Minicurso Técnicas de Sequenciamento e suas Aplicações
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TÉCNICAS DE SEQUENCIAM
ENTO E APLICAÇÕES
Lucélia Silva BarrosoBacharel em Fisioterapia – FAP
Laboratório de Microbiologia – HC – UFMGMembro do LINC – INCT MM – FM - UFMG
Ana Paula Mendes SilvaBacharel em Ciências Biológicas – UFV
Mestre em Genética – USPDoutoranda em Medicina Molecular – UFMG
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• Definir o que é sequenciamento;
• Quais as aplicações dessa técnica;
• Quais as Plataformas disponíveis;• Diferenças metodológicas,• Vantagens e desvantagens.
• Perspectivas futuras
Objetivos do Minicurso
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DNA
mRNA
Proteínas
Variação Normal ou Patológica
DOGMA CENTRAL
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Cromatina
mRNA ncRNA
Proteínas
Variação Normal ou PatológicaAmbiente
Variação em seqüência Variação estrutural Variação química na cromatina
Epigenômica
Genômica
Transcritômica
Proteômica
DOGMA CENTRAL
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• Processo de determinação da ordem precisa de nucleotídeos na molécula de DNA, RNA e outras moléculas;
• Determina a ordem das bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina, Timina e Uracila,
• Visa o entendimento do dogma central e a previsão das moléculas possivelmente formadas a partir de determinada sequência.
Sequenciamento de DNA
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Objetivos para sequenciamento genômico
Exemplo
Sequenciamento de novo
Sequenciamento genômico
Sequenciamento de >1000 genomas de influenza
DNA de org. extinto Homo neanderthalenses
Metagenômica Intestino humano
Resequencia-mento
Genomas completos Indivíduos humanos
Regiões genômicas Detecção de rearranjos ou regiões associados à doenças
Mutações somáticas Em câncer
Transcriptoma mRNA Definir regulação da transcrição
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)
RNAs não codificadores Identificar e quantificar microRNAs
Epigenética Padrão de Metilação Avaliar padrão de metilação em câncer
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ESTUDO DE CASO 1
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Esse casal de albinos poderia ter um filho com
melanina (normal)?
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X1 X2
S1 S2 S3
PAI MÃE
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ESTUDO DE CASO 2
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Megaureter Família Modelo: Pai saudável, Mãe
saudável, filhos gêmeos monozigóticos (um saudável e um doente)
Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar o fenótipo da doença.
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Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar o fenótipo da doença.
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ESTUDO DE CASO 3
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1985 Inglaterra Numa pequena cidade localizada entre
montanhas estava acontecendo uma série de estupros e assassinatos de mulheres
Qual análise inicial poderia ser feita?
- Coleta e análise do DNA do esperma - Comparação entre os DNAs dos espermas de
cada assassinato
• As autoridades locais simularam uma doação de sangue -> identificar o agressor.
Todos os habitantes doaram, e apenas um deles possuía o DNA igual ao do estuprador.
Estupro e assassinato
Amabis & Martho, 1995<==?
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PLATAFORMAS
Genetic Analyser 3130
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PCR
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
https://www.youtube.com/watch?v=kvQWKcMdyS4
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Gene TBX3
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Gene LDB3
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MÉTODO SANGER
Prêmio Nobel 1980
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Amplificação do fragmento alvo por PCR
Purificação do produto
Reação de Sequenciamento
Purificação do produto
MÉTODO DE SANGER
Obtenção da sequência do fragmento desejado
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MÉTODO DE SANGER
PCR
Sequenciamento
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MÉTODO SANGER
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MÉTODO SANGER-MANUAL-
• DNA molde + dNTPs e
ddNTPs + DNApolimerase +
Primer
• Amplificação - PCR
• Eletroforese em gel de
acrilamida
• Os fragmentos migram
distâncias proporcionais ao
seu tamanho.http://www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Atividades%20on-line&tabela=atividades
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Reads longos (~900bps)
- Baixo Rendimento - Alto Custo
MÉTODO SANGER-MANUAL-
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MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
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MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
http://www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Atividades%20on-line&tabela=atividades
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Norm
aliz
ed F
luore
scence
Em
issi
on
(Exc
itati
on a
t 48
8 n
m)
Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
500 550 600 650 700
Wavelength (nm)
MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
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MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
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MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
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MÉTODO SANGER-AUTOMÁTICO-
![Page 31: Minicurso Técnicas de Sequenciamento e suas Aplicações](https://reader031.fdocumentos.tips/reader031/viewer/2022013105/55d750ffbb61eb2f708b466e/html5/thumbnails/31.jpg)
Genomas sequenciados (outubro/2014)Eucariotos: 21 completes, 1701 em progresso
Procariotos: 3227completo, 25252 em progresso
Virus: 4127 completes, 94 em progresso
Organellar: 5039 completos
195
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NATURE Vol 464 1 April 2010
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2001: Human Genome Project2.7G$, 11 years
2001: Celera100M$, 3 years
2007: 4541M$, 3 months
2008: ABI SOLiD60K$, 2 weeks
2009: Illumina, Helicos40-50K$
2010: 5K$, a few days?
2012: 1000$, <24 hrs?
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Next Gen X Sanger
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2ª Geração de Sequenciamento • 454 - Pirosequenciamento (Roche)
• •Genome Analyser - Seqüenciamento por término reversível (Illumina-Solexa)
• SOLiD - Seqüenciamento por ligação de sondas (Applied Biosystems - Life)
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• Comercializada em 2004
Pirosequenciamento – 454/Roche
• Etapas:- Ligação de adaptadores
- PCR em emulsão
- Seqüenciamento
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Pirosequenciamento – 454/Roche
![Page 38: Minicurso Técnicas de Sequenciamento e suas Aplicações](https://reader031.fdocumentos.tips/reader031/viewer/2022013105/55d750ffbb61eb2f708b466e/html5/thumbnails/38.jpg)
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*dNTP – só um deles
Pirosequenciamento – 454/Roche
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Resultado
Pirosequenciamento – 454/Roche
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HiSeq 2000Illumina (Solexa)
Produz acima de 600Gb por corrida em 13 dias. Custo de resequenciar um genoma humano: UNC-CH Genome Analysis Facilit - (30x cobertura) aproximadamente $6,000
MiSeq Sistema de
pequena capacidade,
Estudo metagenômico,
PE 2x250cycles in 27hours.
https://www.youtube.com/watch?v=l99aKKHcxC4
https://www.youtube.com/watch?v=1uZtCMY-yEw
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• Data de comercialização = 2007
• Etapas:1)Ligação de adaptadores2)PCR em emulsão3)Seqüenciamento
Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD)
• SOLiD = Sequencing by Oligo Ligation and Detection
https://www.youtube.com/watch?v=nlvyF8bFDwM
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Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD)
![Page 45: Minicurso Técnicas de Sequenciamento e suas Aplicações](https://reader031.fdocumentos.tips/reader031/viewer/2022013105/55d750ffbb61eb2f708b466e/html5/thumbnails/45.jpg)
Ion Torrent (life technologies)Tamanho do read -
200-250bp (200cycles)
Não realiza leitura Paired End
Sequenciamento mais rápido do mercado.Recommendações: Amplicons
(produtos de PCR), Genomas de
tamanho pequeno a médio.
4ª Geração de Sequenciamento
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Genoma humano em 1 dia
Custo de reagents por corrida - $1000
Taxa de erro em torno de 1.2%
RNAseq, ChIPseq Ion Proton Chip I –
10 Gb Ion Proton Chip II –
100 Gb
Ion Proton System (life technologies)
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Plataform
a
Tamanho do
read
Tempo de
corrida
Gb/corrid
a
Vantagens
Desvantagens
SAGE 900 pb 1 – 2 dias
0.02 Read longo
Alta taxa de erro
454 500 pb 8 horas
0.04 Read longo
Alta taxa de erro
HiSeq
75-100 2 dias 600 Sequenciamento profundo/custo
Reads pequenos
MiSeq
75 1 dia 2 Sequenciamento profundo/custo
Reads pequenos
Solid 85 8 dias 150 Baixa taxa de erro
Reads pequenosCorrida longa
Ion Torrent
200 2 horas
100 Corrida rápida
Novo*
Ion Proton
200 2horas
100 Corrida rápida
Novo*
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![Page 49: Minicurso Técnicas de Sequenciamento e suas Aplicações](https://reader031.fdocumentos.tips/reader031/viewer/2022013105/55d750ffbb61eb2f708b466e/html5/thumbnails/49.jpg)
![Page 50: Minicurso Técnicas de Sequenciamento e suas Aplicações](https://reader031.fdocumentos.tips/reader031/viewer/2022013105/55d750ffbb61eb2f708b466e/html5/thumbnails/50.jpg)
“ Só os que se arriscam a
ir longe demais são
capazes de descobrir o
quão longe se pode ir. ”
T. S.
Eliot