Microesferas Lipídicas encapsuladas com proteínas ... · O Senhor me proporcionou a...

Universidade de São Paulo Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto Departamento de Química Programa de Pós-Graduação em Química

Microesferas Lipídicas encapsuladas com proteínas

antigênicas da membrana de Leishmania amazonensis

com potencial aplicação terapêutica.

Luiz Eduardo dos Reis Santos

Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade

de São Paulo, como parte das exigências para a

obtenção do título de Mestre em Ciências, Área:

Química.

RIBEIRÃO PRETO -SP

2009

Universidade de São Paulo Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto Departamento de Química Programa de Pós-Graduação em Química

Microesferas Lipídicas encapsuladas com proteínas

antigênicas da membrana de Leishmania amazonensis

com potencial aplicação terapêutica.

Luiz Eduardo dos Reis Santos

Orientador: Prof. Dr. Pietro Ciancaglini

Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade

de São Paulo, como parte das exigências para a

obtenção do título de Mestre em Ciências, Área:

Química.

RIBEIRÃO PRETO -SP

2009

FICHA CATALOGRÁFICA

Santos, Luiz Eduardo dos Reis.

Microesferas Lipídicas encapsuladas com proteínas antigênicas da membrana de Leishmania amazonensis com potencial aplicação terapêutica. Ribeirão Preto, 2009.

83 p.

Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Química.

Orientador: Ciancaglini, Pietro.

1. Microesferas Lipídicas. 2. Leishmania amazonensis. 3. Delivery de Antígenos. 4. Proteínas Antigênicas. 5. Aplicação Terapêutica.

DDDEEEDDDIIICCCAAATTTÓÓÓRRRIIIAAA

Dedico este trabalho...

À minha Mãe. Obrigado por sempre acreditar em mim e por todo o incentivo,

amor, sacrifícios e pelas orações, aliás, foram muitas não é Mãe? A Senhora

dedicou a sua vida à minha educação, me ensinou que os problemas se tornam

pequenos quando temos fé e pessoas amadas ao nosso lado, esta dissertação é

uma vitória sua Mãe! Ah...Muitos créditos para minha Avó e minha Tia Luiza.

Ao meu Pai. Agradeço pelo investimento nos meus estudos, pelos conselhos e

pelas críticas. O Senhor me proporcionou a tranqüilidade para estudar, que

infelizmente, nem todas as pessoas tem.

Ao meu irmão. Obrigado por sempre estar perto nos momentos de alegrias e

tristezas e por sempre me incentivar e acreditar em mim. Mas do que um irmão

você é um grande amigo.

À Rafa. Dificilmente conseguirei expressar em palavras o quão importante você

foi. Você participou ativamente dos meus projetos, das minhas escolhas,

comemorou comigo minhas conquistas e também sofreu com meus fracassos.

“Pequena”, foi grande sua participação nesta conquista!

AAAGGGRRRAAADDDEEECCCIIIMMMEEENNNTTTOOOSSS EEESSSPPPEEECCCIIIAAAIIISSS

Primeiramente agradeço a Deus e a Nossa Senhora que durante toda essa

caminhada me guiaram de forma brilhante.

Em especial agradeço ao meu amigo e orientador,

Professor Dr. Pietro Ciancaglini, pela orientação excepcional, amizade, e pelo

exemplo de dedicação, competência e responsabilidade. Obrigado pelos

ensinamentos transmitidos nestes seis anos de convivência, seus conselhos e

sugestões foram indispensáveis para o meu amadurecimento e crescimento

profissional. Tenho orgulho de lhe ter como referência, pois você é um “verdadeiro

professor universitário”!

À Kátia e a Marcelle, que compartilharam comigo um pouco de seus

conhecimentos, e colaboraram de maneira direta neste trabalho.

À Associação Atlética Acadêmica Lucien Lison (Atlética Filô), pelos amigos e

experiências, que me proporcionou.

À Rep LOKS, agradeço por ter me acolhido nestes meus dois anos de mestrado,

foram anos extremamente valiosos. Agradeço a todos moradores, ex-moradores e

agregados, pelas conversas, festas, e conhecimentos compartilhados. Juma, Pala

e Flor, obrigado pelo carinho, companhia e por sempre me escutarem, sem pedir

nada em troca.

AAAGGGRRRAAADDDEEECCCIIIMMMEEENNNTTTOOOSSS

À CAPES pela bolsa concedida durante o desenvolvimento deste projeto.

À todos os meus amigos e amigas (ficaria difícil citar todos!) pela amizade, carinho e

apoio. A todos aqueles que, embora não nomeados, me brindaram com seus

inestimáveis apoios em inesquecíveis momentos, o meu reconhecido e carinhoso muito

obrigado!

Aos amigos do laboratório Marcelle, Simone, Carol, Ana Maria, Ju, Maytê, Rosângela e

Fernanda pela amizade, companheirismo, pelos momentos de alegria compartilhados e

acima de tudo obrigada por todo apoio e auxílio que me ofereceram durante todos esses

anos de convivência.

Aos alunos de iniciação científica Imaculada, Bruno, Thais, Ricardo, Andréia pelos

auxílios no laboratório.

Aos técnicos Dra. Ivana Aparecida Borin e Nilton Rosa Alves, sempre muito prestativos.

À Professora Maria Elisabete D. Zaniquelli, por permitir a utilização do equipamento Ultra

Turrax.

À Priscila Cerviglieri Ciancaglini, pela correção dos textos em inglês.

Aos docentes, técnicos e funcionários do Departamento de Química da Faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP.

À Maria Dolores (Tuca) e José Aparecido do Departamento de Morfologia da Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto – USP, pela ajuda e disponibilidade na obtenção de

imagens de microscopia eletrônica.

À FAPESP e CNPq pelos auxílios financeiros concedidos ao laboratório.

Enfim, agradeço a todos aqueles que contribuíram de alguma forma com a execução

deste trabalho.

“A Natureza faz do homem um ser natural; a

sociedade faz dele um ser social; somente o

homem é capaz de fazer de si um ser livre”.

Rudolf Steiner

“As pessoas estão sempre culpando as

circunstâncias pelo que elas são. Eu não

acredito em circunstâncias. As pessoas que

progridem neste mundo são as pessoas que

se levantam e procuram pelas circunstâncias

que elas querem, e, se elas não conseguem

encontrá-las, elas as fazem”.

George Bernard Shaw

SSSUUUMMMÁÁÁRRRIIIOOO

Lista de Siglas e Abreviaturas ............................................................................... I

Resumo .................................................................................................................. III

Abstract .................................................................................................................. IV

1. Introdução...................................................................................................... 1

1.1 – A Leishmania................................................................................................ 2

1.2 – Superfície celular da leishmania .................................................................. 3

1.3 – A doença Leishmaniose............................................................................... 6

1.4 - O desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose.................................... 8

1.5 – O papel do adjuvante no desenvolvimento de vacinas ............................. 13

1.6 – Microesferas lipídicas................................................................................. 14

2. Objetivos ...................................................................................................... 19

2.1 – Objetivo geral ............................................................................................. 20

2.2 – Objetivos específicos ................................................................................. 20

3. Materiais e Métodos.................................................................................... 21

3.1 – Parasita ...................................................................................................... 22

3.2 – Obtenção da L. amazonensis .................................................................... 22

3.3 – Preparação do soro contendo os anticorpos contra os determinantes

imunogênicos de L. amazonensis ............................................................. 22

3.4 – Isolamento das membranas da L. amazonensis ....................................... 23

3.5 – Dosagem de proteína................................................................................. 23

3.6 – Solubilização das proteínas de membrana da L. amazonensis

com SDS.................................................................................................... 24

3.7 – Eletroforese em condição desnaturante (SDS-PAGE).............................. 24

3.8 – Avaliação da atividade antigênica das proteínas de membrana da

L. amazonensis.......................................................................................... 25

3.9 – Remoção do SDS do extrato protéico solubilizado ............................... 25

3.10 – Preparação das microesferas lipídicas .................................................... 26

3.10.1 – Protocolo 1 ......................................................................................... 26

3.10.2 – Protocolo 2 ......................................................................................... 26

3.10.3 – Protocolo 3 ......................................................................................... 27

3.10.4 – Protocolo 4 ......................................................................................... 27

3.10.5 – Protocolo 5 ......................................................................................... 28

3.11 – Marcação das proteínas antigênicas com isotiocianato de

fluoresceína (FITC).................................................................................... 29

3.12 – Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ............................................ 30

3.13 – Microscopia de Fluorescência (MF)......................................................... 30

3.14 – Medidas de espalhamento de luz ............................................................ 30

3.15 – Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose ......................... 31

3.16 – Dosagem de fosfato inorgânico ............................................................... 32

3.17 – Calorimetria diferencial de varredura (DSC)............................................ 33

3.18 – Quantificação das proteínas incorporadas nas ML ................................. 34

3.19 – Obtenção e o cultivo de macrófagos peritoneais murinos....................... 34

3.20 – Avaliação da viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos............... 35

3.21 – Análise da produção de nitrito ................................................................. 35

3.22 – Análise estatística .................................................................................... 36

4. Resultados e Discussão............................................................................. 37

4.1 – Solubilização e identificação das proteínas antigênicas da

membrana da L. amazonensis .................................................................. 38

4.2 – Remoção do detergente do extrato bruto solubilizado .............................. 41

4.3 – Ensaios de preparação das microesferas lipídicas ................................... 43

4.4 – Caracterização das Microesferas Lipídicas ............................................... 55

4.5 – Quantificação das proteínas encapsuladas nas ML.................................. 62

4.6 - Análise da produção de NO e Teste de viabilidade (MTT) ........................ 65

5. Conclusões .................................................................................................. 69

6. Referências .................................................................................................. 72

I

LLLIIISSSTTTAAA DDDEEE SSSIIIGGGLLLAAASSS EEE AAABBBRRREEEVVVIIIAAATTTUUURRRAAASSS

APC Células apresentadoras de antígenos

C3b Componente C3 do sistema complemento

C3bi Componente C3 do sistema complemento

CMC Concentração micelar crítica

Cp Capacidade calorífica

DAB 3,3’ diaminobenzidina

DHFR-TS Dihidrofolato redutase-timidilato sintase

DNA Ácido desoxirribonucléico

DPPC Dipalmitoilfosfatidilcolina

DSC Calorimetria diferencial de varredura

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EPS Extrato de proteína solubilizada

FITC Isotiocianato de fluoresceína

FML Ligante de fucose e manose

fPPG Forma filamentosa das proteofosfoglicanas

GIPL Glicoinositolfosfolipídeos livres de GPI

GP42 Glicoproteína da superfície da Leishmania com massa de 42 KDa

GP46/M2 Glicoproteína da superfície da Leishmania com massa de 46 KDa

GP63 Glicoproteína da superfície da Leishmania com massa de 63 KDa

GPI Glicosilfosfatidilinositol

HEPES Ácido hidroxietil piperazina etanosulfúrico

IFN-γ Interferon-γ

IgG Imunoglobulina G

IL-12 interleucina-12

IL-2 interleucina-2

KO knock-out

LACK Leishmania homologue of receptors for activated C kinase

LPG Lipofosfoglicanas

LTA Leishmaniose Tegumentar Americana

II

MF Microscopia de fluorescência

MEV Microscopia eletrônica de varredura

ML Microesferas lipídicas

MLP Microesferas lipídicas com proteínas encapsuladas

MTT (3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil brometo tetrazolina)

OS Óleo de soja

PBS Salina tamponada com fosfato

PPG Proteofosfoglicanas

PVA Álcool polivinílico

s.c subcutânea

Sch Schneider

SDS Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE Eletroforese em condição desnaturante

SFB Soro fetal bovino

TC Tampão Carbonato

Th1 T helper 1

Th1 T helper 2

TLR4 Receptor Toll-like 4

Tm Temperatura de transição

Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano

Tween 20 Polioxietileno sorbitan monolaurato

III

RRREEESSSUUUMMMOOO Microesferas lipídicas (ML) são excelentes sistemas de delivery de drogas e são

relativamente estáveis. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema capaz de

encapsular proteínas antigênicas da membrana de L. amazonensis. Proteínas de

membrana são importantes na formulação de vacinas, uma vez que estas proteínas são

os primeiros componentes celulares a entrarem em contato com a célula hospedeira,

provocando e mediando a resposta imune. Esta é uma ferramenta útil para evitar ou

inativar a invasão do parasita. As ML são constituídas por óleo de soja (OS),

dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), colesterol e extrato de proteínas solubilizadas (EPS)

(previamente tratadas para remoção do detergente). Primeiramente foram ensaiadas

formulações de ML contendo álcool polivinílico (PVA). Estudos de microscopia eletrônica

de varredura (MEV) mostraram que as ML são formadas quando PVA 3% (p/v) é usado

na formulação. Além disso, foi feita a marcação das proteínas com isotiocianato de

fluoresceína (FITC) e a microscopia de fluorescência revelou a presença de estruturas

esféricas fluorescentes, o que indicou a encapsulação das proteínas na região lipofílica

das ML. A presença do PVA na formulação das ML acarretou em algumas limitações

cruciais para a continuidade desta pesquisa, levando a substituição deste pelo glicerol.

Com o objetivo de otimizar a formulação foram avaliadas cinco diferentes formulações

contendo glicerol 2,5% (p/v). Nestas formulações foram avaliadas as relações molares

DPPC:Colesterol:OS. As partículas formadas apresentaram um diâmetro médio de

200nm, baixa polidispersão, e estabilidade por um período de 30 dias, de acordo com

ensaios de espalhamento de luz dinâmico. Ensaios de gradiente de densidade de

sacarose das ML mostraram que proteínas e lipídios se encontram juntos no gradiente

de sacarose (5-50% p/v) sugerindo que a preparação de ML foi homogênea e que as

proteínas estão interagindo com este sistema lipídico. Termogramas obtidos por

calorimetria diferencial de varredura (DSC) corroboram com a formação de um sistema

de ML-proteína estável, além de fornecer indícios que as proteínas se encontram

localizadas no núcleo oleoso das ML. Os resultados mostraram que foram encapsulados

85% das proteínas do EPS nas microesferas, e que estas não perderam sua atividade

antigênica, mesmo após o complexo processo de preparação do sistema. Estudos de

viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos e o ensaio de geração de nitrito

mostraram que o sistema ML associado às proteínas não apresenta efeito citotóxico para

os macrófagos e ainda estimula a produção de NO nos mesmos. Com isso, podemos

sugerir que ML contendo proteínas antigênicas de membrana de L. amazonensis

constituem um promissor sistema para a terapia da leishmaniose.

IV

AAABBBSSSTTTRRRAAACCCTTT Lipid microspheres (LM) are excellent drug delivery systems and they are also

relatively stable. The aim of this work was to develop a lipid-based system to encapsulate

antigenic membrane proteins from Leishmania amazonensis. Membrane proteins are

important for vaccine formulation because these proteins are the first ones to get in

contact with the host cell, triggering the cell mediated immune response. This is a useful

tool to avoid or to inactivate parasite invasion. LM are constituted by soybean oil (SO),

dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), cholesterol and solubilized protein extract (SPE)

(previously treated to remove detergent). First, the LM formulations containing polyvinylic

alcohol (PVA) were assayed. Scanning electronic microscopy (SEM) studies have shown

that LM are formed when 3% PVA (w/v) is used in the formulation. Besides, proteins were

marked with fluorescein Isothiocyanate (FITC) and the fluorescence microscopy showed

the presence of fluorescent spherical structures, which indicated protein encapsulation in

the lipophilic region of the LM. The presence of PVA in the LM formulation has caused

some crucial limitations for the continuity of the research, leading to its substitution for

glycerol. In order to optimize the system, five different formulations containing 2.5%

glycerol (w/v) were evaluated for DPPC:Cholesterol:OS molar ratios. The particles formed

(LM-protein) presented an average diameter of 200 nm, low polydispersion and good

stability for a period of 30 days, according to dynamic light scattering assays. Isopycnic

density gradient centrifugation of LM-protein showed that proteins and lipids floated in the

sucrose gradient (5-50% w/v) suggesting that the LM preparation is homogeneous and

that the proteins are interacting with these systems. Thermograms obtained by differential

scanning calorimetry (DSC) corroborate with the formation of a stable LM system, besides

giving indication that proteins are located in the oily LM core. The results show that 85%

of the SPE proteins were encapsulated in the LM without loosely their antigenic activity

even after the system preparation process. Viability studies of the peritoneal macrophage

murines and the nitrate assay generation have shown that system does not have a

cytotoxic effect for the macrophages and it yet stimulate their NO production. Therefore,

we conclude that LM, encapsulated with L. amazonensis membrane antigenic proteins

seems to be a promising system for for therapy of Leishmaniasis.

1. INTRODUÇÃO

Introdução

2

1.1 – A Leishmania

Em 1903, Leishman e Donovan, separadamente, descreveram na Índia, um

protozoário presente em tecidos esplênicos de pacientes. A doença passou a ser

chamada de leishmaniose visceral e o parasita denominado Leishmania donovani

(Herwaltd, 1999).

Nos hospedeiros mamíferos, representados na natureza por várias ordens

e espécies, a Leishmania assume a forma amastigota, arredondada e imóvel, que

se multiplica obrigatoriamente dentro de células do sistema monocítico fagocitário.

À medida que as formas amastigotas vão se multiplicando, os macrófagos se

rompem liberando parasitas que são fagocitados por outros macrófagos (Gontijo

& Carvalho, 2003). Todas as espécies do gênero são transmitidas pela picada de

fêmeas infectadas de dípteros da subfamília Phlebotominae, pertencentes aos

gêneros Lutzomyia – no Novo Mundo, e Phlebotomus – no Velho Mundo. Nos

flebotomíneos as leishmanias vivem no meio extracelular, na luz do trato

digestivo. Ali, as formas amastigotas, ingeridas durante o repasto sangüíneo, se

diferenciam em formas promastigotas, flageladas, morfológicas e

bioquimicamente distintas das amastigotas (Gontijo & Carvalho, 2003). Esta forma

é alongada e apresenta um longo flagelo livre. No sistema digestivo de seus

vetores, as formas promastigotas multiplicam-se por aparente divisão simples e

assexuada e migram para a probóscíde do inseto após aproximadamente 4 a 5

dias. Neste ponto, bloqueiam o proventrículo, de onde podem ser inoculadas na

pele do hospedeiro vertebrado, junto com a saliva (Marzochi, 1992).

Há aproximadamente 21 espécies de Leishmania, transmitidas por cerca

de 30 espécies de flebotomíneos. Leishmania tem desenvolvido uma variedade

de mecanismos adaptativos não somente para viver dentro do vetor, mas também

Introdução

3

para escapar da resposta imune do hospedeiro vertebrado, inclusive dentro do

macrófago (Cunningham, 2002). Vários receptores da superfície celular dos

macrófagos, moléculas da superfície do parasita e fatores derivados do soro são

responsáveis pelas interações das formas promastigotas com a célula hospedeira

garantindo assim a sobrevivência, multiplicação, patogênese ou mesmo a morte

do parasita no hospedeiro (Mosser & Rosenthal, 1993; Garg et al., 2005).

1.2 – Superfície celular da leishmania

Considerando a estratégia de invasão da Leishmania, proteínas presentes

na superfície celular desses parasitas são de extrema importância, sendo

responsáveis pela interação com a célula do hospedeiro garantindo a

sobrevivência, multiplicação e patogênese do parasita no mesmo (Garg et al.,

2005).

A superfície celular de todos os tripanossomatídeos é dominada por

proteínas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI), formando uma cobertura

que protege a superfície do parasita e medeia interações essenciais parasita-

hospedeiro. Acredita-se que essas proteínas ancoradas por GPI formem clusters

em microdomínios da membrana celular, geralmente chamados de lipids rafts, em

associação com glicoesfingolipidios, esfingomielina, colesterol e outras proteínas

sinalizadoras. No parasita Leishmania essas proteínas formam uma efetiva

barreira de difusão macromolecular efetiva que protege as formas promastigotas

de processos microbicidas tais como lise mediada pelo sistema complemento,

radicais oxigênio e hidrolases dos hospedeiros vertebrados e invertebrados

(Descoteaux &Turco, 1999; Ilgoutz & McConville, 2001).

As formas promastigotas de Leishmania são cobertas por um grande

Introdução

4

número de glicoproteínas ancoradas por GPI, como por exemplo, GP63, GP42

denominados de proteofosfoglicanas (PPG), um complexo lipofosfoglicano (LPG)

que possui uma âncora estruturalmente distinta da GPI (McConville & Ferguson,

1993) e uma abundante família de GPIs livre (aproximadamente 10 vezes mais

abundante do que proteínas ancoradas por GPI e LPG), denominada

glicoinositolfosfolipideos (GIPL) (McConville et al., 2002). Ao contrário, as formas

amastigotas de Leishmania, que proliferam dentro do fagolisossomo do

macrófago do hospedeiro, são recobertas por um mínimo glicocálix que é quase

exclusivamente composto por GIPLs e glicolipídeos derivado da célula do

hospedeiro, e a expressão das proteínas ancoradas por GPI e LPG é

dramaticamente baixo-regulada neste estágio (McConville & Blackwell, 1991;

Winter et al., 1994).

A glicoproteína ancorada por GPI mais predominante da superfície de

Leishmania é a zinco-metaloprotease chamada GP63 com peso molecular de 63

KDa (Bordier, 1987; Button & McMaster, 1988). Essa proteína é expressa na

superfície de promastigotas de diferentes espécies de Leishmania e em ambas

formas promastigotas e amastigotas de L. major e L. mexicana (Frommel et al.,

1990). Cada promastigota é coberta com aproximadamente 5x105 cópias de

GP63 o que corresponde a aproximadamente 1% das proteínas totais (Ilgoutz &

McConville, 2001). Essa glicoproteína apresenta um papel importante na

leishmaniose por agir com aceptor para o componente C3 do complemento (C3b

e C3bi) mediando a ligação da forma promastigota ao macrófago (Brittingham et

al., 1995; Russell et al., 1989). Outros estudos também mostraram que GP63 é o

ligante para múltiplos receptores de macrófagos, incluindo Mac-1 (CD11b/CD18)

e receptor celular para fibronectina (Brittingham et al., 1999). Ainda, GP63 pode

Introdução

5

ter um papel importante na proteção contra degradação dentro do fagolisossomo

do macrófago (Chaudhuri et al., 1989). Essa proteína exibiu atividade ótima sob o

ambiente ácido do fagolisossomo, e têm mostrado degradar as enzimas

lisossomais presentes neste ambiente (Cunningham, 2002).

Outras proteínas ancoradas também mostraram ter participação na

resposta imune como, por exemplo, as PPGs que constituem uma classe distinta

de moléculas e que são sintetizadas por ambas formas promastigotas e

amastigotas do parasita. Essas proteofosfoglicanas podem estar ancoradas por

GPI na superfície celular ou serem secretadas (forma filamentosa fPPG) (Ilgoutz

& McConville, 2001) respondendo pela virulência do parasita tanto no hospedeiro

vertebrado quanto no hospedeiro invertebrado (Ilg et al., 1999).

As proteínas antigênicas GP42 e GP46/M2 também parecem estar

envolvidas na resposta imunológica do hospedeiro vertebrado. A GP42 mostrou

induzir alta resposta proliferativa, assim como a produção de interleucina-2 (IL-2)

e interferon-γ (IFN-γ) por linfócitos humanos de pacientes com leishmaniose

(Burns et al., 1991).

Um outro composto (não protéico) importante na interação da superfície do

parasita e que participa da interação parasita-hospedeiro é o lipofosfoglicano

(LPG). Este glicolipídeo é um dos mais abundantes na superfície de

promastigotas de Leishmania, forma um denso glicocálix ao redor do parasita.

Este composto possui uma âncora estruturalmente distinta das GPIs, constituída

por unidades repetidas de Galβ1,4Manα-PO4 ligada a membrana de

promastigotas via uma ancora lipídica específica; 1-Ο-alquil-2-liso-

fosfatidil(mio)inositol com uma cadeia não usual longa de ácido graxo saturado de

24-26 carbonos (Turco & Descoteaux, 1992). A LPG, assim como outros

Introdução

6

glicoconjugados, têm uma participação importante na interação Leishmania-

complemento e ainda, se ligam e interagem com outras proteínas do soro para

promover a entrada na célula hospedeira. A LPG pode contribuir para a habilidade

da Leishmania em resistir ou escapar dos efeitos microbicidas dos macrófagos

(Descoteaux & Turco, 2002). Dentro dos macrófagos, as LPGs apresentam vários

efeitos como, por exemplo, inibição da maturação do fagossomo, inibição da

proteína C quinase e modulação da produção de óxido nítrico (NO) (Winberg et

al., 2009; Descoteaux & Turco, 2002).

1.3 – A doença Leishmaniose

Entre todas as doenças emergentes, aquelas causadas por protozoários são de

grande importância por apresentarem um elevado nível de morbidade e mortalidade. Este é

o caso da leishmaniose que é uma doença infecto-parasitária que acomete o homem,

causada por várias espécies de protozoários tripanossomatideos do gênero Leishmania

(Santos et al., 2008). Esta doença afeta aproximadamente 12 milhões de pessoas e está

presente em 88 países, principalmente em áreas tropicais e subtropicais. A incidência anual

é de aproximadamente 2 milhões de novos casos e cerca de 350 milhões de pessoas vivem

em áreas endêmicas, revelando assim a importância dessa doença negligenciada

(http://www.who.int/).

A leishmaniose pode causar um amplo espectro de manifestações clínicas. Na pele,

essas manifestações variam de úlceras cutâneas localizadas a lesões faciais mutilantes

(leishmaniose cutânea), lesões mucocutâneas (leishmaniose mucocutânea), e a

leishmaniose cutânea difusa e visceral que pode muitas vezes ser fatal (Teixeira, 2006).

Estas manifestações vão depender da espécie de Leishmania envolvida e da relação do

parasita com seu hospedeiro (Gontijo & Carvalho, 2003). A variedade de manifestações

Introdução

7

clínicas presentes na leishmaniose cutânea está diretamente relacionada ao estado

imunológico do paciente e a espécie de Leishmania envolvida. As diferentes formas de

leishmaniose cutânea constituem um importante problema de saúde pública principalmente

pela dificuldade de sua prevenção (MS/FUNASA, 2000).

Lesões causadas por Leishmania amazonensis, utilizada em nossos estudos,

usualmente apresentam uma lesão única ulcerada que é muito suscetível ao tratamento e

pode curar-se espontaneamente. Contudo, a diversidade de apresentação clínica desta

espécie parece variar de lugar, possivelmente devido a diferenças na sua virulência

(Weigle & Saravia, 1996).

A leishmaniose tegumentar americana, lesões cutâneas e muco cutâneas, (LTA) é

uma doença que acompanha o homem desde a antiguidade, existindo relatos e descrições

encontrados na literatura desde o séc. I d.C (Laison, 1997; Camargo & Barcinski, 2003). O

primeiro a observar o parasita do gênero Leishmania foi Cunningham, em 1885, na Índia,

em casos de leishmaniose visceral. No Brasil, Cerqueira, em 1855, observou a existência

da moléstia da pele, identificando-a clinicamente como “botão de Biskra”. Em 1895, na

Itália, Breda, descreveu a moléstia em italianos provenientes de São Paulo (Pessoa, 1982).

Entretanto, no Brasil, a natureza leishmaniótica das lesões cutâneas e nasofaríngeas só foi

confirmada, pela primeira vez, em 1909, por Lindenberg, que encontrou formas de

Leishmania, idênticas a Leishmania tropica da leishmaniose do Velho Mundo, em lesões

cutâneas de indivíduos que trabalhavam nas matas do interior do Estado de São Paulo

(Pessoa, 1982).

A leishmaniose tegumentar tem aumentando nos últimos 20 anos em quase todos os

estados brasileiros, e surtos epidêmicos tem ocorrido no Sudeste, Centro-Oeste, Nordeste,

e mais recentemente, na região Amazônica, devido ao processo predatório de colonização

(Delorenzi et al., 2001; Gontijo & Melo, 2004).

Introdução

8

O controle das leishmanioses esbarra no fato dela ser uma zoonose, sendo os

animais silvestres e domésticos potenciais reservatórios do parasita. O crescimento urbano

desordenado tem gerado muitas dificuldades no combate ao flebótomo (Handman, 2000).

1.4 - O desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose

O controle da leishmaniose, tanto em saúde pública como individualmente,

é pouco eficiente, não existindo medidas simples e eficazes de proteção e

consiste principalmente em tratamentos quimioterápicos, pois infelizmente, ainda

não há uma vacina efetiva contra o parasita (Silva & Camargo-Neves, 2004).

Atualmente, o tratamento da leishmaniose primeiramente usa da

quimioterapia, com algumas tentativas no uso de imunoterapias (Ghosh et al.,

2003; Santos et al., 2003; Borja-Cabrera et al., 2004). A primeira linha de

tratamento é predominantemente baseada em antimoniais pentavalentes (ex.

Glucantime), um tratamento clássico na maioria das áreas endêmicas, contudo, a

sua utilidade tem sido comprometida pela acentuada resistência e efeitos

colaterais (Herwaldt, 1999). A segunda linha de tratamento inclui drogas tais como

anfotericina B e pentamidina, que são caracterizadas pela alta eficiência, mas são

relativamente caras e apresentam vários efeitos colaterais (Berman, 2003; Davis

e Kedzierski, 2005).

Novas drogas, tais como formulações lipídicas de anfotericina B, têm sido

efetivas no tratamento da leishmaniose visceral, mas o custo dessas formulações

é certamente inviável para a maioria dos pacientes (Berman et al., 1998; Murray,

2004). Recentemente, miltefosine tem mostrado ser um tratamento oral efetivo

para leishmaniose visceral na Índia (Sundar et al., 2002), e para leishmaniose

cutânea na América do Sul (Soto et al., 2001).

Introdução

9

Com a restrita oferta de drogas utilizadas para o tratamento de infecções

por Leishmania ssp. faz-se necessário a busca de alternativas profiláticas para

esta infecção. Devido a facilidade na utilização dos modelos in vivo e in vitro de

infecção com Leishmania, a eficiência de vários compostos e protocolos de

vacinação estão sendo testados (Handman et al., 2000).

A vacinação contra leishmaniose cutânea humana tem sido praticada por

séculos. A primeira vacina contra leishmaniose foi desenvolvida por Adler da

Universidade Hebrew de Jerusalém. Ele observou que mães libanesas expunham

os braços de seus filhos a picadas pelo inseto vetor, uma vez que elas

intuitivamente sabiam que o desenvolvimento de uma primeira e única lesão, que

se auto curava, poderia proteger seus filhos de uma forma mais severa da doença

no futuro. Por essa razão, práticas antigas inoculavam em indivíduos não

infectados o material infeccioso de lesões, em regiões do corpo onde a cicatriz

pudesse ser escondida (Palatnik-de-Souza, 2008). Conhecida como

leishmanização, esta prática utilizava amostras de lesões humanas ou de outros

animais. Posteriormente estas amostras foram substituídas pelo uso de formas

promastigotas de L. major, obtidas de culturas (Greenblatt, 1980; Senekji &

Beattie, 1941). A leishmanização foi usada em Israel e no Irã nas décadas de 70 e

80 respectivamente (Nadim et al., 1983), como uma vacina profilática. Esta prática

também foi adotada pelo Governo iraniano durante a guerra entre o Irã e o Iraque,

um conflito que foi de 1980 a 1988, este programa abrangeu cerca de 2 milhões

de pessoas. A variabilidade no tamanho e na duração das lesões resultantes da

inoculação de cepas virulentas fez com que a técnica fosse abandonada no Irã,

após a guerra. Assim, vacinas de primeira geração compostas de parasitas

mortos foram gradualmente substituindo a leishmanização (Modabber, 1995).

Introdução

10

Em geral, as vacinas em desenvolvimento contra a leishmaniose, assim

como contra outras doenças infecciosas, podem ser divididas em três categorias:

(i) Vacinas vivas, incluindo também as construções geneticamente modificadas;

(ii) Vacinas de primeira geração, que são aquelas produzidas com frações do

agente patogênico ou ainda com o patógeno inteiro e morto, com ou sem

adjuvante e (iii) Vacinas de segunda e terceira geração, produzidas com proteínas

recombinantes ou DNA (ácido desoxirribonucléico) e vetores microbianos (vírus e

bactérias) expressando antígenos do parasita.

No Brasil, o uso de parasitas mortos na tentativa de se induzir uma

proteção contra a leishmaniose teve início na década de 40. A partir de 1970,

Wilson Mayrink e seus colaboradores na Universidade Federal de Minas Gerais

(UFMG), desenvolveram uma vacina morta composta de quatro espécies

diferentes de Leishmania (Genaro et al., 1996). Essa vacina acabou sendo

simplificada pelo uso de uma única espécie e está sendo usada aqui no Brasil

como um adjuvante durante o tratamento contra a leishmaniose (Machado-Pinto

et al., 2002) após ter sido aprovada pelo Ministério da Saúde. Além disso, essa

vacina também foi testada na Colômbia (Vélez et al., 2000; Vélez et al., 2005) e

no Equador (Armijos et al., 2004).

As vacinas de primeira geração, produzidas com frações do parasita,

também já foram empregadas. Conhecida como Leishmune® está sendo

produzida e comercializada no Brasil, desde que foi autorizada pelo Ministério da

Agricultura em junho de 2003, esta é uma vacina de subunidade contra a

leishmaniose visceral canina, constituída pelo ligante de fucose e manose (FML)

da L. donovani com saponina, induz cerca de 92 a 97% de proteção contra a

leishmaniose visceral zoonótica (Saraiva et al., 2006). A Leishmune®, apesar de

Introdução

11

eficaz na proteção canina, traz riscos para a população, uma vez que dificulta a

distinção entre animais vacinados e os animais contaminados assintomáticos.

Outra abordagem na busca de uma vacina contra a leishmaniose baseia-se

na manipulação gênica e criação de parasitas geneticamente modificados. Nessa

estratégia, aqueles genes que são essenciais para a sobrevivência da Leishmania

no seu hospedeiro são bloqueados, removidos ou mesmo substituídos por outros

genes. A primeira construção que gerou um mutante deficiente para um gene deu

origem a uma cepa de L. major knock-out (KO) para a enzima dihidrofolato

redutase-timidilato sintase (DHFR-TS) (Cruz et al., 1991). Os camundongos

inoculados com esses mutantes apresentaram uma proteção significativa, mas

temporária, após o desafio com os parasitas virulentos (Veras et al., 1999; Titus et

al., 1995).

Na construção das vacinas de segunda geração, muitos antígenos de

Leishmania já foram utilizados. A região codificadora para a parte protéica da

glicoproteína da superfície da Leishmania, a GP63, foi à primeira vacina de

plasmídeo produzida contra a leishmaniose (Xu & Liew, 1994). Ainda, outro

antígeno utilizado é o LACK (Leishmania homologue of receptors for activated C

kinase), contudo, resultados conflitantes foram observados. Enquanto cães

vacinados com vetores do vírus da vaccinia expressando esse antígeno

apresentaram 60% de proteção contra a leishmaniose visceral causada pela L.

infantum (Ramiro et al., 2003), camundongos BALB/c vacinados com DNA do

LACK não foram protegidos contra a infecção pela L. chagasi (Marques-da-Silva

et al., 2005).

Recentemente, o uso de substâncias com estruturas moleculares bem

definidas em vacinas de segunda e terceira geração contra leishmaniose estão

Introdução

12

emergindo (Coler & Reed, 2005). Embora o desenvolvimento de vacinas de

primeira geração seja mais barato e não necessite equipamentos sofisticados e

avanços tecnológicos, o desenvolvimento de uma vacina de antígenos bem

definidos tem vantagens na reprodutibilidade sobre vacinas com o extrato bruto

de Leishmania. Muitos dos antígenos de Leishmania que estão sendo testados

em modelos animais mostraram proteger quando usados com um adjuvante

apropriado (Afonso et al., 1994; Aebischer et al., 2000; Campos-Neto et al., 2001).

A inclusão de adjuvantes nas vacinas para leishmaniose é crítica para a

eficácia contra leishmaniose experimental murina. Pesquisas recentes têm focado

na identificação de adjuvantes que estimulam imunidade celular, e aqueles que

agem através do receptor Toll-like 4 (TLR4) (Coler & Reed, 2005; Cluff et al.,

2005), como por exemplo, ONO-4007 que tem capacidade para aumentar a

imunidade do tipo 1 e induzir produção de óxido nítrico, que pode ter um potente

efeito leishmanicida. Esse composto, sozinho, mostrou inibir a proliferação

intracelular de amastigotas de L. amazonensis e L. major dentro de macrófagos

(Calvopina et al., 2006).

Assim, vacinas preventivas são reconhecidas como as de melhor proteção

contra patógenos, a da Leishmania não é uma exceção. Contudo, o

desenvolvimento de vacinas para leishmaniose tem demonstrado ser uma tarefa

difícil e desafiadora, provavelmente devido a conhecimentos insuficientes da

patogênese do parasita e a complexidade da resposta imune necessária para

proteção. Vários novos antígenos estão sendo avaliados e com a conclusão do

projeto genoma de L. major e L. infantum serão, sem dúvida, descobertos mais

candidatos promissores (Kedzierski et al., 2006).

Introdução

13

1.5 – O papel do adjuvante no desenvolvimento de vacinas

Adjuvantes imunológicos foram originalmente descritos por Ramon, em

1924 como “substâncias usadas em combinação com um antígeno específico,

levando a uma resposta imune mais robusta do que o antígeno sozinho”. Estes

podem ser utilizados para melhorar a resposta imune de vacinas, de várias

formas diferentes: (1) aumentando a imunogenicidade de antígenos fracos; (2)

aumentando a velocidade e duração da resposta imune; (3) modulando a avidez

do anticorpo, especificidade, isotipo ou distribuição de subclasses; (4)

estimulando linfócitos T citotóxicos; (5) promovendo a indução de imunidade das

mucosas; (6) aumentando a resposta imune em indivíduos imunologicamente

imaturos; (7) decrescendo a dose do antígeno na vacina para reduzir o custo ou

(8) auxiliando a derrotar a competição entre os antígenos em vacinas combinadas

(O´Hagan & Singh, 2001).

O mecanismo de ação da maioria dos adjuvantes ainda permanece

parcialmente entendido, uma vez que a imunização freqüentemente ativa uma

cascata complexa de respostas que dificulta entender o efeito primário do

adjuvante. Contudo, se admitirmos o conceito local da reatividade imune, no qual

os antígenos que não alcançam os nódulos linfáticos locais não induzem resposta

imune (Zinckernagel et al., 1997), se torna mais fácil propor interpretações a

respeito do mecanismo de alguns adjuvantes, particularmente aqueles baseados

em um mecanismo de delivery. Se antígenos, que não alcançam os nódulos

linfáticos, não induzem resposta imune, então algum adjuvante, que aumente o

delivery de antígeno nas células que traficam para os nódulos linfáticos, pode

aumentar a resposta. Existem fortes indicações para supor que uma subclasse de

células dendríticas constituam as “células chaves” que circulam em tecidos

Introdução

14

periféricos e agem como “sentinelas”, sendo responsáveis pela captura de

antígenos e sua transferência para os nódulos linfáticos, onde eles são então,

apresentados para as células T (O´Hagan & Singh, 2001).

Os adjuvantes podem ser separados em duas classes, baseados em seus

principais mecanismos de ação: Sistemas de delivery e adjuvantes

imunoestimulatórios. Os sistemas de delivery dos antígenos são geralmente

particulados, por exemplo, emulsões, micropartículas e lipossomos. Estes

funcionam principalmente como agentes que direcionam os antígenos as células

apresentadoras de antígenos (APC). Em contraste, adjuvantes

imunoestimulatórios são predominantemente derivados de patógenos e

freqüentemente representam padrões moleculares associados, como por

exemplo, lipopolissacarídeos, e DNA, os quais ativam o sistema imune inato. Uma

vez ativado o sistema imune inato, é ativado o sistema imune adquirido (O´Hagan

& Singh, 2001).

Os aspectos práticos importantes para o desenvolvimento de adjuvantes e

a escolha de qual sistema usar vão depender da aplicação e do perfil do produto

de interesse. Devem ser levados em consideração: a via de administração, o

custo e a aplicabilidade para uma vasta gama de vacinas, estabilidade, facilidade

de manufatura, condições de uso e armazenamento (Boyd, 2008).

1.6 – Microesferas lipídicas

Microesferas lipídicas (ML) são também chamadas de emulsões lipídicas,

onde um dos dois líquidos que não dissolve homogeneamente se transforma em

micropartículas, as quais são dispersas no outro líquido. Quando o óleo está

Introdução

15

presente na micropartícula, esta é do tipo óleo-em-água, ou emulsão O/W,

todavia, no caso oposto temos emulsões tipo água-em-óleo, ou emulsão W/O.

Geralmente, as microesferas lipídicas estão na emulsão O/W. Um emulsificador é

requerido para tornar a emulsão estável e, para isto, surfactantes são geralmente

utilizados (Yamagushi & Mizushima, 1994). Microesferas lipídicas são produzidas

com óleo de soja e lecitina de gema de ovo (Figura 1) e comumente

administradas por via parenteral intravenosa. Podem ser usadas como

suprimentos calóricos em pacientes que são incapazes de obter nutrientes

adequados através de uma dieta normal. Seu uso clínico tem sido bem aceito,

como é o caso da Intralipid® e Lipofundin®. Nestas formulações o núcleo oleoso é

usado como um carreador de substâncias lipofílicas, para realçar sua ação

terapêutica (Igarashi et al., 1996; Nasirideen, 1998). Dentre os princípios ativos

encapsulados nesses carreadores podemos citar antiinflamatórios esteroidais e

não esteroidais, prostaglandinas bronco e vasodilatadoras, agentes

imunossupressores, citostáticos, etc. (Mizushima, 1996; Takenaga, 1996).

Introdução

16

Colesterol FosfolipídiosÓleo de SojaColesterol FosfolipídiosÓleo de Soja

Figura 1: Ilustração de um modelo de Microesferas Lipídicas (ML). Modificado de

Lehninger et al. (1995).

Introdução

17

Sua utilidade como delivery tem como base sua habilidade de incorporar

drogas com pouca solubilidade em água dentro da fase dispersa (Muller et al.,

2004). Assim, o contato direto da droga com fluidos sanguíneos e tecidos pode

ser evitado (reduzindo irritação) e a droga é liberada por um período de tempo

prolongado (liberação sustentada), o qual pode ser marcado por reduzir os efeitos

colaterais (Bock & Müller, 1994). A ML é um promissor veículo alternativo para

administração parenteral de drogas. Além disso, reduz a hidrólise, aumenta a

biodisponibilidade, bem como a atividade específica do composto carreado em

comparação com a administração em forma de solução (Nasirideen, 1998).

As ML são muito estáveis e podem ser estocadas por mais de dois anos a

temperatura ambiente (Lixin et al., 2006). Estas podem ser preparadas pelo

processo de sonicação, por métodos de agitação ou trituração. Dentre estes

métodos, o da trituração é o mais frequentemente usado até o momento, e é

chamado geralmente de método da emulsificação sob alta pressão. O princípio

deste método consiste no líquido receber uma força de trituração e emulsificar

quando dois líquidos passam através de um capilar sob alta pressão (Yamagushi

& Mizushima, 1994).

Em particular, emulsões lipídicas são consideradas sistemas superiores, devido ao

fato de poderem ser produzidas em escala industrial, ser estáveis durante armazenamento e

altamente biocompatíveis (Yamaguchi & Mizushima, 1994; Forssen & Willis, 1998).

Como, antígenos sozinhos são geralmente fracos imunógenos, estes requerem um

adjuvante para induzir imunidade protetora. As ML não somente protegem as proteínas da

degradação extracelular, como apresentam as mesmas às células relevantes do sistema

imune.

Introdução

18

No plasma sanguíneo, o transporte de lipídios é regulado por lipoproteínas

constituídas de apolipoproteínas específicas, receptores de lipoproteínas,

enzimas lipolíticas e proteínas de transferência que atuam para manter a

homeostase do colesterol e dos triacilglicerídeos (Kawakami et al. 2000). As

microesferas lipídicas são parecidas com as lipoproteínas, mas não possuem

apolipoproteínas específicas em sua superfície, enquanto sabe-se que algumas

emulsões lipídicas adquirem diversas apolipoproteínas do plasma, imediatamente

após a injeção intravenosa (Kawakami et al. 2000). As interações entre emulsões

lipídicas e apolipoproteínas desempenham um importante papel no

prolongamento do tempo de meia-vida desta emulsão na circulação lipídica. Esta

interação é controlada pelo tamanho e composição das emulsões lipídicas

(Kawakami et al. 2000).

2. OBJETIVOS

Objetivos

20

2.1 – Objetivo geral

Desenvolver uma metodologia para a preparação de microesferas lipídicas

estáveis, a fim de incorporar proteínas antigênicas da membrana de Leishmania

amazonensis, e avaliar sua viabilidade terapêutica no tratamento da leishmaniose.

2.2 – Objetivos específicos

I. Obter o extrato bruto solubilizado das proteínas de membrana da L. amazonensis e

avaliar a antigenicidade das mesmas;

II. Desenvolver um protocolo experimental para a preparação das microesferas lipídicas

na presença e na ausência das proteínas da membrana de L. amazonensis;

III. Caracterizar o tamanho das partículas e a sua estabilidade;

IV. Avaliar a interação entre as proteínas e o sistema de ML;

V. Quantificar a incorporação das proteínas pelas ML;

VI. Analisar a produção de NO e a citotoxicidade, em culturas de macrófagos

peritoneais murinos, estimulados com as proteínas de membrana e com o sistema de

ML.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Resultados e Discussão

38

4.1 – Solubilização e identificação das proteínas antigênicas da membrana

de L. amazonensis

O isolamento das proteínas de membrana de agentes patogênicos e a sua

posterior reconstituição em sistemas de delivery, tem sido empregado com

sucesso na tentativa de obter-se sistemas profiláticos para certas doenças

(Daghastanli et al., 2004; Santos et al., 2006; Jaafari et al., 2007; Migliaccio et al.,

2008).

Há aproximadamente trinta anos, o emprego de detergentes tem alcançado

grande sucesso na solubilização de proteínas de membranas (Silvius, 1992). Uma

solubilização efetiva destas proteínas envolve tanto a seleção do detergente

apropriado quanto a determinação de condições apropriadas para a solubilização.

Deve-se considerar a compatibilidade do detergente com métodos preparativos e

analíticos, bem como a possível remoção do mesmo na sucessiva aplicação das

proteínas de interesse (Hjelmeland, 1980; Santos & Ciancaglini, 2000).

A obtenção do parasita L. amazonensis foi realizada conforme descrito em

3.2 de materiais e métodos. Aproximadamente 5mL do pellet obtido (forma

promastigota do parasita) foi utilizado para se obter a fração de membrana,

conforme descrito em 3.4 de Materiais e Métodos.

Uma preparação típica das frações de membrana da L. amazonensis

utilizando cerca de 5mL de parasita produziu cerca de 35 mg de proteínas totais

de membrana. A eletroforese (SDS-PAGE) destas frações de membrana revelou

uma série de bandas protéicas, dentre as quais as mais intensas foram as de

massas moleculares em torno de 97; 87; 73; 66; 63; 46; 42 e 34 e 26kDa. (Figura

2A coluna 2).


39

Figura 2: SDS-PAGE e Western Bloting das proteínas da membrana de L.

amazonensis. (A) proteínas coradas com prata e (B) Western Blotting de: (1)

extrato de proteína solubilizada; (2) fração de membrana. SDS-PAGE e Western

Blotting foram realizados conforme descrito nos itens 3.7 e 3.8, respectivamente,

de Materiais e Métodos.

205 kDa

116 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa

97,4 kDa

1 2 1 2205 kDa

116 kDa

66 kDa

45 KDa

29 kDa

97,4 kDa

A B


40

Posteriormente a eletroforese, foi avaliada a atividade antigênica das

proteínas presentes na fração de membrana, para isso foi realizado ensaio de

Western Blotting. A figura 2B coluna 2 mostra que muitas das bandas protéicas

presentes na fração de membrana foram reconhecidas pelo anticorpo contra

antígenos totais de L. amazonensis, obtido conforme descrito em 3.3 de materiais

e métodos.

A solubilização das proteínas da fração de membrana da L. amazonensis

foi realizada incubando-se esta na concentração de 1,0 mg/mL de proteína com

SDS 0,1% (p/v) por 30 minutos sob agitação, conforme descrito no item 3.6 de

materiais de métodos. A dosagem de proteína do material solubilizado, separado

por ultracentrifugação, revelou um rendimento de solubilização de

aproximadamente 85% das proteínas presentes nas frações de membrana.

O perfil eletroforético da fração de membrana e do extrato de proteínas

solubilizadas (EPS) foi muito semelhante, mostrando assim a eficiência do

processo de solubilização (Figura 2A coluna1). Foi feita também uma

investigação da atividade antigênica das proteínas presentes no EPS. Após o

ensaio de Western Blotting pode-se observar que bandas protéicas do EPS foram

reconhecidas pelo anticorpo contra antígenos totais de L. amazonensis assim

como na fração de membrana (Figura 2B coluna 1).

O processo de solubilização utilizado neste trabalho teve como principal

objetivo, o de preservar as características estruturais das proteínas de membrana

desejáveis para sua antigenicidade. Através da Figura 2B coluna 1, pudemos

observar que não houve perda da antigenicidade das proteínas solubilizadas, em

comparação a membrana do parasita (Figura 2B coluna 2). Processos de

solubilização de proteínas de membrana de L. amazonensis, similares ao utilizado


41

neste trabalho, foram descritos com êxito por Colhone et al. (2009) e Santos et al.

(2006).

Assim, uma vez obtido este extrato de proteínas solubilizadas rico em

proteínas de membrana de L. amazonensis, e sabendo que se conseguiu a

manutenção da atividade antigênica destas, efetuamos estudos sistemáticos para

definir a melhor condição para a incorporação dessas proteínas em sistemas de

microesferas lipídicas.

Vale a pena ressaltar que até o presente momento não é descrito na

literatura a utilização de ML como sistemas de delivery de um pool de proteínas

antigênicas de membrana.

4.2 – Remoção do detergente do extrato bruto solubilizado

Muitos métodos têm sido empregados para a remoção completa ou parcial

do detegente a partir de misturas de detergente-proteína ou de detergente-lipídio-

proteína (Furth, 1980; Furth et al. 1984). Dentre estes métodos tem-se: uma

simples diluição (Racker et al., 1979), diálise (Mimms et al., 1981; McCormick et

al., 1984), ultracentrifugação (Jones et al., 1988), precipitação seletiva e

ultrafiltração (Furth et al. 1984) que removem anfifílicos na forma de monômeros

(ou pequenos agregados), entretanto estes métodos são usados somente para

detergentes com alto valor de Concentração Micelar Crítica (CMC). Em casos de

detergentes com baixas CMC, como é o caso do SDS, detergente usado neste

trabalho, utiliza-se a adsorção seletiva do detergente em resinas hidrofóbicas

(Haaker e Racker, 1979; Levy et al., 1990a; Silvius, 1992). Atualmente, algumas

resinas como BioBeads® e Calbiosorb® têm sido empregadas. Este método

remove seletivamente o detergente na sua forma monomérica a qual é rápida e


42

eficientemente adsorvido pela resina hidrofóbica quando esta entra em contato

com a amostra detergente-proteína. Na prática, entretanto, uma significativa

quantidade de proteína pode ser adsorvida pela resina durante o processo de

remoção de detergente. Este problema, algumas vezes, pode ser reduzido por

ajustes no raio das partículas das resinas, pelos detergentes utilizados ou pela

exposição da amostra à resina por curtos períodos de incubação (Levy et al.,

1990b; Silvius, 1992; Rigaud et al., 1995; Rigaud et al., 1998; Daghastanli et al.,

2004).

Considerando que o objetivo deste trabalho é a incorporação das proteínas

da membrana de L. amazonensis no núcleo oleoso das ML, torna-se necessário à

obtenção de uma solução protéica livre de detergente. Para isso padronizamos

uma metodologia para a remoção do detergente empregado na solubilização das

proteínas da fração de membrana do parasita.

Para tal, foram realizados testes de remoção do SDS utilizando-se a resina

Calbiosorb, uma vez que já se conhece a sua eficiência na remoção do

detergente durante a formação dos proteolipossomos pelo método da co-

solubilização conforme descrito em Daghastanli et al. (2004).

Assim, foram realizados dois testes, no primeiro utilizamos uma proporção

de 200mg/mL de resina, uma vez que esta quantidade de resina é indicada para

obtenção de proteolipossomos. Os resultados obtidos revelaram uma remoção

final de 99,4% do detergente após 4 horas de tratamento, com uma troca de

resina após 2 horas, e com uma recuperação final de 76% de proteína. No

segundo teste, a quantidade de resina foi ajustada proporcionalmente a

concentração de detergente a ser removida, para eliminar o excesso de resina e

maximizar a recuperação de proteína. Assim, utilizamos 6,2mg de Calbiosorb


43

para cada 1mL de EPS. Ao final das 2 primeiras horas de tratamento obteve-se

uma remoção de 76,3% do SDS e nenhuma perda de proteína. Neste ponto, a

resina foi trocada e a amostra tratada por mais 2 horas, como resultado final,

observou-se uma remoção de 98,7% e uma recuperação de 92% de proteína.

Este extrato de proteína solubilizada livre de detergente foi então utilizado

na formulação das ML. É importante ressaltar que este procedimento de remoção

de detergente foi realizado sempre no momento do uso efetivo deste extrato

protéico, para evitar ao máximo o processo de agregação das proteínas

solubilizadas.

4.3 – Ensaios de preparação das microesferas lipídicas

Embora não exista nenhuma vacina comercial disponível baseada em

emulsões lipídicas, existem vários artigos na literatura documentando o grande

potencial deste sistema de transporte guiado. As possíveis formas de uso deste

sistema estão relacionadas à maneira de encapsular um antígeno viável em uma

pequena partícula, tal que este se mantenha estável e que possa ser

seguramente liberado para sítios apropriados no hospedeiro. A adequação do

veiculo a vacina pode ser obtida pela seleção de diferentes materiais e técnicas

(Kawakami et al., 2000).

O método mais usado para produção de ML encapsuladas com algum

“principio ativo” é dissolver este componente na fase oleosa e depois misturar

com os componentes aquosos sobre forte agitação, promovendo a emulsificação

do sistema (Lixin et al., 2006; Yu et al., 2006). Entretanto, para proteínas de

membrana, esta não é uma opção praticável porque estas se encontram em fase

aquosa, ou seja, não são diretamente inseridas na fase oleosa.


44

De acordo com a literatura os três fatores principais que influenciam a

estabilidade física de ML são: (a) Fase oleosa apropriada, (b) emulsificante

apropriado, (c) bom controle de homogeneização (Zhang et al., 2007).

Neste trabalho foram estudadas diferentes formulações de ML com o

objetivo de ajustar estes três fatores que influenciam em sua estabilidade física.

O primeiro ensaio para a preparação das microesferas lipídicas foi

realizado conforme descrito no Protocolo 1 do item 3.10.1 de Materiais e

Métodos. A metodologia empregada aqui é uma adaptação daquela descrita por

Yamaguchi e Mizushima (1994).

A suspensão resultante desta preparação, após a centrifugação, mostrou-

se não homogênea, apresentando uma fase oleosa de cor branca na superfície

da amostra o que sugere a presença de uma fase emulsionada.

Uma alíquota desta emulsão foi tomada e observada em microscópio ótico

onde foi visualizada a presença de gotículas translúcidas que são características

de microgotas de óleo e não a formação de microesferas lipídicas as quais

aparecem como partículas opacas.

Com o intuito de minimizar a agregação destes sistemas passamos a

empregar o Protocolo 2, o qual introduz na preparação o álcool polivinílico (PVA),

uma vez que é descrito que este polímero é capaz de revestir este sistema

proporcionando assim uma maior estabilidade das partículas (Hilbert et al., 1999).

Também para o Protocolo 2 foi observada a fase emulsionada na

superfície da amostra, indicando mais uma vez que esta metodologia também

não é a mais adequada para a formação das microesferas lipídicas.

Uma vez que não obtivemos êxito na separação da fase emulsionada por

centrifugação, modificamos a metodologia para a filtração a vácuo em


45

membranas Amicon YM-3 (Protocolo 3). Porém, durante o processo a fase oleosa

adsorveu na membrana obstruindo seus poros e impedindo assim a filtração da

amostra.

Visto que os protocolos anteriores não resultaram nas microesferas

lipídicas, elaboramos outra metodologia de montagem das microesferas

(Protocolo 4), desta vez unindo e adaptando 2 métodos descritos na literatura

(Asai & Watanabe, 1999; Hilbert et al., 1999). As amostras resultantes deste

protocolo apresentaram-se homogêneas, com aparência turva, característica de

uma suspensão de micropartículas. Devido a isto, foi adotado este protocolo para

melhor investigarmos os componentes da suspensão.

Inicialmente, foram realizadas montagens de sistemas de microesferas na

ausência de proteínas antigênicas, para a adequação das condições

experimentais.

Foram realizados estudos relacionados a concentração de PVA mais

adequada para a obtenção das microesferas lipídicas com a colaboração da

Profa. Dra. Juliana Maldonado Marchetti da FCFRP-USP e da Dra. Kátia R.P.

Dhagastanli do IQ-USP. Dentre as diversas concentrações de PVA testadas, a

formulação que resultou em uma suspensão característica de microesferas foi

quando utilizamos para a preparação da segunda emulsão uma solução de PVA

3% (p/v).

Esta preparação foi centrifugada a 2.000xg, conforme descrito no item

3.10.4 de Materiais e Métodos, e foram realizados ensaios de MEV tanto no

sobrenadante quanto no pellet obtido.

A imagem obtida para o sobrenadante (Figura 3A) revela a presença de

estruturas esféricas bem definidas, características das microesferas lipídicas


46

recobertas por PVA (Hilbert et al., 1999; Dinarvand et al., 2002; Bouissou et al.,

2004), e a ausência das tramas poliméricas observadas nas imagens de

microscopia das formulações com menores concentrações de PVA (0,01, 0,05 e

0,1%) como pode ser observado nas figuras 3B, 3C, 3D, respectivamente.

Quando utilizamos concentrações de PVA de 0,01; 0,05 e 0,1%, não havia

quantidade suficiente de polímero na formulação, ou seja, não havia um balanço

adequado na relação lipídio:polímero para que pudéssemos alcançar a formação

de ML. Devido a isto, obtínhamos apenas tramas de PVA ao acaso e não uma

estrutura organizada, referente as microesferas. De fato, as imagens de

microscopia eletrônica (Figuras 3B, 3C, 3D) indicam que não houve formação de

micropartículas para as preparações realizadas com menores concentrações de

PVA (Hu et al., 2002).

Já a imagem obtida do pellet, mostra a presença de microesferas que,

neste caso, estão associadas sob o excesso de PVA sedimentado pela

centrifugação (Figura 4), formando uma espécie de “tapete” de PVA.


47

Figura 3: Microscopia eletrônica de varredura das formulações obtidas pelo

Protocolo 4, conforme descrito no item 3.10.4 de Materiais e Métodos. (A)

sobrenadante da preparação utilizando 3% (p/v) de PVA; (B) 0,01% (p/v) de PVA;

(C) 0,05% (p/v) de PVA; (D) 0,1% de PVA.


48

Figura 4: Microscopia eletrônica de varredura do pellet da formulação

obtida pelo Protocolo 4, utilizando 3% PVA (p/v), conforme descrito no item

3.10.4 de Materiais e Métodos.


49

Estes estudos referentes à concentração de PVA indicam que para

alcançar o balanço lipídio:proteína ideal para a estabilização das ML é necessário

o uso de PVA 3 % (p/v) na formulação, no entanto, a alta viscosidade do sistema

conferida pelo uso deste, torna ineficiente a separação efetiva das ML por

centrifugação, acarretando assim a presença das ML tanto no pellet quanto no

sobrenadante.

Para a obtenção das microesferas lipídicas na presença das proteínas

antigênicas (MLP), foi utilizada a relação proteína:lipídios 1:10 (p/p), portanto

durante a preparação do sistema, o Tampão Tris-HCl 5 mM foi substituído pelo

extrato de proteínas solubilizadas (EPS) livre de detergente, em quantidade

suficiente de proteína para obtermos a mesma relação proteína:lipídio desejada.

A micrografia obtida pela microscopia eletrônica de varredura para a

preparação de microesferas na presença de proteínas está mostrada na Figura

5A. Podemos observar nesta imagem a formação de sistemas esféricos

referentes à ML, semelhantes àquelas obtidas na ausência de proteína (Figura

3A).

A fim de determinarmos se as proteínas antigênicas estavam encapsuladas

nas microesferas, submetemos o EPS livre de detergente ao processo de

marcação com o fluoróforo isotiocianato de fluoresceína (FITC), o qual tem a

propriedade de se ligar aos grupamentos amino dos resíduos laterais e terminais

presentes nas proteínas.

A marcação das proteínas com FITC foi realizada conforme descrito no

item 3.11 de Materiais e Métodos. Para disponibilizar os grupos amino não

acessíveis das proteínas e então proporcionar um maior contato do fluoróforo

com a amostra de EPS na ausência de detergente, foi feita a adição de uréia


50

7mM. De fato, este tratamento possibilitou a marcação das proteínas as quais

ficaram visíveis no topo do gel de eletroforese sob condições desnaturantes. A

agregação das proteínas no gel pode ser devido a um novo estado

conformacional resultante do tratamento com a uréia ou ainda a presença de

uréia residual não removida durante o processo de diálise (resultados não

mostrados).

Quando estas proteínas marcadas com FITC foram adicionadas a

formulação de microesferas foi possível verificar por microscopia de fluorescência

a presença de esferas fluorescentes (Figura 5B) indicando êxito na encapsulação

das proteínas antigênicas no interior das ML.

Resultados semelhantes foram encontrados por Sun et al. (2003) para

proteínas marcadas com FITC encapsuladas em microesferas poliméricas.


51

Figura 5: Microesferas lipídicas, contendo as proteínas antigênicas de

membrana, obtidas através do protocolo 4 conforme descrito no item 3.10.4

de Materiais e Métodos. (A) Microscopia eletrônica de varredura das ML; (B).

Microscopia de fluorescência das MLP, contendo proteínas antigênicas marcadas

com isotiocianato de fluoresceína conforme descrito no item 3.11 de Materiais e

Métodos. Aumento de 800 X.

B


52

A preparação oriunda do protocolo 4 embora tenha apresentado bons

resultados, quando analisada por MEV e microscopia de fluorescência,

apresentou algumas limitações cruciais para a continuidade da pesquisa. A

preparação utilizando uma solução de PVA 3% resultou em uma solução

extremamente viscosa, o que inviabiliza estudos de espalhamento de luz

dinâmico e estudos de interação lipídio:proteína; também tivemos problemas para

quantificação das proteínas encapsuladas, uma vez que o PVA interfere em todos

métodos de quantificação disponíveis em nosso laboratório.

Diante das dificuldades encontradas para posteriores estudos, devido

principalmente a presença de PVA na formulação, optamos por substituir o PVA

por glicerol, esta mudança foi fundamentada em trabalhos descritos na literatura,

(Lixin et al., 2006; Yu et al., 2006).

Com o objetivo de otimizar a formulação de ML foram avaliadas cinco

diferentes formulações (protocolo 5), conforme descrito no item 3.10.5 de

Materiais e Métodos, (Tabela 1), estas foram preparadas e caracterizadas

separadamente, podendo-se assim ajustar a quantidade de cada componente na

formulação.

Nas formulações número 1 e 2 foram feitas principalmente investigações

quanto a proporção molar DPPC:Óleo de Soja(OS) a ser utilizada. Na primeira foi

utilizada uma proporção de aproximadamente 1:1, enquanto na segunda

formulação utilizou-se uma relação de 1:7. A avaliação feita por ensaios de

espalhamento de luz dinâmico revelou um alto índice de polidispersão na

formulação número 1, evidenciando a baixa homogeneidade da preparação, uma

vez que, quanto maior este índice, mais ampla a distribuição de tamanhos de

partículas no sistema (Nele & Pinto, 2002). Esta formulação também apresentou


53

baixa estabilidade, fato que ficou evidenciado nos resultados de espalhamento,

que registrou grandes valores de diâmetro médio, oriundos de uma provável

agregação no sistema.

Já na formulação de número 2 obteve-se bom índice de polidispersão,

porém assim como na primeira, houve agregação em poucos dias. Nas

formulações 3 e 4 tomou-se como base a relação DPPC:óleo de soja da

formulação número 2 e adicionou-se colesterol na proporção molar de 1:3

(colesterol:DPPC), nestas formulações foi variada a concentração de glicerol no

meio. O colesterol diminui a permeabilidade da monocamada lipídica

(Brockerhoff,1974) enquanto o glicerol é descrito como estabilizador de emulsões

(Zeringue, 1964), ambos evitam a coalescência entre as partículas estabilizando

assim as ML. Os resultados de espalhamento de luz obtidos para as formulações

número 3 e 4 mostraram a maior estabilidade da formulação de número 3.

Com isso, acompanhamos por medidas de espalhamento a formulação de

número 3 por um período de 30 dias, a fim de se obter informações sobre a

estabilidade do tamanho das partículas (Figura 6). Nesta Figura pode-se observar

que as partículas se mantêm estáveis no período estudado. As ML apresentaram

diâmetro médio de 160 nm, enquanto as MLP apresentaram 200 nm de diâmetro

médio. Houve um aumento de 25% no tamanho médio das ML com a

incorporação das proteínas, e também foi observado uma possível agregação nas

MLP em torno do 15º dia, porém as partículas se mantiveram com tamanho

próximos a 200 nm. Este aumento nas partículas devido à incorporação das

proteínas também foi observado em sistemas de proteolipossomos, descritos por

Daghastanli et al. (2002).


54

0 5 10 15 20 25 300

100

200

300

400

Diâ

met

ro m

édio

(nm

)

Tempo (dias)

Figura 6: Variação do diâmetro médio das ML e MLP armazenadas a 4oC

durante 30 dias. Os valores de diâmetro médios das amostras de (○) ML e (●)

MLP, foram obtidos através de ensaios de espalhamento de luz conforme

descrito no item 3.14 de Materiais e Métodos.


55

Após o estudo de tamanho de partícula, iniciou-se estudos de interação

lipídeo:proteína, neste ponto nos deparamos com outro problema da formulação,

a concentração de lipídeos e proteínas atingidos no final da preparação estavam

abaixo do limite de detecção das nossa metodologias de dosagem, além de não

apresentarem sinal quando submetidas a ensaios prévios de calorimetria

diferencial de varredura. Para resolvermos este problema, montamos a

formulação número 5, onde apenas aumentamos em cinco vezes a quantidade de

cada componente da formulação, mantendo somente a concentração de glicerol

em 2,5% (p/v). Foi usada a formulação de número 5 para os ensaios de

caracterização da microesferas lipídicas.

4.4 – Caracterização das Microesferas Lipídicas

Para avaliar a interação entre as proteínas e o sistema de ML, foi feito um

ensaio de centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Amostras de

EPS, ML e MLP foram submetidas ao gradiente, conforme descrito no item 3.15

de Materiais e Métodos.

A centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, do extrato

solubilizado de proteínas, mostrado na Figura 7B, revelou a presença de proteína

em concentrações de sacarose na faixa de 10 a 25 % (p/v), mostrando que a

amostra do EPS aparece espalhada na primeira metade do gradiente. Quando o

experimento foi realizado com ML (Figura 7A), observou-se a presença de um

único pico em uma concentração de sacarose ao redor de 13% (p/v) que é

identificado pela dosagem de fosfato inorgânico oriundo da hidrólise ácida dos

fosfolipídios, conforme descrito por Chen et al. (1956). Finalmente a centrifugação

em gradiente de densidade de sacarose das MLP, revelou a presença de um


56

único pico em concentrações de sacarose ao redor de 13% (p/v) (o mesmo

acontece com as ML) onde, tanto as proteínas quanto o lipídio se equilibram na

mesma densidade, sugerindo, portanto, a associação das proteínas às

microesferas lipídicas (Figura 7C).

O fato das proteínas de membrana quando livres equilibrarem-se numa

faixa de densidade de sacarose entre 10 a 25% e ao redor de 13% quando

colocadas juntas na preparação das ML sugerem que estas proteínas estão

interagindo com o sistema de ML e não simplesmente coexistindo na mesma

solução. Resultados semelhantes foram obtidos por Daghastanli et al. (2004) na

caracterização da interação de proteínas de membrana com sistemas de

lipossomos.


57

0 5 10 15 20 25 30

0.0

0.5

1.0

Saca

rose

(%)

C

Frações

0.0

0.1

0.2

Abs

orbâ

ncia

B

0.0

0.4

0.8

A

10

15

20

25

30

35

40

10

15

20

25

30

35

40

10

15

20

25

30

35

40

Figura 7: Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose: (A) ML, (B)

EPS, (C) MLP: (●) Absorbância em 595 nm, referente ao conteúdo protéico; (○)

Absorbância em 820 nm, referente ao fosfato inorgânico obtido pela hidrólise

ácida dos fosfolipídios e (■) % sacarose determinada por índice de refração.


58

Posteriormente, foi realizado um ensaio de calorimetria diferencial de

varredura (DSC). Esta é uma técnica de grande importância na caracterização

termodinâmica de modelos de membranas e sistemas lipídicos estruturados. Na

Figura 8 pode-se visualizar os termogramas obtidos para as diferentes amostras

analisadas. Nota-se que os termogramas referentes às ML e as MLP apresentam

um comportamento muito similar com temperatura de transição ao redor de 38,1 e

37,4ºC, respectivamente. Já a amostra que continha somente uma mistura física

dos componentes das ML, apresentou uma transição na temperatura de 43,0ºC.

Cabe destacar que com esta técnica, na faixa de temperatura estudada, é

possível determinar diretamente o calor absorvido de modo a determinar, por

exemplo, a transição de fase gel para fase líquido-cristalino (fluido) do DPPC. Os

termogramas revelam picos de capacidade calorífica (Cp) numa faixa estreita de

temperatura, dos quais se obtém facilmente a temperatura de transição (Tm) para

a qual a transição está concluída em 50% (Tristam-Nagle & Nagle, 2004). Pelo

fato das ML serem um sistema mais complexo, não abordamos os parâmetros

termodinâmicos, mas apenas a temperatura de transição do DPPC que está

localizado na forma de uma monocamada na superfície das esferas (Figura 1).

Assim, a transição apresentada na “mistura física” é característica de

sistemas constituídos somente por DPPC, que apresenta uma temperatura de

transição ao redor de 42,0ºC (Tristam-Nagle & Nagle, 2004). Entretanto, observa-

se um deslocamento desta temperatura de transição para valores menores nos

sistemas de ML e MLP, que reflete a um comportamento de um sistema

estruturado de DPPC:Colesterol. Além disso, a presença da proteína não está

afetando significativamente a temperatura de transição do sistema

(DPPC:Colesterol), e isso pode ser um indicio que as mesmas estariam mais


59

localizadas na região interna da ML (Figura 1).

Os resultados obtidos nos ensaios de DSC (Figura 8), juntamente com os

obtidos no gradiente de densidade de sacarose (Figura 7), confirmam que houve

a formação de um sistema de microesferas lipídicas estáveis, bem como um

sistema de LM encapsuladas com proteínas de membrana da L. amazonensis.

Como as técnicas utilizadas para isolar e purificar as proteínas de

membranas, bem como as técnicas de reconstituição destas em sistemas de

delivery são bastante drásticas, podendo causar a desorganização da estrutura

nativa da proteína, e consequentemente a perda de sua função, foi feito um

ensaio de eletroforese e western blotting para as amostras de EPS sem

detergente (pós sonicação) e das MLP. A Figura 9 mostra que mesmo após o

processamento destas proteínas (obtenção das frações de membrana,

solubilização, remoção de detergente e incorporação em ML), aparentemente não

há o aparecimento de novas bandas protéicas de menor massa molecular

oriundas de proteólise, nem a perda de atividade imunogênica das proteínas,

quando reveladas no western blotting.


60

15 30 45 60 75

0,50

0,55

0,60

0,65

Cp

(Kca

l/ m

ol.K

)

Temperatura (ºC)

Figura 8: Termograma Cp (kcal/mol.K) em função da Temperatura (°C), após

subtração da linha de base. Termogramas obtidos para as amostras de: ML

(___),MLP (___) e a mistura física dos componentes das ML(___). As análises

foram realizadas conforme descrito no item 3.17 de Materiais e Métodos,

utilizando um equipamento N-DSC II.


61

Figura 9: SDS-PAGE e Western Blotting das proteínas encapsuladas nas ML.

(A) proteínas coradas com prata e (B) Western Blotting de: (1) EPS após

sonicação; (2) Proteína encapsulada nas microesferas lipídicas (MLP). SDS-

PAGE e Western Blotting foram realizados conforme descrito nos itens 3.7 e 3.8,

respectivamente, de Materiais e Métodos.

205 kDa

116 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa

97,4 kDa

1 2 1 2205 kDa

116 kDa

66 kDa

45 KDa

29 kDa

97,4 kDa

A B


62

Trabalhos de Colhone et al. (2009), Migliaccio et al. (2008), Santos et al.

(2006) e Daghastanli et al. (2004), onde foram reconstituídas proteínas de

membrana de patógenos de L. amazonensis (promastigota), T. cruzi, L.

amazonensis (amastigota) e Pasteurella multocida, respectivamente, em

sistemas de lipossomos, mostraram resultados similares aos obtidos no presente

trabalho onde, as frações de proteínas de membrana que foram solubilizadas e

reconstituídas em sistemas de proteolipossomos, mantiveram suas respectivas

atividades antigênicas.

É descrito que ML possuem uma atividade farmacológica mais potente

quando comparada com administrações de princípios ativos na forma de solução

(Nasirideen, 1998). Por exemplo, já estão disponíveis no mercado ML contendo

diazepam, etomidato e propofol com boas relações custo beneficio (Lixin et al.

2006). Assim, seguindo a mesma linha de raciocínio, apesar de ainda não haver

dados suficientes disponíveis na literatura, é possível que a veiculação das

proteínas em ML possa levar a uma resposta imunogênica mais eficiente.

4.5 – Quantificação das proteínas encapsuladas nas ML

A quantificação das proteínas encapsuladas nas ML foi estimada através

da dosagem de proteína nas frações cromatográficas onde se encontravam as

ML, ou seja, as frações que apresentaram maior leitura de fosfato inorgânico

(Figura 10). Primeiramente foi aplicada na coluna, uma amostra de ML, após a

dosagem de fosfato inorgânico das frações coletadas, pode-se identificar o

volume de eluição das ML. A quantidade total de proteínas encapsuladas nas ML

foi estimada após a filtração em gel, que foi feita, para garantir a total separação

das proteínas não encapsuladas. Assim, a quantificação de proteínas foi avaliada


63

especificamente para as frações que continham as ML (maior leitura de fosfato

inorgânico) (Figura 10).

A quantidade total de proteína encontrada nestas frações, quando

comparada à quantidade total de proteína no sistema, revelou uma incorporação

de 85% das proteínas de membrana da L. amazonensis nas microesferas

lipídicas. Santos et al. (2006) trabalhando com sistemas de lipossomos obteve

uma incorporação de 60% de proteínas solubilizadas de membrana de L.

amazonensis (amastigotas), e em ensaios de imunização utilizando

camundongos BALB/c obteve cerca de 50% de redução da lesão provocada pelo

parasita, quando o animal foi imunizado com 40µg de proteolipossomo.

Portanto, conseguiu-se uma maior incorporação das proteínas nos

sistemas de ML, quando comparados com sistemas de lipossomos descritos na

literatura (Santos et al. 2006), afirmando assim o grande potencial que este

sistema possui na incorporação de proteínas de membrana.


64

0 5 10 15 20

0,00

0,05

0,10

0,15

Abs

orbâ

ncia

Frações

Figura 10: Quantificação das proteínas encapsuladas nas ML. Perfil de

eluição das MLP em uma coluna Superose 6 equilibrada e eluída com tampão

Tris.HCl 5mM, pH 7.5, contendo glicerol 2.5%, fluxo de 1 mL/min. Frações de 0,5

mL foram coletadas e alíquotas foram analisadas para: ( ) Concentração de

proteína (A595nm) e ( ) Concentração de fosfato inorgânico oriundo da hidrólise

ácida dos fosfolipídios (A820nm).


65

4.6 - Análise da produção de NO e Teste de viabilidade (MTT)

Atualmente existe uma gama de evidências clínicas e experimentais sobre

a via de controle da leishmaniose cutânea: macrófagos ativados produzem IL-12

que conduz a diferenciação e a proliferação de células Th1. As células Th1

produzem IFN-γ que ativa macrófagos para matar o parasita Leishmania através

da produção de NO. É bem documentado que a produção de NO é a etapa chave

na atividade leishmanicida de macrófagos murinos (Liew et al., 1997; Ropert and

Gazzinelli, 2000; Balaraman et al., 2004). Consequentemente foi avaliada a

produção de NO por macrófagos peritoneais murinos em resposta aos diferentes

estímulos com os sistemas de microesferas lipídicas.

Como se pode observar na Figura 11, maiores níveis de NO são

produzidos quando as culturas são estimuladas com 150 µL/mL de ML e 150

µL/mL de MLP (0,42 mg/mL) quando comparados as culturas controle que não

receberam nenhum estímulo. Apesar da literatura não apresentar dados que

possibilitem a comparação dos nossos resultados, aumentos na produção de NO

em culturas estimuladas com antígenos de Leishmania incorporados em outros

sistemas constituídos de lipídios tais como, lipossomos, também foram

observados por outros autores (Mazumdar et al., 2004; Bhowmick et al., 2008).

Também, Afrin et al. (2002) observaram que estimulações com GP63 livres ou

incorporadas em lipossomos ativaram macrófagos peritoneais, impedindo assim a

multiplicação de amastigotas de L. donovani in vitro. Em conclusão, o aumento na

produção de nitrito observado nos sobrenadantes das culturas que foram

estimuladas com os diferentes tratamentos (Figura 11) sugere que esses

estímulos podem estar ativando as células, o que pode conduzir a um maior efeito

leishmanicida dos macrófagos.


66

Ainda, para avaliar se as microesferas, na presença ou ausência das

proteínas, poderiam exercer algum efeito tóxico nos macrófagos estimulados por

esses diferentes tratamentos, verificamos a viabilidade celular através do teste do

MTT. Esse teste tem muitas vantagens, como, por exemplo, é rápido, permite

analisar muitas amostras de uma só vez e o substrato não interfere na medida do

produto. Segundo Mosmann (1983) através do teste do MTT é possível

diferenciar células vivas de células mortas, sendo assim de ampla aplicabilidade

para medidas de sobrevivência e proliferação de várias células. Pode-se observar

na Figura 12 que macrófagos peritoneais murinos estimulados com 70 µL/mL de

EPS (0,85 mg/mL), 150 µL/mL de ML e 150 µL/mL de MLP (0,42 mg/mL) por 48

horas, não mostram diferenças significativas na viabilidade celular quando

comparados as culturas controles que não foram estimuladas. Assim, estes

resultados demonstram que os macrófagos não sofrem efeitos tóxicos extremos

por ação de tais estímulos. Embora a literatura não ofereça dados que permitam

uma análise comparativa destes resultados, foi observado que o sistema de ML e

MLP nas concentrações testadas, não apresentam efeitos citotóxicos.

Portanto, todos esses resultados indicam que as microesferas lipídicas

podem estar ativando as células a produzirem maiores níveis de NO e ainda

mantêm as funções mitocondriais normais dos macrófagos na presença dos

diferentes estímulos.


67

1,8

2,1

2,4

2,7

*

*

MLPMLControle

NO

( µM

)

Figura 11: Produção de nitrito em culturas de macrófagos peritoneais

murinos estimulados com diferentes tratamentos. Macrófagos peritoneais

(1x106cel/mL) foram estimulados com: 150µL/mL de ML e 150µL/mL de MLP

(0,42mg/mL) e mantidos em estufa úmida a 21% O2, 5% CO2 e N2 atmosférico

durante 48h. Após, o sobrenadante das amostras de células foram utilizados para

análises da concentração de nitrito através do método de Griess conforme item

3.21 de Materiais e Métodos. Diferenças significativas entre controle, ML e MLP.

**P < 0,05.

**

**


68

0,03

0,06

0,09

0,12

0,15

0,18

MLPMLEPSControle

Abs

orbâ

ncia

(650

nm -

570n

m)

Figura 12: Efeitos de diferentes tratamentos na viabilidade de macrófagos

peritoneais murinos. Macrófagos peritoneais (1x106cel/mL) foram estimulados

com: 70 µL/mL de EPS (0,85mg/mL), 150µL/mL de ML e 150µL/mL de MLP

(0,42mg/mL) e mantidos em estufa úmida a 21% O2, 5% CO2 e N2 atmosférico

durante 48 horas. A viabilidade celular foi avaliada pelo teste do MTT (n=6)

conforme descrito no item 3.20 de Material e Métodos.

5. CONCLUSÕES

Conclusões

70

I. Foi padronizada uma metodologia rápida e eficiente para a obtenção de um

extrato de membrana de L. amazonensis rico em proteínas antigênicas.

II. As proteínas de membrana da L. amazonensis foram eficientemente

solubilizadas após tratamento com o SDS.

III. Foi adaptado e otimizado um protocolo para a remoção do detergente do EPS

com uma recuperação de 92% de proteína total.

IV. Foi possível obter ML revestidas por PVA encapsuladas com proteínas

antigênicas de membrana.

V. Microscopia eletrônica de varredura das ML com PVA revelou estruturas

esféricas revestidas pelo polímero.

VI. Microscopia de fluorescência das ML constituídas de proteínas antigênicas

marcadas com FITC indicou que este sistema foi capaz de encapsular as

proteínas antigênicas.

VII. A presença do PVA na formulação das ML implicou em elevada viscosidade e

interferência nos métodos de dosagem de proteína. Assim, o PVA foi

substituído por formulações contendo glicerol.

VIII. A condição ótima para a obtenção de ML foi: DPPC (56,50mg), OS (376,64mg);

Colesterol (10,00mg); Glicerol (2,5%p/v) e Água (q.s.p. 50mL). Esta formulação

apresentou maior estabilidade, baixa viscosidade e polidispersão.

IX. Uma encapsulação de 85% das proteínas do extrato protéico solubilizado de L.

amazonensis foi obtida nas ML.

X. ML e MLP são estáveis por um período de até 30 dias de armazenamento a

4ºC e possuem um diâmetro médio de 160 e 200 nm, respectivamente, quando

analisadas por espalhamento de luz dinâmico.

XI. Experimentos de gradiente de densidade de sacarose e DSC confirmam que se

Conclusões

71

conseguiu obter um sistema organizado onde as proteínas estão interagindo

com as ML. Ainda, pelos resultados de DSC podemos sugerir que as proteínas

estão localizadas no interior das ML.

XII. As proteínas da membrana L. amazonensis não perderam a atividade

antigênica, mesmo após os processos de solubilização, remoção do detergente

e posterior encapsulação.

XIII. Ensaios de viabilidade celular e de geração de NO em macrófagos peritoneais

murinos, revelaram que os sistemas de ML e MLP não apresentaram nenhum

efeito citotóxico e ativaram a produção de NO nas células.

XIV. Baseado nos resultados obtidos pode-se sugerir a utilização das microesferas

lipídicas encapsuladas com proteínas antigênicas da membrana de L.

amazonensis como um potencial sistema para terapia da leishmaniose.

6. REFERÊNCIAS

Referências

73

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Microesferas Lipídicas encapsuladas com proteínas ... · O Senhor me proporcionou a...

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