sobre o ciclo estral de ratas. Este animal é
um bom modelo experimental por apresentar ovulação espontânea e um perfil de
variação de gonadotrofinas bastante semelhante ao da mulher. O ciclo estral de ratas
dura, em média, de 4-5 dias. O dia do estro é o único período em que a fêmea é receptiva
ao macho e quando a ovulação e o coito ocorrem. Esta fase é precedida pelo dia de
proestro, no qual ocorrem os picos pré-ovulatórios de gonadotrofinas que induzem a
ovulação. Se não há concepção, o estro é seguido por dois dias de recuperação
denominados metaestro (ou diestro I) e diestro (ou diestro II). Segue-se a esta última
fase um novo proestro (Heape, 1992).
Durante o ciclo estral, a concentração plasmática de estradiol começa a aumentar
na tarde do diestro e alcança as maiores concentrações ao redor do meio dia do proestro
(Figura 1). No fim da tarde, estas caem rapidamente atingindo valores basais no início da
madrugada do estro. As concentrações de progesterona aumentam durante a tarde e
Introdução 18
noite do proestro, quase simultaneamente com pico pré-ovulatório de LH, atinge o pico
juntamente com LH e retorna às concentrações basais na manhã do estro. Este pico de
progesterona é de origem folicular. Um segundo pico deste hormônio, de origem luteal,
inicia-se ao meio dia do metaestro, mantém-se na madrugada de diestro e diminui para
concentrações basais no início da manhã deste dia (Smith et al., 1975). As concentrações
plasmáticas de LH começam a aumentar rapidamente entre duas e três horas da tarde
do proestro alcançando o pico por volta das 5 às 6 horas da tarde. Este aumento rápido
de LH induz a ruptura do folículo e ovulação. Após o pico, há uma rápida queda nas
concentrações deste hormônio. O padrão de secreção de FSH no ciclo estral é
semelhante ao do LH, mas na madrugada do estro, por volta das 3 horas, ocorre um pico
secundário de FSH (Smith et al., 1975).
Figura 1: Pefil hormonal de ratas (Anselmo-Franci and Szawka, 2005; modificado de Smith et al., 1975).
Em ratos, os neurônios GnRH estão distribuídos ao longo da base do cérebro, se
estendendo do septo medial da banda diagonal de Broca, através da área pré-óptica
(APO) e no interior do hipotálamo (Kawano & Daikoku, 1981; Silverman et al., 1994).
Estudos mostraram que o sistema GnRH do cérebro de ratos é difuso, complexo e
multifuncional (Merchenthaler, 1984). A subpopulação da porção rostral da área pré-
óptica medial (APOM) – onde se localizam os núcleos periventricular anteroventral
Introdução 19
(AVPV) e pré-óptico ventromedial (VMPO) – além de conter neurônios GnRH também
contém interneurônios que expressam receptores para estradiol e progesterona,
constituindo assim um local fisiologicamente importante para a ação destes esteroides
(Simonian et al., 1999; Herbison, 2008). De fato, lesões no AVPV resultaram na abolição
do pico de LH induzido por estradiol ou estradiol e progesterona (Wiegand & Terasawa,
1982), mostrando que este núcleo é um local crítico para a regulação dos picos de GnRH
e LH pelos esteroides ovarianos.
O GnRH é liberado no hipotálamo médio basal, no plexo capilar primário da
eminência mediana (EM) e, através dos vasos porta longos do sistema porta-hipofisário,
alcança a hipófise onde atua diretamente nos gonadotrofos. Esse neuro-hormônio é
liberado de maneira pulsátil e seus pulsos estão intimamente associados aos pulsos de
LH (Levine & Duffy, 1988). Durante a tarde do proestro, o pico pré-ovulatório de LH é
desencadeado pelo aumento da liberação de GnRH na EM (Levine & Ramirez, 1982).
A liberação de gonadotrofinas ao longo do ciclo estral é controlada por ações de
feedback exercidas pelos esteroides gonadais (Schwartz & McCormack, 1972). Na maior
parte do ciclo os estrogênios e a progesterona exercem uma ação de feedback negativo
na secreção de gonadotrofinas, o que é comprovado pelo aumento na concentração
plasmática de LH após a remoção dos ovários (Tapper et al., 1971). Por outro lado, o
pico pré-ovulatório de gonadotrofinas da tarde do proestro, depende de um feedback
positivo, resultado do aumento crescente das concentrações estrogênicas e
posteriormente de progesterona associado a um sinal neural circadiano (Levine, 1997).
A ação de feedback positivo de estrogênio tem sido demonstrada experimentalmente por
meio da administração de antagonista (Shirley et al., 1968) ou anticorpo (Neill et al.,
1971) contra estradiol, os quais bloqueiam os picos pré-ovulatórios de LH. Outro
modelo que corrobora essa hipótese é a ocorrência de um pico diário de LH no período
da tarde em ratas ovariectomizadas tratadas apenas com estradiol (Legan & Karch,
1975).
A administração de progesterona em ratas ovariectomizadas tratadas com
estradiol antecipa e amplifica o pico diário de LH e impede a ocorrência do pico do dia
seguinte (Krey et al., 1973), à semelhança do observado na tarde do proestro (Figura 2).
O bloqueio da ação da progesterona por meio da administração do antagonista do
receptor de progesterona, RU-486, resulta na manutenção do pico diário de
gonadotrofinas induzido apenas por estradiol (Sánchez-Criado et al., 1997). Em ratas no
Introdução 20
proestro, a administração de RU-486 bloqueia o pico de LH endógeno (Sánches-Criado et
al, 1990 & Bauer-Dantoin et al., 1993) e inibe a expressão da proteína Fos (um marcador
de atividade neuronal) nos neurônios GnRH, indicando o papel estimulador da
progesterona nos neurônios GnRH (Lee et al, 1990a; 1990b).
Figura 2: Perfil hormonal da secreção de LH em ratas ciclando e ratas ovariectomizadas com ou sem injeções diárias de estradiol (E2) seguidas ou não da injeção de progesterona (P4). A secreção de LH permanece baixa ao longo do ciclo, aumentando agudamente na tarde do proestro, o que desencadeia a ovulação. A ovariectomia (OV) induz o aumento da secreção de LH, devido a perda do feedback negativo, que é revertido pela injeção de estradiol. A reposição de estradiol por, pelo menos, dois dias consecutivos, nas ratas ovariectomizadas, induz picos diários de LH, por volta das 17 h, de menor magnitude do que o do proestro. Uma injeção única de progesterona, nas ratas estrogenizadas, antecipa em uma hora e amplifica o pico circadiano induzido pelo estradiol. As barras escuras na abscissa indicam o período noturno (Anselmo-Franci & Szawka, 2005).
Embora a ação dos esteroides ovarianos sobre a liberação de GnRH e de
gonadotrofinas tenha sido comprovada por diferentes estudos, os mecanismos dessa
regulação ainda não estão bem estabelecidos. A ação direta dos esteroides sobre os
neurônios GnRH tem sido bastante questionada. Já na década de 80, Shivers e
colaboradores (1983) mostraram que o estradiol não se concentra nestes neurônios o
que sugeria que o estradiol não atuava diretamente sobre neurônios GnRH.
Posteriormente, utilizando-se a técnica de imunocitoquímica (ICC) para receptores de
estradiol do tipo (ER) foi demonstrado que estes receptores não eram expressos nos
neurônios GnRH da APOM de ratos machos ou de fêmeas (Herbison & Theodosis, 1992)
bem como de macacas (Herbison et al, 1995). Além disso, a presença de ER em
neurônios não-GnRH também sugerem uma ação indireta dos hormônios ovarianos
Introdução 21
(Simonian et al., 1999). Não há também evidências da presença de receptor para
progesterona (PR) nesses neurônios (Fox et al., 1990). Desta forma, acredita-se que o
mecanismo regulatório dos esteroides gonadais sobre a ação dos neurônios GnRH se dê
de maneira transináptica (Figura 3), regulando outros neurônios da rede GnRH
(Herbison, 1998). Evidências experimentais indicam que esse papel modulatório pode
ser exercido por diferentes neurotransmissores, como catecolaminas (Herbison, 1998;
Lima et al., 2007), aminoácidos excitatórios (Herbison, 1998; Ottem et al., 2004), GABA
(Herbison, 1998; Ottem et al., 2004) e neuropeptídeo Y (Herbison, 1998; Rocha et al.,
2006), entre outros.
Figura 3: Representação esquemática dos mecanismos envolvidos na retroalimentação positiva do GnRH e gonadotrofinas pelos esteroides ovarianos. No final da fase folicular, o folículo dominante passa a secretar discretas quantidades de progesterona (P4), além da grande quantidade de estrógenos (E2). Nesse período, ocorre um aumento adicional da síntese de GnRH e sua liberação; o mesmo ocorre na adeno-hipófise com as gonadotrofinas. Os esteroides ovarianos parecem atuar em interneurônios produtores de neurotransmissores excitatórios e inibitórios da função dos neurônios GnRH, tais como GABA: ácido γ-aminobutírico, POE: peptídeos opióides endógenos, Da: dopamina, NT: neurotensina, NA: noradrenalina, NPY: neuropeptídeo Y, AAE: aminoácidos excitatórios. O resultado final (ativação ou inibição) depende da soma algébrica dos inputs excitatórios e inibitórios que alcançam os neurônios GnRH. A espessura das setas está relacionada com a quantidade de hormônio plasmático (adaptado de Anselmo-Franci & Szawka, 2005).
Introdução 22
1.2 Regulação noradrenérgica da secreção de gonadotrofinas
Dentre as catecolaminas, a noradrenalina (NA) tem sido considerada o principal
neurotransmissor envolvido na liberação de GnRH. Os neurônios noradrenérgicos
parecem constituir um importante local de ação dos esteroides ovarianos no sistema
nervoso central, visto que esses neurônios expressam ER (Shughrue et al., 1997;
Haywood et al., 1999; Mitra et al., 2003; Helena et al. 2006) e PR (Haywood et al., 1999;
Helena et al., 2006). Além disso, foi demonstrado que o estrógeno estimula a expressão
do RNAm para a enzima tirosina hidroxilase (TH), enzima limitante para biossíntese de
noradrenalina nesses neurônios (Liaw et al., 1992; Thanky et al., 2002).
A inervação noradrenérgica do telencéfalo origina-se exclusivamente em
neurônios do tronco cerebral, dos quais partem dois importantes feixes ascendentes: o
feixe ventral – grupos celulares noradrenérgicos A1, A2, A5 e A7 – e o feixe dorsal –
grupo celular A6, também denominado locus coeruleus (LC) (Ungerstedt, 1971). Os
neurônios do núcleo A2 e do LC se projetam diretamente para corpos celulares dos
neurônios GnRH (Campbell & Herbison, 2007) sugerindo o controle direto da NA na
liberação de GnRH. De fato, foi demonstrado que o padrão de liberação de NA na rede
GnRH parece ser crítico na determinação dos parâmetros de liberação pulsátil de GnRH
(Brown et al., 1994).
Evidências experimentais indicam o envolvimento da neurotransmissão
noradrenérgica na gênese do pico pré-ovulatório de gonadotrofinas. O papel facilitador
da NA no pico de LH é indicado pelo aumento gradual de sua liberação no hipotálamo
médio basal (HMB) (ThyagaRajan et al., 1995) e na APOM (Mohankumar et al., 1994;
Szawka et al., 2007) durante o proestro. Além disso, a inibição seletiva de dopamina-ß-
hidroxilase (DBH), enzima chave na produção de NA, no diestro resulta no bloqueio do
pico de LH no proestro (Voogt & Carr, 1981). Em ratas ovariectomizadas estrogenizadas,
a infusão de antagonista α1-adrenérgico na APO bloqueia o aumento local do RNAm para
GnRH e o pico de LH (Weesner et al., 1993), enquanto a microinjeção
intracerebroventricular de NA estimula a liberação de GnRH e, consequentemente, de
LH no sangue porta-hipofisário (Ching & Krieg Jr, 1986), evidenciando a participação da
NA na gênese do pico pré-ovulatório. Os esteroides sexuais, por sua vez, modulam a
neurotransmissão noradrenérgica; por exemplo, o tratamento com estradiol, embora
agudamente iniba a liberação de NA, a longo prazo permite a ocorrência de um aumento
da liberação de NA na APOM (Demling et al., 1985) e do turnover desse
Introdução 23
neurotransmissor em diferentes regiões hipotalâmicas (Wise et al., 1981), o que
coincide com o pico induzido de gonadotrofinas. Este aumento da liberação de NA é
fortemente amplificado pela progesterona e correlaciona-se diretamente com a
amplificação do pico de LH induzido por ambos esteroides ovarianos (dados não
publicados do nosso laboratório).
1.2.1 Participação do locus coeruleus
O envolvimento do LC no pico pré-ovulatório de LH foi primeiramente sugerido
com um estudo demonstrando que a lesão dessa área provocava o bloqueio do pico de
LH na tarde do proestro e em ratas ovariectomizadas com reposição hormonal (Franci &
Antunes-Rodrigues, 1985). Posteriormente, mostrou-se que em ratas ovariectomizadas
tratadas com estradiol, a estimulação elétrica do LC promovia o aumento na secreção de
LH (Gitler & Barraclough, 1987b), efeito dependente da ativação de receptores α1-
adrenérgicos (Gitler & Barraclaough, 1987a). Esses dados forneciam evidências de que o
estímulo do LC evocava a liberação de NA na APOM, a qual, via receptores α1-
adrenérgicos, aumentava a liberação de GnRH.
Trabalhos do nosso laboratório demonstraram que a lesão do LC na manhã do
proestro reduz as concentrações de NA na APOM e HMB, bloqueia os picos de
gonadotrofinas e promove o acúmulo de GnRH na APOM e EM, impedindo a ovulação
(Anselmo-Franci et al., 1997; Helena et al., 2002). Também demonstramos um aumento
da expressão de Fos nos neurônios do LC durante a tarde do proestro, o que indica
maior atividade neuronal no LC (Martins-Afferri et al., 2003) o qual, consequentemente,
deve ser responsável pelo aumento da liberação de noradrenalina na APO durante o pico
pré-ovulatório de LH. Tais resultados sugeriram que as projeções noredrenérgicas do LC
para o hipotálamo parecem estimular a liberação de GnRH e a consequente deflagração
do pico pré-ovulatório de gonadotrofinas.
Assim, o feedback positivo dos esteroides ovarianos, necessário para que o pico
pré-ovulatório de LH ocorra, parece acontecer, pelo menos em parte, via neurônios do
LC. Essa relação entre os esteroides ovarianos e os neurônios do LC foi reforçada por
Heritage e colaboradores (1980), que encontraram esteroides sexuais em tais neurônios.
Nesse sentido, também foram descritas variações do RNAm da TH neste núcleo após a
ovariectomia e reposição estrogênica (Liaw et al., 1992) e o aumento da expressão dos
genes para TH e DBH nesses neurônios, provocado pelo estradiol (Serova et al., 2002;
Introdução 24
Thanky et al., 2002). Além disso, já mostramos que os neurônios do LC expressam ERα e
PR, expressão que varia ao longo do ciclo estral (Helena et al., 2006). Esses dados
reunidos confirmam que os neurônios desse núcleo são alvos das ações dos esteroides
ovarianos.
Em relação à forma de atuação dos esteroides ovarianos neste núcleo,
demonstramos em camundongos fêmeas que a administração de estradiol resulta em
um aumento da expressão de PR em neurônios do LC (Helena et al., 2009). Além disso,
demonstramos que o estradiol inibe a atividade dos neurônios desse núcleo (medida
pela expressão de Fos), enquanto a progesterona tem o efeito inverso, aumentando a
atividade dos mesmos (Szawka et al., 2009). Neste mesmo trabalho, demonstramos que
a frequência de potencias de ação dos neurônios do LC é diminuída pelo estradiol e
aumentada pela progesterona. Juntos, esse dados sugerem que durante o mecanismo de
feedback positivo, o papel principal do estradiol parece ser preparar esse núcleo
noradrenérgico para a ação estimulatória da progesterona.
Após todas as evidências explicitadas anteriormente, é possível considerar a NA
um importante neurotransmissor envolvido no controle do pico pré-ovulatório de LH e,
dentre os núcleos noradrenérgicos, o LC como sendo o principal núcleo envolvido nessa
regulação. Dessa maneira, considerando: 1) que o LC envia projeções para a APO, onde
estão localizados os neurônios produtores de GnRH; 2) que os neurônios deste núcleo
estão sob regulação dos esteroides ovarianos; 3) que o estradiol inibe a atividade desse
núcleo e 4) que a progesterona estimula os neurônios do LC de ratas pré-tratadas com
estradiol, nossa hipótese foi que no início período pré-ovulatório (manhã de proestro) o
aumento inicial da secreção de estradiol inibiria a atividade do LC, ao mesmo tempo em
que aumentaria a expressão de PR, tornando estes neurônios mais sensíveis à ação
posterior da progesterona, e que, no momento do pico pré-ovulatório de LH, a
progesterona ativaria o LC deflagrando este pico.
Objetivos
Objetivos 26
2 Objetivos
2.1 Geral
O objetivo do presente trabalho foi avaliar, em ratas ovariectomizadas
estrogenizadas, se a ativação dos neurônios do LC, e consequentemente, dos neurônios
da APO, induzida pelo tratamento com progesterona, é prevenida mediante a aplicação
de um antagonista de receptores de progesterona, o RU-486.
2.2 Específicos
Avaliar se o bloqueio dos receptores de progesterona pelo RU-486, em
ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol ou estradiol e progesterona, alterará a
expressão de FRA em neurônios da APO e de FRA/TH nos neurônios do LC.
Avaliar, por meio da dosagem de LH, se o tratamento com o bloqueador de
PR foi efetivo.
Material e métodos
Material e métodos 28
3 Material e métodos
3.1 Planejamento experimental
Ratas foram ovariectomizadas e tratadas, a partir do quinto dia pós-ovariectomia,
com cipionato de estradiol às 9:00 h, por três dias consecutivos. No 8º dia, receberam
injeções subcutâneas de RU-486 ou óleo às 8:00 h e de progesterona ou óleo às 10:00 h
(Grupo OVEP: tratados com óleo e progesterona. Grupo OVEP-RU: tratados com RU-486
e progesterona. Grupo OVE: tratados com óleo tanto às 8:00 h quanto às 10:00 h. Grupo
OVE-RU: tratados com RU-486 e óleo). Os animais foram perfundidos às 11 h, 13 h e 15
h. Após a perfusão, o cérebro de cada animal foi removido, congelado e processado
imunohistoquimicamente para FRA na APO e FRA/TH no LC. Antes do início da
perfusão, o sangue foi retirado do ventrículo cardíaco para dosagem de LH por
radioimunoensaio (RIE).
Figura 4: Linha esquemática do desenho experimental. OVX: ovariectomia, E2: estradiol, P4: progesterona, RIE: radioimunoensaio.
Dosagem de LH
por RIE
Cortes em
criostato da
APO e do LC
Imunohistoquímica
para FRA na APO e
FRA/TH no LC
Dia 1 Dia 5-7
Óleo
E2
Dia 8
OVX 10 h 8 h
RU 486
10 h 11 h 13 h 15 h
Óleo (OVE-RU)
P4 (OVEP-RU)
Perfusão
Amostra de
sangue do
ventrículo
Remoção
do cérebro
Óleo (OVE)
P4 (OVEP)
Material e métodos 29
3.2 Animais
Foram utilizadas ratas Wistar adultas, pesando entre 260-280 g, mantidas em
caixas plásticas (1280 cm2) em grupos de 4 por caixa, em um ambiente de temperatura
(24 0,5 °C) e luz (12 horas claro/12 horas escuro; luzes acesas às 6:00h) controladas,
com água e ração ad libitum. Somente ratas com pelo menos três ciclos estrais regulares
e consecutivos foram utilizadas no experimento. Todos os protocolos utilizados nesse
projeto foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do campus de
Ribeirão Preto-USP, Protocolo N° 11.1.728.53.8/2011.
3.3 Ovariectomia
As ratas foram anestesiadas com uma solução de ketamina (Cloridrato de
cetamina 10%, Agener; 55 mg/Kg peso corporal, i.p.) associada a xilazina (Coopazine®,
Coopers; 10 mg/Kg peso corporal, i.p.). Os animais foram ovariectomizados
bilateralmente, segundo técnicas correntes em endocrinologia. Após esta cirurgia,
receberam tratamento profilático com antibiótico (Pentabiótico Veterinário, Fontoura-
Wyeth S.A.; 0,2 mL/animal, i.m.) e anti-inflamatório (Banamine, 2,5 mg/kg peso
corporal, Schering-Plough; 0,07 mL/rata, s.c.), sendo transferidos para caixas
individuais (570 cm2) onde permaneceram até o dia do experimento.
3.4 Tratamento hormonal
O cipionato de estradiol em veículo oleoso (Pfizer) foi injetado na dose de 10
g/0,2 mL/rata e a progesterona (Progesterona, Sigma, diluída em óleo de milho) na
dose de 2,5 mg/0,2 mL/rata, administrada 24 h após a última injeção de estradiol. A via
de administração foi subcutânea.
3.5 Tratamento com antagonista de receptores de progesterona
O RU-486, na dose de 5,2 mg/0,2 mL/rata (Mifepristona, Sigma) diluído em óleo
de milho, também foi administrado por via subcutânea, duas horas antes da
administração de progesterona. A dose do RU-486 utilizada baseou-se em experimentos
realizados pelo grupo de Sánchez-Criado (Sánchez-Criado et al., 1990, Bellido et al.,
1999), ajustando-se a dose ao peso dos animais do presente experimento.
Esse composto foi desenvolvido por pesquisadores do Russel-Uclaf em
Romainville, França, a partir da substituição do grupo 11ß na noretindrona – agonista da
Material e métodos 30
progesterona – pelo grupo 4 dimetil-amino-fenil (Mahajan & London, 1997). O composto
recebeu o número serial da companhia RU-38486 – atualmente abreviado para RU-486
– e o nome genérico de mifepristona (Mahajan & London, 1997). Em experimentos de
ligação, o RU-486 mostrou ter elevada afinidade tanto para PR quanto para receptores
de glicocorticóide (GR) (Philibert, 1984), porém estudos mostraram que sua atividade
anticorticotrópica é observada apenas quando sua administração é crônica (Attardi et
al., 2004) ou muito elevada (Spitz & Bardin, 1993), o que não é necessário para obter um
efeito antiprogestágeno, além de não ter sido observada hipertrofia adrenal em estudos
nos quais foi utilizada a mesma dose de RU-486 do presente trabalho (Sánchez-Criado,
1990).
O RU-486 apresenta alta afinidade por PR e meia-vida metabólica prolongada;
além disso, exclui eficientemente o agonista correspondente de se ligar ao receptor,
sendo este eliminado da célula alvo ou metabolizado in situ (Mahajan & London, 1997).
Ao se ligar ao receptor, o antagonista irá fortalecer a ligação desse com suas chaperonas
associadas e irá provocar uma transconformação do domínio de interação com o ligante,
tornando-o inativo (Baulieu, 1991) e impedindo o complexo antagonista-receptor de
interagir com o DNA no elemento de resposta ao hormônio, consequentemente, não
ocorrerá a transcrição gênica (Mahajan & London, 1997).
3.6 Radioimunoensaio
Para confirmar o efeito dos esteroides ovarianos e correlacionar a atividade
central noradrenérgica com as concentrações de LH, estas foram determinadas por
radioimunoensaio de duplo anticorpo. O anticorpo primário (anti-rat LH-S11), e a
preparação padrão (LH-RP3) foram fornecidos pelo National Institute of Arthritis,
Diabetes, Digestive and Kidney Diseases (NIADDK, Baltimore, USA). O LH foi iodinado
pelo método da Cloramina T, com Iodo 125. Todas as diluições foram realizadas em
tampão fosfato gel com EDTA (pH=7.4). A fim de evitar erros inter-ensaio, todas as
amostras foram dosadas em um único ensaio. O erro intra-ensaio foi de 3,4% e o limite
mínimo de detecção de 0,04 ng/mL.
Material e métodos 31
3.7 Processamento do cérebro para imunocitoquímica
Perfusão: Os animais foram anestesiados com ketamina e xilasina (como descrito
anteriormente), e após a anestesia e imediatamente antes do início da perfusão, uma
amostra de sangue foi retirada do ventrículo para posterior dosagem de LH. As ratas
foram perfundidas através da artéria aorta ascendente com 40 mL de tampão fosfato
salina 0,01M (PBS 0,01M: tampão fosfato 0,01M, pH 7,4, em solução de NaCl 0.9%)
contendo heparina (5UI/mL) à temperatura ambiente, seguido de 400 mL de
paraformaldeído 4% em tampão fosfato (PB) 0,1M (PFA 4%) a 4°C. Após a perfusão, os
cérebros foram pós-fixados em PFA 4% por 2 horas a 4°C.
Crioproteção: Após a fixação, os cérebros foram mergulhados em solução de
sacarose 30% diluída em tampão fosfato 0,1M (PB 0,1M), à temperatura de 4°C, até a
saturação.
Congelamento: Após a crioproteção, os cérebros foram mergulhados em
isopentano 99% (Vetec, C5H12), mantido entre -45 e -50°C de temperatura, durante 1
minuto. Logo após o congelamento, os tecidos foram armazenados a -70°C até o
momento da obtenção dos cortes em criostato.
Cortes em criostato: Foram obtidos cortes coronais seriados de 30 µm de toda a
extensão antero-posterior da APO, bem como do LC. Os cortes foram armazenados em
solução crioprotetora (Watson et al., 1986) a -20°C, onde permaneceram até a realização
da imunocitoquímica.
3.8 Imunocitoquímica
A imunocitoquímica foi realizada pelo método de “free-floating”. Antes do início
da imunocitoquímica os cortes foram lavados três vezes, por 5 minutos, em PBS 0,01M
para remoção da solução crioprotetora, na qual ficaram armazenados a –20°C após a sua
obtenção em criostato. Todos os passos de preparação do tecido foram realizados à
temperatura ambiente, com soluções diluídas em PBS 0,01M, pH=7.4, intercalados por
três lavagens com PBS durante 5 minutos.
Os cortes foram lavados rapidamente com glicina (0,1M) para eliminação do
excesso de PFA, incubados em Triton X-100 (TX-100 0,4%) por 30 minutos para
aumentar a permeabilidade celular, e incubados com água oxigenada (H202 1%), por 45
minutos, para a eliminação da peroxidase endógena. A seguir, os cortes foram lavados
Material e métodos 32
com PBS até a eliminação da água oxigenada. As ligações inespecíficas foram bloqueadas
com a incubação por 60 minutos em albumina bovina (BSA 3%).
Incubação com os anticorpos: Os cortes foram incubados a 4°C por 40 h com
anticorpo policlonal produzido em coelho anti-FRA (k-25; Santa Cruz Biotechnology,
INC.), diluído 1:2000 em solução contendo TX-100 0,3% e BSA 1% em PBS 0,01M
(PBS+). Depois de lavados, os cortes foram incubados com um 2º anticorpo biotinilado,
uma anti-IgG de coelho produzida em cabra (BA-1000, Vector), diluído 1:600 em PBS+
durante 90 min. Após as lavagens com PBS, os cortes foram incubados com o complexo
Avidina-Biotina (KIT ABC Elite, Vectastain), por 60 minutos, diluição 1:100, à
temperatura ambiente. A seguir, foi adicionado o substrato cromógeno 3,3’-
diaminobenzidina (DAB) intensificado com sulfato de níquel (0,2 mg/mL DAB, Sigma; 25
mg/mL NiSO4, Sigma; e 1 L/mL de uma solução de H2O2 30%) em tampão acetato
0,05M (pH=7.5), por 8 minutos nos cortes da APO e 12 minutos nos do LC, e a reação foi
interrompida transferindo-se os cortes para o PBS. A seguir, somente os cortes do LC
foram lavados com H2O2 1% diluída em PBS 0,01M, durante 15 minutos, e lavados com
PBS 0,01M, quatro vezes, por 5 minutos, para posterior incubação com o anticorpo anti-
TH, produzido em camundongo (anti-TH 2, Sigma), diluído 1:500.000 em PBS+ por 40 h
a 4°C. Depois de lavados, os cortes do LC foram incubados com um 2º anticorpo
biotinilado, uma anti-IgG de camundongo produzida em cavalo (BA-2001, Vector),
diluído 1:600 em PBS+ durante 60 minutos. Após as lavagens com PBS, os cortes foram
incubados com o complexo Avidina-Biotina (KIT ABC Elite, Vectastain), por 60 minutos,
diluição 1:100, à temperatura ambiente. A seguir, foi adicionado o DAB (0,1 mg/mL DAB
e 1 L/mL de uma solução de H2O2 30%) em tampão Tris-HCl 0,05M (pH=7.6), por 15
minutos, e a reação foi interrompida transferindo-se os cortes para o PBS.
Os cortes imersos em PBS foram montados em lâminas gelatinizadas, secas à
temperatura ambiente, lavadas com etanol e xilol e cobertas com lamínulas utilizando-se
Entellan (Merck).
3.9 Análise quantitativa
As secções contendo a APO e o LC foram examinadas em um microscópio óptico
(Axioskop 2 plus, Zeiss, Germany) associado a um sistema para análise de imagens
(Axiovision 3.1, Zeiss, Germany).
Material e métodos 33
Na APO, o número de neurônios imunorreativos ao FRA foi quantificado
bilateralmente por toda a extensão rostro-caudal do núcleo periventricular
anteroventral (AVPV) e do núcleo pré-óptico ventromedial (VMPO). No VMPO, a
contagem foi realizada de + 0.12 a - 0.12 mm do Bregma. No AVPV, foram utilizadas
caixas para delimitar a área a ser utilizada para a contagem dos neurônios. O tamanho
das caixas variou conforme o tamanho do AVPV, sendo que o tamanho utilizado a
aproximadamente + 0.12 mm do Bregma foi de 80 µm de largura (a partir da superfície
ventricular) x 160 µm de altura; ao nível do Bregma, foi de 80 µm x 240 µm e a – 0.12
mm do Bregma foi de 80 µm x 360 µm.
No LC, o número de neurônios imunorreativos a TH que expressavam FRA foi
quantificado bilateralmente por toda a extensão rostro-caudal desse núcleo, sendo a
contagem realizada de -9.48 a -10.32 mm do Bregma.
Para a contagem foi utilizado o Atlas de Paxinos e Watson (2007) como referência
para identificação das áreas analisadas.
3.10 Análise estatística
As diferenças estatísticas dos dados quantitativos obtidos foram determinadas
por análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias seguida do pós-teste de Newman-
Keuls para múltiplas análises. O nível crítico foi fixado em 5% (p<0,05) para se admitir
uma diferença de valores como estatisticamente significante.
Resultados
Resultados 35
4 Resultados
4.1 Efeito do RU-486 na expressão de FRA
4.1.1 No LC
A figura 5 apresenta fotomicrografias representativas do LC, com neurônios
duplamente marcados para FRA e TH em animais OVEP-RU (Figura 5A) e OVEP (Figura
5B) às 13 h. Uma vez que a maior parte do LC expressa TH (Pickel et al., 1975), a
marcação para esta proteína, observada somente no citoplasma dos neurônios, foi eficaz
na delimitação desse núcleo. Todos os neurônios imunorreativos a FRA o eram também
para TH, porém nem todos os neurônios imunorreativos a TH o eram para FRA.
Figura 5: Fotomicrografias representativas de neurônios duplamente marcados para FRA e TH no locus coeruleus de ratas OVEP-RU (A) e ratas OVEP (B) perfundidas às 13 h. Setas indicam neurônios duplamente marcados (marcação de TH é citoplasmática, enquanto a de FRA é nuclear). * Neurônios marcados apenas para TH. Escala: 50µm. 4V: quarto ventrículo.
Os animais tratados com estradiol apresentaram apenas uma tendência à
diminuição da atividade neuronal do LC. No grupo OVE-RU (Figura 6A), a atividade dos
neurônios do LC diminuiu significantemente às 13 h em relação às 11 h (P<0,05), e às 15
h, permaneceu igual às 13 h. No grupo OVEP (Figura 6B) foi observado um aumento no
número de neurônios imunorreativos a FRA e TH às 13 h, sendo que às 15 h este número
foi semelhante ao das 11 h, não havendo diferença significativa entre eles. O aumento do
4V 4V 4V
A B
*
*
Resultados 36
número de neurônios duplamente marcados às 13 h foi bloqueado pelo RU-486
(P<0,05).
LC
11 13 150
10
20
30
40OVE
OVE-RU
#
#
Tempo (h)
Nú
mer
o d
e n
eurô
nio
s F
RA
/TH
-ir
LC
11 13 150
10
20
30
40OVEP
OVEP-RU*
#
Tempo (h)
Nú
mer
o d
e n
eurô
nio
s F
RA
/TH
-ir
Figura 6: Número de neurônios TH-ir que expressam FRA no LC de ratas OVE (A) e OVEP (B) tratadas com óleo ou RU-486 no dia do experimento e perfundidas às 11 h, 13 h e 15 h. Grupo OVE: 11 h (n=7), 13 h(n=6) e 15 h (n=6). Grupo OVE-RU: 11 h (n=9), 13 h (n=8) e 15 h (n=7); Grupo OVEP: 11 h (n=7), 13 h (n=7) e 15 h (n=7). Grupo OVEP-RU: 11 h (n=9), 13 h (n=6) e 15 h (n=8). Dados apresentados como média ± EPM. #P< 0,05 para 13 h e 15 h vs 11 h.
No grupo OVEP tratado com RU-486 o número de neurônios TH positivos
imunorreativos a FRA igualou-se àquele do grupo OVE tratado com óleo às 13 horas
(Figura 7). Nos outros horários também não houve diferença entre os dois grupos.
11 h 13 h 15 h0
5
10
15
20
OVE
OVEP-RU
LC
Nú
mer
o d
e n
eurô
nio
s F
RA
/TH
-ir
Figura 7: Número de neurônios duplamente marcados para TH e FRA de ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVE) e com estradiol, progesterona e RU-486 (OVEP-RU) nos três diferentes horários de perfusão. Dados apresentados como média ± EPM.
A B
Resultados 37
4.1.2 Na APO
Na figura 8 são apresentados um diagrama esquemático mostrando a localização
do AVPV e do VMPO e fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos a
FRA no AVPV de ratas OVEP (Figura 8B) e OVEP-RU (Figura 8C) perfundidas às 15 h.
Figura 8: (A) Diagrama esquemático demonstrando as regiões do AVPV e VMPO analisados, de +0.12 a -0.12 mm do Bregma. A caixa representa a área selecionada para a quantificação dos neurônios imunorreativos a FRA no AVPV. (B e C) Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos a FRA no AVPV de ratas OVEP (B) e OVEP-RU (C) perfundidas às 15 h. Escala: 50 µm. 3V: terceiro ventrículo.
O número de neurônios imunorreativos a FRA do AVPV e no VMPO no grupo OVE
tratados com óleo permaneceu constante nos três horários estudados e não foi alterado
pelo tratamento com RU-486 (Figuras 9A e 9C).
Animais do grupo OVEP apresentaram às 15 h um aumento significativo (P<0,05)
do número de neurônios imunorreativos a FRA no AVPV quando comparados aos outros
dois horários (Figura 9B) e no VMPO quando comparado às 13 h (Figura 9D). Estes
aumentos de expressão de FRA foram totalmente bloqueados pelo RU-486 (P<0,05).
A B C
3V 3V
AVPV
Resultados 38
AVPV
11 13 150
20
40
60
80OVE
OVE-RU
Tempo (h)
Nú
mer
o d
e n
eurô
nio
s F
RA
-ir
AVPV
11 13 150
20
40
60
80
*#
OVEP
OVEP-RU
Tempo (h)
Nú
mer
o d
e n
eurô
nio
s F
RA
-ir
VMPO
11 13 150
10
20
30
40
50OVE
OVE-RU
Tempo (h)
Nú
mer
o d
e n
eurô
nio
s F
RA
-ir
VMPO
11 13 150
10
20
30
40
50OVEP
OVEP-RU*†
Tempo (h)
Nú
mer
o d
e n
eurô
nio
s F
RA
-ir
Figura 9: Número de neurônios que expressam FRA no AVPV (A e B) e no VMPO (C e D) de ratas OVE (A e C) e OVEP (B e D) tratadas com óleo ou RU-486 no dia do experimento e perfundidas às 11 h, 13 h e 15 h. Número de animais utilizados: OVE 11 h (n=8), 13 h (n=9) e 15 h (n=8); OVE-RU 11 h (n=7), 13 h (n=7) e 15 h (n=7); OVEP 11 h (n=8), 13 h (n=7) e 15 h (n=6); OVEP-RU 11 h (n=9), 13 h (n=7) e 15 h (n=7).
Dados apresentados como média ± EPM. #P<0,05 15 h vs 11 e 13 h ; † P<0,05 15 h vs 13 h; *P<0,05 óleo vs RU-486 no mesmo horário.
No grupo OVE tratado com progesterona e RU-486 (OVEP-RU) o número de
neurônios imunorreativos a FRA no AVPV e no VMPO às 15 h foi semelhante àquele dos
animais tratados apenas com estradiol (Figuras 10A e 10B). Nos outros horários
também não houve diferença entre os dois grupos.
A B
C D
Resultados 39
11 h 13 h 15 h0
10
20
30OVE
OVEP-RU
AVPVN
úm
ero
de
neu
rôn
ios
FR
A-i
rVMPO
11 h 13 h 15 h0
10
20
30OVE
OVEP-RU
Nú
mer
o d
e n
eurô
nio
s F
RA
-ir
Figura 10: Número de neurônios imunorreativos a FRA no AVPV (A) e no VMPO (B) de ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVE) e estradiol, progesterona e RU-486 (OVEP-RU) nos três diferentes horários de perfusão. Dados apresentados como média ± EPM.
4.2 Efeito do RU-486 na liberação de LH
Como esperado, o tratamento de ratas ovariectomizadas com estradiol (OVE)
provocou um aumento nas concentrações plasmáticas de LH às 15 h quando
comparadas às das 11 h e 13 h (P<0,05), o qual não foi alterado pelo RU-486 (Figura
11A).
O tratamento de ratas OVE com progesterona (OVEP; Figura 11B), induziu
aumento significante nas concentrações de LH já às 13 h, quando comparadas com os
animais das 11 h (P<0,05) e estas concentrações foram maiores às 15 h quando
comparadas às 13 h (P<0,05). O RU-486 diminuiu significantemente as concentrações de
LH tanto às 13 h, quanto às 15 h (P<0,05). Esta redução foi de 59,9% às 13 h e de
44,36% às 15 h em relação aos animais tratados com óleo.
11 13 150
2
4
6
8
10
12
14OVE
OVE-RU
#
#
Tempo (h)
LH
(n
g/m
L)
11 13 150
2
4
6
8
10
12
14OVEP
OVEP-RU
*
#
#
*#
Tempo (h)
LH
(n
g/m
L)
Figura 11: Concentração plasmática de LH de ratas ovariectomizadas tratadas (A) com estradiol (OVE) e (B) com estradiol e progesterona (OVEP). No dia do experimento, os animais foram tratados com RU-486 ou óleo às 8 h e perfundidos às 11 h, 13 h e 15 h. Número de animais utilizados: OVE 11 h (n=10), 13 h (n=7) e 15 h (n=12); OVE-RU 11 h (n=9), 13 h (n=9) e 15 h (n=12); OVEP 11 h (n=8), 13 h (n=11) e 15 h (n=10); OVEP-RU 11 h (n=8), 13 h (n=10) e 15 h (n=10). Dados apresentados como média ± EPM. #P<0,05 vs os dois outros horários dentro do mesmo grupo. *P<0,05 óleo vs RU-486 no mesmo horário.
A B
A B
Resultados 40
No grupo OVE tratado com progesterona e RU-486 (OVEP-RU) as concentrações plasmáticas de LH tanto às 13 h como às 15 h foram semelhantes àquelas dos animais tratados apenas com estradiol (Figura 12).
11 h 13 h 15 h0
2
4
6
8OVE
OVEP-RU
LH
(n
g/m
L)
Figura 12: Concentração plasmática de LH de ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVE) e estradiol, progesterona e RU-486 (OVEP-RU) nos três diferentes horários. Dados apresentados como média ± EPM.
Discussão
Discussão 42
5 Discussão
Os resultados deste trabalho mostraram que o tratamento de ratas
ovariectomizadas com estradiol e progesterona promove o aumento da atividade dos
neurônios do LC às 13 h, seguido do aumento da atividade de neurônios da APO às 15 h
com concomitante aumento da secreção de LH às 15 h (início do pico pré-ovulatório). Os
dados também demonstraram que o bloqueio dos receptores para progesterona foi
capaz de bloquear o aumento da atividade do LC e da APO induzidos pela administração
de progesterona, bem como a amplificação do pico de LH induzido por estradiol.
O uso de técnicas sensíveis para mensurar a secreção hormonal, como o
radioimunoensaio, em conjunto com a técnica de imunohistoquímica para analisar a
ativação de genes que refletem a atividade neuronal permite a compreensão da
dinâmica da regulação neuroendócrina. Estas abordagens são de grande importância
para o estudo de eventos que apresentam variações rápidas e de considerável
magnitude, como é o caso dos picos pré-ovulatórios de secreção de gonadotrofinas.
A proteína expressa pelo gene c-Fos tem sido amplamente utilizada como
marcador de atividade neuronal devido sua expressão ser rapidamente ativada por
inúmeros estímulos que aumentam a atividade do neurônio (Hoffman e Lyo, 2002).
Neste sentido, o uso de antígenos relacionados à Fos (FRA) tem se mostrado ainda mais
importante, por possibilitar a avaliação tanto da atividade aumentada (Lerant et al.,
2001) quanto suprimida (Bailey et al., 2006) nos neurônios, além de neurônios em
atividade tônica (Hoffman et al., 1994). O fato da proteína expressa pelo gene c-Fos ser
nuclear permite a marcação dupla de neurônios ativados com a finalidade de determinar
a identidade de seu neurotransmissor (Hoffman e Lyo, 2002).
O anticorpo para FRA utilizado neste trabalho reconhece todos os membros
conhecidos da família Fos – c-Fos, Fos B, Fra-1 e Fra-2 (Szawka et al., 2009). Sua
utilização se mostrou essencial, visto que o tratamento com RU-486 provocaria uma
inibição da ação da progesterona em neurônios do LC. De fato, este anticorpo mostrou
ser útil na detecção de variações na atividade de neurônios do LC, mostrando o
envolvimento deste núcleo na regulação dos picos de prolactina (Szawka et al., 2005) e
de LH (Szawka et al., 2009), e na síndrome do ovário policístico induzida por estresse
por frio (Bernuci et al., 2008).
Estudos do nosso laboratório já demonstraram por meio da avaliação da
expressão de FRA, que na manhã e início da tarde do proestro, quando as concentrações
Discussão 43
de estradiol aumentam, ocorre uma inibição dos neurônios do LC; este mesmo efeito
inibitório do estradiol foi observado em ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol
(Szawka et al., 2009). Estudos de eletrofisiologia demonstraram também que o estradiol
diminui a frequência dos potenciais de ação do LC, reforçando os dados anteriores que
sugeriam um efeito inibitório do estradiol sobre os neurônios do LC (Szawka et al.,
2009). Em estudos subsequentes demonstramos que o tratamento de ratas
ovariectomizadas apenas com estradiol inibe a secreção de NA no período da manhã,
mas induz um pico deste neurotransmissor partir das 15 h sugerindo que neurônios
noradrenérgicos sejam ativados a partir deste horário (dados não publicados). De fato,
no presente estudo, observamos um aumento significativo da secreção de LH neste
grupo às 15 horas, o que coincide com o período de aumento da liberação de NA na APO.
Por outro lado, a atividade deste núcleo foi constante nos três horários estudados. Uma
vez que a atividade dos neurônios do LC parece aumentar por volta das 15 h, seria
esperado que a marcação de um maior número de neurônio com FRA só fosse detectada
a partir das 17 h, o que não foi possível observar desde que o estudo foi realizado até às
15 horas. Como esperado, o bloqueio dos receptores de progesterona não interferiu na
atividade do LC como também não interferiu na magnitude ou no momento do aumento
de LH nas ratas tratadas apenas com estradiol.
Já está bem estabelecido que a progesterona amplifica e antecipa os picos de
gonadotrofinas em ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol (Everett, 1948; Krey
et al., 1973). De acordo com Levine (1997), o tratamento com estradiol induziria a
síntese de PR e a progesterona atuaria diretamente sobre eles, promovendo a
transativação de uma quantidade maior de receptores e, desta forma, amplificando as
respostas transcricionais que medeiam a síntese e liberação de GnRH e,
consequentemente de LH. Nós já demonstramos que o estradiol induz a síntese de PR
nos neurônios do LC (Helena et al., 2009) e a queda nas concentrações de LH em reposta
ao bloqueio dos PRs reforçam a ideia de que a ativação do PR é imprescindível para a
ocorrência dos picos pré-ovulatórios de gonadotrofinas.
Na tarde do proestro, quando há um aumento na secreção de progesterona, há
um aumento na expressão de FRA no LC, e a injeção de progesterona também é eficaz
em aumentar a atividade dos neurônios do LC em ratas ovariectomizadas e
estrogenizadas. Este efeito estimulador da progesterona foi confirmado em estudos de
eletrofisiologia onde foi demonstrado que este esteroide provoca um aumento da
Discussão 44
frequência de potenciais de ação nos neurônios do LC de ratas OVE (Szawka et al., 2009).
Em estudos de microdiálise do nosso laboratório, foi observado um aumento da
liberação de NA na APO por volta das 14 horas do proestro, quando inicia-se o aumento
da secreção de progesterona (Szawka et al., 2007). Além disso, a injeção de progesterona
às 10 h em ratas OVE aumenta drasticamente a liberação de NA na APO entre 10 e 12 h,
confirmando o efeito estimulatório da progesterona em neurônios noradrenérgicos. Este
aumento antecipado e amplificado de NA também antecipa e amplifica o pico pré-
ovulatório de LH (dados não publicados).
Os resultados obtidos no presente trabalho reforçam estes dados uma vez que
um aumento da atividade neuronal no LC foi observado já às 13 h nas ratas
estrogenizadas nas quais a progesterona foi injetada às 10 h. A imunorreatividade de c-
Fos atinge seu máximo de 1 h a 2 h após a ativação neuronal, devido ao acúmulo de seu
RNAm no citoplasma por este período e posterior tradução das proteínas (Morgan &
Curran, 1989). Desde que, como citado acima, há um aumento na liberação de NA entre
10h e 12 h em ratas OVE tratadas com progesterona às 10 horas, é possível inferir que
este aumento na atividade do LC observado às 13 h em nosso estudo possivelmente
ocorreu por volta das 11-12 h, ou seja, logo após o tratamento com a progesterona.
Este aumento de atividade do LC parece ter sido responsável pela antecipação e
amplificação do pico de LH uma vez que já às 13 h houve um aumento significativo das
concentrações deste hormônio e que estas concentrações, às 13 e 15 h, foram
significantemente maiores do que aquelas do grupo OVE nos mesmos horários.
Adicionalmente, nossos resultados demonstram que a inibição dos PRs preveniu
o efeito estimulatório da progesterona no LC bem como na secreção de LH. As ratas
OVEP tratadas com antagonista de receptores para a progesterona exibiram número de
neurônios FRA positivos no LC e concentrações de LH similares ao grupo tratado apenas
com estradiol. Este dado sugere que o efeito da progesterona no LC seja responsável
pela amplificação e antecipação do pico de LH. De fato, em experimentos recentes do
nosso laboratório, foi demonstrado que o estradiol é capaz de estimular os neurônios do
grupo noradrenérgico A2 (mas não A1) enquanto a progesterona ativa os neurônios do
LC que se projetam para a APO, mas não os neurônios dos grupos A1 e A2. Estes dados
sugeriram que o grupo A2 (mas não o LC ou o A1) poderia estar envolvido com o pico de
LH induzido pelo estradiol, enquanto que a amplificação e antecipação do pico de LH
induzido pelo estradiol seriam atribuídas ao LC (dados não publicados). De fato injeção
Discussão 45
intraventricular de DSP-4, uma substância que destrói seletivamente os terminais
noradrenérgicos do LC, aboliu a amplificação do pico e preservou o pico de LH da
magnitude daquele induzido apenas pelo estradiol (dados não publicados do nosso
laboratório). Estes dados demonstraram que, de fato, o estradiol induz um pico de LH
via ativação do A2 e a progesterona antecipa e amplifica este pico via ativação do LC.
Os dados do presente estudo corroboram esta ideia uma vez que após o bloqueio
dos receptores de progesterona pelo RU-486, o pico de LH induzido apenas pelo
estradiol parece ter sido preservado.
A análise da atividade neuronal das regiões do AVPV e do VMPO da APO mostrou
que não há variação da atividade destes neurônios nos animais tratados apenas com
estradiol nos horários estudados. No entanto, o tratamento de ratas OVE com
progesterona provocou um aumento da atividade neuronal às 15. O bloqueio deste
aumento de atividade pelo RU-486 indica que a progesterona seja essencial para a
estimulação destes neurônios.
A APO, que inclui as sub-regiões avaliadas neste estudo, AVPV e VMPO, concentra
grande parte dos neurônios GnRH (Simonian et al., 1999). Como citado anteriormente
não há expressão de ERα (Herbison e Theodosis, 1992) e de PR (Fox et al.1990) nos
neurônios GnRH. Portanto, a modulação de tais neurônios pelos esteroides ovarianos
ocorre de forma indireta. Na APO são encontrados não somente neurônios GnRH
positivos, que não expressam receptores para os esteroides ovarianos, mas também
interneurônios que expressam ER e PR, os quais modulam a atividade dos neurônios
GnRH. É Importante ressaltar que esta ação modulatória não se restringe somente aos
neurônios situados próximos aos neurônios GnRH. Neurônios localizados em regiões
distantes da APO podem também modular direta ou indiretamente a atividade dos
neurônios GnRH, como é o caso dos neurônios noradrenérgicos pontinos que enviam
projeções diretas aos neurônios GnRH e indiretas, para outros neurônios da APO
(Herbison, 1998). Além disso, estudos utilizando marcação retrógrada mostraram
projeções diretas de neurônios do LC para neurônios GnRH da porção rostral da APO de
camundongos (Campbell & Herbison, 2007). No entanto, este estudo não permite
identificar se o efeito estimulatório da NA do LC é exercido diretamente nos neurônios
GnRH ou indiretamente, via interneurônios.
Os resultados sugerem fortemente haver uma relação temporal entre os
parâmetros analisados. O aumento do número de neurônios da APO que expressam FRA
Discussão 46
às 15 h nos animais OVEP sugere que estes neurônios devam ter sido ativados por volta
das 13 h, momento em que também se observa um aumento inicial das concentrações
plasmáticas de LH. Esta associação temporal entre o aumento na expressão de c-Fos na
APO e o pico de LH constituíram as primeiras evidências diretas de que a atividade
celular dos neurônios GnRH acompanha os picos de LH (Hoffman et al., 1993).
Uma vez que este aumento de atividade na APO (às 15 h) é observado
posteriormente àquele observado no LC (às 13 h), é possível que ele seja consequente à
estimulação do LC, cujos neurônios, sabidamente, se projetam para a APO. Por sua vez, a
atividade dos neurônios do LC é aumentada por ação da progesterona. Esta ação da
progesterona em deflagrar a liberação de LH por induzir a liberação de NA foi por nós
confirmada em experimentos de microdiálise reversa em ratas OVE, nos quais a NA
infundida diretamente na APO de animais OVE induziu um pico de LH com o mesmo
perfil e mesma magnitude daquele induzido pela progesterona, bem como um aumento
da atividade do AVPV (dados não publicados). Os dados sugerem, portanto, que a
progesterona ativa os neurônios do LC, que por sua vez estimulam neurônios da APO, os
quais rapidamente induzem o pico de LH.
Já está bem esclarecido na literatura, que o tratamento de ratas em proestro com
RU-486 provoca redução da amplitude do pico pré-ovulatório de LH (Rao & Mahesh,
1986; Lee et al., 1990b; Sánchez-Criado et al., 1990; Bauer-Dantoin et al., 1993). No
entanto, foi também mostrado que a administração do antagonista da progesterona,
ZK98299, em ratas ovariectomizadas estrogenizadas bloqueia o pico de LH induzido por
estradiol (Chappell & Levine, 2000). Esses autores associaram tal bloqueio com a
transativação de PR a partir de sinais neurais, os quais irão direcionar o início e, desta
forma, o momento apropriado para a ocorrência do pico de GnRH (Levine et al., 2001).
Nossos dados mostram que, na ausência da progesterona (grupo OVE), o bloqueio de PR
não modificou a liberação de LH, o que indica que, neste modelo experimental, a
ativação de PR foi exclusivamente dependente do ligante, não ocorrendo o mecanismo
de transativação de PR proposto por Levine et al. (2001). Por outro lado, nas ratas
tratadas com progesterona foi observada uma redução da amplitude do pico de LH pelo
RU-486. Esta redução foi precedida por uma diminuição da atividade dos neurônios da
APO, o que por sua vez parece ter sido consequência da redução de atividade dos
neurônios do LC. Portanto, o bloqueio do aumento de atividade dos neurônios
noradrenérgicos do LC aferentes aos interneurônios da APO que modulam a secreção de
Discussão 47
GnRH pode ser um dos mecanismos pelos quais o RU-486 atenua o pico pré-ovulatório
de LH.
Conclusão
Conclusão 49
6 Conclusão
O conjunto de dados obtidos neste trabalho mostra que em ratas estrogenizadas
a progesterona, por meio de seus receptores localizados no LC, aumenta a atividade
deste núcleo por volta das 11 h; a noradrenalina liberada provoca o aumento da
atividade nos neurônios da APO por volta das 13 h, consequentemente aumentando a
secreção de GnRH o que, por sua vez, amplifica o pico de LH induzido por estradiol.
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