microscopia

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MICROSCOPIA

Ana Paula DiasVanessa Priscila Moreira

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Índice:

Introdução Tipos de Microscópio:

Microscópio de Contraste de Fase e Interferência de Nomarski

Microscópio de PolarizaçãoMicroscópio Óptico (Luz)Microscópio de Fluorescência ComumMicroscópio de Fluorescência ConfocalMicroscópio Eletrônico de VarreduraMicroscópio Eletrônico de Transmissão

Desenvolvimento Bibliografia

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Introdução

Desde a antiguidade já havia tentativas de reforçar a visão com o auxílio de dispositivos ópticos, como pedaços de vidros usados como lentes. A partir do século XIV, as lentes começaram a ser usadas comumente para corrigir defeitos de visão e como dispositivos de aumento.

O uso do microscópio atingiu seu apogeu com Leeuwenhoek, que é

considerado o primeiro verdadeiro microscopista. Ele usou microscópios de sua própria construção, dotados de uma única lente (microscópio simples), relatou formas e comportamentos de microorganismos.

Em 1590, os irmãos holandeses Francis e Zacharias Janssens, construíram o primeiro microscópio óptico composto.

Hooke fabricou um microscópio óptico composto mais aperfeiçoado relativamente ao de Janssens e examinou um pedaço de cortiça.

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Introdução

Após estas primeiras descobertas, os estudos microscópicos progrediram muito pouco, e nos duzentos anos seguintes, nenhuma descoberta importante foi feita.

Finalmente, a partir de 1830, começaram a produzir-se lentes acromáticas, que não dão origem a aberrações. Este progresso culminou com a invenção, pelo físico alemão Ernest Abbé, do microscópio acromático com condensador, praticamente idêntico aos utilizados atualmente.

Em 1930, V. Zworkin inventa o microscópio eletrônico. O seu uso veio a revelar a ultraestrutura celular, permitindo aumentar ainda mais o objeto da biologia.

No microscópio eletrônico a luz é substituída por um feixe de elétrons que se propaga no vácuo. Este microscópio não utiliza elementos ópticos, mas lentes eletrostáticas ou magnéticas, do que resulta uma ampliação e um poder de resolução muito maior.

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Tipos de Microscópio

Luz:


Microscópio de Polarização Microscópio Óptico (Luz) Microscópio de Fluorescência Comum Microscópio de Fluorescência Confocal

Eletrônicos:

Microscópio Eletrônico de Varredura Microscópio Eletrônico de Transmissão

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Microscópio de Contraste de Fase e Interferência de

Nomarski Visualização de características estruturais

muito sutis e células únicas contidas em espécimes muito finos (< 5 µm) e não coloridos, pobres em contraste.

Gera imagem com diferentes graus de obscuridade ou luminosidade.

Utiliza índices de refração e difração. Mesma célula é fotografada a intervalos

regulares ao longo de períodos que duram várias horas (movimento celular).

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Aspecto tridimensional.

Paramécia viva observada em contraste de fase

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Microscópio de Contraste de Fase

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Microscópio de Polarização

Observação de materiais birrefringentes músculo, ossos, celulose, fibras, cabelos, cristais, etc.

Dois prismas: um polarizador e outro analisador.

Utiliza índices de refração e difração. O prisma deixa passar apenas uma das

vibrações luminosas. Estruturas birrefringentes (anisotrópicas) →

vibração luminosa que passará, ficando brilhante.

Estruturas isotrópicas → permanece escuro.

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Microscópio de Polarização

Microscopia de luz polarizada. Um fragmento de mesentério do rato foi corado com o método de picro-sirius, que cora fibras de colágeno. O mesentério foi colocado sobre a lâmina e observado por transparência. Sob luz polarizada, as fibras de colágeno exibem intensa birrefringência e aparecem

brilhantes ou em amarelo. Aumento médio.

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Microscópio Óptico

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Parte mecânica → serve de suporte. Parte óptica → dois sistemas de lentes

convergentes. Objetiva → imagem real e aumentada do objeto; Ocular → imagem virtual e aumentada da imagem real.

Aumento total de ampliação: Objetiva aumenta o poder de resolução; Ocular aumenta o material.

Poder separador, ou distância mínima distinguível entre dois pontos, é limitado pela difração da luz.

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Constituição: sistema óptico de ampliação; uma fonte de luz; e um estágio de visualização.

Sistemas de lentes Sistema de Ampliação Resolução Profundidade do foco Diâmetro do campo ocular Sistema Mecânico Sistema de Focalização Sistema de Iluminação

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Lentes Objetivas Acromáticas →Ajustadas para duas cores

(vermelho e verde); Apocromáticas → Ajustadas para três

cores(vermelho, verde e violeta); Não-acromática → Não ajustada para cor alguma. → forma halos coloridos ao redor

da imagem.

Profundidade Focal: distância entre a objetiva e a amostra quando a imagem está em foco.

Sistema de Ampliação

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Lentes Objetivas Poder de Ampliação

Aob = A’B’/ABAB é imagem real e A'B', imagem ampliada e

invertida.

A ampliação, é uma das características ópticas essenciais da objetiva. A ocular, por sua vez, fornece de A’B’ uma imagem virtual A’’B’’ muito afastada, mas que, através do cristalino, se projeta na retina do globo ocular.


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Microscópio Óptico Abertura Numérica da Objetiva

AN = n. sen αsendo n o índice de refração do meio que se

interpõe entre o objeto AB e a lente e α, o ângulo que forma o raio mais externo captado pela lente frontal da objetiva.

Aberturas das objetivas

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Microscópio Óptico Poder de resolução → capacidade que o

microscópio possui de distinguir dois pontos adjacentes.

Limite de resolução ε → menor distância que pode existir entre dois pontos para que apareçam individualizados.

Quanto menor for o limite de resolução, maior será o respectivo poder de resolução.

ε = 0,61 λ l n. sen αonde λ é o comprimento de onda médio da luz

empregue na observação.

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Lentes Oculares Negativa (Huggenian), Positiva (Ramsden) Negativa Verdadeira ("Amplifying").

Principal objetivo → ampliar a imagem fornecida pela objetiva e fazer com que ela se forme na retina do olho do observador.

A ampliação da ocular é função da distância focal (foc) em milímetros:


Aoc = 250/foc

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Diafragma Ocular Tem que ter uma abertura grande para o olho

observar uma maior área do objeto. Geralmente, de 20mm.

O diâmetro máximo do diafragma é limitado pelo máximo ângulo de campo que o observador vê convenientemente, que é por volta de 50º.

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Esquema óptico de formação de imagem

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Corte histológico de uma célula vegetal

Corte histológico de uma célula animal

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Quadro comparativo da microscopia óptica e eletrônica:

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Microscópio de Fluorescência Comum

Invenção → August Köhle (1901-1904). Usa luz de comprimento de onda curto e de

alta energia (normalmente ultravioleta) para excitação de elétrons dentro de algumas moléculas no interior do espécime. Quando voltam para seus níveis de energia iniciais, emitem luz com menos energia e comprimento de onda maior (geralmente no espectro visível) formando, dessa maneira, a imagem. A técnica usa agentes químicos que emitem luz visível

que pode ser verde, laranjada ou vermelho.

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Autofluorescência → tecido demonstra fluorescência quando irradiado por luz ultravioleta.

Imunofluorescência → técnica de conjugação de fluorócromos a anticorpos. Localização e identificação de moléculas

individuais que reagem com o anticorpo; Fornece maior sensibilidade, necessária para a

demonstração das reações anticorpo-antígeno in situ.

Principal fator impulsionador para a microscopia de fluorescência!

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Evolução Wilhelm Conrad Roentgen e Alexandre Edmond

Becquerel → primeiras observações sobre a fluorescência.

Antoine Henri Becquerel → fluorescência exige uma contínua fonte de energia para emitir radiação.

Biólogo marinho Osamu Shimomura → identificou e isolou proteína com autofluorescência de cor verde – Green Fluorescent Protein (GFP).

2008 → Prêmio Nobel da Química aos cientistas que identificaram a estrutura da GFP. Martin Chalfie, Roger Y. Tsien e Osamu Shimomura

(1996).

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Capacidade de isolar diferentes proteínas com um alto grau de especificidade, sendo a sua sensibilidade suficientemente elevada para detectar cerca de 50 moléculas/µm3.

Constituição do microscópio Parte mecânica → sistema de suporte e o

sistema de focagem. Parte óptica → sistema de ampliação e o

sistema de iluminação.

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Sistema de ampliação Oculares

Huygens → simplicidade de construção, baixo custo e desempenho adequado para muitas aplicações; cobertura de campo limitada e uma pequena tensão de relaxamento.

Hi-Point → vantagem de tensão de relaxamento maior (bom para quem usa óculos) e possui a desvantagem de ter a cobertura de campo limitada.

Hyperplane Compensating → evitam a aberração cromática lateral, isto é, distorções das cores na parte periférica do campo de observação.

Ultraplane → especificamente para aplicações fotográficas.

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Sistema de ampliação

Objetivas Somente acromáticas simples são práticas →

autofluorescência de iluminação de campo claro é perigosa para o ser vivo.

Iluminação de fundo escuro → lentes mais elaboradas, com maior abertura e maior “poder de recolha de luz”.

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Sistema de iluminação Fonte de Luz

1. Lâmpadas de mercúrio → mais baratas; corrente alternada;

Amplitudes elevadas para determinados comprimentos de onda, enquanto que noutros a emissão é baixa, o que resulta num perfil de emissão com vários picos;

Tempo de vida → aproximadamente 200 horas.2. Lâmpadas de gás xenônio → requer a adição de

retificadores ao equipamento primário; corrente contínua → adequadas para fluorimetria ou

medição de emissão de fluorescência. perfil mais suave, com predominância de curvas

contínuas.3. Lâmpadas com filamentos de halogênio.

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Sistema de iluminação Fonte de Luz

Diodo de emissão de luz (LED) aparelho semicondutor de tipo estado sólido; períodos de vida muito longos, com poucas

alterações na saída de luz ao logo do tempo de vida; emitem num comprimento de onda apenas, com

uma largura do pico muito estreita; não requer tantos filtros ópticos para selecionar o

comprimento de onda de interesse e não sofre as distorções de luz visualizadas nas de alta pressão.

não existe o perigo de explodir.

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Sistema de iluminação Filtros

Filtros de excitação → vidros de alta resolução com ópticas de interferência, para que permitam ou rejeitem a passagem de luz a determinados comprimentos de onda com grande especificidade e elevada transmissão.

Espelhos dicromáticos → filtros especializados, desenhados para refletir ou permitir a passagem da luz a específicos comprimentos de onda, quando colocados no trajeto da luz com uma inclinação de 45º.

Filtros de barreira → ambos os vidros corados ou com revestimento de interferência (ou uma combinação dos dois).

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Sistema de iluminação Filtros

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Sistema de iluminação Condensador

Ilumina o objeto, usando toda a energia disponível; Direciona os raios, depois do objeto até à objetiva. perigo para os olhos do observador!

Solução: condensador de campo escuro → não permite a entrada de luz direta na objetiva, e adicionalmente, proporciona um fundo escuro que contrasta com a fluorescência.

Diafragma Situa-se junto ao condensador e é o responsável

pelo controle da abertura angular do cone de luz para a iluminação da amostra.

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Princípios Físicos de Funcionamento Princípio Geral

A tarefa crucial do microscópio de fluorescência consiste em permitir que a luz de excitação irradie a amostra e depois separar a luz emitida mais fraca para formar a imagem. Assim, primeiro, a luz, originária da fonte de luz colocada num extremo do microscópio, encontra-se frente a um filtro de excitação que apenas vai deixar passar a radiação com o comprimento de onda desejado, sendo este coincidente com o material fluorescente.

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Princípios Físicos de Funcionamento Princípio Geral

A radiação depois passa pelo espelho dicromático, que faz com que rode 45º colidindo então com os átomos da amostra, o que leva a que os elétrons sejam excitados para um nível energético superior. Quando estes átomos perdem a energia de excitação, retomam o nível energético de repouso e emitem luz (fótons).

Para se tornar visível, a luz emitida torna a passar pelo espelho dicromático sendo depois separada da luz de excitação (absorção) mais brilhante num filtro de barreira. Aqui, o fato de a luz emitida ter energia mais baixa e um maior comprimento de onda é usado para permitir a separação. As áreas fluorescentes são então exibidas e poder-se-ão observar no microscópio, evidenciadas contra um fundo escuro de alto contraste.

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Princípios Físicos de Funcionamento Fenômenos de fading, quenching, photobleaching

Fading (desvanecimento) → redução da intensidade de emissão de fluorescência .

Photobleaching (lixiviamento/branqueamento) → decomposição irreversível das moléculas fluorescentes no seu estado excitado devido à interação destas moléculas com oxigênio molecular antes de emitirem energia.

Quenching (extinção) → redução da intensidade de fluorescência, como resultados de agentes oxidantes ou da presença de sais, metais pesados ou compostos de halogênios. Em alguns casos, o quenching resulta da transmissão de energia para outra molécula (denominada aceitador) fisicamente próxima do fluoróforo excitado (o doador), sendo este fenômeno conhecido por ressonância de energia transferida em fluorescência (FRET – fluorescence resonance energy transfer).

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Princípios Físicos de Funcionamento Variação da luz fluorescente

Em termos matemáticos, a fluorescência produzida (F) é dada pela equação:

F = σ x Q x I onde σ corresponde à absorção molecular do tecido, Q é

o rendimento quântico, e I corresponde ao fluxo de luz incidente.

A eficiência de detecção é dada em função da eficiência do conjunto óptico usado e da eficiência do detector quântico.

A duração de emissão de fluorescência depende da taxa de destruição de fluoróforo como resultado do photobleaching.

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Princípios Físicos de Funcionamento Processamento de amostras

O material biológico é geralmente seccionado, em secções muito finas (na ordem das 3μm) que são colocadas em lâminas.

Podem ser utilizadas em forma de esfregaço ou aplicada a células vivas.

Colheita do tecido, fixação, processamento (Desidratação, Diafanização ou clarificação e Impregnação), inclusão, corte, coloração e montagem.

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Princípios Físicos de Funcionamento Processamento de amostras

Meio de montagem → não poderá causar a sua dissolução ou obscurecimento do fluorócromo.

Deve ser transparente a qualquer comprimento de onda;

Não ser fluorescente; O seu índice de refração deve ser igual ao da lamela; Não deve dissolver amostra em geral e o fluorócromo

em particular; Deve fornecer um ambiente propício ao fluorócromo,

que maximize a sua fluorescência e evite reações que levem ao seu enfraquecimento.

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Aplicações Biologia, Ciências Biomédicas e Ciências dos Materiais. É capaz de revelar a presença de uma única molécula.

Permite o estudo e a observação de células vivas. Como apenas a luz refletida é observada, enquanto a

transmitida é eliminada do campo de visão, cria maior intensidade e a definição da imagem é superior.

Preparações não permanentes, a técnica de fluorescência vai decaindo, ou seja, ao fim de algum tempo de permanência do fluorócromo nas células, o seu efeito desaparece.

Observação das preparações tem de ser efetuada em sala escura, devido à fraca adaptação do olho humano ao escuro, poderá ser difícil a observação de amostras durante algum tempo após o escurecimento da sala.

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Aplicações

Imagem fluorescente de células cultivadas do cérebro de um rato. Células vivas com calceína (esquerda) e células mortas coloridas com iodeto de propídio (direita).

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Microscópio de Fluorescência Confocal

No microscópio confocal, a iluminação é feita por um feixe delgado de raios laser, que varre o corte iluminado, ponto por ponto, em determinado ponto da célula, realizando um verdadeiro “corte óptico”. A imagem é formada exclusivamente pelas estruturas que estão no plano de varredura, sem que os componentes celulares situados em outros planos contribuam para a formação da imagem.

Geralmente, as células são submetidas a um composto fluorescente e a luz emitida é processada num computador, que envia sinais para formação da imagem na tela de um monitor de vídeo. As imagens dos “cortes ópticos” assim obtidas podem ser armazenadas em computador e utilizadas para construir uma imagem tridimensional, ou para cálculos de comprimento, área, volume e ouras análises de acordo com a finalidade do estudo.

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Microscópio de Fluorescência Confocal

Foto de Shirlei Pimentel (Unicamp) Foto de Maria Júlia (Unicamp)

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Microscópio Eletrônico de Transmissão

Análises morfológicas, caracterização de precipitados e determinação de parâmetros de rede.

Observação de modulações na composição química, formação de cristais, estrutura eletrônica e a indução da mudança da fase eletrônica bem como absorção regular da imagem.

Em 1938 a Siemens Corporation construiu o primeiro modelo comercial do MET, o qual exerceu, em meados do século XX,uma imensa influência sobre a biologia e a ciência, ao permitir estudos das ultra-estruturas dos materiais.

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Enquanto o microscópio de luz utiliza fótons como a radiação visível para observação do material celular, o microscópio eletrônico, por sua vez emprega feixes de elétrons. Estes após atravessarem a célula chegam a uma tela fluorescentes onde formam uma imagem visível sobre uma chapa fotográfica que depois serão reveladas podendo ser ampliadas 2 a 4 vezes, sendo chamadas de micrografias. Os elétrons desviados por certas estruturas da célula não contribuirão para formar a imagem e aparecem escuras e são chamadas de eletron-densas. Os componentes celulares que desviam uma pequena percentagem de elétrons aparecerão em diversas tonalidades de cinza.

Hoje o limite de resolução de um microscópio eletrônico de transmissão é 40.000 vezes melhor do que a resolução do microscópio óptico e 2 milhões de vezes melhor que a resolução do olho humano. No entanto não se é possível ainda aproveitar inteiramente a capacidade resolutiva dos melhores microscópios eletrônicos assim ele passa somente a ter 2.000 vezes melhor resolução dos microscópios ótico.

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O MET possui sistemas de iluminação e vácuo que produz feixes de elétrons de alta energia (energia cinética), que ao incidir sobre uma amostra de tecido ultrafina (na espessura de nanômetro), fornece imagens planas, imensamente ampliadas, possuindo a capacidade de aumento útil de até um milhão de vezes e assim permitindo a visibilização de moléculas orgânicas, como o DNA, RNA, algumas proteínas, etc. O sistema de vácuo remove o ar e outras moléculas de gás da coluna do microscópio, evitando assim que ocorra erosão do filamento e propiciando a formação de uma imagem com excelente qualidade e contraste. A imagem é projetada em um anteparo fluorescente, que poderá ser redirecionada para uma chapa fotográfica para registro, ou ainda a imagem pode ser captada por um sistema computadorizado de captação de imagens e armazenada em CD-Rom para futura análise.

Grande parte dos átomos das estruturas celulares tem baixo número atômico e muito pouco contribui para a formação da imagem. O emprego de substâncias que contêm átomos pesados, como ósmio, chumbo e urânio permitem obter um contraste entre as estruturas celulares, contribuindo para uma melhor imagem. Então, por fim, a imagem é também uma resultante da absorção diferenciada de elétrons por diversas regiões da amostra, seja por variação de espessura, seja por interação com átomos de maior ou menor número atômico.

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Para aumentar a interação entre o feixe de luz e a amostra fixa-se o material por perfusão e/ou imersão; - O fragmento geralmente é embebido em tetróxido de ósmio, depois passa por processos de lavagens, desidratado em concentrações crescentes de álcool e imerso em resina (apon, araldite...), onde permanece até a polimerização;

O excesso de resina polimerizada é retirado para expor o material de estudo e permitir o seu fatiamento no ultramicrotomo; - As fatias ultrafinas são colocadas em telas de cobre ou níquel, e são contracoradas geralmente com uranila e chumbo;

Após a obtenção de fotografias, caso não haja um sistema de captação de imagens para CD-Rom, segue-se com a revelação do negativo, revelação e ampliação das fotografias. Análise dos dados.

Otimizando o método

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Foto de Karina Mancini

(Unicamp) Foto de Heidi Dolder (Unicamp)

Foto da Profª. Adelina

Ferreira (UFMT) Foto de Heidi Dolder (Unicamp)

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Microscópio Eletrônico de Varredura

Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) é um instrumento muito versátil e usado rotineiramente para a análise microestrutural de materiais sólidos. Apesar da complexidade dos mecanismos para a obtenção da imagem, o resultado é uma imagem de muito fácil interpretação.

O aumento máximo conseguido pelo MEV fica entre o microscópio ótico (MO) e o Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET). A grande vantagem do MEV em relação ao microscópio ótico é sua alta resolução, na ordem de 2 a 5 nm, atualmente existem instrumentos com até 1 nm, enquanto que no ótico é de 0,5 μm. Comparado com o MET a grande vantagem do MEV está na facilidade de preparação das amostras.

Entretanto, não são apenas estas características que fazem do MEV uma ferramenta tão importante e tão usada na análise dos materiais. A elevada profundidade de foco (imagem com aparência tridimensional) e a possibilidade de combinar a análise microestrutural com a microanálise química são fatores que em muito contribuem para o amplo uso desta técnica.

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Na microscopia eletrônica de varredura os sinais de maior interesse para formação da imagem são os elétrons secundários e os elétrons retroespalhados.

À medida que o feixe de elétrons primários vai varrendo a amostra, estes sinais vão sofrendo modificações de acordo com as variações da superfície. Os elétrons secundários fornecem imagem de topografia da superfície da amostra e são os responsáveis pela obtenção das imagens de alta resolução, já os retroespalhados fornecem imagem característica de variação de composição.

O Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) se tornou um instrumento imprescindível nas mais diversas áreas: eletrônica, geologia, ciência e engenharia dos materiais, ciências da vida, etc. Em particular, o desenvolvimento de novos materiais têm exigido um número de informações bastante detalhado das características microestruturais só possível de ser observado no MEV. Podemos afirmar que onde haja um grupo de desenvolvimento de materiais, há a necessidade de um MEV para as observações microestruturais.

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O MEV tem seu potencial ainda mais desenvolvido com a adaptação na câmara da amostra de detectores de raios-X permitindo a realização de análise química na amostra em observação. Através da captação pelos detectores e da análise dos raios-X característicos emitidos pela amostra, resultado da interação dos elétrons primários com a superfície, é possível obter informações qualitativas e quantitativas da composição da amostra na região submicrometrica de incidência do feixe de elétrons.

Este procedimento facilita a identificação de precipitados e mesmo de variações de composição química dentro de um grão. Atualmente quase todos os MEV são equipados com detectores de raios-X, sendo que devido a confiabilidade e principalmente devido a facilidade de operação, a grande maioria faz uso do detector de energia dispersiva (EDX).

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O canhão de elétrons é o conjunto de componentes cuja finalidade é a produção dos elétrons e a sua aceleração para o interior da coluna. Este feixe de elétrons deve ser estável e com intensidade suficiente para que ao atingir a amostra possa produzir um bom sinal. O diâmetro do feixe produzido diretamente pelo canhão de elétrons é muito grosseiro para produzir uma boa imagem em grandes aumentos e por isso precisa ser reduzido pelas condensadoras (lentes eletromagnéticas). A maioria dos MEV é capaz de produzir um feixe de elétrons que ao atingir a amostra tenha um diâmetro da ordem de 10 nm e que ainda possua corrente suficiente para formar uma imagem com boa resolução.

Vários tipos de canhão de elétrons são usados nos microscópios variando assim a quantidade de corrente que as mesmas podem produzir, o tamanho da fonte, a estabilidade do feixe produzido e o tempo de vida da fonte.

Funcionamento

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Para que uma fonte de elétrons seja considerada uma boa fonte, alguns parâmetros de desempenho devem ser considerados: densidade de corrente, brilho, tempo de vida, tamanho e estabilidade da fonte. O feixe eletrônico é freqüentemente caracterizado pela densidade de corrente, expressa como:

Jb = (corrente/área) = ib / π (d/2)2

Não adianta uma fonte produzir uma quantidade muito grande de elétrons se os mesmos são perdidos ao serem colimados pelas lentes eletromagnéticas, devido a grande divergência do feixe de elétrons. A divergência do feixe está diretamente relacionada com a área de emissão do filamento. O brilho ( β ) é o parâmetro mais adequado para caracterizar o desempenho de uma fonte. O brilho leva em conta tanto a densidade de corrente, como a divergência do feixe de elétrons e é expresso pela equação:

β = corrente / [(área) (angulo sólido)] = 4 ib / π2 d2 α2

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O brilho do feixe eletrônico é uma grandeza muito importante para avaliar o desempenho de uma fonte, de tal maneira que mesmo valores aproximados são validos. Um importante resultado é que o brilho do feixe de elétrons aumenta com a voltagem e diminui com o aumento da temperatura do filamento.

A resolução de um MEV não depende apenas da tensão de aceleração utilizada, mas também do desempenho das lentes condensadoras e do número de elétrons que se consegue tirar do filamento, mantendo a área de emissão a menor possível.

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Na microscopia eletrônica de varredura sinal que fornece a imagem de maior resolução e a dos elétrons secundários. Isto é resultado da profundidade de onde são originados o sinais, ou seja, do volume de interação. O volume de interação pode ser descrito como tendo a forma de uma pêra, conforme pode ser visto na Figura abaixo:

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Portanto, reduzindo o diâmetro do feixe eletrônico, irá resultar num sinal de elétrons secundários com melhor resolução (maiores aumentos), considerando que outros fatores como a relação sinal/ruído não sejam problemas.

O detector mais usado na microscopia eletrônica de varredura é o detector do tipo Everhart-Thornley (ET) é formado pelo cintilador, tubo de luz e a fotomultiplicadora. O detector é isolado eletricamente do resto do microscópio e possui na sua frente uma grade com potencial de +300 eV. Os elétrons secundários, que possuem energia inferior a 50 eV, são atraídos por esta grade carregada positivamente. Este sistema permite coletar com muita eficiência os elétrons secundários provenientes da amostra;

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Uma pequena fração de elétrons retroespalhados também atinge o detector. Todos os elétrons que penetram no detector são acelerados em direção ao cintilador por uma voltagem de +10 kV aplicada a um filme de alumínio depositado sobre o cintilador. Esse potencial deve ser alto para permitir que os elétrons tenham energia suficiente para produzir fótons de luz quando atingirem o cintilador. Esses fótons , através de um guia de luz, são conduzidos a uma fotomultiplicadora onde são transformados num sinal elétrico.

A luz ao atingir a fotomultiplicadora cria um cascata de elétrons gerando um sinal que é amplificado até 108 vezes. Este sistema permite uma grande amplificação do sinal (ES) as custas de muito pouco ruído, desde que o cintilador seja eficiente.

O detector de ES é bastante eficiente sem ser obstrutivo e as imagens de ES são aparentemente” fáceis de interpretar. É basicamente por esta razão que a imagem de elétrons secundários é a mais comumente usada na microscopia eletrônica de varredura.

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Conclusão

O microscópio permite observações que estão fora do alcance da visibilidade direta do olho humano.

Existem diferentes tipos de microscópios, que são escolhidos de acordo com as características da amostra a ser analisada e as condições de trabalho.

É muito utilizado, sobretudo na Biologia Moderna, sendo responsável por algumas das mais importantes descobertas relacionadas com a vida, como é o caso da célula e de toda a sua estrutura e funcionamento.

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Referências Bibliográficas:

http://www.ufmt.br/bionet/conteudos/01.09.04/Microscopia.htm

www.dsif.fee.unicamp.br/~furio/IE607A/MO.pdf http://oficina.cienciaviva.pt/~piv172/PDFs/Aceta

tos%20n%BA20-21.pdf http://www.dbio.uevora.pt/jaraujo/biocel/mftecni

cas.htm http://ciencia.hsw.uol.com.br/microscopios-de-lu

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tm http://www.neurofisiologia.unifesp.br/eletronica.

htm http://www.materiais.ufsc.br/lcm/web-MEV/ME

V_index.htm

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