PAPEL DA OBESIDADE E DA DISFUNÇÃO HEPÁTICA SOBRE A...
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA _________________________________________________________________________________ PAPEL DA OBESIDADE E DA DISFUNÇÃO HEPÁTICA SOBRE A ATIVIDADE VASCULAR DE RATOS MILENA DO NASCIMENTO Sinop-MT 2016/2
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA
_________________________________________________________________________________
PAPEL DA OBESIDADE E DA DISFUNÇÃO HEPÁTICA SOBRE A ATIVIDADE
VASCULAR DE RATOS
MILENA DO NASCIMENTO
Sinop-MT
2016/2
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA
_________________________________________________________________________________
PAPEL DA OBESIDADE E DA DISFUNÇÃO HEPÁTICA SOBRE A ATIVIDADE
VASCULAR DE RATOS
MILENA DO NASCIMENTO
Trabalho de Curso apresentado ao Curso de
Farmácia da Universidade Federal de Mato
Grosso – UFMT, campus de Sinop como
requisito parcial para obtenção do título de
Farmacêutica, sob a orientação da Professora Dra
Gisele Facholi Bomfim
Sinop-MT
2016/2
Dedico este trabalho ao meu pai Sidney do
Nascimento (em memória) pelo exemplo de vida
e inspiração profissional, e à minha mãe Sandra
Regina Menin do Nascimento por seu amor
incondicional e por sempre me incentivar.
AGRADECIMENTOS
“Não há no mundo exagero mais belo que a Gratidão.” (Jean de la Bruyere)
Agradeço primeiramente à Deus que é a força divina que tem me sustentado e me dado forças
nos momentos difíceis, além de estar sempre iluminando e abençoando o meu caminho.
Ao meu pai Sidney do Nascimento (em memória) que foi e sempre será a minha inspiração
profissional e pessoal.
À minha mãe Sandra Regina Menin do Nascimento, que se tornou pai e mãe há 12 anos e não
mediu esforços para que eu pudesse alcançar meus objetivos, sempre me incentivando e
apoiando com seu amor incondicional.
À toda a minha família: meus irmãos Maiara e Paulo Henrique; meu avós maternos Helena e
Leonildo; meus tios Marcia, Marcio, Marcos, Paulo e Ana Paula; meus primos Felipe,
Gabriela, João Vitor e José Otávio; os agregados Thiago e Vera, que já são da família.
Agradeço imensamente por serem a base da minha vida, sempre me dando forças e
incentivando à ir atrás dos meus sonhos, participando de cada conquista em minha vida.
À minha orientadora Dra Gisele Facholi Bomfim, que considero como uma “mãe científica”,
pela oportunidade, paciência, carinho e por todos os conhecimentos compartilhados. Obrigada
por me mostrar o mundo da pesquisa científica e me ajudar a finalizar essa etapa importante
em minha vida.
Aos meus amigos e colegas de sala, “cats da farmácia”: Aléxia, Renata, Caio, Lauren, Juliana,
Maristela, Joyce, Kamila, Kesye, Rosane, Veridiana, Caroline e Charles. Muito obrigada por
toda a amizade e companheirismo que foram essenciais durante os anos da graduação.
À minha melhor amiga, Esther, pelo total apoio, por me suportar nos momentos de
nervosismo e sempre me distrair quando preciso.
À toda equipe UPEX: minhas amigas Renata e Caroline (sempre será parte de nossa equipe),
o apoio e amizade de vocês foi essencial para tornar a rotina dos experimentos mais leve e
agradável. Aos colegas e ex-colegas de laboratório, Bianca, Carina, Amanda, Larissa, Livia,
Thais, Lucas, Manoel, Ana Carolina, Angélica, Gabriel, Miguel, Ingrid, Paulo, Amadeu,
Felipe e Cintia que foram fundamentais, pois sem a ajuda de vocês nenhum experimento
poderia ter sido executado e finalizado de formas melhores. Agradeço também à todos os
professores da nossa equipe, André, Mario, Ricardo, Renata,
Eveline, Marcos, Julio, Nadia e Danilo; especialmente ao professor Mario, por abrir as portas
de seu laboratório e estar sempre disposto a nos ajudar em tudo que está ao seu alcance.
Ao meu co-orientador Dr André Ferreira do Nascimento, que teve um papel importante
durante a licença maternidade da minha orientadora compartilhando conhecimentos e
ajudando durante os protocolos experimentais.
À técnica do laboratório Morenna Giordani, por ser tão prestativa e ajudar sempre em tudo
que é necessário durante os experimentos.
À Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop, e ao Instituto de
Ciências da Saúde, por todo o suporte dado para que minha formação acadêmica fosse
concluída com êxito.
À Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP, que através do XII Curso de Inverno de
Farmacologia me proporcionou um aprendizado ímpar sobre a pesquisa científica.
Principalmente ao Dr Fernando Carneiro pela ótima recepção em seu laboratório e sua
colaboração para com o nosso trabalho.
Aos ratos, que deram suas vidas para os experimentos deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de
iniciação científica e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso pelo apoio
financeiro.
“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo.
Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas
admiráveis.”
(José de Alencar)
RESUMO
NASCIMENTO, M. Papel da obesidade e da disfunção hepática sobre a atividade
vascular de ratos. 2016. 47. Trabalho de Curso de Farmácia – Universidade Federal de
Mato Grosso, Campus de Sinop.
Palavras-chaves: DHGNA, obesidade, cardiovascular
INTRODUÇÃO: Estudos têm demonstrado que a doença hepática gordurosa não alcoólica
(DHGNA) cresce em paralelo ao aumento da obesidade, tornando-se um problema de saúde
pública. A DHGNA também é considerada um fator de risco independente para o
desenvolvimento de doenças cardiovasculares, podendo causar prejuízo na função dos vasos,
entretanto ainda é incerto o papel da DHGNA sobre as propriedades funcionais do sistema
vascular. OBJETIVO: avaliar se ratos com obesidade e inflamação hepática, um modelo de
DHGNA, apresentam disfunção vascular. MÉTODOS: Ratos machos Wistar foram divididos
em quatro grupos: controle (C), dieta ocidental (D), controle e tioacetamida (C+TAA), dieta
ocidental e tioacetamida (D+TAA). A dieta rica em gordura é constituída por ração rica em
gordura e água com açúcar (300g/L). A administração de tioacetamida (100mg.kg), um agente
hepatotóxico indutor de inflamação e fibrose no fígado, foi feita via intraperitoneal, duas
vezes por semana. Após oito semanas foi avaliado a função vascular através da reatividade
vascular, usando anéis isolados de aorta com e sem endotélio. Foram realizadas curvas
concentração resposta (CCR) para fenilefrina, acetilcolina (Ach) e nitroprussiato de sódio
(NPS). Fizemos ainda o bloqueio com L-NAME (inibidor da óxido nítrico sintase).
RESULTADOS: Nas CCR para fenilefrina em anéis de aorta com endotélio, tanto o grupo
C+TAA quanto o D+TAA apresentaram maior EC50 em relação aos grupos C e D
respectivamente (C=6,32±0,4 vs C+TAA=6,8±0,19 e D+TAA=6,52 ± 0,20 vs D=6,080,32).
O bloqueio com L-NAME aumentou a resposta contrátil apenas nos grupos C e D e não
alterou nos animais tratados com tioacetamida. Na ausência de endotélio, a resposta máxima
foi elevada apenas no grupo D+TAA em comparação ao D (D+TAA=1,88 ± 1,03 vs D=1,00 ±
0,37). Em relação ao relaxamento com Ach não houve diferença entre os grupos. No entanto,
nas CCR para o NPS, os grupos D+TAA e C+TAA apresentaram menor EC50 quando
comparados aos seus respectivos controles, sugerindo que a TAA causa um prejuízo no
relaxamento independente do endotélio (C=8.1±0,1 vs C+TAA=7,3±0,4 e D+TAA=7,50,2
vs D=8,3 ± 0,4). CONCLUSÃO: a obesidade induzida pela dieta isoladamente não
comprometeu a função vascular; em contraste, o tratamento com o agente hepatotóxico, foi
um fator relevante para causar uma disfunção vascular, através da menor liberação de óxido
nítrico.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Consumo alimentar dos animais submetidos à dieta hipercalórica e
tioacetamida ............................................................................................................... 28
Tabela 2 – Dados morfológicos dos animais submetidos à dieta hipercalórica e
tioacetamida ............................................................................................................... 28
Tabela 3 – Dados bioquímicos dos animais submetidos à dieta hipercalórica e
tioacetamida ............................................................................................................... 29
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT – Alanina aminotransferase
Ang – Angiotensina
AST – Aspartato aminotransferase
CCR – Curva concentração resposta
CEUA – Comitê de Ética no Uso de Animais
COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
C – Controle
D – Dieta
DCV – Doença cardiovascular
DHGNA – Doença Hepática Gorduroso Não Alcoólica
DMEs – Enzimas metabolizadoras de drogas
DRC – Doença Renal Crônica
EDCF – Fatores Contráteis Derivados do Endotélio
EDHF – Fator hiperpolarizante derivado do endotélio
EDRF – Fatores Relaxantes Derivados do Endotélio
eNOS – Óxido Nítrico Sintase endotelial
ET – Endotelina
EROS – Espécies Reativas de Oxigênio
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IL – interleucina
iNOS – Óxido Nítrico Sintase induzida
LDL – Lipoproteína de baixa densidade
L-NMMA – NG-monometil-L-arginina
NASH – Esteato- hepatite
NO – Óxido Nítrico
NOS – Óxido Nítrico Sintase
OMS – Organização Mundial da Saúde
TAA – Tioacetamida
TNF – Fator de necrose tumoral
TXA – Tromboxano A
VLDL – Lipoproteína de muito baixa densidade
SUMÁRIO
RESUMO 7
LISTA DE ABREVIATURAS 10
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................................
2.1. Obesidade ....................................................................................................................
2.1.1. Fisiopatologia da Obesidade ...................................................................................
2.1.2. Obesidade e reatividade vascular ...........................................................................
2.2. Doença hepática gordurosa não-alcoólica (DHGNA) ..............................................
2.2.1. DHGNA e doenças cardiovasculares ......................................................................
2.2.2. Tioacetamida em modelo de DHGNA ....................................................................
14
14
14
15
17
18
19
3.OBJETIVOS .................................................................................................................... 21
4. MÉTODOS ....................................................................................................................
4.1. Animais ........................................................................................................................
4.2. Modelo de obesidade e DHGNA ................................................................................
4.3. Caracterização do modelo ..........................................................................................
4.3.1. Índice de adiposidade ..............................................................................................
4.3.2. Glicemia ....................................................................................................................
4.3.3. Parâmetros bioquímicos ..........................................................................................
4.3.4. Consumo alimentar ..................................................................................................
4.4. Reatividade vascular ...................................................................................................
4.5. Histologia .....................................................................................................................
4.6. Análise estatística ........................................................................................................
22
22
22
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23
23
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25
26
27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 28
5. CONCLUSÕES .............................................................................................................. 40
REFERÊNCIAS................................................................................................................. 41
ANEXOS ............................................................................................................................ 46
12
1. INTRODUÇÃO
Os hábitos alimentares não saudáveis têm sido cada vez mais observados na população
brasileira e mundial, e quando estes são associados ao sedentarismo, podem ocasionar
aumento de peso como consequência do acúmulo excessivo de tecido adiposo, caracterizando
o desequilíbrio metabólico chamado de obesidade. Indicadores da Organização Mundial de
Saúde mostraram que, no ano de 2014, mais de 1,9 bilhões de pessoas em todo o mundo, com
18 anos ou mais, apresentaram sobrepeso; destes, mais de 600 milhões eram obesos1. Em
relação aos índices de crianças obesas, resultados apontam que no ano de 2013, 42 milhões de
crianças, com idade inferior a 5 anos, já estavam com sobrepeso ou obesas1. No Brasil,
segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), o excesso de peso atingirá
um terço da população brasileira nos próximos dez anos2. Quanto aos dados em infantis, em
1974-75 o excesso de peso atingia 10,9% e 8,6% dos meninos e meninas, respectivamente;
estes valores aumentaram para 34,8% e 32% no período 2008-092. Com estes estudos
podemos comparar os dados e observar que a prevalência da obesidade no mundo mais do que
duplicou nos últimos trinta anos, tornando-se um importante problema de saúde pública.
A obesidade pode ser definida como um excesso de gordura corporal, que pode se
desenvolver por fatores genéticos, ambientais e psicossociais. Essa condição pode influenciar
o estado de bem-estar do indivíduo, visto que o acúmulo de tecido adiposo é considerado um
fator de risco para diversas doenças crônicas como hipertensão arterial, diabetes mellitus,
câncer e doenças cardiovasculares3.
Diversos estudos já demonstraram que a obesidade está relacionada com o
desenvolvimento de doenças cardiovasculares e que indivíduos obesos apresentam prejuízo na
função arterial e disfunção endotelial4. Apesar do fato de que as doenças relacionadas com a
obesidade podem prejudicar a função endotelial, a adiposidade visceral e o depósito de
gordura ao redor dos vasos sanguíneos também podem afetar a função endotelial através da
liberação de fatores vasodilatadores e vasoconstritores, e também de adipocitocinas5-6.
Trabalhos clínicos têm demonstrado que a obesidade está diretamente relacionada com
o desenvolvimento da doença hepática gordurosa não-alcóolica (DHGNA). A DHGNA pode
ser considerada a principal doença hepática crônica do mundo e é caracterizada pelo acúmulo
de gordura (esteatose) nos hepatócitos na presença ou não de inflamação hepática, também
conhecida como esteato-hepatite (NASH), podendo evoluir para quadros mais graves como
fibrose e cirrose. Estima-se que a DHGNA esteja afetando 30% da população adulta de países
ocidentais. Sua alta prevalência é reconhecida como um componente epifenômeno da atual
13
epidemia de obesidade, desde que ambas demonstraram um crescimento em paralelo nas
últimas décadas7.
Devido a sua relação com a obesidade, sugerem-se ainda, que a DHGNA é um
importante fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares como infarto
do miocárdio, acidente vascular cerebral, hipertensão, angina, entre outras. Estudos utilizando
marcadores das doenças cardiovasculares mostram que pacientes com esteatose hepática
comprovada por biópsia, e, em particular, NASH, apresentam disfunção endotelial8, função
diastólica comprometida, aumento da espessura das camadas íntima-média da carótida9-12, e
mostrou uma maior prevalência de placas ateroscleróticas carotídeas em comparação com
pacientes sem DHGNA. Senturk et al.13, relataram que a disfunção endotelial foi pior em
grupos com apenas esteatose ou com NASH quando comparados com os controles, sugerindo
a influência da inflamação no fígado sobre a função vascular. Além disso, Thakur et al.14,
demonstraram a associação significativa entre aterosclerose e disfunção endotelial em um
grupo de índios asiáticos com DHGNA.
Apesar da existência de diversos estudos que relacionam a obesidade com doenças
cardiovasculares e que sugerem que a DHGNA é considerada um fator de risco para o
desenvolvimento destas doenças, ainda não se conhece muito sobre o efeito da DHGNA sobre
o sistema vascular. Sendo assim, o objetivo do nosso estudo foi testar a hipótese de que a
DHGNA é um fator de risco causal para o surgimento de alterações no sistema vascular,
incluindo a disfunção endotelial.
14
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2. 1. Obesidade
A obesidade é caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura corporal no indivíduo.
Pode ser considerada um problema de saúde pública, pois sua prevalência está aumentando e
atingindo proporções epidêmicas. Segundo a OMS, em 2014 mais de 1,9 bilhões de adultos
(com 18 anos ou mais) estavam acima do peso, nos quais mais de 600 milhões eram obesos1.
Além disso, aumenta-se a cada ano o número de mortes devido a doenças relacionadas ao
excesso de peso. Assim, torna-se extremamente importante a realização de estudos
relacionados a essa morbidade e suas consequências.
2.1.1. Fisiopatologia da Obesidade
Estudos têm demonstrado que as células adiposas não são consideradas apenas como
estruturas de proteção e sustentação, mas sim como um verdadeiro órgão responsável por uma
intensa atividade endócrina e metabólica15. A descoberta da leptina, por exemplo, deixou
claro que o tecido adiposo participa ativamente do controle energético e do apetite, através de
seus efeitos sobre o sistema nervoso simpático e função cardiovascular16. Dessa forma, o
excesso de gordura corporal está associado às disfunções metabólicas envolvidas em
mecanismos que resultam no aparecimento de doenças cardiovasculares.
Na obesidade, durante a hipertrofia do tecido adiposo observa-se um aumento da
expressão e liberação das chamadas adiponectinas, como a interleucina (IL) 1β, IL-6,
resistina, leptina e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), que são necessárias para a
diferenciação celular, hematopoiese, dentre outras funções. Porém, suas funções dependem de
suas concentrações na corrente sanguínea, no qual o aumento das mesmas já se torna
responsável por iniciar o processo inflamatório de baixo grau17. Ao alcançarem o hipotálamo,
no Sistema Nervoso Central, essas proteínas interferem na regulação da fome e do gasto
energético exercida por ele. Desse modo, o indivíduo apresenta um desequilíbrio da
saciedade, aumentado assim a ingestão de alimentos e consequentemente seu peso e acúmulo
do tecido adiposo, que acarreta em maior liberação de leptina causando hiperleptinemia.
A leptina, compartilha com a insulina, alvos neuroquímicos e anatômicos no
hipotálamo medial, sendo considerada um sinal adipostático endógeno, induzindo redução no
consumo alimentar18. Ambas as moléculas podem ser consideradas fatores de risco no
desenvolvimento de doenças cardiovasculares, quando associadas à resistência à insulina. Um
exemplo para demonstrar este fato vem de um estudo populacional realizado por Courten et.
15
al19, onde se registrou alta prevalência de diabetes não insulino-dependente e obesidade que se
correlacionaram fortemente aos elevados níveis de leptina. Além disso, a leptina apresenta
característica inflamatória quando está em altas concentrações e sua estrutura é homóloga aos
receptores das citocinas inflamatórias contribuindo para o desenvolvimento do quadro
inflamatório.
A IL-6 é o principal regulador de síntese de proteína de fase aguda com propriedades
pró e anti-inflamatórias20, além de ser induzido por outras citocinas, como o TNF-α21. Altos
níveis de TNF-α estão associados ao desenvolvimento da resistência à insulina no tecido
adiposo22. Além disso, está associada a danos significativos nos tecidos causados por espécies
reativas de oxigênio (EROS) e à promoção da angiogênese23. A IL-6 e o TNF-α também são
responsáveis por promoverem a produção de leptina pelo tecido adiposo, mas a leptina
também aumenta a produção de citocinas inflamatórias24. Sendo assim, a hiperleptinemia está
relacionada com a resposta pró-inflamatória e com o estado sub-inflamatório crônico que é
observado na obesidade. Além disso, a leptina também é responsável por induzir a captação
de colesterol pelos macrófagos, angiogênese e agregação plaquetária, e estimula o estresse
oxidativo nas células endoteliais, inibindo o relaxamento dos vasos sanguíneos e aumentando
o risco de aterosclerose25. A resistina, outra adipocina pró-inflamatória, atua através da
ligação ao receptor Toll-like 426. Além de estar correlacionada com outros marcadores
inflamatórios, a resistina está associada à diminuição da sensibilidade à insulina e ao
desenvolvimento de doenças relacionadas à obesidade, como a doença hepática gordurosa não
alcoólica27.
2.1.2 Obesidade e reatividade vascular
Os vasos sanguíneos são constituídos de uma camada interna, chamada de túnica
íntima, que é formada por células endoteliais. O endotélio é considerado um órgão endócrino
responsável pela manutenção da homeostase cardiovascular. Além de proporcionar uma
barreira física entre o lúmen e a parede do vaso, o endotélio controla o tônus muscular e a
reatividade vascular através da liberação de fatores contráteis e relaxantes. Através da ação de
determinados estímulos, as células endoteliais podem liberar os fatores relaxantes derivados
do endotélio (EDRF), como também liberar fatores contráteis derivados do endotélio (EDCF).
Os EDRFs são a prostaciclina (PGI2), fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) e
o óxido nítrico (NO). Já os EDCFs compreendem as espécies reativas de oxigênio (EROs),
angiotensina II (Ang II), endotelina (ET) e tromboxano A2 (TXA). Em uma condição de
desequilíbrio na produção e/ou liberação tanto dos fatores de contração quanto dos fatores de
16
relaxamento, seja por aumento de EDCFs ou pela redução de EDRFs, caracteriza-se a
disfunção endotelial28.
Apesar dos mecanismos envolvidos não estarem esclarecidos, estudos experimentais
reportam que a obesidade, em diferentes leitos vasculares, é acompanhada por aumento da
liberação de fatores contráteis e diminuição da vasodilatação dependente de óxido nítrico, que
pode ocorrer devido ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio, como o ânion
superóxido (O2-), que inativa o NO29. O NO é um gás, capaz de se difundir pelas membranas
celulares e exercer alta atividade biológica. A produção enzimática do NO ocorre a partir do
aminoácido L-arginina e é mediada por uma família de três sintases de óxido nítrico (NOS),
codificadas por genes distintos30. A óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e a óxido nítrico
sintase neuronal (nNOS) possuem mecanismo de ativação constitutivo. A isoforma induzida
(iNOS) encontra-se expressa em processos celulares anormais, como na insuficiência
cardíaca, induzidas por citocinas e agentes inflamatórios, resultando no aumento do fluxo de
NO30-32. Para avaliar a participação do NO na homeostasia desse sistema, estudos in vivo em
indivíduos saudáveis demonstraram que a administração intra-arterial de NG-monometil-L-
arginina (L-NMMA), um bloqueador inespecífico da atividade das NOS, reduz o fluxo
sanguíneo local entre 25% e 50%33. Embora o tônus vascular basal seja o produto das forças
constritoras versus forças vasodilatadoras, esses resultados demonstram que o NO participa
em uma parte desta modulação.
Na obesidade, a gravidade da disfunção endotelial está correlacionada com o grau de
adiposidade visceral. Os adipócitos e os macrófagos derivados do tecido adiposo secretam
vários fatores, chamados adipocinas, que são capazes de afetar a função endotelial. A
secreção descontrolada das adipocinas pelos adipócitos em indivíduos obesos promove um
estado inflamatório sistêmico, que contribui para o desenvolvimento de doenças
cardiovasculares34. Além disso, já foi demonstrado que o tecido adiposo perivascular também
contribui para a disfunção endotelial por promover a liberação de fatores relaxantes, contráteis
e diversas adipocinas. O processo inflamatório local causado pelas adipocinas derivadas do
tecido adiposo perivascular juntamente com o estado inflamatório sistêmico pode ocasionar
alteração na função endotelial35.
Estudos demonstraram que as citocinas pró-inflamatórias prejudicam a função
endotelial, manifestada pela redução do relaxamento dependente de NO. A redução da
expressão da eNOS foi observada em aortas de camundongos com obesidade induzida por
uma dieta rica em gordura, que exibem marcadores inflamatórios aumentados como o TNF-α
35. Dessa forma, observa-se que a obesidade modifica a regulação da eNOS que,
17
consequentemente, resulta na diminuição da produção de NO que está envolvida com a
redução do relaxamento dependente do endotélio nos animais obesos.
Através da estimulação das fontes de EROS pelas citocinas pró-inflamatórias em
células endoteliais ocorre não só a redução da produção de NO, como também a diminuição
da sua biodisponibilidade, devido ao aumento da biodisponibilidade de EROS34. Embora o
aumento de EROS produzida por células vasculares possa ser observado em artérias de
animais obesos36, as EROS derivadas do tecido adiposo perivascular obeso podem ter ação
parácrina na parede vascular e prejudicar o relaxamento dependente do endotélio6. Sendo
assim, o aumento dos níveis de EROS associado à redução da produção de NO, representa
uma parte do mecanismo da disfunção endotelial na obesidade.
2. 2. Doença hepática gordurosa não-alcoólica (DHGNA)
A doença hepática gordurosa não alcoólica é caracterizada pelo acúmulo de gordura
no fígado denominada esteatose hepática, que pode evoluir para quadros de esteato-hepatite
(NASH), cirrose hepática e até carcinoma hepatocelular37 (Figura 1). A esteatose hepática é
caracterizada por acúmulo de gordura nas células hepáticas, que são os hepatócitos. Já na
esteato-hepatite observa-se acúmulo de gordura associada à inflamação nos hepatócitos. A
DHGNA é uma doença que está associada à síndrome metabólica e pode ser considerada a
principal causa de doença hepática crônica em todo o mundo. Aproximadamente 20 a 30%
dos adultos da população geral dos países ocidentais têm doença hepática gordurosa não
alcoólica e sua prevalência aumenta de 70 a 90% entre pessoas obesas ou com diabetes38.
Além disso, diversos estudos têm demonstrado associações entre a DHGNA e doenças
cardiovasculares (DCV), doença renal crônica (DRC) e câncer colo retal. Em vista dos riscos
relacionados a DHGNA, é necessária a realização de estudos que investiguem os mecanismos
de correlação entre esta e outras doenças para propor novos métodos de prevenção e
tratamento.
18
2.2.1. DHGNA e doenças cardiovasculares
A causa da relação entre a DHGNA e doenças cardiovasculares se deve
principalmente a fatores que encontram-se aumentados nessa condição, como, colesteróis
VLDL e LDL, resistência à insulina, aumento de proteínas de fase aguda como proteína C
reativa e fibrinogênio, fatores estes que estão diretamente relacionados com o
desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Dessa forma o aumento desses fatores
juntamente com o aparecimento de um processo inflamatório com aumento de citocinas pró-
inflamatórias e infiltrado celular, bem como a influência dos e fatores genéticos relacionados,
tornam o aparecimento de doenças cardiovasculares uma consequência da DHGNA39.
Estudos sugerem que os pacientes com DHGNA possuem uma sobrevida reduzida em
comparação com a população geral, e que as doenças cardiovasculares determinam o
resultado, mais do que a progressão da doença hepática. Adams et. al40 demonstrou em um
estudo baseado na população, que 25% da morte relacionada à DHGNA estava ligada ao
infarto agudo do miocárdio e apenas 13% à doença hepática. Outro estudo publicado em
2006, que inclui 212 pacientes com biópsia de DHGNA, encontrou-se que a maior
mortalidade dos pacientes com NASH foi principalmente resultado de DCV e, em menor
grau, de causas relacionadas aos danos hepáticos41.
O aumento da camada intima-média (IMT) da artéria carótida, também têm sido
utilizado para caracterizar o risco de DCV de pacientes com DHGNA42. Targher et al43
demonstraram que pacientes com DHGNA tiveram uma IMT carotídea marcadamente maior
(1,14 ± 0,20 vs. 0,82 ± 0,12 mm, P <0,001) do que os indivíduos controle, sugerindo que a
DHGNA
Figura 1. Histologia do fígado normal, com esteatose e NASH. (Cohen JC et al.
Science 2011; 332:1519-23)
19
gravidade da lesão hepática poderia desempenhar um papel no desenvolvimento da
aterosclerose.
A medida das propriedades elásticas das artérias tornou-se um importante parâmetro
utilizado na pesquisa epidemiológica cardiovascular. A perda de propriedades elásticas
arteriais resulta em uma série de alterações fisiopatológicas relacionadas com a circulação,
incluindo o aumento da pressão de pulso, a hipertrofia ventricular esquerda, isquemia
subendocárdica, disfunção endotelial dos vasos e fibrose cardíaca. Vários estudos recentes
relataram uma forte associação entre DHGNA e propriedades elásticas arteriais. Kim et al44,
indicaram que a presença e o grau de DHGNA estavam associados à rigidez arterial, medida
pela velocidade da onda de pulso braquial-tornozelo, em indivíduos não hipertensos, não
diabéticos, especialmente na ausência de síndrome metabólica.
Outro parâmetro avaliado é a função ventricular esquerda, no qual vários estudos
relataram que a DHGNA estava associada à disfunção diastólica do ventrículo esquerdo,
alterações no metabolismo energético e perturbação do ritmo cardíaco. Goland et al45
descobriram que os pacientes com DHGNA apresentavam características iniciais de disfunção
diastólica do ventrículo esquerdo e geometria ligeiramente alterada do ventrículo esquerdo.
Hallsworth et al46, relataram que adultos com DHGNA tinham parede ventricular esquerda
significativamente mais espessa à sístole e diástole quando comparados aos controles.
Embora muitos estudos já tenham demonstrado a relação entre a DHGNA e o risco de
DCV, vários mecanismos podem estar envolvidos, incluindo predisposição genética,
resistência à insulina, dislipidemia aterogênica, estresse oxidativo, inflamação crônica, níveis
reduzidos de adiponectina e produção alterada de pró e anticoagulantes47. Todos esses
mecanismos podem estar presentes ao mesmo tempo em uma condição de DHGNA. Sendo
assim, faz-se necessária a realização de estudos mais aprofundados sobre cada mecanismo de
forma individual para melhor conhecimento e esclarecimento de suas correlações.
2.2.2. Tioacetamida em modelo de DHGNA
A tioacetamida (TAA), é um agente hepatotóxico bem conhecido para induzir
insuficiência hepática aguda e crônica. A exposição prolongada à TAA resulta sempre na
proliferação dos ductos biliares e cirrose hepática histologicamente semelhante à da infecção
por hepatite viral humana48. Sendo assim, TAA tem sido amplamente utilizada para
desenvolver modelos animais de fibrose hepática e/ou cirrose imitando doenças hepáticas
humanas não-biliares. As doenças hepáticas são causadas por vários fatores que geralmente
levam à desregulação da maioria das enzimas metabolizadoras de drogas (DMEs),
20
especialmente os citocromos P450 (P450s). Visto que os modelos de fibrose e cirrose hepática
induzidos pela TAA têm sido amplamente aplicados para imitar doenças do fígado humano, é
definitivamente importante entender os padrões de desregulação induzidos pela TAA sobre as
DMEs. A TAA é um composto que contém enxofre (Figura 2) e é bioativado por CYP2E1 e
mono-oxigenase contendo flavina para produzir acetamida e tioacetamida-S-dióxido. Estes
metabólitos reativos podem ligar-se covalentemente a várias proteínas, o que é de fato o
principal mecanismo da TAA para causar toxicidade hepática. Com base nestas
características, sugere-se que a intoxicação por TAA pode levar tanto a desregulações
translacionais como à inativação direta de enzimas do sistema citocromo P45049. É importante
lembrar que estudos relatam a ação deste medicamento exclusivamente no fígado, não
apresentando, até o momento, toxicidade em outros órgãos.
Dashti et. al50, relataram a indução de cirrose hepática com a administração de
tioacetamida na água potável (0,3 g / l) durante 16 semanas, verificando nas imagens
histológicas a presença de atipias nucleares e proliferação do tecido hepático, além de
demonstrarem elevados níveis plasmáticos das enzimas transaminases. Guerra et. al51,
também utilizaram a tioacetamida como modelo para indução de cirrose hepática, porém
realizaram o tratamento através da administração intraperitoneal de 200 mg / kg em ratas
Wistar fêmeas por 14 semanas. Furtado et. al52, demonstraram inflamação e cirrose hepática
através da administração intraperitoneal de 200 mg/kg durante 8 semanas, 2 vezes por
semana, em ratos Wistar machos.
Figura 2. Fórmula estrutural da Tioacetamida.
21
3.OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a função vascular em aorta de ratos Wistar em um modelo de obesidade e
disfunção hepática, simulando a doença hepática gordurosa não alcóolica.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar em ratos Wistar obesos e com disfunção hepática os seguintes parâmetros:
Parâmetros bioquímicos: glicemia, ALT, AST, albumina, colesterol, triglicerídeos e
HDL;
Dados morfológicos dos animais (peso antes e após os tratamentos);
Consumo alimentar e a ingestão energética dos animais;
Reatividade vascular em anéis de aortas com e sem endotélio;
Analisar os possíveis mecanismos de ação envolvidos na função vascular;
Avaliar a histologia de aortas e fígados.
22
4. MÉTODOS
4.1. Animais
Os animais utilizados foram ratos Wistar machos, provenientes do Biotério Central da
Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Universitário de Cuiabá. Antes de iniciarmos
o experimento, os animais foram aclimatados à temperatura e umidade controladas, em ciclo
de claro/escuro de 12/12 horas, com oferta de água e ração ad libitum. Após a aclimatação,
quando os animais atingiram cerca de 200 gramas (o peso padronizado para o início do
protocolo experimental) os animais foram divididos de forma aleatória em quatro grupos
(n=8): Controle (C), Dieta hipercalórica (D), Controle mais Tioacetamida (C+TAA) e Dieta
mais Tioacetamida (D+TAA).
Os animais dos grupos C e C+TAA receberam água ad libidum e ração padrão para
roedores (NUVILAB CR-1, Sorgob Indústria e Comércio Ltda, São Paulo/SP, Brasil) na
presença ou não de Tioacetamida (TAA, Sigma-Aldrich®, EUA). Já os animais dos grupos D
e D+TAA receberam água acrescida de sacarose e dieta rica em gordura também na presença
ou não de TAA. A dieta rica em gordura53 foi produzida com a colaboração da professora
Valéria Sinhorin (Laboratório de Bioquímica, UFMT Sinop). Após o período experimental de
8 semanas, os animais foram eutanasiados sob anestesia com tiopental (50mg/kg). O estudo
seguiu as recomendações do Guide for the Care and Use of Experimental Animals, na Lei
11.794/2008, e nos Princípios Éticos na Experimentação Animal adotado pelo Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) que foi aprovado pelo Comitê de Ética no
Uso de Animais (CEUA), sob protocolo n°23108.700353/14-0.
4.2. Modelo de obesidade e DHGNA
O modelo de obesidade foi induzido através da ingestão de uma ração rica em gordura
(Figura 3) e água acrescida de sacarose. A ração rica em gordura é constituída de pó de ração,
caseína, banha, leite condensado, bolacha maisena, mistura vitamínica e mistura mineral.
Foram ofertadas 500 gramas de ração por dia para cada caixa, as quais haviam entre 3 ou 4
animais cada uma. A solução de água com sacarose foi preparada com 300 gramas de açúcar
comercial diluída em 1 L de água quente, no qual foram ofertados 1 L de água acrescida de
sacarose por dia para cada caixa.
Para a indução da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (DHGNA) nos ratos foi
realizada a ingestão da dieta rica em gordura e a administração do agente hepatotóxico
23
tioacetamida (TAA), baseado no trabalho de Furtado et. al.52. A dose administrada de TAA
foi de 100mg/kg via intraperitoneal (Figura 4), duas vezes por semana durante as 8 semanas.
A dose utilizada foi menor que a utilizada no trabalho referenciado, devido à baixa taxa de
sobrevida dos animais, sendo considerada uma dose tóxica.
4.3. Caracterização do modelo
4.3.1. Índice de adiposidade
O índice de adiposidade foi utilizado como indicador do modelo de obesidade. Após a
eutanásia, foram dissecados os depósitos de gordura epididimal, visceral e retroperitoneal dos
animais. A soma dos depósitos normalizada pelo peso corporal [(epididimal + visceral +
retroperitoneal) /peso corporal x 100] foi considerada o índice de adiposidade.
4.3.2. Glicemia
A glicemia dos animais foi medida através da coleta de uma gota de sangue caudal dos
ratos submetidos a privação alimentar de 8 horas e com o auxílio de glicosímetro (InjexSens
II) e fitas reagentes adequadas para esse aparelho.
Figura 3. Ração rica em gordura produzida em nosso laboratório.
Figura 4. Administração por via intraperitoneal em ratos.
24
4.3.3. Parâmetros bioquímicos
Os animais foram submetidos a privação alimentar de 8 horas, anestesiados e
eutanasiados por decapitação. Em seguida, amostras do sangue foram coletadas em tubos
Falcon, centrifugadas (3000rpm; 10 minutos; Eppendorf®Centrifuge 5804-R, Hamburg,
Germany) e o soro foi utilizado para analisar os níveis de: glicemia, albumina, alanina
aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), colesterol, triglicerídeos e
lipoproteína de alta densidade (HDL). Foram utilizados kits da Labtest para a realização
dessas análises.
O princípio do teste para glicemia é que a glicose oxidase catalisa a oxidação da
glicose e o peróxido de hidrogênio formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob ação
catalisadora da peroxidase, através de uma reação oxidativa de acoplamento formando uma
antipirilquinonimina vermelha suja intensidade de cor é proporcional à concentração da
glicose na amostra. Já o princípio do teste para albumina é que o sistema se baseia no desvio
do pico de absortividade máxima de um corante complexo (verde de bromocresol) quando
este se liga à albumina, onde a cor formada é proporcional à quantidade de albumina na
amostra até a concentração de 6,0 g/dL.
Os testes para ALT e AST se baseiam nos seguintes princípios: a ALT catalisa
especificamente a transferência do grupo amina da alanina para o cetoglutarato, com
formação de glutamato e piruvato. O piruvato é reduzido à lactato por ação da lactato
desidrogenase, enquanto que a coenzima NADH é oxidada a NAD. A leitura da absorbância
em 340 nm, consequente à oxidação da coenzima NADH, é monitorada fotometricamente,
sendo diretamente proporcional à atividade da ALT na amostra. Já a AST catalisa
especificamente a transferência do grupo amina do ácido aspártico para o cetoglutarato com
formação de glutamato e oxalacetato. O oxalacetato é reduzido a malato por ação da malato
desidrogenase, enquanto que a coenzima NADH é oxidada a NAD. A leitura da absorbância
em 340 nm, consequente à oxidação da NADH, também é monitorada fotometricamente,
sendo diretamente proporcional à atividade da AST na amostra.
As análises para o colesterol total e para os triglicerídeos das amostras foi realizada
através do método enzimático colorimétrico Trinder, no qual a intensidade da cor vermelha
formada na reação final é diretamente proporcional à concentração do colesterol na amostra
de soro. Enquanto que para a avaliação de HDL foi utilizado método colorimétrico, através de
25
um sistema de precipitação seletiva das lipoproteínas de baixa e muito baixa densidade (LDL
e VLDL) com ácido fosfotúngstico e cloreto de magnésio.
4.3.4. Consumo alimentar
O consumo alimentar de ração, água e ingestão calórica foram controlados diariamente
e calculou-se a média de consumo por animal; a ingestão calórica foi determinada pelo
produto do consumo e teor energético das dietas.
4.4. Reatividade vascular
Para a análise de reatividade vascular foi utilizada a aorta torácica isolada de cada
animal de todos os grupos, dissecada e imersa em solução nutriente de Krebs Henseleit
modificado (mmol/L: NaCl 113; KCl 4,7; CaCl2 2,5; NaHCO3 25; MgSO4 1,1; KH2PO4
1,1; EDTA 0,03; glicose 5,5, pH 7.4), saturado com 95% de O2, 5% de CO2 e mantida a 37
ºC. A aorta torácica foi cortada em anéis de 4mm (Figura 5) sendo que em alguns anéis o
endotélio foi mantido intacto e em outros a camada endotelial foi removida por fricção,
utilizando uma haste fina envolta com algodão embebido em Krebs Henseleit. Em seguida,
um par de ganchos de aço inoxidável, em forma de “L”, foi introduzido no lúmen dos anéis de
aorta.
Os anéis de aorta foram suspensos pelos ganchos e colocados em uma cuba de vidro
em banho para estudo de órgãos isolados (Figura 6), contendo 10 ml de solução de Krebs
Henseleit modificado saturado com 95% de O2, 5% de CO2 e mantido a 37 ºC durante todo o
protocolo experimental. Nessa condição, um dos ganchos foi fixado na base da cuba de vidro
e o outro gancho foi conectado a um transdutor isométrico de tensão (ML T001,
PowerLab/8S, ADInstruments, Ltda) que, por sua vez, está acoplado a um computador.
Durante o período de estabilização, a solução nutriente foi trocada três vezes em intervalos de
10 minutos e a tensão ajustada a 1,5 gramas.
Após este procedimento, foram realizadas curvas concentração-resposta cumulativas
para o agente vasoconstritor fenilefrina e para os vasodilatadores acetilcolina e nitroprussiato
de sódio. Em alguns experimentos o endotélio foi removido dos anéis de aorta friccionando
delicadamente a parte interna da aorta (camada íntima) com o auxílio de uma haste metálica
fina envolta em algodão embebido com solução de Krebs. Além disso, também foram
investigados possíveis mecanismos de ação envolvidos, usando o bloqueador da óxido nítrico
sintase (LNAME). Para comparação entre os grupos foram utilizadas: as respostas máximas
26
(Rmax) produzidas pelos diferentes agonistas e a pD2 (logaritmo da concentração molar que
produz 50% da Rmax) o qual avalia a potência dos agonistas sobre as preparações.
A fenilefrina é um agonista α1-adrenérgico sintético utilizado como agente
vasoconstritor no músculo liso vascular por agir de maneira específica nos receptores
adrenérgicos α-1, promovendo contração através do aumento do cálcio intracelular nas células
musculares lisas. A acetilcolina é um neurotransmissor endógeno liberado por células
nervosas do sistema nervoso autônomo parassimpático. No músculo liso vascular a
acetilcolina age nos receptores muscarínicos M3, acoplados à proteína G, promovendo
vasodilatação através do aumento da produção de óxido nítrico, o vasodilatador mais potente
derivado do endotélio. Dessa forma, a acetilcolina é considerada um vasodilatador dependente
do endotélio. Enquanto que o nitroprussiato de sódio, é um nitrato orgânico que, quando
metabolizado, libera óxido nítrico, responsável por promover o relaxamento do músculo liso
vascular, sendo assim considerado um vasodilatador independente do endotélio.
Figura 5. Anéis de aorta torácica.
Figura 6. Banho para estudo de órgãos isolados.
27
4.5. Histologia
Os animais foram anestesiados e eutanasiados por decapitação. Em seguida, amostras da
aorta e fígado foram coletadas para a análise histológica. O material foi coletado com auxílio
de bisturi, pinça ou lâmina de barbear. Em seguida, as amostras foram fixadas em formaldeído
tamponado. Os tecidos foram então armazenados no fixador por um período entre 6 a 24
horas. Após a fixação, a primeira etapa da inclusão foi feita que é a desidratação, na qual foi
retirada a água dos tecidos e substituída por álcool. A etapa seguinte foi substituir o álcool
presente nos tecidos por xilol. A última etapa foi a impregnação, onde o xilol é substituído por
parafina fundida a 60 ºC em pequenos blocos. Após a impregnação, foi utilizado um
micrótomo para obter cortes sucessivos, delgados e uniformes dos blocos de parafina, estes
cortes então foram utilizados para a montagem das lâminas histológicas que, após serem
coradas com hematoxilina e eosina (HE), foram posteriormente analisadas com auxílio de
microscópio.
4.6. Análise estatística
Os dados estão apresentados em média desvio padrão. A comparação entre os grupos
foi realizada pela Análise de Variância para o modelo de dois fatores independentes (Two
Way ANOVA), e o nível de confiança utilizado foi de 95%.
28
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 1. Consumo alimentar dos animais submetidos à dieta hipercalórica e
tioacetamida
Grupos
Variáveis C C+TAA D D+TAA
Ração (g) 32 0 38 1* 17 0 # 25 1*#
Água (mL) 49 0 38 3 * 38 0 # 36 1 *#
Calorias (Kcal) 120 1 141 3 * 137 2 # 174 8 *#
Dados apresentados em média desvio padrão. C, controle; TAA, tioacetamida; D, ração rica em gordura e água
com açúcar; D+TAA ração rica em gordura e água com açúcar + tioacetamida. * indica p<0,05 na comparação
entre C vs C+TAA ou D vs D+TAA. # indica p<0,05 na comparação entre de D vs C ou D+TAA vs C+TAA.
A Tabela 1 demonstra que houve uma diminuição do consumo alimentar e de água dos
grupos que possuíam dieta quando comparados aos grupos controle. Porém houve uma maior
ingestão calórica dos animais dos grupos que possuíam dieta devido ao seu alto teor de
calorias. Em relação aos grupos que receberam administração de tioacetamida, observou-se
um aumento de ingestão alimentar e de calorias, mas redução da ingestão de água quando
comparados aos seus grupos controles.
29
Tabela 2. Dados morfológicos dos animais submetidos à dieta hipercalórica e
tioacetamida
Grupos
Variáveis C C+TAA D D+TAA
PCI (g) 264 41 263 34 267 49 267 26
PCF (g) 418 40 355 44 * 490 41 # 433 33 *#
AT (g) 0,10 0,03 0,08 0.02 0,10 0,03 0,08 0,02
AT/PCF 0,23 0,06 0,23 0.05 0,20 0,06 0,17 0,05
VD (g) 0,24 0,04 0,20 0.04 * 0,27 0,04 0,22 0,04 *
VD/PCF 0,57 0,09 0,54 0.12 0,55 0,06 0,47 0,08
VE (g) 0,81 0,11 0,66 0.19 0,91 0,08 0,71 0,16 *
VE/PCF 1,94 0,30 1,83 0.46 1,87 0,27 1,53 0,32
Fígado (g) 12 2 12 2 16 2 # 14 2
Fígado/PCF 29 6 34 4 * 33 4 31 4
Gordura retroperitoneal
(g) 9 3 5 2 20 7 # 18 2 #
Gordura epididimal (g) 7 2 4 1 15 4 # 11 3 *#
Gordura visceral (g) 6 2 5 1 13 4 # 13 2 #
Gordura total (g) 21 5 15 4 48 14 # 42 6 #
Indice de adiposidade
(%) 5 1 4 1 10 2 # 9 1 #
Dados apresentados em média desvio padrão. C, controle; TAA, tioacetamida; D, ração rica em gordura e água
com açúcar; D+TAA ração rica em gordura e água com açúcar + tioacetamida; VE, ventrículo esquerdo; VD,
ventrículo direito; AT, átrios; PCF, peso corporal final; PCI, peso corporal inicial. * indica p<0,05 na
comparação entre C vs C+TAA ou D vs D+TAA. # indica p<0,05 na comparação entre de D vs C ou D+TAA vs
C+TAA.
Observou-se na tabela 2, que o peso corporal final dos animais que receberam a droga
diminuiu quando comparado aos seus controles. Observou-se ainda um aumento do peso do
fígado do grupo D sugerindo então que houve um aumento do órgão quando comparado ao
30
grupo C. Além disso, observou-se um aumento em todos os depósitos de gordura
(retroperitoneal, periepididimal e visceral) e consequentemente no índice de adiposidade nos
grupos dieta quando comparado com seus respectivos controles, demonstrando o aumento da
gordura corporal total nos animais que recebram a dieta ocidental, caracterizando o modelo
proposto de obesidade.
Tabela 3. Dados bioquímicos dos animais submetidos à dieta hipercalórica e
tioacetamida
Grupos
Variáveis C C+TAA D D+TAA
Glicemia (mg/dL) 119 18 107 11 140 21 # 129 17 #
Albumina (g/dL) 2,50 0,48 2,35 0,10 2,08 0,18 # 2,39 0,20*
ALT (U/L) 76 8 139 57 * 70 18 80 25 #
AST (U/L) 217 25 354 23 * 196 29 191 52 #
Colesterol (mg/dL) 107 16 86 17 * 102 15 95 15
Triglicerídeos (mg/dL) 73 14 79 31 146 53 # 108 33 *
HDL (mg/dL) 39 5 42 4 39 3 40 3
Ureia (mg/dL) 31 3 49 14 * 29 4 36 7 #
Creatinina (mg/dL) 0,70 0,13 0,88 0,17 * 0,63 0,13 0,69 0,12 #
Dados apresentados em média desvio padrão. C, controle; TAA, tioacetamida; D, ração rica em gordura e água
com açúcar; D+TAA ração rica em gordura e água com açúcar + tioacetamida; ALT, enzima alanina
aminotransferase; AST, enzima aspartato aminotransferase; HDL, lipoproteína de alta densida. * indica p<0,05
na comparação entre C vs C+TAA ou D vs D+TAA. # indica p<0,05 na comparação entre de D vs C ou D+TAA
vs C+TAA.
A tabela 3, demonstra que houve um aumento da glicemia dos grupos dieta quando
comparado aos controles. Sugerindo-se que a ingestão da sacarose acrescida na água alterou
esse parâmetro bioquímico. Além disso, observou-se aumento das enzimas hepáticas ALT e
AST caracterizando o dano hepático, visto que as enzimas são intracelulares e só estão
presentes no soro se houver lise dos hepatócitos.
O modelo de D+TAA inicialmente utilizado para caracterizar a DHGNA mostrou que
os animais realmente ficaram obesos, devido ao aumento do peso corporal e do índice de
31
adiposidade. No entanto, esse modelo não apresentou alterações das enzimas hepáticas visto
que as enzimas ALT e AST não se alteraram quando comparados ao grupo Controle.
Entretanto, de forma interessante, verificamos que a dieta reduziu os níveis plasmáticos da
concentração das enzimas ALT e AST no grupo D+TAA comparando-o com o grupo
C+TAA. Além disso, também observamos um aumento destas enzimas no grupo Controle
tratado com TAA, mostrando que a droga realmente causou o dano hepático desejado.
Além da dosagem das enzimas hepáticas, avaliamos também cortes histológicos do
fígado desses animais. Apesar de não termos quantificado as lesões hepáticas presente nos
animais tratados com dieta e tioacetamida, as imagens representativas demonstradas na figura
7 mostram as diferenças morfológicas.
32
Figura 7. Cortes histológicos do fígado. Imagens representativas da análise histopatológica dos
grupos no aumento de 20x na coluna à esquerda e 40x na coluna à direita. Grupo Controle (A e
B). Grupo Dieta (C e D). Grupo Controle + Tioacetamida (E e F). Grupo Dieta + Tioacetamida
(G e H). Em todas as imagens a barra de escala é 50 µm. Coloração HE.
33
Na análise histológica do grupo Controle, obtivemos cortes histológicos do fígado que
demonstraram a presença de hepatócitos sem alteração histológica em cordões em meio aos
capilares sinusóides ao redor da veia centrolobular (Figura 7A e B). Enquanto que no grupo
Dieta, observamos a presença de hepatócitos com muitas inclusões lipídicas no citoplasma ao
redor da veia centrolobular, demonstrando um quadro de esteatose hepática causado pela dieta
rica em gordura (Figura 7C e D).
Ao analisar os cortes histológicos do fígado dos animais do grupo Controle +
Tioacetamida, observamos a presença de processo inflamatório com leucócitos ao redor da
veia centrolobular e hepatócitos alterados (ex: núcleo picnótico), além de apoptose celular e
quadro de fibrose progredindo à um cirrótico hepática, demonstrando o dano hepático causado
pela administração da Tioacetamida (Figura 7E e F). Enquanto que na análise dos cortes do
grupo Dieta + Tioacetamida, verificamos a presença do processo inflamatório ao redor dos
hepatócitos e hepatócitos com inclusões lipídicas, demonstrando esteatose e inflamação
hepática (Figura 7G e H) conforme se desejava na caracterização do modelo de DHGNA.
Além do fígado, também foram realizadas as análises histológicas da aorta (Figura 8)
dos animais, sendo que não observamos diferenças entre os grupos. Dessa forma, o resultado
vai de acordo com o descrito por um estudo realizado por Marin et. al., no qual demonstraram
que não foram observadas alterações morfológicas significativas em aorta de animais
controles quando comparados ao grupo com dieta hipercalórica.
34
Em relação aos experimentos de reatividade vascular observamos que as curvas
concentração resposta para o agonista vasoconstritor fenilefrina apresentaram um
deslocamento para esquerda em segmentos de aorta em ratos tratados com tioacetamida
quando comparado com seus controles (Figura 9). O grupo D+TAA apresentou menor
resposta contrátil máxima (D+TAA=1,03 ± 0,38 vs D=1,55 ± 0,29) e maior EC50
(D+TAA=6,52 ± 0,20 vs D= 6,08 0,32) quando comparado ao D, enquanto o grupo C+TAA
apresentou diferença apenas na EC50 em relação ao C (C+TAA=6,81 ± 0,19 vs C=6,32 ± 0,40.
Sugerindo-se que a droga hepatotóxica contribui para o aumento da resposta contrátil do vaso,
caracterizando uma disfunção vascular gerada pelo tratamento com tioacetamida e a
associação com a dieta hipercalórica mostrou um efeito contrário, diminuindo a resposta
contrátil do vaso.
Figura 9. Curvas concentração resposta à fenilefrina em segmentos de aorta com endotélio. Cada ponto
representa a média desvio padrão.
Figura 10. Resposta contrátil máxima e EC50 à fenilefrina em segmentos de aorta com endotélio intacto. Dados
apresentados em média desvio padrão. * indica p<0,05 na comparação entre C vs C+TAA ou D vs D+TAA.
35
Para as curvas concentração resposta com o agonista vasoconstritor fenilefrina em
segmentos de aorta na ausência do endotélio observou-se que houve redução da atividade
contrátil em ratos tratados com tioacetamida quando comparado com seus controles (Figura
11). A resposta contrátil máxima foi elevada apenas no grupo D em comparação ao D+TAA
(D+TAA=1,00 ± 0,37 vs D=1,88 ± 1,03), enquanto que não houve diferença para EC50 entre
os grupos (Figura 12).
Quando o endotélio é removido nas preparações de reatividade vascular sob o estímulo
de agente vasoconstritor o que ocorre é um aumento da resposta contrátil quando comparado
com preparações na presença do endotélio. Isso ocorre porque o endotélio vascular, sob o
estímulo da fenilefrina, libera fatores relaxantes e contráteis, no entanto há mais fatores
vasoconstritores do que relaxantes, o que culmina na contração do vaso. Na ausência do
endotélio não há fatores relaxantes sendo liberados portanto o que se observa é apenas o efeito
da fenilefrina diretamente no músculo liso vascular, por isso é observado uma maior
contração deste vaso.
Nas curvas apresentadas observamos uma menor contração vascular do grupo C+TAA
quando comparado com o grupo C, o que nos leva a sugerir que o endotélio do grupo tratado
com o agente hepatotóxico está liberando mais fatores contráteis do que relaxantes, já que na
presença do endotélio esse grupo contraiu mais. Dessa forma sugerimos que a tiocetamida
está causando um dano vascular que gerou uma disfunção nesse vaso.
De forma semelhante, no caso do grupo D+TAA foi observado uma grande
diminuição da resposta contrátil em relação ao grupo D, o que sugere que a droga
hepatotóxica associada a dieta hipercalórica contribui para a piora da resposta contrátil através
da menor liberação de fatores relaxantes derivados do endotélio.
36
Figura 11. Curvas concentração resposta à fenilefrina em segmentos de aorta sem endotélio. Cada ponto
representa a média desvio padrão.
Figura 12. Resposta contrátil máxima e EC50 à fenilefrina em segmentos de aorta sem endotélio. Dados
apresentados em média desvio padrão. * indica p<0,05 na comparação entre C vs C+TAA ou D vs D+TAA.
Em relação ao relaxamento, não houve diferença entre os grupos para o agonista
vasodilatador Acetilcolina (Figura 13). No entanto, nas CCR para o nitroprussiato de sódio, os
grupos D+TAA e C+TAA apresentaram menor EC50 quando comparadas aos seus
respectivos controles (Figura 14). Esse resultado sugere um prejuízo na resposta
vasodilatadora causada pela tiocetamida, visto que o grupo D não teve alteração em relação ao
controle, sugerindo que a dieta sozinha não altera essa resposta.
O NPS é um agente vasodilatador doador de óxido nítrico que pode agir tanto
diretamente no músculo liso vascular liberando NO e gerando uma dilatação ou através da
diminuição da geração de espécies reativas de oxigênio, o que aumenta a biodisponibilidade
37
de NO e favorece a vasodilatação54. Dessa forma a menor resposta ao NPS encontrada nos
grupos tratados com tioacetamida reforça a hipótese da presença de uma disfunção vascular
presente em ratos com disfunção hepática.
Figura 13. Curvas concentração resposta à acetilcolina em segmentos de aorta com endotélio intacto. Cada
ponto representa a média desvio padrão.
C C + TAA Dieta D + TAA0
2
4
6
8
EC
50
Figura 14. Resposta relaxante máxima e EC50 à acetilcolina em segmentos de aorta com endotélio intacto.
Dados apresentados em média desvio padrão. # indica p<0,05 na comparação entre de D vs C ou D+TAA vs
C+TAA.
38
Figura 13. Curvas concentração resposta ao nitroprussiato de sódio em segmentos de aorta com endotélio
intacto. Cada ponto representa a média desvio padrão.
Figura 14. Resposta relaxante máxima e EC50 ao nitroprussiato de sódio em segmentos de aorta com endotélio
intacto. Dados apresentados em média desvio padrão. * indica p<0,05 na comparação entre C vs C+TAA ou D
vs D+TAA
Para verificar o possível mecanismo de ação envolvido nas alterações vasculares
encontradas nas CCR para fenilefrina, fizemos o bloqueio com L-NAME que é o inibidor da
óxido nítrico sintase (NOS), uma enzima responsável pela produção de óxido nítrico, o
principal vasodilatador e responsável pela manutenção da homeostase vascular. Verificamos
que no grupo controle, o bloqueio com L-NAME aumentou a resposta contrátil (Figura 15),
como já era esperado e já foi bem demonstrado na literatura, pois mostra que está havendo
liberação de NO sob o estímulo da fenilefrina e que com o bloqueio da NOS essa liberação
cessa e então há a prevalência apenas de agentes vasoconstritores, o que gera uma maior
contração do vaso. No entanto, no grupo tratado com tioacetamida vimos que não houve
diferença na resposta com L-NAME, mostrando que a droga prejudica a síntese de NO, já que
39
com o bloqueio da NOS não há diferença na resposta contrátil pois não está havendo síntese
de NO por essa enzima, colaborando dessa forma com a disfunção vascular.
O mesmo não foi observado nos grupos dieta (Figura 16), onde vimos que os ratos
com dieta hiperlipídica tratados com tiocetamida tiveram um aumento da resposta contrátil na
presença do L-NAME, quando comparado com os ratos apenas com dieta. Esse resultado
sugere um papel “protetor” da dieta em relação ao prejuízo na síntese de NO causado pelo
agente hepatotóxico.
A disfunção vascular na obesidade é bem controvérsia na literatura, pois a função
vascular nesta condição pode variar de acordo com o leito do vaso e o modelo de obesidade
utilizado. Um estudo demonstrou que a obesidade promove um aumento da resposta contrátil
e redução da resposta vasodilatadora dependente do endotélio no leito arteriolar mesentérico
isolado. Essas alterações foram relacionadas com a redução da produção de NO, aumento da
geração de EROs e redução da razão PGI2/TXA2 no leito arteriolar mesentérico55. Assim, o
papel na manutenção da homeostasia no cenário vascular, é caracterizado por uma harmonia
entre substâncias liberadas pelo endotélio, no qual o NO é visto como um composto de grande
relevância. Caracterizada como uma desordem sistêmica que antecede a aterosclerose e suas
complicações, a disfunção endotelial em artérias coronárias ateroscleróticas foi inicialmente
demonstrada por Ludmer e cols.56 e, depois, relacionada à alteração na biodisponibilidade do
NO. Em trabalhos atuais, mostra-se que a baixa atividade biológica do NO, causada pela
redução na síntese ou pelo aumento da sua degradação através do estresse oxidativo, é
determinada como o mecanismo relevante na disfunção endotelial e de algumas disfunções
cardiovasculares. No processo de disfunção endotelial, ocorre um aumento na produção de
EROs, e estas podem diminuir a disponibilidade de NO por diferentes vias: inativação direta
do NO por superóxido, com formação de peroxinitrito (ONOO-)57; redução na expressão e na
atividade das sintases do NO, por causa das mudanças nos seus substratos ou cofatores, e no
aumento dos níveis de dimetilarginina assimétrica (ADMA)55; e, ainda, desacoplamento da
NOS endotelial causado pela oxidação aumentada de tetraidrobiopterina (BH4)58.
40
3
Figura 15. Curvas concentração resposta à fenilefrina com bloqueio L-NAME em segmentos de aorta com
endotélio intacto dos grupos C e C+TAA. Cada ponto representa a média desvio padrão.
Figura 16. Curvas concentração resposta à fenilefrina com bloqueio L-NAME em segmentos de aorta com
endotélio intacto dos grupos D e D+TAA. Cada ponto representa a média desvio padrão.
Como estudos de função vascular em modelos de DHGNA é algo novo, não existem
trabalhos realizados no qual podemos realizar comparações entre os nossos resultados. Sendo
assim, nosso trabalho demonstrou de forma inédita uma disfunção vascular gerada a partir do
tratamento com um agente hepatotóxico. Dessa forma, pacientes com disfunção hepática
podem desenvolver disfunção vascular e esse pode ser um dos mecanismos relacionados com
o aumento do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares nessa condição.
41
6. CONCLUSÕES
Em resumo, demonstramos no presente trabalho que a obesidade induzida pela dieta
hipercalórica isoladamente não comprometeu a função vascular; em contraste, o tratamento
com o agente hepatotóxico, foi um fator relevante para aumentar a função vasoconstritora e
reduzir a função vasodilatadora da aorta. Sugere-se que o mecanismo envolvido nessa
disfunção vascular gerado pelo tratamento com tioacetamida é a menor biodisponibilidade de
óxido nítrico na aorta.
42
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47
8. ANEXOS
Anexo 1. Protocolo de aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais da
Universidade Federal de Mato Grosso
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![sepse [Modo de Compatibilidade] - INETI · • Sepse grave: sepse + disfunção (cardiovascular, respiratória, hematológica, renal, metabólica, hepática, neurológica) ... UTI](https://static.fdocumentos.tips/doc/165x107/5bfee81209d3f224168c6c90/sepse-modo-de-compatibilidade-sepse-grave-sepse-disfuncao-cardiovascular.jpg)
