Motilidade da associação entre uma diatomácea cêntrica e ... · Sra Zezinha e Lisa por...
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Yonara Garcia Borges Felipe
Motilidade da associação entre uma diatomácea cêntrica e um ciliado peritríquio
e suas possíveis consequências ecológicas
Dissertação apresentada ao Instituto
Oceanográfico da Universidade de São
Paulo, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências,
Programa de Oceanografia, área de
Oceanografia Biológica.
Orientador: Prof. Dr. Rubens Mendes Lopes
São Paulo
Maio de 2018
ii
Universidade de São Paulo
Instituto Oceanográfico
Motilidade da associação entre uma diatomácea cêntrica e um ciliado peritríquio
e suas possíveis consequências ecológicas
Yonara Garcia Borges Felipe
Dissertação apresentada ao Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo,
como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências, área de
Oceanografia Biológica
VERSÃO CORRIGIDA
Julgada em ____/____/____
_____________________________________ _______________
Prof(a). Dr(a). Conceito
_____________________________________ _______________
Prof(a). Dr(a). Conceito
_____________________________________ _______________
Prof(a). Dr(a). Conceito
iii
Para minha família Dinalda, João Inacio,
Matheus, Catarina e Aécio,
com muito amor.
iv
Agradecimentos
Ao meu orientador Prof. Dr. Rubens Mendes Lopes pelo carinho, paciência,
conhecimento, conversas, conselhos e amizade. Obrigada por acreditar no meu trabalho
e me proporcionar um grande crescimento profissional e pessoal.
Ao Prof. Dr. J. Rudi Strickler pela disposição e paciência em compartilhar seu
conhecimento sobre sistemas ópticos, bem como suas contribuições intelectuais para o
desenvolvimento deste trabalho.
À Prof. Dra Sylvia Susini por ter disponibilizado parte de seu tempo para me
ajudar com as análises em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Gostaria de
agradecer por ser esta pessoa linda, pela amizade e por todo carinho que recebi em
minhas visitas a Ilhéus que me proporcionaram além de conhecimento científico, muito
crescimento pessoal.
Aos amigos do LAPS (Maiá, Leandro, Catarina, Alessandra, Claudinha, Carol
Maciel, Bruno, Rafaella, Cássia, Damián, Felipe, Gelaysi, Josi, Luciana, Silvana, Yumi,
Carol Suwaki, Carol Lara, Adrian e Martinha) pela amizade, ajuda, conversas, risadas e
dias de descontração.
Às gordas da minha vida, meu love Alessandra, Claudinha e Carol Maciel por
me emprestarem suas famílias (mamis Angélica e Elidamar e papis Alexandre e
Onésimo), por não deixarem que eu me sentisse sozinha nesta nova vida, por sempre
estarem ao meu lado em momentos bons e ruins e pelos dias mais divertidos em
Ubatuba e São Paulo.
À Maiá por ser esta pessoa linda, calma, organizada e cheirosa que me ajudou a
dar os primeiros passos no sistema óptico.
Ao Leandro Ticlia pelo desenvolvimento dos softwares de filmagem (LCR) e
de aquisição das trajetórias (LPD). Também gostaria de agradecer pela grande amizade,
disposição, paciência e por toda ajuda que você me deu neste trabalho, parte do ponto
final que foi dado aqui eu devo a você.
À Martinha por toda paciência, ajuda, conversas, conselhos e colo que uma
típica mãe (mãe do LAPS) nos dá.
v
Ao Felipe e Damián pela paciência e apoio essencial nas análises finais do meu
trabalho.
Aos meus amigos do Laboratório de Aquicultura da base de Ubatuba (Ricardo,
Rafael e Júlio) pelas boas conversas e pelo café que salva o dia.
Ao Ricardo, meu grande irmão em Ubatuba. Obrigada pela amizade, risadas,
conselhos, reflexões e apoio que sempre recebo.
Aos funcionários da base de Ubatuba, obrigada pela amizade, conversas e
gentilezas de cada dia. Em especial gostaria de agradecer à Vânia, Dona Cida e Bete por
sempre me tratarem com tanto carinho.
À todos os amigos que fiz no Instituto Oceanográfico (IO-USP), obrigada pelas
companhias, conversas, risadas, cafés e todos os momentos compartilhados.
À secretaria da Pós-graduação, por sempre me atenderem muito bem e pela
amizade.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pela concessão da bolsa de Mestrado.
Às meninas do Blog Bate-papo com Netuno que me permitiram fazer parte
desse lindo trabalho que leva a ciência para além da academia, além de ajudar a
combater preconceitos relacionados a gênero que ainda ocorrem na ciência. Obrigada
pela experiência, conhecimento e paciência em momentos que precisei estar ausente.
Aos meus amigos de Juiz de Fora e Argirita, em especial Michele, Pedro, Mari,
Jana, Leandro e Yuri, que apesar da distância sempre continuam em meu coração.
À minha família, meu porto seguro. À minha linda mãe Dinalda, ao meu pai
João Inacio e meu irmão Matheus, por sempre me apoiarem em minhas escolhas e
sempre estarem ao meu lado nos momentos bons e ruins. Aos meus avós Catarina e
Aécio que são meus amores, meus pais, meu bem maior. Aos meus anjinhos Meg, Gigi,
Sra Zezinha e Lisa por compartilhar comigo esse amor tão puro. Aos meus Bisavós
Lourdes e Geraldo que no início desta caminhada viraram estrelinhas, mas tenho certeza
que sempre estarão comigo me guiando. À minha tia Thida por sempre ser essa pessoa
linda e topar minhas ceias de última hora. E em especial, ao meu tio Nando que abriu as
vi
portas de sua casa pra me receber quando precisei me mudar para São Paulo, saiba que
sempre estarei ao seu lado e não desistirei de te ajudar nunca, pois eu te amo!
E à Deus, que sempre iluminou meu caminho e me ajudou a tomar as decisões
certas. E a todos que de certa forma tornaram a realização deste trabalho possível.
vii
Sumário
Introdução....................................................................................................1
Objetivos.......................................................................................................5
Materiais e Métodos....................................................................................6
Resultados..................................................................................................17
Discussão....................................................................................................36
Considerações finais e perspectivas.........................................................42
Referências bibliográficas.........................................................................43
viii
Índice de Figuras
Figura 1: Chaetoceros coarctatus em associação com o ciliado Vorticella oceanica. A)
Adaptado de Lee et al., 2014. B) Adapatado de Cupp, 1943............................................4
Figura 2: Localização das estações de coleta situada na plataforma interna ao largo de
Ubatuba, litoral norte do estado de São Paulo. A) Estação próxima à Praia do Flamengo;
B) Estação Boqueirão........................................................................................................6
Figura 3: Representação esquemática do sistema óptico 3D. Os LEDs representam a
fonte emissora de luz, que passa através de uma lente colimadora (tornando os feixes de
luz paralelos) atravessando o aquário e a lente focalizadora, produzindo a imagem. As
fontes emissoras de luz deste sistema são LEDs infravermelhos......................................9
Figura 4: Configuração do sistema óptico configurado em 3D. O sistema observacional
foi construído sobre a mesa óptica Smart Table Newport com controle de vibração e
suspensão pneumática......................................................................................................10
Figura 5: Interface do software LPD (LAPS Plankton Detector). A linha vermelha
representa um exemplo de trajetória realizada pela associação Chaetoceros-
Vorticella.........................................................................................................................11
Figura 6: No esquema acima, a posição P (x, y, z) de uma partícula em um instante de
tempo é construída a partir de duas imagens em 2D.......................................................12
Figura 7: Esquema do deslocamento do organismo. Os pontos representam a posição
XY e o tt representa o ângulo de rotação (Adaptado de Edgar et al.,
2014)................................................................................................................................14
Figura 8: Representação do cálculo do NGDR para cada ponto da trajetória. O ponto
vermelho (Pi) representa o ponto central do segmento analisado...................................15
Figura 9: Trajetórias da associação Chaetoceros-Vorticella obtidas pelo LPD e
processadas no MATLAB® R2013. Foram identificadas três principais categorias de
padrões de deslocamento realizados pela associação: retilíneo (A), helicoidal (B) e
curvado (C). O volume em que a trajetória ocorre (cubo com dimensões de 2 cm x 2 cm
x 2 cm) representa o campo focal localizado no centro do aquário.................................18
ix
Figura 10: Mediana da velocidade média da associação Chaetoceros-Vorticella. No
boxplot, as linhas superior e inferior em cada uma das categorias representam o primeiro
e o terceiro quartil (Q1 e Q3), respectivamente; a linha central representa a mediana. Os
pontos em cada uma das categorias representa a distribuição dos dados. Os pontos
acima e abaixo dos quartis Q1 e Q3 correspondem aos bigodes (whiskers) que mostram
a dispersão dos dados. O teste Shapiro-Wilk indicou que os dados não são normais
(p<0,05). Não houve diferença significativa entre as categorias de deslocamento de
acordo com o teste Kruskal-Wallis (p=0,06)...................................................................20
Figura 11: Variação da velocidade instantânea em cada uma das 75 trajetórias,
agrupadas por categoria de deslocamento. Cada trajetória é representada por um
boxplot. As linhas superior e inferior em cada caixa representam o primeiro e o terceiro
quartil (Q1 e Q3), respectivamente; a linha central representa a mediana. Os pontos
acima e abaixo dos quartis Q1 e Q3 correspondem aos bigodes (whiskers) que mostram
a dispersão dos dados. Os sinais vermelhos representam os outliers da velocidade
instantânea em cada trajetória .........................................................................................21
Figura 12: Porcentagem da velocidade instantânea de acordo com as categorias de
trajetórias.........................................................................................................................23
Figura 13: Mediana da dimensão fractal da associação Chaetoceros-Vorticella. No
boxplot, as linhas superior e inferior em cada uma das categorias representam o primeiro
e o terceiro quartil (Q1 e Q3), respectivamente; a linha central representa a mediana. Os
pontos em cada uma das categorias representa a distribuição dos dados. Os pontos
acima e abaixo dos quartis Q1 e Q3 correspondem aos bigodes (whiskers) que mostram
a dispersão dos dados. De acordo com o teste Shapiro-Wilk, os dados são paramétricos
(p>0,05). As categorias são significativamente diferentes de acordo com o teste
ANOVA (p<0,0001) e teste post-hoc de Tukey com p<0,05..........................................24
Figura 14: Trajetória retilínea. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma
projeção 2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em
todo o eixo do deslocamento. O gráfico da direita representa a variação dos parâmetros
quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade instantânea
para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 268 quadros. A
velocidade média da trajetória foi de 1,2484 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,87 ±
0,22. O asterisco (*) indica o início da trajetória.............................................................25
x
Figura 15: Trajetória retilínea. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma
projeção 2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em
todo o eixo do deslocamento. O gráfico da direita representa a variação dos parâmetros
quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade instantânea
para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 216 quadros. A
velocidade média da trajetória foi de 0,6870 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,85 ±
0,31. O asterisco (*) indica o início da trajetória.............................................................25
Figura 16: Trajetória retilínea. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma
projeção 2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em
todo o eixo do deslocamento. O gráfico da direita representa a variação dos parâmetros
quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade instantânea
para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 257 quadros. A
velocidade média da trajetória foi de 0,2463 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,72 ±
0,52. O asterisco (*) indica o início da trajetória............................................................ 26
Figura 17: Trajetória helicoidal. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma
projeção 2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em
todo o eixo do deslocamento. O gráfico da direita representa a variação dos parâmetros
quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade instantânea
para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 4342 quadros. A
velocidade média da trajetória foi de 0,2561 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,19 ±
0,34. O asterisco (*) indica o início da trajetória.............................................................27
Figura 18: Trajetória helicoidal. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma
projeção 2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em
todo o eixo do deslocamento. O gráfico da direita representa a variação dos parâmetros
quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade instantânea
para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 1713 quadros. A
velocidade média da trajetória foi de 0,4356 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,11 ±
0,24. O asterisco (*) indica o início da trajetória............................................................ 27
Figura 19: Trajetória helicoidal. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma
projeção 2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em
todo o eixo do deslocamento. O gráfico da direita representa a variação dos parâmetros
quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade instantânea
xi
para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 4293 quadros. A
velocidade média da trajetória foi de 0,2889 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,19 ±
0,35. O retângulo vermelho destaca um período de maior variação na velocidade
instantânea com um NGDR próximo a 0, ou seja, onde houve maior tortuosidade no
movimento. O asterisco (*) indica o início da trajetória.................................................28
Figura 20: Trajetória curvada. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma
projeção 2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em
todo o eixo do deslocamento. O gráfico da direita representa a variação dos parâmetros
quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade instantânea
para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 1166 quadros. A
velocidade média da trajetória foi de 0,5045 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,11 ±
0,58. O asterisco (*) indica o início da trajetória.............................................................29
Figura 21: Trajetória curvada. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma
projeção 2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em
todo o eixo do deslocamento. O gráfico da direita representa a variação dos parâmetros
quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade instantânea
para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 748 quadros. A
velocidade média da trajetória foi de 0,6568 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,99 ±
0,18 O asterisco (*) indica o início da trajetória..............................................................30
Figura 22: Trajetória curvada. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma
projeção 2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em
todo o eixo do deslocamento. O gráfico da direita representa a variação dos parâmetros
quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade instantânea
para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 1294 quadros. A
velocidade média da trajetória foi de 0,3673 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,06 ±
0,21 O asterisco (*) indica o início da trajetória..............................................................31
Figura 23: Representação diagramática da frústula do gênero Chaetoceros. (1) vista
pleural (cingular) larga; (2) vista pleural (cingular) estreita; (3) vista valvar. Eixos: A
distância da superfície da epiteca através da frústula até a superfície da hipoteca é o eixo
pervalvar (P), que equivale à altura da célula; T, eixo transapical; A, eixo apical.
Estruturas: superfície valvar (vs); manto valvar (mv); cinta ou cíngulo (c); seta (s); seta
terminal (st); base da seta (bs); forame (f). Adaptados de Cupp, 1943...........................32
xii
Figura 24: Chaetoceros coarctatus. Vista interna da valva intercalar em formato
elíptico.............................................................................................................................32
Figura 25: Chaetoceros coarctatus em associação com Vorticella oceanica. (B, C, D,
E, F). As cadeias representadas nestas imagens são provenientes de diferentes
organismos. Dentre as imagens representadas acima, a imagem E pertence a uma
amostra que não passou pelo método do ponto crítico. As setas indicam o ponto de
aderência do disco adesivo do ciliado no manto da diatomácea.....................................34
Figura 26: Vorticella oceanica. (A) Estrutura do zooide. CV = vacúolo contrátil; FV =
vacúolo alimentar; MA = acronúcleos. Barra de escala = 20 µm. (Adaptado de
Nagasawa & Warren, 1996). (B, C, D) Imagens de MEV. (B) Zooide (C) V. oceanica
distendida. As setas indicam o pedúnculo e o disco adesivo. (D) Base do disco
adesivo.............................................................................................................................35
Figura 27: Cadeia de C. coarctatus após V. oceanica abandonarem a cadeia. As setas
indicam o pedúnculo de alguns ciliados..........................................................................36
Índice de Tabelas
Tabela 1: Data, horário e local das coletas realizadas nos dias dos
experimentos......................................................................................................................7
Tabela 2: Número de quadros, número de trajetórias, números mínimo e máximo de
quadros por trajetória para cada categoria de deslocamento...........................................19
Tabela 3: A média da velocidade instantânea de deslocamento apresentou os seguintes
valores de mínimo e máximo para cada padrão comportamental. Os valores da
velocidade instantânea estão expressos em mm s-1
.........................................................22
xiii
Resumo
A associação simbiótica entre a diatomácea cêntrica Chaetoceros coarctatus e
o ciliado peritríquio Vorticella oceanica é amplamente conhecida e registrada em
diversos estudos, porém nunca havia sido analisada sob o ponto de vista de suas
implicações para o movimento destes organismos. A fim de contribuir com novos dados
acerca desta associação simbiótica, o presente trabalho analisou a relevância ecológica
da simbiose entre Chaetoceros e Vorticella, por meio de um estudo comportamental do
deslocamento destes organismos na coluna de água. As associações foram coletadas em
águas costeiras de Ubatuba, São Paulo, onde sua ocorrência foi observada em elevada
abundância, particularmente durante o verão. Utilizando técnicas de imagem de alta
frequência em um sistema óptico tridimensional foi possível descrever os padrões de
deslocamento desta associação e avaliar as implicações ecológicas deste
comportamento. De acordo com as análises realizadas neste trabalho, pode-se sugerir
que o comportamento de deslocamento realizado pela associação Chaetoceros-
Vorticella na coluna de água resulta em vantagens tanto para o epibionte quanto para o
hospedeiro. Em termos de submesoescala, este estudo sugere que o deslocamento
realizado pela associação Chaetoceros-Vorticella pode contribuir para a formação de
camadas finas, levando à formação de hotspots de atividade biogeoquímica e interações
tróficas no ecossistema pelágico.
Palavras-chave: Diatomáceas, Ciliados, Chaetoceros, Vorticella, Simbiose, Motilidade
xiv
Abstract
The symbiotic association between the centric diatom Chaetoceros coarctatus
and the peritrich ciliate Vorticella oceanica is widely known and reported in several
studies, but its implications for the movement of these organisms have never been
analyzed. In order to contribute with new data about this symbiotic association, the
present study investigated the ecological relevance of the Chaetoceros-Vorticella
association by recording displacement parameters of these organisms in the water
column. The associations were collected in coastal waters of Ubatuba, São Paulo, where
their occurrence was observed in high abundance, particularly during the summer.
Using high-resolution imaging techniques in a three dimensional optical system it was
possible to describe the displacement patterns of this association and to provide initial
insights about the ecological implications of this behavior. It is suggested that the
displacement behavior performed by the Chaetoceros-Vorticella association in the
water column is beneficial for both the epibiont and the host. In terms of submesoscale
processes, this study indicates that the displacement carried out by the Chaetoceros-
Vorticella association may contribute to the formation of thin layers, leading to the
formation of hotspots of biogeochemical activity and trophic interactions in the pelagic
ecosystem.
Keywords: Diatoms, Ciliates, Chaetoceros, Vorticella, Symbiosis, Motility
1
Introdução
O termo simbiose é geralmente definido como uma associação entre duas ou
mais diferentes espécies de organismos que vivem juntos (De Bary, 1879; Sapp, 2004).
Esta associação pode resultar em benefícios, prejuízos ou não afetar os organismos
envolvidos nesta relação (Douglas, 1994; Leung & Poulin, 2008). Estas relações podem
ser de curto ou longo prazo, desempenhando papéis ecológicos fundamentais nos
ecossistemas terrestre e aquático, além de poderem resultar em grandes consequências
evolutivas para as espécies envolvidas (Decelle et al., 2012; Leung & Poulin, 2008).
As associações simbióticas são comuns na natureza e encontradas em quase
todos os táxons, desde bactérias com raízes de plantas terrestres a gigantes vermes
tubulares com bactérias oxidantes de enxofre no mar profundo (Cavanaugh, 1994; van
Rhijn & Vanderleyden, 1995; Sassen et al., 1998; Paracer & Ahmadjian, 2000). Podem
ser divididas em três categorias principais: (i) mutualismo, onde ambos associados se
beneficiam, (ii) parasitismo, onde um dos associados se beneficia à custa do outro e (iii)
comensalismo, onde uma espécie se beneficia enquanto a outra não é afetada (Decelle et
al., 2012; Paracer & Ahmadjian, 2000; Anderson, 2014).
As relações epibióticas são normalmente definidas como relações de
comensalismo, mas estudos recentes têm demonstrado que de acordo com as condições
bióticas e abióticas do ambiente, estas relações podem resultar em vantagens,
desvantagens ou serem neutras (Wahl, 2009; Souissi et al., 2013; Cabral et al., 2016). O
termo epibiose se refere a uma associação facultativa e interespecífica entre dois
organismos: um organismo substrato (basionte) e um organismo durante a fase séssil de
seu ciclo de vida (epibionte), que se fixa na superfície do basionte (Cabral et al., 2016;
Wahl, 1989. Wahl 2009; Rajabunizal & Ramanibai, 2011; Fernandez-Leborans & Tato-
Porto, 2000).
Muitos estudos ainda consideram forese e inquilinismo como categorias de
simbiose, sendo estas relações facultativas e interespecíficas, nas quais um simbionte
(transportador ou hospedeiro) fornece abrigo, suporte ou transporte para o outro
simbionte, sem benefícios ou trocas metabólicas (Paracer & Ahmadjian, 2000; Ohtsuka
et al., 2009; Stampar et al., 2010).
A simbiose ainda pode ser classificada baseando-se em outras características,
como localização dos simbiontes e o nível de dependência entre eles. De acordo com a
localização dos simbiontes, pode-se classificar em: endossimbiose, definida como
2
qualquer relação simbiótica em que um dos simbiontes vive no espaço intracelular ou
intercelular do outro, e ectossimbiose, onde o simbionte habita a parte externa do
hospedeiro (Paracer & Ahmadjian, 2000; Rosati, 2001; Gast et al., 2009). Já com
relação ao nível de dependência, podem ser simbiontes obrigatórios, em que não podem
viver de forma independente, e simbiontes facultativos, em que são capazes de viver
independentes, na condição de vida livre (Vega et al., 2006). Embora existam diversas
classificações para descrever os tipos de simbiose, é importante ressaltar que a simbiose
não é necessariamente uma relação estática, visto que fatores ambientais ou endógenos
influenciam o tipo de relação simbionte-hospedeiro (Paracer & Ahmadjian, 2000).
Relações simbióticas são extremamente comuns no fitoplâncton marinho. As
microalgas planctônicas são responsáveis por cerca da metade da atividade
fotossintética do planeta (Field et al., 1998; Grimsley et al., 2012), constitui a base de
quase todas cadeias alimentares nos ecossistemas aquáticos (Lewis et al., 2012; Häder
& Gao, 2018) e está diretamente ligados aos ciclos biogeoquímicos da Terra (Falkowski
et al., 1998; Litchman, 2007). É um grupo muito diverso, com representantes de formas
procariontes e eucariontes, e variam em termos de tamanho desde picoplâncton (0,2 - 2
µm) a mesoplâncton (200 - 2000 µm) (Marañón et al., 2009; Not et al., 2012).
Dentre os grupos de fitoplâncton, as diatomáceas constituem um dos mais
abundantes e ecologicamente importantes, com mais de 250 gêneros (Hoek et al.,1995;
Mann & Droop, 1996; Norton et al., 1996; Li et al, 2017). São eucariontes
fotossintéticos unicelulares (1 - 1000 µm), sendo responsáveis por aproximadamente
40% da produtividade primária marinha (Nelson et al., 1995; Falkowski et al., 1998;
Scala & Bowler, 2001).
Pertencentes à classe Bacillariophyceae, as espécies deste grupo possuem
frústula, constituída por sílica e composta por duas valvas (tecas), o que faz com que
elas exerçam um importante papel no ciclo biogeoquímico global da sílica, já que
utilizam este componente para a biogênese de sua parede celular (Hopkins & Drum,
1966; Kadono et al., 2015). Em termos morfológicos, as diatomáceas são
tradicionalmente divididas em penadas e cêntricas, sendo distinguidas por meio por
meio das ornamentações das estruturas na parede celular (Hendey, 1964; Lee, 2008).
Diatomáceas penadas possuem ornamentação dos poróides na valva disposta
simetricamente em ambos os lados de uma linha central (rafe ou pseudorafe), sendo
bilateralmente simétricos (face valvar). São representadas principalmente pelas formas
bentônicas, mas existem representantes planctônicos, como as pertencentes ao gênero
3
Nitzschia (Hendey, 1964; Raven et al., 1996; Lee, 2008). Diatomáceas cêntricas
possuem a ornamentação dos poróides na valva e estrias radiais arranjadas de acordo
com um ponto central. São mais comuns no plâncton, representadas por gêneros como
Chaetoceros, Coscinodiscus, Skeletonema e Thalassiosira (Hendey, 1964; Raven et
al., 1996; Lee, 2008). Em ambas as formas, a frústula silicosa possui padrões de
ornamentação específicos para cada espécie que, juntamente com características
estruturais, possibilitam a classificação e identificação taxonômica dos indivíduos
(Scala & Bowler, 2001).
Chaetoceros é um dos gêneros de diatomáceas mais comuns e diversos do
fitoplâncton marinho, possuindo uma ampla distribuição geográfica e muitas espécies
cosmopolitas (Hernández-Becerril, 1991; Assmy et al, 2008; Bosak & Sarno, 2017).
Foi inicialmente descrita por Ehrenberg, em 1844, no oceano Antártico (Rines, 1999;
Lee et al., 2014). De acordo com Guiry & Guiry (2017), o gênero compreende 534
espécies já descritas, das quais 210 são aceitas atualmente.
Chaetoceros é caracterizada principalmente pela presença de setas e por suas
células formarem cadeias (Antolí et al, 2004). As setas são extensões vazias e
alongadas presentes nas extremidades da valva e, geralmente, são de dois tipos:
intercalares e terminais (Lee & Lee, 2011; Lee et al., 2014). Algumas espécies
possuem setas intercalares especiais, que são estruturas mais grossas e silicificadas
que as demais (Lee & Lee, 2011). Embora a maioria das espécies deste gênero
formem cadeias de células, alguns representantes do grupo possuem a forma solitária,
como no caso de C. pendulus Karsten e C. gracilis Schutt (Takano, 1960; Sunesen et
al., 2008).
Entre as espécies de Chaetoceros, C. coarctatus Lauder, 1864, é encontrada
em ambientes marinhos tropicais e subtropicais. Formam cadeias robustas, geralmente
longas, com cerca de 25 - 30 células, podendo existir exemplares com 35 - 40 células
(Gómez et al., 2018). Possuem setas intercalares especiais, setas intercalares e seta
terminais. A seta terminal posterior é mais grossa do que a anterior, levemente curva,
com muitos espinhos e mais curta que as demais. As setas intercalares são comuns e
suavemente curvas (em torno de 45° do eixo apical, em direção à extremidade
posterior - Cupp, 1943; Hernández-Becerril, 1991; Lee & Lee, 2011). Esta espécie de
diatomácea planctônica é comumente encontrada em associação com o peritríqueo
ciliado Vorticella oceanica (Sahu et al., 2017; Gómez et al., 2018).
4
Os ciliados peritríqueos ocorrem, como epibiontes, em uma ampla variedade
de substratos, como plantas aquáticas, animais e detritos orgânicos, em água doce,
salobra e salgada. Alguns representantes são planctônicos, se aderindo sobre
microalgas ou nadando livremente por meio de seus cílios orais. São suspensívoros,
ingerindo bactérias, fitoplâncton e detritos orgânicos (Ryu et al., 2016).
Representantes do gênero Vorticella podem ser encontrados na forma de vida
livre ou séssil. Vorticella séssil consiste de um zooide e um pedúnculo. O zooide
possui, geralmente, formato de sino invertido, podendo ser encontrado na forma
cilíndrica ou de "barril" em algumas espécies, com, aproximadamente, 25 µm de
diâmetro e 50 µm de comprimento (Pepper et al., 2009; Nagai et al., 2009; Zhou et al.,
2017). Já o pedúnculo é formado por uma bainha que contém um líquido e um
filamento contrátil em forma espiral com, aproximadamente, 3 a 4 µm de diâmetro e
100 µm de comprimento (Ryu et al., 2016). Embora sejam frequentemente
encontrados em grupo, cada pedúnculo é fixado independentemente no substrato.
Descrito por Zacharias (1906), o ciliado Vorticella oceanica possui corpo
entre a forma cônica e de sino, com extensão do zooide de 28 µm de comprimento e
22 µm de diâmetro, disco peristomial plano e pedúnculo com extensão de 80 µm, que
se fixa ao substrato por meio de um disco adesivo que possui de 3 a 5 µm de diâmetro
(Cupp, 1943; Nagasawa & Warren, 1996; Sahu et al., 2017).
Figura 1: Chaetoceros coarctatus em associação com o ciliado Vorticella oceanica. A)
Adaptado de Lee et al., 2014. B) Adaptado de Cupp, 1943
A motilidade é um elemento chave para responder diversas questões ecológicas
sobre muitos organismos. O deslocamento de um organismo é definido como a
5
mudança de sua posição espacial em um intervalo de tempo (Schmitt & Seuront, 2001;
Nathan, 2008). A capacidade de movimento é um fenômeno que influencia as interações
entre os indivíduos, incluindo a probabilidade de acasalamento, a interação presa-
predador, assim como amplia a probabilidade de os organismos encontrarem condições
adequadas, como alimento, temperatura e luminosidade (Crenshaw, 1996, Nathan,
2008, Bianco et al., 2014).
A motilidade em microrganismos planctônicos está ligada a diversos
fenômenos importantes, como por exemplo, a migração vertical. Para o fitoplâncton a
motilidade permite que as células se desloquem para regiões mais profundas durante a
noite, onde os nutrientes limitantes são abundantes e há menor risco de predação e,
durante o dia, permaneçam em águas superficiais com disponibilidade de luz (Ryan et
al., 2010; Sullivan et al., 2010; Bollens et al., 2010).
A associação Chaetoceros-Vorticella ocorre com alta frequência em águas
costeiras de Ubatuba, São Paulo, Brasil, principalmente durante o verão (Gómez et al.,
2018). A fim de avaliar a relevância ecológica desta associação, este trabalho analisou
o comportamento natatório de Chaetoceros-Vorticella na coluna de água, por meio de
técnicas de imageamento utilizando sistemas ópticos implementados especialmente
para essa finalidade.
Objetivos
Objetivo geral
Avaliar a relevância ecológica do comportamento de deslocamento da
associação entre a diatomácea planctônica Chaetoceros coarctatus e o ciliado
peritríquio Vorticella oceanica, por meio técnicas de imageamento.
Objetivos específicos
(i) Descrever as características do deslocamento da associação da
diatomácea Chaetoceros coarctatus com o ciliado Vorticella oceanica,
por meio de análises tridimensionais das trajetórias.
(ii) Analisar as implicações ecológicas do comportamento de
deslocamento, a partir de análises qualitativas do movimento e da
extração dos parâmetros de locomoção, como velocidade média,
6
velocidade instantânea, ângulo de rotação, NGDR (Net-to-gross
displacement ratio), dimensão fractal, entre outros.
(iii) Observar as características morfológicas dos pontos de fixação do
ciliado sobre a diatomácea, através de Microscopia Eletrônica de
Varredura (MEV), e interpretar os resultados em relação ao
comportamento de deslocamento.
Materiais e Métodos
Área de estudo
A área amostrada compreende uma estação fixa localizada no canal do
Boqueirão (23º 31’ 27’’ S e 45º 04’ 54’’ O), nas proximidades da Base Norte de
pesquisa Clarimundo de Jesus, do Instituto Oceanográfico da Universidade de São
Paulo, no município de Ubatuba, litoral norte do estado de São Paulo, Brasil (Figura 2).
Além desta estação principal, ocasionalmente houve necessidade de realizar coletas em
uma estação mais abrigada, próxima à Praia do Flamengo (23º 30’ 57,1’’ S e 45º 06’
17,7’’ O), devido a fatores externos, como mau tempo.
Figura 2: Localização das estações de coleta situada na plataforma interna ao largo de Ubatuba,
litoral norte do estado de São Paulo. A) Estação próxima à Praia do Flamengo; B) Estação
Boqueirão.
7
Obtenção das amostras de plâncton marinho
As coletas foram realizadas no período de Maio de 2017 a Janeiro de 2018. As
colônias de Chaetoceros coarctatus em associação com Vorticella oceanica foram
coletadas com rede de abertura de malha de 200 µm, a bordo de uma embarcação de
alumínio com motor de popa. Os experimentos foram realizados de acordo com a
disponibilidade dos organismos no ambiente. A tabela 1 indica os dias em que os
experimentos foram realizados, bem como o horário das coletas.
Tabela 1: Data, horário e local das coletas realizadas nos dias dos experimentos.
Local da coleta Data Horário (h)
Canal do Boqueirão 17/07/17 9:30
Canal do Boqueirão 21/09/17 10:00
Canal do Boqueirão 12/01/18 9:00
Canal do Boqueirão 16/01/18 9:00
O material foi obtido por meio de arrastos oblíquos curtos, com a embarcação à
deriva ou em uma velocidade mínima. Após os arrastos, a amostra foi transferida
cuidadosamente para garrafas plásticas de 1 L, contendo água do mar proveniente do
local da coleta. O número de amostras coletadas foi determinado de acordo com a
concentração aparente dos organismos, obtida pela inspeção visual das amostras no
copo coletor. Além disso, a temperatura da superfície da água foi verificada com
termômetro manual e foi coletada água do mar da superfície, armazenando-a em
garrafas de 2 L, que foi utilizada para triagem, manipulação e incubação dos
organismos. O material coletado foi transferido imediatamente para o Laboratório
Integrado de Processos Oceanográficos (LIPO), em no máximo 30 minutos e mantido
em uma sala com temperatura controlada, coincidente com a temperatura da água no
momento da amostragem. O procedimento de obtenção das amostras era realizado,
preferencialmente, no período da manhã.
Triagem e isolamento da associação de Chaetoceros - Vorticella
As associações Chaetoceros-Vorticella foram triadas, cuidadosamente, com o
auxílio de pipetas, sob estereomicroscópio binocular (Nikon® - SMZ800) e luz de baixa
8
intensidade, e mantidos em recipientes de vidro (béqueres ou aquários) para que fossem
aclimatados (sob temperatura controlada e baixa luminosidade) antes das filmagens. Os
recipientes continham alíquotas de água do mar filtrada em filtros GF/F (ø 47 mm e
porosidade de 0,7 µm). Com a finalidade de manter a integridade dos organismos a
serem estudados, foram avaliadas as condições morfológicas dos mesmos, para evitar a
utilização de colônias com estruturas danificadas nos experimentos.
Experimentos de descrição do comportamento natatório da associação
Chaetoceros-Vorticella
Para descrever os caracterizar o deslocamento da associação Chaetoceros-
Vorticella, os organismos selecionados foram colocados em aquários cúbicos de vidro
com dimensões de 8 cm de largura e profundidade e 10 cm de altura. Estes recipientes
eram preenchidos com um volume de 512 mL de água do mar filtrada (GF/F) com
salinidade coincidente com o local da coleta. Para cada conjunto de filmagem, 10
associações foram introduzidas no aquário, cuidadosamente, por meio de pipetas, uma
por vez. Os organismos foram aclimatados no recipiente por um período de 30 minutos
antes das filmagens. Cada experimento foi realizado sem estímulos externos (por
exemplo, sem fontes luminosas, com temperatura constante e sem adição de alimento).
Método de observação do comportamento
Configuração do sistema óptico
Para realizar o estudo do comportamento de deslocamento da associação
Chaetoceros-Vorticella, foi desenvolvido um sistema óptico horizontal 3D,
confeccionado com base em sistemas descritos por Strickler (1998); Yen et al. (2008) e
Bianco et al. (2013).
O sistema observacional 3D foi constituído de: (i) duas fontes luminosas
(LEDs - Light Emmiting Diode), (ii) duas lentes colimadoras (150 mm - usadas para
tornar o feixe de luz paralelo), (iii) duas lentes focalizadoras (150 mm) e (iv) duas
câmeras Ethernet (Basler acA2040-25gm GigE) com o sensor CMV4000 CMOS, que
fornece uma taxa de aquisição de 25 quadros por segundo e resolução máxima de 2048
x 2048 pixels (Figura 3). Para a montagem deste sistema, foram construídos dois
sistemas 2D in line, dispostos de forma ortogonal, de modo que o volume de interesse
ficasse no ponto focal de ambos sistemas simultaneamente (Figura 4).
9
O aumento utilizado no presente sistema observacional foi de 0,5 X. As
distâncias entre objeto - lente e lente - câmera foram calculadas por meio da Equação
de Gauss, a saber:
(1)
Onde:
f = distância focal da lente usada;
p = distância focal do objeto;
p' = distância focal da imagem.
Figura 3: Representação esquemática do sistema óptico 3D. Os LEDs representam a fonte
emissora de luz, que passa através de uma lente colimadora (tornando os feixes de luz paralelos)
atravessando o aquário e a lente focalizadora, produzindo a imagem. As fontes emissoras de luz
deste sistema são LEDs infravermelhos.
10
Figura 4: Configuração do sistema óptico configurado em 3D. O sistema observacional foi
construído sobre a mesa óptica Smart Table Newport com controle de vibração e suspensão
pneumática.
Obtenção das imagens
As filmagens foram realizadas utilizando o software LCR (LAPS Camera
Recorder), desenvolvido pelo LAPS/IOUSP. No sistema de filmagem, cada câmera foi
conectada a um computador. Para garantir a simultaneidade das gravações, um
microcontrolador foi conectado em cada sistema 2D, de forma que ao dar o comando
para iniciar as gravações, elas começavam ao mesmo tempo nas duas câmeras. Esta
ferramenta garantiu a obtenção das coordenadas de ambos sistemas (XY e ZY) de forma
precisa, visto que os vídeos possuíam o mesmo número de quadros captados no mesmo
instante.
As filmagens foram realizadas em uma sala óptica sem interferência da
luminosidade natural e com temperatura controlada, a uma taxa de 20 fps (frames per
second). As gravações eram iniciadas quando os organismos apareciam no campo focal
dos dois sistemas ao mesmo tempo, com tempo de duração variando de acordo com a
permanência dos indivíduos neste volume. O campo de focal possuía dimensões de 2
cm de altura e 2 cm de largura em cada câmera do sistema, localizado no centro do
aquário para que não houvesse efeito da borda sobre o comportamento dos organismos.
Aquisição das trajetórias
Após as filmagens, os vídeos foram processados utilizando o software LPD
(LAPS Plankton Detector). Esse programa possui uma interface de fácil utilização, que
possibilita a identificação e a análise das trajetórias dos organismos (Figura 5). O
11
procedimento geral para extração das trajetórias consistiu, basicamente, em quatro fases
principais: (i) geração do vídeo a partir das imagens quadro a quadro, (ii) detecção dos
organismos nos quadros do vídeo, (iii) cálculo do centroide em cada associação
Chaetoceros-Vorticella identificada e (iv) formação da trajetória a partir dos centroides
mais próximos e sequenciais gerados na terceira etapa. A partir da extração das
trajetórias, foi formado um arquivo com as informações das abcissas e ordenadas
(posicionamento da colônia ao longo do tempo), além de outras informações
importantes como área da partícula, ângulo, intensidade média, entre outros.
Figura 5: Interface do software LPD ( LAPS Plankton Detector). A linha vernelha representa
um exemplo de trajetória realizada pela associação Chaetoceros-Vorticella.
Os dados de abcissa e ordenada das trajetórias extraídos de cada sistema 2D
foram combinados para a formação das trajetórias em 3D. No esquema da Figura 6, a
vista frontal é dada pelas imagens adquiridas pela câmera 1, enquanto que a
profundidade é gerada pela vista lateral, dada pelas imagens da câmera 2. A
reconstrução da trajetória é feita extraindo as posições tridimensionais para cada par de
quadros Ft1
e Ft2, correspondentes às imagens das câmeras 1 e 2 em um mesmo instante
de tempo.
12
Figura 6: Esquema mostrando que a posição P (x, y, z) de uma partícula em um instante de
tempo é construída a partir de duas imagens em 2D.
Assim, 'P' aparecerá em ambos os quadros, dado que a partícula está sendo
filmada por ambas as câmeras ao mesmo tempo. Desta forma, denotamos como (x1, y1)
a posição de 'P' na perspectiva da câmera 1 e denotamos como (x2, y2) a posição 'P'
segundo a perspectiva da câmera 2. Assim, a partir de (x1, y1) e (x2, y2), calcula-se a
posição 3D de 'P', isto é: (x1, y1) (x2, y2) → (x, y, z). O procedimento para calcular e
construir as coordenadas tridimensionais foram realizadas por meio do software
MATLAB® R2013.
Análise dos dados: quantificando o comportamento de deslocamento da
associação Chaetoceros-Vorticella
A partir da análise das trajetórias podemos obter uma variedade de métricas
quantitativas importantes para a compreensão do comportamento de deslocamento da
associação Chaetoceros-Vorticella. Para este estudo foram calculadas a distância
percorrida, deslocamento total, velocidade instantânea do deslocamento, velocidade
média, ângulo de rotação, NGDR e dimensão fractal. Também foram realizadas análises
qualitativas do movimento estimando a frequência de estados de deslocamento. A
seguir são descritas cada uma das métricas utilizadas neste trabalho.
a) A distância percorrida d (mm) foi calculada a partir das coordenadas x, y e z,
em uma trajetória tridimensional, por meio da seguinte fórmula:
(2)
13
onde (xt, yt, zt) e (xt+1, yt+1, zt+1) representam as posições das coordenadas
no instante t e t + 1, respectivamente.
b) O deslocamento foi calculado por meio da diferença entre o primeiro e o
último ponto da trajetória (deslocamento bruto).
c) A velocidade instantânea de natação Vi (mm s-1
) entre dois pontos
consecutivos foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:
(3)
onde dS é a distância entre dois pontos consecutivos e dt é o tempo que a
associação levou de um ponto para o outro. Além da velocidade instantânea,
também foi calculada a velocidade média da trajetória através da seguinte
fórmula:
(4)
onde ∆S é a variação espacial da trajetória e ∆t é a variação temporal da
trajetória.
d) O ângulo de rotação, ou turning angle, foi calculado a partir da diferença na
direção entre dois movimentos consecutivos (Figura 7 - Dodson, et al., 1997;
Schmitt & Seuront, 2001; Edgar et al., 2014). Esta métrica expressa a
mudança de direção da partícula ao se deslocar.
14
Figura 7: Esquema do deslocamento do organismo. Os pontos representam a posição XY e o tt
representa o ângulo de rotação (Adaptado de Edgar et al., 2014).
e) O NGDR (Net-to-gross displacement ratio – Buskey, 1984), é uma medida
do grau de linearidade da trajetória do organismo (quanto menor o NGDR,
maior é o grau de tortuosidade da trajetória do organismo). Esta métrica foi
calculada por meio da fórmula que se segue:
(5)
Onde:
ND é o deslocamento líquido (adição das distâncias Euclidianas totais
percorridas pelo organismo);
GD é o deslocamento bruto (deslocamento entre o ponto final e o ponto inicial).
Para tornar a medida invariante ao tempo de filmagem e ter um valor de NGDR
contínuo, o cálculo deste índice foi feito para cada ponto da trajetória Pi, de
forma que o valor do NGDR para Pi era o valor do NGDR do segmento definido
15
pelos pontos Pi-r e Pi+r. Neste trabalho, os resultados gerados foram feitos
considerando r=8 (figura 8).
Figura 8: Representação do cálculo do NGDR para cada ponto da trajetória. O ponto vermelho
(Pi) representa o ponto central do segmento analisado.
f) A dimensão fractal é utilizada para caracterizar o grau de complexidade das
trajetórias dos organismos (Dicke & Burrough, 1988). Contudo, ao contrário
do NGDR, esta métrica é independente de escala e fornece uma estimativa
mais consistente (Coughlin et al., 1992; Seuront et al., 2004; Uttieri et al.,
2005; Uttieri et al., 2008).
A dimensão fractal D foi estimada para as trajetórias de deslocamento da
associação Chaetoceros-Vorticella, baseada no método de contagem de
caixas (Box-Counting Method), proposta por Uttieri et al. (2005). Neste
método, basicamente, cada imagem é coberta por um conjunto de quadrados
não sobrepostos de comprimento l e o número de quadrados interceptados
pela trajetória realizada N(l) é contabilizado. Esse processo é repetido por
uma série de valores descendentes l, obtendo novos valores de N
correspondentes. Assim, com os números de quadrados e suas dimensões, o
valor de log N(l) é plotado em função de log (1/l), e a inclinação da
regressão D indica o grau de complexidade da trajetória.
Existem vários estudos que utilizam esta métrica como critério importante
para a caracterização de trajetórias e pode ser aplicada em N-dimensões.
Neste trabalho foi aplicado o método box-counting tridimensional. Para isso,
16
ao invés da grade quadrada, foi utilizada uma grade com elementos cúbicos
(Fielding, 1992; Seuront et al., 2004; Uttieri et al, 2005).
Além das métricas quantitativas, as trajetórias foram avaliadas
qualitativamente a fim de categorizar os movimentos que a associação realizou na
coluna de água. Para isso, foram analisadas as variações dos ângulos de rotação nos
planos XY e ZY no decorrer de cada trajetória.
Análises estatísticas
Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o programa R (R
Development Core Team, 2011). Para analisar a normalidade dos dados, foram feitos
testes de normalidades (teste Shapiro-Wilk). Nos dados que apresentaram distribuição
normal foi aplicado o teste ANOVA. Nos casos em que houve rejeição da hipótese nula
foi realizado um teste post-hoc de Tukey (teste de comparações múltiplas). Nos dados
não-paramétricos foi aplicado o teste Kruskal-Wallis.
Preparo das amostras para análise de Microscopia Eletrônica de Varredura
(MEV)
As análises de MEV foram realizadas na Universidade Estadual de Santa Cruz
- UESC, Ilhéus - BA. Após os experimentos de análises comportamentais, os
organismos foram fixados com Bouin 10%. As amostras fixadas foram submetidas à
metodologia de filtração com desidratação e passagem pelo ponto crítico (CO2 líquido)
e ao método de simples filtração, para observação sob o MEV.
a) Filtração com desidratação e passagem pelo ponto crítico (CO2
líquido): as amostras fixadas foram concentradas em um suporte de
filtração, sobre o filtro Nuclepore (ø 13 mm e porosidade de 0,8 µm). O
excesso de líquido foi eliminado, tendo cuidado para não deixar o filtro
secar e, em seguida, foi iniciada uma série de passagens em soluções de
álcool em concentrações crescentes (10, 30, 50, 70, 90%) e 3 vezes em
álcool absoluto durante 10 minutos em cada passo. Após esse processo
17
de desidratação, a amostra foi transferida para a câmara do equipamento
de secagem ao ponto crítico, onde o álcool foi substituído pelo CO2
líquido e, em seguida, evaporado sob pressão. Os filtros foram então
montados em suportes metálicos e metalizados para serem observados no
microscópio eletrônico de varredura.
b) Simples filtração: as amostras fixadas foram filtradas lentamente em
filtros Nuclepore (ø 13 mm e porosidade de 3 µm). Em seguida, os filtros
foram lavados em água destilada e secos ao ar. Os filtros, então, foram
montados sobre suportes de alumínio, recobertos com ouro, pela técnica
de sputtering (evaporação por pulverização catódica) e analisados no
microscópio eletrônico de varredura.
Resultados
A partir dos dados gerados pelo o software LPD, a quantificação e análise das
trajetórias de deslocamento da associação Chaetoceros-Vorticella foram realizadas por
meio de rotinas confeccionadas no software MATLAB® R2013 e por meio do programa R
(R Development Core Team, 2011).
Descrição dos padrões de deslocamento
Após a extração das trajetórias, foi obtido um total de 343 trajetórias,
considerando cada sistema em 2D. Porém, apenas 75 pares de trajetórias foram
utilizados para realizar a reconstrução tridimensional do deslocamento dos organismos,
pois estas trajetórias foram detectadas em ambos os sistemas observacionais ao mesmo
tempo.
A partir da análise das trajetórias, os padrões de deslocamento da associação
foram caracterizados. A identificação dos padrões natatórios foi feita por meio de
análises visuais das trajetórias, sendo agrupados em três principais categorias: retilíneo,
helicoidal e curvado. A figura 9 resume movimentos típicos identificados a partir da
reconstrução tridimensional das trajetórias. Além do ângulo de rotação, foram
consideradas as características, a saber:
18
1. Trajetória Retilínea: Uma trajetória foi considerada do tipo retilíneo quando a
forma dela era semelhante à forma de uma reta. Isto é, na maioria dos casos, a
partícula se dirigia em uma única direção.
2. Trajetória Helicoidal: Uma trajetória foi considerada helicoidal quando os
organismos se deslocavam em uma direção determinada fazendo rotações ao
redor de um eixo imaginário.
3. Trajetória Curvada: Uma trajetória foi considerada do tipo curvada a todas
aquelas trajetórias que não foram categorizadas como retilíneas nem como
helicoidais.
Figura 9: Trajetórias da associação Chaetoceros-Vorticella obtidas pelo LPD e processadas no
MATLAB® R2013. Foram identificadas três principais categorias de padrões de deslocamento
realizados pela associação: retilíneo (A), helicoidal (B) e curvado (C). O volume em que a
trajetória ocorre (cubo com dimensões de 2 cm x 2 cm x 2 cm) representa o campo focal
localizado no centro do aquário.
19
De todas as trajetórias tridimensionais obtidas, observou-se que o tempo de
duração delas variaram de 4 s a 4 min. Este tempo é relativo a trajetória realizada no
campo de filmagem de ambas câmeras.
A tabela 2 resume o número de quadros, bem como os números mínimo e
máximo de quadros por categoria de deslocamento. Pode-se observar que o número
total de quadros não é necessariamente proporcional em cada uma das trajetórias. Além
disso, o número de trajetórias classificadas como retilínea e helicoidal foram próximos,
embora as trajetórias helicoidais tiveram um número de quadros consideravelmente
maior que as trajetórias retilíneas. Em geral, o deslocamento em trajetórias helicoidais
foi menor do que em trajetórias retilíneas, para um mesmo intervalo de tempo. Assim,
quando os organismos realizaram trajetórias helicoidais, eles permaneceram por mais
tempo em um mesmo local, apresentando uma maior área de ocupação e, desta forma,
um maior número de quadros.
Tabela 2: Número de quadros, número de trajetórias, números mínimo e máximo de
quadros por trajetória para cada categoria de deslocamento.
Tipo de
trajetória
Nº de
quadros
Nº de
trajetórias
Nº mínimo de quadros
por trajetórias
Nº máximo de quadros
por trajetórias
Retilíneo 3252
16 80 368
Helicoidal 33772
17 475 4342
Curvado 35719 42 112 4293
Além disso, o tempo de duração de algumas filmagens foi bastante diferente de
uma trajetória para outra. Isto porque a velocidade em cada trajetória foi variável e
juntamente com o padrão e direção de deslocamento realizado, refletiu no tempo que a
associação permaneceu no campo de filmagem e consequentemente, no número de
quadros adquiridos por trajetória.
20
Medidas quantitativas do comportamento de deslocamento da associação
a) Velocidade Média
A velocidade média de deslocamento da associação teve distribuição não-
paramétrica (p<0,05) e, de acordo com o teste Kruskal-Wallis, não houve diferença
significativa entre as categorias de deslocamento (p=0,06). Porém, é possível observar
que os valores para o deslocamento retilíneo foram mais variáveis (Figura 10) e que os
maiores valores de velocidade foram observados nesta categoria.
Os valores de velocidade média mínima e máxima para cada padrão de
deslocamento foram, respectivamente, para o movimento retilíneo 0,1530 e 1,9986 mm
s-1
; helicoidal 0,1920 e 0,7873 mm s-1
e curvado 0,2511 e 1,0825 mm s-1
.
Figura 10: Mediana da velocidade média da associação Chaetoceros-Vorticella. No boxplot, as
linhas superior e inferior em cada uma das categorias representam o primeiro e o terceiro quartil
(Q1 e Q3), respectivamente; a linha central representa a mediana. Os pontos em cada uma das
categorias representa a distribuição dos dados. Os pontos acima e abaixo dos quartis Q1 e Q3
correspondem aos bigodes (whiskers) que mostram a dispersão dos dados. O teste Shapiro-Wilk
indicou que os dados não são normais (p<0,05). Não houve diferença significativa entre as
categorias de deslocamento de acordo com o teste Kruskal-Wallis (p=0,06).
21
b) Velocidade instantânea de deslocamento
Na figura 11 é possível observar que os movimentos mais tortuosos (helicoidal
e curvado) tiveram mais valores outliers de velocidade instantânea quando comparados
ao retilíneo. Isto indica que essas categorias de movimento possuíram maior variação da
velocidade instantânea em cada uma das trajetórias.
Figura 11: Variação da velocidade instantânea em cada uma das 75 trajetórias, agrupadas por
categoria de deslocamento. Cada trajetória é representada por um boxplot. As linhas superior e
inferior em cada caixa representam o primeiro e o terceiro quartil (Q1 e Q3), respectivamente; a
linha central representa a mediana. Os pontos acima e abaixo dos quartis Q1 e Q3 correspondem
aos bigodes (whiskers) que mostram a dispersão dos dados. Os sinais vermelhos representam os
outliers da velocidade instantânea em cada trajetória.
A média da velocidade instantânea em todas as trajetórias analisadas variou de
0,0013 ± 0,0014 a 2,9192 ± 0,6896 mm s-1
. A tabela 3 indica os valores mínimo e
máximo da média da velocidade instantânea para cada categoria de deslocamento.
22
Tabela 3: Média mínima e máxima da velocidade instantânea de deslocamento para
cada padrão comportamental. Os valores estão expressos em mm s-1
.
Tipo de
trajetória
Velocidade
Instantânea
Mínima
Velocidade
Instantânea
Máxima
Retilíneo 0,0013 ± 0,0014 2,9192 ± 0,6896
Helicoidal 0,3270 ± 0,1467 1,2035 ± 0,4941
Curvado 0,3448 ± 0,1900 1,7550 ± 0,4654
De modo geral, o movimento retilíneo teve os maiores valores de velocidade
no decorrer do tempo, com 22% das trajetórias acima de 2 mm s-1
. Porém, como pode
ser observado na figura 12, houve grande variação de velocidade neste padrão de
deslocamento, que teve as maiores e menores velocidades quando comparado as demais
categorias (tabela 3).
Em contrapartida, o movimento helicoidal teve a maior concentração de
trajetórias em velocidades menores, com cerca de 90% delas menores que 1 mm s-1
,
sendo a maior concentração em velocidades abaixo de 0,5 mm s-1
(54%). As trajetórias
curvadas também tiveram maior frequência de ocorrência em velocidades abaixo de 1
mm s-1
(cerca de 80% das trajetórias), embora a maioria tenha sido observada em
velocidades entre 0,5 e 1,0 mm s-1
(44%).
23
Figura 12: Porcentagem da velocidade instantânea de acordo com as categorias de trajetórias.
c) NGDR e Dimensão Fractal
Para as trajetórias analisadas no presente trabalho o NGDR variou de 0,037 a
0,996, com média de 0,572 ± 0,293. A variação dos valores do NGDR no decorrer do
tempo está expressa nos gráficos de comparação das medidas quantitativas (Figura 14 a
22).
A dimensão fractal variou de 0,49 ± 0,45 a 1,22 ± 0,54. Os maiores valores de
dimensão fractal estiveram associados com os maiores índices de tortuosidade e com o
grau de ocupação espacial. Em nosso contexto esperava-se que os movimentos
helicoidais possuíssem os maiores valores de dimensão fractal do que os demais
padrões. A partir de análises estatísticas, foi observado de fato que a dimensão fractal
para movimentos helicoidais foi significativamente maior que as demais categorias de
movimento (teste ANOVA, p<0,0001), mesmo quando comparada a cada categoria
(teste post-hoc de Tukey). Assim, a figura 13 corrobora com o resultado esperado,
apresentando maiores valores para movimentos mais tortuosos.
24
Figura 13: Mediana da dimensão fractal da associação Chaetoceros-Vorticella. No boxplot, as
linhas superior e inferior em cada uma das categorias representam o primeiro e o terceiro quartil
(Q1 e Q3), respectivamente; a linha central representa a mediana. Os pontos em cada uma das
categorias representa a distribuição dos dados. Os pontos acima e abaixo dos quartis Q1 e Q3
correspondem aos bigodes (whiskers) que mostram a dispersão dos dados. De acordo com o
teste Shapiro-Wilk, os dados são paramétricos (p>0,05). As categorias são significativamente
diferentes de acordo com o teste ANOVA (p<0,0001) e teste post-hoc de Tukey com p<0,05.
Comparação das medidas quantitativas
Os gráficos abaixo expressam as trajetórias dos organismos em relação aos
parâmetros calculados. As figuras 14, 15 e 16 representam exemplos de padrões
retilíneos de deslocamento realizados pela associação. O NGDR se manteve próximo a
1 em toda trajetória, bem como uma menor variação do ângulo de rotação em ambos
planos (XY e ZY), o que é esperado para este tipo de deslocamento. Nesta categoria de
deslocamento a velocidade instantânea não expressou, necessariamente, sempre os
maiores valores. Por exemplo, as figuras 14 e 15 indicam movimentos retilíneos
descendentes, sendo que a trajetória da figura 15 expressa uma velocidade instantânea
menor na maior parte do percurso quando comparada à figura 14 (média da velocidade
instantânea para as trajetórias da figura 14 e 15, respectivamente: 2,0957 ± 0,3947 mm
s-1
e 1,1801 ± 0,2121 mm s-1
). Já a trajetória da figura 16 mostra um movimento
retilíneo ascendente, com uma velocidade instantânea menor (0,4210 ± 0,1119 mm s-1
)
quando comparado a outras trajetórias desta mesma categoria. Esta variação de
velocidade para esta categoria de movimento pode ser observada na figura 10.
25
Figura 14: Trajetória retilínea. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção
2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em todo o eixo do
deslocamento. A velocidade está em mm s-1
. O gráfico da direita representa a variação dos
parâmetros quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade
instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 268 quadros.
A velocidade média da trajetória foi de 1,2484 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,87 ± 0,22. O
asterisco (*) indica o início da trajetória.
Figura 15: Trajetória retilínea. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção
2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em todo o eixo do
deslocamento. A velocidade está em mm s-1
. O gráfico da direita representa a variação dos
parâmetros quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade
instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 216 quadros.
A velocidade média da trajetória foi de 0,6870 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,85 ± 0,31. O
asterisco (*) indica o início da trajetória.
26
Figura 16: Trajetória retilínea. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção
2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em todo o eixo do
deslocamento. A velocidade está em mm s-1
. O gráfico da direita representa a variação dos
parâmetros quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade
instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 257 quadros.
A velocidade média da trajetória foi de 0,2463 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,72 ± 0,52. O
asterisco (*) indica o início da trajetória.
Os movimentos helicoidais estão representados nas figuras 17, 18 e 19. Nestas
categorias houve maior variação do ângulo de rotação nos planos XY e ZY e do NGDR
ao longo da trajetória. A variação do ângulo de rotação está ligada à característica do
próprio movimento helicoidal. Já a variação do NGDR pode ser explicada pela forma
com que esse índice foi calculado (item e - figura 8). Como esta categoria de
movimento possuiu, no geral, uma velocidade menor durante o deslocamento, há mais
pontos em uma mesma distância quando comparado ao movimento retilíneo. Como
consequência a essas circunstâncias é possível observar intervalos na trajetória onde o
valor de NGDR é próximo a 1.
27
Figura 17: Trajetória helicoidal. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção
2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em todo o eixo do
deslocamento. A velocidade está em mm s-1
. O gráfico da direita representa a variação dos
parâmetros quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade
instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 4342
quadros. A velocidade média da trajetória foi de 0,2561 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,19 ±
0,34. O asterisco (*) indica o início da trajetória.
Figura 18: Trajetória helicoidal. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção
2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em todo o eixo do
deslocamento. A velocidade está em mm s-1
. O gráfico da direita representa a variação dos
parâmetros quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade
instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 1713
quadros. A velocidade média da trajetória foi de 0,4356 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,11 ±
0,24. O asterisco (*) indica o início da trajetória.
28
A trajetória da figura 19 foi categorizada como helicoidal com base na variação
do ângulo de rotação, tanto no plano XY quanto no plano ZY, em todo o deslocamento,
apesar de o NGDR ter indicado uma menor tortuosidade durante a maior parte do
percurso. A partir da análise do vídeo, foi possível observar que em toda a trajetória
houve movimento de rotação da associação em torno de seu próprio eixo, além do
movimento de deslocamento que os organismos desempenhavam na coluna de água.
Isso fez com que houvesse maior variação na detecção do centroide de
Chaetoceros/Vorticella pelo programa. Desta forma, o movimento helicoidal foi mais
sutil, fazendo com que, quando plotado, indicasse um movimento mais curvilíneo. O
intervalo em destaque no gráfico ressalta um período em que a associação teve um
menor deslocamento, mas rápidas atividades rotacionais, refletindo, desta forma, nos
picos de velocidades instantâneas, bem como no declínio do NGDR, indicando uma
maior tortuosidade.
Figura 19: Trajetória helicoidal. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção
2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em todo o eixo do
deslocamento. A velocidade está em mm s-1
. O gráfico da direita representa a variação dos
parâmetros quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade
instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 4293
quadros. A velocidade média da trajetória foi de 0,2889 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,19 ±
0,35. O retângulo vermelho destaca um período de maior variação na velocidade instantânea
com um NGDR próximo a 0, ou seja, onde houve maior tortuosidade no movimento. O
asterisco (*) indica o início da trajetória.
29
As trajetórias curvadas estão representadas pelas figuras 20, 21 e 22. A figura
20 destaca o ponto de mudança de direção no deslocamento da associação, onde se
observa um decréscimo no valor do NGDR, indicando maior tortuosidade no
movimento, e uma maior variação nos valores dos ângulos de rotação nos dois planos
(plano XY e plano ZY). Neste mesmo ponto também é possível observar um consequente
decréscimo, seguido de um aumento na velocidade instantânea. Esta variação dos
parâmetros está ligada ao momento em que há uma brusca mudança na direção da
trajetória, neste caso, em que a trajetória passou de um movimento descendente para
ascendente.
Figura 20: Trajetória curvada. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção
2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em todo o eixo do
deslocamento. A velocidade está em mm s-1
. O gráfico da direita representa a variação dos
parâmetros quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade
instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 1166
quadros. A velocidade média da trajetória foi de 0,5045 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,11 ±
0,58. O asterisco (*) indica o início da trajetória.
Na trajetória da figura 21, o NGDR indicou uma menor tortuosidade em todo o
deslocamento, possuindo valores acima de 0,9 associados às menores variações nos
ângulos de rotação em ambos os planos, bem como maiores valores de velocidade
instantânea. Esta maior velocidade fez com que nesta trajetória houvesse maior
deslocamento no eixo Y e a menor tortuosidade resultou em um menor deslocamento
nos eixos X e Z, quando comparada às outras trajetórias classificadas como curvadas ou
helicoidais, como, por exemplo, a trajetória curvada da figura 22. Esta trajetória teve um
total de 1294 quadros, um deslocamento de 16,96 mm e uma distância percorrida de
30
23,76 mm. Já a trajetória da figura 21 resultou em 748 quadros, um deslocamento de
20,48 mm e uma distância percorrida de 24,56 mm. Ou seja, apesar de ambas possuírem
valores deslocamento muito próximos, a distância percorrida na trajetória da figura 21
foi menor, o que indica um movimento menos tortuoso (corroborado pelos valores de
dimensão fractal), além de uma velocidade média maior.
Figura 21: Trajetória curvada. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção
2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em todo o eixo do
deslocamento. A velocidade está em mm s-1
. O gráfico da direita representa a variação dos
parâmetros quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade
instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 748 quadros.
A velocidade média da trajetória foi de 0,6568 mm/s. A dimensão fractal foi de 0,99 ± 0,18 O
asterisco (*) indica o início da trajetória.
31
Figura 22: Trajetória curvada. O gráfico da esquerda representa a trajetória em uma projeção
2D nos planos XY e ZY, na qual a velocidade instantânea foi representada em todo o eixo do
deslocamento. A velocidade está em mm s-1
. O gráfico da direita representa a variação dos
parâmetros quantitativos NGDR, ângulo de rotação nos planos XY e ZY e a velocidade
instantânea para cada ponto da trajetória. A trajetória foi realizada com um total de 1294
quadros. A velocidade média da trajetória foi de 0,3673 mm/s. A dimensão fractal foi de 1,06 ±
0,21 O asterisco (*) indica o início da trajetória.
Observações morfológicas da associação Chaetoceros-Vorticella
A diatomácea cêntrica Chaetoceros coarctatus é frequentemente observada
com numerosos ciliados da espécie Vorticella oceanica aderidos ao longo de toda
extensão de sua cadeia em águas costeiras de Ubatuba, litoral norte de São Paulo
(Gómez et al., 2018).
De acordo com estudos morfológicos, os ciliados se fixam na frústula (célula
individual da diatomácea) da diatomácea. A frústula é uma estrutura silicosa, composta
por duas estruturas principais: epiteca (oriunda da célula mãe) e hipoteca (a teca menor),
que são opostas e se encaixam. Cada uma das tecas é composta pela valva (epivalva e
hipovalva) associada ao cíngulo, formado por uma ou mais bandas (chamados de
epicíngulo e hipocíngulo). A região superior da valva é frequentemente chamada de
face valvar e, disposto perpendicularmente ao longo de todo o perímetro da face valvar,
está localizado o manto valvar. O limite entre manto e cíngulo é marcado por uma
sutura mais ou menos profunda (Cupp, 1943; Hernández-Becerril, 1991). A
representação diagramática da frústula está na figura 23.
32
Figura 23: Representação diagramática da frústula do gênero Chaetoceros. (1) vista pleural
(cingular) larga; (2) vista pleural (cingular) estreita; (3) vista valvar. Eixos: A distância da
superfície da epiteca através da frústula até a superfície da hipoteca é o eixo pervalvar (P), que
equivale à altura da célula; T, eixo transapical; A, eixo apical. Estruturas: superfície valvar (vs);
manto valvar (mv); cinta ou cíngulo (c); seta (s); seta terminal (st); base da seta (bs); forame (f). Adaptados de Cupp, 1943.
As frústulas em C. coarctatus apresentam formato cilíndrico e elíptico em vista
valvar, com um eixo apical de 25 a 35 µm (Cupp, 1943; Lee et al., 2014 – Figura 24).
Figura 24: Chaetoceros coarctatus. Vista interna da valva intercalar em formato elíptico.
33
A partir das observações morfológicas sob o MEV foi possível observar a
aderência dos ciliados V. oceanica na frústula da diatomácea C. coarctatus. Nestas
análises, o disco adesivo foi visto mais frequentemente localizado na região do manto
da valva da diatomácea (figura 25), sugerindo uma preferência do ponto de fixação.
Também foram realizadas análises morfológicas em MEV de V. oceanica. Na
figura 26B, pode-se observar o zooide cônico, em formato de sino invertido e a coroa de
cílios orais na região peristomial. O tamanho do zooide varia de 18 a 34 µm de
comprimento por 22 a 44 µm de diâmetro e cílios orais com cerca de 12 µm de
comprimento (Nagasawa & Warren, 1996; Sahu et al., 2017). Na figura 26C é possível
observar o pedúnculo estendido, com tamanho variando de 80 a 200 µm de
comprimento, e na base o disco adesivo (3 a 5 µm de diâmetro), usado para fixação no
substrato (Gómez et al., 2018).
34
Figura 25: Chaetoceros coarctatus em associação com Vorticella oceanica. As cadeias
representadas nestas imagens são provenientes de diferentes organismos. Dentre as imagens
representadas acima, a imagem E pertence a uma amostra que não passou pelo método do ponto
crítico. As setas indicam o ponto de aderência do disco adesivo do ciliado no manto da
diatomácea.
35
Figura 26: Vorticella oceanica. (A) Estrutura do zooide. CV = vacúolo contrátil; FV = vacúolo
alimentar; MA = acronúcleos. Barra de escala = 20 µm. (Adaptado de Nagasawa & Warren,
1996). (B, C, D) Imagens de MEV. (B) Zooide (C) V. oceanica distendida. As setas indicam o
pedúnculo e o disco adesivo. (D) Base do disco adesivo.
A partir de análises da associação sob o microscópio invertido (Olympus
IX73), foi verificado que em situações de estresse, como exposição a altas intensidades
de luz, os ciliados abandonavam a cadeia de diatomáceas, deixando muitas vezes o
pedúnculo nela fixado. Além disso, quando as associações foram colocadas em placas
de cultura de células com água do mar filtrada ou em meio de cultura f/2 e mantidas em
câmaras de germinação com temperatura próxima à verificada em campo e fotoperíodo
de 12:12 horas, os ciliados também abandonaram a cadeia de Chaetoceros após um
período de 24 horas nestas condições (figura 27).
36
Figura 27: Cadeia de C. coarctatus após V. oceanica abandonarem a cadeia. As setas indicam o
pedúnculo de alguns ciliados.
Discussão
A associação simbiótica entre a diatomácea cêntrica Chaetoceros coarctatus e o
ciliado peritríquio Vorticella oceanica é amplamente conhecida e registrada em diversos
estudos, porém nunca havia sido analisada sob o ponto de vista de suas implicações para
o movimento destes organismos. O epibionte ciliado V. oceanica foi inicialmente
descrito por intermédio de amostras coletadas no Mar do Sargaços, onde foi encontrado
em associação com a diatomácea C. coarctatus (Zacharias 1906). Cupp (1943)
examinou amostras da costa do Pacífico da América do Norte e detectou grande número
de V. oceanica aderidas a C. coarctatus. Nagasawa & Warren (1996) realizou um
estudo da distribuição vertical das diatomáceas do gênero Chaetoceros durante três anos
em Otsuchi Bay, Japão, onde verificaram uma grande abundância de C. coarctatus
associados a V. oceanica. Sahu et al. (2017) registrou uma diversidade de espécies de
diatomáceas do gênero Chaetoceros em águas costeiras da Índia, bem como em regiões
do Oceano Índico, e entre estas espécies, cadeias de C. coarctatus foram encontradas
em associação com o peritríqueo V. oceanica. Gómez et al. (2018) reportou a associação
37
C. coarctatus-V. oceanica no Atlântico Sul, indicando sua ampla distribuição em águas
tropicais. A fim de contribuir com novos dados acerca desta associação simbiótica, o
presente trabalho analisou a relevância ecológica da simbiose entre Chaetoceros e
Vorticella, por meio de um estudo comportamental do deslocamento destes organismos
na coluna de água.
Diatomáceas planctônicas são comuns em águas eutróficas e bem misturadas,
incluindo áreas polares, regiões costeiras temperadas e tropicais, além de ressurgências
(Malviya et al., 2016). Contudo, estes organismos também são frequentes e diversos em
águas oligotróficas e estratificadas. Para serem capazes de sobreviver sob limitação
nutricional, alguns grupos desenvolveram certas adaptações. Entre estas estratégias, a
migração vertical e as associações simbióticas podem explicar o sucesso de muitas
espécies nestes locais (Scala & Bowler, 2001; Gómez, 2007; Vincent et al., 2018).
Diversos trabalhos têm registrado um amplo espectro de interações simbióticas
entre diatomáceas planctônicas e outros organismos do plâncton, como é o caso da
associação epibiótica entre a diatomácea penada Fragillariopsis doliolus e o ciliado
tintinídeo Salpingella sp. Vincent et al. (2018) sugeriram que esta é uma relação
simbiótica mutualística, onde as diatomáceas adquirem maior motilidade e, em
contrapartida, os tintinídeos se beneficiam de maior proteção e maior eficiência na
produção da corrente alimentar. Gómez (2007) registrou a distribuição espacial e
vertical da associação Eutintinnus–Chaetoceros em águas do Oceano Pacífico. De
acordo com suas análises, foi sugerido que esta associação é fundamental para o sucesso
da diatomácea em águas com baixa disponibilidade de nutrientes e torna o tintinídeo
mais competitivo em relação às espécies congêneres. Outra associação bem conhecida é
da diatomácea do gênero Rhizosolenia com a cianobactéria diazotrófica Richelia
intracellularis, para a qual foi sugerido que florações de fitoplâncton em certas regiões
oligotróficas do oceano poderiam estar ligadas a disponibilidade de nutrientes
resultantes da fixação do nitrogênio por parte destas cianobactérias (Venrick, 1974).
Não há registros da diatomácea C. coarctatus sem a presença dos ciliados
aderidos (Cupp, 1943; Kimor et al., 1992). De acordo com estudos anteriores, a relação
entre V. oceanica e C. coarctatus pode ser uma relação de epibiose ou de foresia. Para
Lincoln et al. (1982) epibiose é uma relação simbiótica em que um organismo vive
sobre a superfície externa do outro. Já foresia foi definida por Kinne (1980) como uma
relação em que um organismo fornece abrigo, transporte ou algum tipo de suporte ao
outro indivíduo, sem qualquer exploração ou troca na atividade metabólica. Taylor
38
(1982) considerou a associação Chaetoceros-Vorticella uma relação de epibiose, onde o
ciliado é o epibionte e a diatomácea o hospedeiro.
A motilidade da associação ocorre, basicamente, em função da produção da
corrente alimentar pelos ciliados aderidos à cadeia de C. coarctatus. Para os ciliados de
vida livre, a motilidade é considerada aleatória, para aumentar a probabilidade de
detecção de presas. Ao detectarem uma fonte alimentar por um estímulo mecânico ou
químico, por exemplo, os ciliados têm a capacidade de modificar seu movimento,
alterando a velocidade de natação e a direção do movimento (Fenchel, 1987).
A disponibilidade e distribuição de fontes alimentares é uma importante
questão que afeta o padrão de movimento de forrageamento dos organismos (Bell,
1991; Cianelli et al., 2009). Para Fenchel (1987) “há aparentemente duas razões para a
motilidade dos protozoários: para capturar partículas alimentares ou para se deslocar
para uma nova locação”. Assim, a locomoção em ciliados ocorre em resposta a uma
combinação de estímulos abióticos e bióticos (como intensidade de luz e
disponibilidade de alimento) que proporciona maior acesso a regiões com condições
mais adequadas de sobrevivência.
Em laboratório, a partir de nossos experimentos, foi observado que a
associação desempenhou movimentos classificados em três categorias de deslocamento:
retilíneo, helicoidal e curvado. Os experimentos foram analisados em um ambiente
homogêneo, sem estímulos adicionais para os ciliados. Os movimentos realizados pela
associação podem ser vistos como randômicos. Como os organismos estavam inseridos
em um ambiente sem estímulos alimentares, a associação se deslocava ativamente,
possuindo velocidades médias variáveis (velocidade média mínima e máxima,
respectivamente: 0,15 mm s-1
e 2,0 mm s-1
). Apesar de não haver diferença significativa
da velocidade média entre as categorias de movimento, foi possível observar que houve
grande variação de velocidade entre as trajetórias retilíneas. De modo geral, a distância
percorrida foi maior em menor tempo nesta categoria de trajetória. Isto sugere que ao
detectar que em certo local do aquário não havia partículas alimentares, a associação
realizava uma espécie de "salto" (movimento retilíneo associado a uma velocidade mais
constante) se alocando em uma nova região e realizando novamente movimentos
curvilíneos e helicoidais, na tentativa de encontrar fontes alimentares.
O movimento helicoidal é um movimento típico identificado em
microrganismos (Buskey et al., 1993). Este movimento está ligado à distribuição e
agregação dos organismos, taxa de encontro de presas e outros processos ecológicos
39
fundamentais (Gurarie et al., 2011). Por exemplo, é o caso de movimentos individuais
que influenciam fenômenos ecológicos como florações de algas nocivas (FANs -
Bearon et al., 2006). Este fenômeno é caracterizado por um rápido e localizado acúmulo
de células produtoras de toxinas em altas densidades populacionais (Bearon &
Grünbaum 2008). As características do comportamento natatório têm sido apontadas
como um dos aspectos que influenciam a ocorrência destas altas concentrações
celulares, como no caso de Heterosigma akashiwo, que executa trajetórias helicoidais
orientadas verticalmente. Para Jennings (1901), a trajetória helicoidal permite com que
um organismo se desloque de um modo assimétrico ao longo de uma trajetória
resultante quase reta. Este movimento é benéfico para os organismos, como em
microalgas com motilidade, que necessitam estar na camada eufótica para realizar
fotossíntese em um ambiente onde a turbulência pode influenciar a sua taxa de
afundamento na coluna de água (Kessler 1985; Gurarie et al., 2011).
Buskey & Stoecker (1989) fizeram um estudo do comportamento natatório de
Favella sp. a fim de quantificar suas respostas comportamentais na presença de
diferentes espécies de fitoplâncton e analisar seus estímulos mecânicos e químicos.
Neste estudo foi verificado que os tintinídeos diminuíam a velocidade quando expostos
a altas concentrações de alimento. Desta forma, de acordo com a literatura e a partir dos
experimentos, pode-se sugerir que ao encontrar regiões com alta concentração de
partículas alimentares a associação Chaetoceros-Vorticella tende a diminuir a
velocidade de natação e deixar de alterar sucessivamente a orientação do deslocamento.
Este deslocamento dos ciliados para as regiões onde estão suas fontes alimentares faz
com que as diatomáceas provavelmente também se beneficiem de áreas com maior
disponibilidade de nutrientes inorgânicos.
Os ciliados desempenham um importante papel em ecossistemas aquáticos. São
consumidores de pico e nano produtores primários, sendo considerados membros chave
na alça microbiana (Azam et al., 1983; Pierce & Turner 1992). Predadores de topo na
cadeia alimentar microbiana, os ciliados são vistos como mediadores na transferência de
carbono microbiano para níveis tróficos superiores, já que são fontes de alimento de
metazoários zooplanctônicos e larvas de peixes (Gemmell et al., 2015). Além disso,
devido a seus hábitos nutricionais e seu metabolismo, os ciliados têm sido reconhecidos
como envolvidos na ciclagem de nutrientes (Lamersdorf & Meyer, 1993; Buhse et al.,
2001).
40
Estes membros do microzooplâncton são reconhecidos como importantes
regeneradores de nutrientes (nitrogênio, fósforo e elementos traços), principalmente
como fontes de NH4+ (Pettigrosso & Popovich, 2009; Echevarria et al., 2014). No
oceano o nitrogênio é considerado um nutriente limitante para produtividade primária
(Carpenter & Capone, 1983). Assim, a excreção dos ciliados é considerada uma fonte de
nutrientes para os organismos autotróficos. No caso de associações simbióticas, esta
excreção pode ser vista como um benefício para a alga, onde ela possuiria seu próprio
suprimento de nutrientes em águas oligotróficas.
Entre os benefícios observados nesta associação podemos citar maior proteção
dos ciliados contra a predação, já que se alocam entre as setas e são capazes de se
contrair na direção da cadeia quando detectam alguma ameaça ou partículas maiores.
Outra característica estrutural é a presença de cloroplastos nas setas (Hernández-
Becerril, 1991). Esta característica faz com que a atividade fotossintética não seja tão
prejudicada devido à presença dos epibiontes sobre a cadeia.
Além de possuírem maior sucesso no deslocamento quando estão em
associação, pode-se sugerir que quando aderidos à cadeia de diatomáceas, os ciliados
podem aumentar o fluxo da corrente alimentar, o que aumentaria tanto a captura de
alimento para os ciliados quanto o fluxo de nutrientes para a cadeia de diatomáceas.
Jonsson et al. (2004) verificou que tintinídeos da espécie Eutintinnus inquilinus, quando
fixados em agregados, possuíam uma taxa alimentar 80% maior do que quando estavam
em vida livre.
A orientação das setas de C. coarctatus também pode ser vista como uma
adaptação da diatomácea à simbiose, pois possivelmente contribui para um
deslocamento mais eficiente, em termos hidrodinâmicos, de toda a colônia. Alterações
morfológicas para hospedar os ciliados também foram identificadas em outras
diatomáceas, como em Chaetoceros tetrastichon Cleve e Chaetoceros dadayi Pavillard,
que são frequentemente encontradas associadas com o tintinídeo Eutintinnus inquilinus
(Gómez, 2007).
Por meio de análises morfológicas em microscopia eletrônica de varredura foi
possível analisar os locais de adesão dos epibiontes à cadeia de diatomáceas. Os discos
adesivos de V. oceanica se encontraram aderidos com maior frequência na região do
manto da frústula da célula individual da diatomácea. Isso pode ser visto como uma
estratégia para permanecerem aderidos na diatomácea mesmo após a cadeia se dividir.
41
Outra característica comportamental observada em condições laboratoriais foi
que quando em situações de estresse como aumento da temperatura ou meio sem
alimento para os ciliados, as Vorticella abandonavam a cadeia de Chaetoceros,
destacando o zooide e passando a nadar livremente. Embora não haja registros destes
organismos no ambiente sem estarem em simbiose, este comportamento pode sugerir
que os ciliados saem em busca de condições mais adequadas.
O comportamento natatório da associação Chaetoceros-Vorticella pode ter
consequências para a agregação dos organismos no ambiente marinho, por intermédio
da formação de camadas finas. Este fenômeno é comum em oceanos costeiros
estratificados (Donaghay et al., 1992). Em resposta a processos biológicos ou físicos, a
camada é formada por aglomeração do fitoplâncton em manchas discretas na coluna de
água com espessura variando de alguns centímetros a poucos metros, extensão
horizontal de vários quilômetros e pode persistir por dias (McManus et al., 2003). Estas
camadas possuem uma grande importância ecológica, já que podem representar um
“hotspot” de interações biológicas, estando frequentemente associadas com alta
abundância de bactérias, zooplâncton e peixes (Benoit-Bird et al., 2009; Durham et al.,
2009). Contudo, algumas camadas são formadas por espécies de fitoplâncton tóxicas,
refletindo em menores concentrações de zooplâncton quando relacionada as camadas
adjacentes (Benoit-Bird et al. 2009). Neste caso a camada pode fornecer uma vantagem
seletiva para estas espécies de algas, fazendo com que a camada seja vista como um
refúgio contra a predação (Durham & Stocker, 2011).
Muitas camadas finas são compostas por células de fitoplâncton móveis,
embora existam camadas finas formadas com espécies não móveis, como certas
diatomáceas (Alldredge et al., 2002; Sullivan et al., 2010). A motilidade dos
organismos, juntamente com o deslocamento do fluido, pode resultar em um fenômeno
complexo e ecologicamente importante nestas regiões. Quando as células migram
verticalmente e atingem uma zona de cisalhamento, onde a direção do fluxo horizontal
muda rapidamente ao longo de uma faixa vertical curta, as forçantes gravitacionais e
viscosas aplicam um torque sobre elas, fazendo com que girem e saiam de sua
orientação no eixo vertical. Quando o cisalhamento excede um limiar crítico, o giro
impede que o fitoplâncton continue se deslocando para cima e, assim, fique preso nesta
faixa. Este processo é chamado de aprisionamento girotático, que contribui para a
formação de camadas finas (Durham & Stocker, 2011).
42
Devido a esse “aprisionamento” de presas em um pequeno intervalo, as
camadas finas são capazes de atrair predadores e aumentar significativamente a
transferência de energia desde os produtores primários aos níveis tróficos superiores,
quando comparadas a regiões onde o plâncton está distribuído de forma mais
homogênea (Durham & Stocker, 2011).
Os ciliados possuem um comportamento natatório que lhes permite explorar a
coluna de água e provavelmente aumentar a chance de encontrar regiões com maior
disponibilidade de alimento. Por outro lado, a maioria das diatomáceas não possui
motilidade. Neste caso elas possuem recursos que auxiliam no controle de sua posição
vertical na coluna de água, regulando sua flutuabilidade. Para esse controle na coluna de
água o fitoplâncton utiliza mecanismos que permitem que sua densidade seja diferente
do meio. Entre esses mecanismos estão a regulação pelos vacúolos de gás (Walsby,
1972), controle de íons (Gross & Zeuthen, 1948), entre outros (vide Gemmell et al.,
2016).
A associação Chaetoceros-Vorticella permite a esta diatomácea cêntrica uma
motilidade ativa na coluna de água, bem como um maior deslocamento para todos os
organismos envolvidos nesta simbiose. De acordo com os cálculos realizados neste
estudo, se considerarmos a velocidade média máxima que a associação desempenhou
em nossos experimentos, uma cadeia de Chaetoceros-Vorticella poderia se deslocar
cerca de 170 metros por dia. Esse não é um valor necessariamente realista, pois não leva
em conta forçantes do meio, como turbulência, mas dá uma medida da significância do
deslocamento da associação Chaetoceros-Vorticella e de suas possíveis consequências
ecológicas.
Considerações finais e perspectivas
Com base em investigações empíricas realizadas neste trabalho, bem como em
outros estudos comportamentais de organismos planctônicos, podemos sugerir que o
comportamento de deslocamento realizado pela associação Chaetoceros-Vorticella na
coluna de água resulta em um baixo custo-benefício tanto para o epibionte quanto para o
hospedeiro. Em regiões oligotróficas, epipelágicas e estratificadas, a associação com
Vorticella pode ser um dos fatores que garante o sucesso desta diatomácea sob
condições ambientais que seriam de outra forma adversas para espécies do
microfitoplâncton. A motilidade possibilitaria à diatomácea atingir regiões com maior
43
disponibilidade de nutrientes e, em contrapartida, os ciliados teriam uma maior
probabilidade de detectar partículas alimentares em maior concentração e ainda obter
proteção contra a predação.
Em termos de submesoescala, este estudo sugere que o deslocamento realizado
pela associação Chaetoceros-Vorticella pode contribuir para a formação de camadas
finas, levando à formação de hotspots de atividade biogeoquímica e de interações
tróficas. No entanto, esta hipótese necessita de validação experimental e, idealmente, de
observações de campo.
O presente estudo forneceu dados iniciais sobre o comportamento de
deslocamento da associação Chaetoceros-Vorticella, e deve ser considerado como um
ponto de partida para elucidar diversas questões ecológicas relevantes. Ainda é
necessário investir em estudos comportamentais para verificar, por exemplo, como os
organismos reagem a estímulos bióticos e abióticos incluindo intensidade de luz,
turbulência, disponibilidade de fontes alimentares, entre outros fatores. Análises
adicionais também são sugeridas na tentativa de entender os mecanismos que levam V.
oceanica a se aderir especificamente a C. coarctatus, assim como para avaliar o destino
dos indivíduos de V. oceanica que se destacam da cadeia de diatomáceas diante de
condições de estresse. Se na natureza eles desempenharem tal comportamento, seriam
eles capazes de encontrar uma nova cadeia de Chaetoceros para se aderir? Nestas
condições adversas, quando sozinhos, os ciliados possuiriam maiores chances de
sobreviver do que com a proteção da diatomácea? Para responder estas questões
também são necessários novos experimentos.
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