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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE MORTALIDADE E COMPORTAMENTO DE Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) RESISTENTE A PIRETRÓIDES EXPOSTO AO ÓLEO ESSENCIAL DE Aristolochia trilobata L. (Piperales: Aristolochiaceae) INDIRA MORGANA DE ARAÚJO SILVA 2017
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE
MORTALIDADE E COMPORTAMENTO DE Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) RESISTENTE A PIRETRÓIDES EXPOSTO
AO ÓLEO ESSENCIAL DE Aristolochia trilobata L. (Piperales:
Aristolochiaceae)
INDIRA MORGANA DE ARAÚJO SILVA
2017
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE
INDIRA MORGANA DE ARAÚJO SILVA
MORTALIDADE E COMPORTAMENTO DE Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)
RESISTENTE A PIRETRÓIDES EXPOSTO AO ÓLEO ESSENCIAL DE Aristolochia
trilobata L. (Piperales: Aristolochiaceae)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Sergipe, como parte das exigências
do Curso de Mestrado em Agricultura e
Biodiversidade, área de concentração em
Agricultura e Biodiversidade, para obtenção do
título de “Mestre em Ciências”.
Orientador
Prof. Dr. Leandro Bacci
SÃO CRISTÓVÃO
SERGIPE – BRASIL
2017
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S586m
Silva, Indira Morgana de Araújo
Mortalidade e comportamento de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) resistente a
piretróides exposto ao óleo essencial de Aristolochia trilobata L. (Piperales:
Aristolochiaceae) / Indira Morgana de Araújo Silva – São Cristóvão, 2017.
54 f.: il.
Dissertação (Mestrado em Agricultura e Biodiversidade) – Programa de Pós-
Graduação em Agricultura e Biodiversidade, Universidade Federal de Sergipe,
2017.
Orientador: Prof. Dr. Leandro Bacci
1. Aedes aegypti – Comportamento. 2. Aedes aegypti - Mortalidade. 3. Essências
e óleos essenciais. 4.Inseticidas. I. Bacci, Leandro, orient. II. Título.
CDU: 595.771:665.52/.54
INDIRA MORGANA DE ARAÚJO SILVA
MORTALIDADE E COMPORTAMENTO DE Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)
RESISTENTE A PIRETRÓIDES EXPOSTO AO ÓLEO ESSENCIAL DE Aristolochia
trilobata L. (Piperales: Aristolochiaceae)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Sergipe, como parte das exigências
do Curso de Mestrado em Agricultura e
Biodiversidade, área de concentração em
Agricultura e Biodiversidade, para obtenção do
título de “Mestre em Ciências”.
APROVADA em 27 de fevereiro de 2017.
Prof. Dra. Ana Paula Albano Araújo
UFS
Prof. Dr. Flávio Gabriel Bianchini
IFES
Prof. Dr. Leandro Bacci
UFS
(Orientador)
SÃO CRISTÓVÃO
SERGIPE – BRASIL
Aos que são tudo pra mim nessa Terra,
Anselmo, Diva, Inaê e
Joaninha (in memorian).
Amo vocês.
Dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus, pois a Ele toda honra e toda glória. Sem Ele nada dá certo.
Ao Programa de Pós-Graduação em Agricultura e Biodiversidade (PPGAGRI), à
Universidade Federal de Sergipe – UFS, à Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação
Tecnológica do Estado de Sergipe (FAPITEC), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo apoio logístico
e financeiro.
À disponibilidade e proveitosa contribuição da banca avaliadora.
Ao meu orientador Prof. Dr. Leandro Bacci por todo ensinamento e conhecimento,
palavras de incentivo e dedicação. A minha co-orientadora Prof. Dra. Ana Paula Albano Araújo
por ser “nossos braços” durante todos esses anos e por toda ajuda sempre dedicada. Serei
eternamente grata a vocês por tudo.
Ao Prof. Dr. Paulo Fellipe Cristaldo pelo apoio, direcionamentos e contribuição para a
elaboração dessa dissertação.
Ao Prof. Dr. Marcelo Coutinho Picanço por toda colaboração e parceria fundamental
para a execução e obtenção desse trabalho, pela concessão do Laboratório de Manejo Integrado
de Pragas na Universidade Federal de Viçosa - UFV, pela orientação e conselhos, e por toda
receptividade de sempre.
Ao Prof. Dr. Gustavo Ferreira Martins pelo fornecimento essencial das populações do
A. aegypti utilizadas nessa dissertação, pela parceria, confiança e disponibilidade.
Aos meus amigos incondicionais e insubstituíveis: meu pai Anselmo, minha mãe Diva,
minha irmã Inaê e minha vó Joaninha (in memorian), por todo apoio, amor e bondade. Vocês
são minhas motivações e nunca esquecerei o que vocês fizeram por mim durante toda a minha
trajetória-UFS. A minha prima e companheira de “apê”, Ingrid, pelos momentos de
descontração e companheirismo importantes durante minha vida-UFS.
A todos os amigos da Clínica Fitossanitária (Alisson, Ana Paula, Ane Caroline, Ângela,
Bruna, Carlisson, Cecília Beatriz, Emile, Lucas, Ruan, Victor, Wallace e, aos novatos, Everson,
Gabriel e Lucas) pela dedicação e ajuda de sempre na manutenção dos insetos, nos
experimentos (principalmente nos de “TL”) e nas tabulações dos dados. Obrigada a Alisson,
Ana Paula, Emile, Ruan e Abraão pelos trabalhos e convívio em Viçosa. Obrigada a Alisson,
Ana Paula e Emile por também terem me recebido tão bem na casa de vocês quando era preciso
otimizar tempo. A Luizinho, que já é de coração de nossa equipe MIP, por toda amizade, luz e
ajuda. Obrigada pelo carinho, palavras de conforto e encorajamento de todos vocês.
A minha grande amiga Ane, por toda amizade, pelas ajudas, conselhos, orações e as
palavras sempre animadoras e de fé.
Aos meus parceiros-amigos dentro e fora da UFS, Carlisson, Bruna e Cecília Beatriz
pelos conselhos, ajuda e amizade. A Carlisson também pelas caronas e direcionamentos.
Ao Elizeu de Sá, por me orientar na UFV durante meus primeiros experimentos com o
Aedes aegypti. E à Janaína por me ensinar a manter a criação dos insetos e pela paz que sempre
transmitia.
Às meninas do Departamento de Zootecnia - UFS, Juciara e Juliana, por toda
disponibilidade e ajuda quando era preciso usar o gás carbônico para os bioensaios.
Aos velhos amigos de curso pela torcida, mesmo à distância, Jefferson, Hércules, Flávia
e Alanna.
BIOGRAFIA
INDIRA MORGANA DE ARAÚJO SILVA nasceu em Aracaju - SE, em 16 de março
de 1992. Cresceu e viveu até os dois anos de idade no povoado Triunfo – SE, passando a morar
por 15 anos em Simão Dias – SE. Se mudou para a cidade de Aracaju no ano de 2009, onde
vive atualmente. Filha de José Anselmo de Oliveira e Diva de Araújo Silva.
Finalizou o Ensino Médio em 2009 e se formou em Engenharia Agronômica pela
Universidade Federal de Sergipe, em São Cristóvão, SE, em 20 de fevereiro de 2015.
Em 15 de março de 2015 iniciou o mestrado pelo Programa de Pós-Graduação em
Agricultura e Biodiversidade, na Universidade Federal de Sergipe.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................................... i
LISTA DE TABELAS ......................................................................................................................... ii
RESUMO ............................................................................................................................................. iii
ABSTRACT ......................................................................................................................................... iv
1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................................. 05
2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................................ 06
2.1. Aedes aegypti: IMPORTANTE VETOR DE DOENÇAS TROPICAIS .................................. 06
2.1.1. ASPECTOS MORFO-FISIOLÓGICOS ........................................................................... 07
2.1.2. CAPACIDADE VETORIAL ............................................................................................ 08
2.1.3. COMPORTAMENTO ...................................................................................................... 09
2.2. ESTRATÉGIAS DE CONTROLE DO A. aegypti ................................................................... 10
2.2.1. CONTROLE QUÍMICO ................................................................................................... 11
2.2.1.1. RESISTÊNCIA A INSETICIDAS ............................................................................ 11
2.2.1.2. CUSTO ADAPTATIVO DA RESISTÊNCIA ......................................................... 12
2.2.2. CONTROLE ALTERNATIVO ........................................................................................ 13
2.3. PLANTAS BIOATIVAS .......................................................................................................... 13
2.3.1. ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS ............................................................................ 13
2.3.2. ÓLEOS ESSENCIAIS PARA CONTROLE DE A. aegypti ............................................ 14
2.3.3. FAMÍLIA ARISTOLOCHIACEAE ................................................................................. 15
2.3.3.1. Aristolochia trilobata ............................................................................................... 16
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................. 17
4. ARTIGO 1: ALTERNATIVA AO CONTROLE DE Aedes aegypti RESISTENTE A
PIRETRÓIDE: EFEITOS KNOCKDOWN E SUBLETAIS DE MONOTERPENOS
BIOINSETICIDAS .............................................................................................................................. 29
Resumo ............................................................................................................................................ 29
Abstract ........................................................................................................................................... 31
4.1. Introdução ................................................................................................................................. 31
4.2. Material e Métodos ................................................................................................................... 31
4.2.1. Populações de A. aegypti estudadas .................................................................................. 31
4.2.2. Obtenção dos bioinseticidas e do piretróides .................................................................... 32
4.2.3. Bioensaios ......................................................................................................................... 33
4.2.3.1. Toxicidade .............................................................................................................. 33
4.2.3.2. Tempo letal ............................................................................................................ 33
4.2.3.3. Comportamento de natação de larvas .................................................................... 34
4.2.4. Análises estatísticas .......................................................................................................... 34
4.3. Resultados ................................................................................................................................ 34
4.3.1. Caracterização química do OE ......................................................................................... 34
4.3.2. Bioensaios ......................................................................................................................... 35
4.3.2.1. Toxicidade .............................................................................................................. 35
4.3.2.2. Tempo letal ............................................................................................................ 35
4.3.2.3. Comportamento de natação das larvas ................................................................... 35
4.3.2.3.1. Deslocamento e velocidade ...................................................................... 36
4.3.2.3.2. Orientação das larvas ................................................................................ 36
4.3.2.3.3. Atividade larval ........................................................................................ 36
4.4. Discussão .................................................................................................................................. 37
4.5. Conclusões ................................................................................................................................ 38
4.6. Referências Bibliográficas ....................................................................................................... 39
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................................... 54
i
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Fórmula estrutural plana dos compostos majoritários encontrados no OE de A.
trilobata. (1) ρ-cimeno, (2) limoneno, (3) linalol e (4) acetato de sulcatila ...... 44
2 Esquema de síntese química do acetato de sulcatila. (1) sulcatona, (2) sulcatol
e (3) acetato de sulcatila .................................................................................... 45
3 Mortalidade (%) (± EPM) de larvas L3 e fêmeas adultas de A. aegypti
resistentes a piretróides expostas às CLs90 (das larvas L3 susceptíveis) e DLs90
(das fêmeas adultas susceptíveis) da deltametrina, do OE de A. trilobata e dos
seus compostos majoritários após 48 horas de exposição. Histogramas
seguidos pela mesma letra minúscula, para comparação das mortalidades das
larvas, e maiúsculas, para comparação das mortalidades das fêmeas adultas,
não diferem entre si, pelo teste de Tukey à p < 0,05. * O acetato de sulcatila
não foi testado sobre larvas de A. aegypti resistentes, uma vez que não foi
possível obter a CL90 para larvas susceptíveis .................................................. 48
4 Curvas de sobrevivência e tempo médio necessário para matar 50% (TL50) da
população susceptível (A) e resistente a piretróides (B) de larvas/pupas e
população de fêmeas adultas susceptível (C) e resistente a piretróides (D) de
A. aegypti expostas ao ρ-cimeno e deltametrina. Foram utilizadas as CLs90
para larvas/pupas e as DLs90 para fêmeas adultas determinadas nos bioensaios
de toxicidade .................................................................................................... 49
5 Trilhas representativa do deslocamento de larvas L3 de A. aegypti,
susceptíveis e resistentes a piretróides, expostas imediatamente e por 48 horas
às CLs20 (para larvas L3 de A. aegypti susceptíveis à piretróides) do inseticida
deltametrina, do OE de A. trilobata e dos seus compostos majoritários .......... 50
6 Deslocamento (m) (±EPM) e velocidade (±EPM) (pixels/s x 10-2) de larvas
L3 de A. aegypti, susceptíveis e resistentes a piretróides, expostas
imediatamente e por 48 horas de exposição às CLs20 (para larvas L3 de A.
aegypti susceptíveis à piretróides) do inseticida deltametrina, do OE de A.
trilobata e dos seus compostos majoritários. * médias não diferem do controle
pelo teste de Dunnett à p < 0,05 ....................................................................... 51
7 Meandro (deg/mm) (±EPM) e velocidade angular (±EPM) (deg/s) de larvas
L3 de A. aegypti, susceptíveis e resistentes a piretróides, expostas
imediatamente e por 48 horas de exposição às CLs20 (para larvas L3 de A.
aegypti susceptíveis à piretróides) do inseticida deltametrina, do OE de A.
trilobata e dos seus compostos majoritários. * médias não diferem do controle
pelo teste de Dunnett à p < 0,05 ....................................................................... 52
8 Atividade de larvas L3 de A. aegypti, susceptíveis e resistentes a piretróides,
expostas imediatamente e por 48 horas às CLs20 (para larvas L3 de A. aegypti
susceptíveis à piretróides) do inseticida deltametrina, do OE de A. trilobata e
dos seus compostos majoritários. * médias não diferem do controle pelo teste
de Dunnett à p < 0,05 ....................................................................................... 53
ii
LISTA DE TABELAS
Tabela Página
1 Composição química do OE de A. trilobata caracterizado por CG/EM/DIC ..... 43
2 Toxicidade do inseticida deltametrina, do OE de A. trilobata e dos seus
compostos majoritários sobre larvas L3 de A. aegypti susceptíveis à
piretróides após 48 horas da exposição ............................................................. 46
3 Toxicidade do inseticida deltametrina, do OE de A. trilobata e dos seus
compostos majoritários sobre fêmeas adultas de A. aegypti susceptíveis à
piretróides após 48 horas da exposição .............................................................. 47
iii
RESUMO
SILVA, Indira Morgana de Araújo. Mortalidade e comportamento de Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) resistente a piretróides exposto ao óleo essencial de Aristolochia
trilobata l. (Piperales: Aristolochiaceae). São Cristóvão: UFS, 2017. 80p. (Dissertação –
Mestrado em Agricultura e Biodiversidade).*
O Aedes aegypti é vetor de graves arboviroses como dengue, febre amarela, Zika e
Chikungunya, porém inúmeros casos de resistência à piretróides tem sido identificados em
populações desse vetor em vários países. Nesse trabalho, objetivamos analisar os efeitos letais
e subletais do óleo essencial de Aristolochia trilobata e seus compostos majoritários sobre A.
aegypti. O óleo essencial de A. trilobata foi obtido por hidrodestilação em aparelho Clevenger
e analisado quimicamente por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa e a um
detector de ionização de chamas (CG/EM/DIC). Foram utilizadas as populações de A. aegypti
PPCampos e Oiapoque, susceptível e resistente a piretróides, respectivamente. Os bioensaios
foram desenvolvidos com larvas e adultos para obtenção das concentrações/doses e tempos
letais, e apenas com larvas para avaliação do comportamento de natação desses indivíduos.
Foram identificados e quantificados 25 compostos no óleo essencial de A. trilobata, os quais
representaram 98,72% da composição total. Dentre os bioinseticidas, o composto mais tóxico
foi o limoneno, para as larvas, e o óleo essencial de A. trilobata, para os adultos, da população
susceptível. Já as larvas e adultos da população resistente apresentaram mortalidade de
aproximadamente 100% quando tratadas com o composto ρ-cimeno. Esse composto também
causou rápida redução da sobrevivência dos indivíduos da população resistente, com tempo
letal de 9,54 h e 0,08 h para matar 50% das larvas-pupas e fêmeas adultas, respectivamente. Os
tratamentos modificaram o comportamento de natação de larvas das duas populações e, de
forma geral, reduziram suas taxas de deslocamento e velocidade, assim como causaram maior
desorientação de natação. Dessa forma, nossos resultados apontam possíveis alternativas ao
controle de larvas e adultos de A. aegytpi, inclusive resistente a piretóides, e esclarece sobre os
efeitos de inseticidas sobre o comportamento de larvas deste mosquito e suas possíveis
consequências no fitness de populações naturais.
Palavras-chave: Aristolochia trilobata, efeito subletal, óleo essencial de planta, ρ-cimeno,
toxicidade.
___________________
* Comitê Orientador: Leandro Bacci – UFS (Orientador), Ana Paula Albano Araújo – UFS (Co-
orientadora).
iv
ABSTRACT
SILVA, Indira Morgana de Araújo. Mortality and behavior of Aedes aegypti (Diptera:
Culicidae) resistant to pyrethroids exposed to the essential oil of Aristolochia trilobata l.
(Piperales: Aristolochiaceae). São Cristóvão: UFS, 2017. 80p. (Thesis - Master of Science in
Agriculture and Biodiversity).*
The Aedes aegypti is a vector of severe arboviruses such as dengue, february yellow, Zika and
chikungunya, and other examples of resistance to pyrethroids have been identified in vector
populations in several countries. In this work, we aim to analyze the effects of lethal and
subtleties of the essential oil of Aristolochia trilobata and its major compounds on A. aegypti.
The essential oil of A. trilobata was obtained by hydrodistillation in Clevenger apparatus and
chemically analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry and a flame
ionization detector (GC / MS / DIC). They populations of A. aegypti susceptible PPCampos and
resistant to pyrethroids Oiapoque were used. The bioassays were developed with larvae and
adults to obtain concentrations/doses and lethal times, and only with larvae to evaluate the
swimming behavior of these individuals. Twenty-five compounds were identified and
quantified in the essential oil of A. trilobata, which represented 98.72% of the total composition.
Among the bio-insecticides, the most toxic compound was limonene, for larvae, and the
essential oil of A. trilobata, for adults, of the susceptible population. However, as larvae and
adults of the resistant population showed approximately 100% mortality when treated with the
ρ-cymene compound. This compound also caused a reduction in the survival of individuals in
the resistant population, with a lethal time of 9.54 h and 0.08 h to kill 50% of larvae and adult
females, respectively. The treatments modified the larval swimming behavior of the both
populations and, in general, reduced their rates of displacement and velocity, as well caused
greater disorientation of swimming. Thus, our results show possible alternatives to control
larval and adult of A. aegytpi, including resistant to pyrethroids, and clarify the effects of
insecticides on the behavior of larvae of this mosquito and its possible consequences on fitness
of natural populations.
Key words: Aristolochia trilobata, sublethal effect, plant essential oil, p-cymene, toxicity.
___________________
* Supervising Committee: Leandro Bacci – UFS (Orientador), Ana Paula Albano Araújo (Co-
orientadora) – UFS.
5
1. INTRODUÇÃO GERAL
O mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) é vetor de diversas doenças que vêm
causando, a nível global, elevados índices de mortalidade humana, danos sociais e altos custos
econômicos (Sachs, 2002; Shepard et al., 2011). No Brasil, a dengue - transmitida pelo A.
aegypti - vem posicionando o país na liderança do rancking dos países com maior número de
casos da doença (Guzman e Harris, 2015; WHO, 2012). Os elevados índices de casos da dengue
são em grande parte devido ao comportamento de adaptação do A. aegypti e às condições
ambientais favoráveis a sua sobrevivência (Silva Júnior e Pimenta Júnior, 2008). Desta forma,
é fundamental que o combate às doenças transmitidas pelo A. aegypti seja focada
principalmente no controle direto desse vetor.
Por décadas, o A. aegypti foi controlado por inseticidas organossintéticos (Allan, 2011;
Tauil, 2001). Esse método é eficiente e emergencial e foi fundamental para o combate a
epidemias durante o século XX na Europa (Curtis e Lines, 2000) e na década de 50 no Brasil
(Consoli e Oliveira, 1998). No entanto, o uso intenso e inadequado desses inseticidas tem sido
relatado na literatura por selecionar populações resistentes do A. aegypti ao longo do tempo
(Collet et al., 2016; Strode et al., 2008).
Os piretróides se destacam nesse sentido, ocasionando casos de resistência em
populações de A. aegypti em várias regiões tropicais e subtropicais em todo o mundo (Dusfour
et al., 2015; Lima et al., 2011; Martins et al., 2009; Martins et al., 2012). Esses produtos atuam
no sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP), mais especificamente nos canais de sódio
do axônio. Porém, modificações coordenadas por mutações metabólicas tem favorecido a
atuação destoxificativa de complexos enzimáticos e a insensibilização do sítio alvo (Ishak,
2015). Esse último tipo de mutação gera a resistência conhecida como “Knockdown” e é uma
das mais frequentes resistências encontradas em populações de A. aegypti expostas
intensivamente a DDT e piretróides (Davies, 2007).
Nos últimos anos, inúmeros estudos têm sido realizados na tentativa de buscar maneiras
mais eficientes para o controle do A. aegypti, utilizando-se compostos bioativos extraídos de
plantas medicinais e aromáticas (Pavela, 2015; Silva et al., 2007; Yu et al., 2014; Zuharah et
al., 2015). Além da eficiente bioatividade desses constituintes em diversos insetos-praga
(Bakkali et al., 2008; Isman, 2000; Isman et al., 2011; Nerio et al., 2010; Yang et al., 2005;),
esses bionseticidas apresentam degradabilidade elevada, composição química acentuada e
atividade biológica complexa, o que dificulta casos de resistência em insetos (Isman, 2000;
Isman, 2006; Pavela et al., 2013; Pavela, 2014).
Mais do que conhecer os efeitos letais dos inseticidas, é importante investigar os efeitos
subletais uma vez que mudanças no comportamento e outros aspectos biológicos podem
impactar o fitness. Alguns estudos veem demonstrando o efeito de metabólitos secundários no
comportamento de repelência, oviposição e alimentação de A. aegypti (Benelli, 2016;
Noosidum et al., 2008; Klocke, 1987; Yu et al., 2014). No entanto, pouco se sabe sobre a
eficiência dos metabólitos secundários como agentes reguladores de aspectos comportamentais
de natação de larvas do A. aegypti.
O óleo essencial da planta medicinal e aromática Aristolochia trilobata possui potencial
inseticida registrado para formigas cortadeiras do gênero Atta e Acromyrmex (Oliveira, 2014)
e para os cupins-praga Cryptotermes brevis e Nasutitermes corniger (Santos, 2016). No entanto,
estudos mais aprofundados utilizando os metabólitos secundários de A. trilobata sobre o vetor
da dengue A. aegypti ainda não são conhecidos.
Dessa forma, neste estudo nosso objetivo foi avaliar os efeitos letais e subletais do óleo
essencial de A. trilobata e dos seus compostos majoritários sobre A. aegypti susceptível e
resistente a piretróides.
6
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Aedes aegypti: importante vetor de doenças tropicais
Cerca de 16% de todas as doenças em humanos são causadas por agentes etiológicos
que são transmitidos por mosquitos ou pernilongos, o que inclui 200 espécies de insetos da
ordem Diptera (Eldridge e Edman, 2000). Esse dado é preocupante uma vez que o mundo tem
enfrentado pandemias, principalmente devido ao aumento populacional desses mosquitos
vetores. Entre as principais doenças de importância epidemiológica, destacam-se aquelas
transmitidas pelo A. aegypti, tais como a febre amarela, Chikungunya, Zika e dengue (WHO,
2014).
Nas últimas décadas, tais doenças têm sido consideradas um problema de ordem de
saúde pública (Figueiredo, 2007; Gubler, 2002) e estão associadas às condições de clima e
favoráveis para a sobrevivência dos seus vetores. Surtos de arboviroses têm sido mais
frequentes em áreas quentes e chuvosas (Blair et al., 2000) e naquelas que passaram por
urbanização não planejada (Gubler, 2002; Pignatti, 2004; Vasconcelos et al., 2001). Por essas
razões, essas doenças têm acometido números crescentes de pessoas a cada ano (Kuniholm et
al., 2006).
A febre amarela, por exemplo, atinge atualmente 44 países e acarreta de 675 a 30.000
mortes ao ano (Labeaud et al., 2011). Em 2013, o vírus da Chikungunya alcançou o Hemisfério
Ocidental, mais especificamente em Saint Martin e em 2014 já havia se espalhado por 22 países
da América Central e do Sul e o Caribe, culminando em centenas de milhares de ocorrências
(Morrison, 2014). Outra doença que também tem ganhado repercussão e gerado preocupação é
a causada pelo Zika vírus (ZiKV). Esse vírus é emergente desde 2007 e em 2013 foi relatado
causando grande epidemia na Polinésia Francesa (Cao-Lormeau et al., 2014; Ioos et al., 2014).
A dengue também é considerada uma doença severa e ocasiona cerca de 390 milhões de casos
anualmente, sendo desse total, 96 milhões relacionados a expressão aparente da doença em
algum nível de gravidade (Bhatt et al., 2013).
Estima-se que de 50 a 100 milhões de novos casos de dengue deverão ainda ocorrer
anualmente em mais de 100 países (WHO, 2012; WHO, 2010; WHO, 2009). A febre do dengue,
que é o tipo clássico, pode se manifestar de formas mais severas por meio da dengue
hemorrágica e da síndrome do choque (Gubler, 2002). Essa doença pode ocasionar cerca de 20
mil casos de mortes ao ano (Wyse, 2011). Nas Américas, inclusive no Brasil, durante as décadas
de 50 a 70, a epidemia da dengue passou a ser controlada por meio de campanhas de erradicação
do mosquito A. aegypti. No entanto, logo após 1970 e por negligências de alguns países, o
mosquito voltou a elevar suas taxas populacionais e a representar um risco de saúde pública,
passando a ter, nos trópicos, uma distribuição global (Pinheiro, 1989). Com isso, novos surtos
foram comuns nessas regiões com reinfestações dentro de 3 a 5 anos (WHO, 2009). Assim, a
dengue é caracterizada atualmente por causar epidemias e pandemias nas Américas, África,
Ásia, Europa e Austrália (Monath, 1994; Teixeira, 2005) e ser endêmica em todas as regiões da
Organização Mundial de Saúde (OMS) com exceção daquelas europeias (WHO, 2009).
O Brasil é o país com o maior número de casos da dengue em todo o mundo (Guzman
e Harris, 2015; WHO, 2012). Do total de ocorrências da dengue encontradas em toda América
Latina, 70% é oriundo do Brasil (Siqueira, 2005). E desde 2010 circulam os quatro sorotipos
do vírus da dengue, sendo por isso considerado um país hiperendêmico com registro de mais
de um milhão de relatos da doença (Nogueira e Eppinghaus, 2011). De 2012 para 2013 o Brasil
apresentou oscilações quanto as incidências da dengue por região. O Nordeste, por exemplo,
obteve a maior queda significativa entre as regiões de um ano para o outro, com redução de
44%, já o Centro-Oeste, por sua vez, sofreu o maior aumento (Brito, 2015). Em termos de óbitos
por dengue considerados pela OMS, a região Sul apresentou os menores índices em todos os
anos de 2009 a 2013, em contrapartida o Sudeste exibiu os maiores valores de casos letais
(máxima de 8% em 2010) (Brito, 2015). Apesar dos esforços para combatê-la, a dengue
aumentou sua ocorrência nas últimas três décadas em aproximadamente 30 vezes (WHO, 2012).
7
O fato piora quando se considera que a doença tem avançado para regiões antes consideradas
imunes (CDC, 2010). No Brasil, em 2010 já haviam 1,2 milhões de casos da dengue apontados
(Conass, 2011). Em 2015 (até a semana epidemiológica 30) os registros de casos subiram para
um pouco mais de 1,3 milhões.
De modo geral, enfermidades ocasionadas por agentes etiológicos transmitidos por
mosquitos e pernilongos vetores acarretam também problemas sociais e econômicos (Sachs,
2002). Entre as despesas geradas aos governos estão os custos diretos e indiretos com
hospitalização dos pacientes, mortalidade, morbidade, tempo e perda de capital produtivo.
Estima-se que aproximadamente US $ 2,1 bilhões por ano são direcionados para o controle
apenas da dengue nas Américas (Shepard et al., 2011). Isso faz confirmar a necessidade de
maiores estudos, prevenção e controle de doenças em humanos causadas por arboviroses em
todo o mundo.
2.1.1. Aspectos morfo-fisiológicos
O mosquito A. aegypti Linneau, 1762 (Diptera: Culicinae) possui um desenvolvimento
holometábolo com os estádios de larva e pupa ocorrendo em ambientes aquáticos e o estádio
adulto em ambiente terrestre (Gomes et al., 2006). Em condições ambientais favoráveis, o
desenvolvimento de imaturo para adulto pode durar cerca de 10 dias (Gomes et al., 2006).
Os ovos do A. aegypti, geralmente elípticos ou ovais, podem ser ovipositados pela fêmea
adulta individualmente ou em conjunto (Consoli e Oliveira, 1998), geralmente distribuídos em
locais distantes entre si (Corbet e Chadee, 1993). Esse comportamento de “oviposição aos
saltos” da fêmea parece contribuir para o sucesso reprodutivo e dispersão de A. aegypti, além
de uma diminuição do risco de predação. A oviposição ocorre nas primeiras horas do dia e ao
entardecer (Clements, 1999; Consoli e Oliveira, 1994). À partir de estímulo ambiental
suficiente, as larvas eclodem com aproximadamente 48 horas (Silva Júnior e Pimenta Júnior,
2008). Isso acontece com o auxílio de um dente quitinoso na região chamada de clípeo, que é
responsável por romper a estrutura do ovo (Consoli e Oliveira, 1998).
A fase de ovo é considerada a de maior tolerância da espécie, uma vez que quando seco
pode apresentar uma sobrevivência de até aproximadamente um ano, devido a sua capacidade
de quiescência (Silva e Silva, 1999) e cutícula de cera, que se formam entre doze a treze horas
após a oviposição. Essas características conferem aos ovos uma tolerância às condições físicas
e químicas, como a inseticidas ou cloro (Rezende et al., 2008).
Com a eclosão, as larvas passam pelos estádios L1, L2, L3 e L4, o que dura de 5 a 7
dias, até a formação da pupa. As larvas são caracterizadas por possuírem a cabeça e tórax mais
robustos que o abdômen. Em todo o corpo, de formato vermiforme, há a distribuição de cerdas,
que são importantes órgãos sensoriais que facilitam a flutuação no meio aquático. Esse
comportamento é típico da fase larval, uma vez que nesta fase é necessário se manter na
superfície da água para respirar por meio do sifão e espiráculos (Consoli e Oliveira, 1998). O
nado das larvas geralmente ocorre de forma serpenteada, ou seja, em “S” (Forattini, 2002). As
larvas podem se alimentar de resíduos orgânicos, bactérias, fungos ou algas encontradas na
água, por meio de escovas palatais e do aparelho bucal mastigador.
As pupas geralmente são maiores, porém nadam menos ativamente, do que as larvas,
apresentam um formato de vírgula e não se alimentam durante este período. A fase de pupa
dura em torno de 2 a 3 dias (Consoli e Oliveira, 1998).
As formas aquáticas (ovos, larvas e pupas) são comuns em uma variedade de criadouros
naturais que contenham preferencialmente água limpa e parada (Almeida, 2003; Tauil, 2001).
No entanto, também podem ser encontradas em reservatórios artificiais e domiciliares
(Donalísio e Glasser, 2002; Lozovei, 2001; Maciel-de-Freitas, 2007), como por exemplo:
pneus, caixas d’agua e vasos de plantas (Consoli e Oliveira, 1994; Natal, 2002).
Os adultos de A. aegypti são reconhecidos por sua coloração típica escura acompanhada
de faixas branco-prateadas no tórax e nas pernas (Forattini, 2002; Lozovei, 2001). Os adultos
8
dessa espécie apresentam dimorfismo sexual: os machos possuem antenas plumosas e as fêmeas
possuem antenas filiformes ou monoliformes pilosas.
Os adultos de A. aegypti são altamente adaptados a ambientes antropizados. A
alimentação é baseada em sangue, exclusivamente para as fêmeas após acasalamento, como
também em carboidratos vegetais, néctar ou seiva, tanto para fêmeas quanto para machos (Scott
et al., 1993). Açúcares são importantes aos indivíduos dessa espécie, por serem uma fonte
nutricional que confere maior longevidade e permite energia suficiente para o voo (Tsunoda et
al. 2010). Porém, as fêmeas modificam sua fonte de alimento pela necessidade de formação dos
ovos a partir de proteínas e albumina (Telang e Wells, 2004) encontradas no sangue humano e
de outros mamíferos e aves (Rozendaal, 1997). Em geral, a fêmea se alimenta de mais de um
hospedeiro no mesmo ciclo gonotrófico (Barata et al., 2001; Forattini, 2002; Scott et al., 2002).
2.1.2. Capacidade vetorial
A capacidade vetorial significa o quão fácil um determinado vetor é infectado, consegue
replicar e transmitir um patógeno, como um vírus (Rodhain e Rosen, 1997). O A. aegypti
apresenta grande potencial de se disseminar passivamente por extensas áreas em todo o mundo.
Tal característica torna o A. aegypti um potencial vetor de diferentes doenças tropicais, como
por exemplo: a dengue (Albuquerque et al., 2012), febre amarela, chikungunya (Albuquerque
et al., 2012; Vargas et al., 2010) e a Zika (Caron et al., 2012; Hayes, 2009; Medlock et al.,
2012).
O sucesso vetorial de A. aegypti também é altamente dependente da capacidade que as
fêmeas possuem em localizar seus hospedeiros via correntes de ar, podendo identificar odores,
dióxido de carbono e calor corporais (Forattini, 2002). Aspectos morfofisiológicos, ecológicos
(Kelly e Thompson, 2000), genéticos (Klowden, 1990) e de capacidade de aprendizado (Alonso
e Schuck-Paim, 2006) também podem influenciar diretamente a relação vetor-hospedeiro,
trazendo assim maiores impactos epidemiológicos.
Diversos fatores fisiológicos contribuem para a habilidade intrínseca que o A. aegypti
possui para transmitir um agente etiológico. Por exemplo, este inseto possui um complexo
salivar eficiente para neutralizar o sistema hemostático de seus hospedeiros (Mans, 2011) e que
expressa proteínas juntamente com colágeno salivar e assim aumenta o sucesso do seu repasto
sanguíneo (Chagas et. al 2014).
No entanto, tão importante quanto compreender o potencial vetor do A. aegypti, dada a
sua capacidade epidemiológica, é também entender a origem desse potencial pela sua relação
com o vírus transmitido. O A. aegypti é refratário a infecção aos Flavivirus, desenvolvendo
modificações genéticas que o ajudam no processo de proteção. No entanto, os vírus também
passam por um processo de coevolução difusa, no qual novos artifícios burlam os mecanismos
celulares de defesa anti-virais do mosquito (Amaral e Dansa-Petretski, 2012).
De uma forma geral, a relação vírus-Aedes é bastante íntima, e tanto a virulência quanto
a resistência que envolvem ambas as espécies certamente são dependentes dessa relação
(Amaral e Dansa-Petretski, 2012). Alguns artifícios de tal interação podem estar relacionados
com o mecanismo imune do genoma do mosquito pelo RNAi, que tem a função repressora a
transgenes, como podem ser aqueles oriundos de infecção viral (Amaral e Dansa-Petretski,
2012). Outra estratégia está relacionada a capacidade de adsorção dos vírus por parte das células
do intestino do mosquito (Black iv et al., 2002) ou as barreiras pelas glândulas salivares desses
insetos (Bennett et al., 2002). Porém, uma vez ocorrida a infecção, o A. aegypti poderia estar
sendo “manipulado” pelo vírus da dengue. De acordo com Lima-Camara et al. (2011) e Maciel-
Freitas et al. (2011), mosquitos infectados com vírus da dengue aumentaram a locomoção e o
índice de picada em comparação com o grupo controle (sem o vírus).
Quando a infecção do vetor pelo vírus da dengue ("Dengue Virus"; DENV) ocorre,
inicia-se o período do ciclo patógeno-hospedeiro chamado de extrínseco. Nesse período, o
mosquito ao se alimentar do sangue de algum hospedeiro virulento, passa a adquirir o vírus que
inicialmente se instala em seu intestino e posteriormente em suas glândulas salivares (Mcbride
9
e Bielefeldt-ohmann, 2000). A partir desse momento, torna-se possível a continuidade do ciclo
por meio da infecção de um novo hospedeiro. O A. aegypti tem potencial para infectar, em
média, 300 pessoas ao longo do seu ciclo de vida (Mcbride e Bielefeldt-Ohmann, 2000).
A fase seguinte do ciclo infeccioso, conhecida como intrínseca, ocorre em humanos ou
outros mamíferos. A incubação do vírus na fase extrínseca dura cerca de 8 a 12 dias, sendo a
partir desse período que o vetor se torna virulento ininterruptamente. Já o período de incubação
do vírus na fase intrínseca ocorre de 3 a 15 dias após infecção e o período de virulência ocorre
um dia antes do aparecimento dos primeiros sintomas, se estendendo até o fim da febre, em
geral por volta do 6º dia (Mafra e Lemos, 2009).
De uma maneira geral, a epidemiologia da dengue depende das características próprias
do inseto, porém, o meio em que o inseto vive também possui considerável relevância (Bennett
et al., 2002; Black iv et al., 2002). A ocupação inadequada dos grandes centros urbanos,
associado a sistemas de coleta de lixo e saneamento ineficientes, combinado com a capacidade
de colonização do A. aegypti a diversos ambientes contribuem para uma acelerada distribuição
geográfica do vírus transmitido pelos indivíduos dessa espécie (Kuno, 1995; Tauil, 2002).
Dessa forma, táticas mais eficientes e promissoras de combate à doença são aquelas focadas no
manejo do vetor da doença, o A. aegypti.
2.1.3. Comportamento
O desempenho ótimo das atividades e a sobrevivência de organismos são dependentes
das condições externas nas quais eles se encontram. Desta forma, variações nas condições
externas (por ex.: temperatura, xenobióticos, disponibilidade de recurso, riscos de predação e
competição) podem desencadear modificações consideráveis nas características fisiológicas
e/ou comportamentais. E da mesma forma, podem ser cruciais para a sobrevivência do
indivíduo ou impactar de maneira significativa o seu fitness (Atkinson, 1995; Barrera et al.,
2006; Kingsolver e Huey, 2008; Nijhout et al., 2010; Yanoviak, 2001).
Dessa forma, a capacidade de adaptação e de modificação de hábitos, metabolismo e
comportamentos podem ser fundamentais para a manutenção dos indivíduos em ambientes com
condições sub-ótimas. Um organismo pode, por exemplo, regular as taxas de catabolismo ou
anabolismo dependendo do resultado de seu forrageamento (Padmanabha et al., 2012) ou então
migrar para regiões com condições mais adequadas para sua sobrevivência e sucesso
reprodutivo (Ngoc et al., 2010).
Assim como os demais insetos, o A. aegypti é um animal ectodérmico e também sofre
influência das condições externas para o seu desenvolvimento fisiológico (Aznar et al., 2015),
busca de parceiros sexuais, localização de alimento (Davis, 1994; Farjana e Tuno, 2013) e
oviposição (Chadee, 2012; Day, 2016). Para que o sistema reprodutor da fêmea produza os
ovos, após a alimentação sanguínea, a temperatura torna-se essencial. Em regiões tropicais, a
digestão do sangue pela fêmea leva de dois a três dias, porém, em áreas de clima temperado,
esse processo pode durar mais de uma semana (Clements, 1996).
Os mosquitos do A. aegypti possuem comportamento de busca por hospedeiros e as
respostas sensoriais são ativadas por níveis específicos de gás carbônico do ambiente (Majeed
et al, 2014). Além disso, os adultos possuem a capacidade de lidar com as variações ao longo
do dia e sazonais em relação a essas concentrações atmosféricas (Guerenstein e Hildebrand,
2008). Esses insetos utilizam a luz solar polarizada sobre a lâmina d’água para localizar seus
sítios de oviposição mais adequados (Wellington, 1974).
Essas propriedades fisiológicas e comportamentais estão relacionadas ao meio no qual
o A. aegypti vive e são relevantes principalmente porque estão associadas direta e indiretamente
com o potencial vetor e o ciclo gonotrófico das doenças transmitidas por ele. Porém, tais
habilidades do adulto podem ser mitigadas a depender não apenas dos fatores externos que
envolvem essa fase do ciclo de vida, mas também, fases joviais do mesmo.
10
A natação das larvas do A. aegypti torna-se, portanto, o comportamento principal pelo
qual esses insetos podem explorar adequadamente seu meio em busca de recursos ou condições
mais adequadas (abióticas e de defesa).
Alterações na temperatura e disponibilidade de alimento ofertadas às larvas do A.
aegypti já foi relatado na literatura por reduziram o tamanho das asas em adultos e modificaram
sua alometria (Reiskind e Zarrabi, 2012). Esses fatores também foram suficientes para mudar
o tamanho do corpo de mosquitos (Fajana e et al., 2012). O menor tamanho do corpo desses
insetos, dado a variações na alimentação durante a fase jovial, em laboratório, ocasionou menor
fecundidade (Farjana e Tuno, 2013) e maior busca por hospedeiros (Farjana e Tuno, 2012).
Além disso, ambientes com elevada competição coespecífica de larvas ocasionaram, da mesma
forma, menor massa de fêmeas de A. aegypti emergentes (Barrera et al., 2006).
Portanto, tais alterações nas fases joviais do inseto podem gerar adultos menos
competitivos ou resultar na própria morte do organismo. Em laboratório, estágios imaturos do
A. aegypti e Aedes albopctius, tiveram suas mortalidades aumentadas quando expostos
simultaneamente à temperatura de 35ºC e à elevada taxa nutricional (Farjana et al, 2012). Da
mesma forma, as larvas do A. aegypti na presença do predador Toxorhynchites splendens foram
mais vulneráveis, devido a sua natação mais ativa, e portanto, mais arrisacada, do que as larvas
dos mosquitos A. albopictus e Anopheles sinensis, o que poderia ser justificado pela “hipótese
de sensibilidade a ameaça” (Helfman, 1989; Zuharah et al., 2015).
Porém, ainda é pouco conhecido como inseticidas (seus efeitos subletais) podem alterar
direta ou indiretamente a percepção de tais condições ambientais por parte do A. aegypti e,
consequentemente, seu comportamento, como o de natação de suas larvas, ao ponto de afetar
as habilidades normais ou adaptativas do mesmo frente às variadas condições de seu meio.
Até o momento, sabe-se que os princípios ativos de inseticidas organossintéticos
deltametrina, imidaclopride e spinozinas reduzem os movimentos e natação de larvas de quarto
instar do A. aegypti (Tomé et al., 2014) e que larvas de A. aegypti resistentes a piretróides
apresentam diferentes padrões de comportamento de natação dependendo das concentrações do
inseticida (Marriel et al., 2016).
Contudo, os efeitos subletais de óleos essenciais oriundos de plantas bioinseticidas sobre
a natação (variáveis quantitativas) de larvas de A. aegypti ainda não é conhecido, tão pouco
sobre a alteração desse comportamento em populações de A. aegypti já influenciadas por custos
adaptativos, como, possivelmente, as resistentes.
Portanto, nós investigamos de que forma moléculas bioinseticidas e a deltametrina de
plantas podem alterar a capacidade de locomoção de larvas de A. aegypti susceptíveis e
resistentes a piretróides. Assim, sugerimos como tais xenobióticos podem afetar o
comportamento natural ou adaptativo de natação, e consequentemente, o forrageamento,
proteção, competitividade e fitness do A. aegypti no ambiente.
2.2. Estratégias de controle do A. aegypti
Segundo a OMS mosquitos vetores podem ser controlados por métodos mecânicos,
biológicos, ambientais, químicos, além de genéticos (WHO, 2012). Porém, as principais formas
de combate se baseiam na utilização de inseticidas organossintéticos (Duque et al., 2009;
Guzman et al., 2010), uma vez que a utilização de vacinas possui algumas limitações, como
necessidade de estudos mais conclusivos (Villar et al, 2015).
O uso de inseticidas organossintéticos tem, há algumas décadas, se mostrado ineficiente
para a regulação populacional de vetores como o A. aegypti. A seleção de populações resistentes
têm sido apontada como a principal causa dessa ineficiência (Lima et al., 2011). Dessa forma,
há necessidade de estudos e desenvolvimento de novos inseticidas que apresentem mecanismos
de ação variados e maior eficiência, principalmente a longo prazo.
11
2.2.1. Controle químico
Em termos de saúde pública, a utilização de inseticidas é o tipo de controle mais
corriqueiro para o manejo de populações de insetos vetores de patógenos (Rose, 2001). O
controle da dengue, por exemplo, ainda é estreitamente ligado ao controle do vetor
especialmente por inseticidas organossintéticos (Allan, 2011; Tauil, 2001). Essa tática tornou-
se comum desde o século XX alicerçada pelo desenvolvimento da indústria química da Segunda
Guerra Mundial (Giannini, 2001).
As classes de inseticidas usadas segundo recomendações da OMS para controle de
larvas do A. aegypti são as benzoilureias (diflubenzuron e novaluron), análogos de hormônio
juvenil (piriproxifen), espinosinas, organofosforados e carbamatos (WHO, 2012). Em relação
aos adultos pode-se citar os inseticidas de ação neurotóxica como os organofosforados e
piretróides, à exemplo da deltametrina e cipermetrina (Baldacchino et al., 2015).
No entanto, o uso intensivo e inadequado desses produtos por muitas décadas resultou
em seleção de indivíduos resistentes encontrados no Brasil, Sul da Ásia e América (Carvalho
et al., 2004; Chediak, M. et al., 2016; Polson et al., 2010;). Além disso, alguns desses inseticidas
apresentam instabilidade química com alta toxicidade mesmo em baixas concentrações, como
por exemplo os temefós (Ware, 2000).
As vias de exposição pelas quais os organofosforados atuam é por ingestão e contato
(Becker et al., 2003). Esses inseticidas agem nas sinapses do sistema nervoso e inibem
irreversivelmente a ação da enzima acetilcolinesterase que tem o papel de hidrolisar o
neurotransmissor acetilcolina. Como a atuação da acetilcolisterase é inibida o impulso nervoso
passa a ser contínuo no inseto, o que leva esse à morte por excitação e exaustão (Becker et al.,
2010). Já os piretróides atuam a nível de neurônio e nos canais de sódio do inseto (Hemingway
et al., 2004). Nesse sentido, permitem que tais canais permaneçam abertos, ocorrendo a
despolarização da membrana, e resultando na passagem contínua do impulso nervoso, o que
leva à convulsão e paralisia seguida de morte, mais conhecido como efeito “knockdown”
(Becker et al., 2010).
2.2.1.1. Resistência a inseticidas
Um dos graves entraves para o combate à importantes arboviroses que atingem o homem
é a resistência de populações de insetos vetores, como o A. aegypti (WHO, 2012). A resistência
em populações dessa espécie tem sido relacionada a utilização inadequada de inseticidas
organossintéticos (Ranson et al., 2010; WHO, 2012; Zahran e Abdelgaleil, 2011). O uso
frequente desses produtos gera pressão de seleção considerável sobre indivíduos de uma
população e com isso há a seleção daqueles resistentes a doses que normalmente seriam letais
para a maioria dos indivíduos (Hemingway e Ranson, 2000).
A resistência depende tanto do manejo do produto inseticida, quanto das características
intrínsecas dos organismos-alvo, como por exemplo a variabilidade genética (Hemingway e
Ranson, 2000). Por meio da pressão de seleção há o aumento na frequência de genes
anteriormente raros na população. Essa tendência pode ser verificada mais facilmente, dentro
de um curso evolutivo, em organismos como os insetos, uma vez que esses possuem
características reprodutivas como ciclo de vida curto e número de descendentes elevado.
A resistência pode ocorrer por meio de alterações bioquímicas, fisiológicas ou
comportamentais. No primeiro caso, a resistência é baseada em três possíveis atividades:
aumento da expressão de genes; aumento da atividade de enzimas envolvidas no metabolismo
de xenobióticos; ou mutações em neurorreceptores e em canais de sódio (Martin et al., 2003).
A base molecular dessas atividades pode estar associada a mutações em regiões estruturais dos
genes responsáveis pela codificação de proteínas que são alvo dos inseticidas, resultando em
menores chances de ligação do inseticida no inseto (Hemingway e Ranson, 2000). As principais
proteínas envolvidas nesse tipo de resistência são as monooxigenases dependentes do citocromo
P450, as esterases e as glutationas S-transferases (Ranson, 2002). Em última instância, pode
ocorrer a redução do poder de penetração do pesticida, aumento da capacidade sequestrante de
12
moléculas tóxicas, insensibilidade aos compostos tóxicos e/ou aumento da destoxificação
celular (Casida et al., 1998; Ranson et al., 2002).
Na resistência fisiológica geralmente ocorrem modificações na exocutícula do inseto,
que na maioria das vezes é dependente da presença de determinadas proteínas ou da fase de
vida do mesmo. Além disso, nesse tipo de resistência também pode haver o sequestro de
substâncias tóxicas (Soderlund et al., 2003). Já em relação a resistência comportamental,
considera-se que o inseto é resistente a determinado produto tóxico quando ele possui melhor
capacidade de evita-lo por superior percepção (Yu et al., 2008).
Casos de resistência já foram verificados em populações de A. aegypti em regiões
tropicais e subtropicais de todo o mundo, inclusive em diferentes regiões do Brasil. Nesse
processo, os produtos envolvidos são os principais inseticidas organossintéticos empregados
para controle desse vetor, como o temefós (Braga et al., 2004; Chediak et al., 2016; Polson et
al., 2011) e piretróides (Martins et al., 2009).
Como forma de contornar tal problema, vários produtos químicos e biológicos
alternativos passaram a ser empregados. Assim, um inibidor da síntese de quitina, o
diflubenzuron, pertencente ao grupo das benzoil-fenil-uréias (BPU`s), foi empregado como
substituinte do temefós (Ministério da Saúde, 2010). Outra alternativa, passou a ser a utilização
da bactéria transgênica, Bacillus thuringiensis sorovariedade israelensis (Bti) desde 2001
(Braga e Valle, 2007). Porém, problemas quanto ao uso desses produtos já foram verificados,
seja porque os novos inseticidas organossintéticos recomendados estavam sendo empregados
em campo sem estudos prévios (Braga e Valle, 2007) ou por já terem sido verificados casos de
resistência relativos a utilização deles (Paris et al., 2010; Paul et al., 2005; Rivero et al., 2010).
Dessa forma, existe uma crescente busca por alternativas de controle que sejam mais
eficientes. Entre elas, a utilização de inseticidas botânicos, a base de óleos essenciais ou
moléculas desses, pode representar uma medida promissora ao controle de A. aegypti. Esses
compostos bioativos possuem uma ampla diversidade química e têm a capacidade de agir sobre
variados sítios e mecanismos de ação no inseto (Rattan, 2010). Assim, há maiores chances de
retardo da resistência em populações de A. aegypti submetidas a esses compostos (Isman, 2000).
Associado a esses fatores, tem sido relatado que populações resistentes a determinados
inseticidas, tendem a estar em desvantagem na ausência desses ou quando na presença de outras
moléculas com diferentes mecanismos de ação (Haubruge e Arnaud, 2001; Mckenzie e
Batterham, 1994), ainda que exista a possibilidade de resistência cruzada entre os compostos
referidos (Després et al., 2007). Isso pode ser justificado pelo chamado custo adaptativo e pela
teoria de alocação de recursos.
Nesses processos, indivíduos resistentes possuem menos chances de desenvolver outras
estratégias de resistência (Haubruge e Arnaud 2001; Mckenzie e Batterham, 1994). O aumento
da síntese de enzimas destoxificativas, por exemplo, pode prover energia adicional, resultando
na elevação das taxas metabólicas (maior consumo de O2), o que geralmente ocasiona
desbalanço nas trocas gasosas, e com isso, desvantagens adaptativas aos insetos resistentes por
alterar diversos outros processos fisiológicos (Guedes et al., 2005).
2.2.1.2. Custo adaptativo da resistência O custo adaptativo geralmente está associado à presença de um determinado gene que
pode proporcionar uma vantagem adaptativa ao indivíduo que o possui na presença de uma
determinada condição que seria desfavorável para a maioria da população. Porém, a presença
de tal vantagem, acarreta alterações em alocação e uso de recurso, e pode conferir uma
desvantagem na ausência da condição de pressão de seleção (Coustal et al., 2000; Guedes et
al., 2005). Sob efeito pleiotrópico, a presença do gene pode permitir que o custo para sua
manutenção interfira no metabolismo normal do indivíduo de modo a deixa-lo menos
competitivo que os susceptíveis (Gould, 1998).
Especificamente em A. aegypti resistentes a piretroídes já foi verificada menor taxa de
eclosão de ovos e alterações no ciclo circadíaco de fêmeas, além de diferenças reprodutivas
13
como menor quantidade de ovos ovipositados, e menor competitividade em situação
interespecíca, quando comparado à indivíduos susceptíveis (Brito et al., 2013).
2.2.2. Controle alternativo
Entre os produtos ecologicamente viáveis e eficazes para controle de pragas estão os
óleos essenciais extraídos de plantas medicinais e/ou aromáticas, os quais podem ser usados
para combate a diversos culicídeos (Pavela, 2015). Outras formas de controlar o mosquito A.
aegypti que tem ganhado destaque são as técnicas de manipulação genética (Horn e Wimmer,
2003; Moreira e Ghosh et al., 2002; Speranca e Capurro, 2007). No entanto, nesse caso em
específico, há que se considerar outras questões como custo adaptativo.
Com isso, identificar novas estratégias que reduzam a possibilidade de disseminação e
evolução de quadros de arboviroses na população mundial é essencial. E para tanto, ratifica-se
a carência de ampliação de atividades interdisciplinares que sejam efetivas contra o mosquito
transmissor da dengue (Marshall, 2010).
2.3. Plantas bioativas
2.3.1. Óleos essenciais de plantas
Estudos focados na busca por formas alternativas de controle de pragas vêm recebendo
um forte investimento nos últimos 50 anos a partir dos problemas ocasionados pelas formas
tradicionais de controle químico (Isman e Grieneisen, 2014; Nerio et al., 2010). Com isso, os
recursos naturais passaram a ganhar um novo sentido como potenciais agentes inseticidas. Entre
eles, estão as substâncias obtidas de algumas plantas que possibilitam com segurança e eficácia,
quando manejadas adequadamente, o desenvolvimento de produtos que são viáveis para o
controle de pragas (Knaak e Fiuza, 2010).
Os óleos essenciais (OEs), por exemplo, são substâncias extraídas de plantas medicinais
e/ou aromáticas, sendo definidos como substâncias aromatizantes, voláteis e que podem
apresentar-se isoladas ou misturadas entre si, desterpenadas ou concentradas e retificadas
(ANVISA, 2007). Os OEs são produzidos e armazenados em variados órgãos e estruturas
vegetais, tais como tricomas glandulares, dutos de resina e cavidades secretoras (Fahn, 2000).
Os compostos presentes nos OEs são oriundos do metabolismo secundário de plantas.
Essas substâncias apresentam potencial repelente, atraente e/ou tóxico a insetos, uma vez que
são pertencentes ao mecanismo de defensa química de vegetais em resposta ao ataque de
herbívoros (Aguiar-Menezes, 2005; Simas et al., 2004). Além dessas utilidades, os OEs têm
sido constantemente aproveitados nos mais diversificados setores: medicinal, farmacêutico, de
perfumaria, de cosméticos, de alimentos e de limpeza (Bizzo, 2009; Isman, 2000; Isman, 2011;
Souza et al., 2010).
As propriedades físico-químicas dos OEs se baseiam em alta volatilidade, associado a
baixo peso molecular e uma diversidade elevada de compostos (Alves, 2001; Bakkali et al.,
2008; Souza et al., 2010). A constituição dos OEs é complexa e formada, principalmente, por
hidrocarbonetos como monoterpenos, acompanhados pelos sesquiterpenos, fenilpropanóides,
compostos oxigenados e aromáticos (Nerio et al, 2010). O OE de uma determinada espécie
vegetal pode conter de 20 a 80 constituintes (Regnault-Roger et al., 2012) ou até centenas deles
(Bakkali et al., 2008; Nerio et al., 2010).
A composição química diversificada e em concentrações e interações diferentes assume
papel decisivo sobre a eficácia dos OEs como produtos atraentes ou repelentes (Knaak e Fiuza,
2010), além de dificultar os casos de seleção de indivíduos resistentes dentro de uma população
(Bakkali et al., 2008; Rattan, 2010; Souza et al., 2010; WHO, 2012). Além disso, os OEs podem
ainda ser seletivos a organismos não-alvo, persistirem pouco no ambiente e na cadeia trófica
(Isman, 2006).
Os OEs podem agir em insetos através de algumas rotas bioquímicas específicas e assim
causar alterações que levam os insetos a um quadro de intoxicação, seja ele letal ou sub-letal.
Entre os sítios de ação mais comuns se tem o sistema nervoso (SN) desses organismos, mais
14
especificamente as sinapses, por exemplo. Nesse caso, pode-se citar a atuação de alguns
compostos de OEs como terpinen-4-ol, 1,8-cineol, S-carvona, linalol, fenchona, γ-terpineno e
geraniol agindo sobre a enzima acetilcolinesterase (AChE). Outro sítio de ação no SN podem
ser os canais de cloro-GABA. Nesse caso, compostos de OEs como o timol podem atuar
bloqueando o sinal nervoso entre os neurônios (Priestley et al., 2003).
Embora existam algumas informações sobre os possíveis sítios e mecanismos de ação
de OEs sobre insetos, essa área de estudo ainda é bastante recente e complexa, carecendo de
novas pesquisas. Isso acontece principalmente devido à grande complexidade e interações
químicas entre os constituintes dos óleos essenciais e sua relação com as variadas respostas
biológicas que podem causar nos organismos-alvo (Rattan, 2010).
A composição química de determinados OEs pode variar de planta para planta dentro
de uma mesma espécie, formando assim quimiotipos, e interespecificamente, dependendo não
somente de condições genéticas, mas também ambientais, como por exemplo: os tratos
culturais, forma de cultivo e estocagem dos órgãos vegetais das plantas aromáticas, bem como
a extração, armazenamento e manipulação do OE obtido (Regnault-Roger et al., 2012). Dessa
forma, tal variação química e as interações moleculares tornam a atuação dos OEs e de seus
constituintes sobre insetos bastante complexa e difícil de ser identificada e especificada (Rattan,
2010).
Contudo, de forma mais geral, é possível identificar a toxicidade de OEs por meio de
modificações no comportamento e sobrevivência do inseto. Assim, os OEs podem causar
deterrência, declínio do consumo alimentar, prolongamento de um estádio de vida, deformações
e esterilidade (Costa et al., 2006), deficiência respiratória, diminuição de fecundidade (Attia et
al., 2013) ou em última instância, morte (Costa et al., 2006). Essas alterações são subletais ou
letais e são ambas importantes a nível de controle de insetos pragas, uma vez que o manejo de
insetos prejudiciais é voltado para a população, refletindo na descendência e não
necessariamente no indivíduo (Gallo et al., 2002).
Assim, os OEs configuram-se como um recurso alternativo e podem ser considerados
como uma estratégia fundamental de controle de pragas por contribuir para geração de uma
cadeia produtiva de inseticidas botânicos (Cutler, 1988; Gallo et al., 2002). Os bioinseticidas
são as principais alternativas aos inseticidas organossintéticos, os quais podem apresentar uma
série de efeitos negativos à nível social, ambiental e ainda podem contribuir para casos de
geração de populações de A. aegypti resistentes, como aqueles já verificados na Ásia e América
Latina (Lima et al., 2011; Martins et al., 2009).
No que se refere ao controle de vetores como culicídeos, algumas pesquisas mostraram
o potencial tóxico de compostos oriundos de plantas bioativas. Para o manejo do A. aegypti
vários testes sob condições ambientais controladas comprovaram eficácia de plantas inseticidas
como larvicidas e adulticidas dessa praga (Pavela, 2015).
2.3.2. Óleos essenciais para controle de A. aegypti
O uso inadequado dos inseticidas organossintéticos e a pressão de seleção que esses
inseticidas podem promover nas populações de A. aegypti tem aumentado em cerca de 10 a
15% o interesse de desenvolver e empregar inseticidas botânicos para o controle de A. aegypti
(Isman, 2000). Desta forma, nas últimas décadas os OEs têm sido amplamente investigados
sobre seu potencial larvicida (Isman e Grieneisen, 2014).
De acordo com Pavela (2015), considerando Concentração Letal para matar 50% da
população (CL50) de culicídeos ≤ 100 ppm, as principais famílias de plantas estudadas são, em
ordem de representatividade: Lamiaceae, Cupressaceae, Rutaceae, Apiaceae e Myrtaceae,
sendo seus constituintes mais comuns, o 1,8-cineol, timol, ρ-cimeno, α- e β-pineno, δ-3-careno,
sabineno, limoneno e trans-anetol.
As formas de aplicação de OEs sobre A. aegypti consistem na diluição em solventes,
aplicação tópica e fumigação. Os óleos essenciais podem agir nos insetos por meio de ingestão,
absorção cutânea (Ketoh et al., 2005) e/ou vias respiratórias (Yang et al., 2005).
15
OEs que possuem em sua composição substâncias formadas por um número maior de
ligações duplas serão possivelmente mais capazes de proporcionar toxicidade (Santos et al.,
2010) e poderão ser aplicados topicamente, uma vez que tenderão a ser mais lipofílicos. Simas
e colaboradores (2004) ao estudarem sobre a atividade larvicida de mono- e sesquiterpenos
notaram que monoterpenos eram menos tóxicos a larvas de A. aegypti que os sesquiterpenos,
justamente por lipofilicidade.
Alguns trabalhos têm sido desenvolvidos com o objetivo de comparar a toxicidade de
OEs relacionando-a com a sua estrutura e introdução de determinados grupos químicos. Lima
et al (2014) relatam que a presença de ligações duplas, misturas racêmicas, anéis aromáticos e
ligações conjugadas e exoligações duplas em análogos do composto majoritário rotundifolona
da Mentha x villosa ou ainda a disposição de certas cetonas nesses compostos favoreciam ao
potencial larvicida sobre A. aegypti. Por outro lado, a adição de heteroátomo, hidroxila ou
substituição de ligações duplas por epóxido diminuem a potência larvicida de uma coleção de
monoterpenos sobre A. aegypti (Santos et al., 2011). Essas alterações, embora químicas,
resultam em modificações físicas, como aumento ou diminuição de polaridade, e portanto
modificações na potência larvicida dos OEs.
A alta diversidade de compostos que os óleos essenciais possuem associado as suas
demais características benéficas (ex. evitar a resistência Rattan, 2010), já é um grande
motivador para o desenvolvimento de novos estudos. Os OEs podem tanto ser fontes geradoras
de novas moléculas passíveis de síntese como podem também ser promissores inseticidas
botânicos (Cutler, 1988; Gallo et al., 2002).
Até o momento, nenhum teste foi realizado com plantas da família Aristolochiaceae
sobre o A. aegypti, muito menos que permitisse a comparação quanto ao nível de resistência ou
aptidão entre diferentes populações desse vetor.
2.3.3. Família Aristolochiaceae
A família Aristolochiaceae - aristos, que significa “melhor” e lochios, “expulsão de
placenta” (González, 2004; Stevens et al., 2009) - descrita por Jussieu (1789) é pertencente a
ordem Piperales (Neinhuis et al., 2005) e engloba atualmente quatro gêneros - Aristolochia,
Thottea, Euglypha e Holostylis - distribuídos por áreas tropicais, subtropicais e temperadas
(González, 1990). Tais gêneros enquadram cerca de 600 espécies (WU et al., 2005), sendo que
o gênero mais representativo é o Aristolochia (Barros e Araújo, 2012) com 400 a 500 espécies
(González, 2011). No Brasil existem 90 espécies de Aristolochiaceae e apenas no dominínio da
Floresta Atlântica, 49 (Barros e Araújo, 2012).
Diversas espécies de Aristolochiaceae são encontradas nos variados estados brasileiros
(Lorenzi e Matos, 2002). Em Sergipe, as plantas dessa família são comumente utilizadas para
produção de cachaça (Santos et al., 2013).
As plantas do gênero Aristolochia são caracterizadas pela presença de folhas simples,
alternas e pecioladas; seus ramos são lisos; as flores desse gênero são isoladas, hermafroditas e
zigmorfas; os frutos são do tipo capsular cilíndrico, com sementes achatadas, ventralmente lisas
e dorsalmente verrugosas. Tais plantas são trepadeiras, herbáceas e perenes (Nascimento et al.,
2010).
As espécies do gênero Aristolochia são utilizadas com maior incidência na Ásia e
América, representando metade e um terço da utilização total dessas espécies, respectivamente
(Heinrich et al., 2009). Tais espécies estão distribuídas principalmente nas Américas do Norte
e Sul, Ásia e África (Nascimento et al., 2010; Wu et al., 2005). A maior parte do uso de espécies
de Aristolochia é voltada para o tratamento de problemas relativos a distúrbios gastrointestinais,
com destaque para diarreias (Heinrich et al., 2009). Outras aplicações recorrentes remetem-se
ao uso dessas espécies para picadas de animais venenosos e pacientes com problemas
ginecológicos, ou ainda para tratamento de malária (Neuwinger, 2000; Wiart, 2000),
leishmaniose, asma, e como composto abortivo (Messiano et al., 2008).
16
Tais atividades são descritas associadas aos constituintes de óleos essenciais e extratos
das plantas desse gênero, entre eles, flavonóides, benzenóides, terpenóides, éter dimetil e
lignanas (Wu et al., 2005), ou ainda devido aos compostos nitrogenados, aristoloquinas e ácidos
aristolóquios. Em um levantamento realizado por Heinrich (2009), 32 espécies dentre as 99 do
gênero Aristolochia estudadas apresentavam ácidos aristolóquicos.
Entretanto, a presença de ácidos aristolóquicos, predominantemente o I e II (Zhou et al.,
2004), é crucial para o desenvolvimento de uma série de complicações médicas (principalmente
renais) por serem carcinogênicos e nefrotóxicos (Ioset et al., 2002). Provavelmente, esses
ácidos estariam se ligando a proteínas celulares e DNA devido a redução do grupo nitro pelo
citocromo P450 e, assim, gerando toxidez em humanos (Ioset et al., 2002).
Constituintes do metabolismo secundário de espécies do gênero Aristolochia já
mostraram bioatividade sobre bactérias e fungos (Heinrich et al., 2009). Quanto ao potencial
inseticida, os OEs de A. baetica foram letais ou afetaram o desenvolvimento do ciclo biológico
normal e a produção da enzima α-amilase da espécie praga de grãos armazenados Tribolium
castaneum (Jbilou et al., 2008). Além disso, extratos da planta A. argentina Gris. apresentaram
atividade significativa sobre Sitophilus oryzae (Broussalis et al., 1999). As lagartas curuquerê
oriental Spodoptera litura e a lagarta-da-soja Anticarsia germatalis também foram susceptíveis
a A. tagala (Baskar et al., 2011) e A. malmeana (Messiano et al., 2008), respectivamente. Da
mesma forma, as atividades de A.aff. orbicularis tiveram efeito repelente para Sitophilus
zeamais (Rauscher et al., 2001).
2.3.3.1. Aristolochia trilobata
A. trilobata podem ser popularmente conhecidas como mil-homens ou milone, jarrinha,
jiboinha, papo-de-peru, dentre outros nomes (Lorenzi e Matos, 2009). A planta A. aristolochia
ocorre naturalmente em terrenos sombrios e ligeiramente úmidos de margens de matas e rios.
Outros ambientes comuns são florestas ombrófilas, mangues, região com dunas e zonas de
restinga (Nascimento et al., 2010). Aristolochia trilobata é encontrada naturalmente nas
Américas Central e do Sul (Heinrich et al., 2009).
Os constituintes da A. trilobata possuem uso distribuído por todo o mundo. Metabólitos
secundários de raízes, tubérculos e folhas da planta aromática A. trilobata são habitualmente
empregados como compostos medicamentosos, agindo como antinflamatórios (Mors et al.,
2000; Ruffa et al., 2002; Wu et al., 2004) e analgésicas (Honychurch, 1986; Lans, 2007) e para
o combate da atividade de fosfolipases encontrados em venenos de cobra (Honychurch, 1986;
Wu et al., 2004). A atividade biológica da planta A. trilobata já foi testada para algumas
bactérias como Escherichia coli e Staphylococcus aureus (Camporese et al., 2003) e há relatos
contra fungos (Fenner et al., 2006).
No que se refere ao controle de insetos, A. trilobata e seus compostos majoritários
isolados demonstraram atividade rápida e eficiente sobre formigas cortadeiras Atta sexdens e
Acromyrmex balzani. As misturas binárias dos compostos majoritários do óleo essencial de A.
trilobata agiram nas espécies de formiga de forma sinérgica e aditiva (Oliveira, 2014). Aqui,
analisamos se o óleo essencial de A. trilobata pode ser eficaz para o controle de A. aegypti
devido ao seu elevado potencial bioativo.
17
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29
4. ARTIGO
ALTERNATIVA AO CONTROLE DE Aedes aegypti RESISTENTE A PIRETRÓIDES:
EFEITOS KNOCKDOWN E SUBLETAIS DE MONOTERPENOS BIOINSETICIDAS
Periódico a ser submetido: Plos One
RESUMO
O mosquito Aedes aegypti é alvo de intenso controle por ser vetor de vírus que causam várias
doenças, principalmente em regiões tropicais. Devido ao uso indiscriminado de inseticidas,
populações provenientes de diferentes regiões têm apresentado resistência a piretróides. Neste
estudo, analisamos os efeitos letais e subletais do óleo essencial (OE) de Aristolochia trilobata
e seus compostos majoritários sobre A. aegypti. Bioensaios foram conduzidos utilizando-se
larvas e fêmeas adultas de uma população susceptível e uma resistente a piretróides. Nossos
resultados mostraram que a toxicidade e alterações comportamentais dos diferentes compostos
são dependentes da fase do ciclo de vida dos insetos. O monoterpeno ρ-cimeno causou alta
mortalidade tanto em larvas como em fêmeas adultas de A. aegypti, inclusive daqueles
provenientes da população resistente a piretróides. Os monoterpenos limoneno e linalol
acarretaram efeitos subletais nas larvas causando mudanças no padrão de natação, o que pode
resultar em diminuição do fitness e maior vulnerabilidade a diferentes fatores de stress sob
condições naturais. Desta forma, este estudo ressalta o potencial de utilização do OE de A.
trilobata, ρ-cimeno e limoneno para o controle de A. aegypti e revela a importância de se
analisar os efeitos subletais para a dinâmica populacional do mosquito A. aegypti.
Palavras-chave: Aristolochia trilobata, efeito subletal, óleo essencial de planta, ρ-cimeno,
toxicidade.
30
ABSTRACT
Alternative to control of Aedes aegypti resistant to pyrethroid: knockdown and subletal
effects of bioinseticid monoterpens
The Aedes aegypti mosquito is intensely controlled because it is a vector of viruses that cause
innumerous diseases, especially in tropical regions. Due to the indiscriminate use of
insecticides, populations from different regions have been resistant to pyrethroids. In this study,
we analyzed the lethal and sublethal effects of Aristolochia trilobata essential oil (OE) and its
major compounds on A. aegypti. Bioassays were conducted using larvae and adult females from
a susceptible and a pyrethroid resistant population. Our results showed that the toxicity and
behavioral changes to different compounds are dependent on the insect life cycle phase. The
monoterpene p-cymene caused high mortality in both larvae and adult A. aegypti females,
including those from the pyrethroid resistant population. The monoterpenes limonene and
linalool caused a sublethal effect in the larvae causing changes in the swimming pattern, which
can decrease fitness and increase vulnerability to different stressors under natural conditions.
Thus, this study highlights the potential of A. trilobata OE, p-cymene and limonene for the
control of A. aegypti and reveals the importance of analyzing the sublethal effects for the
population dynamics of the A. aegypti mosquito.
Key words: Aristolochia trilobata, sublethal effect, plant essential oil, p-cymene, toxicity.
31
4.1. Introdução
Os insetos são os principais vetores de patógenos nas regiões tropicais, causando
doenças graves que resultam em elevada mortalidade e gastos econômicos [1,2]. O mosquito
Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) é considerado o mais importante vetor de doenças virais
para o homem, incluindo a dengue, febre amarela urbana, Zika e Chicungunya [3–6]. Nas
últimas décadas, o controle de A. aegypti tem sido feito basicamente por meio de inseticidas
[7,8], principalmente piretróides [9], os quais representam hoje a classe de inseticida mais
utilizada por área [10]. No entanto, populações de A. aegypti em diversas regiões do mundo,
têm apresentado resistência a este grupo de inseticidas, limitando ainda mais seu controle [11–
13].
Estudos têm relatado a ocorrência de custos associados à resistência, com consequente
redução do fitness dos indivíduos resistentes em ambiente livre do fator de seleção ou quando
expostos a outros tipos de moléculas bioativas [14,15]. Neste sentido, uma alternativa ao
controle de populações resistentes de A. aegypti é a utilização de misturas complexas de
compostos bioativos que apresentem diferentes mecanismos e sítios de ação de inseticidas,
como é o caso dos OEs de plantas [16–20]. De fato, alguns estudos têm demonstrado que
populações de A. aegypti, incluindo aquelas resistentes, podem ser controladas por meio desses
produtos [21,22]. Além da eficiência desses bioinseticidas, o uso desses compostos pode ainda
apresentar outras características vantajosas, como por exemplo, seletividade aos organismos
não-alvo, baixo poder residual e demanda de mais tempo para seleção de resistência devido à
sua complexidade de compostos [16,23]. Contudo, os efeitos subletais dos bioinseticidas nas
diferentes fases do ciclo de vida de A. aegypti resistentes a piretróides ainda é pouco conhecido.
A seleção de resistência aos inseticidas pode interferir em características da história de
vida dos organismos, culminando em trade-offs ecológicos [24]. Assim, é importante que a
seleção de novas moléculas para controle de insetos resistentes seja fundamentada não apenas
nos efeitos letais em si, mas também na análise dos efeitos subletais em diferentes fases do ciclo
de vida dos indivíduos. Tais efeitos podem desencadear mudanças comportamentais que
resultem em alteração do fitness desses indivíduos quando sujeitos a diferentes pressões bióticas
e abióticas em situações naturais.
Aqui, avaliamos os efeitos letais e subletais do OE de Aristolochia trilobata e dos seus
componentes majoritários, sobre populações resistente e susceptível de A. aegypti. A
mortalidade de larvas e adultos e o comportamento de natação das larvas foram analisados em
indivíduos tratados com os bioinseticidas e do piretróide deltametrina. A compreensão dos
níveis de toxicidade e dos efeitos subletais dos bioinseticidas (alterações comportamentais),
principalmente para populações resistentes, pode fornecer informações que permitam um
controle mais eficiente deste vetor.
4.2. Material e Métodos
4.2.1. Populações de A. aegypti estudadas
Populações de A. aegypti utilizadas nos experimentos (N=2) foram provenientes do
município de Campos dos Goytacazes (cepa PPCampos - população susceptível a piretróides)
e do Instituto Oswaldo Cruz (geração F2 Oiapoque - população resistente a piretróides) -
município do Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
As populações foram criadas de acordo com metodologia descrita por Marriel et al.
(2016). As larvas das populações de A. aegypti foram mantidas, isoladamente, em bandejas
plásticas (6 L) contendo 5 L de água (livre de cloro) e foram alimentadas com ração animal
(Fed: Reptolife, Alcon Pet, Camburuí, SC, Brasil e DoCat Carne: Nutriane Alimentos LTDA,
Viana, ES, Brasil). Os adultos foram acondicionados, separadamente por população, em gaiolas
de plástico (20 cm de altura x 18 cm de ϕ) recobertas por organza. Solução de sacarose
embebida em algodão foi oferecida diariamente para alimentação. Os insetos foram mantidos
32
sob condições de temperatura, umidade e fotoperíodo controlados (26 ± 2oC, 60 ± 2% e 12:12
L).
4.2.2.Obtenção dos bioinseticidas e do piretróide
O OE foi extraído dos caules de plantas de A. trilobata coletadas em área de manguezal,
no município de Pirambu, Sergipe, Brasil (10o40’42”S, 36o52’25”W). A média anual de
temperatura e precipitação pluviométrica da região é de 26o C e 1.650 mm, respectivamente,
com período chuvoso de março a agosto [26]. O material coletado foi seco em estufa à 60 ± 1oC
por 4 dias [27]. Em seguida, o OE foi obtido por meio de hidrodestilação em aparelho do tipo
Clevenger [28] e foi separado da fase aquosa, sendo armazenado em frasco âmbar, sob
temperatura de -4oC.
A análise dos componentes do OE foi realizada por CG/EM/DIC (GCMSQP2010 Ultra,
Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão) equipado com um injetor automático AOC-20i
(Shimadzu). As separações foram realizadas em uma coluna capilar de sílica fundida Rtx®-
5MS Restek (5%-difenil-95%-dimetilpolisiloxano) com 30 m x 0,25 mm de diâmetro interno,
0,25 mm de espessura de filme, em um fluxo constante de Hélio 5.0 com taxa de 1,0 ml min-
1.A temperatura de injeção foi de 280 °C, 1,0 μL (10 mg ml-1) de amostra e foi injetado, com
uma razão de split de 1:30. A programação de temperatura do forno iniciou-se a partir de 50 °C
(isoterma durante 1,5 min), com um aumento de 4 °C min-1, até 200 °C, em seguida, a 10 °C
min-1 até 300 °C, permanecendo por 5 min. Para o CG/EM as moléculas foram ionizadas por
ionização por elétrons com energia de 70 eV. Os fragmentos foram analisados por um sistema
quadrupolar programado para filtrar fragmentos/íons com m/z na ordem de 40 a 500 Da e
detectados por um multiplicador de elétrons. O método de ionização para o CG/DIC foi
realizado pela chama proveniente dos gases hidrogênio 5.0 (30 ml min-1) e ar sintético (300 ml
min-1). As espécies coletadas e a corrente elétrica gerada foram amplificadas e processadas. O
dados foram processados no software CG PostrunAnalysis (Labsolutions- Shimadzu).
A identificação dos constituintes foi realizada com base na comparação dos índices de
retenção da literatura [29]. Para tanto, foi utilizada a equação de Van den Dool e Kratz (1963)
[30] em relação a uma série homóloga de n-alcanos (nC9- nC18). Também foram usadas três
bibliotecas do equipamento (WILEY8, NIST107 e NIST21), as quais permitiram a comparação
dos dados dos espectros com aqueles constantes das bibliotecas, por meio de um índice de
similaridade de 80%.
Foram considerados como majoritários, os compostos do OE de A. trilobata que
apresentaram proporções acima de 6% da composição química total: ρ-cimeno, limoneno,
linalol e acetato de sulcatila (ver Fig. 1). Estes compostos foram adquiridos através de padrões
comercializados pela empresa Sigma-Aldrich® (Steinheim, Germany), com exceção do acetato
de sulcatila que foi sintetizado por meio da redução química do composto 6-metil-5-hepten-2-
ona (sulcatona, 500 mg, 3,97 mmol, Sigma Aldrich®) (Fig. 2). Para isso, a sulcatona foi
solubilizada em 10 ml de metanol com adição de NaBH4 (160 mg, 3,97 mmol). A mistura foi
mantida sob agitação magnética à temperatura ambiente por uma hora. A reação foi
interrompida com adição de 1 ml de água destilada. A extração do produto obtido [(±)-6-metil-
5-hepten-2-ol 2 (sulcatol)] foi realizada com acetato de etila (20 ml), o qual foi removido por
rotaevaporação. O sulcatol, por sua vez, foi completamente seco com N2 com rendimento de
98% (500 mg, 3,91 mmol) e, posteriormente, tratado com piridina (1 ml) e anidrido acético (1
ml) por 24 horas, à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados à mistura reacional
4 ml de HCl 10% e então extraído, com acetato de etila (20 ml), o 2-acetil 6-metil-5-hepteno
(acetato de sulcatila). O solvente foi removido por rotaevaporação. O acetato de sulcatila foi
completamente seco com N2 e apresentou rendimento de 83% (550mg, 3,24mmol).
O piretróides deltametrina (K-othrine 25 CE, 25 g i.a./L, concentrado emulsionável,
Bayer S.A.®, Estrada da Boa Esperança, Belford Roxo, Rio de Janeiro, Brasil) foi obtido
comercialmente.
33
4.2.3. Bioensaios
Os bioensaios de toxicidade foram conduzidos inicialmente para determinar as curvas
de concentração e dose-mortalidade para larvas e adultos da população susceptível, usando: i)
OE de A. trilobata; e seus compostos majoritários, ii) ρ-cimeno, iii) limoneno, iv) linalol e v)
acetato de sulcatila; vi) piretróide deltametrina. O controle foi feito usando tensoativo ou
solvente. As CL90 (larvas) e DL90 (fêmeas adultas), obtidas para a população susceptível, foram
então utilizadas para avaliar a toxicidade destes compostos sobre a população resistente. O
tempo letal foi estimado para ambas as populações, considerando-se apenas os compostos que
mostraram toxicidade para larvas e adultos da população resistente. Posteriormente, bioensaios
comportamentais foram feitos a fim de avaliar os efeitos subletais de todos os tratamentos sobre
ambas as populações.
Em todos os casos, nos bioensaios para larvas de A. aegypti, os tratamentos OE de A.
trilobata e seus compostos majoritários foram diluídos em água destilada com o tensoativo
dimetilsulfóxido à 0,2% (ppm). Já nos bioensaios com adultos, as diluições destes tratamentos
foram feitas em acetona (µg/ mg do inseto). Testes preliminares realizados com indivíduos de
A. aegypti mostraram que o tensoativo dimetilsulfóxido não altera o comportamento normal de
natação das larvas (3º instar - L3) e que a acetona não afeta a sobrevivência das fêmeas adultas
do A. aegypti.
Todos os experimentos foram realizados conforme as recomendações da Organização
Mundial de Saúde [11,31,32].
4.2.3.1.Toxicidade
Os bioensaios de toxicidade para obter as curvas de concentração e dose-mortalidade
foram realizados com larvas (L3) e fêmeas adultas da população susceptível a piretróides.
As larvas foram expostas aos tratamentos por contato e ingestão, em solução aquosa.
Cada unidade amostral consistiu em 10 larvas de A. aegypti em 100 ml de solução do
tratamento, acondicionados em pote plástico de 140 ml fechado. Foram feitas oito repetições
por tratamento x população. Já os adultos foram expostos aos tratamentos por contato. Nesse
caso, cada unidade experimental consistiu em dez fêmeas de A. aegypti tratadas, acondicionadas
em pote de plástico coberto por organza e tampa perfurada (3 cm ϕ). Os tratamentos foram
aplicados (0,5 µL) na região torácica dos mosquitos, com o auxílio de microseringa de 10 μL
(Hamilton, Reno, NV, USA). Para a aplicação, as fêmeas foram previamente sedadas com CO2
e manipuladas sobre mesa de gelo seco à 4o C. Foram feitas quatro repetições por tratamento x
população.
Posteriormente, bioensaios com a mesma metodologia foram feitos para larvas e adultos
da população resistente a piretróides, à exceção de que tais insetos foram expostos a todos os
tratamentos utilizando-se apenas as concentrações e doses necessárias para matar 90% dos
indivíduos da população susceptível (ver Tabela 2).
Em todos os casos, as avaliações de mortalidade foram feitas após 48 h de exposição
dos insetos aos tratamentos.
4.2.3.2. Tempo letal
Os bioensaios foram conduzidos avaliando a mortalidade dos insetos, de ambas as
populações, para determinação das curvas de sobrevivência e do tempo letal (TL). Neste caso,
foram utilizados apenas os tratamentos que mostraram toxicidade tanto para larvas quanto para
fêmeas adultas da população resistente: CL90 e DL90 da deltametrina e ρ-cimeno (ver Tabela 2).
O experimento foi conduzido de acordo com a metodologia adotada nos bioensaios de
toxicidade. Foram feitas dez repetições para cada tratamento x população. A mortalidade das
larvas foi avaliada a cada: 10 min na primeira hora, 30 min de 1 h até 30 h, 120 min de 30 h até
54 h, 360 min de 54 h até 78 h e 720 min de 78 h até o final do experimento, quando das pupas
emergiram os adultos. A mortalidade das fêmeas adultas foi avaliada a cada: 5 min na primeira
hora, 10 min de 1 h até 2 h, 15 min de 2 h até 3 h, 30 min de 3 h até 6 h, 60 min de 6 h até 12
34
h, 120 min de 6 h até 24 h, 240 min 24 até 48 h, 360 min de 48 h até 72 h e 720 min de 72 h até
o final do experimento, quando a mortalidade do controle atingiu 20%.
4.2.3.3. Comportamento de natação de larvas
Os bioensaios foram realizados para verificar o efeito dos tratamentos e do tempo de
exposição sobre o comportamento de natação das larvas, de ambas as populações,
considerando: (i) o deslocamento, (ii) a velocidade, (iii) a sinuosidade do trajeto percorrido
(meandro), (iv) a mudança de orientação (velocidade angular) e (v) o tempo de
repouso/movimentação das larvas.
Os experimentos foram realizados em placa de Petri (9 cm ϕ x 1,5 cm altura) contendo
20 ml de solução com os tratamentos diluídos nas CL20 determinadas para larvas susceptíveis
a piretróides. Em cada placa foi acondicionada uma única larva, que foi filmada por 10 min,
utilizando uma câmera de vídeo (Panasonic SD5 Superdynamic - modelo WV-CP504 - lente
Spacecom 1/3” 3-8 mm) acoplada a um computador. As filmagens foram realizadas
imediatamente após a exposição e 48 h após a exposição das larvas aos tratamentos. As análises
dos comportamentos foram realizadas por meio do software Ethovision XT (versão 8.5; Noldus
Integration System, Sterling, VA) e Studio 9 (Pinnacle Systems, moutain View, CA). Foram
feitas 25 repetições por população, considerando-se cada tratamento e tempo de avaliação.
4.2.4. Análises estatísticas
Análises de Próbit foram realizadas para obtenção das curvas concentração- e dose-
mortalidade para larvas e fêmeas adultas de A. aegypti susceptíveis a piretróides. Foram aceitas
as curvas cuja probabilidade de aceitação da hipótese de nulidade pelo teste χ2 fosse maior que
0,05, usando o software SAS (PROC PROBIT; SAS, 2011) [33] . As CLs e DLs estimadas por
meio dessas curvas foram comparados pelo critério da não-sobreposição dos intervalos de
confiança (IC95) com a origem do intervalo.
Os valores de mortalidade de larvas e fêmeas adultas resistentes a piretróides foram
submetidos a análise de variância (ANOVA) e comparados pelo teste de Tukey ao nível de 5%
de probabilidade, usando o software SAS (PROC GLM, com Tukey; SAS, 2011) [33] .
Para cada combinação de tratamento x população x estádio de desenvolvimento foram
obtidas curvas de sobrevivência utilizando-se estimadores de Kaplan-Meier, no programa
SigmaPlot 11.0. Por meio destas curvas foi possível estimar os tempos necessários para causar
mortalidade de 50% dos indivíduos de cada população (TL50). As curvas de sobrevivência
foram comparadas par a par pelo método Holm-Sidak, no programa SigmaPlot 11.0.
Nos bioensaios de comportamento de natação das larvas, inicialmente foi analisado o
comportamento das duas populações na ausência de tratamentos (controle) nos dois tempos de
exposição por meio de análise de variância multivariada (PROC GLM, com MANOVA; SAS)
afim de verificar possíveis diferenças intrínsecas das populações. Em seguida os dados de
comportamento de natação das larvas expostas ao controle e aos tratamentos também foram
analisados por meio de análise de variância multivariada (PROC GLM, com MANOVA; SAS).
Análises de variância univariada (ANOVA) (para cada população e tempo de exposição)
foram realizadas individualmente para os parâmetros: deslocamento, velocidade, meandro,
velocidade angular e movimentação em função dos tratamentos. Posteriormente, os dados
foram analisados pelo teste de Dunnett para comparação das médias dos controles com as
médias dos tratamentos (PROC GLM, com Dunnett; SAS).
4.3. Resultados
4.3.1. Caracterização química do OE
Foram identificados e quantificados 25 compostos no OE de A. trilobata, os quais
representaram 98,72% da composição total. Os compostos em maiores proporções foram os
monoterpenos: acetato de sulcatila (25,64%), limoneno (24,80%), ρ-cimeno (10,41%) e linalol
35
(9,51%). Os demais constituintes representaram menos do que 5,3% da composição do OE de
A. trilobata (Tabela 1).
4.3.2. Bioensaios
4.3.2.1. Toxicidade
Para as larvas da população susceptível de A. aegypti, a concentração necessária dos
compostos para matar 50% dos indivíduos variou de 3,3 x 10-5 a 238,80 ppm (Tabela 2). O
inseticida deltametrina foi mais tóxico para as larvas do que o OE de A. trilobata e seus
compostos majoritários. Dentre os bioinseticidas, a maior toxicidade foi observada para o
limoneno, seguido pelo ρ-cimeno, OE de A. trilobata e linalol. O acetato de sulcatila não causou
mortalidade dos indivíduos mesmo quando aplicado na dose máxima testada (600 ppm). Este
padrão se manteve para a CL90 (Tabela 2).
Já para as fêmeas adultas da população susceptível, a deltametrina continuou sendo o
composto mais tóxico, apresentando DL50 de 3,2 x 10-8 ppm. Dentre os bioinseticidas, a DL50
variou de 12,25 a 32,81 ppm, apresentando um padrão de toxicidade distinto do observado para
as larvas: o OE de A. trilobata foi o composto mais tóxico, seguido pelo linalol, acetato de
sulcatila, limoneno e ρ-cimeno (Tabela 3).
Por outro lado, a mortalidade de larvas e fêmeas adultas da população resistente tratada
com a deltametrina (CL90 e DL90, respectivamente) não diferiu do controle, conforme esperado.
O mesmo resultado foi observado com o composto linalol (Fig. 3). No entanto, larvas e fêmeas
adultas da população resistente apresentaram elevada mortalidade (≈ 100%) quando tratados
com o composto ρ-cimeno. Mortalidade semelhante foi observada para fêmeas adultas tratadas
com limoneno. Por sua vez, o OE de A. trilobata e o acetato de sulcatila resultaram na
mortalidade de cerca de 50-60% das fêmeas adultas, porém não tiveram nenhum efeito na
mortalidade de larvas (Fig. 3).
4.3.2.2. Tempo letal
A sobrevivência das populações susceptíveis de A. aegypti expostas à deltametrina e ao
ρ-cimeno foi significativamente reduzida ao longo do tempo (larva/pupa: teste de Log-rank: 2
= 260,97; gl = 2, P < 0,001 e fêmeas adultas: teste de Log-rank: 2 = 223,50; gl = 2, P < 0,001)
(Fig. 4 A, C). As larvas desta população mostraram uma rápida redução da sobrevivência
quando expostas à deltametrina (TL50 = 0,24 h) e ao ρ-cimeno (TL50 = 0,55h), diferindo
significativamente do controle. Em menos de 10 h todos os indivíduos morreram (Fig. 4 A). As
fêmeas adultas desta mesma população, tiveram sua sobrevivência reduzida mais rapidamente
pelo ρ-cimeno (TL50 = 0,08 h) do que pela deltametrina (TL50 = 57,9 h) e o controle. Todas as
fêmeas adultas expostas ao ρ-cimeno morrem instantaneamente. Por outro lado, 34% das
fêmeas adultas expostas à deltametrina sobreviveram até o final do experimento (Fig. 4 C).
Da mesma forma, a sobrevivência das populações resistentes de A. aegypti expostas à
deltametrina e ao ρ-cimeno foi significativamente reduzida ao longo do tempo (larva/pupa: teste
de Log-rank: 2 = 394,35; gl = 2, P < 0,001 e fêmeas adultas: teste de Log-rank: 2 = 127,29;
gl = 2, P < 0,001) (Fig. 4 B, D). Nesta população, conforme esperado, em ambas as fases do
ciclo de vida (larva-pupa e fêmeas adultas), o tempo letal observado para matar 50% dos
indivíduos não diferiu (P < 0,05) entre o tratamento deltametrina e o controle. Por outro lado,
o ρ-cimeno mostrou rápido potencial para redução da sobrevivência da população, com tempo
letal de 9,54 h e 0,08 h para larva-pupa e fêmeas adultas, respectivamente (Fig. 4B, D). Todas
as fêmeas adultas expostas ao ρ-cimeno morrem instantaneamente (Fig. 4 D). E 4% das
larvas/pupas expostas a este composto sobreviveram até o final do experimento (Fig. 4 B).
4.3.1.3. Comportamento de natação das larvas
O comportamento de natação intrínseco (controle) das larvas das populações susceptível
e resistente a piretróides avaliados imediatamente ou após 48 h de natação diferiu entre as
36
populações (imediatamente: Wilks’ lambda = 0,532; F = 7,73; glnum/den = 5/44; p < 0,001 e
48 h de natação: Wilks’ lambda = 0,758; F = 19,27; glnum/den = 5/44; p < 0,001) quando
submetidos à análise de variância multivariada.
Da mesma forma, os tratamentos modificaram o comportamento de natação de larvas
da população susceptível (Wilks’ lambda = 0,232; F = 20,38; glnum/den = 25/1056; p < 0,001)
e resistente (Wilks’ lambda = 0,510; F = 8,41; glnum/den = 25/1056; p < 0,001) quando
submetidos à análise de variância multivariada.
4.3.2.3.1. Deslocamento e velocidade
Houve diferenças significativas no deslocamento e na velocidade das larvas susceptíveis
(F5;288 = 26,92; p < 0,001 e F5;288 = 26,92; p < 0,001) e resistentes (F5;288 = 15,35; p < 0,001 e
F5;288 = 19,30; p < 0,001) expostas aos tratamentos. Trilhas representativas do deslocamento
das duas populações expostas aos tratamentos estão apresentadas na Fig. 5.
De forma geral, nos casos em que houve efeito significativo dos tratamentos, estes
causaram redução do deslocamento e da velocidade das larvas em relação ao controle (Fig. 6).
A taxa de deslocamento dos indivíduos da população susceptível, em ambos tempos de
exposição, foi significativamente reduzida quando expostos a todos os tratamentos, com
exceção da deltametrina que não diferiu do controle (Fig. 6 A). Já a população resistente, teve
seu deslocamento afetado por diferentes compostos dependendo do tempo de exposição.
Imediatamente após o contato, a deltametrina, ρ-cimeno e o limoneno reduziram o
deslocamento dos indivíduos. No entanto, após 48 h de exposição das larvas, este efeito foi
observado para o p-cimento, limoneno e linalol (Fig. 6 B).
A velocidade de deslocamento (Fig. 6 C,D) seguiu praticamente o mesmo padrão
descrito acima. Para a população susceptível, a exceção foi que o ρ-cimeno não teve efeito
imediatamente após o contato e o limoneno não teve efeito após 48 h de exposição. A
deltametrina aumentou a velocidade de natação imediatamente após o contato (Fig. 6 C). Já
para a população resistente, a única exceção foi que o ρ-cimeno não alterou a velocidade das
larvas resistentes após 48 h de exposição (Fig. 6 D).
4.3.2.3.2. Orientação das larvas
Houve diferenças significativas nos meandros e na velocidade angular das larvas
susceptíveis (F5;288 = 4,16; p < 0,001 e F5;288 = 5,08; p < 0,001) e resistentes (F5;288 = 5,24; p <
0,001 e F5;288 = 5,08; p < 0,001) expostas aos tratamentos.
Nos casos em que houve efeito significativo dos tratamentos, de uma forma geral, estes
causaram aumento na desorientação (aumento de meandros e da velocidade angular) das larvas
durante a natação quando comparados ao controle (Fig. 7). Larvas da população susceptível
realizaram mais meandros e maior velocidade angular de nado quando foram imediatamente
expostas ao linalol (Fig. 7 A,C). Após 48h de exposição das larvas, o OE de A. trilobata também
aumentou a velocidade angular das larvas desta população (Fig. 7 C).
Já a população resistente, apresentou mais meandros e velocidade angular
imediatamente quando expostas ao ρ-cimeno e limoneno (Fig. 7 B,D). Após 48 h de exposição
das larvas, os meandros também foram aumentados quando expostos ao linalol (Fig. 7 B).
4.3.2.3.3. Atividade larval
Houve diferenças significativas no tempo que as larvas susceptíveis (F5;288 = 8,07; p <
0,001) e resistentes (F5;288 = 10,41; p < 0,001) ficaram imóveis quando expostas aos
tratamentos.
Larvas da população susceptível tratadas com linalol, em ambos os tempos de
exposição, permaneceram por mais tempo imóveis do que aquelas do tratamento controle (Fig.
8 A,B).
Por outro lado, as larvas da população resistente quando imediatamente tratadas com
deltametrina, p-cimento e limoneno permaneceram maior proporção do tempo imóveis do que
37
as larvas do controle (Fig. 8 C). Após 48h de exposição, as larvas desta população
permaneceram mais tempo imóveis quando tratadas com deltametrina, limoneno e linalol, do
que as larvas do controle (Fig. 8 D).
4.4. Discussão
A seleção de resistência de A. aegypti a inseticidas, principalmente nas regiões tropicais,
tem representado um enorme obstáculo ao controle deste importante vetor de doenças. Nossos
resultados destacam o grande potencial de toxicidade dos monoterpenos, ρ-cimeno e limoneno,
encontrados no OE de A. trilobata sobre larvas e fêmeas adultas de uma população altamente
resistente ao piretróide deltametrina. Adicionalmente, os resultados também indicam que outros
diferentes monoterpenos desencadeiam efeitos subletais, alterando os padrões comportamentais
que podem reduzir o fitness desses indivíduos em situações naturais.
Os efeitos letais dos diferentes compostos foram dependentes do ciclo de vida dos
indivíduos de A. aegypti, o que está relacionado às características morfológicas e fisiológicas
intrínsecas de cada fase de desenvolvimento. Como esperado, a população resistente, quando
exposta à deltametrina, não apresentou mortalidade significativamente diferente da observada
no controle (Fig. 3). De forma geral, os piretróides promovem uma abertura prolongada dos
canais de sódio [34], causando forte ação excitatória no sistema nervoso dos insetos. No
entanto, as populações resistentes de A. aegypti podem apresentar resistência metabólica [ex.
enzimas do citocromo P450 [13], esterases [35] e glutathione S-transferases [36] ou de
mutações em sítios alvo de ligação dos inseticidas (mutação knockdown - Kdr), portanto, não
se intoxicando com a deltametrina. Interessantemente, nossos resultados destacam que os
monoterpenos p-cimento e limoneno mostraram alta toxicidade para indivíduos da população
resistente (Fig. 3). O ρ-cimeno agiu muito rapidamente causando elevada mortalidade (efeito
knockdown) para indivíduos de ambas as populações (Fig. 4). Destaca-se o fato de que, ao
contrário da deltametrina, que causa efeito knockdown apenas em indivíduos adultos, o p-
cimento mostrou esta eficácia também para larvas. Estes resultados evidenciam o potencial de
utilização deste composto para o controle do mosquito A. aegypti. Nossos resultados
corroboram com estudos que têm mostrado que os OEs apresentam uma eficiente ação
inseticida sobre diversas pragas [37,38]. Porém, poucos trabalhos têm avaliado o potencial
inseticida e subletal desses produtos sobre populações de insetos resistentes, incluindo A.
aegypti. No melhor do nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar a
bioatividade de monoterpenos presentes em OEs contra A. aegypti resistentes a deltametrina
assim como os seus efeitos subletais sobre a natação de larvas de populações resistentes.
A ocorrência de resistência em populações de insetos confere aos indivíduos uma
vantagem adaptativa sobre pressão do inseticida. No entanto, esta resistência pode, na maioria
das vezes, ser acompanhada também por um alto custo no fitness dos indivíduos [24] . Desta
forma, a resistência é acompanhada por trade-offs que envolve realocação de recursos entre a
vantagem adaptativa x custos associados, afetando processos fisiológicos, reprodutivos e/ou
comportamentais dos indivíduos de populações resistentes [39]. Especificamente para A.
aegypti, a resistência tem sido reportada na literatura por interferir na capacidade vetorial,
parâmetros biológicos (desenvolvimento, reprodução e sobrevivência), fisiológicos e também
comportamentais [24,40–42]. No presente estudo, os indivíduos de populações de A. aegypti,
susceptível e resistente a piretróides, apresentam parâmetros de desenvolvimento e
comportamento naturalmente distintos. Os indivíduos da população resistente, além de
apresentar um ciclo de vida mais curto (Fig. 4 A,B), também apresentaram uma maior atividade
de locomoção do que os indivíduos da população susceptível (Fig. 5 e 6). Redução no ciclo de
vida dos indivíduos (L3-pupa) da população resistente, observado no presente estudo, também
já foi relatado em outros estudos [40,42]. Tal diminuição no tempo de desenvolvimento é um
ponto relevante: a longo prazo, pode ocorrer um crescimento mais rápido da população
resistente. Além disso, a maior atividade de locomoção dos indivíduos resistentes poderia
aumentar, por exemplo, suas habilidades de escaparem de predadores, consequentemente
38
aumentando sua probabilidade de sobrevivência e reprodução. Tais alterações no
desenvolvimento e comportamento, aumentam ainda mais a preocupação sobre a atividade
vetorial desses mosquitos [24]. Porém, aqui verificamos que sob efeito dos bioinseticidas, os
indivíduos de ambas as populações sofreram efeitos subletais, com redução de suas taxas de
deslocamento e velocidade (Fig. 6), assim como apresentaram maior desorientação de natação
(Fig. 7). Este comportamento pode indicar uma possível percepção e toxicidade dos compostos
aos indivíduos, uma vez que a redução da atividade locomotora é considerada uma estratégia
amplamente utilizada por insetos para minimizar os efeitos de toxicidade por inseticidas [43].
Embora seja conhecido que a deltametrina cause redução da atividade locomotora dos
indivíduos [25], este efeito não foi observado para a população susceptível, a qual aumentou
sua velocidade de nado quando exposta a este produto, o que poderia estar relacionado à
tentativa de fuga (Fig. 6).
As características da história de vida, assim como morfologia, fisiologia e
comportamento dos organismos podem representar adaptações para se defenderem de
predadores. Dentre estas características está o comportamento de redução da atividade de
natação de larvas de mosquito, que pode evitar sua detecção pelo predador [44], assim como
interferir na capacidade de alimentação das larvas [45]. Desta forma, a redução do
deslocamento e velocidade das larvas, de ambas as populações susceptíveis e resistentes,
tratadas com os monoterpenos de OEs poderia, à princípio, torná-las menos perceptíveis aos
predadores em situações naturais. Porém, uma vez detectadas pelo predador, sua habilidade de
escape pode estar comprometida, uma vez que além da menor capacidade de deslocamento, e
possivelmente menor frequência de busca e ingestão de recursos, ainda mostraram maior
desorientação de nado. Assim, efeitos subletais, capazes de alterar tais padrões
comportamentais, podem interagir com fatores externos no ambiente determinando a
sobrevivência e viabilidade das populações de mosquitos.
4.5. Conclusões
Nossos resultados apontam possíveis alternativas ao controle de larvas e adultos de A.
aegytpi por meio da utilização do óleo essencial de A. trilobata e seus compostos majoritários.
Este estudo ressalta o potencial de utilização do ρ-cimeno e limoneno para o controle de A.
aegypti resistente a piretróides, bem como, os efeitos subletais de diferentes monoterpenos na
redução da atividade de natação e maior desorientação das larvas dessa espécie. Este trabalho
contribui para aumentar a compreensão do efeito de pesticidas sobre o comportamento de fases
juvenis do A. aegypti e de suas possíveis consequências no fitness de populações naturais.
39
4.6. Referências Bibliográficas
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43
Tabela 1. Composição química do OE de A. trilobata caracterizado por CG/EM/DIC.
Composto Tempo de
retenção (min)
Índice de
retençãoa
Área do pico
(%)b
Tricicleno 8,985 929 1,88±0,02
Cânfeno 9,469 944 3,24±0,012
b-pineno 10,353 973 1,05±0,02
Mirceno 10,681 984 0,68±0,03
6-Metil-5-hepten-2-ol* 10,728 985 0,64±0,08
ρ-cimeno 11,859 1020 10,41±0,03
Limoneno 12,021 1025 24,80±0,26
(Z)-b-ocimeno 12,546 1041 5,27±0,42
Linalol 14,257 1092 9,51±0,05
Acetato de sulcatila 15,220 1122 25,64±0,45
Borneol 16,568 1165 0,64±0,05
a-terpineol 17,328 1189 0,28±0,02
Acetato de bornila 20,222 1283 0,79±0,007
b-elemeno 23,345 1391 0,30±0,012
(E)-cariofileno 24,260 1424 1,15±0,03
Aromadendreno 24,633 1438 0,27±0,01
Allo-aromadendreno 25,415 1467 0,27±0,0
Germacreno D 25,922 1485 0,70±0,007
Biciclogermacreno 26,343 1501 1,52±0,02
d-cadineno 26,933 1524 0,40±0,06
Espatulenol 28,508 1586 3,04±0,10
Globulol 28,695 1594 4,29±0,13
Viridiflorol 28,903 1602 0,49±0,03
Isoespatulenol 29,971 1646 0,94±0,05
a-Cadinol 30,348 1662 0,55±0,05
Monoterpenos (%) 84,83
Sesquiterpenos (%) 13,89
Total (%) 98,72 a Índice de retenção calculado utilizando a equação de Van den Dool e Kratz 1963 em relação a uma série homóloga
de n-alcanos (nC9- nC18). b Valores (± EPM) do conteúdo dos compostos obtido pela média de três diferentes determinações e foram obtidas
por CG/EM/DIC.
44
Fig 1. Fórmula estrutural plana dos compostos majoritários encontrados no OE de A.
trilobata. (1) ρ-cimeno, (2) limoneno, (3) linalol e (4) acetato de sulcatila.
45
Fig 2. Esquema de síntese química do acetato de sulcatila. (1) sulcatona, (2) sulcatol e (3)
acetato de sulcatila.
46
Tabela 2. Toxicidade do inseticida deltametrina, do OE de A. trilobata e dos seus
compostos majoritários sobre larvas L3 de A. aegypti susceptíveis à piretróides após 48
horas da exposição.
Tratamento N CL50 (IC95)
(ppm)
CL90 (IC95)
(ppm) Incl.a 2 P
Deltametrina 1116 3,3 x 10-5
(3,2 x 10-5-3,5 x 10-5)
5,3 x 10-5
(4,8 x 10-5-6,3 x 10-5) 6,25 0,01 0,99
A. trilobata 1360 97,38
(95,51-99,78)
113,99
(109,28-121,67) 18,7 3,31 0,18
ρ-cimeno 2229 97,89
(88,98-104,58)
167,54
(154,47-189,80) 5,48 0,93 0,81
Limoneno 2559 74,35
(72,00-76,61)
104,34
(99,33-111,30) 8,69 3,88 0,57
Linalol 2708 238,80
(233,21-244,09)
295,34
(285,97-307,94) 11,1 0,78 0,85
Acetato de sulcatila 1440 >600 -* - - - a Inclinação da curva. * Não foi possível determinar a curva de concentração mortalidade para
este composto devido à baixa toxicidade do mesmo.
47
Tabela 3. Toxicidade do inseticida deltametrina, do OE de A. trilobata e dos seus
compostos majoritários sobre fêmeas adultas de A. aegypti susceptíveis à piretróides após
48 horas da exposição.
Tratamento N DL50 (IC95)
(µg/mg)
DL90 (IC95)
(µg/mg) Incl.a 2 P
Deltametrina 441 3,2 x 10-8
(2,2 x 10-8-4,8 x 10-8)
2,4 x 10-6
(1,1 x 10-6-6,6 x 10-6) 0,68 1,85 0,76
A. trilobata 471 12,25
(11,70-12,82)
18,49
(17,19-20,39) 7,16 3,36 0,18
ρ-cimeno 471 32,81
(29,08-36,95)
93,46
(78,20-117,80) 2,81 1,79 0,58
Limoneno 506 26,11
(24,54-27,66)
45,81
(42,16-50,98) 5,24 4,45 0,21
Linalol 542 16,38
(13,84-19,74)
87,71
(57,23-187,02) 1,75 0,72 0,70
Acetato de sulcatila 773 25,23
(23,73-26,74)
40,21
(37,07-44,73) 6,32 2,32 0,31
a Inclinação da curva.
48
Fig 3. Mortalidade (%) (± EPM) de larvas L3 e fêmeas adultas de A. aegypti resistentes a
piretróides expostas às CLs90 (das larvas L3 susceptíveis) e DLs90 (das fêmeas adultas
susceptíveis) da deltametrina, do OE de A. trilobata e dos seus compostos majoritários
após 48 horas de exposição. Histogramas seguidos pela mesma letra minúscula, para
comparação das mortalidades das larvas, e maiúsculas, para comparação das mortalidades das
fêmeas adultas, não diferem entre si, pelo teste de Tukey à p < 0,05. * O acetato de sulcatila
não foi testado sobre larvas de A. aegypti resistentes, uma vez que não foi possível obter a CL90
para larvas susceptíveis.
49
Fig. 4. Curvas de sobrevivência e tempo médio necessário para matar 50% (TL50) da
população susceptível (A) e resistente a piretróides (B) de larvas/pupas e população de
fêmeas adultas susceptível (C) e resistente a piretróides (D) de A. aegypti expostas ao ρ-
cimeno e deltametrina. Foram utilizadas as CLs90 para larvas/pupas e as DLs90 para fêmeas
adultas determinadas nos bioensaios de toxicidade.
50
Fig. 5. Trilhas representativas do deslocamento de larvas L3 de A. aegypti, susceptíveis e
resistentes a piretróides, expostas imediatamente e por 48 horas às CLs20 (para larvas L3
de A. aegypti susceptíveis à piretróides) do inseticida deltametrina, do OE de A. trilobata
e dos seus compostos majoritários.
51
Fig. 6. Deslocamento (m) (±EPM) e velocidade (±EPM) (pixels/s x 10-2) de larvas L3 de A.
aegypti, susceptíveis e resistentes a piretróides, expostas imediatamente e por 48 horas de
exposição às CLs20 (para larvas L3 de A. aegypti susceptíveis à piretróides) do inseticida
deltametrina, do OE de A. trilobata e dos seus compostos majoritários. * médias não
diferem do controle pelo teste de Dunnett à p < 0,05.
52
Fig. 7. Meandro (deg/mm) (±EPM) e velocidade angular (±EPM) (deg/s) de larvas L3 de
A. aegypti, susceptíveis e resistentes a piretróides, expostas imediatamente e por 48 horas
de exposição às CLs20 (para larvas L3 de A. aegypti susceptíveis à piretróides) do inseticida
deltametrina, do OE de A. trilobata e dos seus compostos majoritários. * médias não
diferem do controle pelo teste de Dunnett à p < 0,05.
53
Fig. 8. Atividade de larvas L3 de A. aegypti, susceptíveis e resistentes a piretróides,
expostas imediatamente e por 48 horas às CLs20 (para larvas L3 de A. aegypti susceptíveis
à piretróides) do inseticida deltametrina, do OE de A. trilobata e dos seus compostos
majoritários. * médias não diferem do controle pelo teste de Dunnett à p < 0,05.
54
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo revela que o óleo essencial de A. trilobata e seus compostos
majoritários além de apresentarem potencial inseticida para o controle de larvas e adultos do A.
aegypti, podem causar efeitos subletais em larvas dessa espécie, o que poderia reduzir seu
fitness e sobrevivência em condições naturais. Além disso, nossos resultados apontam a
possibilidade de utilização dos bioinseticidas testados para um manejo de resistência de A.
aegypti mais eficaz e ambientalmente mais seguro, de forma complementar ou substitutiva aos
inseticidas organossintéticos.
![Trabajo Especial de Grado. Indira[1]](https://static.fdocumentos.tips/doc/165x107/62d5a87b230197179e78d5af/trabajo-especial-de-grado-indira1.jpg)
