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1 MICHELLE VANZELLA DULGUER ESTUDO SOBRE A ADESˆO DA Escherichia coli ENTEROPATOG˚NICA AT˝PICA O26:H11 A CLULAS EPITELIAIS Tese apresentada Universidade Federal de Sªo Paulo-Escola Paulista de Medicina para obtenªo do ttulo de Doutor em CiŒncias Sªo Paulo 2006
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MICHELLE VANZELLA DULGUER
ESTUDO SOBRE A ADESÃO DA Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA ATÍPICA O26:H11 A CÉLULAS
EPITELIAIS
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo-Escola Paulista
de Medicina para obtenção do título de
Doutor em Ciências
São Paulo
2006
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
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MICHELLE VANZELLA DULGUER
ESTUDO SOBRE A ADESÃO DA Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA ATÍPICA O26:H11 A CÉLULAS
EPITELIAIS
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo-Escola Paulista
de Medicina para obtenção do título de
Doutor em Ciências pelo Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia e
Imunologia.
Orientadora:
Profa. Dra. Isabel Cristina Affonso Scaletsky
Co-Orientador:
Prof. Dr. Renato A. Mortara
São Paulo
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA
Chefe do Departamento: Prof. Dr. Sérgio Schenkemam
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. José Daniel Lopes
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Este trabalho foi realizado na Disciplina de Microbiologia do Departamento de
Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de São
Paulo � Escola Paulista de Medicina (UNIFESP), com auxílio financeiro
concedido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP � 01/03525-1).
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Aos meus pais Ivan e Maria Cecília que me deram a vida, amor
incondicional sem nunca pedirem nada em troca; que me ensinaram a ser
uma pessoa de princípios e qualidades, mas acima de tudo com humildade
para reconhecer os meus erros; por estarem ao meu lado , de braços sempre
abertos nos momentos difíceis . . .
vocês serão sempre meu porto seguro . . .
Dedico,
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À minha irmã e companheira nesta longa jornada Patrícia, pelo seu amor,
amizade, dedicação e incentivo
Dedico,
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Não Sei. . . .
Não sei...se a vida é curta ou longa demais pra nós,
Mas sei que nada do que vivemos tem sentido,
se não tocarmos o coração das pessoas.
Muitas vezes basta ser:
Colo que acolhe,
Braço que envolve,
Palavra que conforta,
Silêncio que respeita,
Alegria que contagia,
Lágrima que corre,
Olhar que acaricia,
Desejo que sacia,
Amor que promove.
E isso não é coisa de outro mundo,
é o que dá sentido à vida.
É o que faz com que ela não seja nem curta,
nem longa demais, mas que seja intensa,
verdadeira, pura......Enquanto durar.
(Cora Coralina)
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AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Isabel Cristina Affonso Scaletsky (Bel) pela
oportunidade de trabalhar em seu laboratório e fazer parte de sua equipe,
pelos conhecimentos transmitidos desde a iniciação científica, pela paciência,
por algumas broncas que hoje reconheço que foram muito importantes para o
meu amadurecimento profissional, pela compreensão e apoio que teve
comigo em momentos difíceis que passei e, acima de tudo, pela amizade.
Serei sempre GRATA......
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Renato A. Mortara pela ajuda no
desenvolvimento deste trabalho, principalmente pela paciência, dedicação e
permanente disponibilidade.
Aos professores do Departamento de Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia da Escola Paulista de Medicina.
A Sandra Hilde Fabbricotti (Sandrinha) pela amizade, pela sua alegria
constante, pelas nossas conversas e principalmente pelos seus conselhos
sempre valiosos
Ao Prof. Dr. Antônio José Piantino Ferreira do Departamento de
Ornitopatologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP,
por ceder gentilmente o soro policlonal anti-K88.
9
Ao Dr. Ivan Hong Jung Koh do Departamento de Cirurgia Experimental
da UNIFESP, pela amizade, pelos conselhos e pela grande ajuda nos
experimentos de colonização em camundongos
As secretárias da Disciplina de Microbiologia Magda e Paola pela amizade,
dedicação e pela ajuda constante na realização deste trabalho.
Às amigas Andresa Zamboni, Bianca Bragato, Kátia Regina S. Aranda e
Lúcia M. Lopes pela torcida, pela convivência dentro e fora do laboratório,
pelas alegrias e por sempre me apoiarem em todos os momentos.
A Isabel C. Cintra minha grande amiga e irmã do coração nesta VIDA, pela
sua torcida constante, seu apoio e por estar sempre ao meu lado em todos
estes anos. Seremos sempre AMIGAS.....
Ao amigo Sergio Suzart pelo incentivo, ajuda, por participar da minha reta
final e por mostrar que por mais difícil que as coisas possam parecer aos
nossos olhos, devemos sempre acreditar em �Alguém� bem maior que tudo
isso e que rege as nossas vidas.
Ao André Luis L. Bachi pela amizade, torcida e principalmente pela grande
ajuda nos experimentos de imunização.
Aos amigos: Rodrigo, Lucília, Luciano, Ana Maria, Cecília Abe, Fábia, Vera,
Mônica e Joel pela torcida. Muito obrigada!
Aos funcionários Edvan, Sueli e Flávio sempre dispostos a ajudar.
À Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado de São Paulo (FAPESP) pela
concessão da bolsa de doutorado, fundamental pela realização deste
trabalho.
A todas as pessoas que de alguma forma, direta ou indiretamente,
10
contribuíram para a realização deste trabalho.
MUITO OBRIGADA!
SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO 1 1.1. E. coli diarreiogênica 1 1.2. Adesinas de EPEC 3 1.3. Adesinas de EHEC/STEC 4 1.4. Adesinas de ETEC 5 1.5. Adesinas de EIEC 6 1.6. Adesinas de EAEC 7 1.7. Adesinas de DAEC 7 1.8. EPEC atípica 8 1.9. EPEC atípica O26:H11 9 2. OBJETIVOS 13 3. MATERIAIS E MÉTODOS 14 3.1. Amostras bacterianas e condições de cultivo 14 3.2. Extração de DNA 15 3.2.1. Extração de DNA plasmidial em larga escala ("maxi-prep") 15 3.2.2. Extração de DNA plasmidial em pequena escala ("mini-prep") 15 3.2.3. Extração de DNA cromossômico 16 3.2.4. Determinação da concentração de DNA 16 3.2.5. Eletroforese de DNA em gel de agarose 17 3.3. Teste de hibridização de DNA bacteriano com sonda genética 17 3.3.1. Transferência de DNA de células bacterianas para filtros de papel Whatman - "Colony blot" 17 3.3.2.Transferência de DNA de gel de agarose para membrana de nylon "Southern blot" 18 3.3.3. Preparo de fragmento sonda 18 3.3.4. Marcação radioativa de fragmento sonda 19
11
3.3.5. Hibridização dos filtros e membranas 19 3.4. Reação de polimerização em cadeia (PCR) 20 3.5. Teste de adesão 21 3.5.1. Cultivo das células HEp-2 21 3.5.2. Realização do teste de adesão 21 3.6. Testes de inibição da adesão 22 3.6.1. Leitura do teste de inibição da adesão 22 3.7. Ensaios de imunofluorescência 23 3.8. Análise de proteínas 23 3.8.1. Extração de estruturas fimbriais parcialmente purificadas 23 3.8.2. Extração da fímbria K88 25 3.8.3. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 3.8.4. "Imuno blot" 25 3.9. Sequenciamento da região amino-terminal 26 3.10. Preparo de soro policlonal 27 3.11. Microscopia eletrônica de transmissão 27 3.11.1. Coloração negativa 27 3.11.2. Imunomarcação com ouro coloidal 28 3.12. Experimentos de colonização 28 3.12.1. Animais utilizados 28 3.12.2. Preparo das amostras bacterianas 29 3.12.3. Inoculação intragástrica 29 3.12.4. Número de bactérias detectadas nas fezes e nos segmentos intestinais (íleo, cólon e ceco) 29 4. RESULTADOS 34 4.1. Ensaios preliminares para a caracterização da adesina LDA 34 4.2. Purificação da adesina LDA 35 4.3. Caracterização fenotípica da adesina LDA 36 4.3.1. Ensaios de inibição da adesão com o anti-soro LdaG 36 4.3.2. Ensaios de imunofluorescência 36 4.3.3. Ensaios de imunomarcação com ouro coloidal 37 4.3.4. Ensaios de inibição da adesão com carboidratos 37 4.4. Estudos sobre a presença da adesina LDA em amostras de EPEC atípica 38 4.4.1. Pesquisa do gene ldaH que codifica a subunidade estrutural LdaH da adesina LDA 38 4.4.2. Pesquisa da subunidade estrutural LdaG através de "Imuno blot" 39 4.4.3. Ensaios de inibição de adesão com soro anti-LdaG 39 4.4.4. Ensaios de imunofluorescência 39 4.4.5. Pesquisa do gene ldaG que codifica a subunidade estrutural LdaG da adesina LDA 40 4.5. Relação antigênica entre as adesinas LDA e K88 40 4.6. Ensaios de colonização "in vivo" 41 4.6.1. Análise das amostras fecais dos animais 42 4.6.2. Análise macroscópica do íleo, ceco e cólon dos animais 42
12
4.6.3. Adesão e colonização no íleo, cólon e ceco 43 4.6.4. Parâmetros clínicos analisados 43 5. DISCUSSÃO 66 6. CONCLUSÃO 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75 8. ANEXO 90
13
RESUMO
O sorogrupo O26 de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) atípica
é um dos sorogrupos mais freqüentes implicados na diarréia infantil, sendo
um sorogrupo muito comum também em amostras de E. coli
enterohemorrágica (EHEC). O sorotipo mais freqüente dentro do sorogrupo
O26 tanto em amostras de EPEC quanto em amostras de EHEC é a
O26:H11.
Num recente estudo, amostras de EPEC atipica O26:H11 isoladas de
crianças com diarréia apresentaram um padrão de adesão localizado (AL),
porém eram desprovidas da fímbria BFP responsável pelo fenótipo AL das
EPEC típicas. Uma dessas amostras, E. coli 22, foi escolhida para
caracterização de seus determinantes genéticos.
Foi construída uma biblioteca genômica da amostra 22 na E. coli
DH5α e identificado um clone cosmídeo denominado pV-B-6, aderente a
células HeLa. O clone pV-B-6 exibiu um padrão de adesão difusa (AD) sobre
as células epiteliais, diferente da formação de microcolônias presentes na
adesão AL apresentada pela amostra 22. O cosmídio pV-B-6 foi submetido a
mutagênese utilizando o transposon mini-Tn10::kan e identificado um
mutante não aderente (pV-B-6-Tn). Um fragmento de 2,3 kb EcoRI-HindIII
contendo 1 kb do mini-Tn10 foi clonado, sendo identificado um gene, ldaH,
que possuía 73% de identidade com a subunidade fimbrial faeH da de fímbria
K88 ETEC. Essa região foi denominada de �locus for diffuse adherence� (lda).
O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a adesina
codificada pelo lócus lda, a qual é responsável por conferir o padrão AD a
células HEp-2 na amostra pV-B-6.
A análise em SDS-PAGE de extratos parcialmente purificados das
14
amostras 22 e pV-B-6 mostrou uma banda protéica de
aproximadamnete 25 kDa, que estava ausente nos extratos do mutante pV-B-
6-Tn. A proteína de 25 kDa foi cortada do gel, sendo determinado o
sequenciamento da região amino-terminal. A seqüência de aminoácidos
correspondeu à forma madura de LdaG, a principal subunidade estrutural da
adesina. A expressão de Lda foi induzida em meio ágar MacConkey a 37oC.
Para demonstrar que a adesina LDA era a responsável pelo padrão AD
a células HEp-2, foi produzido um anti-soro LdaG em coelho. A especificidade
do soro anti-LdaG foi determinada pela reação de �Imuno blot�. Apenas a
proteína de 25 kDa foi reconhecida pelo soro imune, apresentando uma
reação fortemente positiva com a amostra selvagem E. coli 22 e com o clone
pV-B-6. Nenhuma reação do soro anti-LdaG foi observada no mutante,
demonstrando, assim, a especificidade desse soro. Ensaios de inibição de
adesão revelaram que o anti-soro LdaG reconheceu os epítopos da adesina
responsáveis pela fenótipo AD, visto que foi capaz de inibir totalmente a
adesão do clone pV-B-6.
A imunomarcação com o anti-soro LdaG identificou na amostra 22 uma
matriz de superfície amorfa sem nenhuma aparência de estrutura fimbrial.
Quando observado em aumento maior, verificou-se a presença de estruturas
fibrilares muito finas formando estruturas semelhantes a uma malha. Em
contrapartida, nenhuma marcação foi observada no mutante LDA1.
Foi determinada a incidência do gene ldaH em 65 amostras de EPEC
atípica, isoladas em diferentes cidades brasileiras de crianças com diarréia
aguda e de controles e pertencentes a 34 diferentes sorogrupos. Nenhuma
dessas 65 amostras produtoras do padrão ALL em ensaios de 6 horas
apresentou a seqüência ldaH.
Também foram estudadas 13 amostras de EPEC atípica que
pertenciam aos sorogrupos O26, O55 e O111. O gene ldaH foi encontrado
em quatro amostras, todas do sorogrupo O26 e que apresentavam o padrão
AL em ensaios de três horas. No entanto, tanto os experimentos de PCR para
amplificação do gene estrutural ldaG, como os experimentos de �Imuno blot�
utilizando o anti-soro LdaG não revelaram a proteína de 25 KDa.
15
Ensaios de inibição de adesão e imunofluorescência com soro anti-
K88 foram realizados com o intuito de investigar a relação antigênica entre as
adesinas LDA e K88. Os resultados mostraram que ambas as adesinas são
antigenicamente distintas, uma vez, que o soro anti-K88 não inibiu a AD e
nem reconheceu qualquer estrutura presente na superfície da amostra pV-B-
6.
Neste estudo foi avaliado o papel da adesina LDA na virulência
bacteriana, utilizando o modelo do camundongo tratado com estreptomicina e
comparando a amostra selvagem 22 com a isogênica apresentando deleção
do gene ldaG. Os resultados obtidos mostraram que aparentemente, a
adesina LDA está envolvida no processo de colonização, uma vez que a
amostra selvagem 22 aderiu e colonizou mais eficientemente o ceco de
camundongos C57BL/6J do que a amostra 22 ∆ldaG
Concluindo, nossos resultados levaram a identificação e caracterização da
adesina LDA responsável pela aderência difusa a células HEp-2. LDA é uma
adesina afimbrial que contém uma subunidade principal, LdaG, cuja
expressão é induzida em ágar MacConkey a 37oC. Estudos futuros são
necessários para caracterizar melhor o papel da adesina LDA na virulência
bacteriana.
16
ABSTRACT
The O26 serogroup of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is one
of the most frequently implicated in infant diarrhea and is also common among
enterohemorrhagic E. coli (EHEC) strains. The most common O26 strains
belong to EPEC/EHEC serotype O26:H11.
In a previous report, atypical EPEC strains O26:H11 isolated from
children with diarrhea exhibited a localized adherence (LA) pattern within 3
hours, but do not harbor the BFP fimbriae correlated with the LA phenotype of
typical EPEC. One isolate, E. coli 22 was used to characterize its genetic
determinants.
A genomic cosmid library of E. coli 22 was generated in E. coli K12 and
the resulting clones were screened for LA adherence to HEp-2 cells. One
cosmid clone, pV-B-6, exhibited adherence in a diffuse pattern over the entire
epithelial cell rather than the LA microcolony formation seen with E. coli 22.
Transposon mutagenesis was utilized to identify the region of cosmid pV-B-6
responsible for the adhesive phenotype. One isolate tested negative for
adherence (pV-B-6-Tn) was chosen for further analysis. DNA sequencing of a
subclone of pV-B-6 revealed an open reading frame, ldaH, whose predicted
protein product shares 73% amino acid identity with that of the E. coli K88
fimbrial gene faeH. This region was named the locus for diffuse adherence
(lda).
The aim of this study was to characterize the adhesin encoded by the
lda locus that is responsible for mediating diffuse adherence to HEp-2 cells.
SDS-PAGE of whole-cell cell lysates from E. coli 22 and pV-B-6
showed a broad band with an apparent molecular mass of 25 kDa, which was
absent in the pV-B-6-Tn extracts. The 25-KDa band was excised from the gel,
and its N-terminal amino acid sequence determined. The sequence
corresponds to the mature form of LdaG, the major structural subunit. The
expression of LdaG is induced on MacConkey agar at 37oC.
To provide further evidence that the LDA adhesin was responsible for
the diffuse adherence seen on HEp-2 cells, we raised polyclonal rabbit
antiserum against the major structural subunit LdaG. Imuno blot analysis
17
showed that the antiserum recognized the 25-kDa band present in wild-
type E. coli 22 and pV-B-6, but not the pV-B-6-Tn mutant. Treatment of pV-B-
6 with the antiserum completed inhibited diffuse adherence of pV-B-6 to the
HEp-2 cells.
Immunogold labeling with LdaG antiserum identified an amorphous
surface matrix with no obvious fimbrial structure. At higher magnification, very
fine wiry fibrils forming mesh-like structures could be visualized.
To determine whether the lda locus was specific to our O26:H11 strain
or if it is present in other E. coli strains, we performed colony blots and HEp-2
adherence on a collection of 65 atypical EPEC strains representing 34 O
serogroups. Most (61.5%) of strains were positive for HEp-2 localized-like
adherence assay and all strains were ldaH probe negative. We also tested 13
atypical EPEC strains, which belonged to Dr. Luiz R. Trabulsi and ldaH was
found in four O26 LA positive strains. These strains were tested with an ldaG
gene probe, but were negative.
By using a K88 antiserum, it was possible to demonstrate different
antigenic determinants, between LDA and K88 adhesins.
A streptomycin-treated mouse model was used to compare the
intestinal colonization capacity of E. coli 22 strain with that of its ∆ldaG
derivative (LDA1). The results showed that E. coli 22 adheres and colonizes
the cecum of C57BL/6J mice more efficiently than the LDA1.
In conclusion, we were able to characterize the LDA adhesin
responsible for diffuse adherence to HEp-2 cells. LDA is an afimbrial adhesin
that contains a major subunit, LdaG, whose expression is induced on
MacConkey agar at 37oC. Additional work is needed to characterize the role in
virulence of the LDA adhesin.
18
1. INTRODUÇÃO
1.1. E. coli diarreiogênica
Uma etapa importante na colonização do trato gastrointestinal humano
por bactérias é a adesão do microrganismo à superfície do hospedeiro.
Embora a adesão seja essencial na manutenção dos membros da microbiota
do intestino, também é a fase inicial e crítica em todas as infecções intestinais
causadas por amostras de Escherichia coli patogênicas, conhecidas como as
E. coli diarreiogênicas (Torres et al., 2005).
Pelo menos seis categorias de E. coli diarreiogênica são reconhecidas:
E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC) ou E. coli
produtora da toxina de Shiga (STEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli
enteroinvasora (EIEC), E. coli aderente difusamente (DAEC) e E. coli
enterogregativa (EAEC) (Nataro & Kaper, 1998). EHEC está associada a
casos de colite hemorrágica e a síndrome hemolítica-urêmica (Tarr, 1995;
Moake et al., 1994). Além de causar a lesão do tipo �attachment and
effacement� (A/E), produz as toxinas denominadas toxina de Shiga (Stx) I e II.
ETEC está associada à diarréia aguda e envolvida nos casos de diarréia do
viajante em adultos. A adesão à mucosa intestinal e produção de pelo menos
uma das enterotoxinas termoestáveis (ST) e termolabéis (LT), são os fatores
de virulência apresentados por essa categoria (Nataro & Kaper, 1998). EIEC
apresenta a capacidade de invadir, de multiplicar-se em células epiteliais e de
causar ceratoconjuntivite em cobaia. Tal como Shigella causam colite
inflamatória e disenteria (Mounier et al., 1992; Sansonetti et al., 2000). EAEC
e DAEC são definidas como categorias de E. coli diarreiogênicas que aderem
a células epiteliais cultivadas nos padrões denominados de adesão difusa e
adesão agregativa, respectivamente, e que não reagem com as sondas
genéticas empregadas no diagnóstico de EPEC, EIEC, ETEC e EHEC.
O aumento dos conhecimentos e a sofisticação dos recursos nos últimos
anos alteraram a definição de EPEC. No 2o Simpósio Internacional de EPEC
em 1995, ficou estabelecida uma definição consensual sobre as EPEC. São
19
chamadas de EPEC típicas as amostras de E. coli que apresentam o
plasmídio EAF (�E. coli adherence factor�), as quais provocam lesões A/E e
não são produtoras de toxina Shiga, enquanto que as EPEC atípicas são
aquelas que não possuem o plasmídio EAF (Kaper et al., 1996).
Nos últimos anos, obteve-se grande avanço na identificação de fatores
de aderência nas diferentes categorias de E. coli diarreiogênica. Essas
estruturas protéicas estão associadas à superfície bacteriana e podem ser
divididas em adesinas fimbriais e afimbriais (Tabela 1). As adesinas fimbriais
são apêndices filamentosos não flagelares, enquanto que as adesinas
afimbriais são agregados amorfos, sem um formato definido (Duguid et al.,
1955; Krogfelt, 1991). A arquitetura das adesinas afimbriais não é muito bem
conhecida, mas presume-se que a maioria delas estejam ligadas à superfície
celular como monômeros ou oligômeros simples (Hultgreen et al., 1993).
TABELA 1. Principais adesinas das E. coli diarreiogênicas
Grupo de E. coli Adesina fimbrial Adesina afimbrial
EPEC BFP Intimina, flagelo, LifA/Efa1, Afa
EHEC/STEC Lpf, Sfp Intimina, Iha, Saa, Efa1,ToxB
ETEC CFs, Longus -
EIEC - HAF
EAEC AFFS -
DAEC F1845 AIDA-I
Torres et. al., (2005)
1.2. Adesinas de EPEC
Amostras de EPEC colonizam o intestino delgado e produzem uma
lesão histopatológica denominada de �attaching and effacing�, conhecida
como lesão A/E, que é comumente encontrada em amostras de EHEC
(Stanley et al., 1969). Esta lesão pode ser observada em células de cultura
de tecido, em mucosa intestinal de animais e de seres humanos (Rothbaum
20
et al., 1982; Moon et al., 1983; Knutton et al., 1989; Pedroso et al., 1993).
A lesão A/E é resultante da adesão íntima da bactéria ao enterócito,
causando a destruição das microvilosidades, a polimerização da actina e o
rearranjo de outros componentes do citoesqueleto, resultando na formação
de projeções da membrana, cujo formato lembra um pedestal (Rothbaum et
al., 1982; Knutton et al., 1987; Silva et al., 1989; Finlay et al., 1992).
Os genes que codificam a lesão A/E estão localizados no cromossomo
em uma ilha de patogenicidade de aproximadamente 35 Kb, denominada de
�locus of enterocyte effacement� (região LEE) (McDaniel et al., 1995). A
região LEE, descrita na amostra protótipo de EPEC E2348/69 (O127:H6),
contém 41 ORFs que estão organizadas em três regiões funcionais: a região
central que codifica proteínas responsáveis pela aderência íntima, uma
segunda região codificadora de proteínas secretadas e uma terceira região,
que codifica os componentes do sistema de secreção tipo III, que são
responsáveis pela translocação das proteínas secretadas para a célula
hospedeira (Elliot et al., 1998).
Estudos realizados com células cultivadas in vitro mostraram que, na
adesão íntima, essas bactérias aderem de forma localizada (AL) à superfície
das células epiteliais. Este padrão está associado à expressão da fímbria
BFP, a qual promove a aderência bactéria-bactéria (Giron et al., 1991).
A fímbria BFP (�bundle forming pilus�) é do tipo IV codificada por um
cluster de 14 genes localizados no plasmídio EAF (Baldini et al., 1983; Giron
et al., 1991; Sohel et al., 1996; Stone et al., 1996). O primeiro gene, bfpA,
codifica a subunidade da adesina, que é expressa como uma pré-proteína,
clivada na forma ativa por uma peptidase codificada pelo gene bfpP (Zhang et
al., 1994). Além do �cluster� bfp, a expressão deste operon é regulada pelo
regulon global per e pelo locus cromossômico dsbA, que codificam uma
enzima periplasmática, que por sua vez, está envolvida na estabilização de
pontes dissulfeto (Zhang & Donnenberg, 1996). Além de promover a adesão
bactéria-bactéria, resultando na formação de microcolônias localizadas nas
células epiteliais (Girón et al., 1991), a fímbria BFP também está envolvida na
dispersão dos agregados bacterianos em meios de cultivo celular, promovida
21
pelo gene bfpF, associada à alterações na estrutura do feixe fibrilar (Bieber et
al., 1998; Knutton et al.,1999).
Além da BFP, Girón et. al. (1993) caracterizaram outras três estruturas
fimbriais na amostra B171 de EPEC O111:H-. A análise da seqüência N-
terminal destas proteínas revelou homologia com as fímbrias F9 e F7 de E.
coli uropatogênica e com a fímbria F1845 de DAEC respectivamente, o papel
que essas fímbrias desempenham na patogênese das EPEC ainda não foi
elucidado.
Recentemente, Keller et al. (2002) demonstraram a presença de uma
adesina da família Dr mediando o padrão difuso de adesão em amostras de
EPEC do sorogrupo O55. A adesina Afa apresenta estruturas fibrilares na
superfície da bactéria.
1.3. Adesinas de EHEC/STEC
Vários estudos demonstraram que a intimina, codificada pelo gene eae
é o fator mediador principal da adesão em EHEC, visto que as amostras de
O157:H7 mutadas no gene eae foram incapazes de aderirem e promoverem
a lesão A/E (Donnenberg et al., 1993; Mckee et al., 1995; Tzipori et al., 1995).
Além da intimina, outras proteínas não codificadas na região LEE
foram propostas como possíveis fatores de aderência. Entre elas, ToxB, (uma
proteína identificada no plasmídio pO157 e envolvida na adesão da amostra
Sakai O157:H7 a células HEp-2) (Tatsuno et al., 2001), Saa, (uma adesina
autoaglutinante identificada em amostras eae-negativas) (Paton et al., 2001),
Sfp (uma fimbria encontrada em amostras de EHEC O157:H7 fermentadoras
de sorbitol) (Brunder et al., 2001), Iha, (uma proteína semelhante a IrgA de
Vibrio cholerae mediando a adesão) (Schmidt et al., 2001; Tarr et al., 2001),
Efa1(fator de aderência de EHEC) identificada em uma amostra de EHEC
O111 (Nicholls et al., 2000) e LPF (�long polar fimbriae�), relacionada
estritamente com a LPF de Salmonella typhimurium (Torres et al., 2002). As
adesinas ToxB, Sfp e Saa são codificadas no plasmídio pEHEC, enquanto
que as adesinas Iha, Efa1 e LPF são codificadas por genes cromossômicos.
22
1.4. Adesinas de ETEC
As amostras de ETEC isoladas de casos de diarréia possuem um
repertório de componentes de superfície antigenicamente distintos
denominados antígenos de fatores de colonização (CFAs) e antígenos de
superfície de E. coli (CS). Esses componentes de superfície facilitam a
colonização dessas amostras no intestino (Gaastra & Graaf, 1982; Levine,
1987), favorecendo o contato das toxinas termo-lábil (LT) e termo-estável
(ST) (Smith &Hall, 1967; Sack et al., 1971). As fímbrias de ETEC são
espécie-específicas, por exemplo: as amostras produtoras de K99 são
patogênicas para porcos, bezerros e carneiros (Cassels & Wolf, 1995),
enquanto as amostras que expressam K88 são capazes de promover diarréia
somente em porcos (Cassels & Wolf, 1995).
A adesina K88 foi descrita pela primeira vez por ∅ rskov et al. (1961)
como uma adesina termo-lábil, cuja expressão é inibida a 18oC. Stirm et al.
(1966, 1967) demonstraram a extração da fímbria K88, quando a cultura
bacteriana era aquecida a 60oC por 20 minutos. Os genes que codificam para
a fímbria K88 estão localizados em plasmídios geralmente não conjugativos
(Shipley et al., 1978). Análise da organização genética demonstrou a
presença de pelo menos seis genes estruturais (faeC-faeH) envolvidos na
biogênese da fímbria K88 (Mooi et al., 1981; Mooi et al., 1982): faeG codifica
a porção aderente da fímbria (Gaastra et al.,1981), faeC codifica a menor
estrutura protéica (Mooi et al., 1984; Oudega et al., 1989), faeD codifica uma
proteína de membrana externa responsável pela translocação das
subunidades fimbriais para a superfície da célula (Mooi et al., 1986) e o gene
faeE codifica uma chaperonina periplasmática (Bakker et al., 1991).
Entre os CFAs e CS, CFA/I (Evans et al., 1975) e CFA/III (Honda et al.,
1984) são fímbrias cilíndricas e uniformes, ao passo que CFA/II e CFA/IV
consiste de distintos CS (Cravioto et al., 1982; Thomas et al., 1985). Assim,
as amostras produtoras de CFA/II expressam CS3 e também podem
expressar CS1 ou CS2 (Cravioto et al., 1982). Da mesma forma, as amostras
produtoras de CFA/IV expressam a fibrila CS6 sozinha ou em combinação
23
com CS4 ou CS5 (Thomas et al., 1985).
A adesina CS31A (�coli-surface-associated antigen�) foi descrita na amostra
de ETEC 31A e geralmente está associada com infecções em bezerros. Esta
adesina apresenta-se como uma estrutura fimbrial bem delgada, com dois nm
de diâmetro e com massa molecular de aproximadamente 30 kDa. A análise
através de �Imuno blot� e do seqüenciamento da porção N-terminal
demonstrou uma relação imunológica e estrutural entre a CS31A e a fímbria
K88. A fímbria CS31A é codificada por genes plasmidiais (Gaastra & de
Graaf, 1982).
Uma outra fímbria, distinta das demais, denominada �Longus� foi
descrita em várias amostras de ETEC humana (Girón et al., 1994). Além
dessa, muitas outras adesinas também foram isoladas em ETEC, porém
estão presentes em menor freqüência (de Graaf & Gaastra, 1994).
1.5. Adesinas de EIEC
Recentemente, um fator hemaglutinante manose-resistente associado
à célula, fator HAF, foi identificado em uma amostra de EIEC do sorotipo
O124:H- (Simi et al., 2002). O fator HAF é provavelmente um potencial fator
de aderência que medeia a aderência in vitro da referida amostra a células
epiteliais, entretanto nenhuma função ou papel na adesão de outras amostras
de EIEC ainda foi relatado.
1.6. Adesinas de EAEC
Os fatores de aderência melhor estudados em EAEC são as adesinas
fimbriais AAFs (�aggregative adherence fimbria�), codificadas em plasmídios
de alto peso molecular conhecidos como plasmídios pAA. Até o momento,
foram descritas três diferentes AAFs: AAF/I, AAF/II e AAF/III. Estas adesinas
são capazes de mediar o fenótipo AA nas amostras protótipos 17-2, 042 e
55989, respectivamente (Nataro et al., 1992; Czeczulin et al., 1997; Bernier et
al., 2002).
24
As adesinas AAFs são morfologicamente e estruturalmente diferentes
entre si, e estão presentes em pequeno número de amostras de EAEC.
1.7. Adesinas de DAEC
Na categoria das DAEC somente duas adesinas associadas ao
fenótipo AD foram descritas até o momento: a adesina fimbrial F1845 a
adesina afimbrial AIDA-I (Bilge et al., 1989; Benz & Schmidt et al., 1989).
A fímbria F1845 foi identificada por Bilge et al. (1989). Os autores
caracterizaram uma região no DNA cromossômico, que codificava uma
adesina fimbrial responsável pelo padrão difuso de adesão (AD) da amostra
C1845 (O75:H-) isolada de uma criança com diarréia. Uma sonda
correspondente a um segmento de 380 pb do gene daaC, que codifica uma
proteína com funções de �usher�, envolvida na biogênese da fimbria F1845
reage com cerca de 65% das amostras de DAEC.
A adesina AIDA-I é uma proteína de membrana externa de 100 kDa e
está associada ao fenótipo AD em uma amostra do sorotipo O126:H27. Os
estudos epidemiológicos realizados por Benz & Schmidt (1989) utilizando
uma sonda específica para AIDA-I sugeriram que este fator é expresso em
uma minoria dos isolados de DAEC.
1.8. EPEC atípica
As EPEC atípicas apresentam como principal característica a presença
da região LEE e ausência do plasmídio EAF. Amostras de EPEC atípicas
podem pertencer ou não aos sorogrupos clássicos de EPEC O26, O55,
O111, O114, O119, O126, O127, O128 e O142.
Os sorotipos não pertencentes aos sorogrupos O de EPEC são menos
conhecidos. Vieira et al. (2001) identificaram 35 sorotipos entre 59 amostras
estudadas, porém um número relativamente grande de antígenos O e H não
puderam ser determinados.
25
Amostras de alguns sorotipos de EPEC atípicas apresentam fatores de
virulência adicionais como a expressão da toxina �enteroaggregative E. coli
heat-stable toxin� (EAST-1) nos sorotipos O128:H2 e O119:H2 (Dias 1998),
enterohemolisinas no sorotipo O111:H9 (Campos et al., 1994) e o padrão de
adesão agregativa a células epiteliais no sorotipo O125:H6 (Valle et al.,
1997).
As EPEC atípicas enquadram-se entre outras amostras de E. coli que
emergiram aparentemente nos últimos anos e já se encontram entre os
principais agentes de diarréia em nosso meio e em outros países (Smith et
al., 1996; Rosa et al., 1998; Scaletsky et al., 1999; Franzolin et al. 2005).
Amostras de EPEC atípicas foram isoladas tanto de crianças com
diarréia como de algumas crianças sem alterações gastrointestinais
(Scaletsky et al., 2002). Com o intuito de caracterizar o potencial de virulência
destas amostras, Dulguer et al. (2003) realizaram uma extensiva análise
genotípica e fenotípica. Essa análise revelou a presença dos genes de
virulência associados a enterohemolisina (E-hly), citotoxina letal distensora
(CDT) e adesina afimbrial (Afa) em pequeno número de amostras. Um sub-
grupo de amostras portadoras da seqüência astA (relacionada à produção da
toxina EAST-1) foi o único que mostrou associação epidemiológica com
diarréia.
Algumas amostras de EPEC atípica apresentam o padrão de adesão
AL, embora não possuam a fímbria BFP. Estudos realizados por vários
pesquisadores relataram a existência de amostras de EPEC EAF-BFP-,
apresentando o padrão AL, porém a caracterização do fator responsável pelo
fenótipo AL dessas amostras não foi investigada (Girón et al., 1993; Knutton
et al., 1991; Scotland et al., 1990).
1.9. EPEC atípica O26:H11
O sorogrupo O26 de EPEC é um dos sorogrupos mais freqüentes
envolvidos na diarréia infantil, sendo um sorogrupo muito comum também em
amostras de EHEC. O sorotipo mais freqüente dentro do sorogrupo O26 tanto
26
em amostras de EPEC quanto em amostras de EHEC é a O26:H11. Os
mecanismos de virulência das amostras pertencentes ao sorotipo O26:H11
variam de acordo com a sua distribuição geográfica. Muitas amostras
O26:H11 isoladas na América do Norte, Europa e Japão são produtoras de
Stx e, portanto classificadas como EHEC (Levine et al., 1987).
No Brasil, com exceção de um caso isolado descrito por Guth et al.,
(2002), amostras de E. coli O26:H11 e O26:H- isoladas de crianças com
diarréia são Stx negativas e não estão associadas com a síndrome urêmica
hemolítica (Silva et al., 1983; Peixoto et al., 2001). Portanto, amostras de E.
coli O26 que apresentam como características: região LEE+, stx- e EAF- são
classificadas como EPEC atípica.
Fisher et al. (1994) identificaram uma amostra de EPEC O26:NM EAF-
BFP- isolada de um bezerro com diarréia que apresentava o padrão AL em
ensaios de 3 horas, mas o fator de aderência também não foi identificado.
Em um estudo realizado por Pelayo et al. (1999), amostras de EPEC
atípica dos sorogrupos O26, O55 e O111 aderiam a células HEp-2 exibindo
variações do padrão AL. Algumas amostras apresentavam o fenótipo AL,
porém, com agrupamentos pequenos e mais frouxos após 6 horas de contato
com as células HEp-2. Para diferenciá-lo do padrão AL expresso após 3
horas e geneticamente diferente, foi dado o nome de padrão de �adesão
localizada-like� (ALL) (Scaletsky et al.,1996). Entretanto, um grupo de
amostras do sorotipo O26:H11 apresentou a formação de microcolônias
compactas compatíveis com o padrão AL em 3 horas de contato com células
HEp-2, porém desprovido do gene bfpA, que codifica a subunidade estrutural
da fímbria BFP (Donnenberg et al., 1992; Sohel et al., 1993).
Com o objetivo de identificar o(s) gene(s) responsáveis pelo padrão AL
de uma dessas amostras, foi construída uma biblioteca genômica da amostra
22 na E. coli DH5α, tendo sido identificado um clone cosmídeo denominado
pV-B-6, aderente a células HEp-2. O clone pV-B-6 exibiu um padrão de
adesão difusa (AD) às células epiteliais, diferente da formação de
microcolônias presentes na adesão AL apresentada pela amostra 22 (Figura
1A e 1B).
27
O cosmídio pV-B-6 foi submetido à mutagênese utilizando um
transposon
mini-Tn10::kan e identificado um mutante não aderente (pV-B-6-Tn) (Figura
1C).
Um fragmento de 2,3 kb EcoRI-HindIII contendo 1 kb do mini-Tn10 foi
clonado e seqüenciado no Center for Vaccine Development, University of
Maryland, EUA. A análise da seqüência identificou um gene, ldaH, que
possuía 73% de identidade com a subunidade fimbrial faeH da de fímbria K88
ETEC (Bakker et al., 1992) (Figura 2).
FIGURA 2. Comparação das seqüências de aminoácidos deduzidas
de LdaH e FaeH. Os aminoácidos idênticos estão representados por (*).
A B
C FIGURA 1. Adesão das
amostras (A) 22; (B) pV-B-6
e (C) pV-B-6-Tn a células
HEp-2 em ensaios de 3
horas de incubação.
28
A análise do seqüenciamento do cosmídio p-V-B-6 identificou uma
região de 15-kb com 15 ORFs e conteúdo G+C igual a 46,8%, apresentando
semelhança com os operons fimbriais fae e clp das ETEC K88 e CS31A,
respectivamente (Mooi et al., 1981; Girardeau et al., 1988). Essa região foi
denominada de �locus for diffuse adherence� (lda).
A região lda é parte de uma ilha genômica de 26 kb inserida no gene
proP no cromossomo de E. coli. O locus lda é constituído por genes
regulatórios (ldaA e ldaB), uma chaperonina periplasmática (ldaE), um usher
(ldaD), um gene estrutural (ldaG) e pelos genes ldaC, ldaF, ldaH e ldaI. A
organização genético do locus lda está apresentada na Figura 3.
FIGURA 3. Organização genética dos loci lda e fae (K88). A
localização e direção dos genes estão indicados pelas setas, e o local de
inserção do mini-Tn10 no mutante pV-B-6-Tn está representado pelo
triângulo invertido.
29
2. OBJETIVOS
Uma vez identificado o gene ldaH envolvido na aderência bacteriana,
que apresenta similaridade genética com o gene faeH da fímbria K88
envolvida na colonização de ETEC, foram estabelecidos os seguintes
objetivos:
- Caracterizar fenotipicamente a adesina responsável pelo padrão difuso da
amostra p-V-B-6, através de ensaios de SDS-PAGE e �Imuno blot�, inibição
de adesão, imunofluorescência e imunomarcação com ouro coloidal.
- Verificar a prevalência do gene ldaH em amostras de EPEC atípica isoladas
de fezes de crianças com diarréia e de controles em diferentes cidades
brasileiras.
- Verificar o papel da fímbria K88 na adesão da EPEC atípica 22, mediante
ensaios de inibição de adesão, imunofluorescência e �Imuno blot�.
- Verificar o papel da adesina LDA na adesão e colonização intestinal de
camundongos C57Bl/6J
30
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Amostras bacterianas e condições de cultivo.
A amostra de EPEC atípica 22, sorotipo O26:H11, foi isolada de um
caso de diarréia infantil, na cidade de São Paulo no ano de 1981 (Pelayo et
al., 1999). Esta amostra apresenta o padrão de adesão AL em ensaios de 3
horas, mas não expressa a fímbria BFP. As características fenotípicas e
genotípicas das demais amostras de E. coli utilizadas neste estudo
encontram-se na Tabela 2.
Para os experimentos de detecção do gene ldaH, que codifica a
subunidade estrutural ldaH da adesina LDA, foram selecionadas 65 amostras
de EPEC atípica, pertencentes a 34 sorotipos diferentes, previamente
isoladas e identificadas em um estudo etiológico da diarréia aguda em
crianças menores de dois anos em diferentes cidades brasileiras. Essas
amostras foram isoladas de 438 crianças com diarréia aguda e 422 controles
pareados por idade (Scaletsky et al., 2002a e 2002b). Todas as 65 amostras
reagiram com a sonda genética eaeA e eram desprovidas das seqüências
genéticas das sondas EAF e bfpA, sendo então caracterizadas como EPEC
atípicas (Tabela 3).
Também foram analisadas outras 13 amostras de EPEC atípica,
gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Luiz R. Trabulsi. A Tabela 4 apresenta o
sorotipo, origem e genótipo dessas amostras.
As amostras bacterianas foram cultivadas rotineiramente em caldo LB
(item 8.1.1) a 37oC com aeração e estocadas a �70oC em caldo LB contendo
15% de glicerol. Para os testes de adesão as bactérias foram crescidas em
caldo LB sem aeração. Quando necessário, foi adicionado ao meio de cultura
os antibióticos nas seguintes concentrações: canamicina (Km) 30 µg/mL,
ampicilina (Ap) 100 µg/mL e estreptomicina (Sm) 100 µg/mL. As amostras
com resistência à estreptomicina foram obtidas através de mutação por
seleção natural.
31
3.2. Extração de DNA
3.2.1. Extração do DNA plasmidial em larga escala (�maxi-prep�)
O kit �Qiagen � Plasmid Midi Kit� (Qiagen Inc., Califórnia, EUA) foi
empregado para extração de DNA em larga escala, segundo recomendações
do fabricante. A amostra pLDAH foi cultivada em 500 mL de caldo LB (item
8.1.1) contendo os antibióticos apropriados. Em seguida, a cultura foi
centrifugada a 3.000 X g por 15 minutos em centrífuga Sorvall RC2B sob
refrigeração a 4oC. A cultura assim obtida foi utilizada no experimento de
extração de DNA plasmidial, utilizando a coluna �Qiagen-tip 500�. O DNA
plasmidial obtido foi ressuspenso em 400 µL de tampão TE (item 8.2.8).
3.2.2. Extração de DNA plasmidial em pequena escala (�mini-
prep�)
A extração de DNA plasmidial em pequena escala foi realizada pelo
método de Birnboim & Doly (1979).
As amostras bacterianas foram cultivadas em 3 mL de caldo LB (item
8.1.1) sob agitação constante por 16 a 18 horas. Em seguida, 1 mL da cultura
foi transferido para tubos de polipropileno e centrifugado por 2 minutos em
microcentrífuga a 11.600 X g. Após centrifugação, os sobrenadantes foram
desprezados e as células foram ressuspensas em 100 µL de solução I (item
8.2.3). Em seguida, foram adicionados 200 µL de solução II (item 8.2.4) e a
suspensão foi homogeneizada invertendo-a lentamente e incubada em banho
de gelo por 5 minutos. A seguir, foram adicionados 150 µL de solução III
(item 8.2.5) e a mistura foi novamente incubada em banho de gelo por 1 hora.
Após a incubação, os tubos foram centrifugados a 11.600 X g por 10 minutos,
o sobrenadante foi coletado e o DNA precipitado em 1 mL de etanol e
incubado a 20oC por 1 hora. A mistura foi centrifugada por 10 minutos e o
32
DNA foi ressuspenso em 100 µL da solução IV (item 8.2.6) e precipitado em 2
volumes de etanol gelado. Os tubos foram homogeneizados lentamente e
mantidos a �20oC por 1 hora. Após a centrifugação, os tubos foram secos à
temperatura ambiente e o DNA ressuspenso em 20 µL de tampão TE (item
8.2.8) contendo RNAase (Sigma) em concentração final de 20 µg/mL e
incubadas a 37oC por 30 minutos.
3.2.3. Extração de DNA cromossômico
Para a extração de DNA cromossômico foi utilizado o kit �Easy DNA�
(Invitrogen), segundo as recomendações do fabricante.
As amostras foram cultivadas em 2 mL de caldo LB (item 8.1.1) sob
agitação por 16 a 18 horas. Em seguida, os cultivos foram transferidos para
tubos de polipropileno e centrifugados em microcentrífuga por 2 minutos a
11.600 X g. Os sedimentos obtidos foram empregados para extração de DNA
cromossômico através do kit.
Os sedimentos de DNA cromossômico foram ressuspensos em
tampão TE (item 8.2.8) contendo 20 µg/mL de RNAse e incubadas a 37oC
por 30 minutos.
3.2.4. Determinação da concentração de DNA
Após a extração, o DNA em solução teve sua concentração e pureza
estimada, segundo técnica descrita por Sambrook et al. (1989). As soluções
foram diluídas a 1:60 em água e as densidades ópticas foram determinadas
em espectrofotômetro �Spectronic 20� (Bausch & Lomb, Nova Iorque, EUA)
nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm. As leituras em 260 nm foram
empregadas no cálculo da concentração de DNA em ng/µL ou µg/µL.
A relação entre as leituras de 260 nm e 280 nm indicou a pureza da
extração, quando os valores se encontravam entre 1,8 e 2.
33
3.2.5. Eletroforese de DNA em gel de agarose
Os géis de agarose foram preparados dissolvendo-se a agarose
(Invitrogen, Life Tecnologies Inc, Gaithenesburg MD, EUA) por aquecimento
em tampão TEB 0,5X (item 8.3.1) nas concentrações finais de 0,7 e 1,5%.
A corrida eletroforética foi realizada sob voltagem máxima e constante
de 100 Volts em tampão TEB 0,5X (item 8.3.1). Após a corrida, o gel foi
corado em solução de brometo de etídio (5 mg/mL) por 10 a 15 minutos e
observado em um transiluminador de luz ultravioleta (Fotodyne), para análise
visual.
3.3. Teste de hibridização de DNA bacteriano com sonda genética
3.3.1. Transferência de DNA de células bacterianas para filtros de papel Whatman � �Colony blot�.
Os testes de hibridização com sondas genéticas foram feitos conforme
descrito por Grunstein & Hogness (1975).
As amostras bacterianas a serem testadas foram semeadas
inicialmente em meio LB (item 8.1.1) e incubadas a 37oC durante 16 a 18
horas. Posteriormente, as amostras bacterianas foram semeadas em placas
de ágar MacConkey e incubadas a 37oC durante 16 a 18 horas. As colônias
foram então carimbadas em papel de filtro Whattman 541 e incubadas
durante 1 hora a 37oC, posteriormente o papel de filtro foi retirado e mantido
em temperatura ambiente por no mínimo 30 minutos para secar. Os filtros
assim obtidos foram tratados com uma solução desnaturante (item 8.4.1),
expostos a vapores de água fervente durante 3 minutos e novamente
tratados com solução desnaturante (item 8.4.1), por 1 minuto, à temperatura
ambiente. Após esse período, os filtros foram imersos em solução
neutralizante (item 8.4.2) durante 4 minutos, colocados para secar a 65oC,
guardados a temperatura ambiente até o momento do uso. Foram utilizados
34
como controles E. coli 22 (controle positivo) e E. coli DH5α (controle
negativo).
3.3.2. Transferência de DNA de gel de agarose para membrana de
nylon � �Southern blot�
Após a realização da eletroforese, o DNA contido no gel de agarose foi
desnaturado em solução desnaturante (item 8.4.1) durante 15 minutos sob
agitação lenta e, em seguida, tratado com solução neutralizante (item 8.4.2)
por 15 minutos sob agitação. Realizou-se, então, a transferência do DNA por
capilaridade, utilizando SSC 6X (item 8.4.3) para membrana de Nylon
Hybond-N (Amersham Life Science) por no mínimo 16 horas à temperatura
ambiente. Após este período, o sistema foi desmontado e a membrana foi
colocada em uma solução de SSC 2X durante 20 minutos sob agitação e
mantida àtemperatura ambiente para secar.
3.3.3. Preparo de fragmento sonda
Cerca de 1 µg do DNA plasmidial da amostra pLDAH foi digerido com
as enzimas de restrição EcoRI e HindIII de acordo com as recomendações do
fabricante. Após a digestão enzimática, a preparação de DNA foi submetida à
eletroforese em gel de agarose e a banda correspondente ao fragmento de
2,3 kb foi eluída do gel empregando o kit �GeneClean II Kit� (Bio 101,
Califórnia,EUA), segundo recomendações do fabricante.
3.3.4. Marcação radioativa de fragmento sonda
O fragmento sonda foi marcado utilizando o kit �Ready To Go � DNA
Labelling Beads (dCTP)� (Amersham Pharmacia Biotech Inc, EUA), segundo
35
as recomendações do fabricante, utilizando 5 µL de [α-32P]dCTP (Amersham,
EUA), com atividade específica de 3.000 Ci/mmol.
3.3.5. Hibridização dos filtros e membranas
Os filtros e as membranas foram inicialmente imersos em solução de
SSC 2X (item 8.4.3) e posteriormente pré-hibridizados durante 1 hora a 65oC,
em solução de hibridização (item 8.4.6) acrescida de 100 µg/mL de DNA
desnaturado de esperma de salmão sob agitação lenta. Em seguida, os filtros
foram transferidos para sacos plásticos contendo nova solução de
hibridização acrescida, de aproximadamente 105 cpm/mL da sonda
radioativa, previamente desnaturada a 100oC por 5 minutos. Os sacos de
hibridização foram selados e incubados por 18 horas a 65oC sob agitação
lenta. Posteriormente, a solução de hibridização contendo a sonda radioativa
foi retirada, e os filtros e as membranas transferidos para recipientes
adequados onde foram lavados por 2 vezes durante 15 minutos a 65oC, sob
agitação lenta, em solução de lavagem 0,1% (item 8.4.7) e uma vez em
solução de lavagem 0,05% (item 8.4.8). Após esse período, os filtros foram
secos à temperatura ambiente e expostos a filmes de raios-X Kodak �X-
Omar-R� (Eastman Kodak), contendo tela intensificadora, por no mínimo 24
horas a -70oC. Em seguida, o filme foi revelado em revelador automático de
filmes raios-X em câmera escura.
3.4. Reação de polimerização em cadeia (PCR)
As reações de PCR foram realizadas segundo Sambrook et al. (1989)
utilizando a enzima Taq DNA polimerase, tampão de reação e a solução de
cloreto de magnésio, todos da marca Invitrogen conforme instruções do
fabricante.
As reações de PCR foram realizadas em banho de gelo, utilizando
36
tubos de polipropileno de 0,2 mL (Eppendoff, Hamburgo, Alemanha), onde
foram colocados o DNA molde, obtido através de fervura de duas a três
colônias bacterianas em 50 µL de água destilada esterilizada durante 5
minutos e os reagentes nas seguintes concentrações: 1X tampão de reação,
50 pmoles de cada �primer�, 200 mM de cada desoxinucleotídeo trifosfasto
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1U da enzima Taq DNA polimerase, 1,5 mM de
MgCl2 (50 mM) e 5 µL do DNA bacteriano, sendo o volume completado com
25 µL de água destilada estéril.
Os �primers� foram empregados na reação de PCR foram sintetizados
a partir da seqüência de DNA que codifica para o gene ldaG, subunidade
estrutural principal da adesina, descrita por Scaletsky et al. 2005. As
seqüências desses �primers� estão apresentadas abaixo:
K3094 � 5� AAAGATCTGTGATGAGGTTCAGGTGA 3�
K3095 � 5� AAATCTAGATGCAGACGCAACTACAG 3�
Os tubos Eppendof contendo as preparações foram colocados em
um termociclador (modelo 2400, Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT), sendo
que a reação de PCR foi submetida a 30 ciclos, 60 segundos a 94°C de
desnaturação, 90 segundos a 62°C de anelamento e 60 segundos a 72°C de
extensão. Após amplificação, os produtos foram analisados através de
eletroforese em gel de agarose 1,5%, comparando-se ao padrão de peso
molecular �1 Kb DNA ladder� (Invitrogen). Foram utilizados como controle
positivo as amostras 22 e pV-B-6 e como controle negativo a E. coli DH5α.
3.5. Teste de adesão
O teste de adesão a células HEp-2 foi realizado segundo a técnica
descrita por Scaletsky et al. (1984), utilizando-se monocamadas de células
HEp-2, originadas de adeno carcinoma de laringe.
37
3.5.1. Cultivo das células HEp-2
O cultivo das células HEp-2 foi realizado em garrafas apropriadas,
contendo 7 mL de meio DMEM (item 8.5.2) suplementado com 10% de soro
fetal (Cultilab, Brasil) (DMEM-SFB 10%) e , mantidas em estufa a 37oC, sob
atmosfera de 5% de CO2 por 3 a 4 dias. Após este período, o meio de cultivo
foi removido e a monocamada celular lavada em 4,5 mL de solução ATV
(item 8.5.3). A solução foi desprezada e, em seguida, foram adicionados 0,5
mL de ATV de modo que ficasse em contato com as células durante 1 a 2
minutos à temperatura ambiente, para provocar o descolamento celular. Em
seguida, foram adicionados 5 mL de DMEM-SFB 10% e volume de 1 mL foi
transferido para cada orifício de placas de 24 orifícios (Costar, Cambridge,
MA, EUA), contendo lamínulas de vidro. A placa foi incubada a 37oC sob
atmosfera de 5% de CO2 por 48 horas.
3.5.2. Realização do teste de adesão
Inicialmente, o meio de cultivo foi retirado dos orifícios da placa e as
células foram lavadas por 5 vezes com PBS (item 8.5.1) estéril. Em seguida,
adicionou-se 1 mL de DMEM-SFB 2% contendo 1% de D-manose (item
8.5.5), para inibir a adesão bacteriana devido à fímbria do tipo I (OLD, 1972).
Uma alíquota de 40 µL do crescimento bacteriano cultivado em TSB a 37oC
durante 16 horas foi inoculada sobre a monocamada celular e incubada em
estufa a 37oC por 3 horas. Após este período, o meio de cultivo foi removido
e as células foram lavadas 6 vezes com PBS (item 8.5.1) fixadas com
metanol P.A. por 30 minutos e coradas por 10 minutos com solução de May-
Grünwald (item 8.5.7) diluído 1:2 (v/v) em tampão de S∅ rensen (item 8.5.6),
num volume suficiente para cobrir toda a camada celular. Em seguida, a
solução de May-Grünwald foi retirada e substituída pelo corante Giemsa (item
8.5.8) diluído 1:3 (v/v) em tampão de S∅ rensen durante 20 minutos. Após
este período, as lamínulas foram lavadas em água corrente, retiradas dos
38
orifícios e montadas sobre lâminas de vidro.
3.6. Testes de inibição da adesão
O teste de inibição da adesão à célula HEp-2 com soro foi realizado
segundo a metodologia descrita por Barros et al. (1992). Cerca de 200 µL dos
soros a serem testados (nas diluições 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 e 1:100) e 50 µL
da suspensão bacteriana foram incubados em banho-maria a 37oC durante 2
horas e testados quanto à adesão as célula HEp-2 conforme descrito no item
3.5.2.
Para o teste de inibição da adesão utilizamos os carboidratos D-
galactose, N-acetilgalactosamina, L-fucose, N-acetilglucosamina, D-glucose,
lactose, rafinose e ramnose. Os açúcares foram adicionados individualmente
na concentração de 0,1 M ao meio de DMEM, imediatamente antes do início
do teste de adesão.
3.6.1. Leitura do teste de inibição da adesão
As lamínulas foram observadas ao microscópio óptico (Carl Zeiss-
Alemanha) com aumento de 400 X e 1.000 X. A leitura foi realizada contando-
se um total de 300 células que apresentavam bactérias aderidas ou não. A
determinação da porcentagem de inibição da adesão foi efetuada, utilizando-
se a seguinte fórmula:
Inibição (%) = nû de células não aderidas X 100
nû total de células
39
3.7. Ensaios de imunofluorescência
Após o teste de adesão, as células foram fixadas com formaldeido a
3,5% durante 1 hora, e as lamínulas lavadas 3 vezes com PBS (item 8.5.1) e
incubadas por 15 minutos com cloreto de amônia 50 mM diluído em PBS para
retirar o excesso do formaldeído. Em seguida, as lamínulas foram tratadas
com PBS contendo 0,2% de soro albumina bovina (BSA) (Sigma) para evitar
ligações não específicas durante as subseqüentes incubações e incubadas
com o anticorpo a ser testado diluído em PBS, durante 1 hora à temperatura
ambiente e posteriormente lavadas por 3 vezes em PBS. A seguir, as
lamínulas foram então incubadas com anti-IgG de coelho produzido em cabra
e conjugado com fluoresceína (Sigma-Aldrich Chemical, Missouri, EUA)
diluído em PBS conforme títulos previamente estabelecidos, durante 1 hora, à
temperatura ambiente. Após esse período, as lamínulas foram lavadas por
mais 3 vezes em PBS e montadas em lâminas de vidro com PBS-glicerol
(Sigma). As amostras foram, então, examinadas em microscópio de
fluorescência (Olympus BX60).
3.8. Análise de proteínas
3.8.1. Extração de estruturas fimbriais parcialmente purificadas
As amostras foram semeadas em placas contendo ágar MacConkey e
incubadas a 37oC durante 18 horas. A seguir, o cultivo bacteriano foi retirado
das placas adicionando-se 1 mL de PBS (item 8.3.1) e transferido para tubos
Eppendorf®. As amostras bacterianas foram aliquotadas em porções de 4,0
X 108 UFC/mL, para a extração de proteínas totais e 4,0 X 109 UFC/mL para
a extração de estruturas fimbriais parcialmente purificadas proteínas
aquecidas. No preparo dos extratos brutos, as células bacterianas foram
centrifugadas a 12.000 x g por 5 minutos à temperatura ambiente, o
sedimento foi lavado com 1 mL de PBS, centrifugado novamente nas
mesmas condições, ressuspenso em 200 µL do tampão de amostra (item
40
8.6.2), sendo as células bacterianas lisadas a 100oC por 5 minutos. Os restos
celulares foram removidos por centrifugação, sendo o sobrenadante removido
para novo tubo Eppendorf® e armazenado a �20oC. Para extração de
estruturas fimbriais parcialmente purificadas, as células bacterianas foram
centrifugadas a 3.000 X g por 10 minutos, e o sedimento foi ressuspenso em
160 µL de PBS e incubado em banho-maria a 65oC por 30 minutos. Após
nova centrifugação, o sobrenadante foi transferido para novo tubo
Eppendorf® e foram adicionados 40 µL de tampão de amostra. As proteínas
foram aquecidas a 100oC por 5 minutos e posteriormente analisadas através
de eletroforese em gel de poliacrilamida em condições redutoras (SDS-
PAGE).
Após eletroforese em gel de SDS-PAGE, a proteína de interesse foi
eletroeluída em Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad). O material foi dializado em
água bidestilada por 48 horas a 4oC e a proteína quantificada. A dosagem de
proteínas na preparação foi realizada segundo o método de Bradford
(Micrométodo � colorimétrico) (Sambrook et al., 1989).
3.8.2. Extração da fímbria K88
A extração da fímbria K88 foi realizada segundo a técnica descrita por
Jacobs & de Graaf (1985). Para tanto, as amostras foram cultivadas em 400
mL de meio TSB até atingir a fase exponencial de crescimento (absorbância
de 0,5-1,0) em espectrofotômetro �Spectronic 20� (Bausch & Lomb, Nova
Iorque, EUA) no comprimento de onda de 620 nm. As amostras foram
centrifugadas a 3.000 X g por 15 minutos em centrífuga Sorvall RC2B sob
refrigeração a 4oC, e os sedimentos ressuspensos em 20 mL de PBS (item
8.5.1). As amostras foram aquecidas a 65oC por 30 minutos e submetidas à
agitação máxima em �vortex�, durante 15 minutos e centrifugadas a 3.000 X g
durante 15 minutos para remover os restos celulares. O sobrenadante foi
coletado, sendo então adicionados os inibidores de protease PMSF 1mg/mL
(Sigma), aprotinina 0,05 mg/mL (Sigma) e EDTA 0,5M. A seguir, o material foi
41
precipitado com sulfato de amônia (60% de saturação) durante 18 horas a
4oC. Após precipitação, o material foi centrifugado a 230.000 X g por 4 horas
em ultracentrífuga (Beckman, rotor 60Ti). O sedimento foi ressuspenso em 2
mL de PBS e dializado contra água destilada durante 48 horas a 4oC.
3.8.3. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A eletroforese de proteínas foi realizada conforme descrita por
Laemmli et al. (1970) em um gel composto de géis de resolução 12% (item
8.6.4) e de empacotamento 5% (item 8.6.3). A eletroforese foi conduzida em
tampão de eletroforese (item 8.6.5) sob uma corrente de 25 mAmp durante
aproximadamente 4 horas. Após eletroforese, os polipeptídios foram
visualizados pela coloração do gel em solução de Coomassie Blue (item
8.6.6) durante 1 hora, seguida da descoloração com uma solução descorante
(item 8.6.7).
3.8.4. �Imuno Blot�
Os experimentos de �Imuno blot� foram realizados segundo Sambrook
et al. (1989). Após eletroforese, foi colocado sobre o gel uma membrana de
nitrocelulose (Millipore) e montado um sistema de transferência durante 18
horas sob uma corrente de 14 mAmp. Para certificar-se da eficácia da
transferência, a membrana foi colocada em um recipiente com o corante
reversível Ponceau S (item 8.7.3). A membrana foi extensivamente lavada
com água destilada sob agitação. Após a retirada do corante, adicionou-se
solução bloqueadora (item 8.7.2) por 2 horas à temperatura ambiente sob
agitação lenta. A seguir, adicionou-se o anticorpo primário a ser testado
diluído em tampão Tris (item 8.7.1), e incubou-se por 1 hora a temperatura
ambiente sob agitação lenta. A membrana foi lavada em tampão Tris por 6
vezes de 10 minutos cada e colocada em presença do anticorpo secundário
42
(anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase) (Sigma) na diluição de
1:10.000 durante 1 hora a temperatura ambiente sob agitação lenta. A
membrana foi lavada por mais 6 vezes de 10 minutos cada com tampão Tris
e revelada com quimiluminescência, utilizando o kit ECL (Amersham).
3.9. Seqüenciamento da região amino-terminal
Após eletroforese em SDS-PAGE, a proteína de interesse foi
transferida para membrana de �polyvinylidene difluoride� (PVDF- Millipore) e
visualizada mediante a coloração com 0,1% de �napthalen black�em 50% de
ácido acético, segundo recomendações do fabricante. A seguir, a banda
correspondente a 25 kDa foi cortada da membrana, e a proteína
correspondente foi enviada para o seqüenciamento no Instituto Nacional de
Farmacologia (INFAR) - UNIFESP . A seqüência amino-terminal da proteína
foi alinhada com seqüências previamente conhecidas, presentes no
GenBank, utilizando o programa BLAST.
3.10. Preparo de soro policlonal
A produção de anti-soro foi realizado conforme metodologia descrita
por Girón et al. (1991) utilizando um coelho da raça New Zealand pesando
aproximadamente 2.0 Kg. Para obtenção do soro contra a adesina LdaG
expressa pelo clone pV-B-6 (anti-soro LdaG), obtida no item 3.8.1. e
eletroeluída em Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad), inoculou-se através de
injeções subcutâneas 100 µg de proteína (obtida no item 3.8.1) com
adjuvante completo de Freund (Sigma). Após 3 semanas foi aplicado à
mesma quantidade de proteína com adjuvante incompleto de Freund (Sigma).
No fim de 10 dias o sangue foi coletado e o soro obtido foi filtrado e
armazenado a �20oC.
43
3.11. Microscopia eletrônica de transmissão
Os ensaios para microscopia eletrônica foram realizados segundo
Knutton (1995). As preparações foram examinadas no microscópio de
transmissão eletrônica JEOL JEM 1200 EX II do Department of Pathology,
School of Dentistry, University of Maryland, EUA, operando a 80 kV.
3.11.1. Coloração negativa
As amostras bacterianas foram semeadas em ágar MacConkey
durante 18 horas a 37oC. Após incubação, o crescimento bacteriano foi
removido da placa através de lavagens com PBS (item 8.8.1). Alíquotas de
40 µL da suspensão bacteriana foram transferidos para tubos Eppendof e
centrifugados em microcentrífuga por 3 minutos a 11.600 X g. A seguir, o
sedimento foi centrifugado novamente e ressuspenso em 50 mL de PBS. Em
seguida, 10 µL da suspensão celular foram transferidos para outro tubo
Eppendof contendo uma solução de bacitracina (50 µg/mL) juntamente
com 10 µL de molibdato de amônio (item 8.8.2). Após suave
homogeneização, 10 µL desta solução foram aplicados em grades revestidas
de carbono. Após 5 minutos, o excesso de líquido foi removido com o auxílio
de papel de filtro e as grades secas à temperatura ambiente.
3.11.2. Imunomarcação com ouro coloidal
Para a imunomarcação, as amostras bacterianas foram cultivadas e
ressuspensas em PBS como citado no item anterior. Após lavagem das
amostras, 10 µL do crescimento bacteriano em PBS foram aplicados nas
grades revestidas de carbono, e mantidos por 5 minutos. A seguir, o excesso
do líquido foi removido com papel de filtro e as grades foram colocadas com a
face voltada para gotas do anti-soro LdaG diluído 1:100 por 30 minutos. Após
lavagens em passagens sucessivas em gotas de PBS, as grades foram
colocadas em gotas de soro anti-IgG de coelho produzido em cabra e
44
conjugado com partículas de ouro de 10 nm (Electron Microscopy Sciences)
diluído 1:20 durante 30 minutos.
3.12. Experimentos de colonização
3.12.1. Animais utilizados
Foram utilizados camundongos da linhagem C57Bl/6J, machos com
aproximadamente 6 a 8 semanas. Os animais foram mantidos em jejum por
24 horas antes do experimento.Foram constituídos 2 grupos experimentais:
grupo 1- animais não tratados com estreptomicina e o grupo 2- animais pré-
tratados com estreptomicina (5 g/L) 48 horas antes da inoculação com as
amostras a serem testadas. Os experimentos foram realizados em duplicata,
sendo que cada experimento era composto por quatro camundongos.
3.12.2. Preparo das amostras bacterianas
As amostras 22, LDA1, ORN103 (pIJ20) e ORN103 foram submetidas
à mutação por seleção natural para resistência à estreptomicina. As amostras
foram semeadas inicialmente em caldo LB (item 8.1.1) contendo
estreptomicina em concentração inicial de 10 µg/mL, com aeração. Após 18
horas a 37°C, as culturas bacterianas foram semeadas novamente em novo
caldo LB contendo concentrações crescentes de estreptomicina até se obter
culturas resistentes a uma concentração final de estreptomicina de 100
µg/mL. As amostras resistentes à estreptomicina (100 µg/mL) foram
estocadas a �70oC.
45
3.12.3. Inoculação intragástrica
As amostras a serem testadas foram cultivadas em 200 mL de meio LB
(item 8.1.1) contendo estreptomicina (100 µg/mL) e, quando necessário foi
acrescentado ao meio ampicilina (100 µg/mL), e incubadas a 37°C durante 18
horas sob agitação. A seguir, a cultura foi centrifugada por 20 minutos a
5.000 X g e o sedimento ressuspenso em 10 mL de PBS estéril (pH 7,4). A
concentração bacteriana foi determinada pelo método de contagem de placas
viáveis, sendo a concentração final a ser utilizada ajustada para 108, 109, 1010
e 1011UFC/mL. As amostras a serem testadas foram inoculadas
intragastricamente com o auxílio de uma agulha para gavagem nos
camundongos previamente anestesiados por inalação com éter etílico.
3.12.4. Número de bactérias detectadas nas fezes e nos
segmentos intestinais (íleo, cólon e ceco)
As amostras de fezes dos camundongos foram coletadas nos 4
primeiros dias consecutivos após a inoculação bacteriana. As fezes foram
ressuspensas em PBS (10 mL/g de fezes) e feitas diluições seriadas em
PBS. Cerca de 100 µL de cada diluição foi semeada em ágar MacConkey
contendo o antibiótico estreptomicina e, quando necessário, foi acrescentado
ao meio ampicilina. As placas foram incubadas a 37oC durante 18 horas e, a
concentração de bactérias inoculadas presentes nas fezes nos dias
estipulados foi posteriormente determinada.
Para analisarmos se houve colonização das amostras estudadas no
trato intestinal, segmentos referentes ao íleo terminal, colón e ceco foram
retirados de cada animal no quarto dia após infecção. Os segmentos foram
individualmente abertos e lavados suavemente com PBS, posteriormente
macerados com auxílio de um cadinho com pistilo e homogeneizados em
PBS. Foram feitas diluições seriadas do macerado, que posteriormente,
foram semeadas em ágar MacConkey contendo os antibióticos.
46
TABELA 2. Características e origem das amostras de E. coli _________________________________________________________________ Amostra Características relevantes Referência ou origem
________________________________________________________________________
22 O26:H11, bfp-, AL Pelayo et al., 1999
DH5α [supE44∆lacU169 (φ80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 Sambrook et al., 1989
endA1 gyrA96 thi-1 relA1] (Nal)
pV-B-6 Fragmento de 15 kb da amostra 22 clonado em Scaletsky et al. 2005
pHC79, lda+, AD, Ap
pV-B-6::Tn10 pV-B-6 mutante com inserção de Tn10 em ldaH, Scaletsky et al. 2005
não aderente, Ap, Km
LDA1 22 mutante com inserção não polar em ldaG Scaletsky et al. 2005
ORN103 P678-54 ∆(argF-lac)U169, Pil- Orndorff et al., 1985
ORN103(pIJ20) ORN103 transformada com o pV-B-6, AD, Ap Scaletsky et al. 2005
ETEC 4021 O157:H43, LT, ST, K88+, F41+ Cornick et. al., 2000
pLDAH fragmento EcoRI-HindIII de 2,3 kb do pV-B-6, Scaletsky et al. 2005
subclonado no sítio correspondente de pUC18 (Ap)
________________________________________________________________________
Ap, resistência a ampicilina; Km, canamicina; Nal, ácido nalidíxico; AL, adesão
localizada; AD, adesão difusa; Pil, pili tipo I.
47
TABELA 3. Distribuição dos sorotipos das 65 amostras isoladas de casos e
controles.
______________________________________________________________ Sorotipo No de amostras Casos Controles Total ______________________________________________________________ O26:H- 3 1 4
O33:H6 0 1 1
O35:H19 0 1 1
O55:H- 0 1 1
O85:H40 1 0 1
O101:H- 1 0 1
O103:H- 0 2 2
O105:H7 0 1 1
O108:H31 0 1 1
O109:H54 0 1 1
O111:H- 1 2 3
O114:H- 0 1 1
O119:H2 3 1 4
O126:H- 1 0 1
O127:H- 0 1 1
O127:H40 2 0 2
O128:H- 1 0 1
O141:HNT 0 1 1
O142:H- 1 0 1
O142:H2 2 0 2
O156:H16 1 0 1
O157:H- 0 2 2
ONT:H18 1 0 1
ONT:H-, HNT 20 10 30
______________________________________________________________
ONT, O não tipável; HNT; H não tipável
48
TABELA 4. Sorotipo, origem e genes de virulência das 13 amostras de EPEC
atípica pertencentes à bacterioteca do Prof. Dr. Luiz R. Trabulsi.
______________________________________________________________
Amostra Sorotipo Origem Genes de virulência
______________________________________________________________
2262-79 O26:H- EUA eaeA
C240-52 O26:H- Suíça eaeA
C814-67 O26:H11 Dinamarca eaeA
3323-61 O26:H11 EUA eaeA
15 O26:H11 Brasil eaeA, E-hly
20 O26:H11 Brasil eaeA, E-hly
47 O26:H11 Brasil eaeA, E-hly
660-79 O55:H- EUA eaeA
5624-50 O55:H7 EUA eaeA
C586-65 O55:H7 Sri-Lanka eaeA
316 O55:H7 Brasil eaeA
340 O55:H7 Brasil eaeA
25 O111:H- Brasil eaeA
______________________________________________________________
eaeA, E. coli attaching-effacing; E-hly, hemolisina de EHEC
49
4. RESULTADOS 4.1. Ensaios preliminares para a caracterização da adesina LDA
Os ensaios para a caracterização da adesina foram realizados com a
amostra 22, contra a qual havíamos preparado um anti-soro policlonal. Este
soro produzido em coelho foi absorvido com uma amostra de EPEC atípica
O26:H11 não aderente.
Primeiramente, procurou-se verificar a influência da temperatura na
expressão da adesão da amostra selvagem E. coli 22 e do clone cosmídeo
pV-B-6. O cultivo das bactérias, por 18 h, a temperatura de 37oC mostrou que
nessa temperatura ambas as amostras expressaram seu padrão de adesão
característico. O mesmo não ocorreu quando a bactéria foi cultivada a 30oC e
a 25oC. A 30oC ocorreu drástica redução no padrão de adesão, e a 25oC não
ocorreu adesão. Diante desses resultados, concluiu-se que a expressão do
padrão AD da amostra pV-B-6 foi melhor expresso a 37oC (Figura 4).
A seguir, foram analisados os extratos brutos de proteínas e de
estruturas fimbriais parcialmente purificadas das amostras 22 e pV-B-6, e do
mutante pV-B-6-Tn cultivados em diferentes meios de cultura (ágar LB,
MacConkey, Brucella, BAB, TSA acrescido de 5% de sangue de carneiro,
caldo LB e DMEM) por 18 horas a 37oC. A análise dos extratos parcialmente
purificados em gel de SDS-PAGE revelou a presença de uma proteína de 25
kDa presente nos extratos aquecidos da amostra selvagem 22 e do clone pV-
B-6 cultivadas somente em ágar MacConkey. Essa proteína não foi
observada no mutante pV-B-6-Tn cultivado nas mesmas condições. Quando
esses extratos foram analisados em �Imuno blot� utilizando o anti-soro 22
absorvido, verificou-se uma forte reação desse soro com a proteína de 25
kDa (Figura 5).
Os dados obtidos com o gel de SDS-PAGE e �Imuno blot� indicavam
que a proteína de 25 kDa possivelmente estaria envolvida no processo de
adesão, pois a mesma estava sendo expressa na amostra selvagem e no
clone, mas não no mutante não aderente.
50
Com o intuito de confirmar esses resultados, testes de inibição de
adesão da amostra pV-B-6 foram realizados com o mesmo anti-soro
absorvido e não absorvido. Os resultados mostraram que o soro anti-22
reconheceu os epítopos da adesina responsável pelo fenótipo AD, visto que
foi capaz de inibir 70% a adesão do clone pV-B-6. Em relação a amostra 22,
houve uma inibição de 90% (Figura 6).
4.2. Purificação da adesina LDA
Após o cultivo da amostra pV-B-6 a 37oC em ágar MacConkey, por 18
horas, as proteínas foram extraídas e purificadas, conforme descrito no item
3.8.1.
Após eletroforese em gel de SDS-PAGE, a proteína de 25 kDa foi
transferida para membrana de PVDF para seqüenciamento da região N-
terminal. A seqüência de aminoácidos SDWTDNQPAGDI corresponde à
forma madura da proteína LdaG, subunidade estrutural principal da adesina
LDA, apresentando 56% de similaridade com a fímbria F41 (GenBank no.
I41116), 27% com a subunidade estrutural FaeG da fímbria K88 e 23% com a
subunidade estrutural ClpG da fímbria CS31A (GenBank no. I413118 e
A41663 respectivamente). A Figura 7 apresenta o alinhamento das
seqüências, na qual os aminoácidos similares estão representados por (*).
Este dado mostrou que o componente mediador do fenótipo AD na
amostra pV-B-6 era a proteína de 25 kDa, a qual passamos a denominar de
adesina LDA.
4.3. Caracterização fenotípica da adesina LDA
Para confirmar o papel eventual da proteína de 25 kDa na adesão
difusa, anticorpos purificados específicos para esta proteína foram utilizados
em testes de inibição de adesão, imunofluorescência e imunomarcação com
51
ouro coloidal.
A especificidade do soro anti-LdaG foi feita utilizando-se a reação de
�Imuno blot�. Os ensaios realizados com as amostras 22, pV-B-6 e com o
mutante V-B-6::Tn10 utilizando o anti-soro LdaG estão apresentados na
Figura 8. Apenas a proteína de 25 kDa foi reconhecida pelo soro imune,
apresentando uma reação fortemente positiva com a amostra selvagem e
com o clone. Nenhuma reação do soro anti-LdaG foi observada no mutante,
demonstrando assim a especificidade desse soro .
4.3.1. Ensaios de inibição da adesão com o anti-soro LdaG
Os ensaios de adesão realizados com as amostras 22 e pV-B-6
revelaram que o anti-soro LdaG reconheceu os epítopos da adesina
responsável pela fenótipo AD, visto que foi capaz de inibir totalmente a
adesão do clone pV-B-6. Na amostra selvagem 22, o padrão de adesão AL
foi inibido em 56%, sugerindo, portanto o envolvimento de outra(s) adesina(s)
(Figura 9).
4.3.2. Ensaios de imunofluorescência
Com base nos dados obtidos através dos testes de inibição de adesão,
pesquisou-se a presença de proteínas de superfície das amostras 22 e pV-B-
6 através de imunofluorescência. Os resultados obtidos revelaram que ambas
as amostras apresentaram uma forte marcação de superfície quando em
contato com o anti-soro LdaG (Figuras 10 e 11), demonstrando a presença de
estruturas antigênicas semelhantes presentes na superfície da amostra
selvagem e do clone.
52
4.3.3. Ensaios de imunomarcação com ouro coloidal
Os ensaios de microscopia eletrônica utilizando imunomarcação com
ouro coloidal foram realizados com as amostras 22 e LDA1 (E. coli 22 ∆ldaG).
As observações de microscopia eletrônica realizadas após imunomarcação
com o anti-soro LdaG mostraram na amostra 22 uma superfície amorfa sem
aparência de estrutura fimbrial (Figura 12A e B). Quando observado em
aumento maior, verificou-se a presença de estruturas fibrilares muito finas
formando estruturas semelhantes a uma malha (Figura 12C). Em
contrapartida, nenhuma marcação foi observada no mutante LDA1 (Figura
12D), sendo que observação semelhante foi feita nos ensaios realizados com
ouro sem a presença do anti-soro. A aparência de LDA foi muito semelhante
à observada em outras adesinas afimbriais, tais como Ral de EPEC de
coelho (Adams et al.,1997), CS6 de ETEC ( Wolf et al., 1989) e Afa,
identificada originalmente em uma amostra do sorotipo de E. coli
uropatogênica O2 (Labigne-Roussel et al., 1984) e depois em uma amostra
de EPEC atípica O55:H- (Keller et al., 2002). Assim, apesar das homologias
de aminoácidos com as fímbrias K88 e CS31, LDA parece ser na sua
estrutura uma adesina afimbrial.
4.3.4. Ensaios de inibição da adesão com carboidratos
Os testes de inibição da adesão com carboidratos na concentração de
0,1 M mostraram que somente a N-acetilgalactosamina foi capaz de inibir
completamente a aderência bacteriana do cosmídeo pV-B-6 a células HEp-2
(Figura 13). Todos os demais açúcares (monossacarídeos, dissacarídeos ou
trissacarídeos) testados não tiveram efeito na adesão.
53
4.4. Estudos sobre a presença da adesina LDA em amostras de
EPEC atípica
4.4.1. Pesquisa do gene ldaH que codifica a subunidade estrutural LdaH da adesina LDA
A presença do gene ldaH, que codifica para uma subunidade estrutural
menor da adesina LDA, foi pesquisada através de testes de hibridização de
colônias. No total foram pesquisadas 78 amostras de EPEC atípica: 65
amostras recentemente isoladas de crianças com e sem diarréia e 13
amostras pertencentes a coleção do Prof. Dr. Luiz R.Trabulsi. Todas as 78
amostras foram testadas quanto a adesão a células HeLa em ensaios de 3 e
6 horas (Tabela 5). A maioria das amostras apresentou o padrão ALL em
ensaios de 6 horas, 3 amostras apresentaram o padrão AA, 1 amostra
apresentou o padrão AD, 11 promoveram descolamento celular e 4 amostras
do sorogupo O26 apresentaram o padrão AL em 3 horas (Tabela 5).
Das 78 amostras analisadas, apenas as 4 amostras que apresentaram
o padrão AL, todas pertencentes a coleção do Prof. Dr. Luiz R. Trabulsi
(2262-79, C240-52, C814-67 e 3323-61), hibridizaram com a seqüência ldaH.
Com o objetivo de localizar o gene ldaH nestas amostras, os DNAs
plasmidial e cromossômico foram extraídos e submetidos a �Southern blot�,
utilizando como sonda o referido gene. A análise do �Southern blot� mostrou
que todas as 4 amostras carregavam seqüências homólogas ao gene ldaH no
cromossomo assim como a amostra de E. coli 22 (Figura 14), uma vez que
nos ensaios realizados com DNA plasmidial não ocorreu hibridização com a
sonda.
4.4.2. Pesquisa da subunidade estrutural LdaG através de �Imuno blot�
Pesquisou-se a subunidade estrutural LdaG através de �Imuno blot�
54
utilizando o anti-soro LdaG. Os resultados obtidos demonstraram que as
amostras não reagiram com o anti-soro, que apresentou reação positiva
somente com as amostras 22 e pV-B-6 (Figura 15).
4.4.3. Ensaios de inibição de adesão com soro anti-LdaG
Os ensaios de inibição de adesão com as 4 amostras revelaram que o
soro anti-LdaG não reconhece os epítopos da adesina responsável pela
adesão AL, visto que nas 4 amostras ldaH-positivas o padrão AL permaneceu
inalterado. A Figura 16A ilustra a adesão da amostra 2262-79 na presença do
soro anti-LdaG.
4.4.4. Ensaios de imunofluorescência
Embora todos os testes realizados indicassem a ausência da
subunidade estrutural LdaG, pesquisou-se ainda as proteínas de superfície
destas amostras através de imunofluorescência. Os resultados obtidos foram
confirmatórios, uma vez que nenhuma das amostras reagiu com o anti-soro
LdaG. A Figura 16C ilustra a imunomarcação da amostra 2262-79 aderida a
células Hep-2 após imunomarcação com o soro anti-LdaG.
4.4.5. Pesquisa do gene ldaG que codifica a subunidade estrutural LdaG da adesina LDA
Realizou-se a pesquisa do gene ldaG por meio de PCR empregando
os �primers� descritos no item 3.4, e utilizando como controle positivo as
amostras 22 e pV-B-6.
Como mostra a Figura 17, nenhuma das amostras apresentou
qualquer produto de PCR. Apenas nas amostras de E. coli 22 e V-B-6 foram
55
amplificados o fragmento de 950 pb. Estes dados mostraram que essas
amostras não apresentam o gene ldaG, que codifica a subunidade estrutural
LdaG da adesina LDA.
4.5. Relação antigênica entre as adesinas LDA e K88
Com o intuito de verificar o papel da fímbria K88 na adesão das
amostras 22 e pV-B-6 a células epiteliais, foram realizados ensaios de
inibição de adesão e imunofluorescência, empregando-se o anti-soro K88
gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Antônio José P. Ferreira do Departamento
de Ornitopatologia da Faculdade de Zooctenia e Medicina Veterinária da
Universidade de São Paulo.
A especificidade do soro anti-K88 foi avaliada em ensaios de �Imuno
blot� em condições que favorecem a expressão da fímbria K88 (item 3.8.2).
Os resultados demonstraram que apenas a amostra de ETEC 2041, que
expressa as fímbrias K88 e F41, reagiu com o anti-soro (Figura 18). Verificou-
se uma proteína de 23 kDa fortemente expressa, que corresponde a
subunidade estrutural da fímbria K88. As amostras 22 e pV-B-6 não reagiram
com o soro.
Os ensaios de inibição de adesão mostraram uma inibição de 30% da
adesão da E. coli 22 e nenhuma inibição da adesão do clone pV-B-6 a células
HEp-2 quando incubadas com o soro anti-K88 na diluição de 1:5 (Figura 19).
Utilizando diluições maiores, de 1:10 até 1:100, não foi observada nenhuma
inibição na adesão da amostra 22.
Dado haver uma pequena inibição da E. coli 22 pelo soro anti-K88,
pesquisou-se então, se esse soro seria capaz de reconhecer proteínas de
superfície através de ensaios de imunofluorescência. Os resultados obtidos
demonstraram que o soro anti-K88 não reagiu com nenhuma estrutura de
superfície da amostra 22 quando comparado a amostra de ETEC 2041
(Figura 20), o que permitiu inferir a presença de estruturas antigenicamente
distintas na superfície dessas duas amostras.
56
4.6. Ensaios de colonização in vivo
Os experimentos de colonização foram realizados com as amostras
selvagem 22, LDA1 (22 ∆ldaG), ORN103 (pIJ20) (ORN103 transformada com
o pV-B-6) e a ORN103 (controle negativo), utilizando camundongos
C57BI/6J.
Para a realização dos ensaios foram obtidos mutantes destas 4
amostras resistentes à estreptomicina por seleção natural como descrito no
item 3.1.2. Foram utilizados dois grupos de camundongos: grupo 1, animais
não tratados; e grupo 2, camundongos submetidos ao tratamento com
estreptomicina anterior a inoculação conforme descrito no item 3.12.1.
Para cada amostra foram utilizados 4 animais tratados com
estreptomicina (grupo 2) e 4 animais não tratados (grupo 1) e cada amostra
foi testada em duplicata, perfazendo um total de 8 animais do mesmo grupo
para cada amostra.
A concentração do número de bactérias a ser inoculada nos animais
foi padronizada em 109 UFC/mL, uma vez que a inoculação de concentrações
de 1010 e 1011 UFC/mL ocasionou a morte de mais da metade dos animais
algumas horas após a inoculação.
4.6.1. Análise das amostras fecais dos animais
Após a inoculação dos animais, amostras fecais foram coletadas
durante 4 dias consecutivos. A Tabela 6 apresenta o número de bactérias
detectadas nas fezes dos camundongos tratados (UFC/g) durante os 4 dias
com as amostras 22, LDA1, ORN103 (pIJ20) e ORN103.
A amostra selvagem 22 foi detectada numa mesma concentração de
106 UFC/g de fezes dos animais do grupo 2 nos 4 dias consecutivos após a
inoculação. Resultados semelhantes foram obtidos com a amostra LDA1,
embora numa concentração menor de105 UFC/g de fezes. Contudo, quando
no caso da E. coli ORN103 (pIJ20) o número de bactérias nas fezes foi
57
diminuindo com o tempo de inoculação. Nos primeiros três dias em
concentrações de 104, 103 e 101 UFC/g de fezes, respectivamente, e no
quarto dia, não se isolou mais a amostra. A E. coli ORN103 utilizada como
controle negativo, foi detectada nas fezes apenas no primeiro dia após a
inoculação em uma concentração baixa de 103 UFC/g de fezes. Nenhuma
destas amostras foi isolada das fezes nos experimentos realizados com os
animais do grupo 1.
4.6.2. Análise macroscópica do íleo, ceco e cólon dos animais
No quarto dia após a inoculação, os animais foram sacrificados e os
segmentos intestinais referentes ao íleo, ceco e cólon foram retirados e
analisados.
A análise macroscópica destes segmentos intestinais demonstrou um
aumento aparente de volume no ceco de 5 e 4 camundongos do grupo 2
inoculados com as amostras 22 e LDA1, respectivamente (Tabela 7). Nos
animais inoculados com a amostra ORN103 (pIJ20), os três segmentos
apresentaram-se com aspecto macroscópico normal, ou seja, sem nenhuma
evidência de aumento de volume. O mesmo ocorreu nos animais inoculados
com a amostra ORN103 utilizada como controle negativo. Nos experimentos
realizados com os camundongos do grupo 1 não foi observada nenhuma
alteração macroscópica do íleo, ceco e cólon.
4.6.3. Adesão e colonização no íleo, cólon e ceco
Para determinar se as amostras 22 e LDA1 eram capazes de aderir e
colonizar o intestino dos camundongos C57Bl/6J, foi feita uma estimativa do
número de colônias bacterianas por grama de tecido das células epiteliais
dos segmentos intestinais referentes ao íleo, ceco e cólon após o quarto dia
de inoculação. Neste dia, os animais foram sacrificados, os segmentos
intestinais obtidos e procedeu-se a contagem.
58
Como mostra o Gráfico 2, a amostra selvagem 22 foi capaz de aderir
ao íleo e cólon de camundongos do grupo 2, visto que o número de UFC/g
de tecido permaneceu quase o mesmo nestes segmentos. No ceco, o
número de UFC/g de tecido aumentou de 107 para 108, sugerindo uma
possível colonização da amostra 22 neste segmento do intestino. Os
resultados obtidos com a amostra LDA1 foram semelhantes, embora o
aumento tenha sido numa concentração menor, de 106 para 107 UFC/g de
tecido. Nos experimentos realizados com os camundongos do grupo 1, não
foi isolada nenhuma colônia bacteriana no íleo, ceco e cólon.
4.6.4. Parâmetros clínicos analisados
Foram analisados a perda de massa corpórea e a presença de diarréia
nos animais inoculados com as 4 amostras (Tabela 7). Como podemos
observar todos os animais do grupo 2 inoculados com a amostra selvagem 22
apresentaram retardamento com relação ao seu crescimento através da
perda de massa corporal e cinco dos animais desenvolveram um quadro de
diarréia 48 horas após a inoculação. No 1o dia, os animais inoculados com a
amostra 22 pesavam em torno de 21 g e no 4o dia 18 g. Os camundongos
inoculados com as amostras LDA1 e ORN103(pIJ20) não apresentaram
nenhuma alteração quanto ao peso e diarréia. O mesmo ocorreu com os
animais inoculados com a amostra ORN103 utilizada como controle negativo.
Nos experimentos realizados com os camundongos do grupo 1, nenhum tipo
de alteração foi observada nos animais.
59
TABELA 5. Resultados dos testes de adesão a células HEp-2 e hibridização
com a sonda ldaH nas 78 amostras de EPEC atípica
______________________________________________________________
Sorotipo No amostras Padrão de adesão Sonda ldaH
______________________________________________________________
O26:H- 4 ALL - O26:H- 2 AL + O26:H11 2 AL + O26:H11 3 ALL - O33:H6 1 ALL - O35:H19 1 ALL - O55:H- 2 ALL - O55:H7 4 ALL - O85:H40 1 ALL - O101:H- 1 ALL - O103:H- 2 ALL - O105:H7 1 ALL - O108:H31 1 DE - O109:H54 1 ALL - O111:H- 4 ALL - O114:H- 1 ALL - O119:H2 4 ALL, DE - O126:H- 1 ALL - O127:H- 1 ALL - O127:H40 2 ALL - O128:H- 1 ALL - O141:HNT 1 ALL - O142:H- 1 ALL - O142:H2 2 ALL, DE - O156:H16 1 ALL - O157:H- 2 NA - ONT:H18 1 AA - ONT: H- 3 DE, AD - ONT:H-, HNT 27 V - ______________________________________________________________ ONT, O não tipável; HNT, H não tipável; ALL, adesão �localizada-like�; AL, adesão localizada; AA, adesão agregativa; AD, adesão difusa; NA, não aderente; V, variável
60
TABELA 6. Número de colônias bacterianas (UFC) detectadas nas fezes dos
camundongos inoculados com 109 UFC das amostras 22, LDA1 (22 ∆lda),
ORN103(pIJ20) e ORN103.
_____________________________________________________________
Amostra UFC/ga nos 4 dias consecutivos após a inoculação:
1o dia 2o dia 3o dia 4o dia
______________________________________________________________
22 2,9X106 6X106 6,5X106 6,9X106
LDA1 1,5X106 7X105 7,3X105 8,2X105
ORN103(pIJ20) 4,4X104 1,3X103 1,2X10 -
ORN103 2X103 - - -
______________________________________________________________ aMédia aritmética da UFC de 8 animais por amostra bacteriana.
61
TABELA 7. Aspectos clínicos e macroscópicos dos camundongos inoculados
com as amostras de E. coli 22, LDA1, ORN103(pIJ20) e ORN103.
______________________________________________________________ Amostra No. animais positivos para os diferentes aspectos / No. animais
inoculados
de E. coli Perda de Diarréiab Presença de dilataçãoc
inoculada pesoa ileo ceco cólon
___________________________________________________________________
22 8/8 5/8 0/8 5/8 0/8
LDA1 0/8 0/8 0/8 4/8 0/8
ORN103 (pIJ20) 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8
ORN103 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8
___________________________________________________________________a, os animais foram pesados no 1o dia e 4a dia; b, a diarréia foi observada no 2o dia; c, os segmentos intestinais foram retirados e analisados após o 4o dia.
62
0
2
4
6
8
E. coli 22 (log10 UFC/g
tecido)
íleo cólon ceco
animal 01animal 02animal 03animal 04
0
2
4
6
8
E. coli LDA1 (log10 UFC/g
tecido)
íleo cólon ceco
animal 01animal 02animal 03animal 04
Gráfico 1: Número de colônias das amostras de E. coli 22 (A) e LDA1 (B) isoladas por
grama de tecido das células epiteliais dos segmentos intestinais dos camundongos pré-
tratados com estreptomicina. Os experimentos foram realizados em duplicatas em
grupos contendo 4 animais; as informações representadas nos gráficos são referentes a
um experimento sendo que não ocorreu diferença significante entre os mesmos
experimentos.
A
B
63
22 pV-B-6
37oC
30oC
25oC
Figura 4. Fotomicrografias do efeito das diferentes temperaturas no padrão de adesão
das amostras de 22 e pV-B-6 a células HEp-2. Aumento de 1.000 X.
64
PM 1 2 3
FIGURA 5. (A) SDS-PAGE 12% corado com Comassie Blue de proteínas parcialmente
purificadas após cultivo das amostras em ágar MacConkey a 37oC. Canaletas: PM-padrão de peso molecular; 1- 22; 2- pV-B-6; 3- pV-B-6-Tn. (B) �Imuno blot� do gel com
o soro anti-22 absorvido diluído 1:100.
(kDa)
176,5
113,7
80,9
63,8
49,5
37,4
23,0~25 kDa
1 2 3(kDa)176,5
113,7
80,9
63,8
49,5
37,4
23,0
A B
65
FIGURA 6. Fotomicrografias mostrando a adesão das amostras 22 e pV-B-6 a
células HEp-2 na presença dos soros pré-imune e policlonal anti-22, ambos diluídos
1:100. Aumento de 1.000 X.
Soro pré-imune Soro anti-22
22
pV-B-6
66
25 kDa SDWTDNQPAGD I F41 A* * * EG * * GD I * 56% CS31A(ClpG) ** YEG* GV * LQS 27% K88(FaeG) V *I GGS I T * D* Y 23%
FIGURA 7. Alinhamento N-terminal da seqüência de aminoácidos da proteína
de 25 kDa com as adesinas F41, CS31A (ClpG) e K88 (FaeG). Os
aminoácidos similares estão representados por (*).
67
PM 1 2 3
1 2 3
FIGURA 8: (A) SDS-PAGE 12% corado com Comassie Blue de proteínas
fimbriais parcialmente purificadas das amostras 22 (1), pV-B-6 (2) e pV-B-6-
Tn (3). PM- padrão de peso molecular. (B) �Imuno blot� do gel com o soro
anti-LdaG diluído 1:200.
A
B
(kDa)
37,4
23,0
(kDa)
37,4
23,0
68
FIGURA 9. Fotomicrografias da adesão das amostras 22 e pV-B-6 a células HEp-2, na
presença dos soro pré-imune e anti-LdaG diluídos 1:100. Aumento de 1.000X.
Soro pré-imune Anti-soro LdaG
22
pV-B-6
69
A
A�
B
B�
FIGURA 10. Fotomicrografias da imunomarcação da E. coli 22 com os soros anti-LdaG e pré-
imune diluídos 1:100. (A) Microscopia de fluorescência mostrando a reatividade do soro anti-
LdaG na amostra 22 aderida a células HEp-2. (A�) Contraste de fase mostrando amostra 22
aderida a células HEp-2. (B) Microscopia de fluorescência mostrando a ausência de
reatividade na amosatra 22 pelo soro pré-imune. (B�) Contraste de fase da lâmina B
mostrando a amostra 22 aderida a células HEp-2. Aumento de 1.000 X.
70
A
A�
B
B�
FIGURA 11. Fotomicrografias da imunomarcação do clone pV-B-6 com os soros anti-LdaG e pré-
imune diluídos 1:100. (A) Microscopia de fluorescência mostrando reatividade do soro anti-LdaG
no clone pV-B-6. (A�) Contraste de fase mostrando o clone pV-B-6 aderido a células HEp-2. (B)
Microscopia de fluorescência mostrando a ausência de reatividade no clone pV-B-6 pelo soro pré-
imune. (B�) Contraste de fase mostrando o clone pV-B-6 aderido a células HEp-2. Aumento de
1.000 X.
71
FIGURA 12. Fotomicrografias das amostras 22 e LDA1 visualizadas em microscopia
eletrônica de transmissão imunomarcadas com ouro coloidal utilizando o soro anti-LdaG
após coloração negativa. (A, B e C). As barras representam 200 nm (A e B) e 50 nm (C).
Houve marcação em toda a superfície da amostra 22; (D) Observa-se a ausência total de
marcação na superfície da amostra LDA1. A barra representa 200 nm.
A B
C D
72
A
B
FIGURA 13. Fotomicrografias da adesão do clone pV-B-6 a células HEp-2 na
ausência (A) e presença (B) de N-acetilgalactosamina. Aumento de 1.000 X.
73
FIGURA 14. (A) Gel de agarose 0,7% do DNA cromossômico das 4 amostras de
EPEC atípica ldaH-positivas. Canaletas: PM- padrão de peso molecular; 1- 240-52;
2- 2262-79; 3- C814-67; 4- 3323-61; 5- pLDAH. (B) �Southern blot� do gel com a
sonda ldaH marcada com [α-32P] dCTP.
1 2 3 4 5 PM 1 2 3 4
74
1 2 3 4 5 6
37,4
23,0
19,6
kDa
FIGURA 15: (A) Gel de SDS-PAGE 12% corado com Comassie Blue de proteínas
fimbriais parcialmente purificadas das amostras de E. coli: 22 (1); pV-B-6 (2); (3)
2262-79; (4) C814-67; (5) 240-52; (6) 3323-61; PM- padrão de peso molecular. (B)
�Imuno blot� do gel com o soro anti-LdaG diluído 1:200.
25,0
PM 1 2 3 4 5 6
A B
75
A B
DC
FIGURA 16. Fotomicrografias da EPEC atípica 2262-79 ldaH-positiva aderida a células
HEp-2 na ausência (A) e na (B) presença do soro anti-LdaG; (C) Contraste de fase
mostrando a adesão bacteriana a células HEp-2; (D) Imunofluorescência com o soro anti-
LdaG (diluído 1:100) mostrando a ausência de reatividade na amostra 2262-79. Aumento
de 1.000 X.
76
PM 1 2 3 4 5 6 7
FIGURA 17. Gel de agarose 1,5%. PCR para amplificação do gene ldaG das amostras de E.
coli: 1- 22 (controle positivo); 2- DH5α (controle negativo); 3- 2262-79; 4- C814-67; 5- C240-52;
6- 3323-61; 7- pV-B-6; PM-padrão de peso molecular 100 pb DNA ladder.
950 pb
77
37,4 26,0 19,6
23,0
kDa
Figura 18. �Imuno blot� de extratos fimbriais parcialmente purificados das amostras
de ETEC 2041 (K88+); 22 e do clone pV-B-6 com soro anti-K88 diluído 1:100.
ETEC 2041 22 pVB6
78
FIGURA 19. Fotomicrografias da adesão das amostras 22 e pV-B-6 a células HEp-2, na
ausência (A e B) e na presença do soro anti-K88 (C e D) diluído 1:5. Aumento de 1.000X.
22
pV-B-6
A
B
C
D
79
A
A�
B
B�
FIGURA 20. Fotomicrografias da imunomarcação das amostras ETEC 2041 e 22 aderidas à
células HEp-2 com soro anti-K88 1:100. (A) Contraste de fase mostrando ETEC 2041 aderida
a células HEp-2. (A�) Microscopia de fluorescência mostrando reatividade do soro anti-K88 na
amostra ETEC 2041 a células HEp-2. (B) Contraste de fase mostrando a amostra 22 aderida a
células HEp-2. (B�) Microscopia de fluorescência mostrando ausência de reatividade do soro na
amostra 22. Aumento de 1.000 X.
80
5. DISCUSSÃO
As E. coli diarreiogênicas apresentam uma grande diversidade de
estratégias para colonizar a mucosa intestinal e causar a doença diarréica no
homem e em animais. Essa versatilidade de mecanismos de patogenicidade
compreende, de modo geral, a adesão a células epiteliais propiciando a
colonização do intestino delgado ou grosso, como etapa inicial do processo
infeccioso. Após a aderência bacteriana, as diferentes categorias de E. coli
diarreiogênicas podem produzir toxinas, invadir a mucosa intestinal ou induzir
vias de transdução de sinais na célula eucariótica (Nataro & Kaper, 1998).
Dentre as categorias de E. coli diarreiogênicas, a EPEC foi a primeira a
ser reconhecida como causadora de diarréia infantil e a partir de 1995 a
categoria EPEC passou a ser subdividida em EPEC típica e atípica baseado
na presença ou ausência do plasmídio EAF, respectivamente (Bray et al.,
1945; Nataro & Kaper 1998; Girón et al., 1991).
Considerado como EPEC durante muitos anos, o sorogrupo O26 foi
transferido para a categoria das EHEC, porque parte das amostras do
sorotipo O26:H11 produz citotoxinas (Scotland et al., 1990; Scotland et al.,
1993). Aparentemente há diferenças geográficas na virulência das amostras
O26:H11, já que as isoladas no Brasil raramente produzem Stx (Giraldi et al.,
1990, Silva et al., 1983; Guth et al., 2002). As amostras O26 não apresentam
o plasmídio EAF e assim são caracterizadas como EPEC atípicas (Nataro &
Kaper,1998).
Múltiplos fatores de aderência, incluindo a fímbria BFP, flagelos e
proteínas codificadas na região LEE estão implicados na adesão da EPEC
típica, porém, nenhuma adesina distinta dessas, até o momento da escrita
deste trabalho foi caracterizada em amostras de EPEC atípica. Szalo et al.
(2002) identificaram várias amostras O26 isoladas de bovinos que possuíam
89% de identidade com a chaperonina ClpE da fímbria CS31A. Estes
isolados, entretanto foram negativos para o gene clpG, que codifica a
principal subunidade estrutural da fímbria, sugerindo a presença de uma
eventual nova adesina.
81
No estudo realizado anteriormente por Pelayo et al. (1999) foi
demonstrado que algumas amostras de EPEC atípica O26 apresentaram um
padrão de adesão localizado (AL), porém eram desprovidas da fímbria BFP.
Com o objetivo de identificar e caracterizar os genes envolvidos no padrão
AL, construímos uma biblioteca genômica de uma dessas amostras, a EPEC
atípica 22, e identificamos um locus cromossômico denominado lda, que é
responsável por uma adesão difusa (AD) a células HEp-2, quando presente
numa E. coli K12.
Anteriormente à realização deste trabalho, o seqüenciamento completo
do locus lda não era conhecido, uma vez que somente o gene ldaH que
possuía 73% de identidade com a subunidade fimbrial faeH da fímbria K88 de
ETEC estava identificado. Portanto este estudo foi realizado em paralelo a
caracterização genética do locus lda, e inicialmente teve como objetivo
caracterizar fenotipicamente a subunidade estrutural LdaH e verificar sua
distribuição entre amostras de EPEC atípica.
Com o objetivo de caracterizar a adesina responsável pelo padrão
adesão difusa da amostra pV-B-6, foram empregados ensaios de adesão,
�Imuno blot�, imunofluorescência e também experimentos fenotípicos de
análise ultraestrutural da adesina realizados com a amostra 22, para a qual
havíamos preparado um anti-soro policlonal, que foi submetido à absorção
com uma amostra isogênica não aderente.
Estudos fenotípicos sobre a adesão da amostra pV-B-6 a células HEp-
2 realizado em diferentes temperaturas mostraram que a adesina
responsável pelo padrão AD apresenta ótima expressão a 37oC. A maioria
das adesinas fmbriais das E. coli diarreiogênicas, incluindo BFP de EPEC
típica (Girón et al., 1991), 987P de ETEC (Klemm, 1985), bem como das E.
coli uropatogênicas são expressas em temperaturas fisiológicas, ou seja, a
37oC. Entre temperaturas de 18oC a 25oC, poucas fímbrias são produzidas, e
abaixo de 18oC a produção cessa completamente (Klemm, 1985).
A utilização do soro anti-22 em testes de inibição de adesão revelou
um efeito inibitório significativo na adesão da amostra pV-B-6, sugerindo a
presença de anticorpos contra os determinantes antigênicos envolvidos na
82
adesão difusa. Sendo assim empregou-se o soro policlonal anti-22 para
caracterizar a adesina LDA.
Nos ensaios de �Imuno blot�, o soro anti-22 reagiu fortemente com uma
proteína de 25 kDa presente nos extratos fimbriais parcialmente purificados
das amostras 22 e pV-B-6 quando cultivadas apenas em ágar MacConkey,
mas ausente no mutante pV-B-6-Tn. Ao se analisar os componentes do ágar
MacConkey, verifica-se que na sua composição química encontra-se uma
determinada concentração de sais biliares que não está presente na maioria
dos meios de cultura. Curiosamente, adicionamos esta mesma concentração
de sais biliares ao ágar LB, o que resultou na detecção da proteína de 25
kDa, demonstrando assim que a expressão desta proteína parece ser
induzida por sais biliares (dados não mostrados). A expressão da adesina
LPF de EHEC também é induzida em ágar MacConkey (Torres et al., 2002).
Outras adesinas dependem de outros ingredientes para sua melhor
expressão, por exemplo, a fímbria BFP de EPEC típica é expressa na
presença de 5% de sangue de carneiro adicionado no ágar TSA (Girón et al.,
1991).
A análise da seqüência amino-terminal de 12 aminoácidos da proteína
de 25 kDa presente na amostra pV-B-6 confirmou a similaridade com as
seqüências das adesinas F41, K88 (FaeG) e CS31 (ClpG), bem como
confirmou a seqüência de aminoácidos deduzida a partir da seqüência de
nucleotídeos codificada no gene ldaG.
Com base nestes achados, um anti-soro LdaG foi preparado e utilizado
em testes de adesão. Os ensaios de inibição de adesão com o soro LdaG
revelaram que este soro contêm anticorpos específicos contra a adesina
responsável pela adesão difusa, uma vez que houve inibição total da adesão
difusa do clone pV-B-6, demonstrando que LdaG, principal subunidade
estrutural da adesina LDA, está mediando a adesão difusa nessa amostra.
Foi determinada a incidência do gene ldaH em 65 amostras de EPEC
atípica, sendo que 34 dessas amostras pertenciam a 21 diferentes
sorogrupos. Essas amostras foram isoladas em diferentes cidades brasileiras
de crianças com diarréia aguda e de controles, sem sintomatologia
83
gastrointestinal, pareados por idade. Essas amostras foram classificadas
como atípica, uma vez que não reagiram com a sonda EAF e foram
caracterizadas quanto ao padrão de adesão células HEp-2. A maioria das
amostras apresentou o padrão ALL em ensaios de 6 horas. Nenhuma dessas
65 amostras produtoras do padrão ALL em ensaios de 6 horas apresentou a
seqüência ldaH.
Também foram estudadas 13 amostras de EPEC atípica cedidas pelo
Prof. Dr. Luiz R. Trabulsi, as quais pertenciam aos sorogrupos O26, O55 e
O111. O gene ldaH foi encontrado em quatro amostras, todas do sorogrupo
O26 e que apresentavam o padrão AL em ensaios de três horas. Os
experimentos de hibridização mostraram que o gene ldaH estava localizado
no cromossomo das amostras, assim como na E. coli 22. Esses dados
sugeriam que a adesina LDA era específica de amostras do sorotipo O26. No
entanto, tanto os experimentos de PCR para amplificação do gene estrutural
ldaG, como os experimentos de �Imuno blot� utilizando o anti-soro ldaG não
revelaram a proteína de 25 kDa. Portanto, é provável que nessas amostras o
padrão AL seja devido à expressão de outra adesina, apresentando
homologia com a subunidade estrutural ldaH, uma vez que essas amostras
reagiram com a sonda ldaH.
Estudando uma coleção de amostras de EPEC atípica e EHEC do
Center for Vaccine Development, University of Maryland, EUA, encontramos
o gene ldaH em 19 amostras, sendo 14 EPEC atípica O26 e 5 EHEC (2 O26,
O5, O111, e O145), todas apresentando o padrão AL em ensaios de 3 horas.
Esses resultados mostraram que a presença do gene ldaH não está limitado
apenas ao sorogrupo O26, mas está presente também em amostras EHEC.
Uma das amostras positivas, a EHEC O145 era uma amostra isolada das
fezes de boi, mostrando que lda não é restrito a amostras de origem humana.
Em seis dessas amostras foi pesquisado o gene ldaG, sendo que o mesmo
foi encontrado apenas nas amostras O26. Esses resultados indicam que,
embora possa existir homologias com a subunidade estrutural menor da
adesina, ldaH, entre os diferentes sorotipos, a principal subunidade estrutural,
ldaG, parece ser específica do sorogrupo O26. Por outro lado, a presença de
84
seqüências homólogas a ldaH entre amostras de diferentes sorotipos não é
um dado tão surpreendente, se observarmos as extensas homologias de
DNA encontradas entre as proteínas ancestralmente relacionadas a K88
(Anderson et al., 1988; Bakker et al., 1991; Martin et al., 1991); na verdade,
essas seqüências podem muito bem serem utilizadas de forma permutável
para a expressão das fímbrias (Korth et al., 1992).
Um dos dados mais surpreendentes encontrados durante a
caracterização da adesina, foi que o locus lda aparentemente não codifica
uma estrutura fimbrial bem definida, mas uma estrutura com aparência
amorfa semelhante a adesinas afimbriais. Assim, como as adesinas Ral
(Adams et al., 1997), CS6 (Wolf et al., 1989) e Afa (Keller et al., 2002), LDA
se assemelha a uma rede de fibrilas que, devido ao seu pequeno diâmetro,
não são bem definidas pelas técnicas normais de coloração, sendo de difícil
visualização ao microscópio eletrônico.
Sabe-se que as adesinas se ligam a receptores específicos na
superfície da célula hospedeira, compostos de modo geral por carboidratos
que podem ser simples ou polímeros. No presente estudo foi investigada a
natureza do receptor da adesina LDA, através de testes de inibição de
adesão com diferentes açúcares. Os dados obtidos mostraram que receptor é
o epítopo N-acetilgalactosamina, presente na superfície de células Hep-2,
uma vez que este carboidrato inibiu totalmente a adesão difusa do clone pV-
B-6. Interessante salientar que esse mesmo epítopo está também envolvido
no fator adesão localizada de EPEC típica (Scaletsky et al., 1988). Portanto,
há uma razão para acreditar que o componente de superfície N-
acetilgalactosamina atuaria como sítio específico de ligação para amostras de
EPEC, independente do tipo de adesina.
A organização e a similaridade da seqüência deduzida de aminoácidos
do locus lda lembra a do operon fae K88 (Bakker et al., 1992), embora
também tenha apresentado considerável identidade com o operon fimbrial clp
de ETEC CS31 (Girardeau et al., 1988) e numa menor extensão com o
operon fimbrial ral de REPEC (Adams et al., 1997). É interessante salientar
que a seqüência de aminoácidos do principal gene estrutural, ldaG, está
85
relacionado mais à subunidade estrutural da adesina F41 codificada por
genes cromossômicos (56%) do que qualquer uma das várias subunidades
estruturais da fae K88 codificadas num plasmídio (23%).
Com base nos achados acima, ensaios de inibição de adesão e
imunofluorescência com soro anti-K88 foram realizados com o intuito de
investigar a relação antigênica entre as adesinas LDA e K88. Os resultados
mostraram que ambas as adesinas são antigenicamente distintas, uma vez,
que o soro anti-K88 não inibiu a AD e nem reconheceu qualquer estrutura
presente na superfície da amostra pV-B-6.
É muito bem conhecida a especificidade das adesinas de ETEC às
suas células hospedeiras (Gaastra et al., 1982). Amostras de ETEC que
expressam o antígeno fímbrial F41 são patogênicas para gado, suínos e
carneiros, enquanto amostras de ETEC K88 são patogênicas para suínos
(Cassels & Wolf, 1995).
Embora muito progresso tenha havido nas ultimas décadas em relação
ao estudo da patogênese da EPEC, relativamente pouco se conhece sobre
as mudanças fisiopatológicas induzidas por EPEC. A falta de um modelo
animal de pequeno porte restringiu muito os estudos in vivo para análise das
interações da EPEC com o hospedeiro. Entretanto, estudos mais recentes
mostraram que amostras de EPEC isoladas de seres humanos são capazes
de aderir ao epitélio intestinal de camundongos in vitro e in vivo, sugerindo o
modelo do camundongo C57BL/6J como modelo animal para estudar as
respostas do epitélio intestinal à infecção de EPEC (Savkovic et al., 2005).
Baseado neste estudo, avaliamos o papel da adesina LDA na
virulência bacteriana, utilizando o modelo do camundongo C57BL/6J tratado
e não tratado com estreptomicina e comparando a amostra selvagem 22 com
a isogênica apresentando deleção do gene ldaG (LDA1).
Evidências de microscopia eletrônica sugerem que grande parte da
microbiota do intestino está associada a uma camada de muco presente na
parede intestinal (Hartley et al., 1979; Savage et al., 1977). Alguns
investigadores sugeriram que esta camada de muco serviria como sítio de
aderência inicial para bactéria ou como uma matriz para a aderência
86
bacteriana permanente (Savage et al., 1980). Outros investigadores,
entretanto, sugerem que a camada de muco serviria de proteção evitando a
aderência e penetração de microrganismos (Freter et al.,1981). Os dados
obtidos com os animais do grupo 1, não tratados com estreptomicina são
consistentes com esta última observação, pois nenhuma bactéria foi
detectada durante os 4 dias consecutivos nos camundongos não tratados
com estreptomicina. O modelo do camundongo tratado com estreptomicina
tem sido utilizado no estudo da colonização da EHEC O157:H7 (Wadolkowski
et al., 1990).
Os resultados obtidos mostraram que a amostra selvagem 22 adere e
coloniza o epitélio intestinal do ceco dos camundongos. A colonização foi
demonstrada pela persistência da bactéria recuperada nas fezes e no epitélio
superficial do ceco após o 4o dia da inoculação. O pequeno número de
colônias recuperadas da superfície epitelial do ceco dos camundongos
inoculados correlacionou-se com o número de UFC/mL da EPEC 2348/69
∆bfpA encontrado em camundongos após infecção (Savkovic et al., 2005).
Além do mais, nossos resultados mostraram que a amostra 22 apresentando
deleção no gene ldaG adere menos do que a amostra selvagem,
demonstrando assim, que o locus lda pode desempenhar eventual papel na
aderência bacteriana desta amostra. Provavelmente, a adesina LDA teria
papel semelhante ao da fímbria BFP na aderência inicial da EPEC típica a
células epiteliais, mediando uma adesão não íntimina da bactéria, seguida
pela adesão íntima promovida pela intimina (Moon et al., 1996).
O efeito da infecção da EPEC 22 no estado clínico do camundongo
incluiu a perda de peso e a presença de diarréia após o quarto dia de
infecção. Nenhum destes sinais, porém, foi observado nos animais infectados
com a amostra 22 ∆ldaG, demonstrando assim, um eventual papel da
adesina LDA na patogênese da diarréia. Sinais clínicos semelhantes foram
reportados em camundongos inoculados com C. rodentium (Luperchio et al.,
2001), mas não com a EPEC típica E2348/69 e tampouco com o mutante
isogênico ∆bfp (Savkovic et al., 2005). Essa discrepância pode ser devida a
uso de animais mais jovens (3 a 4 semanas) infectados por um período mais
87
prolongado (14 dias), utilizados nos estudos de Savkovic et al. (2001).
Nossos resultados levaram à identificação e caracterização da adesina
LDA responsável pela aderência difusa a células HEp-2. LDA é uma adesina
afimbrial que contém uma subunidade principal, LdaG, cuja expressão é
induzida em ágar MacConkey a 37oC. Estudos futuros são necessários para
caracterizar em maior detalhe o papel da adesina LDA na virulência
bacteriana.
88
6. CONCLUSÕES
1. O padrão difuso de adesão da amostra pV-B-6 é mediado pela
principal subunidade estrutural da adesina, LdaG, cuja expressão é
induzida em ágar MacConkey a 37oC.
2. A adesina LDA apresentou morfologia ultraestrutural de adesinas
afimbriais, sendo, portanto um agregado amorfo sem um formato
definido.
3. Nenhuma das 65 amostras de EPEC atípica, isoladas de crianças com
e sem diarréia, produtoras do padrão ALL em ensaios de 6 horas
apresentou a seqüência ldaH. O gene ldaH foi encontrado em quatro
amostras pertencentes a bacterioteca do Prof. Dr. Luiz R. Trabulsi,
todas do sorogrupo O26 e que apresentavam o padrão AL em ensaios
de três horas.
4. As adesinas LDA e K88 são antigenicamente distintas, uma vez que o
soro anti-K88 não inibiu a AD e nem reconheceu qualquer estrutura
presente na superfície da amostra pV-B-6.
5. Aparentemente, a adesina LDA está envolvida no processo de
colonização, uma vez que a amostra selvagem 22 aderiu e colonizou
mais eficientemente o ceco de camundongos C57BL/6J do que a
amostra 22 ∆ldaG
89
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105
8. ANEXOS 8.1. Meios de cultura, reagentes e soluções
Os meios de cultura, sais e açúcares utilizados, quando não
especificados, foram de procedência Difco (Difco Laboratories, Michigan,
EUA), Merck (Merck Chemicals, New Jersey, EUA) e Synth (Labsysnth S. A.,
Diadema, SP). Os demais reagentes utilizados foram provenientes da Sigma
(Sigma-Aldrich Chemical, Missouri, EUA), Invitrogen (Life Tecnologies Inc,
Gaithenesburg MD, EUA), Amershan (Amershan Pharmacia Biotech AB,
Uppsala, Sweden), tendo sido preparados conforme especificações dos
fabricantes.
Os meios de cultura, obtidos sob a forma desidratada foram
preparados com água destilada e purificada pelo sistema Mili-Q (Milipore Inc.,
Massachusetts, EUA) e autoclavados a 121ûC por 15 minutos. Foram
utilizados os meios ágar MacConkey, Blood Agar Base (BAB), agar Brucella,
ágar TSA acrescido de 5% de sangue de carneiro, caldo TSB (Tryptic Soy
Broth).
8.1.1. Caldo Lúria Bertani (LB)
Triptona 10 g
Extrato de levedura 5 g
Cloreto de sódio 5 g
Água destilada q.s.p. 1000 mL
Todos os elementos foram adicionados à água destilada, e o meio
esterilizado em autoclave a 121°C durante 15 minutos. Para a preparação de
LB ágar foi adicionado à solução acima 2% de bacto agar (Difco).
106
8.2. Soluções utilizadas para extração de DNA plasmidial
8.2.1. Solução Tris-HCl 1 M pH 8,0
O Trizma base foi dissolvido em água bidestilada e seu pH ajustado
com HCl 10N. A solução foi autoclavada a 121oC por 15 minutos.
8.2.2. Solução Na2EDTA 0,5M pH 8,0
O Na2EDTA foi dissolvido em água bidestilada quente e pH ajustado
com NaOH 5N para 8,0 e autoclavada a 121oC por 15 minutos.
8.2.3. Solução I (solução de ressuspensão)
Glicose 50 mM
Tris-HCl pH 8,0 25 mM
EDTA pH 8,0 10 mM
A solução foi preparada no momento do uso e mantida no
gelo.
8.2.4. Solução II (solução lítica desnaturante)
NaOH 0,2N
SDS 1%
A solução foi preparada no momento do uso.
107
8.2.5. Solução III (Acetato de sódio 3M pH 4,8)
NaAc 3 M pH 4,8
O acetato de sódio foi dissolvido em água bidestilada, o pH
ajustado com ácido acético glacial e a solução autoclavada a 121oC
por 15 minutos. A solução foi mantida à temperatura ambiente.
8.2.6. Solução IV (Acetato de sódio 100 mM pH 7,0)
NaAc 100 mM
Tris 50 mM
A solução foi autoclavada a 121oC por 15 minutos.
8.2.7. Solução de Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico
Fenol 25 mL
Clorofórmio 25 mL
Álcool isoamílico 1 mL
Após preparo, a solução foi armazenada a 4ûC.
8.2.8. Solução Tris-EDTA (TE) pH 8,0
Trizma base 100 mM
Na2EDTA 10 mM
Inicialmente o Na2EDTA é dissolvido à quente com uma parte de água
108
destilada, adicionando-se em seguida Trizma base e ajustando o pH com
HCl. Completar o volume da solução, autoclavar a 121ûC por 15 minutos.
8.3. Soluções para eletroforese em gel de agarose
8.3.1. Solução tampão Tris-Borato-EDTA (TEB) - pH 8,2 (10X)
Trizma base 890 mM
Na2EDTA 25 mM
Ácido Bórico 89 mM
Após a dissolução à quente do Na2EDTA, são acrescentados Tris e
ácido bórico e o volume da solução é completado com água destilada. No
momento de uso, esse tampão é diluído 0,5 x em água destilada.
8.3.2. Tampão de amostra para DNA (6X)
Ficoll 400 2,5 g
Azul de bromefonol 0,025 g
Xileno cianol 0,025 g
O Ficoll é dissolvido à quente em 10 mL de água bidestilada e em
seguida são acrescentadas as demais soluções, completando-se o volume
desejado.
8.3.3. Solução de brometo de etídio
O brometo de etídio foi preparado a 5 mg/mL em tampão Tris a 0,05 M
pH 8,5 e mantidos em frasco à temperatura ambiente.
109
8.4. Soluções utilizadas nos testes de hibridização de DNA bacteriano com sondas genéticas
8.4.1. Solução desnaturante
NaOH 0,5 N
NaCl 1,5 M
Esta solução foi preparada em água destilada a partir das soluções
estoque de NaOH a 10 N e de NaCl à 5 M.
8.4.2. Solução neutralizante
Tampão Tris � pH 7,0 1 M
NaCl 2 M
Esta solução foi preparada em água destilada a partir das soluções
estoque de tampão Tris (2M), pH 7,0 e NaCl (5M).
8.4.3. Solução salina citrato �SSC� � pH 7,0 (20X)
NaCl 3 M
Citrato de sódio 0,3 M
A solução foi preparada em água destilada e o pH ajustado com HcL.
A seguir a solução foi autoclavada a 121ûC durante 15 minutos.
110
8.4.4. Solução de esperma de salmão
Foi preparada uma solução de DNA de esperma de salmão em tampão
Tris-EDTA na concentração de 10 mg/mL. Esta solução foi submetida a 5
passagens sucessivas por uma agulha de 38 mm X 7 mm, para
homogeneização. Após o preparo, esta solução foi mantida a -20°C.
8.4.5. Solução Denhardts (50X)
Ficol 400 1 g
Polivinil pirrolidona 1 g
BSA 1 g
Água destilada q.s.p. 100 mL
8.4.6. Solução de pré-hibidização
SSC 5 X
SDS 0,1 %
Denhardts 2 X
Esperma de Salmão 0,1 mg/mL
Água destilada q.s.p. 100 mL
8.4.7. Solução de lavagem 0,1%
SSC 0,1%
SDS 0,1%
Água destilada q.s.p. 500 mL
111
8.4.8. Solução de lavagem 0,05%
SSC 0,05%
SDS 0,05%
Água destilada q.s.p. 500 mL
8.5. Soluções e meios de cultura utilizados para os testes de adesão em célula HeLa.
8.5.1. Solução tampão salina fosfato (PBS)
NaCl 136,9 mM
KCl 2,7 mM
Na2.HPO4 8,1 mM
KH2.PO4 1,5 mM
Os sais foram dissolvidos em água destilada e a solução foi
autoclavada a 121°C durante 15 minutos. Para a solução salina fosfato com
pH 7,2, acertar o pH com ácido clorídrico.
8.5.2. Meio mínimo essencial de Eagle (modificado) com sais de
Earle (DMEM)
O meio foi dissolvido em água bidestilada, conforme recomendações
do fabricante. O pH foi ajustado para 7,2 com solução de bicarbonato de
sódio a 7,5%; o meio foi suplementado com 10% e 2% de soro fetal bovino
(SFB). Em seguida, o meio foi filtrado em membranas de acetato de celulose
com poros de 0,22 µm (Sistema de filtração Miliipore Corporation, EUA) e
armazenado a 4oC.
112
8.5.3. Solução Associada de Tripsina e Versene (ATV)
Primeiramente, foi preparada uma solução salina:
NaCl 0,8%
KCl 0,2%
Na2.HPO4 6,4 g
KH2.PO4 0,2 g
Água bidestilada q.s.p. 1000 mL
Foram dissolvidos 2 g de tripsina (Difco) em 50 mL da solução salina
durante 2 horas sob agitação em banho de gelo e, então, acrescentada no
restante da solução salina. A solução de Versene foi preparada dissolvendo-
se 0,2 g de Titriplex (Merck) em 10 mL da solução salina e 1,5 mL de solução
vermelho de fenol a 1%. A solução foi esterilizada por filtração em
membranas com poros de 0,22 µm de diâmetro (Millipore Corporaion, USA) e
conservada a �20oC.
8.5.4. Solução Azul de Tripan a 0,5%
O azul de tripan foi diluído na solução tampão salina fosfato (PBS) a
0,5%. Esta solução foi utilizada na diluição 1:2 (v/v) com a suspensão de
células HeLa para efeito de contagem de células viáveis.
8.5.5. Solução estoque de D-manose
A solução de D-manose foi preparada em água bidestilada na
concentração final de 10% e autoclavada em vapor fluente por 1 hora. A
solução foi armazenada a 4°C até o momento do uso.
113
8.5.6. Solução tampão de S∅ rensen
Solução A:
KH2PO4 0,64 g
Água bidestilada q.s.p. 70 mL
Solução B:
Na2HPO4 2,36 g
Água bidestilada q.s.p. 250 mL
Para a solução final: foi adicionado 69,6 mL da solução A em 230,4 mL
da solução B. Essa solução foi armazenada a 4°C até o momento do uso.
8.5.7. Solução corante de May-Grünwald (eosina-azul de metileno)
A solução comercial foi diluída no momento do uso na proporção 1:2
(v/v) em tampão de S∅ rensen.
8.5.8. Solução corante de Giemsa (azul-eosina-azul de metileno)
A solução comercial foi diluída no momento do uso na proporção 1:3
(v/v) em tampão de S∅ rensen.
8.6. Soluções utilizadas na eletroforese de proteína em SDS-PAGE
8.6.1. Solução de Acrilamida bis � Acrilamida
Acrilamida 30 g
N,N, - metilenobisacrilamida 0,8g
114
Água destilada q.s.p. 100 mL
A solução foi filtrada em papel de filtro e armazenada em frasco escuro
a 4°C.
8.6.2. Solução de Ressuspensão das Amostras
Tris-HCl (0,5 M pH 6,8) 2,5 mL
SDS 400 mg
Glicerol 2,0 mL
Azul de bromofenol 1%
Betamercaptoetanol 5%
Água destilada q.s.p. 20 mL
Manter essa solução a 4ûC.
8.6.3. Gel de Empacotamento
Acrilamida/bis 1,70 mL
Tris-HCl 1 M pH 6,8 1,25 mL
Persulfato de amônia 10% 0,10 mL
TEMED 0,01 mL
SDS 10% 0,10 mL
Água bidestilada 6,80 mL
115
8.6.4. Gel de Resolução 12%
Acrilamida/bis 8,30 mL
Tris-HCl 1 M pH 8,8 6,30 mL
Persulfato de amônia 10% 0,25 mL
TEMED 0,01 mL
SDS 10% 0,25 mL
Água bidestilada 9,90 mL
8.6.5. Tampão de Eletroforese (4 x)
Trizma base 6 g
Glicina 28,5 g
SDS 2 g
Água bidestilada q.s.p. 500 mL
8.6.6. Solução de Coomassie Blue
Metanol 10%
Coomassie Brilhant Blue 0,05%
Ácido acético 10%
Água bidestilada 40%
8.6.7. Solução descorante
Ácido acético 10%
Metanol 40%
Água destilada q.s.p. 100 mL
116
8.7. Soluções utilizadas em �Imuno blot�
8.7.1. Tampão Tris
Tris-HCl 1 M pH 7,3 10 mL
Albumina bovina (BSA) 1 gr
Tween 0,5 mL
NaCl 9 gr
Completar com 2.400 mL de água bidestilada
8.7.2. Tampão para bloquear a reação
Dissolver 3 gr de albumina bovina (BSA) em 100 mL de tampão Tris
8.7.3. Ponceau S (solução estoque)
Ponceau S 2 gr
Ácido tricloroacético 30 gr
Ácido sulfosalicílico 30 gr
Completar com 100 mL de água destilada.
No momento do uso diluir 1 parte da solução estoque em 9 partes de
água destilada.
117
8.8. Solução utilizada na microscopia eletrônica de transmissão
8.8.1. Solução tamponada com fosfato monossódico-dissódico
0,2M pH 7,4
Solução A
NaH2PO4.H2O 2,76 g
H2O destilada estéril 100 mL
Solução B
Na2HPO4.H2O 5,66 g
H2O destilada estéril 100 mL
Para obtenção do tampão na concnetração de 0,1M pH 7,4 foram
misturados 19 mL da solução A com 81 mL da solução B, sendo a mistura
resultante, diluída a 1:2 (v/v) em água destilada estéril e armazenada a 4oC.
8.8.2. Solução de molibdato de amônio a 2% (pH 5,0)
Foram dissolvidos 2,0 gramas de molibdato de amônia em 100 ml de
água bidestilada esterilizada e o pH ajustado para 5,0. A solução foi
armazenada em frasco de vidro protegido da luminosidade e mantida à
temperatura ambiente até o momento do uso.
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