Métodos de Transformação de Plantas
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LGN0232 - Genética Molecular
Métodos de Transformação de Plantas
7ª aula
Antonio Figueira
CENA
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• O processo de introdução de sequências (genes) de interesse emorganismos chama-se transformação genética
• O gene sendo transferido para o organismo é chamado de transgene
• Organismos com modificações genéticas que recebem um transgenesão denominados de transformados ou transgênicos;
• Organismos Geneticamente Modificados (OGM)
NÃO É TODO OGM QUE É UM TRANSGÊNICO!
Conceitos Importantes
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Métodos de Introdução de Genes na Célula
Altamente dependente do organismo!
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OGM = Organismos Geneticamente Modificado
•algodão
•batata
•milho
•soja
•milho
•canola
•outras
Exemplos de culturas atuais
Culturas resistentes à herbicida Culturas resistentes à insetos
Engenharia Genética em Plantas
GMO = Genetically Modified Organism
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• Seleção de tecido vegetal competente para propagação ou regeneração
• Método de transferência do gene de interesse (biológico ou físico)
• Identificação de células transformadas por seleção – marca de seleção
• Regeneração de plantas a partir de células transformadas
• Plantas transgênicas analisadas para confirmar presença do transgene -herança e estabilidade
• Plantas transgênicas avaliadas para performance no campo.
Etapas para a Transformação Genética da
Plantas
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Introdução do DNA dentro da célula vegetal
Regeneração da planta
Seleção
Construção sintética do transgene
Melhoramento
Em Síntese
Totipotência = capacidade
de regeneração da planta a
partir de uma única célula
Confirmação
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Célula Vegetal
núcleo
parede celular membrana
citoplasmática
transgene1. DNA pode ser transferido para a célula
vegetal por meio biológico (via
Agrobacterium) ou físico (bombardeamento
com micropartículas),
2. DNA deve cruzar várias barreiras
3. DNA deve se integrar ao cromossomo no
núcleo da célula vegetal
4. Cada célula transformada é única
5. Número de células transformadas é
mínimo.
citoplasma
Transferindo DNA para Células de
Plantas
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Agrobacterium
• Bactéria fitopatogênica de solo que tem a capacidade de transferir
parte do seu DNA para dentro da célula da planta
• No laboratório, a bactéria é colocada em cultura junto com as
células de plantas, ou inoculada no tecido da planta, transferindo
parte do seu DNA para as células da planta
Bombardeamento (Biobalística)
• Micropartículas de ouro ou tungstênio são recobertas com DNA e
aceleradas em direção ao tecido da planta (hélio comprimido)
• As partículas perfuram a parede celular e penetram dentro da célula
• Utilizado quando não é possível por incompatibilidade biológica o
uso de Agrobacterium - em monocotiledôneas.
Métodos para a Introdução do Transgene
na Planta
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Bombardeamento de microprojéteis
“Biolística” ou gene gun
Partículas são cobertas de DNA
e aceleradas para dentro da
célula da planta.
Método Biológico x Físico
Agrobacterium tumefaciens
Propriedade natural da bactéria
Agrobacterium de transferir DNA
para dentro da célula da planta.
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• Bactéria de solo Gram-negativa, tipo bacilo
• Causa ‘galha da coroa’ (crown gall disease): videira, maçã, etc.
• Afeta mais dicotiledôneas e pouco monocotiledôneas
• Família Rhizobiaceae
• Erwin Smith – descreveu em 1892
• Outras espécies:
–Agrobacterium rhizogenes -raiz em cabeleira (“hairy root”)
–Agrobacterium radiobacter - não tumorogênica (sem Ti)
Agrobacterium tumefaciens
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Galha da Coroa
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Patogenicidade
natural de
A. tumefaciens
Opinas: fonte de C e N para Agrobacterium
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Agricultural biotechnology: Gene exchange by design (Nature 433, 583-584 2005)
Patogenicidade
natural de
A. tumefaciens
Animação
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Planta ferida
• Libera substâncias que atraem a agrobactéria
• Ativa genes da região de virulência
Contato planta-bactéria
• As bactérias sintetizam microfibrilas de celulose para favorecer a formação de agregados de células bacterianas em volta do tecido vegetal ferido
Inserção do
T-DNA
• o T-DNA integrado ao genoma vegetal é expresso de forma estável
• A síntese de auxinas e citocininas (oncogenes) levam a planta a um desbalanço hormonal
Síntese de Opina
• Quanto mais a célula da planta se divide maior é a produção de opina e o nicho da agrobactéria se torna extremamente favorável
• Somente a linhagem indutora é capaz de catabolizar a opina produzida como fonte de energia, carbono e nitrogênio
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Apesar de sua origem procariótica, a expressão
dos genes presentes no T-DNA só é possível
por serem os sinais de regulação desses genes
reconhecidos pelo sistema de transcrição
eucarioto vegetal!!
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• Infecção natural – ferimentos
• Quimiotactismo - fenóis, açúcares, amino ácidos
• Expressão de genes da bactéria transferidos e integrados de forma estável ao genoma vegetal
• Formação de tumores;
• Capacidade tumorogênica - plasmídeo Ti =
• Ti = Tumor Inducing - 150 a 250 kpb
• Regiões do plasmídeo Ti importantes:
• região T-DNA - Transfer DNA
• região vir - genes de virulência
Agrobacterium
Plasmídeo Ti
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Região T-DNA
• Tamanho: de 12 a 24 kb
• Limitada por sequências repetidas = bordas
• bordas direita (RB) e esquerda (LB) - delimitam T-DNA
• Contém genes de síntese de reguladores de crescimento (hormônios vegetais) e de opinas
• Transferem genes para direcionar metabolismo para manutenção da Agrobacterium
Plasmídeo Ti
Agrobacterium
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Região vir
• genes responsáveis pela síntese de enzimas da transferência e integração do T-DNA
Plasmídeo Ti
Região vir é suficiente para transferir
qualquer T-DNA - reconhece bordas
Gene indutores de tumores podem
ser retirados e substituídos no T-
DNA
Ti desarmado
Agrobacterium
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TRANSFERÊNCIA DO TRANSGENE
Característica de interesse
Elementos essenciais ao
processo de transferência
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Precisa conter no mínimo:
1. Gene de interesse
• A região de interesse e seus elementos controladores
2. Gene Marcador de seleção
• Diferenciar células/plantas transformadas e não transformadas
Construção Sintética do Transgene
A característica de interesse pode e deve ser
engenheirada…
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REGIÃO CODIFICANTE Sinal poli APROMOTOR
Transgene
Genes bacterianos•Resistência a antibiótico
•Origem de replicação
Marca de seleção na planta
Construção
Sintética
Vetor Plasmidial
Construindo o Transgene
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Transformação via Biobalística
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Transformação via Biobalística
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Transformação via
Bombardeamento
Biobalística
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Todos os protocolos de transformação introduzem o
DNA nas células de plantas em cultura de tecidos
• Cultura in vitro permite a regeneração de plantas
férteis a partir de uma única célula
• Grande número de células alvo na forma de calo
• Estabelecimento, manutenção e regeneração de
plantas é bastante trabalhoso e com um alto grau
de dificuldade
• Métodos estão limitados a alguns genótipos,
geralmente de variedades não comerciais
• Pode introduzir mutações (alterações) não
desejáveis (variantes somaclonais)
Transformação – Célula Alvo
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1 em 1.000 células terá o DNA integrado no
genoma na planta
Células transformadas são marcadas pela
Co-introdução de um gene de resistência a agentes
seletivos
Células transformadas são selecionadas pela morte
de células não transformadas pelo agente seletivo
Dois principais agentes seletivos: antibióticos
herbicidas
Marcadores seletivos auxiliam os passos seguintes
de estudos sobre a herança do transgene.
Células em cultura
(seleção)
Ensaio resistência à herbicida
transgênico não-transgênico
Resistente Susceptível
Transformação - Seleção
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Transformação – Seleção e Confirmação
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Transformação -
Confirmação
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www.cpac.embrapa.br/download/285/t
Princípios da Cultura de Tecidos Vegetais
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Regeneração depende do explante..
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Etapas no Laboratório
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ProliferaçãoDesenvolvimento
Germinação
Planta regenerada
Sementes imaturas
Cultura de tecidos de soja
Indução
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Com o auxílio da
engenharia genética
Pelos métodos
clássicos
Fonte de GenesFonte de Genes
Plantas, Bactérias,
Fungos e Vírus
Plantas da mesma
espécie ou relacionadas
Identificação, Isolamento,
síntese de genes
Transferência de
genes para células
Regeneração de plantasHibridização
Avaliação de caracteres
importantes
Avaliação
Testes quantitativos Testes qualitativos
Seleção
Avaliação Final
Variedade Comercial
S
E
L
E
Ç
Ã
O
V
A
R
I
A
Ç
Ã
O
Pedro C. Binsfeld, Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento
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Retrocruzamento e seleção (6 - 8 gerações)
Linha
transgênica
Cultivar comercial
x
x
x
Linhagem transgênica
comercialBiotecnologia
Construção da Cultivar Transgênica
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The Golden Rice Story
• Deficiência em vitamina A é um problema importante de saúde
pública
• Causa cegueira
• Influencia na severidade de diarreias e sarampo
• >100 milhões de crianças tem este problema
• Para muitos países a infraestrutura não existe para entregar pílulas
de vitaminas
• Melhorar o conteúdo de vitamina A em cereais parece uma
alternativa atrativa
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Via do -Caroteno em Plantas
IPP
Geranylgeranyl diphosphate
Phytoene
Lycopene
-carotene(precursor de vitamina A)
Phytoene synthase
Phytoene desaturase
Lycopene-beta-cyclase
ξ-carotene desaturase
Problema:
Arroz faltam
estas enzimas
Normal
Vitamina A
“Deficiente”
arroz
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The Golden Rice
IPP
Geranylgeranyl diphosphate
Phytoene
Lycopene
-carotene(precursor de vitamina A)
Phytoene synthase
Phytoene desaturase
Lycopene-beta-cyclase
ξ-carotene desaturase
Daffodil gene
Um Gene de bactéria
realiza as duas funções
Daffodil gene
Adicionar os genes da via do -Caroteno
via
Vitamina A
está completo
e funcional
Golden
Rice
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RoundUp Ready
Antes Depois
Teste Final dos Transgêncios
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http://cdn.intechopen.com/pdfs/18820/InTech-Genetic_transformation_of_forest_trees.pdf
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Microinjeção
Por meio de agulhas microscópicas é injetado DNA no núcleo da célula alvo
- rotina para transformação de célula animais- utiliza micromanipulador- complexo e demorado
Transformação de Animais
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+ -
Muramatsu et al. (1997) – ELETROPORAÇÃO
DNA recombinante + transgenia em embriões de frango
DNA exógeno
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Eletroporação dos embriões - SOMITOS
Eletroporação in ovo
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Nakamura et al., 2004
Eletroporação dos embriões – TUBO NEURAL
Eletroporação in ovo
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CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats) + Cas (CRISPR-associated)
https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(15)01705-5.pdf
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CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats) + Cas (CRISPR-associated)
Sistema Imune Adaptativo
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https://www.youtube.com/watch?v=0Mkie4R7haA
https://www.youtube.com/watch?v=47pkFey3CZ0
https://www.youtube.com/watch?v=MnYppmstxIs
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https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats) + Cas (CRISPR-associated)
CRISPR-Cas9
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https://www.youtube.com/watch?v=UfA_jAKV29g
https://www.youtube.com/watch?v=TnzcwTyr6cE
https://www.youtube.com/watch?v=jAhjPd4uNFY
Animações
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Bibliografia Recomendada
Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento de Plantas
Ed(s) Borém, A. Fritsche-Neto, R. (2013)
Cap 7 – Plantas Transgênicas, pp. 229-266.
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ESTUDO DIRIGIDO
1. Conceitos referentes a transgênicos
2. Transformação por agrobactéria
3. Transformação por biobalistica
4. A importância da cultura de tecido na transformação de plantas
5. Transformação animal
6. Técnica de CRISPR