Universidade Federal de PelotasCentro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec

Graduação em BiotecnologiaDisciplina de BIOPROCESSOS

Profa. Dra. Patrícia S. Diaz

Fontes Nutricionais para o crescimento dos Microrganismos

Nutrição microbiana

Praticamente quaisquer produtos naturais ou seus derivados orgânicos, basicamente produtos ou subprodutos da agricultura e do processamento de vegetais, podem constituir a base ou substrato para processos fermentativos.

Composição química da célula procariótica

As células procarióticas são compostas, essencialmente por macromoléculas (proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídeos), apresentando também uma menor quantidade de outros compostos orgânicos e inorgânicos. Além destes, encontramos íons e água.

90% de água, 8% de macromoléculas demais componentes.

A maioria das pequenas moléculas são obtidas a partir do meio, sendo as macromoléculas sintetizadas em seu interior.

Os microrganismos exibem os mais diversos mecanismos nutricionais. Em relação aos procariotos (Bacteria e Archaea), a nutrição ocorre predominantemente pela absorção, uma vez que a grande maioria destes organismos possui uma espessa parede celular, impossibilitando a realização de fagocitose.

Os seres vivos podem ser classificados de acordo com as fontes de energia e de carbono que utilizam para seu crescimento:

Nutrientes

São definidos como as substâncias encontradas no ambiente, que participam do anabolismo e catabolismo celular, podendo ser divididos em dois grandes grupos:

MACROnutrientes: necessários em grandes quantidades, tem papel importante na estrutura e metabolismo;

MICROnutrientes: necessários em pequenas quantidades, tem funções enzimáticas e estruturais nas biomoléculas.

Alguns nutrientes são utilizados como fonte de material para a biossíntese das moléculas, enquanto outros correspondem a fontes de energia, necessária aos processos biossintéticos e de manutenção dos organismos. Muitas vezes, diferentes nutrientes podem apresentar os dois papéis descritos acima.

Macronutrientes

Carbono: corresponde à base de todas as moléculas orgânicas. Entre os procariotos melhor estudados até o momento, a maioria requer algum tipo de composto orgânico como fonte de carbono, o qual pode ser de diferentes variedades (aminoácidos, ácidos orgânicos, açúcares, bases nitrogenadas, etc).

Os carboidratos são tradicionalmente a fonte de energia da indústria de fermentação.

Por razões econômicas, a glicose e sacarose puras somente são utilizadas em processos que exijam um controle exato.

Celulose, Amido, Sacarose, Lactose, Glicose, Óleos, Metanol, Etanol; Melaço de cana-de-açúcar – Composição variável (rico em aminoácidos, vitaminas, minerais, vários açúcares); corrigir deficiências (N, P, S); Extrato de Malte: é um extrato aquoso de cevada malteada que contém 90-92% de carboidratos; rico em aminoácidos.

NitrogênioCorresponde ao segundo elemento mais abundante nas células,

compondo proteínas, ácidos nucléicos e peptideoglicano. Podemos encontrar o nitrogênio sob a forma de compostos orgânicos ou inorgânicos, sendo ambas as formas prontamente utilizadas por um grande número de procariotos.

Quanto às necessidades de nitrogênio há três categorias principais de microrganismos:

Retiram o nitrogênio diretamente da atmosfera e o converte em nitrogênio orgânico (especialmente bactérias) – fixadores de nitrogênio;

Utilizam compostos inorgânicos de nitrogênio, como sais de amônio, nitratos e uréia (fungos e bactérias);

Fontes orgânicas de nitrogênio (algumas bactérias). Líquido da maceração do milho (± 4% N);Extrato de levedura e Peptonas (hidrolisado de proteínas).

Extratos de levedura são produzidos a partir de levedura de panificação.

Fontes de peptonas: carne, caseína, gelatina, queratina, farinha de soja, sementes de algodão, amendoim e de girassol.

A composição varia de acordo com a fonte utilizada para obtenção da peptona.

A composição varia de acordo com a forma de obtenção.

Fósforo: encontrado em compostos orgânicos (ácidos nucléicos) ou inorgânicos (fosfatos), sendo importante na composição de ácidos nucléicos e fosfolipídeos. Em sua maioria, os microrganismos utilizam o fósforo sob a forma de compostos inorgânicos.

Enxofre: compondo a cisteína e metionina, estando presente também em várias vitaminas (tiamina, biotina). A principal fonte de enxofre para os microrganismos corresponde aos sulfatos inorgânicos ou H2S.

Potássio: necessário para todos os microrganismos, devido ao seu papel ativador de várias enzimas, tais como aquelas envolvidas na tradução.

Magnésio: necessário geralmente em grandes quantidades, uma vez que tem papel na estabilização de ribossomos, membranas e ácidos nucléicos, sendo também importante para o funcionamento de diferentes enzimas.

Cálcio: embora não seja essencial ao crescimento da maioria dos microrganismos, tem papel de estabilização da parede celular e de termorresistência nos esporos.

Sódio: importante, especialmente para microrganismos marinhos.

Ferro: presente em um grande número de proteínas, especialmente aquelas envolvidas na respiração.

Micronutrientes

Embora necessários em pequenas quantidades, têm papel tão importante quanto os macronutrientes.

Cobalto: necessário apenas para a formação da vitamina B12.

Zinco: tem papel estrutural em várias enzimas (DNA e RNA polimerases) e outras proteínas de ligação ao DNA.

Molibdênio: presente em certas enzimas como a nitrato redutase assimilativa.

Cobre: importante para enzimas respiratórias.

Manganês: ativador de muitas enzimas.

Níquel: presente em hidrogenases.

Fatores de Crescimento

São os compostos orgânicos indispensáveis a um determinado microorganismo, que ele não consegue sintetizar. Tais fatores devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa crescer, como por exemplo vitaminas (especialmente do complexo B), aminoácidos, nucleotídios, ácidos graxos, entre outros.

Seu crescimento será limitado pela quantidade desse fator presente no meio. Dentro de certos limites, o crescimento será proporcional ao teor do composto limitante.

As vitaminas correspondem ao fator de crescimento mais comum para os microrganismos, atuando na maioria das vezes como parte de coenzimas. biotina - Biossíntese de ácidos graxos, b-decarboxilações, fixação de CO2; tiamina (B1) - a-decarboxilações e transcetolase piridoxina (B6) - transformações de aminoácidos e ceto ácidos cobalamina (B12) - redução e transferência de fragmentos únicos de carbono, síntese de desoxirribose.

OBS: As bactérias dos gêneros Streptococcus e Lactobacillus têm uma necessidade por vitaminas maior do que aquela exibida pelo homem.

Água

Não constitui um nutriente, mas é absolutamente indispensável para o crescimento dos microrganismos.

Seu papel é múltiplo: Os microrganismos se nutrem pela passagem de substâncias em solução através da membrana citoplasmática; Exerce função na regulação da pressão osmótica e, Regulação térmica.

A maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecação, a não ser quando esta é precedida pelo congelamento brusco (liofilização).

Oxigênio atmosférico

Como a água não é um nutriente e funciona apenas como receptor de hidrogênio nos processos de respiração aeróbica. Os microrganismos se comportam diferentemente em presença de O2 livre:

Aeróbios – exigem oxigênio livre; Anaeróbios – não toleram a presença de O2 livre;Facultativos – crescem na presença ou ausência de O2.

Meio de cultura – Mosto

Os meios de cultura são soluções de nutrientes utilizadas para promover o crescimento de microrganismos.

Não existe um meio de cultura universal, mas existem vários tipos de meios para diversas finalidades.

Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e proporção adequada.

Meio de cultura X Mosto

Meio de cultura – preparado e utilizado em laboratório, meio sintético.

Mosto – é toda mistura açucarada, oriunda de frutas, destinada a fermentação alcoólica.

Em vinicultura, o termo é utilizado para referir-se ao sumo de uvas frescas utilizado antes do processo de fermentação.

Também é um termo usado na elaboração da cerveja, sendo o produto da fase da mosturação ou brassagem, que compreende a mistura do malte triturado com água, a uma temperatura específica.

Classificação dos meios de cultura

SINTÉTICO: composição conhecida quantitativamente e qualitativamente é usado em pesquisas quando se quer controlar exatamente o curso de uma fermentação. O objetivo é saber a rota de fermentação, saber quanto e quando e quais os substratos que estão sendo utilizados pelos microorganismos. Tem um alto custo.COMPLEXO: composição não é bem definida, estão enquadrados os meios naturais tais como: caldo-de-cana, melaço, suco de uva, extrato de leveduras, enquadram-se todos os mostos naturais.

Características dos meios de cultura

Requerimentos básicos:

1) Proporcionar o máximo rendimento de produto ou biomassa por grama de substrato usado;

2) Produzir a máxima concentração de biomassa ou produto;

3) Permitir o máximo rendimento na formação do produto;

4) Produzir o mínimo de subprodutos indesejáveis;

5) Ser de uma qualidade permanente e estar disponível durante o ano todo;

6) Não sofrer degradação durante a esterilização;

7) Não deverá causar problemas em outras etapas do processo fermentativo particularmente: aeração, agitação, extração, purificação e tratamentos dos efluentes.

Meios de cultura laboratoriais

Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais. Os meios de cultura laboratoriais são divididos de acordo com uma utilização específica:

Meios para anaeróbios: adição de agentes redutores (tioglicolato de sódio)

Meios seletivos: favorece o crescimento de um tipo particular ou suprime outros. Ex. meio ágar verde brilhante.

Meios diferenciais: para diferenciar microrganismos dentro de uma cultura mista. Ex. meio com sangue para distinguir as hemolíticas. Ex. Meio McConkey que contém sais de bile e cristal violeta.

Meios de enriquecimento: se objetiva o aumento de uma determinada espécie sem inibir as demais. Ex. isolar bactérias que oxidam fenol, fornecendo fenol como única fonte de carbono.

Meios de cultura Industriais – Mostos

Matéria prima - Tipos

Amiláceas

Amido

Sacaríneas Celulósicas

Sacarose Celulose

Glicose Frutose

Condições ambientais para o crescimento dos Microrganismos

Temperatura Oxigênio pH Pressão osmótica

O crescimento dos microrganismos é grandemente afetado pelas condições físicas e químicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem influir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo em questão.

Temperatura

Corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam o desenvolvimento bacteriano.

A medida que há um aumento da temperatura, as reações químicas e enzimáticas na célula tendem a tornar-se mais rápidas, acelerando a taxa de crescimento.

Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturação de proteínas e ácidos nucléicos, inviabilizando a sobrevivência celular.

Grupos:

1. Psicrófilos – temperatura ótima abaixo de 15 oC, suscetíveis de crescer a 0 oC.

2. Mesófilos – temperatura ótima entre 20 - 40 oC, maioria dos patógenos humanos.

3. Termófilos – temperatura ótima acima de 45 oC.

m velocidade específica de crescimento máxima

Ponto de máximo crescimento do microrganismo

Oxigênio

Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio

aerotolerante

Meio gelatinoso com indicador redox:

Rosa quando oxidado

Incolor quando reduzido

Durante as reações de redução do O2 são formados vários intermediários tóxicos.

Ex: H2O2, OH°, O2-

Os microrganismos aeróbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas tóxicas

Extremamente importante no desenvolvimento, uma vez que os microrganismos comportam-se de forma bastante distinta, sendo classificados como aeróbios, anaeróbios estritos, anaeróbios facultativos, microaerófilos e anaeróbios aerotolerantes.

pHAo contrário da temperatura, o pH ótimo para o crescimento

encontra-se no valor médio da variação sobre o qual o crescimento acontecerá.

Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o crescimento de diferentes tipos de microrganismos.

Bactérias - faixa entre 7, com algumas acidófilas (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5) e outras alcalifílicas (Bacillus e Archaea).

Fungos - tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH <5).

Quando cultivados in vitro, o meio sofrerá alterações à medida que os metabólitos ácidos ou alcalinos são produzidos.

Necessário a adição de um tampão ao meio.

Fungos

Bactérias

m velocidade específica de crescimento máxima

Pressão osmótica

Não devem existir grandes diferenças na concentração de solutos dentro e fora da célula, pois podem desidratar-se ou romper-se.

Exemplo: microrganismos marinhos necessitam de teores de sais mais elevados.

Desidratação

Rompimento

Equilíbrio