"Metodologias inovadoras para ensaios diagnósticos"

Alexandre Dias T. Costa

Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP/FIOCRUZ-PR)Instituto Carlos Chagas (ICC/FIOCRUZ-PR)

O que são testes de diagnóstico?

• ferramentas auxiliares no diagnóstico

• acompanhamento de uma determinada condição ou

tratamento

• podem ser físicos, psicológicos ou (bio)químicos

O que são testes de diagnóstico?

Objeto da palestra:

Mostrar a evolução das técnicas de diagnóstico, desde

os primeiros testes de detecção imunológica até as mais

novas ferramentas de biologia molecular. Serão também

abordadas as diferentes capacidades de paralelização e

de processividade de amostras, tanto dos diferentes

testes existentes no mercado como dos testes

atualmente em desenvolvimento no Brasil e no mundo.

O passado (mas nem tanto...)

Testes tipo ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)

� criados na década de 60 como alternativa aos métodos então

existentes (radioativos)

� tipos: “indireto”, sanduíche, competitivo

� extremamente versáteis com relação ao tipo de amostra

(sangue/soro, urina, saliva, ou outros fluidos)

ELISA “indireto”

ELISA sanduíche

ELISA competitivo

Usos atuais

� diversas doenças

� gravidez (HCG)

� contaminantes em alimentos

� contaminantes ambientais

O presente

Novas plataformas e melhoria das plataformas existentes

Demanda x Tecnologia

Testes de Fluxo Lateral

Teste rápido para Dengue

� Detecção do vírus (proteína NS1):

� Glicoproteína viral presente nos pacientes infectados do primeiro

ao nono dia após a infecção;

� Detecção de anticorpos específicos contra o vírus:

� IgM: 5 a 10 dias após o aparecimento dos sintomas em infecções

primárias (4 a 5 dias em infecções secundárias);

� IgG: após 14 dia do aparecimento dos sintomas;

Mas…(Sempre tem um “mas”)

Testes tipo ELISA detectam antígenos

ou anticorpos

Problemas com a janela imunológica…

Problemas com a janela imunológica…

Qual a

opção????

Detectar o patógeno!

Como fazer para detectar o ácido nucleico do agente

infeccioso?

DICA: a metodologia tem que ser sensível, reprodutível,

específica, precisa, simples, rápida, com grande

capacidade de processamento e possibilidade de

automação.

A solução é detectar o ácido nucléico

do agente infeccioso

PCR: Reação em cadeia da polimerase

Ao final de 35 ciclos, teremos mais de

1,5 bilhão de cópias do DNA alvo original

PCR convencional x PCR em tempo real

• Convencional

• Um par de iniciadores

• Análise por eletroforese em

gel

• Possibilidade de

contaminação

• Tempo real

• Um par de iniciadores

• Presença de uma sonda

• Detecção simultânea à

amplificação

• Não existe a necessidade de se

abrir o tubo para análise

• Análise quantitativa

Projeto NAT HIV/HCV brasileiro

CNPSH/MS

Pooling + PCR Setup

cDNA + PCR DetecçãoExtração RNA

One Source

Influenza A(H1N1)• 2009: Teste fornecido pelo CDC (Center for Disease Control and

Prevention);

• Disponibilidade limitada;

• Problemas de importação;

• Problemas de especificidade;

• Problemas de processividade;

• 2010: Produção completa do kit Influenza A(H1N1) pelo IBMP;

• Melhoria do produto: reação duplex

Demanda x Tecnologia

O futuro

Multitestes

Alta processividade

Point-of-care

Microarranjo (Biochips)

• Arranjo pré-definido de moléculas de DNA;

• Moléculas ligadas a uma superfície;

• Detecção e quantificação de ácidos nucleicos (RNAm na

forma de cDNA ou DNA genômico);

• Amostras são "marcadas" com fluorocromos;

• Leitores a laser;

Microarranjo Líquido - Luminex

Multiteste para Hemorrede

Inte

rnal

…

Chag

as…

HB

V A

g1

HC

V A

g1

HC

V A

g2

HIV

Ag

1

HIV

Ag

2

HT

LV

…

HT

LV

…

HT

LV

…

HT

LV

2…

Sy

phil

is…

Sy

phil

is…

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

4b1

5b1

6b6

8b6

10b3

14b5

15b4

Pool 2

HCV Multitest – multitest typical resultInternal

ControlChagas Ag

1HBV Ag1

HCV Ag1

HCV Ag2

HIV Ag1

HIV Ag2

HTLV Ag1

HTLV Ag2

HTLV Ag3

HTLV2

Ag1Syphilis

Ag1Syphilis

Ag2

Multiteste prénatal

Alvos: AIDS, Hepatite B e C, Rubéola, Sífilis, Doença de Chagas e Toxoplasmose

Amostra

Bead ativada com antígeno Bead ativada com controle

Pad absorvente

Buffer

UV

Câmera

Buffer

PCR Lab-on-a-chip (LOC)

Projeto PODITRODI - visa o desenvolvimento de uma plataforma tecnológica

para diagnóstico no ponto de atendimento (point of care) para doenças tropicais,

integrando teste sorológico e molecular num único dispositivo.

DNA antibody

From Coura and Borges-Pereira, Acta Tropica, 2010

A inovação do PodiTrodi

A inovação do PodiTrodiAtualmente

• Três processos independentes:

• ELISA

• Extração do ácido nucléico

• qPCR• Equipamentos diferentes

• Semi automatizado

A Proposta

• Três processos sequenciais

automatizados, num único

equipamento portátil

Pooling + PCR Setup

Detecção por qPCR

Extração RNA

Cartucho para extração de ácidos nucléicos

(ENAS/Frauhnhofer)

Chagas

• duplex reaction

(target and internal

control)

• regular mastermix

• 1/3 of regular run

time (ABI7500)

• gelified mix

• template: DNA

• status: in final

stages of

development

Gelification� Gelification consists in a process in which the PCR reagents are stabilized

by the addition of gelifying and stabilizing agents

� Good alternative to reduce the cost of cold chain transport

� Turns the PCR procedure extremely simple and fast to execute

Chagas

• duplex reaction

(target and internal

control)

• regular mastermix

• 1/3 of regular run

time (ABI7500)

• gelified mix

• template: DNA

• status: in final

stages of

development

Sequenciamento de Terceira Geração

� Pirossequenciamento

� SOLiD (oligonucleotídeos)

� Illumina (corantes reversíveis)

� Ion Torrent (condutividade)

� Single molecule

� Vários outros...

- Alta processividade

- Baixo custo por sequência

- Rapidez na obtenção de

grande quantidade de

informações

Aplicações

� tipagem HLA: redução do tempo de análise e maior acurácia

� identificação de patógenos e resistência a drogas: UTI

� Farmacogenética: biomarcadores

� Padrões de metilação, epigenética, polimorfismos...

Diagnóstico através de NGS

Diagnóstico de doenças com NGS

Diagnóstico de doenças com NGS

Proteômica na busca por biomarcadores

� Diagnóstico mais precoce e acompanhamento mais refinado do tratamento, portanto melhor prognóstico.

BioMEMS (Biological MicroElectroMechanical Sensors)

BioMEMS refers to the science and technology of operating at the microscale for

biological and biomedical applications, which may or may not include any

electronic or mechanical functions.

[Steven S. Saliterman

(2006) Fundamentals of

bio-MEMS and medical

microdevices]

BioMEMS History• 60s/70s – initial studies on functionalization of micro scale structures to manipulate their

biological properties

• 60s/70s – Glucose monitors & home pregnancy tests

• 1990 – Manz and Widmer: µTAS

(micro total analysis system)

• 1991 – first oligonucleotide chip

• 1998 – first solid microneedles for drug delivery;

first continous-flow PCR chip

• 1999 – laminar flows in microchannels

Materials approaches• (glass)

• silicon

• plastics and polymers

• paper

Microfluidics

Lab on a Chip, 2011, 11: 1902

Current Opinion in Chemical Biology, 2012, 16: 243

DOI: 10.1515/bmt-2012-4425

Biosensors• Micromechanical

• Electrical and electrochemical

• Optical

Biosens. Bioelectron. 2010, 26:1460

Sens. Actuators A Phys. 2006, 125, 273

Sens. Actuators A Phys. 2007, 135, 315

Appl. Phys. Lett. 2013, 102: 143702

Biological chips• Oligonucleotide chips

• Microarrays

• PCR chips

Projeto Sepsis - desenvolver um método para captura dos

agentes infecciosos diretamente de amostras de sangue total

acoplado a um multiteste diagnóstico molecular rápido,

fundamentado no conceito Lab-On-Chip (LOC), para a

detecção e identificação desses patógenos e seus principais

mecanismos de resistência a antimicrobianos.

Silva et al., 2004

Sepse: síndrome de resposta inflamatória sistêmica desencadeada por um processo

de infecção generalizada, decorrente da invasão da corrente sanguínea por agentes

infecciosos.

BACTÉRIAS e FUNGOS

PRINCIPAL CAUSA DE MORTE EM UTI

Mo

rtal

idad

e (%

)

Adaptado de Siqueira-Batista et al.,2011

Ch

ance

de

So

bre

vivê

nci

a (%

)

Início do tratamento adequado

Adaptado de Kumar et al., 2006

Tubo para

hemocultura,

1915

Tubo para

hemocultura, século

21

Hemocultura: 100 anos

3 – 5 dias

50% negativo

7,6% / hr

OBJETIVO GERAL

ENRIQUECIMENTO DETECÇÃO e IDENTIFICAÇÃO

Captura Seletiva PCR-Array

Multiteste molecular

- Especificidade

- Sensibilidade

- Agilidade

Captura Seletiva

105 102 100M +

Sangue contaminado

artificialmente: P. aeruginosa

In-Check: Plataforma Lab-On-Chip (LOC)

Tecnologia: PCR-Array

PCR chips

Tempo do teste a partir de

amostras de DNA extraído

Nossa Proposta

Tempo total do teste: 2h

Coleta de

sangueCaptura

Detecção e

identificação

5 min 25 min

Extração

DNA

30 min 60 min

Point of care

• Diagnostics

• Home care

• Insulin pumps

Eyenetra(oftalmologista portátil)

Point of Care• Glaucoma

Colaboradores

IBMP/ICC

Marco A. Krieger

Rita Rampazzo

Tahiana Brandalize

Camila B. Suarez

Cheysa A. Biondo

Leonardo Foti

ICC

Christian Probst

Daniela P. Pavoni

BioManguinhos

Antonio G. P. Ferreira

Patricia Brindeiro

Edimilson D. Silva

UFRJ - Biologia

Rodrigo Brindeiro

STMicroelectronics

Marco Bianchessi

Marco de Fazio

Marco Cereda

Alessandro Cocci

ENAS/Fraunhofer

Thomas Gessner

Andreas Morschauser

Jorg Nestler

CEA/Leti

Guillaume Delapierre

Dorothée Jary

Justine Lemonnier

UFPR – Física

Cyro K. Saul

Wido H. Schereiner

Arandi G. Bezerra Júnior

UTFPR

Fábio K. Schneider

Hugo Vieira Neto

UNICAMP

Jacobus Swart

Fundação CERTI (Florianópolis)

Manuel Steidle

Daniel Cobra

Obrigado pela atenção!

Alexandre Dias T. CostaInstituto Carlos Chagas (ICC)

Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP)

FIOCRUZ PARANÁ – adcosta@tecpar.br

http://www.fiocruz.br/icc/

http://www.ibmp.org.br/