INTRODUOA Microbiologia clnica abrange o estudo dos vrus, fungos, bactrias e parasitas. Incluem-se tambm os testes para isolar e identificar estes mircroorganismos.A cultura de bactrias o crescimento de colnias de microorganismos induzida pelo homem para se conseguir um elevado nmero de microorganismos, para estudar as caractersticas culturais da bactria como, a capacidade de crescer em meio selectivo e o aspecto das colnias.Realizada em meios de culturas que fornecem os princpios nutritivos indispensveis ao seu crescimento das bactrias. Entre os principais componentes de um meio de cultura esto s fontes de carbono e energia como os acares, as fontes de nitrognio, fsforo e sais minerais. Outros componentes mais especficos podem ser encontrados em um meio para determinados organismos, estes so os fatores de crescimento como as vitaminas, aminocidos, etc. Alm disso, preciso fornecer condies ambientais para o desenvolvimento dos microorganismos, como pH, presso osmtica, umidade, temperatura, atmosfera (aerbia, microaerbia ou anaerbia), etc.Um meio de cultura pode ser slido, semi-slido ou lquido, em relao a consistncia. Animados ou Inanimados quanto natureza. E so ainda classificados quanto a finalidade, sendo classificados em:Primrios: aquele no qual o material coletado do paciente primeiro inoculado. A escolha do meio baseado na local da infeco.Seletivos: contem ingredientes que inibem o crescimento de certos microorganismos, enquanto deixa outros se desenvolverem. Por exemplo, meio EMB e MacConkey.Indicadores: contm substncias que visivelmente mudam com resultado da atividade metablica de um microorganismo particular.MEIOS DE CULTURAO crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informaes para a sua identificao. importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material. gar sangue (AS): meio rico e no seletivo, diferencial para a hemlise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, alm de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espcies de hemfilos e outros fastidiosos. gar chocolate (AC): meio rico e no seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactrias aerbias e facultativas. Quando incubado em CO2 d suporte tambm ao crescimento dos microaerfilos. Pode-se observar halos esverdeados com colnias alfa- hemolticas gar Mac Conkey (MC): meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilizao de lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivo. Como exceo, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus.Lactose positiva colorao avermelhadaLactose negativa colorao inalterada gar Salmonela-Shigella (SS): meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao rsea) e produo de H2S (colorao negra) gar Hecktoen Enteric (HE): meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao alaranjada) e produo de H2S (colorao negra) gar Thayer Martin Modificado (TMM): meio seletivo pela adio de colistina, vancomicina e nistatina inibe crescimento de enterobactrias, Gram positivos, fungos e algumas espcies de Neisserias saprfitas. Enriquecido com a adio de complementos para a recuperao de N. meningitidis e N. Gonorrhoeae. gar Eosina azul de metileno(EMB): meio de cultura diferencial que inibe o crescimento de bactrias Gram positivas e indica se a bactria fermentadora ou no de lactose. Bactrias fermentadoras delactoseapresentam-se em colnias com o centro preto. Colnias deEscherichia coliso facilmente identificveis por apresentarem colorao verde metlico no meio EMB.H diferentes tcnicas para se efetuar uma semeadura, com ala de platina, com swab, com ala calibrada, tcnica de isolamento, tcnica para antibiograma. Para anlise de morfologia, estudo e identificao da espcie e gnero da bactria, faz-se a tcnica de isolamento em meio de cultura que consiste em isolar as colnias para que no haja interferentes e contaminaes cruzadas aps a incubao.Para a tcnica de antibiograma e urinocultura faz se a semeadura preenchendo a placa inteira. Para identificar o microorganismo e necessrio fazer um Gram dos organismos da placa de Agar sangue. Se observar um organismo Gram positivo, necessrio fazer um teste de catalase para diferenci-lo entre Streptococcus e Staphylococcus.Se a bactria catalase positiva, cocos Gram positivos arranjados na forma de cachos de uva, observados na microscopia, deve ser feito um teste de coagulase para diferenciar Staphylococcus aureus de outros estafilococos. Se observado cocos Gam negativos na microscopia com colorao de Gram deve ser feito semeadura das colnias em Agar EMB ou MacConkey, incubado por uma noite. Fazer colorao de Gram da bactria crescendo no Agar EMB ou MacConkey, o que confirmar a bactria Gram negativa, j que ambos inibem crescimento de organismos Gram positivos.Pelas caractersticas das colnias pode-se identificar o microrganismo pois muitas bactrias Gram negativas tem morfologia de colnia distinta em meios seletivos ou indicadores. As espcies de Klebsiella tm colnias caractersticas, rseas, mucides. E. coli forma um brilho verde metlico no EMB.

ANTIBIOGRAMA uma tcnica destinada determinao da sensibilidade bacteriana in vitro frente a agentes antimicrobianos, tambm conhecido por Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos.A realizao do antibiograma e sua interpretao no uma tarefa fcil, por suas limitaes e principalmente pela crescente descoberta de novos mecanismos de resistncia, o que exige cada vez mais atualizao e treinamento dos profissionais. A metodologia de Kirby e Bauer para antibiograma a mais difundida e utilizada at hoje na rotina de anlises clnicas, devido a sua praticidade de execuo, baixo custo e confiabilidade de seus resultados. Apesar de sua relativa simplicidade de execuo, a tcnica de Kirby e Bauer exige que as instrues sejam seguidas rigorosamente de forma que os resultados obtidos correspondam realidade e possam ser comparados com as tabelas internacionais.As placas so lidas para inibio de crescimento em torno dos discos de antibiticos. As zonas de inibio podem ser medidas usando paqumetos ou rgua transparente. Cada antibitico produz um tamanho especfico para cada organismo. O tamanho da zona ou halo de inibio classificar o organismo como sensvel, resistente ou intermedirio. Esta informao fornecida nas istrues de uso dos discos de antibiticos. Um antibitico que produza uma zona sensvel dever ser prescrito para ainfeco.

PROVAS BIOQUMICASA investigao das atividades metablicas das bactrias in vitro chamada de Provas Bioqumicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espcies de bactrias ou leveduras atravs da verificao das transformaes qumicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ao das enzimas de um dado microrganismo. Como muitas vezes um determinado microrganismo possui um sistema enzimtico especfico, promovendo transformao bioqumica especfica, as provas bioqumicas podem ser utilizadas na prtica para a sua caracterizao.Para a realizao das provas bioqumicas necessrio utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condies nutritivas e ambientais necessrias ao seu desenvolvimento. As principais e mais utilizadas provas bioqumicas so: Produo de catalase - Esta enzima atua sobre a gua oxigenada (perxido de hidrognio 3 a 5%) desdobrando-a em oxignio e gua. A prova feita colocando uma gota de soluo aquosa de perxido de hidrognio a 3-5% numa lmina e, em seguida, com uma ala de platina, colocar uma poro do crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de outra forma, adicionando-se 0,5 ml da mesma soluo a uma cultura em meio lquido ou em gar inclinado. A prova considerada positiva quando h borbulhamento ou efervescncia devido liberao do oxignio. A catalase produzida por muitos microrganismos e usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que so catalase positivos de Streptococcus, catalase negativos, ou os bacilos Gram positivos catalase negativos Lactobacillus e Erysipelothrix de Listeria e a maioria dos Corynebacterium catalase positivos. Utilizao do citrato como nica fonte de carbono - Alguns microrganismos como a E. coli no possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da clula, no conseguindo portanto crescer no meio contendo como nica fonte de carbono o citrato, embora possuam as enzimas, intracelulares, que degradam o citrato. A prova feita semeando-se a bactria no meio slido inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. A prova positiva resulta no transporte do citrato pela permease e a sua utilizao pela enzima citratase resulta na formao de oxaloacetato e acetato. Com o metabolismo do citrato h formao de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do indicador vira para azul. Na prova negativa o meio no se altera pois no h crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculao deve ser feita com agulha e em linha reta para no haver influncia de ingrediente do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos. Prova da produo de urease - A urease uma enzima que degrada a uria em duas molculas de amnia e uma de anidrido carbnico. A prova consiste em transferir uma poro do crescimento bacteriano com uma ala para o meio contendo uria, pH neutro e um indicador de pH, o vermelho fenol. Aps o crescimento a prova revelada positiva quando a urease ataca a uria alcalinizando o meio que toma a colorao rosa choque. Na prova negativa no h alterao da cor do meio. Os organismos do gnero Proteus so urease positivos diferentemente da maioria das enterobactrias. Prova da produo de indol - O indol resultante da degradao do aminocido triptofano pela enzima triptofanase. A prova realizada inoculando-se o meio contendo excesso de triptofano. Aps a incubao colocar 0,5 ml do reagente de Kovac ou o reativo de Ehrlich atravs da parede interna do tubo. A prova positiva quando na poro superior, desenvolve-se um anel de cor rsea dentro de no mximo 5 minutos. A prova negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio ou marrom) Prova do Vermelho de metila (VM) prova efetuada para determinar a capacidade do microrganismo de oxidar a glicose com produo e estabilizao de altas concentraes de produtos finais cidos. Serve para diferenciar organismos entricos, em particular E. coli de E. Aerogenes Prova da Motilidade - A prova da motilidade indica indiretamente a produo de flagelos. No uma prova bioqumica e sim fisiolgica, mas auxilia a identificar bactrias. A prova efetuada inoculando-se em linha reta, atravs da tcnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-slido. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculao, turvando o meio. A prova negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculao sem, contudo, turvar o meio. Prova de Bile-Esculina - baseada na capacidade de algumas bactrias hidrolisarem esculina empresena de blis. A esculina um derivado glicosdico da cumarina. As duas molculas docomposto (glicose e 7-hidroxicumarina) esto unidas por uma ligao ster atravs do oxignio.A esculina incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares. As bactrias Bile-Esculina positivas, so capazes de crescer em presena de sais biliares. Ahidrlise da esculina no meio resulta na formao de glicose e esculetina. A esculetina reage comons frricos (fornecidos pelo composto inorgnico do meio - o citrato frrico), formando umcomplexo negro. Enterococcus spp. so Bile-Esculina positivos. Prova de Gelatinase - Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolticas (gelatinases) queliquefaz/hidrolisa gelatina. Tem como objetivo identificar e classificar bactrias fermentadoras, no fermentadoras e bacilos Gram positivosesporulados. ProvaTSI - OTSI um meionutrientee diferencial que permite estudar a capacidade de produo de cido e gs a partir de glicose, sacarose e lactose em um nico meio.Tambmpermite a identificao da produo deSH2. Esta uma prova especfica para a identificao a nvel de gnero na famliaEnterobacteriaceae, com objetivo de diferenciar entre: bactrias fermentadoras da glicose, da lactose, de sacarose, bactrias aerognicas e bactrias produtoras deSH2 a partir de substncias orgnicas que contenham enxofre. Prova da Fenilalanina - H bactrias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio, originando assim o cido fenilpirvico. O cido fenilpirvico reage com o cloreto frrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde. Tem como objetivo diferenciar gneros e espcies de enterobactrias. Prova da Lisina - Algumas bactrias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a poro carboxila dos aminocidos. Formam-se ento aminas, de reao alcalina (por ex. cadaverina), e CO2. A reao ocorre preferencialmente em condies anaerbias e ligeiramente cidas. Inicialmente ocorre a utilizao da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificao do meio. O meio contm o indicador bromocresol prpura. Nas etapas iniciais de incubao, o tubo torna-se amarelo devido fermentao da glicose. Se o aminocido descarboxilado o meio retorna cor prpura.

BACILOSCOPIAA baciloscopia direta do escarro o mtodo principal no diagnstico e para o controle de tratamento da tuberculose pulmonar por permitir a descoberta das fontes de infeco, ou seja, os casos bacilferos. a pesquisa de BAAR (Bacilos lcool-cido Resistentes) no esfregao da amostra atravs do microscpio Trata-se de um mtodo simples, rpido, de baixo custo e seguro para elucidao diagnstica da tuberculose, uma vez que permite a confirmao da presena do bacilo, porm de baixa sensibilidade (25% a 65%) se comparado com a cultura, pois o nmero mnimo de bacilos para que se tenha um resultado positivo de baciloscopia varia de 5.000 a 10.000 bacilos/ml da amostra.A boa amostra de escarro a proveniente da rvore brnquica, obtida aps esforo da tosse (expectorao espontnea).O esfregao na lmina realizado com uma amostra do escarro, de preferncia a poro mais purulenta, onde os bacilos provavelmente estaro concentrados. Aps um tempo de secagem, as lminas devem ser fixadas e coradas. A colorao realizada pelo mtodo de Ziehl-Neelsen que basea-se na resistncia descolorao da fucsina na parede celular do bacilo, aps lavagem com solues lcool-cido.Na colorao pelo mtodo de Ziehl- Neelsen, os bacilos aparecem em forma de basto avermelhados, por vezes isolados ou agrupados ou ainda fragmentados (pacientes em tratamento), com um fundo azul.A leitura realizada em microscpio optico com objetiva de 100x. O resultado dado por pelo nmero de bacilos contados por campo. Negativo: nenhum BAAR em 100 campos Contagem exata: 1-9 BAAR em 100 campos; neste caso menciona-se o nmero de bacilos observados Positivo +: 10 a 99 BAAR em 100 campos Positivo ++: 1 a 10 BAAR por campo Positivo +++: mais de 10 BAAR por campo

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARINSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICASFACULDADE DE BIOMEDICINA

RELATRIO DE ESTGIO SUPERVISIONADO EM ANLISES CLNICAS REFERENTE AO SETOR DE MICROBIOLOGIA

FILIPE KATSUHIKO KATASHO2015