MILENE TAVARES BATISTA Uma nova estratégia vacinal para o ...

MILENE TAVARES BATISTA

Uma nova estratgia vacinal para o controle da crie baseada em

linhagens recombinantes de Bacillus subtilis

So Paulo 2012

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Microbiologia do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo, para obteno do Ttulo de Doutor em Cincias

MILENE TAVARES BATISTA

Uma nova estratgia vacinal para o controle da crie baseada em

linhagens recombinantes de Bacillus subtilis

rea de Concentrao: Microbiologia

Orientadora: Profa. Dra. Rita de Cssia Caf Ferreira Co-orientador: Prof. Dr. Lus Carlos de Souza Ferreira Verso original

So Paulo 2012

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Microbiologia do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo, para obteno do Ttulo de Doutor em Cincias

Aos meus pais,

Ana e Adilao

Aos meus irmos,

Michael e Marcel

Ao meu marido e eterno amor,

Leandro

Muito obrigada pelo amor, dedicao, apoio e

compreenso ao longo destes anos.

Agradeo Deus e Nossa Senhora por me permitir concluir mais uma etapa

da minha vida.

Aos meus pais, Ana e Adilao, que so a razo da minha vida. Obrigada por me

darem uma famlia linda, por me ensinarem os valores da vida e por sempre estarem

ao meu lado. Me, obrigada por ser meu exemplo de grandiosidade de corao, por

sua alegria, companheirismo, f e amor incondicional. Pai, obrigada por ser meu

exemplo de homem, de trabalhador, pai, por me ensinar o que boa msica, e por

cuidar de mim como sua princesinha.

Aos meus irmos, Michael e Marcel, por serem meus eternos comparsas, por

me apoiarem sempre, me ajudarem quando ningum mais podia.

Ao meu namorido, Leandro, por ser to doce, amvel, companheiro, por me

entender e apoiar, por me ajudar a dar risada quando o que eu mais queria era

chorar. E por ser meu eterno namorado, marido, amigo e amor.

Aos meus avs pelo amor, carinho e cuidado.

minha tia Edna por ser minha segunda me, cuidar de mim e me amar acima

de tudo. E a minha priminha-irm, Jssica, pelas suas eternas estripulias e alegria.

As minhas cunhadas, Vanessa e Vanessa, que so parte da famlia e trazem

ainda mais amor e unio a nossa casa.

Profa. Rita, minha orientadora, por ser minha eterna mestra e amiga, por me

dar a oportunidade de conhecer a cincia, por me apoiar sempre, me ensinar e guiar

pelo caminho profissional e pessoal (muitas vezes!). Obrigada pelo seu carinho e

alegria!

Ao Prof. Lus, meu co-orientador, por ser um exemplo de dedicao,

pesquisador e pessoa, pelos ensinamentos e pacincia no trabalho, por seus bate-

papos alegres e incentivadores.

Ao Prof. Wolfgang pelo seu carinho e cuidado em um tempo de incertezas.

Profa Jeannine, um exemplo de pessoa e profissional, por me receber com

carinho e ateno, pela oportunidade de crescer profissional e pessoalmente, por sua

amizade.

sbib-marciaTexto digitado

sbib-marciaTexto digitadoAGRADECIMENTOS



amiga e mestra Elisa, por ser um exemplo de fora e amizade. Por me ajudar

nos primeiros passos na cincia e ser meu ombro amigo, pelos incontveis almoos e

sorvetes, pela pacincia em ouvir minhas preocupaes e pelas risadas.

Aos amigos Luana, Bruno (Tintim) e Sabrina, pelo companheirismo dentro e

fora do laboratrio, pela descontrao e suporte.

Ao amigo de outrora que me iniciou no laboratrio, muito obrigada!

Aos amigos Bacileiros, Wilson, Rafael, Renata e Juliano (ex-bacileiro) pelo

trabalho em equipe, pela amizade. um prazer trabalhar com pessoas como vocs.

Renata pela sua ajuda profissional e pessoal, pelo carinho, por ter sempre

aquele toque amigo, por ser minha comparsa de viagens nacionais e internacionais.

amiga e companheira de noitadas no laboratrio Camila Santos pela sua

incansvel energia, sua inteligncia nica, por sua maravilhosa fora e amizade ao

longo destes anos. Obrigada por construir comigo uma amizade linda e sincera.

Ao grupo do VTNC (Renata, Rafael e Cariri) que permitiram que eu me

mantivesse s em momentos turbulentos, pelas risadas e amizade.

Aos companheiros de laboratrio (Carol IC, Ewerton, Mnica, Nana, Sara,

Dbora, Priscila, Raza, Rubens, Jaime, Marcinha, Mariana IC, Juliana, Deni, Luana

(e Manuzinha), Mari, Cariri e Bruna). Vocs esto no meu corao, obrigada pela

amizade e coleguismo, colaboraes e por momentos de alegria e baboseira.

Ao Eduardo, Loren e Lilian pela inestimvel ajuda em tudo.

Ao Eduardo por seu profissionalismo, competncia, amizade e por me aguentar

pedindo coisas a toda hora.

Aos estagirios (Paschoal, Joelma, Bruno Tintim, Marianna, Mariela, Marilys e

Gabriela) que me ensinaram muitas lies profissionais e de vida, pela ajuda e

companheirismo.

Maria Elizabete Almeida-Sbrogio (Bete) pelos ensinamentos, carinho e

mimos ao longo destes anos.

Aos funcionrios do Departamento de Microbiologia pelo suporte em todos os

momentos.

Aos funcionrios e amigos do biotrio da Parasitologia (Sandra, Juliane e Dani)

pela competncia, ajuda, ensinamentos e risadas.

As agncias de fomento FAPESP, CNPq e CAPES pelo suporte financeiro,

sem o qual seria impossvel realizar este trabalho.

A todos aqueles que no consegui agradecer, minha eterna gratido.

Talvez no tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito.

No sou o que deveria ser, mas Graas a Deus, no sou o que era antes.

Marthin Luther King

RESUMO

TAVARES, M. B. Uma nova estratgia vacinal para o controle da crie baseada em linhagens recombinantes de Bacillus subtilis. 2012. 200 f. Tese (Doutorado em Microbiologia) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2012.

O Streptococcus mutans (S. mutans) o agente etiolgico da crie dental humana, uma doena com ampla distribuio mundial. A adeso superfcie dental depende da interao entre a protena de superfcie P1 e a aglutinina salivar (SAG) adsorvida ao dente. A regio N-terminal da P1 um alvo vacinal importante que est diretamente associada s funes de adeso e agregao. Este trabalho teve o objetivo de avaliar estratgias vacinais contra o S. mutans baseadas na protena P1 usando linhagens recombinantes de B. subtilis. O B. subtilis uma bactria gram positiva, formadora de esporos, no patognica, empregada como sistema de expresso de protenas heterlogas e como veculo vacinal administrado por vias de mucosas. Empregamos, inicialmente, o B. subtilis para expressar e purificar a protena P139-512 derivada da protena P1 de S. mutans UA159. O antgeno P139-512 apresentou eptopos lineares e conformacionais semelhantes aos presentes na protena P1 nativa. O stio de ligao SAG est preservado nessa protena assim como suas propriedades imunognicas. A coadministrao parenteral do antgeno com adjuvantes vacinais promoveu resposta sistmica especfica com anticorpos eficazes no bloqueio da adeso de S. mutans. Por fim, usamos esporos de B. subtilis como veculo de entrega de mucosa para o antgeno alvo de S. mutans. Esporos de B. subtilis foram modificados para expressar na superfcie adesinas bacterianas (SlpA, InvA ou Inv600) com capacidade de ligao ao epitlio intestinal e, quando no estgio de clula vegetativa, expressar intracelularmente o antgeno P139-512. A imunizao oral com os esporos adesivos induziu altas concentraes de anticorpos sistmicos e de mucosa. A imunizao nasal ou sublingual com os esporos recombinantes induziu nveis de anticorpos sistmicos maiores do que aqueles obtidos aps a imunizao oral. Alm disso, esses anticorpos foram mais eficientes em bloquear a adeso de S. mutans SAG imobilizada, sem interferir com a agregao. Em concluso, os resultados obtidos abrem perspectivas interessantes para o desenvolvimento de vacinas anti-crie baseadas em linhagens de B. subtilis.

Palavras-chave: Bacillus subtilis. Streptococcus mutans. Vacina. Crie dental. Protenas heterlogas. Veculo vacinal. Esporos.

ABSTRACT

TAVARES, M. B. A new vaccine approach for the control of tooth decay based on recombinant Bacillus subtilis strains. 2012. 200 p. Ph. D. thesis (Microbiology) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2012. S. mutans is the major etiologic agent of human dental caries, a disease with worldwide distribution. The adhesion to the tooth surface is dependent on the interaction of the P1 surface protein and salivary agglutinin (SAG) adsorbed to the tooth. The N-terminal region of P1 is an important vaccine target that is directly associated with adhesion and aggregation functions. This study aimed to evaluate vaccination strategies against S. mutans based on the P1 protein using recombinant B. subtilis strains. B. subtilis is a gram positive, spore-forming, non-pathogenic bacterium used as expression system for heterologous proteins and as a vaccine vehicle administered by mucosal routes. Inicially, we employed a recombinant B. subtilis strain to express and purify the P139-512 protein derived from the S. mutans UA159 P1 protein. The P139-512 antigen showed important conformational and linear epitopes similar to those present in the native P1 protein. The SAG-binding site is preserved in P139-512 as well as immunological properties. The parenteral co-administration of antigen with vaccine adjuvants stimulated systemic antibodies effective in blocking adhesion of S. mutans to SAG. Lastly, we used B. subtilis spores as a mucosal delivery vehicle for antigen targeting. B. subtilis endospores were modified to display bacterial adhesins (SlpA, InvA or Inv600), capable to bind to the intestinal epithelium, on the spore surface and to express intracellularly the P139-512 antigen during the vegetative cell stage. Oral immunization with adhesives spores induced high systemic and mucosal specific antibodies levels. The nasal or sublingual immunization with B. subtilis recombinant spores induced higher amounts of systemic antibodies than the oral immunization. Furthermore, the specific antibodies were highly effective in blocking the adherence of S. mutans to immobilized SAG, without interfering with aggregation. In conclusion, the results open interesting perspectives for the development of anti-caries vaccines based on B. subtilis strains.

Keywords: Bacillus subtilis. Streptococcus mutans. Vaccine. Dental caries. Heterologous proteins. Vaccine vehicle. Spores.

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1- Representao esquemtica da protena P1 de S. mutans. ........................... 26

Figura 2- Construo do vetor de expresso e purificao da protena P139-512 em B.

subtilis (pLDV701). ......................................................................................................... 71

Figura 3- Deteco e purificao da protena P139-512 produzida em linhagem

recombinante de B. subtilis. ........................................................................................... 72

Figura 4- Representao esquemtica das protenas recombinantes derivadas da

protena P1 de S. mutans e distribuio dos anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1 na

estrutura conformacional da protena. ............................................................................ 74

Figura 5- Avaliao da reatividade dos mAbs anti-P1 com a protena nativa expressa no

S. mutans NG8 e com os fragmentos de protena derivados da protena P1. ............... 75

Figura 6- Caracterizao dos eptopos da protena recombinante P139-512 usando

anticorpos monoclonais anti-P1. .................................................................................... 76

Figura 7- Interao da protena P139-512 recombinante com a SAG usando BIAcore

(surface plasmon resonance). ........................................................................................ 78

Figura 8- Especificidade antignica dos anticorpos produzidos em camundongos

imunizados com a protena P139-512. ............................................................................... 81

Figura 9- Reatividade dos soros gerados em camundongos com a protena P139-512

purificada em linhagem recombinante de B. subtilis LDV701. ....................................... 83

Figura 10- Determinao da funcionalidade in vitro dos anticorpos gerados em

camundongos com as protenas P139-512 ou P139-512d. ................................................... 86

Figura 11- Avaliao da resposta imunolgica sistmica em camundongos imunizados

pela via subcutnea com a protena P139-512 associada aos diferentes adjuvantes. ...... 89

Figura 12- Determinao da avidez dos anticorpos em relao ao antgeno vacinal P139-

512. .................................................................................................................................. 91

Figura 13- Reatividade dos soros com a protena P1 nativa de S. mutans NG8 e os

fragmentos truncados da P1. ......................................................................................... 93

Figura 14- Deposio do complemento na superfcie de S. mutans na presena de

anticorpos anti-P139-512. .................................................................................................. 95

Figura 15- Funcionalidade dos soros gerados aps imunizao da protena P139-512 co-

administrada com diferentes adjuvantes. ....................................................................... 97

Figura 16- Representao esquemtica do direcionamento dos esporos de B. subtilis

para clulas imunes de mucosa no GALT (gastrointestinal-associated lymphoid tissue) e

consequncia para a resposta imunolgica ao antgeno alvo. ..................................... 107

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Linhagens empregadas e construdas neste trabalho. ................................. 42

Quadro 2 - Vetores empregados e construdos neste trabalho. ..................................... 43

Quadro 3 - Iniciadores desenhados para a amplificao dos genes de interesse.......... 47

Quadro 4- Reatividade dos anticorpos policlonais com as protenas recombinantes P1,

P1 39-512 ou P1 39-512d. ..................................................................................................... 82

SUMRIO

1 INTRODUO ............................................................................................................ 21

1.1 A crie dental humana ........................................................................................... 21

1.2 Streptococcus mutans ........................................................................................... 22

1.3 A famlia do Antgeno I/II e a Protena P1 de S. mutans ...................................... 23

1.4 Regio A ou Regio de ligao saliva ............................................................... 27

1.5 Estratgias vacinais contra a crie dental ........................................................... 28

1.6 Bacillus subtilis e o desenvolvimento de vacinas .............................................. 32

1.7 Vacinas de mucosa baseadas em B. subtilis ....................................................... 37

2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 39

2.1 Objetivo geral ......................................................................................................... 39

2.2 Objetivos especficos............................................................................................. 39

3 MATERIAIS E MTODOS .......................................................................................... 40

3.1 Linhagens e vetores bacterianos, condies de cultivo .................................... 40

3.2 Competncia e transformao em E. coli ............................................................ 40

3.3 Competncia e transformao em B. subtilis ...................................................... 41

3.4 Lise de clulas vegetativas de B. subtilis ............................................................ 44

3.5 Extrao de protenas totais de S. mutans .......................................................... 44

3.6 Induo e purificao da protena CG14 a partir de E. coli ................................ 44

3.7 Produo de anticorpos anti-P1 de S. mutans .................................................... 44

3.8 Construo do vetor de clonagem pGP1N ........................................................... 45

3.8.1 Isolamento de DNA genmico de S. mutans .................................................... 45

3.8.2 Amplificao do gene spaP1N por reao em cadeia da polimerase (PCR) e

clonagem no vetor pGEM-T-easy ................................................................................ 45

3.9 Construo do vetor de expresso pLDV701 ...................................................... 48

3.10 Expresso da protena recombinante P139-512 em linhagem de B. subtilis

LDV701 .......................................................................................................................... 48

3.11 Fracionamento da amostra induzida de LDV701 ............................................... 49

3.12 Purificao da protena recombinante P139-512 a partir de linhagem

recombinante de B. subtilis ......................................................................................... 50

3.13 SDS-PAGE e Western blot da protena P139-512 .................................................. 50

3.14 Expresso e purificao dos fragmentos da protena P1 ................................. 50

3.15 Preparao dos anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1 ................................ 50

3.16 Reatividade dos anticorpos monoclonais anti-P1 com a protena P139-512 por

meio de Western blot ................................................................................................... 51

3.17 Determinao da reatividade dos mAbs anti-P1 com os fragmentos da

protena P1 e a protena P139-512 por meio de ELISA ................................................. 51

3.18 Preparo da aglutinina salivar (SAG) ................................................................... 52

3.19 Ensaio de ligao da P139-512 SAG imobilizada em microchip via sistema

BIAcore.......................................................................................................................... 52

3.20 Regime vacinal e processamento das amostras ............................................... 53

3.21 Produo de anticorpos contra toda bactria S. mutans ................................. 53

3.22 Adsoro dos anticorpos IgG anti-P1 com as protenas P139-512 e P139-512d ... 54

3.23 ELISA para deteco de anticorpos especficos contra as protenas P1,

P139-512 e P139-512d ......................................................................................................... 54

3.24 Imunofluorescncia do S. mutans ...................................................................... 55

3.25 Ensaio de inibio da agregao do S. mutans mediada por saliva livre por

meio de anticorpos anti-P139-512 .................................................................................. 55

3.26 Bloqueio da adeso de S. mutans SAG imobilizada por anticorpos

anti-P139-512 em placa de microtitulao ..................................................................... 56

3.27 Imunogenicidade da protena P139-512 em associao com diferentes

adjuvantes - Protocolo vacinal .................................................................................... 57

3.28 Coleta de amostras .............................................................................................. 57

3.29 ELISA para deteco de anticorpos especficos contra a protena P139-512 .... 58

3.30 ELISA de avidez .................................................................................................... 58

3.31 Reatividade dos soros policlonais anti-P139-512 com os fragmentos da

protena P1 por meio de ELISA ................................................................................... 59

3.32 Inibio da adeso de S. mutans ao SAG imobilizado por anticorpos anti-

P139-512 especficos utilizando o sistema de BIAcore ................................................ 59

3.33 Inibio da agregao de S. mutans ao SAG livre por meio de

espectrofotometria ....................................................................................................... 60

3.34 Ensaio de deposio da protena C3 do complemento .................................... 60

3.35 Construo das linhagens de B. subtilis capazes de expressar adesinas

bacterianas na superfcie dos esporos ...................................................................... 61

3.36 Construo do vetor vacinal pLDV702 de B. subtilis ........................................ 62

3.37 Preparo dos esporos de B. subtilis .................................................................... 63

3.38 Extrao e deteco das protenas recombinantes da capa dos esporos ...... 63

3.39 Deteco e quantificao da expresso in vitro da P139-512 nas linhagens

vacinais de B. subtilis .................................................................................................. 64

3.40 Imunofluorescncia dos esporos ....................................................................... 64

3.41 Adeso dos esporos recombinantes de B. subtilis a clulas Caco-2 in vitro . 65

3.42 Disseminao dos esporos no intestino de camundongos ............................. 66

3.43 Adeso dos esporos de B. subtilis s placas de Peyer de camundongos ..... 66

3.44 Regime vacinal com esporos recombinantes de B. subtilis e processamento

das amostras ................................................................................................................ 67

3.45 Deteco das respostas antgeno-especficas de anticorpos sricos e de

mucosa .......................................................................................................................... 67

3.46 Inibio da agregao de S. mutans mediada pela SAG livre em placas de

microtitulao ............................................................................................................... 68

3.47 Inibio da adeso de S. mutans mediada pelo SAG ligado em placa de

microtitulao ............................................................................................................... 68

3.48 Anlises estatsticas ............................................................................................ 69

4 RESULTADOS ............................................................................................................ 70

4.1 Captulo I. Produo e caracterizao funcional e imunolgica da protena

P139-512 produzida a partir de uma linhagem recombinante de B. subtilis ............... 70

4.1.1 Construo da linhagem recombinante de B. subtilis LDV701, expresso e

purificao da protena recombinante P139-512 ........................................................... 70

4.1.2 Reatividade dos monoclonais (mAbs) anti-P1 com as protenas P1, P139-512 e

os domnios funcionais da P1 ..................................................................................... 73

4.1.3 Ligao da protena recombinante P139-512 produzida em B. subtilis LDV701

SAG ............................................................................................................................... 77

4.1.4 Avaliao das propriedades imunognicas e antignicas da P139-512 expressa

em B. subtilis usando soros policlonais .................................................................... 79

4.1.5 Inibio do processo de agregao e adeso dependente de saliva com

anticorpos anti-P139-512 e anti-P139-512d ....................................................................... 84

4.2 Captulo II. Caracterizao imunolgica de formulaes vacinais usando a

protena P139-512 co-administrada com diferentes adjuvantes .................................. 87

4.2.1 Avaliao da imunogenicidade da protena recombinante P139-512 produzida

em B. subtilis administrada com diferentes adjuvantes ........................................... 87

4.2.2 Caracterizao dos soros gerados com a protena P139-512 associada a

adjuvantes quanto a sua avidez pelo antgeno ......................................................... 90

4.2.3 Avaliao da antigenicidade dos fragmentos de P1 usando os soros gerados

com a protena P1 39-512 associada aos adjuvantes ................................................... 92

4.2.4 Ativao da via clssica do complemento pelos soros policlonais gerados

com a protena P139-512 associada aos diferentes adjuvantes .................................. 94

4.2.5 Funcionalidade in vitro dos soros gerados com a protena P139-512 associada

a adjuvantes em bloquear a adeso do S. mutans NG8 SAG ................................ 96

4.2.6 Inibio da agregao de S. mutans NG8 in vitro usando os soros

policlonais gerados com os diferentes adjuvantes .................................................. 96

4.2.7 Discusso do Captulo I e II ................................................................................ 98

4.3 Captulo III. Desenvolvimento e caracterizao dos esporos adesivos de B.

subtilis como veculo vacinal de entrega de mucosa ............................................. 104

5 DISCUSSO FINAL ................................................................................................. 147

6 CONCLUSO E PERSPECTIVAS ........................................................................... 151

REFERNCIAS ............................................................................................................ 152

APNDICE A - Induction of neutralizing antibodies in mice immunized with an

amino-terminal polypeptide of Streptococcus mutans P1 protein produced by a

recombinant Bacillus subtilis strain ......................................................................... 173

APNDICE B - Avaliao da influncia das condies de cultivo e mtodo de

purificao na recuperao de esporos de B. subtilis com alto grau de pureza e

rendimento .................................................................................................................. 180

APNDICE C - Smula curricular .............................................................................. 196

21

1 INTRODUO

1.1 A crie dental humana

A sade bucal um componente substancial da sade do ser humano.

Entretanto, nos dias atuais diversas doenas orais crnicas, como a crie dental,

esto disseminadas em pases industrializados e em desenvolvimento. A Organizao

Mundial da Sade (OMS) qualifica a crie dental como um dos maiores problemas de

sade pblica, devido alta prevalncia no mundo. Atualmente, a doena acomete

cerca de 90% das crianas em idade escolar e cerca de 100% da populao mundial

adulta (LEHNER, 1992; SHIVAKUMAR; VIDYA; GHANDU, 2009; WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2012).

A crie dental uma doena transmissvel, crnica, no letal, caracterizada

pela desmineralizao do esmalte dental em consequncia da produo de cidos por

bactrias fermentadoras presentes no biofilme dental (COTE et al., 2004;

HAJISHENGALLIS; RUSSELL; MICHALEK, 1998; SMITH, 2012; TAKAHASHI;

NYVAD, 2011; TAUBMAN; NASH, 2006). A doena crie apresenta etiologia

multifatorial com envolvimento da dieta e susceptibilidade do hospedeiro, microbiota e

o tempo (FEJERSKOV, 2004; SHIVAKUMAR; VIDYA; GHANDU, 2009).

Mais de 700 espcies bacterianas esto presentes no biofilme dental e dentre

estas duas espcies pertencentes ao gnero Streptococcus tem sido relacionadas

como agentes etiolgicos primrios da crie dental de superfcie lisa, o S. mutans e o

S. sobrinus, sendo o primeiro mais frequentemente isolado da cavidade oral de

humanos e responsvel por mais de 90% das leses cariosas (DEWHIRST et al.,

2010; HAMADA; SLADE, 1980; LOESCHE, 1986). Alm disso, essa bactria tem sido

associada a doenas infecciosas no orais como a endocardite bacteriana (AJDIC et

al., 2002; HAMADA; SLADE, 1980; LOESCHE, 1986).

Medidas como a administrao tpica e sistmica de flor tiveram forte impacto

sobre a incidncia de crie na populao mundial, contudo a eficcia desses mtodos

no foi suficiente para erradicar a doena (HAJISHENGALLIS; MICHALEK 1999;

KOGA et al., 2002; SHIVAKUMAR; VIDYA; GHANDU, 2009). Desta forma, o

22

desenvolvimento de medidas efetivas de sade pblica que controlem o patgeno

mostra-se interessante pelo potencial impacto sobre a sade bucal e geral do

individuo.

1.2 Streptococcus mutans

O S. mutans um coco, firmicute, imvel, catalase negativo, facultativo, capaz

de fermentar diversos acares provenientes da dieta do hospedeiro produzindo

cidos que reduzem o pH da placa dental e promovem a desmineralizao do esmalte

(HAMADA; SLADE, 1980; TAUBMAN; NASH, 2006 ). A infeco por S. mutans pode

ocorrer em dois momentos ao longo da vida do indivduo saudvel, na erupo dos

dentes decduos e na troca para os dentes permanentes, estes perodos so

denominados de janelas de infectividade (CAUFIELD; CUTTER; DASANAYAKE,

1993; SMITH, 2002).

A capacidade de aderir superfcie dental, a habilidade de metabolizar

carboidratos e produzir cidos (acidogenicidade), e a capacidade de suportar

ambientes cidos (aciduricidade) so os principais fatores de virulncias do S. mutans

relacionados com a doena crie (HAMADA; KOGA; OOSHIMA, 1984; MICHALEK et

al., 1981). A adeso fundamental para a patognese da crie dental, pois na

ausncia desta no haver formao do biofilme e desenvolvimento da doena. A

aderncia do S. mutans superfcie dental envolve dois estgios, o primeiro deles,

denominado sacarose-independente e o segundo, sacarose-dependente (HAMADA;

SLADE, 1980; STAAT; LANGLEY; DOYLE, 1980; TAUBMAN; NASH, 2006).

O primeiro estgio de adeso do S. mutans ao dente reversvel e

caracterizado pela interao entre uma protena de superfcie da bactria, o antgeno

I/II ou P1, expresso por todas as linhagens cariognicas de S. mutans e glicoprotenas

presente na pelcula adquirida adsorvida ao dente (BOWEN et al., 1991; CROWLEY

et al., 1999; SMITH, 2002; STAAT; LANGLEY; DOYLE, 1980). O segundo estgio de

adeso irreversvel e associado produo de polissacardeos extracelulares

insolveis (glucanos) e posterior interao desses com as protenas ligadoras de

glucanos (Gbp) e glicosiltransferases (GtfB) presentes na superfcie bacteriana. Este

23

estgio permite o acmulo do S. mutans e o desenvolvimento do biofilme na

superfcie dental (BOWEN; KOO, 2011; HAMADA; KOGA, 1984; SHIROZA et al.,

2003).

O S. mutans apresenta diferentes antgenos em sua superfcie incluindo

polissacardeos antignicos, as Gtfs, Gbp, antgeno D, antgeno III, antgeno A,

antgeno C e antgeno B (P1). Entretanto, at momento apenas a protena P1 e a

GbpB tem mostrado potencial como alvos vacinais com resultados favorveis para o

controle da doena (BRADY et al., 2010; KOGA et al., 1995; KURAMITSU, 1993)

1.3 A famlia do Antgeno I/II e a Protena P1 de S. mutans

Na cavidade oral a interao inicial entre bactria e hospedeiro dependente

da associao entre adesinas de superfcie bacteriana e receptores presentes na

pelcula adquirida adsorvida sobre o dente (HAMADA; SLADE, 1980).

Nos estreptococos orais do grupo Viridans, as protenas da famlia I/II

participam na aderncia, colonizao e desenvolvimento da comunidade microbiana.

As protenas da famlia I/II so adesinas ancoradas parede celular bacteriana com

estrutura e antigenicidade relacionadas e apresentam entre 1310 e 1653 resduos de

aminocidos (BRADY et al., 2010). Essas protenas possuem propriedades

multifuncionais como ligao a matriz extracelular, a receptores do hospedeiro, co-

agregao com outras bactrias, interao com glicoprotenas salivares e ativao de

clulas monocticas (JENKINSON; DEMUTH, 1997; JENKINSON; LAMONT, 1997;

MADDOCKS et al., 2011). As protenas da famlia I/II tm sido extensivamente

caracterizadas em numerosas linhagens de S. mutans e S. gordonii e apresentam

uma organizao estrutural global altamente conservada com identidade entre 65 a

70% (DEMUTH et al., 1988, 1990; JENKINSON et al., 1993; KELLY et al., 1990; LEE;

PROGULSKE-FOX; BLEIWEIS, 1988; OGIER et al., 1990; OKAHASHI et al., 1989;

TOKUDA et al., 1991). A importncia dessa famlia de protenas pode ser

demonstrada pela presena de ortlogos em virtualmente todos os estreptococos

orais e a identificao destas tambm em S. pyogenes e S. agalactiae (MA et al.,

1991; ZHANG et al., 2006).

24

A protena P1 de S. mutans, tambm referida como Antgeno I/II, Antgeno B

ou PAc, o maior antgeno de superfcie deste microrganismo e pertence a grande

famlia I/II (JENKINSON; LAMONT, 1997; RUSSELL; LEHNER, 1978; KOGA et al.,

1995). A protena P1 em S. mutans est envolvida no complexo processo multifatorial

de aderncia as glicoprotenas salivares adsorvidas ao esmalte dentrio (BOWEN et

al., 1991). Na linhagem UA159 de S. mutans do sorotipo c, a protena P1 com peso

molecular aproximado de 171 kDa codificada pelo gene spaP com 4689 pb (AJDIC

et al., 2002).

A sequncia primria da P1 de S. mutans apresenta seis regies distintas: um

peptdeo sinal predito composto pelos resduos de aminocido 1 at 38, adjacente a

este est a poro N-terminal altamente carregada composta principalmente por uma

regio rica em alanina (regio A, resduos de aminocidos 186-464). A regio C-

terminal inclui um segmento rico em prolina (regio P, resduos de aminocidos 840-

963) que confere uma alta hidrofobicidade a protena, um domnio transmembrnico e

o motivo LPXTG que permite a ancoragem proteica na parede celular bacteriana. Na

regio central, entre as regies A e P, localiza-se um segmento denominado de

varivel (regio V) onde reside a maior variabilidade de sequncia da protena P1

entre as cepas de S. mutans (BRADY et al., 1991, 1998; FISCHETTI; PANCHOLI;

SCHNEEWIND, 1990; KELLY et al., 1989, 1995; MURAKAMI et al., 1997; THON-

THAT; MARRAFFINI; SCHNEEWIND, 2004) (figura 1A).

Anterior cristalografia da protena P1 de S. mutans um conjunto de 11

anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1 de S. mutans foram usados como ferramentas

para caracterizar os domnios funcionais da P1 assim como a antigenicidade desta ou

de fragmentos truncados derivados da P1, permitindo a elucidao de algumas das

propriedades mais importantes deste antgeno (BRADY et al., 1991, 1992; CROWLEY

et al., 1993). Em 2002, Troffer-Charlier obtiveram a cristalografia da regio V da

protena P1, permitindo a primeira observao sobre a estrutura 3D desta protena de

S. mutans. Em 2010 e 2011, o restante da estrutura cristalogrfica da protena P1 de

S. mutans foi resolvida e mostrou ser singular. A protena P1 de S. mutans apresenta

uma estrutura fibrilar alongada de aproximadamente 50 nm, onde a regio A forma

25

uma -hlice que entrelaa intimamente a regio P em hlice, enquanto a regio V se

dobra formando uma estrutura globular (LARSON et al., 2010, 2011) (figura 1B).

A deleo da protena P1 em linhagens de S. mutans resulta em reduo

drstica da adeso superfcie dental na presena de saliva e de sua hidrofobicidade,

indicando o papel desta protena na colonizao da cavidade oral pelo patgeno

(BRADY et al., 1992; KOGA et al., 1990; LEE et al., 1989). A protena P1 de S.

mutans interage especificamente com o receptor de varredura da imunidade inata, a

glicoprotena 340 (gp340), presente na aglutinina salivar (SAG) (LEITO et al., 2008).

O SAG uma protena oligomrica complexa de massa molecular aproximada de 400

kDa composta pela gp340, imunoglobulina A secretada e uma protena de 80 kDa

(OHO et al., 1998; PRAKOBPHOL et al., 2000). A protena P1 pode interagir com

duas formas da gp340, livre ou ligada superfcie dental, e isso determinar o destino

da bactria na cavidade oral. Quando livre na saliva, a glicoprotena interage com a

protena P1 de superfcie do S. mutans resultando em agregao e provavelmente

eliminao da cavidade oral por meio da deglutio. Esse processo importante na

proteo inata contra a crie dental e tem sido considerado um mecanismo no imune

de eliminao do patgeno. Quando imobilizada, a glicoprotena servir como um

receptor para aderncia do S. mutans ao dente com consequente estabelecimento do

biofilme dental (LOIMARANTA et al., 2005; STENUDD et al., 2001). Entretanto,

apesar de ambos os processos envolverem os mesmos constituintes (protena P1 e

gp340) dados sugerem que esses processos devem envolver domnios distintos das

protenas (BRADY et al., 1992).

Evidncias prvias de que vrios fragmentos derivados da protena P1 eram

capazes de interagir com a gp340 indicavam que essa protena poderia apresentar

mltiplos stios de ligao gp340 adsorvida (BRADY et al., 1992; KELLY et al., 1995;

NAKAI et al., 1993). De fato, a protena P1 de S. mutans apresenta pelo menos dois

stios de ligao SAG, um stio est localizado na regio C-terminal, mais

precisamente entre a regio C1 e C2, e outro stio est localizado dentro do fragmento

A3VP1, que corresponde a ltima regio de repetio A, toda a regio V e a primeira

regio de repetio P. Adicionalmente, foi demonstrado que esses fragmentos no

26

competem entre si pelo SAG indicando stios distintos de ligao (LARSON et al.,

2011) (figura 1B).

Figura 1- Representao esquemtica da protena P1 de S. mutans.

(A) Representao da sequncia primria da P1 com seus domnios relevantes. (B) Modelo da estrutura terciria da protena P1 e os stios de ligao aglutinina salivar humana (SAG). PS, peptdeo sinal. Fonte: Modificado de Larson et al. (2010, 2011).

27

1.4 Regio A ou Regio de ligao saliva

Na poro amino-terminal da protena P1 do S. mutans est localizada uma

regio rica no aminocido alanina, composta por trs repeties de alanina completas

e uma incompleta formando uma estrutura em -hlice denominada de regio A

(KELLY et al., 1989; LARSON et al., 2010). Por avidez aos componentes salivares, a

regio A tem sido referida como regio de ligao saliva ou SBR (Saliva-Binding

Region) (CROWLEY et al., 1993; HAJISHENGALLIS; KOGA; RUSSELL, 1994;

HAJISHENGALLIS; RUSSELL; MICHALEK, 1998; NAKAI et al., 1993).

A regio SBR codifica para uma protena de peso molecular aproximado de 42

kDa, a qual permite a interao de S. mutans com componentes salivares,

particularmente a protena gp340, demonstrando sua importncia para aderncia

inicial do patgeno saliva adsorvida ao dente e subsequente desenvolvimento da

crie (CROWLEY et al., 1993; HAJISHENGALLIS; RUSSELL; MICHALEK, 1998;

KOGA; RUSSELL, 1994; MOISSET et al., 1994; PRAKOBPHOL et al., 2000). Esse

segmento da P1 inibe competitivamente tanto aderncia do S. mutans ao SAG

imobilizado quanto agregao na presena de SAG livre (CROWLEY et al. 1993).

Alm disso, a SBR tem papel fundamental na estrutura tridimensional, na expresso,

estabilidade e na antigenicidade da protena P1 de S. mutans (SEIFERT; BLEIWEIS;

BRADY, 2004).

Ademais, essa regio antignica e abrange tanto eptopos para clulas B

como para T, e anticorpos direcionados para a SBR de S. mutans tem reatividade

cruzada com a protena P1 (Pag) de S. sobrinus (KELLY et al., 1995; LEHNER et al.,

1990; SENPUKU et al., 1996; TAKAHASHI et al., 1991). As sequncias

TELARVQKANADAKAAY (repetida trs vezes, com vrios aminocidos conservados)

e TYEAALKQYEADL (repetida quatro vezes, com vrios aminocidos conservados)

localizadas dentro da regio A foram descritas como potenciais stios de adeso aos

componentes salivares (adesitopos) (BRADY et al., 1992; KELLY et al., 1995;

MOISSET et al., 1994; NAKAI et al., 1993; OKAHASHI et al., 1993; SENPUKU et al.,

1995).

28

Anticorpos sricos e da saliva de indivduos naturalmente infectados pelo S.

mutans, porm sem relatos de crie, so capazes de reconhecer fortemente vinte

sete decapeptdeos derivados da regio A da protena P1, indicando o papel protetor

de anticorpos direcionados contra essa regio (MATSUSHITA et al.,1994). Ainda,

estratgias vacinais empregando peptdeos derivados desse segmento da P1 so

capazes de bloquear a agregao e a adeso de S. mutans e reduzir o

desenvolvimento de crie dental em animais (HUANG; HAJISHENGALLIS;

MICHALEK, 2001; MICHALEK; KATZ; CHILDERS, 2001; MUNRO et al., 1993;

TAKAHASHI et al., 1991; TSUHA et al., 2004). Demonstrando que, entre os domnios

funcionais da protena P1, essa regio o maior alvo vacinal para o controle da crie

dental humana.

1.5 Estratgias vacinais contra a crie dental

O conceito de vacinao contra a crie dental foi estabelecido pouco depois da

determinao do papel do S. mutans no desenvolvimento da doena (LEHNER;

CHALLACOMBE; CALDWELL, 1980; LOESCHE, 1986; TAUBMAN; NASH, 2006). As

primeiras estratgias de controle da crie empregaram a imunizao do S. mutans

completo pela via subcutnea e demonstraram resultados encorajadores com reduo

significativa da colonizao oral pelo S. mutans. Entretanto, a observao que esse

tipo de imunizao poderia gerar anticorpos com reatividade cruzada com fibras

cardacas humanas e de coelho, reduziu gradativamente o interesse por essa

abordagem. Consequentemente houve um crescente em estratgias de subunidade

com protenas e peptdeos derivados dos antgenos de superfcie de S. mutans,

principalmente contra a P1 (BOWEN, 1969; KOGA et al., 2002; LEHNER, 1992;

LEHNER; CHALLACOMBE; CALDWELL, 1980; RUSSELL, 1987; WU; RUSSELL,

1990).

Anticorpos contra a protena P1 bloqueiam a adeso rompendo com a

colonizao da cavidade oral pelo S. mutans (MA et al., 1998; MA; LEHNER, 1990).

De fato, a protena P1 tem mostrado ser um alvo promissor na imunidade protetora

natural em humanos e tem sido estudada como um candidato em estudos de

29

imunizao ativa de primatas no-humanos e murinos (LEHNER et al., 1981;

MICHALEK; KATZ; CHILDERS, 2001; SHIVAKUMAR; VIDYA; CHANDU, 2009;

SMITH; MATTOS-GRANER, 2008). Dados atuais tem demonstrado que alm da

protena P1 inteira, fragmentos derivados dela so ponteciais alvos em vacinas

acelulares para o controle da crie (BRADY et al., 2010; SHIVAKUMAR; VIDYA;

CHANDU, 2009).

A SBR apresenta um enorme potencial protetor em estratgias contra a crie

dental visto que tanto anticorpos monoclonais como policlonais contra a regio so

fortes inibidores do primeiro estgio de adeso do S. mutans a superfcie dental

(BRADY et al., 1992; HAJISHENGALLIS et al., 1995; HUANG; HAJISHENGALLIS;

MICHALEK, 2001; LEHNER et al., 1981; SCULLY; LEHNER, 1979). A administrao

parenteral da protena SBR capaz de induzir altos ttulos de IgG e inibir a

colonizao da cavidade oral de camundongos pelo S. mutans (TAKAHASHI et al.,

1991; YU et al., 1997). Quando administrada por via de mucosas, como a via oral ou

nasal, a SBR induz respostas sistmicas e de mucosa potentes em modelos murinos

desde que esteja fusionada a um adjuvante como a CT, LT-I, LT-II ou seus variantes

(HAJISHENGALLIS et al., 1995, 1996, 2001). Contudo, em alguns casos uma dose

reforo foi importante para induo de uma resposta imunolgica pronunciada

(RUSSELL; WU, 1991).

As estratgias usando a regio SBR da protena P1 como alvo vacinal foram

principalmente baseadas na protena recombinante expressa em E. coli, normalmente

fusionada protenas de altos pesos moleculares como transportadora, ou mesmo

secretada no periplasma bacteriano, a fim de reduzir a degradao proteoltica ou

melhorar o processo de purificao e a imunogenicidade do antgeno (CROWLEY et

al., 1993; HAJISHENGALLIS et al., 1995; MATSUMOTO-NAKANO et al., 2008;

MUNRO et al., 1993; OKAHASHI et al. 1993; TOIDA et al., 1997). Baixo custo e alto

rendimento so as duas maiores razes para a grande disseminao do uso de cepas

de E. coli para a expresso de protenas heterlogas. Contudo, muitos problemas

esto associados expresso de protenas recombinantes em E. coli, como baixo

rendimento, gerao de protenas insolveis, contaminao por endotoxinas e a perda

30

de importantes determinantes imunolgicos nativos (HARWOOD, 1992; SCHUMANN,

2007).

Tanto a resposta humoral sistmica, com o extravasamento de IgG pelo fludo

crevicular, como a resposta de mucosa, na forma de IgA salivar, contra a protena P1

de S. mutans tm sido associadas proteo contra a crie dental (BRADY, 2005;

BRADY et al., 2010; MICHALEK; KATZ; CHILDERS, 2001; TENOVUO; LEHTONEN;

AALTONEN, 1990). Contudo, estratgias que promovam a induo de IgA secretor

especfico mostram-se mais promissoras visto que essa imunoglobulina encontra-se

em maior concentrao na saliva e na cavidade oral (LEHNER, 1992; MARCOTTE;

LAVOIE, 1998).

O uso de protenas solveis ou peptdeos, principalmente pela via parental, no

so mtodos eficientes para induzir IgA nas mucosas ou altos ttulos de IgG. Para

isso, novas vias de imunizao enteral como oral, nasal, tonsilar, nas glndulas

salivares e outras foram exploradas, assim como a associao com potentes

adjuvantes de mucosa, como a flagelina e as toxinas termo-lbeis (KOGA, 2002;

SHIVAKUMAR;VIDYA; CHANDU, 2009).

A flagelina um agonista do Toll-like 5 (TLR5) que um receptor de padres

moleculares associados ao patgeno (HAYASHI et al., 2001). Apresenta um potente

efeito adjuvante capaz de ativar tanto a resposta humoral quanto sistmica aps

administrao enteral ou parenteral (BRAGA et al., 2009, 2010; HONKO et al., 2006;

SHI et al., 2012). Shi et al. (2012) demonstraram que a presena da protena FliC de

Salmonella, como adjuvante, em uma vacina de DNA codificando a poro N-terminal

da protena P1 administrada por via nasal aumentou respostas imunolgicas

sistmicas e de mucosa. Como resultado foi observado uma reduo da colonizao

pelo S. mutans e dos ndices de crie em ratos, sugerindo o potencial desta protena

como adjuvante para formulaes vacinais contra a crie dental.

A toxina termolbil de E. coli ETEC (LT) um dos mais efetivos adjuvantes de

mucosa conhecidos, contudo a toxicidade inerente da LT tem impedido seu uso em

humanos. Diferentes metodologias j foram descritas para subverter este problema,

como o uso de protenas mutantes detoxificadas at o uso das subunidades no

txicas desta protena (FREYTAG; CLEMENTS, 2005; HOLMGREN et al., 2005).

31

Abordagens vacinais empregando a SBR como antgeno alvo associado a diferentes

variantes de LT como adjuvante de mucosa foram capazes de induzir tanto respostas

sistmicas quanto de mucosa e, em alguns casos, respostas persistentes (CONNELL,

2007; HAJISHENGALLIS et al., 2005; MARTIN et al., 2000; ZHAO; ZHAO; RUSSELL,

2011).

Uma alternativa eficaz para o controle de doenas infecciosas o uso de

vetores bacterianos vivos de entrega. Esse tipo de abordagem apresenta diversas

vantagens como o baixo custo, no ser invasivo, de fcil aplicao e potencial de uso

em regies geogrficas afastadas (BOLTON et al., 2012; MESTECKY, 1987; RYAN;

DALY; MILLS, 2001). Os vetores vivos bacterianos so baseados em patgenos

atenuados, tais como Salmonella e Listeria (DARJI et al., 2000; LOEFFLER et al.,

2006). As poucas estratgias vacinas anti-crie usando veculos vacinais vivos

carregando antgenos derivados da protena P1 foram desenvolvidos com linhagens

de S. enterica Typhimurium (HAJISHENGALLIS; MICHALEK, 1999;

HAJISHENGALLIS; MICHALEK; RUSSELL, 1996; HUANG; HAJISHENGALLIS;

MICHALEK, 2001; SALAM et al., 2006). Linhagens recombinantes de S. enterica

foram construdas para expressar in vivo a SBR ou a SBR fusionada CTB. A

administrao nasal e oral de ambas as linhagens foram capazes de induzir IgA

especfico na saliva e IgG no soro dos animais imunizados, entretanto para aumentar

os nveis de anticorpos foi necessrio uma dose reforo ou a co-administrao de um

adjuvante (CT). Apesar dos resultados promissores, o potencial risco de reverso

para o fentipo virulento deste tipo de abordagem tem reduzido o interesse por seu

uso no desenvolvimento de formulaes de vacina, em especial para seres humanos

(DARJI et al., 2000; LOEFFLER et al., 2006).

At o momento poucos ensaios clnicos em pequena escala em humanos

foram realizados para testar a eficcia de formulaes vacinais anti-crie. Muitos

dados conflitantes principalmente correlacionando negativamente a presena de IgA

na saliva e a prevalncia de crie dental, assim como a observao de que muitas

dessas estratgias induzem respostas imunolgicas inadequadas em humanos,

inviabilizaram a continuao dos ensaios e a disponibilizao de um produto no

mercado (RUSSELL et al., 2004; SHIVAKUMAR; VIDYA; CHANDU, 2009).

32

Atualmente, est disponvel no mercado internacional um produto para imunizao

passiva baseada em um anticorpo monoclonal produzido em plantas transgnicas do

Tabaco denominada de CaroRx (Planet Biotechnology, Hyaward, California, USA)

que est em fase de aprovao pelo FDA (Food Drug Administration) nos EUA e j

est licenciado na Europa. No entanto, a efetividade do tratamento dependente de

inmeras aplicaes profissionais do produto e o efeito apresenta um tempo limitado,

cerca de um ano (MA et al., 1990, 1994; MA; LEHNER, 1990; MA; SMITH; LEHNER,

1987). Desta forma, o desenvolvimento de estratgias de imunizao ativa que

permitam o controle efetivo da crie dental em humanos se faz necessria.

1.6 Bacillus subtilis e o desenvolvimento de vacinas

O B. subtilis uma bacilo gram positivo, ubiquitrio, produtor de endosporos,

que tem sido explorado como sistema alternativo para expresso de protenas

heterlogas com aplicaes biotecnolgicas e mais recentemente como veculo

vacinal vivo tanto na forma de esporos como na forma de clulas vegetativas

(HARWOOD, 1992; FERREIRA; FERREIRA; SCHUMANN, 2005; PACCEZ et al.,

2006, 2007; PAULITZ; BELANGER, 2001). Alm disso, os esporos de B. subtilis tm

sido usados como probiticos para uso em humanos e animais (DARIENZO et al.,

2006; FOLIGNE et al., 2012; GUO et al. 2006; GREEN et al., 1999;

PERMPOONPATTANA et al., 2012; SHIVARAMAIAH et al., 2011).

O enorme potencial aplicado do B. subtilis devido a muitas caractersticas

peculiares, como: i) a formao de esporos, a forma de vida mais resiliente do

planeta, que facilita sua estocagem e transporte; ii) ausncia de membrana externa e,

portanto, de contaminao com lipopolissacardeos (LPS); iii) um grande

conhecimento de sua gentica e fisiologia, comparvel ao conhecimento de E. coli,

sendo considerado o modelo de estudo gram positivo; iv) diferentes sistemas de

expresso e purificao disponveis, v) sua segurana para uso em humanos, com o

status GRAS (Generally regard as safe) conferido pelo FDA americano (MEIMA; VAN

DIJL; BRON, 2004; WESTERS; WESTERS; QUAX, 2004).

33

Como sistema de expresso e purificao de protenas heterlogas, o B.

subtilis uma alternativa em potencial aos modelos procariotos convencionais

baseados em E. coli, isto porque capaz de produzir molculas com atividade

biolgica preservada e em grandes quantidades, sem a contaminao por

endotoxinas (FERREIRA; FERREIRA; SCHUMANN, 2005; HARWOOD, 1992;

MEIMA; PAULITZ; BELANGER, 2001; VAN DIJL; BRON, 2004; WESTERS;

WESTERS; QUAX, 2004). Inmeros vetores de expresso em B. subtilis esto

disponveis, estes empregam os mais diferentes promotores e direcionamento das

protenas heterlogas para compartimentos diferentes, intracelular ou extracelular

(KAKESHITA et al., 2011; NGUYEN et al., 2005, 2006; NGUYEN; SCHUMANN,

2006;PACCEZ et al., 2007; PHAN; TROESCHEL et al., 2012; YANO et al., 2011).

Ao longo das ltimas dcadas a enorme capacidade de expresso e

purificao de protenas recombinantes usando linhagens de B. subtilis tem sido bem

explorada. Excelentes resultados foram observados principalmente quando protenas

de bactrias gram positivas foram expressas, como o caso da estreptoquinase de S.

equisimis que apresentou uma grande estabilidade quando expressa em B. subtilis

(HARWOOD, 1992; SCHUMANN, 2007; TERPE, 2006; WONG; YE; NATHOO, 1994).

Excelentes resultados tambm foram observados com protenas de interesse mdico,

como a interleucina humana 3 que foi purificada com sucesso a partir de B. subtilis e

com um timo rendimento, por volta de 100 mg/L, e o hormnio de crescimento

humano, por volta de 70 mg/L (OZDAMAR et al., 2009; WESTERS et al., 2005).

Alm da expresso de protenas de interesse mdico os sistemas de

expresso de B. subtilis foram utilizados para a produo de antgenos vacinais.

Dentre os antgenos vacinais produzidos em B. subtilis destaca-se o antgeno PA de

B. anthracis, a subunidade S4 de Bordetella pertussis, a protena P1 de Neisseria

meningitidis, as protenas Omp2 e Hsp60 de Chlamydia pneumoniae, a protena

HpaG de Xanthomonas oryzae, e mais recentemente a protena L1 do capsdeo do

vrus do papiloma humano. Essas protenas recombinantes foram produzidas em

grandes quantidades, com estabilidade e promoveram a ativao de potentes

respostas imunolgicas humorais e celulares (AIRAKSINEN et al., 2003; BAEK et al.,

34

2012; HIMANEN et al., 1990; IDNPN-HEIKKIL et al., 1996; IVINS; WELKOS,

1986; IVINS et al., 1990; LIN et al., 2001; MUTTILAINEN et al., 1995).

Como veculo vacinal, o B. subtilis uma alternativa segura, barata, no

invasiva (sem uso de agulha) e com aplicao sobre doenas infecciosas,

especialmente as causadas por patgenos que colonizam ou invadem o epitlio da

mucosa. O uso do B. subtilis como veculo vacinal de mucosa relativamente recente

e pode ser divido em duas abordagens de sucesso: i) expresso do antgeno na

superfcie dos esporos fusionado as protenas de capa ou ii) dentro da clula

vegetativa (ISTICATO et al., 2001; PACCEZ et al., 2006, 2007).

Na primeira abordagem, a protena heterloga expressa no esporo em fuso

com uma protena exposta em sua superfcie, como a CotB, CotC ou CotG,

frequentemente denominada de estratgia OUT (fora) (DUC et al., 2003; ISTICATO et

al., 2001; LEE et al., 2010a, b; MAURIELLO et al., 2004; NING et al., 2011;

PERMPOONPATTANA et al., 2011; POTOT et al., 2010). At o momento, foi

fusionada a capa dos esporos apenas antgenos com interesse vacinal, para os quais

eram esperadas respostas imunolgicas protetoras. Essa estratgia permite uma

melhor apresentao do antgeno carreado nos stios aferentes do tecido linfide

associado mucosa (MALT), induzindo respostas imunes adaptativas, tais como

respostas de anticorpos especficos de mucosa (IgA) e sistmicos (IgG) (CERAGIOLI

et al., 2009; HOANG et al., 2008).

Na segunda abordagem utilizada com sucesso, a lgica distinta e emprega

plasmdeos, no qual o gene recombinante expresso sob o controle de promotores

ativos apenas na fase de clula vegetativa, imediatamente aps a germinao dos

esporos, denominada de estratgia IN (dentro) (PACCEZ et al., 2006, 2007). Esta

abordagem de entrega de antgeno baseia-se no fato de que os esporos de B. subtilis

germinam durante o trnsito atravs do trato gastrointestinal e depois da captura

pelas clulas apresentadoras de antgeno (DUC et al., 2004; DUC; HOANG;

CUTTING, 2003; HOA et al., 2001). Tais esporos recombinantes demonstraram

induzir anticorpos especficos na mucosa (IgA fecal) e no soro (IgG) aps

administrao pelas vias de mucosa (nasal ou oral) (FERREIRA; FERREIRA;

SCHUMANN, 2005; LUIZ et al., 2008; PACCEZ et al., 2006, 2007 ).

35

Infelizmente, estratgias empregando os esporos ou clulas vegetativas de B.

subtilis como carreadores vacinais demonstraram uma baixa imunogenicidade aos

antgenos carregados (FERREIRA; FERREIRA; SCHUMANN, 2005). De fato, trs

fatores podem contribuir para a reduo da imunogenicidade do B. subtilis,

especialmente aps a entrega por via oral. O primeiro fator pode ser atribudo

entrega de uma pequena quantidade de antgeno vacinal ao sistema imunolgico e

consequente falha na ativao deste. Um segundo fator, a exposio natural e

frequente aos esporos presentes nos alimentos ingeridos e gua podendo levar a

tolerncia imunolgica e, em consequncia o desenvolvimento de mecanismos

imunossupressores que reduzem ou bloqueiam a induo de respostas imunolgicas

mais fortes s protenas de esporos e aos antgenos associados (CERAGIOLI et al.,

2009; DUC et al., 2004). Por fim, outro fator que certamente afeta a imunogenicidade

de esporos de B. subtilis, e nunca antes avaliado, o rpido trnsito atravs do trato

gastrointestinal aps administrao oral. Apesar da evidncia de que os esporos de B.

subtilis germinam durante o trnsito atravs do intestino de mamferos, B. subtilis

administrados oralmente, sejam na forma clulas vegetativas ou de esporos, so

totalmente eliminados do intestino dos camundongos em menos de 72 horas, o que

reduz a possibilidade de interao produtiva com o tecido linfide associado ao trato

gastrointestinal (GALT) e com as clulas M presentes nas placas de Peyer (DUC;

HOANG; CUTTING, 2003; DUC et al., 2004). Desta forma, abordagens que permitam

o aumento do contato e o direcionamento dos esporos para o GALT podem resultar

em potencializao da resposta imunolgica contra o antgeno de interesse.

A expresso de protenas heterlogas na superfcie dos microrganismos

uma estratgia com aplicaes em vrias reas do conhecimento como:

microbiologia, biotecnologia e vacinologia. Os veculos vivos de entrega apresentam

vantagens para a induo de respostas de anticorpos antgeno-especfica quando

expressam protenas heterlogas em sua superfcie, principalmente no caso de

bactrias no patognicas, como o caso do B. subtilis (KLEMM; SCHEMBRI, 2000;

SAMUELSON et al., 2002). Bactrias comensais no invasivas, em geral so

ineficientes em gerar fortes respostas de anticorpos, contudo tem sido demonstrado

que esses veculos vacinais podem ser melhorados pela co-expresso de adesinas

36

que iro auxiliar no direcionamento para o epitlio da mucosa (CANO et al., 1999;

LILJEQVIST et al., 1999).

Adesinas presentes na superfcie das bactrias permitem um ntimo contato

com as clulas eucariticas e so importantes na colonizao do hospedeiro por

microrganismos (NAVARRE; SCHNEEWIND, 1999). A especificidade da adesina

bacteriana por um determinado receptor permitir um direcionamento deste para

stios especficos, refletindo em tropismo por um tecido (KLEMM; SCHEMBRI, 2000).

A protena SlpA de Lactobacillus brevis ATCC8287, assim como a invasina

(InvA) de Yersinia pseudotuberculosis, so protenas de superfcie com papel de

adesina que permite a colonizao de superfcies do hospedeiro (CLARK; HIRST;

HYNONE et al., 2004; JEPSON, 1998). A SlpA de L. brevis o constituinte da

camada S deste microrganismo, e uma protena altamente bsica com massa

molecular variando entre 38 55 kDa capaz de interagir com as protenas da matriz

extracelular como fibronectina, laminina e colgeno (VIDGRN et al., 1992; YASUI;

YOD; KAMIYA, 1995).

A protena invasina de Y. pseudotuberculosis permite a adeso e a

subsequente internalizao da bactria por meio da ligao ao receptor 1- integrina

localizado na superfcie das clulas M das placas de Peyer (CLARK; HIRST;

JEPSON, 1998; LePORE, 2008). A interao da invasina com o receptor 1-

integrina induz uma reorganizao do citoesqueleto da clula que forma pseudpodes

que englobam e internalizam a bactria (YOUNG; FALKOW; SCHOOLNIK, 1992). A

poro C-terminal desta protena, mais precisamente os ltimos 197 resduos de

aminocidos, so suficientes para a ligao da bactria as clulas epiteliais, mas no

para sua internalizao (LEONG; FOURNIER; ISBERG, 1990).

A baixa imunogenicidade do antgeno carregado aps o uso de bactrias

lcticas como veculos vacinais vivos, incapazes de colonizar o trato gastrointestinal

de mamferos, induziu pesquisadores a empregar uma estratgia inovadora. Nessa

abordagem a bactria foi geneticamente modificada para expressar adesinas

bacterianas com capacidade de reconhecer receptores de clulas do hospedeiro,

permitindo o direcionamento e aumentando o contato com clulas intestinais.

Linhagens de Lactococcus lactis recombinantes expressando a protena A de ligao

37

a fibronectina de Staphylococcus aureus ou a internalina A de Listeria monocytogenes

mostraram uma capacidade aumentada para se ligar e invadir clulas de mamferos e

foram mais eficientes como veculo de entrega para vacinas de DNA (GUIMARES et

al., 2005, 2006; INNOCENTIN et al., 2009). Adicionalmente, a expresso da poro

N-terminal da SlpA de L. brevis em L. lactis permitiu que esta bactria, antes no

adesiva, aderisse a fibronectina e as clulas intestinais humanas in vitro (AVLL-

JSKELINEN; LINDHOLM; PALVA, 2003).

Uma estratgia similar foi empregada com sucesso usando uma E. coli no

patognica expressando a invasina de Y. pseudotuberculosis. A linhagem

recombinante de E. coli foi capaz de invadir clulas de mamferos e entregar

plasmdeos e protenas produzindo efeitos teraputicos em tumores (CRITCHLEY et

al., 2004; CRITCHLEY-THORNER; STAGG; VASSAUX, 2006; GRILLOT-COURVALIN

et al., 1998). Apesar do potencial deste tipo de abordagem, ela nunca foi aplicada a

outras bactrias gram positivas no invasivas, tais como o B. subtilis.

1.7 Vacinas de mucosa baseadas em B. subtilis

A via de imunizao tem efeito significativo sobre a natureza da resposta

imunolgica. Nas ltimas dcadas tem havido um crescente interesse em vacinas de

administrao mucosa, visto que estas so alternativas seguras, no precisam de

agulhas o que resulta em maior aceitabilidade pela populao e no necessitam de

profissionais treinados para aplicao. Alm disso, vacinas de mucosa so capazes

de estimular tanto respostas imunolgicas de mucosa (IgA) como sistmicas (IgG),

sendo efetivas contra um grande nmero de patgenos (BELYAKOV; AHLERS,

2009; NEUTRA; KOZLOWSKI, 2006). Entretanto, h a necessidade do uso de

veculos vacinais com estabilidade trmica e resistncia aos estresses induzidos

quando da passagem pelas vias de mucosa, esse o caso dos esporos de B. subtilis.

Dentre as vias de mucosa utilizadas com o B. subtilis como veculo vacinal,

podemos destacar as vias oral, nasal e, mais recentemente, a sublingual (AMUGUNI;

TZIPORI, 2012; LUIZ et al., 2008; PACCEZ et al., 2007). As primeiras estratgias

usando B. subtilis como veculo vacinal foram baseadas na administrao oral das

38

linhagens vacinais contra uma variedade de patgenos humanos e de animais.

Contudo, apesar dos resultados iniciais promissores desta via de administrao, o

pouco conhecimento do processamento do antgeno, a necessidade de usar uma

grande quantidade de antgeno e altos nmeros de doses, associados a muitos

insucessos induziram a busca de outras vias de administrao (CUTTING et al., 2009;

FU et al., 2008; HU et al., 2011; LUIZ et al., 2008; NING et al., 2011; PACCEZ et al.,

2007; PERMPOONPATTANA et al., 2011).

A via nasal tem demonstrado potencial aplicao visto que capaz de induzir

respostas sistmicas e de mucosa superiores a administrao oral, com nmero de

doses menores e concentrao menor do antgeno. Abordagens vacinais baseadas

em B. subtilis, principalmente aquelas empregando esporos recombinantes

expressando o antgeno na superfcie, usando essa via produziram resultados

similares e, em muitos casos, superiores aos obtidos com a imunizao oral, com

produo de altos ttulos de IgA nas mucosas e de IgG srico, permitindo a reduo

da quantidade de esporos usados e melhora do protocolo vacinal (DUC et al., 2007;

LEE et al., 2010; LEE et al., 2010b). Contudo, a segurana desta via tem sido

criticada desde que alguns estudos demonstraram que antgenos inalados ou

adjuvantes co-administrados podem percorrer um caminho retrgrado pelo bulbo

olfativo e causar efeitos colaterais (ARMSTRONG et al., 2005).

Mais recentemente grupos tem explorado a via sublingual como alternativa a

via oral e, possivelmente, para via nasal. Na via sublingual os antgenos no sofrem

com a degradao por enzimas, alm disso, o antgeno rapidamente absorvido. De

fato, trabalhos usando esporos de B. subtilis tem demonstrado a capacidade desta via

de induzir anticorpos sistmicos e de mucosa protetores contra a toxina tetnica em

camundongos e leites (AMUGUNI et al., 2011, 2012). Contudo, estudos mais

aprofundados so necessrios para caracterizar melhor a captura, processamento e

gerao de respostas contra os antgenos carreados pelo B. subtilis usando essa via

de administrao.

39

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Este projeto teve como objetivo desenvolver e caracterizar diferentes

estratgias vacinais contra a crie dental humana causada pelo S. mutans usando

linhagens geneticamente modificadas de B. subtilis. As linhagens de B. subtilis foram

modificadas para expressar como antgeno vacinal um fragmento (P139-512) da

protena P1, a maior protena de superfcie de S. mutans, claramente envolvida na

adeso do patgeno a superfcie dental.

2.2 Objetivos especficos

O trabalho de tese envolveu trs objetivos especficos, cada um deles

representando uma etapa das pesquisas realizadas. (i) Caracterizao das

propriedades antignicas e imunognicas de um novo fragmento derivado da protena

P1 de S. mutans, a protena P139-512, expresso em linhagem recombinante de B.

subtilis; (ii) Uso da protena P139-512 como alvo em vacinas de subunidade em

associao com diferentes adjuvantes; (iii) Construo e caracterizao de um novo

sistema de entrega baseado em esporos de B. subtilis com capacidade interagir com

clulas intestinais e avaliao do potencial vacinal contra o S. mutans.

40

3 MATERIAIS E MTODOS

3.1 Linhagens e vetores bacterianos, condies de cultivo

As linhagens e os vetores bacterianos utilizados nesta tese esto descritos nas

Quadros 1 e 2. As condies de cultivo foram especficas para cada linhagem, sendo

que as cepas de S. mutans foram cultivadas em meio THY ou BHY a 37 C com 5%

de CO2. A linhagem de S. mutans PC3370 foi cultivada em meio contendo tetraciclina

(15 g/ml) e a linhagem PC3370C em meio com tetraciclina (15 g/ml) e canamicina

(500 g/ml). As linhagens de B. subtilis e de E. coli foram mantidas em meio Luria

Bertani (LB) com antibiticos especficos a 37 C em aerobiose.

3.2 Competncia e transformao em E. coli

A competncia qumica e transformao trmica de E. coli foi realizada de

acordo com protocolos descritos por Sambrook et al. (2001). Para o preparado de

competncia uma unidade formadora de colnia (ufc) de E. coli DH5, previamente

isolada em meio LB contendo MgCl2 (25 mM), foi inoculada em 5 ml de LB e incubada

a 37 oC, 200 rpm por 16 horas. Depois, 500 l da cultura foi inoculada em 50 ml de LB

e incubada a 37 oC at atingir a D.O600nm de 0.5 0.6. Em seguida, a cultura foi

mantida em gelo por 15 minutos e depois centrifugada (5.000 rpm, 10 minutos, 4oC).

As clulas foram ressuspendidas em 16 ml de RF1 (100 mM RbCl, 50 mM

MnCl2.4H2O, 30 mM KOAc, 10 mM CaCl2.2H2O, 15% (peso/vol), pH ajustado para 5.8

usando 0.2 M de cido actico) e mantidas em gelo por 60 minutos, em seguida foram

centrifugadas (5.000 rpm, 10 minutos, 4 oC). Logo aps, a amostra foi ressuspendida

em 4 ml de RF2 (10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2.2H2O, 15% (peso/vol), pH

ajustado para 6.8 usando 1 M de NaOH) e mantida em gelo por 15 minutos. Amostras

de 200 l foram imediatamente congeladas usando nitrognio lquido e depois

estocadas a 80 oC.

41

Para a transformao foi usada uma amostra de clulas quimiocompetentes

(200 l) para cada vetor a ser transformado. As clulas foram incubadas em gelo por

10 minutos e a mistura de ligao foi adicionada. O conjunto foi incubado em gelo por

35 minutos e colocado em banho-maria a 42 C por 2 minutos. Imediatamente, a

mistura foi incubada em gelo por 10 minutos e foi adicionado 800 l de SOC (2%

triptona (peso/vol), 0.5% extrato de levedura (peso/vol), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10

mM MgCl2, 20 mM glicose), para cada tubo de transformao. Novamente, a amostra

foi incubada por 90 minutos a 37 C com agitao leve (100 rpm). A suspenso foi

semeada em placas de LB contendo os antibiticos de escolha e mantida a 37 C por

uma noite, para obteno das colnias transformantes.

3.3 Competncia e transformao em B. subtilis

As linhagens de B. subtilis preparadas para transformao seguiu protocolo

descrito por Anagnostopoulos e Spizizen (1961). O B. subtilis torna-se competente

aps cultivo em meio HS (20% de glicose, 0.1% de L-triptofano, 10% de extrato de

levedura, 2% de casaminocidos, 8% de arginina e 0.4% de histidina) at o incio da

fase estacionria (D.O600nm igual ou superior 3). Nessa D.O foi adicionado 1 ml de

glicerol 80% para cada 10 ml de cultura competente e esta foi separada em amostras

(1 ml) armazenadas a 80 C at sua utilizao.

Para a transformao de B. subtilis uma amostra de clula competente foi

inoculada em 10 ml de meio LS (S-Base Mg2+ 1X; 20% glicose; 0.1% L-triptofano; 2%

casaminocidos; 2% extrato de levedura; 500 mM MgCl2). A cultura foi incubada por 2

horas a 30 C, sob agitao constante, aps este perodo foi adicionado 100 l de

EGTA (etilenoglicol tetractico). Novamente, a cultura foi incubada a 30 C por 5

minutos, uma amostra de 1 ml foi retirada e o vetor de interesse foi adicionado.

Seguiu-se nova incubao a 37 C por 2 horas. Ao final, a cultura foi centrifugada, o

precipitado ressuspendido em 200 l de meio LS, semeado em placas LB contendo o

antibitico de escolha e incubado por uma noite 37 C.

42

Quadro 1 - Linhagens empregadas e construdas neste trabalho.

Linhagens Caractersticas Referncia

S. mutans

UA159 Linhagem selvagem do sorotipo c; genoma sequenciado AJDIC et al.(2002)

NG8 Linhagem selvagem do sorotipo c, ErmS, Spec

S, Kan

S LI et al.(2001)

PC3370 S. mutans NG8 spaP::tetR

CROWLEY et al. (1999)

PC3370C PC3370 contendo o vetor pMAD (P1 completa); Tet

R;

KanR

BRADY et al. (1998)

E. coli

DH5 F

-80dlacZM15 (lacZYA-argF)U169 deoR, recA1

endA1 hsdR17(rk- mk

+ phoA supE44

- thi-1 gyrA96 relA1

Invitrogen

CG14 M15(pREP4) albergando o vetor pCG14 BRADY et al. (1998)

B. subtilis

1012 leuA8 metB5 trpC2 hsrdRM1amyE::neo. WEHRL; NIEDERWEIS; SCHUMANN, (2000)

DV701 1012 transformada com o vetor pLDV701 (P139512 sobre o controle do promotor Pgrac).

Este trabalho

LDV700 1012 transformado com pHCMC03. Este trabalho

LDV702 1012 transformada com vetor pLDV702. Este trabalho

BsSlpA 1012 expressando o gene slpA de L. brevis (thrC::slpA-

SpecR)

Este trabalho

LDV703 BsSlpA transformada com o vetor pLDV702. Este trabalho

BsInvA 1012 expressando a protena InvA (invA) de Y. pseudotuberculosis (thrC::invA-Spec

R).

Este trabalho

LDV704 BsInvA transformado com pLDV702. Este trabalho

BsInv600 1012 expressando a regio ligadora da protena InvA (inv600) de Y. pseudotuberculosis (thrC::inv600-Spec

R).

Este trabalho

LDV705 BsInv600 transformado com pLDV702. Este trabalho

43

Quadro 2 - Vetores empregados e construdos neste trabalho.

Plasmidios Caractersticas Referncia

pGEM-T-Easy

Ampr; operon lac;T- end

Promega

pCG14 Derivado do pQE-30 clonado com o gene spaP que codifica

para os aminocidos 39 a 1561 da protena P1 BRADY et al. (1992)

pGP1N

pGEM-T- Easy clonado com a sequncia que codifica para a regio N-terminal da protena P1 de S. mutans UA159 (P139-512)

Este trabalho

pDG1731 Vetor para integrao ectpica no gene thrC; AmpR, Spec

R

GUEROUT-FLEURY; FRANDSEN; STRAGIER, (1996)

pDGcotB pDG1731 contendo o fragmento que codifica para a regio N-terminal do gene cotB e seu promotor proveniente da linhagem 1012 de B. subtilis

Este trabalho

pSlpA pDGcotB clonado com o gene slpA de L. brevis Este trabalho

pInvA pDGcotB clonado com o gene invA de Y. pseudotuberculosis

Este trabalho

pInv600 pDGcotB clonado com a regio ligadora do gene invA Este trabalho

pHT08 AmpR; Cm

R; Promotor induzvel por IPTG (Pgrac); His-tag NGUYEN; PHAN;

SCHUMANN, (2007)

pLDV701 Vetor pHT08 clonado com o gene spaP1N (codifica para a

protena P139-512) Este trabalho

pHCMC03 PgsiB (Promotor induzvel por estresse), ApR; Cm

R PHAN; NGUYEN;

SCHUMANN (2006)

pLDV702 Vetor pHCMC03 clonado com o gene spaP1N (codifica

para a protena P139-512) Este trabalho

44

3.4 Lise de clulas vegetativas de B. subtilis

Amostras de clulas de B. subtilis foram vigorosamente ressuspendidos em

tampo lise (30% sacarose, 50 mM Tris-HCl 7.2, 800 g/ml de lisozima) e incubadas

a 37 C por 15 minutos. Foi adicionado 10 l de SDS (dodecil sulfato de sdio)

seguido por homogeneizao vigorosa. As amostras lisadas foram armazenadas a

80 C at o momento do uso.

3.5 Extrao de protenas totais de S. mutans

Culturas de S. mutans crescidas por 16 horas em meio BHY ou THY foram

centrifugadas (7.000 rpm, 5 minutos). As clulas foram lavadas duas vezes

vigorosamente com gua destilada estril. Em seguida, o material foi ressuspendido

em 1/3 do volume inicial em gua destilada e submetido a trs ciclos trmicos (30

minutos -80 C, seguido por 30 minutos 37 C). A mistura foi homogeneizada

vigorosamente com 800 g/ml de lisozima e incubado por 1 hora a 37 C. Por fim, foi

adicionado 1/10 volume de SDS a 10% e a mistura foi ressuspendida vigorosamente.

As amostras lisadas foram armazenadas a 80 C at o momento do uso.

3.6 Induo e purificao da protena CG14 a partir de E. coli

A induo e purificao da protena P1 completa (CG14) de S. mutans NG8 em

sistema pQE-30 de E. coli seguiu protocolo descrito por Brady et al., 1998.

3.7 Produo de anticorpos anti-P1 de S. mutans

A protena purificada P1 (CG14) foi inoculada por via subcutnea em

camundongos Balb/c. O protocolo de imunizao foi o de cinco doses com intervalo

de 15 dias e a coleta de soro foi feita 15 dias aps a ltima dose. Foi administrado por

45

dose 10 g de protena/animal. A primeira dose foi administrada com adjuvante

completo de Freund e as demais com adjuvante incompleto de Freund. As amostras

de soro foram preparadas para uso e estocadas a 20 C at uso.

3.8 Construo do vetor de clonagem pGP1N

3.8.1 Isolamento de DNA genmico de S. mutans

Uma amostra de S.mutans UA159 crescido (2 ml) por uma noite a 37 C foi

centrifugada (7.000 rpm, 5 minutos). Ao precipitado foi adicionado 400 l de tampo

de lise (50 mM EDTA, 0.5% -mercaptaetanol, 3% SDS, 50 mM Tris HCl pH 7.2). O

precipitado foi ressuspendido vigorosamente e depois incubado por uma hora a 65 oC

com agitao a cada 15 minutos. Aps a incubao, as amostras lisadas foram

tratadas com igual volume de fenol:clorofrmio (1:1) e submetidas centrifugao. A

fase aquosa (superior) foi retirada e transferida para outro tubo, ao qual foi adicionado

igual volume de clorofrmio:alcol isoamlico (24:1). Novamente a amostra foi

centrifugada e a fase superior removida e transferida para outro tubo. Em seguida, foi

adicionado 200 l de isopropanol absoluto e 40 l de acetato de sdio 3 M (NAOAc),

as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi

lavado com 500 l de etanol 70% e centrifugado (5 minutos, 10.000 rpm), o

sobrenadante foi descartado e o precipitado seco foi ressuspendido em 30 l de gua

milliQ estril contendo 50 g/ml de RNAse. As amostras foram analisadas em gel de

agarose 0,8% e estocadas a -20 C.

3.8.2 Amplificao do gene spaP1N por reao em cadeia da polimerase (PCR) e

clonagem no vetor pGEM-T-easy

A regio do gene spaP que codifica para sua poro N-terminal sem o peptdeo

sinal e uma pequena poro da regio V da protena P1, foi denominada nesta tese

de spaP1N e foi amplificada usando iniciadores especficos desenhados (Quadro 3).

Para as reaes de amplificao foram empregadas 100 ng de DNA genmico da

46

linhagem UA159 de S. mutans, 1.5 pmoles de cada iniciador, 1.6 mM de dNTP, 4 mM

de MgCl2, 1X tampo da enzima e 1 unidade de Taq DNA polimerase Platinum

(Promega, Madison, Wisconsin, USA) para um volume final de 50 l. O ciclo de PCR

empregado foi: 2 minutos a 92 oC, 2 minutos a 94 oC, 3 minutos a 56 oC, 2 minutos

72 oC, repetio por 29 vezes, 20 minutos a 72o C. O produto gerado foi analisado

com eletroforese em gel de agarose 0,8%.

O produto de PCR originado foi purificado usando o kit GFX (Amersham,

USA) segundo mtodo descrito pelo fabricante e posteriormente, submetido a reao

de adio de cauda poli-A. Para a reao foram empregados 100 ng de fragmento de

PCR purificado, 0.5 mM de dATP, tampo enzimtico 1X e 1 unidade de enzima CIAP

(calf intestinal alkaline phosphatase, Fermentas, Pittsburgh, Pensilvnia, USA) para

um volume final de 50 l. A reao foi incubada por 15 minutos a 37 oC, seguida por

inativao a 70 oC por 5 minutos. Novamente, os produtos foram purificados com kit

GFX.

O fragmento preparado foi utilizado para a clonagem no vetor pGEM-T-Easy

(Promega), sendo utilizado 150 ng de inserto, 50 ng de vetor, 1 unidade de T4 DNA

ligase, 1X tampo enzimtico, 1X polietilenoglicol (PEG 4000) e H2O milli-Q q.s.p 10

l. A reao foi incubada por 1 hora a 22o C e depois por uma noite a 4o C. A mistura

de ligao foi transformada em linhagem quimiocompetente de E. coli K12 por mtodo

de choque trmico (SAMBROOK et al., 2001). As colnias de E. coli resistentes

ampicilina e deficientes na converso do X-gal (colnias brancas) foram submetidas

ao isolamento do DNA plasmidial e clivagem com enzimas de restrio para

confirmao da clonagem dos fragmentos amplificados (SAMBROOK et al., 2001). O

vetor originado foi denominado de pGP1N (Quadro 2) e foi confirmado por

sequenciamento.

47

Quadro 3 - Iniciadores desenhados para a amplificao dos genes de interesse.

GENE NOME STIO DE

RESTRIO1

SEQUNCIA

spaP1N

FWspaP BamHI aaaggatccatggatgaaacgaccactac

RVsbr AatII cgcgacgtcatttggctcaagatcatagac

cotB

CotB5 BamHI ggccatggatccacggattaggccgtttgtcc

CotB3 HindIII ggccataagcttggatgattgatcatctgaagatt

slpA

SlpAFw HindIII caacgactgctaagcttatgaagtcatacgct

SlpARv EcoRI ggccatgaattccgttatcgttggtggc

invA

InvAFw HindIII atatccctaaagcttgtacctacgctgaccggt

InvA3 EcoRI ggccatgaattctattgacagcgcacagagcg

Inv600 InvA5 HindIII ggccataagcttcttttccagccaatcagtga

1 Sequncia de restrio sublinhada

48

3.9 Construo do vetor de expresso pLDV701

A subclonagem do gene spaP1N no vetor de expresso pHT08 de B. subtilis

envolveu a obteno do fragmento por meio de dupla digesto com as enzimas

BamHI e AatII a partir do vetor pGP1N, assim como digesto do vetor pHT08 com as

mesmas enzimas. Para tal reao foram empregados 200 ng de vetor, 1X tampo

enzimtico, 1 unidade de BamHI, 1 unidade de AatII e H2O q.s.p 50 l, a digesto foi

mantida por 2 horas a 37o C. Aps este perodo, as amostras foram submetidas a

eletroforese em gel de agarose 0,8% e a banda correspondente ao fragmento de

interesse, aproximadamente 1.4 kb, foi excisada, e purificado com kit GFX segundo

instrues do fabricante. O produto purificado e quantificado foi ligado empregando a

reao de ligao: 150 ng de inserto, 50 ng de vetor, 1 unidade de T4 DNA ligase, 1X

tampo enzimtico, 1X PEG 4000 e H2O milli-Q q.s.p 10 l. A reao foi incubada por

1 hora a 22 C e depois por uma noite a 4 C. A mistura de ligao foi transformada

em linhagem competente de E. coli K12 DH5. As colnias que cresceram em meio

seletivo foram isoladas e submetidas a extrao de DNA plasmidial, seguida de

anlise de restrio com as correspondentes enzimas e visualizao em gel de

agarose. O vetor construdo foi denominado de pLDV701 (Quadro 2).

3.10 Expresso da protena recombinante P139-512 em linhagem de B. subtilis

LDV701

O vetor pLDV701 construdo e o vetor pHT08 (controle) foram introduzidos por

transformao natural em clulas competentes da linhagem 1012 de B. subtilis,

originando as linhagens LDV701 e LDV700, respectivamente (Quadro 1). Um clone

recombinante transformado com o vetor pLDV701 e outro com pLDV700 foram

selecionados e submetidos a induo da expresso proteica. As linhagens de B.

subtilis LDV701 e LDV700 (controle) foram crescidas em meio LB, com 30 g/ml de

cloranfenicol a 37 oC sob agitao constante (200 rpm) por 16 horas. Aps esse

perodo, 1 ml do pr-inculo foi diludo em 50 ml de meio LB com cloranfenicol (20

g/ml) e incubado a 37 oC sob agitao at atingir a D.O600nm de 0,6-0,8. Nesta D.O

49

foi retirado 1 ml da cultura, centrifugado (5 minutos, 7.000 rpm). O precipitado,

denominado de T0 (tempo 0), foi congelado a 20 oC. A induo da expresso da

protena P139-512 foi realizada com a adio de IPTG (Isopropil -D-tiogalacyosdeo)

na concentrao final de 1 mM ao restante da amostra. Aps a adio do agente

indutor a linhagem foi cultivada a 37 oC sob agitao por mais 4 horas. Ao final a

amostra induzida foi centrifugada (7.000 rpm, 10 minutos), e o precipitado (T4) foi

congelado a -20 oC. As amostras correspondentes ao T0 e T4 de B. subtilis foram

lisadas conforme protocolo de lise proteica e preparados com tampo de amostra de

SDS-PAGE. As suspenses foram aquecidas a 100 oC por 10 minutos e depois

analisadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (SAMBROOK et al., 2001).

3.11 Fracionamento da amostra induzida de LDV701

Inicialmente, os precipitados induzidos de B. subtilis LDV701 e LDV700 foram

submetidos a ressuspenso vigorosa com 1/10 do volume de tampo F (0.1 M Tris

HCl pH 7.0, 0.5 M NaCl) e lisozima (800 g/ml), seguido por uma incubao em gelo

por 30 minutos. Posteriormente,foi adicionado 0.01% SDS e 0.01 mM PMSF

(fenilmetanosulfonilfluorido), e as suspenses foram sonicadas por 2.5 minutos, com

pulso ativo de 30 segundos e pausa de 1 minuto, com amplitude minma de 40% por 3

vezes. Aps o fracionamento, as amostras foram centrifugadas (1 hora, 13.000 rpm,

4 C), o precipitado foi separado do sobrenadante e estes foram denominados de

extrato insolvel (I) e solvel (S), respectivamente. Amostras dos extratos solveis e

insolveis foram preparadas com tampo de amostra, fervidas por 5 minutos, e

analisadas em gel desnaturante de poliacrilamida. A concentrao de protenas foi

determinada usando kit de quantificao proteica BCA (Pierce, Rockford, Ilinois,

USA), com soro albumina bovina como padro.

50

3.12 Purificao da protena recombinante P139-512 a partir de linhagem

recombinante de B. subtilis

O extrato solvel da linhagem LDV701 foi aplicado no aparelho FPLC (fast

performance liquid chromatograph) AKTA usando colunas niqueladas segundo

instrues do fabricante (Amersham Bioscience). As amostras foram eludas com

tampo B (0.1 M Tris HCl, 0.5M NaCl, pH 7.5) com concetraes crescentes de

imidazol (0.05 M at 1 M) e as eluies foram verificadas em gel de policrilamida.

3.13 SDS-PAGE e Western blot da protena P139-512

A eletroforese em gel desnaturante de policarilamida (SDS-PAGE) foi feita

segundo protocolo descrito por Laemmli (1970), e usando o aparelho Mini Protean II

vertical electrophoresis unit (Miniprotean, BioRad). Para os ensaios com a protena

P1 completa foram usados gis de poliacrilamida com concentrao de 7.5%, para os

demais ensaios foram empregados gis de 12.5%. Os Western blots foram realizados

usando incubao das membranas de nitrocelulose com anticorpo anti-P1 especfico

(1:3,000) ou anti-P139-512 (1:2,000). As bandas reativas foram detectadas com kit de

quimio luminescncia (Super Signal, Pierce), como descrito pelo fabricante.

3.14 Expresso e purificao dos fragmentos da protena P1

Os fragmentos da P1 (CK2, LT1, MA41, NR5) foram produzidos e purificados

seguindo os protocolos descritos por McArthur et al. (2007); Rhodin et al. (2004);

Robinette et al. (2009, 2011).

3.15 Preparao dos anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1

Os mAbs anti-P1 (mAb 3-8D, 1-6F, 4-9D e 4-10A) foram obtidos de hibridomas

previamente estabelecidos no laboratrio da Dra L. Jeannine Brady (AYAKAWA et al.,

51

1987). Todos os mAbs empregados neste trabalho foram purificados seguindo o

protocolo descrito por Robinette et al. (2009).

3.16 Reatividade dos anticorpos monoclonais anti-P1 com a protena P139-512 por

meio de Western blot

A protena P139-512 recombinante purificada de B. subtilis foi submetida

MILENE TAVARES BATISTA Uma nova estratégia vacinal para o ...

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