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PARÂMETROS MORFOLÓGICOS E QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS NA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA EM PLANTAS DE TOMATEIRO POR TRICHODERMA ATROVIRIDE NO CONTROLE DA PINTA PRETA. Christiane Fernandes de Oliveira (INTEGRAR), Luciana Bavaresco Andrade, Lourenzo Monteiro da Silva, Marcia Rodrigues Sandri, Joséli Schwambach (Orientador(a)) O tomate tornou-se uma das hortaliças mais consumidas do mundo pela grande versatilidade de utilização. No entanto, destaca- se pelo elevado número de problemas fitossanitários que comprometem o plantio. A pinta preta é uma das mais frequentes e importantes doenças que comprometem o cultivo do tomateiro. O desenvolvimento do setor agrário proporcionou o aumento do uso de insumos sintéticos destinados ao controle de doenças nas culturas, porém estes prejudicam a sanidade do alimento, a água, o solo, animais, além de comprometer a saúde dos agricultores e consumidores. O controle biológico aparece como uma alternativa promissora e o uso de elicitores para indução de resistência em plantas vem se destacando frente as novas tecnologias agrícolas. Trichoderma é o principal fungo empregado no controle biológico, conhecido pela sua capacidade de induzir defesa nas plantas. A exposição das plantas a diversos tipos de estresse leva a ativação de seus sistemas de defesa. Um dos parâmetros que é utilizado para quantificar a defesa é a quantificação de compostos fenólicos. O objetivo do trabalho foi avaliar parâmetros morfológicos e quantificar compostos fenólicos na ação de Trichoderma atroviride em plantas de tomateiros do cultivar Micro-Tom inoculadas com Alternaria solani. Introdução e Objetivo Parâmetros avaliados Materiais e métodos: Morfologia Diâmetro do caule (mm) Medida do colo Área foliar (cm²) Largura X Altura X 0,59 / 100= Altura Largura Diferença de Altura (cm) Altura final – Altura inicial Tempo de florescimento Surgimento dos botões florais (dias) Transplante com 21 dias de germinação e inoculação de Trichoderma atroviride na concentração 10⁸ conídios/mL Seis tratamentos com 15 plantas cada: 1)Controle, 2)Trichoderma solo, 3)Trichoderma foliar, 4)Controle + Alternaria, 5)T. Solo + Alternaria, 6)T. Foliar + Alternaria. Em 24h, 48h, 72h e 7 dias 15 dias após o transplante, inoculação do patógeno, Alternaria sp. na concentração 10⁶ conídios/mL Produção dos inóculos T. atroviride Isolado de solos de videiras da região serrana Alternaria sp. Isolado de folhas de tomateiro Cultivado em meio BDA Cultivado em meio V8 + + Placas com o fungo foram “lavadas” com H₂O destilada e autoclavada com o auxílio de alça de Drigalski até a concentração de 1x10⁶ conídios/mL Placas com o fungo foram “lavadas” com H₂O destilada e autoclavada com o auxílio de alça de Drigalski até a concentração de 1x10⁸ conídios/mL Materiais e métodos: Fenólicos Passo 1: Maceração das amostras (extrato foliar) com N₂ liquido Passo: 2 Amostras armazenadas em micro tubos com 50 mg cada Passo: 3 Colocou-se 750μL de HCl em cada amostra Passo 4: Amostras passaram por 30 min. no sonicador com gelo para a desnaturação das proteínas. Passo: 5 Após passaram para a centrífuga por 10 min. à 9000rpm e a 4°C. Passo 11: As leituras foram realizadas em espectrofotômetro sob comprimento de onda de 750nm. Passo 6: Recolhido o sobrenadante e armazenado em novos micro tubos, em seguida acrescentou-se mais 750μL de HCl ao pellet e repetiu-se os passos 4 e 5, após recolheu-se pela segunda vez o sobrenadante para os micro tubo e foram ajustados os volumes para 1,5mL. Passo 7: Em seguida passou-se os volumes para tubos de ensaio onde foram acrescidos 0,150mL de reagente Folin-Ciocalteau e 0,300mL de Carbonato de cálcio totalizando 1,950mL em cada amostra Passo 8: Os tubos permaneceram por 30 segundos no vórtex para homogeneização dos líquidos Passo 9: Tubos encubados por 1 min. no banho a 100°C e Imediatamente resfriados no gelo. Passo 10: Retornar as amostras para os devidos micro tubos e repetir o passo 5 Resultados e discussão Figura 1 e 2. Quantificação de compostos fenólicos em plantas de tomateiro Micro-Tom na indução de resistência a Alternaria por T. atroviride nos tratamentos: controle; T. no solo e T. foliar em diferentes tempos 24, 48, 72 horas e 7 dias. Figura 1-Indução de resistência durante a quarta semana; Figura 2- Indução de resistência e Indução do patógeno na sexta semana . As analises estatísticas foram feitas para cada tempo. Os valores estão expressos em Média ± DP. Letras diferentes apresentam diferença estatística (p<0,05), aplicando Tukey. Figura 1. Figura 2. Foram realizadas induções do bioagente Trichoderma atroviride e do patógeno Alternaria solani. As plantas foram expostas ao T. atroviride quando estavam com quatro semanas e o processo foi repetido na sexta semana, na qual foi inoculado concomitantemente o patógeno. As coletas de material foliar foram realizadas em 24h, 48h, 72h e 7 dias após as inoculações. Pôde se observar que não houve indução de defesa da planta analisada pelo método de Folin- Ciocalteu, adaptado de Singleton & Rossi (1965) e Souza et al. (2007). Foram observadas apenas diferenças em relação ao tempo das coletas (idade das plantas) (Fig. 1 e 2). Quanto aos parâmetros morfológicos avaliados, não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos (Tabela 1). Concluiu-se que o tomateiro testado confirma a utilização de uma rota secundária diferente da de produção de fenólicos para a indução de defesa. Como continuidade do trabalho pretende-se avaliar a resposta enzimática relacionada a defesa dos tratamentos testados. Conclusão e perspectiva REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS SINGLETON, V. L.; ROSSI, J. A. (1965). Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic Phosphotungstic Acid Reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16:144-158. SOUZA, C. M DE M; SILVA, H. R., VIEIRA-JR, G. M.; AYRES, M. C. C.; COSTA, C. L. S.; ARAÚJO, D. S; CAVALCANTE, L. C. D.; BARROS, E. D. S.; ARAÚJO, P. B. M.; BRANDÃO, M. S. E CHAVE, M. H. (2007). Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química Nova. 30: 351-355. Apoio: Agradecimento: LBioP- Laboratório de Biotecnologia e Produtos Naturais e Sintéticos
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PARÂMETROS MORFOLÓGICOS E QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS NA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA EM PLANTAS DE TOMATEIRO POR TRICHODERMA ATROVIRIDE
NO CONTROLE DA PINTA PRETA. Christiane Fernandes de Oliveira (INTEGRAR), Luciana Bavaresco Andrade, Lourenzo
Monteiro da Silva, Marcia Rodrigues Sandri, Joséli Schwambach (Orientador(a))
O tomate tornou-se uma das hortaliças mais consumidas do mundo pela grande versatilidade de utilização. No entanto, destaca-se pelo elevado número de problemas fitossanitários que comprometem o plantio. A pinta preta é uma das mais frequentes e importantes doenças que comprometem o cultivo do tomateiro. O desenvolvimento do setor agrário proporcionou o aumento do uso de insumos sintéticos destinados ao controle de doenças nas culturas, porém estes prejudicam a sanidade do alimento, a água, o solo, animais, além de comprometer a saúde dos agricultores e consumidores. O controle biológico aparece como uma alternativa promissora e o uso de elicitores para indução de resistência em plantas vem se destacando frente as novas tecnologias agrícolas. Trichoderma é o principal fungo empregado no controle biológico, conhecido pela sua capacidade de induzir defesa nas plantas. A exposição das plantas a diversos tipos de estresse leva a ativação de seus sistemas de defesa. Um dos parâmetros que é utilizado para quantificar a defesa é a quantificação de compostos fenólicos. O objetivo do trabalho foi avaliar parâmetros morfológicos e quantificar compostos fenólicos na ação de Trichoderma atroviride em plantas de tomateiros do cultivar Micro-Tom inoculadas com Alternaria solani.
Introdução e Objetivo
Parâmetros avaliados
Materiais e métodos: Morfologia
Diâmetro do caule (mm) Medida do colo
Área foliar (cm²) Largura X Altura X 0,59 / 100=
Altura
Largura
Diferença de Altura (cm) Altura final – Altura inicial
Tempo de florescimento Surgimento dos botões florais (dias)
Transplante com 21 dias de germinação e inoculação de Trichoderma atroviride na
concentração 10⁸ conídios/mL
Seis tratamentos com 15 plantas cada: 1)Controle, 2)Trichoderma solo,
3)Trichoderma foliar, 4)Controle + Alternaria, 5)T. Solo + Alternaria, 6)T. Foliar + Alternaria.
Em 24h, 48h, 72h e 7 dias
15 dias após o transplante, inoculação do patógeno, Alternaria sp. na
concentração 10⁶ conídios/mL
Produção dos inóculos
T. atroviride
Isolado de solos de videiras da
região serrana
Alternaria sp. Isolado de
folhas de tomateiro Cultivado em
meio BDA
Cultivado em
meio V8
+ +
Placas com o
fungo foram
“lavadas” com
H₂O destilada e
autoclavada com
o auxílio de alça
de Drigalski até a
concentração de
1x10⁶
conídios/mL
Placas com o
fungo foram
“lavadas” com
H₂O destilada e
autoclavada com
o auxílio de alça
de Drigalski até a
concentração de
1x10⁸ conídios/mL
Materiais e métodos: Fenólicos Passo 1:
Maceração das amostras (extrato foliar) com N₂ liquido
Passo: 2 Amostras armazenadas
em micro tubos com 50 mg cada
Passo: 3 Colocou-se 750µL de HCl em cada amostra
Passo 4: Amostras passaram por 30 min.
no sonicador com gelo para a desnaturação das proteínas.
Passo: 5 Após passaram para a centrífuga por 10 min. à 9000rpm e a 4°C.
Passo 11: As leituras foram realizadas em espectrofotômetro sob
comprimento de onda de 750nm.
Passo 6: Recolhido o sobrenadante e armazenado em
novos micro tubos, em seguida acrescentou-se mais 750µL de HCl ao pellet e repetiu-se
os passos 4 e 5, após recolheu-se pela segunda vez o sobrenadante para os micro tubo e foram
ajustados os volumes para 1,5mL.
Passo 7: Em seguida passou-se os volumes para tubos de ensaio onde foram acrescidos 0,150mL de reagente Folin-Ciocalteau e 0,300mL de
Carbonato de cálcio totalizando 1,950mL em cada amostra
Passo 8: Os tubos permaneceram por 30 segundos no vórtex para
homogeneização dos líquidos
Passo 9: Tubos encubados por
1 min. no banho a 100°C e Imediatamente resfriados
no gelo.
Passo 10: Retornar as amostras
para os devidos micro tubos e repetir o passo 5
Resultados e discussão
Figura 1 e 2. Quantificação de compostos fenólicos em plantas de tomateiro Micro-Tom na indução de resistência a Alternaria por T. atroviride nos tratamentos: controle; T. no solo e T. foliar em diferentes tempos 24, 48, 72 horas e 7 dias. Figura 1-Indução de resistência durante a quarta semana; Figura 2- Indução de resistência e Indução do patógeno na sexta semana . As analises estatísticas foram feitas para cada tempo. Os valores estão expressos em Média ± DP. Letras diferentes apresentam diferença estatística (p<0,05), aplicando Tukey.
Figura 1.
Figura 2. Foram realizadas induções do bioagente Trichoderma atroviride e do patógeno Alternaria solani. As plantas foram expostas ao T. atroviride quando estavam com quatro semanas e o processo foi repetido na sexta semana, na qual foi inoculado concomitantemente o patógeno. As coletas de material foliar foram realizadas em 24h, 48h, 72h e 7 dias após as inoculações. Pôde se observar que não houve indução de defesa da planta analisada pelo método de Folin-Ciocalteu, adaptado de Singleton & Rossi (1965) e Souza et al. (2007). Foram observadas apenas diferenças em relação ao tempo das coletas (idade das plantas) (Fig. 1 e 2). Quanto aos parâmetros morfológicos avaliados, não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos (Tabela 1).
Concluiu-se que o tomateiro testado confirma a utilização de uma rota secundária diferente da de produção de fenólicos para a indução de defesa. Como continuidade do trabalho pretende-se avaliar a resposta enzimática relacionada a defesa dos tratamentos testados.
Conclusão e perspectiva
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS SINGLETON, V. L.; ROSSI, J. A. (1965). Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic Phosphotungstic Acid Reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16:144-158. SOUZA, C. M DE M; SILVA, H. R., VIEIRA-JR, G. M.; AYRES, M. C. C.; COSTA, C. L. S.; ARAÚJO, D. S; CAVALCANTE, L. C. D.; BARROS, E. D. S.; ARAÚJO, P. B. M.; BRANDÃO, M. S. E CHAVE, M. H. (2007). Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química Nova. 30: 351-355.
Apoio: Agradecimento:
LBioP- Laboratório de Biotecnologia e Produtos Naturais e Sintéticos
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