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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE EFEITOS DA ÁGUA DE COCO HIPERTÔNICA E SINVASTATINA NO TRATAMENTO DA SEPSE E CHOQUE HIPOVOLÊMICO EM RATOS VANESSA DE FÁTIMA LIMA DE PAIVA MEDEIROS NATAL/RN JULHO DE 2017
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
EFEITOS DA ÁGUA DE COCO HIPERTÔNICA E SINVASTATINA NO
TRATAMENTO DA SEPSE E CHOQUE HIPOVOLÊMICO EM RATOS
VANESSA DE FÁTIMA LIMA DE PAIVA MEDEIROS
NATAL/RN JULHO DE 2017
VANESSA DE FÁTIMA LIMA DE PAIVA MEDEIROS
EFEITOS DA ÁGUA DE COCO HIPERTÔNICA E SINVASTATINA NO
TRATAMENTO DA SEPSE E CHOQUE HIPOVOLÊMICO EM RATOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros
NATAL/RN 2017
Medeiros, Vanessa de Fátima Lima de Paiva.
Efeitos da água de coco hipertônica e sinvastatina no tratamento da sepse e
choque hipovolêmico em ratos / Vanessa de Fátima Lima de Paiva Medeiros. - Natal, 2017.
54f.: il.
Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Centro
de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientador: Aldo da Cunha Medeiros.
1. Sepse - Tese. 2. Choque hipovolêmico - Tese. 3. Sinvastatina - Tese. 4.
Água de coco - Tese. 5. Tratamento - Tese. I. Medeiros, Aldo da Cunha. II.
Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616.94
iii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde:
Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito
iv
VANESSA DE FÁTIMA LIMA DE PAIVA MEDEIROS
EFEITOS DA ÁGUA DE COCO HIPERTÔNICA E SINVASTATINA NO
TRATAMENTO DA SEPSE E CHOQUE HIPOVOLÊMICO EM RATOS
Aprovada em 28 / 07 / 2017
Banca examinadora
Presidente da Banca: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros
Membros da Banca:
Profa. Dra. Rejane Andrade de Carvalho - UFRN
Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior – UFRN
Dr. Robson de Macedo Filho – Membro externo – IRN
Profa. Dra. Deborah de Melo Magalhães Padilha Membro externo – UnP
v
DEDICATÓRIA
a Fernanda Luíza, meu amor maior, minha continuidade.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me permitir continuar a enfrentar desafios e realizar sonhos;
À minha família, por todo apoio e amor incondicional;
À minha filha, Fernanda Luíza, que sem saber, é a minha maior incentivadora;
Ao Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros, meu orientador e amigo. Muito obrigada
por tudo. Eternamente grata;
Ao amigo Italo Medeiros pela parceria;
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela oportunidade e
aprendizado;
A todos os colegas e colaboradores que direta ou indiretamente contribuíram
para a conclusão deste trabalho.
vii
RESUMO
Reanimação e tratamento de choque e sepse são controversos e desafiadores.
O objetivo deste estudo foi examinar os efeitos da água de coco + NaCl 3% +
sinvastatina na reanimação em modelo murino de sepse abdominal e choque
hemorrágico. Ratos Wistar machos adultos foram submetidos a sepse por
ligadura e punção do ceco e choque hemorrágico, e divididos em quatro
grupos de reposição hidroeletrolítica. 1. solução salina 0,9%; 2. água de coco +
NaCl 3%; 3. água de coco + NaCl 3% + sinvastatina (microemulsão) 10 mg / Kg
i.v; 4. Água de coco não modificada. Escore clínico, histologia e fluorescência
do pulmão foram avaliados neste estudo. Dosagem sérica das citocinas TNF-α,
IL-1β e contagem de leucócitos foram determinados. O tratamento com água
de coco + NaCl 3% + sinvastatina resultou em resultados significativamente
melhores de sobrevivência, análises bioquímicas e histopatologia quando
comparando com os animais submetidos aos tratamentos água de coco + NaCl
3% e água de coco não modificada. Em conclusão, a ressuscitação com água
de coco com Nacl 3% + sinvastatina teve efeito benéfico significativo sobre a
redução dos níveis de citocinas e na atenuação de lesões pulmonares em
modelo de sepse abdominal e choque hemorrágico. Também foi demonstrado
que o tratamento com água de coco com Nacl 3% + simvastatina atuou
positivamente na função do fígado e dos rins, e no escore clínico.
Palavras-chave: Choque hemorrágico. Sepse. Ressuscitação. Sinvastatina.
Água de coco. Ratos.
viii
ABSTRACT
Resuscitation and treatment of shock and sepsis are controversial and
challenging. The aim of this study was to examine the effects of coconut water
+ Nacl 3%+ simvastatin in resuscitation in a murine model of sepsis and
hemorrhagic shock. In methods, adult male Wistar rats were subjected to sepsis
by cecal ligation and puncture and hemorrhagic shock assigned to four fluid
replenishment groups. Animals received 1. saline 0,9%; 2. coconut water (CW)
+ NaCl 3%; 3. coconut water + NaCl 3% + simvastatin (microemulsion)10
mg/Kg i.v; 4. Coconut water. Clinical score was determined and lung tissue was
assessed for inflammation. Serum cytokines TNF-α, IL-1 β and leucocytes were
measured. The results of this study indicated that coconut water+NaCl 3%+
simvastatin decreased significantly serum cytokines, survival, biochemical
analysis and lung histopathological testing when compared to saline,
water+NaCl 3% and coconut water. In conclusion, resuscitation with coconut water
with Nacl 3%+simvastatin had a significant beneficial effect on downregulating
cytokines and decreasing lung injury in a rat model of abdominal sepsis and
hemorrhagic shock. We also demonstrated that coconut water with Nacl
3%+simvastatin administration clearly made liver and kidney function better and
improved clinical score.
Key words: Shock, Hemorrhagic. Sepsis. Resuscitation. Simvastatin. Foods
Containing Coconut. Rats.
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
FMOS .....................................................Falência múltipla de órgãos e sistemas
HMG-CoA .............................................. 3-Hidroxi-3-metil-glutaril-CoenzimaA redutase
PAM .............................................................................................Pressão arterial média
CEUA ...................................................................Comissão de ética no uso de animais
TNF-α ............................................................................. Fator de Necrose tumoral alfa
IL-1β ..................................................................................................Interleucina-1 beta
ELISA ................................................................ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
PCR ……………………………………......................................………Proteína-C reativa
ALT ……….............................................................……………Alanina-aminotransferase
AST …………….............................................……………….Aspartato-aminotransferase
AC ............................................................................................................. Água de coco
IS ......................................................................................................Intensidade do sinal
LPC .......................................................................................Ligadura e punção do ceco
ICV .......................................................................................................Indocianina verde
x
SUMÁRIO
RESUMO ..................................................................................................................... vii
ABSTRACT ................................................................................................................ viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ....................................................................... ix
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 11
2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 14
2.1. OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 14
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 14
3. JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 15
4. MÉTODOS .......................................................................................................... 16
4.1. CHOQUE HEMORRÁGICO .......................................................................... 16
4.2. SEPSE ABDOMINAL E DELINEAMENTO DOS GRUPOS DE ESTUDO ..... 16
4.3. REPOSIÇÃO VOLÊMICA ............................................................................. 17
4.4. ESCORE CLÍNICO ....................................................................................... 17
4.5. EXAMES LABORATORIAIS ......................................................................... 18
4.6. IMAGENS DE FLUORESCÊNCIA PULMONAR (EX VIVO). ......................... 18
4.7. AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DE LESÃO PULMONAR................................. 19
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................... 20
5. ARTIGO PRODUZIDO (Artigo objetivo da tese) .................................................. 21
6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES/CONCLUSÕES ............................ 45
7. REFERÊNCIAS ................................................................................................... 49
11
1. INTRODUÇÃO
A sepse é uma afecção cuja fisiopatologia está ligada a um
desequilíbrio entre substâncias anti-inflamatórias e proinflamatórias que irão
mediar uma resposta aos danos causados aos tecidos orgânicos1. O processo
infeccioso da sepse abdominal é desencadeado basicamente por bactérias
gram-negativas e anaeróbias2.
Mesmo com o avanço crescente no tratamento da sepse, esta ainda é
uma grande causa de mortes em unidades de terapia intensiva, principalmente
em pacientes politraumatizados, em usos de cateteres, ventilação mecânica,
dependentes de esteroides e portadores de pneumonia3. Tal fato deve-se à
grande chance do quadro clínico evoluir para um choque séptico em que é
frequente ocorrer falência de múltiplos órgãos e sistemas (FMOS)3,4. Apesar do
tratamento intensivo com reanimação agressiva, controle de pressão arterial e
oferta adequada de oxigênio, pacientes com sepse muitas vezes persistem
apresentando sinais de hipoperfusão tecidual, o que pode levar à acidose e,
finalmente, FMOS5-10. Investigadores têm demonstrado em modelos em ratos
que a sepse é caracterizada pela diminuição da velocidade do fluxo da
microcirculação, aumento da heterogeneidade de fluxo, aumento de estase
vascular e diminuição da densidade de capilares perfundidos11-14. As arteríolas,
vasos capilares e vênulas da microcirculação funcionam como um complexo
integrado para funções homeostáticas, hemostáticas e imunes. A sepse resulta
em disfunção de todos estes sistemas via desregulação do controle vasomotor,
lesão endotelial, ativação da coagulação, e distúrbio nas funções dos
leucócitos15-17.
Em resumo, a sepse provoca mudanças no ambiente microvascular,
muitas das quais mediadas pela ativação e disfunção das células endoteliais. O
resultado final comum desses efeitos é a diminuição do transporte de oxigênio
para as células que, se não corrigidos, podem levar à FMOS e morte18-22.
Trabalhos relevantes têm estudado a composição da água de coco.
Santoso et al23 descreveram informações detalhadas sobre a presença de
vitaminas, açúcares, ácidos orgânicos, ácidos graxos, aminoácidos, eletrólitos
e minerais na água de coco (Cocus nucifera L.). Aleixo et al24 determinaram o
12
conteúdo de selênio na água de coco, usando a espectrometria de absorção
atômica. Uma característica relevante da água de coco é sua capacidade
antioxidante, exercida em parte pelo selênio25-27. Elementos traço e metais em
pequenas dosagens foram determinados na água de coco, com potencial para
uso na hidratação por via intravenosa e para substituir ou complementar
soluções de nutrição parenteral28,29. A água de coco pode servir como solução
para hidratação intravenosa, se outra solução não estiver disponível, conforme
demonstrado por Campbell-Falck et al, que relataram um caso bem sucedido
de hidratação intravenosa nas Ilhas Salomon e descreveram seu uso por essa
via desde a II Guerra Mundial30. A composição eletrolítica da água de coco com
6 meses da retirada do fruto assemelha-se mais à do líquido intracelular do que
à do extracelular, e consiste principalmente de potássio, cálcio, magnésio e
cloro. O sódio é encontrado em concentração bem mais baixa do que no
plasma humano e dos mamíferos em geral31. A infusão da água de coco por via
intravenosa não interfere com os mecanismos de hemostasia32,33.
As estatinas inibem a 3-Hidroxi-3-metil-glutaril-CoenzimaA
redutase (HMG-CoA redutase), e foram estudadas inicialmente no tratamento
das dislipidemias e da aterosclerose, uma doença inflamatória do endotélio
vascular, cuja patogênese tem muitas semelhanças com a patogênese da
sepse34,35. As estatinas exercem múltiplos efeitos em várias células, através de
vários mecanismos. Esses efeitos, denominados pleiotrópicos, têm sido
descritos como antiinflamatórios e imunomoduladores, e modificam as
interações entre o endotélio e os leucócitos, alterando as respostas dessas
células36,37. Adicionalmente, as estatinas modulam a sinalização das células
inflamatórias, repercutindo na redução da liberação de citocinas e de proteínas
da fase aguda da sepse36,38, além de exercerem importantes efeitos
antioxidantes por vários mecanismos39.
Trauma acompanhado de choque hemorrágico é a terceira causa de
morte no mundo e principal causa de óbitos em pessoas com idade abaixo de
45 anos40-42. Nesses casos, um grande volume de solução salina isotônica é
atualmente o tratamento padrão para o choque por hipovolemia43. Devido à sua
eficácia limitada, diferentes tipos de soluções de reposição volêmica têm sido
avaliados nos últimos anos, no sentido de garantir melhor expansão plasmática
13
para os pacientes. Nos anos 80 surgiu estudo que demonstrou que solução
salina hipertônica 7,5% melhorou significativamente os parâmetros
hemodinâmicos dos pacientes chocados, mesmo quando infundidos pequenos
volumes44. Durante os anos seguintes, outros estudos mostraram que as
soluções hipertônicas faziam aumentar significativamente a pressão arterial45 e
o débito cardíaco, revertendo o choque hipovolêmico sem comprometer a
função cardiopulmonar46,47. Por outro lado, também é sabido que a reposição
do volume plasmático com soluções isotônicas pode induzir a hemodiluição,
que é bem tolerada pelos pacientes hígidos. Os efeitos imediatos podem
depender da duração e intensidade do sangramento. Pacientes
frequentemente chegam às salas de emergência hemodiluídos devido à perda
de grande volume de sangue. A possível influência desse estado de
hemodiluição sobre a resposta do paciente ao tratamento ou a evolução de
pacientes não está bem esclarecido. Além disso, o sangramento contínuo
nesses pacientes requer tratamento adicional, frequentemente cirúrgico47. A
reposição de volume e a solução ideal nesta situação não estão bem
estabelecidas, persistindo controvérsias.
Com o presente protocolo foi estudada a ação da reposição volêmica
com solução de água de coco modificada associada à sinvastatina por via
venosa, em ratos submetidos a duplo desafio: sepse e choque hemorrágico.
São situações comuns e graves na prática clínica diária, que continuam com
alta morbidade e mortalidade nos dias atuais.
14
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem o objetivo de examinar se a sinvastatina atua
sinergicamente com água de coco hipertônica na reposição volêmica e na
evolução da sepse abdominal associada ao choque hemorrágico em ratos.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a sobrevida e escores clínicos dos animais;
Comparar a reposição volêmica com água de coco a 3% de sódio
com a solução salina 0,9%;
Avaliar o uso concomitante da sinvastatina intravenosa (i.v.) com
a reposição volêmica;
Comparar dados laboratoriais entre os grupos.
15
3. JUSTIFICATIVA
Pelo exposto, o choque hemorrágico é muito frequente, grave e induz
respostas inflamatórias sistêmicas e danos a uma série de órgãos, através de
vários mecanismos. Até os dias atuais, não há uma solução de reposição da
volemia que atenda satisfatoriamente o tratamento do choque por perda
sanguínea, especialmente quando associado à sepse. Os efeitos das
estratégias de ressuscitação na resposta inflamatória ao choque e sepse não
são bem conhecidos atualmente. Há algumas evidências recentes de que o
plasma fresco pode ter efeito anti-apoptótico nas células endoteliais, que o
sangue total fresco infundido precocemente tem efeito no controle da liberação
de citocinas, e que soluções hipertônicas têm ação importante na redução da
mortalidade do choque e da sepse. São achados clínicos e experimentais que
têm demonstrado resultados ora satisfatórios, ora deletérios, demonstrando
que a controvérsia persiste.
Justifica-se o protocolo experimental aqui proposto, através do qual foi
testado o uso da sinvastatina i.v. (de efeitos anti-inflamatórios e
imunomoduladores) associado à água de coco, que foi utilizada na II Guerra
Mundial para hidratação i.v. A partir de então, nenhum trabalho com
metodologia bem estruturada foi publicado na literatura a respeito da reposição
volêmica com água de coco em indivíduos chocados. A água de coco tem sido
estudada especialmente quanto à sua composição, para uso oral, sabendo-se
do seu teor em eletrólitos, aminoácidos, lipídeos, glicídeos, antioxidantes, pH
ácido, etc. É grande o potencial da água de coco para uma série de aplicações
na Medicina, de modo que se torna conveniente investir em estudo da sua
utilização para reposição volêmica em casos de choque séptico. Será testada a
hipótese de que a reposição volêmica com água de coco modificada com 3%
de sódio, associada à sinvastatina i.v. contribui para diminuir a produção de
citocinas proinflamatórias, reduzir a lesão de órgãos vitais e prolongar a
sobrevida de ratos em modelo de choque e sepse.
16
4. MÉTODOS
Este protocolo foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética para
Uso de Animais (CEUA) institucional, protocolo 36/2014. O cuidado na
utilização dos animais seguiu as normas vigentes da Legislação Brasileira para
o uso científico de animais (Lei nº 11.794/2008). O estudo foi realizado nas
dependências do Núcleo de Cirurgia Experimental-UFRN. Foi utilizado modelo
animal de choque hemorrágico e sepse abdominal para a avaliação de
possíveis efeitos da associação de sinvastatina e água de coco hipertônica na
reposição volêmica em ratos Wistar, jovens machos, com peso variando entre
250 e 300g. Ficaram em jejum alimentar de 12 horas e hídrico de 3 horas antes
de serem submetidos à anestesia para a realização do experimento. Foram
anestesiados com uma mistura composta por cetamina (70 mg/kg) e xilazina
(10 mg/kg), administrados por via intramuscular e re-administrados
periodicamente se necessário, até o término dos experimentos.
4.1. CHOQUE HEMORRÁGICO
Após a estabilização da anestesia, a monitorização foi instalada. A veia
e artéria femoral contralateral foram dissecadas para a realização e
monitorização da perda volêmica e sua reposição. Cânulas de silicone calibre
24F foram introduzidas na artéria femoral para monitorização da pressão
arterial média e na veia femoral para drenagem sanguínea e reposição
volêmica. Após um período de estabilização para os grupos de animais, o
sangue foi drenado pela veia femoral até a pressão arterial média (PAM)
estabilizar em 35 mmHg, sendo anotado o volume de sangue retirado de cada
animal para cálculo da reposição volêmica. A PAM foi monitorada através de
Equipamento para Medição de Pressão Arterial Invasivo (SP, Brazil). O quadro
de choque hemorrágico foi mantido por um período de 60 minutos.
4.2. SEPSE ABDOMINAL E DELINEAMENTO DOS GRUPOS DE ESTUDO
Completados 60 minutos de choque, com os animais anestesiados, foi
feita laparotomia mediana, ligadura e punção do ceco. Após este período, os
animais receberam a reposição volêmica por via intravenosa ao longo de 10
17
minutos. O volume de reposição foi igual ao dobro do volume sanguíneo
perdido. Para cada solução infundida para reposição volêmica houve um grupo
de animais, totalizando 4 grupos (n=8/grupo), segundo o seguinte
delineamento: 1) reposição com solução salina 0,9%; 2) reposição com água
de coco + NaCl 3%; 3) reposição com água de coco + NaCl 3% de sódio +
sinvastatina (microemulsão) 5 mg/Kg i.v.; 4) reposição com água de coco não
modificada. Durante o período de choque, indução da sepse e reposição
volêmica, os animais foram mantidos em microambiente aquecido a 37ºC
(placa aquecedora Insight, São Paulo, Brasil) e anestesiados até o final do
experimento.
4.3. REPOSIÇÃO VOLÊMICA
A água de coco foi obtida de espécimes de coco (Cocus nucifera L.) de
6 meses (período desde a inflorescência até a colheita dos frutos), com técnica
estéril, retirada do coco imediatamente antes da administração dos animais e
devidamente modificada até atingir o nível de NaCl 3%, através da introdução
de volume de NaCl 10% previamente calculado para atingir esta concentração.
Foi determinado o pH da água de coco, com pHâmetro (Micronal, São Paulo,
Brasil), em média pH 5,8; o pH foi previamente reajustado para o valor 7,4 com
utilização de bicarbonato de sódio 10% gota a gota. Tanto o pH, quanto o
conteúdo de NaCl para 3%, foram ajustados imediatamente antes da infusão
intravenosa. Foi utilizada solução salina 0,9% de procedência B. Braun, Rio de
Janeiro, Brasil. Todas as soluções foram infundidas através de bomba de
infusão (B. Braun, Rio de Janeiro, Brasil), calculando-se o volume usado
sempre durante 10 min., em velocidade de infusão constante. Durante a
infusão todas as soluções foram aquecidas a 36,5ºC.
4.4. ESCORE CLÍNICO
O escore clínico dos ratos foi determinado após seis e 18 horas da
reanimação, os demais exames, após 18 horas. Estes intervalos de tempo e a
análise dos escores foram escolhidos com base em trabalho anterior54. A
pontuação consistiu em analisar os seguintes parâmetros: 1- presença de
piloerecção, 2- frequência respiratória alterada, 3- alteração fecal, 4-
18
lacrimejamento/alterações da pálpebra, 5-contração do abdome, 6- falta de
resistência ao segurar, 7- mudança na temperatura corporal, 8- resposta de
alerta (escapar após o toque), 9-exploração do ambiente, e 10- atividade
locomotora comprometida. Para cada parâmetro foi atribuído 1 ponto, e na
ausência do parâmetro analisado, nenhum ponto. Em seguida, os pontos foram
calculados para cada rato. Uma pontuação de 0 indicou que o animal não
apresentava qualquer alteração clínica; uma pontuação entre 1 e 3 indicou
sepse leve, entre 4 e 7 indicou sepse moderada e entre 8 e 10 indicou sepse
grave.
4.5. EXAMES LABORATORIAIS
Os animais sobreviventes após 18 hs de observação foram novamente
anestesiados e submetidos à coleta de sangue por punção cardíaca para
dosagens. O soro foi separado através de centrifugação a 3000rpm e estocado
a -40ºC para posterior dosagem. Os níveis séricos de fator de necrose tumoral
alfa (TNF-α) e Interleucina 1-beta (IL-1β) foram determinados usando ensaio
quantitativo com kits ELISA, de acordo com as recomendações do fabricante.
(PeproTech, USA). Foram determinados aspartato-aminotransferase (AST),
alanina-aminotransferase (ALT), uréia, creatinina, proteína C-reativa (PCR) e
leucograma. Uréia e creatinina como indicadores de função renal e filtração
glomerular. A PCR foi dosada pelo método da nefelometria.
4.6. IMAGENS DE FLUORESCÊNCIA PULMONAR (EX VIVO).
Com os ratos ainda anestesiados, imediatamente após a coleta de
sangue foi feita a injeção de indocianina verde (ICV) 10mg/Kg (Ophthalmos,
São Paulo Brasil) pela veia femoral. Dez minutos após a injeção, os pulmões e
a traqueia foram removidos, chegando à eutanásia dos animais. As imagens
ópticas foram obtidas usando o equipamento InVivo FX para fluorescência
(Carestream Molecular Imaging, USA). Filtros de excitação e de emissão foram
fixados em 710 nm e 700 nm, respectivamente. Os pulmões foram colocados
na câmara de imagem do equipamento. Um protocolo de imagenologia (tempo
de exposição de 20 segundos, binning 2x2, f-stop 2.8, campo de visão 120 mm,
e plano focal 10 mm) foi mantido para todos os exames, e as imagens foram
19
feitas comparando os grupos. As imagens ópticas do estudo ex vivo foram
avaliadas qualitativamente através da avaliação da presença ou ausência de
fluorescência na região dos pulmões inflamados, comparando apenas o grupo
água de coco + Na 3% + sinvastatina com a fluorescência do grupo tratado
com solução salina 0,9%. A análise quantitativa dos exames pulmonares foi
realizada por medição da intensidade de sinal de fluorescência (IS) dos
pulmões, utilizando o software Kodak Molecular 5.0. Uma região de interesse
criada por uma ferramenta automatizada foi determinada em torno do órgão. As
intensidades de sinal de interesse foram expressas como fluorescência
arbitrária em pixels. Fluorescências em tons de cinza foram coloridas via
software do equipamento para fins quantificação, de acordo com uma escala
de cores definida com os maiores e menores níveis de intensidade de
fluorescência média (vermelho - intensidade máxima e roxo intensidade
luminosa mínima, respectivamente). Os alvos eram foco séptico e inflamação
nos pulmões.
4.7. AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DE LESÃO PULMONAR.
Os pulmões foram retirados e imersos em formalina tamponada 10%
durante 48 horas, sendo em seguida embebidos em parafina. Seções de 4µm
foram coradas com hematoxilina e eosina. A arquitetura pulmonar foi avaliada
por microscopia óptica com microscópio BX50 equipado com câmera digital
DS30 (Olympus, Japan). Duas secções aleatórias de tecido de quatro
diferentes pulmões em cada grupo foram examinadas por um investigador sem
conhecimento prévio dos grupos.
Os escores de lesão pulmonar foram quantificados de acordo com os
critérios usados por Matute-Bello et al, que estabelecem valores totais entre 0 e
1 (Tabela 1)48.
20
Tabela 1 – Sistema de avaliação de lesão pulmonar (adaptado de Matute-Bello at al)48.
Parâmetro Escore por campo
0 1 2
A. Neutrófilos no espaço alveolar Nenhum 1-5 >5
B. Neutrófilos no espaço intersticial Nenhum 1-5 >5
C. Membranas hialinas (presença) Nenhum 1 >1
D. Debris proteináceos enchendo os espaços aéreos
Nenhum 1 >1
E. Espessamento do septo alveolar Nenhum 2x – 4x >4x
s ore A 1 C
n ero e a pos 1
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram armazenados e analisados estatisticamente através do
software SPSS 17.0 e GraphPad Prism® 7.00 for Windows, GraphPad
Software, La Jolla, Califórnia, EUA, (www.graphpad.com). Os resultados dos
parâmetros analisados foram confrontados estatisticamente empregando-se o
método de comparações múltiplas, pela análise de variância (ANOVA) com
medidas repetidas, seguido dos testes de Student, e de Tukey para
comparação entre grupos. Os resultados foram considerados estatisticamente
significativos quando p<0,05.
21
5. ARTIGO PRODUZIDO (Artigo objetivo da tese)
EFFECTS OF HYPERTONIC COCONUT WATER AND SIMVASTATIN IN THE
TREATMENT OF SEPSIS AND HEMORRHAGIC SHOCK IN RATS
Foi publicado originalmente em Inglês no periódico Acta Cirúrgica Brasileira
que possui fator de impacto 0,58 e Qualis B3 da CAPES para a área Medicina
II.
EFEITOS DA ÁGUA DE COCO HIPERTÔNICA E SINVASTATINA NO
TRATAMENTO DA SEPSE E CHOQUE HEMORRÁGICO EM RATOS1
Vanessa de Fátima Lima Paiva MedeirosI, Ítalo Medeiros AzevedoI, Marília Daniela Ferreira CarvalhoI, Eryvaldo Sócrates Tabosa EgitoII, Aldo Cunha MedeirosIII DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S0102-865020160120000008 IAlunos do doutorado, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal-RN, Brasil. Aquisição e interpretação dos dados, procedimentos técnicos, preparação do manuscrito. IIProfessor titular, Departmento de Farmácia, UFRN, Natal-RN, Brasil. Bolsista CNPq/PQ.1D. Análise e interpretação de dados, procedimentos técnicos, revisão crítica. IIIProfessor titular, Chefe do Núcleo de Cirurgia Experimental, UFRN, Natal-RN, Brasil. Bolsista CNPq/PQ.2. Concepção, delineamento, responsável pelo conteúdo científico e intelectual do estudo; análise e interpretação dos dados; revisão crítica.
__________________________________________________________
RESUMO
Objetivo: Reanimação e tratamento de choque e sepse são controversos e
desafiadores. O objetivo deste estudo foi examinar os efeitos da água de coco
+ NaCl 3% + sinvastatina na reanimação em modelo murino de sepse e choque
hemorrágico. Métodos: Ratos Wistar machos adultos foram submetidos a
sepse por ligadura e punção do ceco e choque hemorrágico, divididos em
quatro grupos de reposição hidroeletrolítica. 1. solução salina 0,9%; 2. água de
coco + NaCl 3%; 3. água de coco + NaCl 3% + sinvastatina (microemulsão) 10
mg / Kg i.v; 4. água de coco não modificada. Escore clínico, histologia e
fluorescência do pulmão foram avaliados para estudar inflamação. Citocinas
séricas e leucócitos foram determinados. Resultados: O tratamento com água
de coco + NaCl 3%+ sinvastatina resultou em resultados significativamente
melhores de sobrevivência, análises bioquímicas e histopatologia comparando
com os animais submetidos aos outros tratamentos. Conclusão: Em
22
conclusão, a água de coco + simvastatina exerceu efeitos moduladores no
choque e sepse através de reduzindo níveis de citocinas proinflamatórias, além
de redução de lesões pulmonares, dados bioquímicos e atividade dos
neutrófilos. Também ficou demonstrado que a administração de água de coco
com Nacl 3% + simvastatina, influenciou positivamente na função do fígado e
dos rins e melhorou o escore clínico dos animais.
Palavras chave: Sepse. Choque hemorrágico. Citocinas. Ressuscitação.
Coco. Água. Ratos.
_______________________________________________________________
ABSTRACT
Purpose: Resuscitation and treatment of shock and sepsis are controversial
and challenging. The aim of this study was to examine the effects of coconut
water + Nacl 3%+ simvastatin in resuscitation in a murine model of sepsis and
hemorrhagic shock. Methods: Adult male Wistar rats were subjected to sepsis
by cecal ligation and puncture and hemorrhagic shock assigned to four fluid
replenishment groups. Animals received 1. saline 0,9%; 2. coconut water (CW)
+ NaCl 3%; 3. coconut water + NaCl 3% + simvastatin (microemulsion) 10
mg/Kg i.v; 4. Natural coconut water. Clinical score and lung tissue was
assessed for inflammation. Serum cytokines TNF-α, IL-1 β and leucocytes were
determined. Results: The results of this study indicated that coconut
water+NaCl 3%+ simvastatin decreased significantly serum cytokines, Survival,
biochemical analysis and lung histopathological testing when compared to
saline and other treatments.. Conclusion: In conclusion, coconut water Na 3%
+ simvastatin positively affected shock and sepsis rats through a mechanism
associated with downregulation of cytokines, in addition to other well-known
effects such as decreased lung injury, biochemical data and neutrophil activity.
We also demonstrated that coconut water with Nacl 3%+simvastatin
administration clearly made liver and kidney function better and improved
clinical score.
Key words: Sepsis. Hemorrhagic shock. Cytokines. Resuscitation. Water.
Coconut. Rats.
_______________________________________________________________
23
INTRODUÇÃO
A fisiopatologia da sepse está relacionada a um desequilíbrio entre
substâncias anti-inflamatórias e pró-inflamatórias, que irá mediar a resposta
para o dano dos tecidos corporais1. Apesar do tratamento intensivo com
ressuscitação agressiva, controle da pressão arterial e fornecimento adequado
de oxigênio, pacientes com sepse frequentemente persistem mostrando sinais
de hipoperfusão tecidual, o que pode levar à acidose e, eventualmente, à
falência de múltiplos órgãos2-4. Pesquisadores mostraram que a sepse é
caracterizada pela diminuição da velocidade de fluxo microcirculatório,
aumento da heterogeneidade desse fluxo, aumento estase vascular e
diminuição do número de capilares perfundidos5,6. A falha no fluxo sanguíneo
na microcirculação resulta em shunts de sangue para os tecidos, levando ao
déficit de oxigênio necessário para o metabolismo celular normal7,8.
Mediadores inflamatórios sistêmicos e endotoxinas alteram as conexões
intracelulares e os sinais utilizados pelas células endoteliais, atuando como um
sistema unificado. Essa interrupção pode resultar em alteração na distribuição
do fluxo sanguíneo nos tecidos9.
O choque hemorrágico e consequente hipoperfusão tecidual levam a
uma redução da oxigenação celular, acidose metabólica e hipotermia10. A
redução do suprimento de O2 provoca aumento do metabolismo anaeróbico e
redução dos níveis de ATP e cálcio intracelular, que promovem mudanças
significativas na função celular, estimulando a liberação de citocinas pró-
inflamatórias. Estas, por sua vez, podem alterar a função imunológica de
macrófagos e linfócitos, causando imunossupressão e aumento do risco de
infecção11.
Alguns trabalhos que estudaram a composição da água de coco (AC).
Santoso et al.12 descreveram a presença de vitaminas, açúcares, ácidos
orgânicos, ácidos graxos, aminoácidos, minerais e eletrólitos na água do coco
(Cocus nucifera L.). Aleixo et al13 determinaram o seu teor de selênio utilizando
a espectrometria de absorção atômica. Outra característica importante da AC é
a sua capacidade antioxidante14-16. Elementos traço e metais em pequenas
doses foram determinados, levando a acreditar que a AC tem potencial de uso
24
como soluções de hidratação intravenosa ou nutrição parenteral suplementar17.
Campbell-Falck et al.18 relataram um caso bem sucedido de hidratação
intravenosa nas Ilhas Salomão e descreveram seu uso para este fim durante a
II Guerra Mundial.
A composição eletrolítica da AC aos 6 meses assemelha-se aos meios
intracelular e extracelular e consiste principalmente em potássio, cálcio,
magnésio e cloro. O sódio é encontrado em uma concentração muito menor do
que no plasma humano19. Embora a AC já tenha sido descrita como solução
viável para ressuscitação, relatos do seu uso intravenoso são escassos20,21. Há
evidências de que não interfere nos mecanismos de hemostasia22.
As estatinas inibem a HMG-CoA redutase e têm sido intensamente
estudadas para a prevenção da aterosclerose, doença inflamatória do endotélio
vascular, cuja patogênese tem semelhanças com a patogênese da sepse23.
Embora os efeitos das estatinas tenham sido inicialmente designados apenas
para tratar os altos níveis de colesterol, muitos outros benefícios vieram a ser
considerados e estudados. As estatinas exercem múltiplos efeitos em várias
células, através de diversos mecanismos. Estes efeitos pleiotrópicos foram
descritos como antiinflamatórios, modificando as interações entre o endotélio e
leucócitos24,25. Além disso, as estatinas modulam a sinalização das células
inflamatórias, que por sua vez reduzem a liberação de citocinas e proteínas da
fase aguda da sepse26 e exercem outros importantes efeitos antioxidantes27.
A solução ideal para a reposição de volume em situações de sepse
associada ao choque hemorrágico ainda não está bem estabelecida. Neste
protocolo estudamos os efeitos de uma solução de AC modificada, combinada
com sinvastatina intravenosa, para reposição de volume sanguíneo em ratos
submetidos a um duplo desafio: sepsis e choque hemorrágico. Esta situação é
comum e muito grave na prática cirúrgica, especialmente no trauma, com alta
morbidade e mortalidade. Este estudo teve como objetivo examinar os efeitos
da AC hipertônica combinada com sinvastatina, como fluido de ressuscitação
em modelo de choque hemorrágico e sepse abdominal em ratos.
25
MÉTODOS
Este protocolo foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética para
Uso de Animais (CEUA) da UFRN, sob o protocolo 36-2014. O cuidado na
utilização dos animais seguiu as normas vigentes da Legislação Brasileira para
o uso científico de animais (Lei nº 11.794/2008). O estudo foi realizado nas
dependências do Núcleo de Cirurgia Experimental-UFRN. Foi utilizado modelo
animal de choque hemorrágico e sepse abdominal para a avaliação de
possíveis efeitos da associação de sinvastatina e água de coco hipertônica na
reposição volêmica em ratos Wistar jovens, com peso variando entre 250 e 300
g. Ficaram em jejum alimentar de 12 horas e hídrico de 3 horas antes de serem
submetidos à anestesia para a realização do experimento. Foram anestesiados
com uma mistura composta por cetamina (70 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg),
administrados por via intramuscular e re-administrados periodicamente se
necessário, até o término dos experimentos.
Choque Hipovolêmico
Após a estabilização da anestesia, a monitorização foi instalada. A veia e
artéria femoral contralateral foram dissecadas para a realização e
monitorização da perda volêmica e sua reposição. Cânulas de silicone calibre
24F foram introduzidas na artéria femoral para monitorização da pressão
arterial média (PAM) e na veia femoral para drenagem sanguínea e reposição
volêmica. Após um período de estabilização para os grupos de animais, o
sangue foi drenado pela veia femoral até a PAM estabilizar em de 35 mmHg,
sendo anotado o volume de sangue retirado de cada um deles para cálculo da
reposição volêmica. A PAM foi monitorada através do Medidor de Pressão
Arterial Invasivo (Insight, Ribeirão Preto, SP, Brazil). O quadro de choque
hemorrágico foi mantido por um período de 60 minutos.
Sepse Abdominal e Delineamento dos Grupos de Estudo
Completados 60 minutos de choque, com os animais anestesiados, foi
feita laparotomia mediana, ligadura e punção do ceco. Após este período, os
animais receberam a reposição volêmica por via intravenosa ao longo de 10
26
minutos. O volume de reposição foi igual ao dobro do volume sanguíneo
perdido. Para cada solução infundida para reposição volêmica houve um grupo
de animais, totalizando 4 grupos (n=8/grupo): 1) reposição com solução salina
0,9%; 2) reposição com água de coco + NaCl 3%, 3) reposição com água de
coco + NaCl 3% de sódio + sinvastatina (microemulsão) 5 mg/Kg i.v; 4)
reposição com água de coco normal. Durante o período de choque e reposição
volêmica, os animais foram mantidos em microambiente aquecido a 37ºC
(placa aquecedora Insight, São Paulo, Brasil) e anestesiados até o final do
experimento.
Reposição Volêmica
A água de coco foi obtida de espécimes de coco (Cocus nucifera L.) de 6
meses (período desde a inflorescência até a colheita dos frutos), com técnica
estéril, retirada do coco imediatamente antes da administração nos animais e
devidamente modificada até atingir o nível de NaCl 3%. Foi determinado o pH
da água de coco, com pHâmetro (Micronal, São Paulo, Brasil), em média 5,8; o
pH foi previamente reajustado para o valor 7,4 com utilização de bicarbonato
de sódio 10%, bem como o conteúdo de NaCl para 3%, imediatamente antes
da infusão intravenosa. Foi utilizada solução salina 0,9% de procedência B.
Braun, Rio de Janeiro, Brasil. Todas as soluções foram infundidas através de
bomba de infusão (B. Braun, Rio de Janeiro, Brasil), calculando-se o volume
usado sempre durante 10 min., em velocidade de infusão constante. Durante a
infusão todas as soluções foram aquecidas a 36,5ºC. O protocolo experimental
incluiu avaliação de parâmetros clínicos, de exames séricos, hematológicos, de
imagem e sobrevida, 18 horas após a ressuscitação volêmica.
Escore Clínico
O escore clínico de todos os animais foi examinado após seis e 18
horas da reanimação, sendo os demais exames realizados apenas após 18
horas. Os intervalos de tempo para análise foram escolhidos com base em
estudo anterior28. A pontuação do escore consistiu em analisar os seguintes
parâmetros: 1- presença de piloerecção, 2- frequência respiratória alterada, 3-
alteração fecal, 4-lacrimejamento/alterações da pálpebra, 5-contração do
27
abdome, 6- falta de resistência ao segurar, 7- mudança na temperatura
corporal, 8- resposta de alerta (escapar após o toque), 9-exploração do
ambiente, e 10- atividade locomotora comprometida. Para cada parâmetro foi
atribuído 1 ponto, e na ausência do parâmetro analisado, nenhum ponto. Em
seguida, os pontos foram calculados para cada rato. Uma pontuação de 0
indicou que o animal não apresentava qualquer alteração clínica; uma
pontuação entre 1 e 3 indicou sepse leve, entre 4 e 7 indicou sepse moderada
e entre 8 e 10 indicou sepse grave.
Exames Laboratoriais
Os animais sobreviventes após 18 hs de observação foram novamente
anestesiados e submetidos à coleta de sangue por via intracardíaca para
dosagens. O soro foi separado através de centrifugação a 3000rpm e estocado
a -40ºC para posterior dosagem. Os níveis séricos de TNF-α e IL-1β fora
determinados usando ensaio quantitativo com kits ELISA, de acordo com as
recomendações do fabricante (PeproTech, USA). Foram determinados
aspartato-aminotransferase (AST), alanina-aminotransferase (ALT), uréia,
creatinina, proteína C-reativa (PCR) e leucograma. Ureia e creatinina como
indicadores de função renal e filtração glomerular. A PCR foi dosada pelo
método da nefelometria.
Imagens de fluorescência pulmonar.
Imediatamente após a coleta de sangue, com os animais ainda
anestesiados, foi feita injeção i.v. de indocianina verde (ICV) 10mg/Kg,
(Ophthalmos, São Paulo Brasil). Dez minutos após a injeção, os pulmões e a
traqueia foram retiratos, atingindo a eutanásia dos ratos. As imagens ópticas
foram obtidas usando o equipamento InVivo FX para fluorescência (Carestream
Molecular Imaging, USA). Filtros de excitação e de emissão foram fixados em
710 nm e 700 nm, respectivamente. Os pulmões foram colocados na câmara
de imagem do equipamento. Um protocolo de imagenologia (tempo de
exposição de 20 segundos, binning 2x2, f-stop 2.8, campo de visão 120 mm, e
plano focal 10 mm) foi mantido para todos os exames, e as imagens foram
feitas comparando grupos. As imagens ópticas do estudo ex vivo foram
avaliadas qualitativamente através da avaliação da presença ou ausência de
28
fluorescência na região dos pulmões inflamados, comparando apenas o grupo
CW + Na 3% + sinvastatina com a fluorescência do grupo tratado com solução
salina 0,9%. A análise quantitativa dos exames pulmonares foi realizada por
medição da intensidade de sinal de fluorescência (SI) dos pulmões, utilizando o
software Kodak Molecular 5.0.
Uma região de interesse criada por uma ferramenta automatizada foi
determinada em torno do órgão. As intensidades de sinal de interesse foram
expressas como fluorescência arbitrária em pixels. Fluorescência em tons de
cinza foram coloridos via software para fins de quantificação de acordo com
uma escala de cores definida com os maiores e menores níveis de intensidade
de fluorescência média (vermelho - intensidade máxima e roxo intensidade
luminosa mínima, respectivamente). Os alvos eram foco séptico e inflamação
nos pulmões.
Avaliação Histológica de Lesão Pulmonar
Os pulmões foram retirados e imersos em formalina tamponada 10%
durante 48 horas, sendo em seguida embebidos em parafina. Seções de 4µm
foram corados com hematoxilina e eosina. A arquitetura pulmonar foi avaliada
por microscopia óptica com microscópio BX50 equipado com câmera digital
DS30 (Olympus, Japan). Duas secções de tecido aleatórias de quatro
diferentes pulmões em cada grupo foram examinadas por um investigador sem
conhecimento prévio dos grupos.
Os escores de lesão pulmonar foram quantificados de acordo com os
critérios usados por Matute-Bello et al, que estabelecem valores totais entre 0 e
1 (Tabela 1)29.
29
Tabela 1 – Sistema de avaliação de lesão pulmonar (adaptado de Matute-Bello
at al). De acordo com a American Thoracic Society29.
Parâmetro Escore por campo
0 1 2
a.Neutrófilos no espaço alveolar Nenhum 1-5 >5
b. Neutrófilos no espaço intersticial Nenhum 1-5 >5
c. Membranas hialinas Nenhum 1 >1
d. Debris proteináceos enchendo os
espaços aéreos
Nenhum 1 >1
e. Espessamento do septo alveolar Nenhum 2x – 4x >4x
Escore = [(20 x A) + (14 x B) + (7 x C) + (7 x D) + (2 x E)]/(número de campos
x 100)
Análise Estatística
Os dados foram armazenados e analisados estatisticamente através do
software SPSS 17.0 and GraphPad Prism® 7.00 for Windows, GraphPad
Software, La Jolla, Califórnia, EUA, www.graphpad.com. Os resultados dos
parâmetros analisados foram confrontados estatisticamente empregando-se o
método de comparações múltiplas, pela análise de variância (ANOVA) com
medidas repetidas, seguido dos testes de Tukey ou do teste t de Student para
comparação entre grupos. Os resultados foram considerados estatisticamente
significativos quando p<0,05.
RESULTADOS
Um rato do grupo salina morreu durante os experimentos. Todos os
outros animais sobreviveram. A administração de água de coco + NaCl 3% +
sinvastatina evitou diversas reações clínicas adversas após a indução da
sepse. Para investigar esses efeitos, avaliamos o efeito da associação de água
de coco + NaCl 3% + sinvastatina na da sepse/choque, usando escores
clínicos. Seis horas após a LPC, os ratos apresentaram sinais clínicos
evidentes de sepse, e a maioria dos animais do grupo sepse teve sepse grave.
A associação de água de coco + NaCl 3% + sinvastatina reduziu o escore
30
clínico 18 horas após LPC, melhorando o estado clínico desses animais (As
médias destes dados estão resumidos na Fig. 1)
S a line 0
,9%
CW
+ Na 3 %
CW
+ Na 3 %
+ S imv a s ta
tin CW
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
Cli
nic
al
sc
ore
24
h a
fte
r
M i ld S e p s is
M o d e ra te S e p s is
S e v e re S e p s is
***# #
Figura 1 – Resultados da pontuação clínica dos animais, segundo os grupos de tratamentos. *p<0,05 quando comparado com CW+Na3%+sinvastatina; **p<0,01 quando comparado com CW+Na3%+sinvastatina; ##p<0,01 quando comparado com CW+Na3%+sinvastatina.
Os níveis séricos das citocinas inflamatórias TNF-α e IL-1β fora
medidos em todos os grupos. Os valores encontrados foram menores nos
animais do grupo tratado com água de coco + NaCl3%, associada a
sinvastatina. Embora todos os grupos tenham mostraram uma diferença
significativa (p<0,05) em comparação com o grupo cujos animais foram
tratados com solução salina, os melhores resultados foram encontrados nos
animais com reposição volêmica através de água de coco + NaCl 3%,
associada a sinvastatina (Tabela 2). Mais estudos nesta área são necessários
para decifrar o mecanismo dessa questão em particular.
31
Tabela 2 – Dosagem de interleucinas nos animais submetidos a choque hipovolêmico e sepse abdominal.
Citocinas Grupos Reposição
TNF (pg/ml) IL-1 (pg/ml)
Salina 0,9% 545.5±36ab 174.9±16a
AC Na3% 364.8±42ab 86.2±12a
ACNa3%S 181.7±16.1b 48.1±8a
AC 210.1±14.5a 70.3±5a
*Média Desvio Padrão. (1) Medidas seguidas de mesma letra diferem entre si significativamente ao nível de 5% de probabilidade pelo teste t de Tukey. AC, água de coco. TNF, fator de necrose tumoral; IL, interleucina.
Quanto às dosagens bioquímicas, o tratamento dos animais com a
associação água de coco com Na3% e sinvastatina, teve os mais baixos níveis
de proteína C-reativa, AST, ALT, uréia e creatinina, com diferenças
estatisticamente significativas, comparando com os demais grupos (tabela 3).
O mesmo ocorreu com a leucometria, onde os valores de leucócitos
totais e neutrófilos dos animais tratados com água de coco + Na3%, associada
a sinvastatina, mostraram-se significativamente abaixo dos valores dos demais
grupos. Entretanto, como se observa na tabela 4, o percentual de eosinófilos foi
significativamente mais elevado nos ratos tratados com esta associação
(p<0,05).
32
Tabela 3 – Dosagens bioquímicas nos animais submetidos a choque hipovolêmico e sepse abdominal.
Bioquímica Grupos Reposição
Proteína C-reativa (mg/dl)
AST (mg/dl)
ALT (mg/dl)
Uréia (mg/dl)
Creatinina (mg/dl)
Salina 0,9% 9.40 2.2ab
55,2±6,2ab 62,5±4,9a 76,8±4,9ab 3,78±0,5ab
AC Na3% 4.72 0.39a
39,5±9,3a 39,3±5,7a 47,1±3,4a 2,64±0,6a
ACNa3%S 2.72 0.46ab
32,1±2,4ab 26,5±2,6a 35,3±2,9ab 1,36±0,2ab
AC 4.45 0.57b
42,1±7,4b 36,5±2,6a 45,3±4,0b 2,86±0,3b
*Média Desvio Padrão. (1) Medidas comparativas entre grupos, seguidas de mesma letra, diferem significativamente entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. AC – água de coco; Na – sódio; S – sinvastatina; AST – aspartato aminotransferase; ALT – alanina aminotransferase.
Tabela 4 – Leucometria total, neutrófilos, linfócitos e eosinófilos nos animais submetidos a choque hipovolêmico e sepse abdominal.
Leucócitos Grupos Reposição
Leucócitos/µL) Neutrófilos (%) Eosinófilos(%)
Saline 0,9% 12.46 1.26ab 77.37 6.4ab 0.39 0.4a
AC Na3% 8.72 0.39a 54.50 7.0a 4.57 0.5a
ACNa3%S 6.68 0.56a 47.17 6.6ab 5.41 0.6a
AC 8.32 0.53b 57.10 8.5b 3.68 0.7a
*Média Desvio Padrão. (1) Medidas seguidas de mesma letra diferem entre si significativamente ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. AC – água de coco.
33
Figura 2 – Comparação entre grupos A expressão do marcador de fluorescência foi mais intensa após injeção i.v. da indocianina verde nos animais tratados com salina (A,B,C) quando comparado com os ratos do grupo tratado com água de coco +NaCl3% + sinvastatina (D,E,F). A intensidade dos finais de fluorescência foi mais pronunciada no pulmão direito.
Tabela 5 – Intensidade do sinal de fluorescência após injeção intravenosa de indocianina verde (10 mg/kg).
Grupos
Intensidade do sinal
Salina 0,9% 230±12.1a
AC Na3% S 117±8.3a
*Média Desvio Padrão. (1) Medidas comparativas entre grupos, seguidas de mesma letra, diferem significativamente entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste t. AC – água de coco; S – sinvastatina.
A intensidade do sinal (IS) de fluorescência dos pulmões foi medida nos
animais dos grupos salina e água de coco NaCl3% + simvastatina. As imagens
foram significativamente mais intensas nos pulmões dos animais do grupo
salina em comparação com os animais do grupo água de coco NaCl3% +
sinvastatina, como demonstrado na figura 2. A Tabela 5 mostra que os
correspondentes dados quantitativos da intensidade dos sinais fluorescentes
dos pulmões dos animais do grupo salina foram significativamente mais
elevados, em comparação com o grupo água de coco NaCl3% + sinvastatina
A B C
D F E
34
10 minutos após a injecção intravenosa de 10 mg / kg de indometacina verde
(p<0,05).
Análise histopatológica
Como mostrado na Figura 3, alterações histopatológicas e lesões
pulmonares foram evidentes nos tecidos dos pulmões de ratos após indução de
sepse por LPC e choque hemorrágico. A análise por microscopia ótica de
tecidos pulmonares de animais tratados com solução salina a 0,9%
apresentaram espessamento do septo alveolar com aumento da celularidade.
Estes animais desenvolveram aumento no número de neutrófilos,
mononucleares e células intersticiais no septo alveolar. Edema alveolar esteve
também presente nos pulmões deste grupo. No grupo de animais tratados com
água de coco + NaCl3% + sinvastatina ficou evidente que o dano histológico e
a infiltração de leucócitos foram significativamente menores. Não houve um
aumento do número de neutrófilos no septo alveolar, e de edema nos espaços
alveolares (Figura 3), resultando em escore histopatológico significativamente
menor do que nos grupos salina e água de coco (AC). Os escores
histopatológicos referentes a todos os grupos estudados estão resumidos na
Tabela 6.
35
Figura 3 – Seleção de imagens representativas coradas em hematoxilina e eosina da histopatologia de pulmões de ratos tratados com salina (A, B) ou com água de coco + NaCl 3% + sinvastatina (C, D). Número significativamente maior de neutrófilos, mononucleares e células intersticiais nos espaços alveolar e intersticial, espessamento do septo alveolar e aumento de celularidade em A, B, comparado com C,D. Aumento 200X.
Tabela 6 – Escores histopatológicos.
Grupos Escores
Salina 0,9% 0.78±0.04ab
AC Na3% 0.30±0.02b
AC Na3%S 0.23±0.01a
AC 0.51±0.04ab
*Média Desvio Padrão. (1) Medidas comparativas entre grupos, seguidas de mesma letra, diferem significativamente entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. AC, água de coco; Na, sódio; S, sinvastatina.
A B
C D
36
DISCUSSÃO
Está bem estabelecido que o choque hemorrágico causa danos aos
tecidos e aumenta a hipóxia e a atividade pro-inflamatória. Uma ressuscitação
rápida com fluidos adequados é essencial para minimizar esses danos e
melhorar a perfusão tecidual. O presente estudo examinou uma alternativa
para reduzir o dano causado pela hipovolemia usando água de coco normal e
modificada com Na 3%, que mostrou resultados positivos em comparação com
a ressuscitação com solução salina a 0,9%. No presente estudo, comparamos
os efeitos de solução salina 0,9%, água de coco modificada (Na 3%) e água de
coco + Na 3%+ simvastatina e água de coco normal, em parâmetros
laboratoriais como citocinas séricas, dosagens bioquímicas e contagem de
leucócitos, em modelo experimental de choque hemorrágico associado com
sepse abdominal. Modelos experimentais de sepse e choque hemorrágico têm
sido estudados isoladamente em outros estudos30-32.
Do ponto de vista molecular, a água de coco demonstrou ter efeito na
regulação da resposta inflamatória através da expressão sérica de TNF-a e IL-
1β. Isto é parti ular ente importante, uma vez que não existem estudos até
agora, considerando o papel da água de coco i.v na resposta de citocinas após
indução de choque e sepse simultâneos. A este respeito portanto, esta é a
primeira vez que foi demonstrada uma resposta da associação do tratamento
i.v. com sinvastatina adicionada à água de coco em choque hemorrágico +
sepse. No presente trabalho a resposta das citocinas TNF-α e IL-1β foi
significativamente menor do que nos controles.
O TNF-α é onsi erado o principal agente inflamatório em casos de
choque hemorrágico e desempenha um papel crucial na liberação de outras
citocinas pró-infamatórias (IL-1β, IL-6), levando a excesso de inflamação e
autodestruição celular33. Farias et al.34 demonstraram uma redução
estatisticamente significativa na expressão de citocinas pró-inflamatórias em
ratos chocados, tratados por reposição sanguínea com água de coco, em
comparação com solução salina e sangue fresco. No presente estudo,
demonstramos que o tratamento de ratos com sepse e choque hemorrágico
com água de coco modificada com sódio 3% + sinvastatina reduziu
37
significativamente os níveis de citocinas séricas, parâmetros bioquímicos e
leucócitos periféricos. Essa redução foi maior do que após tratamentos com
outros fluidos de reposição volêmica.
A sinvastatina tem mostrado efeitos imunomoduladores independentes
da ação de redução significativa da hiperlipidemia, finalidade original para a
qual esta droga foi inicialmente desenvolvida35. Esses efeitos, denominados
pleiotrópicos, incluem ação anti-inflamatória36, melhora na função endotelial e
microvascular, na isquemia/reperfusão37 e na sepse38. Com todas essas
propriedades, a sinvastatina atuou sinergicamente com a AC para melhorar os
parâmetros estudados em ratos com choque hemorrágico e sepse simultânea.
Neste estudo, usamos sinvastatina sob a forma de microemulsão intravenosa,
com base no fato de que esta apresentação, desenvolvida no Laboratório de
Sistemas Dispersos da UFRN, tem partículas em escala nanométrica, com
potencial para uso i.v. sem efeitos adversos. Os resultados obtidos neste
estudo com a infusão i.v. de AC provavelmente estão relacionados às suas
propriedades físico-químicas. Alguns estudos têm demonstrado evidências
científicas de uso de água de coco na prática médica, justificada pelo seu
conteúdo de açúcares, vitaminas, minerais, aminoácidos, ácidos orgânicos e
ácidos graxos39. Além disso, a AC tem uma quantidade significativa de
antioxidantes14,15 que protegem o organismo contra o estresse oxidativo, no
presente modelo representado pela hipóxia inerente ao choque hemorrágico16.
A indocianina verde (ICV) tem sido amplamente utilizada por décadas na
oftalmologia para imagens de retina e na cardiologia para estudo do débito
cardíaco. A ICV tem um bem documentado perfil de uso com segurança40,41.
No presente estudo utilizamos uma dose mais elevada de ICV para roedores
comparado com o descrito para pacientes, com o objetivo de compensar a
meia-vida curta no sangue de ratos (1,5 - 2,3 min) em comparação com
pacientes (3-4 min) 42,43. A dose utilizada de ICV proporcionou um contraste
prolongado e permitiu imagens fluorescentes em pulmões sem Injeção de dose
adicional.
Nossos resultados mostraram que os tecidos pulmonares inflamados e
normais diferiram significativamente da fluorescência dos controles. Com base
38
no comportamento da intensidade de fluorescência nos diferentes grupos de
ratos com sepse, é provável que a vasodilatação nos pulmões inflamados e
microvasos neoformados levaram a uma rápida entrada do agente de contraste
ICV nos tecidos pulmonares. A imagem de fluorescência é limitada a órgãos e
tecidos superficiais, porque a forte dispersão e a absorção de luz no tecido
biológico restringe a profundidade de penetração de fótons para alguns
milímetros. Como a fluorescência não foi detectável com o nosso equipamento
em pulmões de ratos in vivo, decidimos realizar imagens ex vivo e imagens
representativas foram obtidas e gravadas em pulmões afetados. Uma maneira
de melhorar ainda mais a especificidade deste método seria usar agentes de
contraste específicos para a doença em combinação com um marcador para
neovascularização.
Conclusão
A substituição do volume com água de coco modificada com Na 3%,
combinada com sinvastatina i.v. teve uma influência positiva no tratamento de
ratos com modelo de sepse + choque hemorrágico. Os achados podem ter
significativas implicações terapêuticas na área clínica e futuros estudos são
necessários para comprovação.
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6-73.
44
Correspondência:
Aldo Cunha Medeiros
Avenida Nilo Peçanha, 620
59012-300 Natal – RN Brasil
Recebido: 15 de agosto, 2016
Revisto: 17 de outubro, 2016
Aceito: 18 de novembro, 2016
Conflito de interesse: nenhum
Fonte de financiamento: CNPq (Grant 4449083/2014-4)
1.Pesquisa realizada no Núcleo de Cirurgia Experimental, Departamento de
Cirurgia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Brasil.
Parte de tese de doutorado, Programa de Pós-graduação em Ciências da
Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Aldo Cunha Medeiros.
45
6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES/CONCLUSÕES
Os objetivos traçados durante o anteprojeto foram satisfatoriamente
atingidos durante a execução deste trabalho experimental. O modelo
desenhado correspondeu às expectativas, sendo capaz de produzir dados que
podem ser úteis para o tratamento de choque séptico. Apesar de terem sido
gerados em estudo de pesquisa básica em animais, podem ter implicações
clínicas futuras. A análise estatística dos dados obtidos mostrou-se adequada
como instrumento auxiliar na interpretação dos achados deste estudo.
Justificativa para o uso de solução de água de coco com cloreto de
sódio 3%:
Uma estratégia de ressuscitação de indivíduos com choque
hemorrágico com pequenos volumes de líquidos modula a resposta
inflamatória e diminui o dano aos órgãos vitais após o uso de solução salina
hipertônica43. Solução salina hipertônica a 3% fornece efeitos
imunomoduladores e metabólicos semelhantes aos observados com
concentrações de solução salina hipertônica 7,5%. A solução salina hipertônica
a 7,5% de NaCl tem sido amplamente estudada e tem mostrado vários
benefícios sobre o padrão de atendimento com solução salina convencional
0,9%. Além da melhoria significativa no fluxo sanguíneo sistêmico e
microcirculatório, pequeno volume de líquidos hipertônicos na reposição
volêmica atenua a marginação de neutrófilos, diminui a lesão pulmonar e a
translocação bacteriana, e reverte a disfunção imune celular que ocorre após
hemorragia em casos de choque43,44
Apesar dos potenciais efeitos salutares da solução salina hipertônica a
7.5% no tratamento do choque hemorrágico, esta solução não tem aprovação
para uso clínico nos Estados Unidos e Canadá, como também no nosso país.
Por outro lado, a solução salina hipertônica 3% (SSH 3%) é aprovada pelo
Food and Drug Administration-USA para terapia do choque e hiponatremia
grave. Além disso, tem sido utilizada com bons resultados no tratamento de
hipertensão intracraniana refratária em pacientes com traumatismo craniano50-
52.
46
Com base nestas observações, especulamos no nosso estudo se a
água de coco modificada com sódio 3% poderia ser eficaz na ressuscitação de
animais com choque hemorrágico. Neste estudo, nós avaliamos o potencial
hemodinâmico, metabólico e imunomodulador nos benefícios do tratamento de
ratos Wistar com SSH 3% + água de coco + sinvastatina. Este tratamento foi
comparado com solução salina convencional 0,9%, água de coco + SSH 3% e
água de coco não modificada. Além disso, procuramos determinar se havia
diferença entre os tratamentos acima descritos no comportamento clínico dos
animais. Ficou comprovado que o tratamento que associou SSH 3% + água de
coco + sinvastatina foi mais eficaz do que os demais do ponto de vista clínico,
imunológico e metabólico. Nossos resultados estão de acordo com os
observados em outros estudos, que não associaram a sinvastatina como
imunomoduladora53.
Com a realização de um estudo piloto, foi possível detectar algumas
imperfeições e fazer ajustes na metodologia, especialmente na realização dos
exames de imagem de fluorescência. Inicialmente foi tentado o exame in vivo,
porém, a capacidade de penetração da fluorescência através da parede
torácica mostrou-se limitada, tornando impossível a visualização dos pulmões
por este método. Consequentemente, os exames de fluorescência para testar o
grau de comprometimento pulmonar foram realizados ex vivo. A detecção
dessa variável só foi possível devido à realização do estudo piloto, reforçando a
sua importância em projetos experimentais dentro desta linha de pesquisa.
Deve-se ressaltar o esforço dispendido na realização deste trabalho e
da publicação gerada a partir dele, uma vez que o modelo experimental de
choque hipovolêmico requer perícia técnica para monitorizar e manter os
animais vivos durante o experimento. Destaca-se também a área técnica na
realização e interpretação dos exames de dosagens, histopatologia e
estatística, que foram fundamentais para o bom termo do trabalho.
Pesquisa por nós realizada nos bancos de dados do Pubmed, Web of
Sciences e Scielo apontou para a inexistência de trabalhos publicados com o
mesmo objetivo, utilizando a água de coco modificada ou não para uso
intravenoso, além da associação com sinvastatina intravenosa, especialmente
47
no modelo experimental de choque hemorrágico e sepse. Tal fato nos deixa
confiantes de que produzimos contribuição relevante para o estudo e
tratamento de problema grave como é o choque hemorrágico associado à
sepse, comum na prática clínica. Esse trabalho foi recentemente publicado,
documentando a originalidade do mesmo na nossa linha de pesquisa.
Esta pesquisa demonstra a real importância da Academia no sentido
de elaborar perguntas relevantes e procurar respondê-las nas bancadas dos
laboratórios da melhor maneira possível, apesar das limitações de recursos.
A experiência vivenciada no Curso de Doutorado foi de grande
importância para a aquisição de conhecimentos que puderam contribuir para o
desenvolvimento do estudo e de outros modelos experimentais em outras
pesquisas, bem como avançar nesse mesmo modelo, para a verificação de
outros resultados. Uma das maiores preocupações foi tentar evitar riscos,
buscando seguir rigorosamente o protocolo metodológico, dessa forma
permitindo a reprodutibilidade integral de nosso estudo pela comunidade
científica, objetivando estimular a obtenção de outros resultados que tragam
maiores contribuições ao meio acadêmico no tema choque e sepse.
Alguns aspectos do nosso trabalho são fontes de motivação para a
ampliação da investigação: incluir nos futuros trabalhos a repercussão do
tratamento em outros órgãos vitais, dar ênfase à imunohistoquímica, outros
marcadores bioquímicos e imunológicos para choque e sepse, bem como
exames de imagem no nível molecular.
O indiscutível crescimento intelectual daqueles que se acharam
envolvidos na execução deste trabalho, como é o meu caso, serviu de
recompensa ao esforço desprendido e atuou como norte, ampliando horizontes
para que esta linha de pesquisa se consolide ainda mais, vinculada ao Núcleo
de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia-UFRN e ao Programa
de Pós-graduação em Ciências da Saúde.
Durante o período de quatro anos foram publicados 05 artigos
científicos, em periódicos indexados, o que contribuiu para o enriquecimento
intelectual da autora do ponto de vista crítico e científico, correspondendo às
48
expectativas e tornando possível o cumprimento do cronograma previamente
estabelecido.
Conclui-se, então, que este trabalho contribuiu para evidenciar novos
conhecimentos a respeito da reposição volêmica e ressuscitação de ratos
Wistar no modelo experimental utilizado, com perspectivas do uso clínico de
soluções à base de água de coco modificada. Adicionalmente, o Programa de
Pós-Graduação de Ciências da Saúde cumpriu sua missão de contribuir
substancialmente com a formação da autora.
49
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ANEXOS
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![Sepse neonatal [Modo de Compatibilidade] · há decréscimo na mortalidade quando usado em pré-termos com suspeita de sepse 3 estudos com pacientes com sepse comprovada associada](https://static.fdocumentos.tips/doc/165x107/5f9a0b704ec740525d396be0/sepse-neonatal-modo-de-compatibilidade-h-decrscimo-na-mortalidade-quando-usado.jpg)
