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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
Michelle Sabrina da Silva
O papel do extrato de Rhodiola rosea e Chlorella
na modulação de cicatrizes queloideanas
The role of Rhodiola rosea extract and Chlorella in the
modulation of keloid scars
Campinas
2017
Michelle Sabrina da Silva
O papel do extrato de Rhodiola rosea e Chlorella
na modulação de cicatrizes queloideanas
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos
para a obtenção do título de Doutora em
Farmacologia.
Orientadora: Profª Drª Mary Luci de Souza Queiroz
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
MICHELLE SABRINA DA SILVA, E ORIENTADA PELA PROFª DRª MARY LUCI DE SOUZA
QUEIROZ.
Campinas
2017
I. Dedicatória
Gosto muito de te ver, leãozinho
Caminhando sob o sol
Gosto muito de você, leãozinho
Para desentristecer, leãozinho
O meu coração tão só
Basta eu encontrar você no caminho
Um filhote de leão, raio da manhã
Arrastando o meu olhar como um ímã
O meu coração é o sol, pai de toda cor
Quando ele lhe doura a pele ao léu
Gosto de te ver ao sol, leãozinho
De te ver entrar no mar
Tua pele, tua luz, tua juba
Gosto de ficar ao sol, leãozinho
De molhar minha juba
De estar perto de você e entrar no mar
Aos meus filhos, que são os motivos do ser e
fazer da minha alma. Caio e Isabela, as
forças que me movem. Não existem palavras
que descrevam o amor que sinto por vocês.
I. Dedicatória
Não é sobre ter todas as pessoas do mundo pra si
É sobre saber que em algum lugar alguém zela por ti
É sobre cantar e poder escutar mais do que a própria voz
É sobre dançar na chuva de vida que cai sobre nós
É saber se sentir infinito num universo tão vasto e bonito, é saber sonhar
Então fazer valer a pena cada verso daquele poema sobre acreditar
Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu
É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu
É sobre ser abrigo e também ter morada em outros corações
E assim ter amigos contigo em todas as situações
A gente não pode ter tudo
Qual seria a graça do mundo se fosse assim?
Por isso eu prefiro sorrisos e os presentes que a vida trouxe pra perto de mim
Não é sobre tudo que o seu dinheiro é capaz de comprar
E sim sobre cada momento, sorriso a se compartilhar
Também não é sobre correr contra o tempo pra ter sempre mais
Porque quando menos se espera a vida já ficou pra trás
Segura teu filho no colo, sorria e abraça os teus pais enquanto estão aqui
Que a vida é trem-bala parceiro e a gente é só passageiro prestes a partir
A minha amada mãe, o exemplo de mulher, minha
inspiração, minha fonte de energia. Ao meu amado pai,
acolhedor à sua forma, muito mais carinhoso do que ele
mesmo imagina ser. Aos meus amados irmãos, Douglas e
Mirella, cuidadosos e presentes, tão fundamentais em
minha vida. Ao Fabio, meu parceiro eterno, exemplo de
honra, caráter, lealdade e amizade. Amo vocês do fundo
do meu coração.
I. Dedicatória
Que nada nos limite, que nada nos defina,
que nada nos sujeite. Que a liberdade seja
nossa própria substância, já que viver é ser
livre. Porque alguém disse e eu concordo
que o tempo cura, que a mágoa passa, que
decepção não mata. E que a vida sempre,
sempre continua.
Simone de Beauvoir
A todas as mulheres que, antes de mim, lutaram
para que eu pudesse estar aqui. A todas as
mulheres que seguem lutando para que nossas
filhas (e as que vierem depois delas) possam ir
mais longe ainda.
II. Agradecimentos
À Profa. Dra. Mary Luci de Souza Queiroz, orientadora deste trabalho, por
me receber tão bem em seu laboratório, por confiar, apoiar e estimular o meu trabalho.
Suas orientações influenciaram não apenas meu desenvolvimento científico, mas
também meu desenvolvimento pessoal. Saiba que sou muito grata por tudo.
A minha querida amiga Samara Eberlin pela amizade acima de tudo, por
todo o auxílio científico e apoio emocional durante o desenvolvimento deste estudo, por
acreditar e confiar no meu trabalho e me oferecer uma oportunidade profissional única.
Por estar sempre por perto e não me deixar esquecer as coisas que realmente importam.
A minha querida amiga Sueli, o coração do laboratório CFU, a mãezona de
todos, sempre atenta e cuidadosa, ouvindo os alunos, aconselhando, dando as merecidas
broncas, mas também os merecidos abraços. Sua amizade é muito importante pra mim.
A Cristiane pela sua contribuição no desenvolvimento deste trabalho.
As queridas Fabiana e Camilla, foi um prazer imenso trabalhar com vocês,
nunca vou me esquecer dos nossos feriados e finais de semana no CFU regados a muito
trabalho e muitas risadas. Vou sempre lembrar com saudosismo desta época.
A Analeda que me auxiliou nos ensaios de citometria de fluxo de forma tão
cuidadosa e dedicada.
A Profª Drª Ana Paula Campanelli, que plantou, regou e cultivou a semente
de cientista que existe dentro de mim.
As minhas amadas amigas-irmãs Patrícia e Adriana, por me conhecerem
melhor que eu mesma, por absolutamente tudo que fizeram nestes nossos longos e bons
anos de amizade. Amo vocês!
Ao amigo Gustavo que sempre me socorreu nas minhas dificuldades com
softwares e afins.
Ao meu tio Celino que sempre esteve ao meu lado independente de tudo, me
ajudando e me apoiando.
A minha família, que me apoiou e incentivou a vida inteira, por estarem sempre
ao meu lado segurando minha mão.
Ao Fabio por acreditar nos meus sonhos junto comigo, por confiar, apoiar,
mesmo quando tudo isso existia apenas na minha cabeça.
Aos meus filhos por me inspirarem e me ensinarem o quanto o amor é capaz de
mover o mundo.
A todos que fizeram parte e me ajudaram com tanta dedicação fazendo com que
tudo isso acontecesse.
Ao Departamento de Farmacologia, ao Hemocentro e ao Hospital das
Clínicas da Unicamp pela equipe, infra-estrutura disponibilizada e todo o apoio durante
a realização deste trabalho.
Ao Grupo Kosmoscience, em especial ao Adriano e a Samara, pela
contribuição técnica e apoio a este trabalho e pela compreensão aos momentos em que
tive que me ausentar para me dedicar a este estudo.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior
(CAPES), pelo apoio financeiro durante o desenvolvimento deste trabalho.
III. Resumo
As cicatrizes queloideanas são definidas como o produto final de um processo
inflamatório crônico que culmina no enrijecimento e crescimento excessivo do tecido
como resultado da deposição excessiva de colágeno. Estudos na literatura mostram que
as citocinas e os fatores de crescimento aumentam a atividade metabólica dos
fibroblastos, ativando caminhos de sinalização intracelular, levando à produção
exacerbada de componentes da matriz extracelular e à consequente formação dessas
cicatrizes. Apesar do grande número de tratamentos disponíveis, os resultados são
inconsistentes e pouco frutíferos com altas taxas de recorrência, além do alto custo
financeiro. Neste contexto, a busca por terapias alternativas que podem atuar para
prevenir a formação dessas cicatrizes é de grande relevância para das indústrias
farmacêutica e cosmética. Desta forma avaliamos neste estudo a capacidade de
modulação in vitro e ex vivo da alga Chlorella e do extrato da planta Rhodiola rosea nos
mecanismos intracelulares da resposta inflamatória na pele, com o objetivo de prevenir
ou minimizar as manifestações clínicas dos queloides. Nossos resultados mostraram que
a alga Chlorella e o extrato da planta Rhodiola rosea modulam parâmetros
imunológicos e fibroproliferativos envolvidos na formação de queloides. Esta atividade
demonstrada por ambas as espécies pode ser considerada uma ferramenta importante na
tentativa de restaurar a atividade metabólica celular normal, contribuindo assim para a
redução da aparência e formação de queloides.
Palavras-chave: Queloide, cicatrização, Chlorella, Rhodiolla rosea.
IV. Abstract
Keloid scars are defined as the end product of a chronic inflammatory process that
culminates in hardening and excessive tissue growth as a result of excessive deposition
of collagen. Studies in the literature show that cytokines and growth factors increase the
metabolic activity of fibroblasts, activating pathways of intracellular signaling, leading
to the exacerbated production of extracellular matrix components and the consequent
formation of these scars. Despite the large number of treatments available, the results
are inconsistent and not very fruitful with high recurrence rates, in addition to the high
financial cost. In this context, the search for alternative therapies that can act to prevent
the formation of these scars is of great relevance for the pharmaceutical and cosmetic
industries. In this study we evaluated the ability of in vitro and ex vivo modulation of
Chlorella algae and Rhodiola rosea extract in the intracellular mechanisms of the
inflammatory response in the skin, with the aim of preventing or minimizing the clinical
manifestations of keloids. Our results showed that Chlorella algae and Rhodiola rosea
plant extract modulate immunological and fibroproliferative parameters involved in the
formation of keloids. This activity demonstrated by both species can be considered an
important tool in the attempt to restore normal cellular metabolic activity, thus
contributing to the reduction of the appearance and formation of keloids.
Key-words: Keloid, Wound Healing, Chlorella, Rhodiola rosea.
V. Lista de Ilustrações
Figura 1. Diagrama do processo de cicatrização de uma ferida onde ocorreu o
rompimento da epiderme e derme (45)........................................................................... 24
Figura 2. Evolução do processo de reparo e regeneração do tecido com formação de
cicatrizes normotróficas, hipertróficas e queloideanas (61). .......................................... 27
Figura 3. Diferentes formas da alga Chlorella. A. Visualização em microscópio
óptico – Aumento de 20x (68). B. Tanques de cultivo da alga (69). C. Alga em formato
pulverizado e comprimido (70). ..................................................................................... 30
Figura 4. Rhodiola rosea. A. Rodhiola rosea em solo arenoso e seco (90). B. Raiz da
planta Rhodiola rosea (91). C. Extrato de Rhodiola rosea (92). .................................... 33
Figura 5. Estrutura química dos principais constituintes fitoquímicos de Rhodiola
rosea. A. Rosavin. B. Rosin. C. Rosarin. D. Salirosídeo (93). ....................................... 35
Figura 6. Fotos de um dos fragmentos de pele provenientes de abdominoplastia antes
de iniciar o processo de assepsia. ................................................................................... 41
Figura 7. Fragmentos de pele normal plaqueados para posterior tratamento com
Chlorella e ERR. ............................................................................................................ 41
Figura 8. Isolamento de fibroblastos normais e derivados de queloides em garrafas de
cultura. ............................................................................................................................ 42
Figura 9. Análise microscópica das culturas primárias de fibroblastos humanos. Cultura
de fragmento de queloide após 3 (A), 7 (B) e 11 (C) dias de incubação. ....................... 42
Figura 10. Efeitos da Chlorella e do extrato de Rhodiola rosea (ERR) sobre a
viabilidade celular de fibroblastos humanos. Fibroblastos foram incubados com
diferentes concentrações (10-0,002mg/mL) de Chlorella e ERR, separadamente,
durante 48 horas e a viabilidade celular foi avaliada pelo método de MTT. A. Chlorella.
B. Extrato de Rhodiola rosea. Os dados representam a média da porcentagem de células
viáveis em relação ao controle obtidos de 3 experimentos independentes..................... 50
Figura 11. Avaliação da viabilidade tecidual de fragmentos de pele humana
mantidos em condições de cultura. Fragmentos de pele humana foram mantidos em
incubadora úmida à 37°C com 5% de CO2 por 5 dias. A avaliação da viabilidade do
tecido foi realizada em intervalos de 24 horas utilizando o corante vital MTT. ............ 51
Figura 12. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de colágeno em
fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram
incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de ERR. A
produção de colágeno foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos
isolados da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e
queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal; ** P <0,01
comparado ao controle queloide; *** P <0,001 em comparação com o controle queloide
(Anova, Tukey). .............................................................................................................. 74
Figura 13. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TGF-β1 em
fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram
incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de ERR. A
produção de TGF-β1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos
isolados da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e
queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal; *** P
<0,001 em comparação com o controle queloide (Anova, Tukey). ............................... 76
Figura 14. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de MMP-1 em
fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram
incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de ERR. A
produção de MMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos
isolados da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e
queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal; *** P
<0,001 em comparação com o controle queloide (Anova, Tukey). ............................... 78
Figura 15. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de IL-6 em
fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram
incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de ERR. A
produção de IL-6 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados
da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide
(KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal; *** P <0,001 em
comparação com o controle queloide (Anova, Tukey). ................................................. 80
Figura 16. Efeitos de Rhodiola rosea na proliferação de fibroblastos de pele
humana. As células foram incubadas por 72 horas na presença ou ausência de
Rhodiolla rosea em diferentes concentrações. A produção de proliferação celular foi
mensurada através da marcação com anti-BrdU e Iodeto de propídeos (PI) e analisada
por citometria de fluxo (FacsCalibur). A e B. Dot plots representativos de pele normal.
C. Fibroblastos obtidos de queloide, tratados com ERR. . #P<0,001 em relação ao
normal. ***P<0,001 em relação ao queloide (Anova, Tukey). ...................................... 82
Figura 17. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de VEGF em
fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram
incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de ERR. A
produção de VEGF foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos
isolados da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e
queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal; *** P
<0,001 em comparação com o controle queloide (Anova, Tukey). ............................... 84
Figura 18. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TIMP-1 em
fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram
incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de ERR. A
produção de TIMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos
isolados da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e
queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal (Anova,
Tukey). ............................................................................................................................ 86
Figura 19. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TIMP-2 em
fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram
incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de ERR. A
produção de TIMP-2 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos
isolados da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e
queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal (Anova,
Tukey). ............................................................................................................................ 87
Figura 20. Efeitos de Chlorella na produção de TIMP-1 em fibroblastos e
fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas
durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de Chlorella. A produção
de TIMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da
pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide
(KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal (Anova, Tukey). 112
Figura 21. Efeitos de Chlorella na produção de TIMP-2 em fibroblastos e
fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas
durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de Chlorella. A produção
de TIMP-2 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da
pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide
(KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal (Anova, Tukey). 113
Figura 22. Efeitos de Chlorella na produção de TIMP-2 em fibroblastos e
fragmentos de pele humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas
durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de Chlorella. A produção
de TIMP-2 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da
pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide
(KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal (Anova, Tukey). 114
VI. Lista de Abreviaturas e Siglas
3R’S SUBSTITUIÇÃO, REDUÇÃO E REFINAMENTO – REPLACEMENT, REDUCTION
AND REFINEMENT
µL MICROLITRO
µG MICROGRAMA
ACTH HORMÔNIO ADRENOCORTICOTRÓFICO
AKT PROTEÍNA QUINASE SERINA/TREONINA
ALA ÁCIDO 5-AMINOLEVULÍNICO
ANVISA AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA
ATCC AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION
BRACVAM CENTRO BRASILEIRO DE VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ALTERNATIVOS
BCRJ BANCO DE CÉLULAS DO RIO DE JANEIRO
BRDU 5-BROMO-2´-DEOXYURIDINA
BSA ALBUMINA DE SORO BOVINO
CAT CATALASE
CFU-GM UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA DE MACRÓFAGOS E GRANULÓCITOS
CM CENTÍMETROS
CNC/MS CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE/ MINISTÉRIO DA SAÚDE
CSA ATIVIDADE ESTIMULADORA DE COLÔNIA
CO2 DIÓXIDO DE CARBONO
DH DIETA HIPERLIPÍDICA
DMEM DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM
EGF FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL
ELISA ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
ERR EXTRATO DE RHODIOLA ROSEA
FB FIBROBLASTO NORMAL
FBQ FIBROBLASTO DERIVADO DE QUELOIDE
FGF FATOR DE CRESCIMENTO DE FIBROBLASTOS
GM-CSF FATOR ESTIMULADOR DE COLÔNIA DE MACRÓFAGOS E GRANULÓCITOS
HCL ÁCIDO CLORÍDRICO
HHA EIXO HIPOTÁLAMO ADRENOCORTICOTRÓFICO
H2O2 PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO
H2SO4 ÁCIDO SULFÚRICO
HFF-1 HUMAN FORESKIN FIBROBLAST 1
IFN INTERFERON
IL INTERLEUCINA
INCQS INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE
IRΒ RECEPTOR DE INSULINA BETA
IRS-1 SUBSTRATO DO RECEPTOR DE INSULINA 1
KEL FIB SKIN KELOID FIBROBLAST
KO KNOCKOUT
LM LYSTERIA MONOCYTOGENES
LTBMC CULTURA LÍQUIDA DE LONGA DURAÇÃO DE CÉLULAS DA MEDULA
ÓSSEA
MCP-1 PROTEÍNA QUIMIOATRATIVA PARA MONÓCITOS 1
MCTI MINISTÉRIO DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E INOVAÇÃO
MEC MATRIZ EXTRACELULAR
MIP-1Α PROTEÍNA INFLAMATÓRIA PARA MACRÓFAGOS 1ALFA
ML MILILITRO
MM MILIMOLAR
M MOLAR
MAPKINASE PROTEÍNA-QUINASE ATIVADA POR MITÓGENOS
MMPS PROTEÍNAS METALOPROTEINASES DE MATRIZ
MRNA ÁCIDO RIBONUCLEICO MENSAGEIRO
MTT 3-(4,5-DIMETILTIAZOL-2-IL)-2,5-BROMETO DE DIFENILTETRAZOLIUM
N NORMAL
NG NANOOGRAMA
NAOH HODRÓXIDO DE SÓDIO
NF-B FATOR NUCLEAR KAPPA B
NK NATURAL KILLER
PB CHUMBO
PI IODETO DE PROPÍDEO
PBS PHOSPHATE BUFFERED SALINE
PDGF FATOR DE CRESCIMENTO DERIVADO DE PLAQUETAS
PDL PULSED-DYE LASER
PG PICOGRAMA
RENAMA REDE NACIONAL DE MÉTODOS ALTERNATIVOS
RER RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO
RNA ÁCIDO RIBONUCLEICO
RPM ROTAÇÃO POR MINUTO
ROS ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
SMAD SMALL MOTHERS AGAINST DECAPENTAPLEGIC
SBF SORO FETAL BOVINO
SNC SISTEMA NERVOSO CENTRAL
SOD SUPER ÓXIDO DISMUTASE
TA TEMPERATURA AMBIENTE
TΒRI RECEPTOR DE TGF-Β1
TΒRII RECEPTOR UBÍQUO DE SERINA TIROSINA QUINASE
TCLE TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
TMB TETRAMETILBENZIDINA
TGF-Β FATOR TRANSFORMADOR DE CRESCIMENTO BETA
TIMPS INIBIDOR TECIDUAL DE METALOPROTEINASES
TNF-Α FATOR DE NECROSE TUMORAL ALFA
UV ULTRAVIOLETA
VEGF FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR
Sumário
1. Introdução ............................................................................................................ 20
1.1. Revisão da Literatura ................................................................................... 21
1.2. A pele e o processo de reparo e regeneração tecidual .................................. 23
1.3. Formação de cicatrizes queloideanas e tratamentos atuais disponíveis ....... 27
1.4. Chlorella....................................................................................................... 30
1.5. Rhodiola rosea ............................................................................................. 33
1.6. Uso de pele ex vivo como modelo alternativo ao uso de animais em pesquisa
37
2. Objetivos .............................................................................................................. 38
3. Material e Métodos .............................................................................................. 39
3.1 Sujeitos da pesquisa ..................................................................................... 39
3.2 Processamento dos Fragmentos de pele ....................................................... 40
3.3 Avaliação da viabilidade dos fragmentos de pele em cultura ...................... 41
3.4 Isolamento das culturas primárias ................................................................ 42
3.5 Caracterização das culturas primárias .......................................................... 43
3.6 Cultivo celular .............................................................................................. 43
3.7 Tratamento das Culturas Celulares .............................................................. 43
3.8 Determinação da viabilidade celular/citotoxicidade .................................... 44
3.9 Quantificação das citocinas e fatores de crescimento IL-6, TGF-β1 e VEGF
44
3.10 Quantificação de Colágeno Total ................................................................. 45
3.11 Mensuração da produção de MMP-1, TIMP-1 e TIMP-2 ............................ 45
3.12 Ensaio de Proliferação celular por Citometria de Fluxo .............................. 46
3.13 Análise estatística ......................................................................................... 47
4. Resultados ............................................................................................................ 48
4.1. Padronização das Concentrações de Tratamento e Avaliação da Viabilidade
Tecidual em Cultura ................................................................................................ 49
4.2. Chlorella....................................................................................................... 52
Comprovante de Submissão. ................................................................................... 52
4.3. Rhodiola rosea. ............................................................................................ 73
4.3.1 Quantificação de Colágeno Total. ................................................................. 73
4.3.2 Quantificação de TGF-β1. ............................................................................. 75
4.3.3 Quantificação de MMP-1. .............................................................................. 77
4.3.4 Quantificação de IL-6. ................................................................................... 79
4.3.5 Avaliação da Proliferação Celular. ............................................................... 81
4.3.6 Quantificação de VEGF. ................................................................................ 83
4.3.7 Quantificação de TIMP-1 e TIMP-2. ............................................................. 85
5. Discussão ............................................................................................................. 88
6. Conclusão ............................................................................................................ 93
7. Referências Bibliográficas ................................................................................... 94
8. Apêndices e Anexos .......................................................................................... 111
Apêndice 1 – Quantificação de TIMP-1 e TIMP-2 após o tratamento com Chlorella
............................................................................................................................... 111
Apêndice 2 – Avaliação da proliferação celular após o tratamento com Chlorella.
............................................................................................................................... 114
Anexo 1 – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa para execução do projeto.
............................................................................................................................... 115
Anexo 2 – Termo de Consentimento livre e esclarecido - TCLE ......................... 117
Introdução 20
1. Introdução
Cicatrizes queloideanas são definidas como produto final de um processo
inflamatório crônico que culmina no crescimento exacerbado e enrijecimento tecidual, em
consequência do excesso de deposição de colágeno (1). Estudos na literatura demonstram que
o aumento na produção de colágeno e na proliferação de fibroblastos é estimulado na
presença de citocinas e fatores de crescimento, tais como, fator de crescimento tecidual beta
(TGF-β), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e interleucina (IL) 6, as quais
levam à produção exacerbada de componentes da matriz extracelular, sendo a colágeno o
principal, além de um aumento na capacidade de migração e o desequilíbrio entre a atividade
das proteínas metaloproteinases de matriz (MMPs) e seus inibidores teciduais (TIMPs), os
quais são decisivos no desenvolvimento destas desordens fibróticas (2–7).
Apesar do número de tratamentos disponíveis, os resultados apresentados são
inconsistentes e muitas vezes frustrantes para o paciente (1,8–15). Dentro deste contexto,
avaliamos neste trabalho a atividade moduladora da alga Chlorella e do extrato da planta
Rhodiola rosea (ERR) sobre os mecanismos intracelulares da resposta inflamatória da pele,
visando prevenir a formação ou minimizar as manifestações clínicas de queloides. Um
aspecto importante na escolha dessas duas espécies consiste na capacidade adaptogênica
apresentada por ambas, o que implica na habilidade de modificar a resposta biológica,
aumentando de forma não específica à resistência do hospedeiro, tornando-o mais apto para
produzir resposta mais adequada frente a diferentes tipos de estresses químicos, físicos,
biológicos e psicogênicos, sem causar distúrbios em parâmetros biológicos normais.
Relevante para o presente trabalho são os resultados anteriores obtidos em nosso
laboratório com as duas espécies aqui propostas. O enfoque destes trabalhos foi original e
pioneiro (16–30), e consiste na escolha de diferentes modelos experimentais in vivo, nos quais
a hematopoese tem papel fundamental no desenvolvimento da doença, visando investigar a
ação adaptogênica de plantas medicinais de domínio popular sobre os mecanismos
reguladores do sistema imunológico e hematopoético.
Introdução 21
1.1. Revisão da Literatura
O processo de cicatrização é realizado por uma cascata de eventos complexos,
dinâmicos e sobrepostos, seguidos de uma reação inflamatória, proliferativa e de remodelação
tecidual (31). As alterações nestes processos fisiológicos resultam na formação de uma
cicatriz patológica denominada queloide, caracterizada pelo crescimento da lesão além das
bordas iniciais (32) e pela regressão não espontânea ao longo dos anos (33).
Os queloides e as cicatrizes hipertróficas são causados por lesões e irritação
cutânea, incluindo trauma, mordida de inseto, queimadura, cirurgia, vacinação, piercing, acne,
foliculite, varíola e infecção por herpes zóster. Lesões superficiais que não atingem a derme
reticular nunca causam cicatrizes queloideanas. Isto sugere que estas cicatrizes patológicas
são devidas a lesões nesta camada de pele e, subsequente, cicatrização anormal da lesão,
caracterizada por inflamação contínua e histologicamente localizada. Como resultado, a
camada reticular de queloides e cicatrizes hipertróficas contêm células inflamatórias, aumento
do número de fibroblastos, vasos sanguíneos recém-formados e depósitos de colágeno (34).
Embora os queloides e as cicatrizes hipertróficas geralmente sejam observados
em torno de 3 meses após a lesão, isso meramente reflete o fato de que a inflamação da derme
reticular, que começa imediatamente após a lesão inicial, só se torna visível através da
epiderme a olho nu neste momento. Além disso, no caso de feridas cirúrgicas, pacientes e
médicos tendem a acreditar de forma equivocada que a ferida suturada amadureceu quando as
suturas são removidas. Isso ocorre porque neste ponto (ou seja, 7-14 dias após a cirurgia), a
epiderme se regenerou e a ferida está fechada e seca. No entanto, nesta fase, a matriz dérmica
ainda está amadurecendo e há inflamação em curso na derme reticular. Se, neste momento, a
camada reticular é submetida à estimulação externa e/ou interna, a inflamação não diminui e,
em vez disso, se torna cada vez mais pronunciada. Isso resulta em cicatrizes patológicas que
eventualmente se tornam aparentes alguns meses após a cirurgia. A intensidade, a frequência
e a duração dos estímulos determinam a rapidez com que as cicatrizes aparecem, a direção, a
velocidade do crescimento e a intensidade dos sintomas. Os estímulos que influenciam as
características e a quantidade de queloides e cicatrizes hipertróficas incluem uma variedade de
fatores locais, sistêmicos e genéticos. Consequentemente, é provável que as diferenças
clínicas entre queloides e cicatrizes hipertróficas apenas reflitam diferenças na intensidade,
frequência e duração da inflamação da derme reticular (35,36).
Em termos de fatores de risco sistêmicos, a adolescência e a gravidez parecem
associar-se a um maior risco de desenvolver cicatrizes patológicas (37,38). Pode ser que os
Introdução 22
hormônios sexuais, como os estrógenos e os andrógenos, tenham efeitos vasodilatadores que
intensifiquem a inflamação, promovendo o desenvolvimento de cicatrizes patológicas ou
piorando cicatrizes existentes. O aumento dos níveis de esteroides sexuais no início da
adolescência é responsável pelo maior risco de desenvolvimento de cicatrizes patológicas em
adolescentes. Em um estudo foi demonstrado que a hipertensão se associa ao
desenvolvimento de queloides graves (39). Esse estudo, envolvendo 304 pacientes, com
queloides avaliou se a hipertensão arterial, um fator sistêmico, influencia a gravidade da
cicatriz patológica. As análises de regressão logística ordinal mostraram que a pressão arterial
associou-se significativamente e positivamente com o tamanho e o número de queloides. Este
estudo fornece evidências epidemiológicas sobre a possibilidade de que a hipertensão possa
agravar o desenvolvimento dos queloides. Esta associação pode refletir o fato de que a
hipertensão danifica os vasos sanguíneos, aumentando assim a inflamação no tecido local,
levando a um processo de inflamação prolongada que, por si só, é um fator de risco para o
desenvolvimento e/ou progressão destas cicatrizes patológicas.
A literatura relata o caso de uma mulher adulta cujos queloides auriculares
foram agravados durante o curso de sua doença de Castleman. A doença de Castleman é uma
desordem linfoproliferativa rara que se caracteriza pela superprodução não regulada de IL-6,
levando a linfadenopatia sistêmica e sintomas inflamatórios constitucionais. Acredita-se que a
inflamação sistêmica seja responsável pelo desenvolvimento de cicatrizes hipertóficas em
pacientes submetidos à cirurgia reconstrutiva de queimaduras extensas: queimaduras graves
iniciais associam-se a uma massiva produção de citocinas que aumentam significativamente o
risco de desenvolver queloides e cicatrizes hipertróficas durante pelo menos 1 (um) ano (34).
A literatura clássica considera que os queloides e as cicatrizes hipertróficas são
tipos distintos de cicatrizes. Os clínicos definem cicatrizes hipertróficas como cicatrizes que
não crescem além dos limites da ferida original e os queloides como cicatrizes que se
espalham pela pele normal circundante. Em contrapartida, os patologistas fazem uma
distinção histológica entre queloides e cicatrizes hipertróficas com base na presença de
colágeno eosinofílico (hialinizantes), sendo que estes estão presentes em maior quantidade
nos queloides, quando comparado a cicatrizes hipertróficas. No entanto, existem muitos casos
em que a cicatriz apresenta o crescimento e as características histológicas das cicatrizes
hipertróficas e queloides concomitantemente. Notavelmente, observa-se que as cicatrizes que
se espalham na pele normal circundante tendem a ter um grande volume de colágeno
hialinizado e muitos vasos sanguíneos, enquanto que aqueles que não crescem além dos
limites da ferida original geralmente têm um pequeno volume de colágeno hialinizado e
Introdução 23
poucos vasos sanguíneos. Assim, é possível que as cicatrizes hipertróficas e os queloides
sejam, na verdade, manifestações da mesma doença fibroproliferativa da pele e apenas
diferem na intensidade e duração da inflamação (35,36).
Essas características podem, por sua vez, ser influenciadas por fatores de risco
locais, sistêmicos e genéticos. Foi relatado que fatores pró-inflamatórios, como IL-1α, IL-1β,
IL-6 e TNF-α, são regulados positivamente nos tecidos de queloides (40,41). Como resultado,
Dong e colaboradores (40) especularam que os genes pró-inflamatórios na pele de pacientes
com queloides são sensíveis ao trauma, ou seja, que eles tendem a serem mais rapidamente
ativados sobre lesões na derme e mais propensos a manter essa regulação positiva do que os
mesmos genes em outras pessoas. Isso resulta em inflamação crônica que também explica o
crescimento invasivo dos queloides. Além disso, a regulação positiva de fatores pró-
inflamatórios em queloides sugere que, ao invés de serem classificados como tumores de pele,
os queloides e as cicatrizes hipertróficas são distúrbios inflamatórios da pele, especificamente
distúrbios inflamatórios da derme reticular.
1.2. A pele e o processo de reparo e regeneração tecidual
Anatomicamente, a pele atua como uma interface entre o meio externo e a
homeostase interna, atuando como um órgão complexo com múltiplos tipos de células e
estruturas, o qual pode ser dividido em três camadas distintas: derme, epiderme e hipoderme
(42).
A ação dos diferentes fatores ambientais ou endógenos no tecido cutâneo pode
promover estímulos iniciais para o desencadeamento de uma resposta inflamatória,
culminando em um dinâmico processo de migração celular, transmissão de sinais e
processamento da informação, que pode ocorrer de maneira benéfica ou prejudicial para o
hospedeiro. Estudos revelam que uma resposta inflamatória exagerada induz a produção
excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) que excede a capacidade antioxidante da
célula, resultando em uma condição conhecida por estresse oxidativo (43). Este ambiente
inibe a migração e proliferação celular, causando um dano tecidual que culmina na
perpetuação da inflamação (44,45).
O processo de regeneração da pele se inicia imediatamente após o dano
tecidual e consiste em três fases distintas: inflamação, proliferação e maturação. Estas fases
ocorrem através de uma complexa e bem organizada interação entre tecidos, células, fatores
Introdução 24
de crescimento e proteases, buscando uma completa regeneração do tecido (46,47). A figura 1
representa um diagrama do processo de cicatrização de uma ferida onde ocorreu o
rompimento da epiderme e derme.
Figura 1. Diagrama do processo de cicatrização de uma ferida onde ocorreu o rompimento da epiderme e derme (48
- adaptado).
A lesão da pele ocorre quando a camada epidérmica é violada, expondo a
derme subjacente ao ambiente. O reparo temporário é realizado através da fixação de um
coágulo de fibrina, que impede o contato da ferida com o ambiente. Em decorrência da lesão
os queratinócitos passam a produzir IL-1 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), alertando as
células ao redor da lesão, o que resulta em um aumento do infiltrado de células inflamatórias.
As plaquetas, além de liberarem o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF),
secretam também o fator de crescimento epidérmico (EGF), TGF-β e diversas quimiocinas,
Introdução 25
ativando e recrutando células e estimulando a primeira fase de proliferação das
células epidérmicas, fibroblastos e células endoteliais (46,49).
As células inflamatórias desempenham um papel importante na cicatrização,
sendo os neutrófilos as primeiras células que chegam à lesão atuando na remoção de debris e
contaminação bacteriana, além de secretarem citocinas pró-inflamatórias que ativam os
fibroblastos e queratinócitos locais.
Após alguns dias, os neutrófilos são substituídos por macrófagos derivados da
corrente sanguínea, que produzem mais citocinas e fatores de crescimento essenciais para
a cicatrização da lesão, dentre estas citocinas, IL-1 e TNF-α, induzem a via de transcrição do
fator nuclear-κB (NF-κB) e a produção dos fatores de crescimento FGF (fator de crescimento
de fibroblastos), TGF-β e EGF que amplificam os sinais produzidos por neutrófilos e
plaquetas. Além disso, esses fatores de crescimento sintetizados pelos macrófagos são
essenciais para a migração e proliferação das células epiteliais, resultando no início do
processo de re-epitelização (46).
Ishida e colaboradores demonstraram um envolvimento essencial de IL-6
durante o processo de regeneração do tecido através do uso de camundongos IL-6 knockout
(KO), seus resultados evidenciaram que estes animais apresentam uma cicatrização mais lenta
(50). Outros estudos revelaram que a ausência do receptor antagonista para IL-1 em
camundongos culmina em uma bioatividade exacerbada de IL-1, resultando em um
favorecimento da resposta inflamatória e consequente diminuição da regeneração do tecido
(51). Por outro lado, a ausência do receptor de TNF p55 reduz a resposta inflamatória e
favorece a angiogênese e a produção de colágeno, acelerando a regeneração do tecido (52).
Adicionalmente, a expressão dos genes para a proteína quimioatrativa para
monócitos 1 (MCP-1) e a proteína inflamatória para macrófagos 1α (MIP-1α), predominante
no recrutamento de macrófagos/monócitos, é essencial para um reparo tecidual normal (43).
Para evidenciar o papel dos macrófagos no controle do reparo tecidual,
diversos estudos analisaram o processo de regeneração de tecido em modelos experimentais
que envolviam a depleção de macrófagos, os resultados destes trabalhos demonstraram que a
ausência destas células influencia negativamente na etapa de re-epitelização, formação do
tecido de granulação, angiogênese, produção de citocinas cicatrizantes e na contração da lesão
associada aos miofibroblastos (53).
Cerca de quatro dias após a lesão, o tecido de granulação está completamente
formado e os macrófagos passam a secretar VEGF e FGF, aumentando o infiltrado de
Introdução 26
fibroblastos e provendo a angiogênese, este processo de neovascularização é fundamental
para a síntese, deposição e organização da nova matriz extracelular (MEC).
Para que a formação da MEC seja bem sucedida é necessário que ocorra o
processo de revascularização, acompanhado da remoção do tecido de granulação, que será
substituído por um conjunto de fibras de elastina e colágeno saturado com proteoglicanas e
glicoproteínas. Este processo é seguido por uma remodelação do tecido que envolve a síntese
de um novo colágeno, mediada por TGF-β, resultando em um tecido de cicatrização. A
transição do tecido de granulação para o tecido de cicatrização é dependente de um processo
contínuo de síntese e degradação do colágeno, que será controlado por diversas enzimas
MMPs que são secretadas por macrófagos, células epidérmicas, células endoteliais e
fibroblastos (49).
Até agora, mais de 25 diferentes MMPs humanas foram identificadas. A
atividade destas enzimas é precisamente regulada por seus inibidores, os TIMPs. Citocinas,
quimiocinas e fatores de crescimento estão envolvidos na regulação das atividades destas
enzimas e em sua interação. O fator de crescimento TGF-β induz a expressão de MMP-9 que
é importante para a remodelação da matriz e para angiogênese e também induz a regulação de
MMP-1, sustentando assim o sutil equilíbrio entre a síntese e a degradação da matriz (54–56).
Outros reguladores cruciais de MMPs são as interleucinas, podendo citar a IL-1 que leva a
liberação de MMP-1, MMP-3, MMP-9 e à inibição de TIMP-1 em fibroblastos.
Introdução 27
1.3. Formação de cicatrizes queloideanas e tratamentos atuais disponíveis
Os queloides constituem desordens fibróticas que podem ser desfigurantes e
afetar adversamente a qualidade de vida do indivíduo por causar estresse tanto físico quanto
psicológico (57). Ao contrário de outras cicatrizes, como as hipertróficas, por exemplo, que
não se estendem além da ferida original, os queloides, mesmo quando oriundos de pequena
lesão tecidual, podem atingir extensas áreas do corpo, especialmente após procedimentos
cirúrgicos. Estas lesões podem crescer durante meses e causar desconforto importante devido
à dor e ao prurido local, além de não serem esteticamente aceitos pela sociedade. Na prática
diária, o tratamento e prevenção dessas desordens constituem um desafio comum às diversas
especialidades médicas. Embora existam fatores prognósticos importantes a serem avaliados,
frequentemente é difícil prever o desenvolvimento de uma cicatriz indesejada (8).
O reparo e regeneração tecidual cutânea constituem um processo dinâmico e
orquestrado de eventos inflamatórios, proliferação celular e remodelamento tecidual que se
inicia logo após o rompimento da barreira epidérmica, envolvendo vários tipos celulares,
mediadores solúveis e componentes da MEC (46,50). A evolução natural deste processo é a
formação de uma cicatriz normotrófica e, consequentemente, uma pele com textura e
consistência semelhantes à anterior ao trauma. Entretanto, a desarmonização nas etapas do
processo de cicatrização pode levar a condições patológicas, tais como as cicatrizes
hipertróficas e queloideanas (Figura 2) (58,59).
Figura 2. Evolução do processo de reparo e regeneração do tecido com formação de cicatrizes normotróficas,
hipertróficas e queloideanas (60).
Cicatrizes queloideanas são definidas como produto final de um processo
inflamatório crônico induzido por uma variedade de estímulos que culminam no crescimento
Introdução 28
exacerbado e enrijecimento tecidual, em consequência do excesso de deposição de colágeno
(1,61). Essas cicatrizes podem surgir após qualquer trauma cutâneo que alcance a derme,
como lacerações, abrasões, cirurgias, piercings, vacinação e queimaduras (62). O queloide
ocorre predominantemente em indivíduos predispostos, como negros e hispânicos, com uma
prevalência entre 4,5 e 16%, sendo também resultado da excessiva formação do tecido de
cicatrização devido a uma alteração no processo de reparo tecidual (8,63). Na literatura,
diversas hipóteses sobre a patogênese da formação dos queloides são discutidas, incluindo
alteração na regulação de fatores de crescimento, disfunção imune, produção exacerbada de
colágeno, entre outros (3).
Está estabelecido que os processos de proliferação e migração desregulada dos
fibroblastos derivados de queloides estão intimamente envolvidos na formação destas
cicatrizes, através da síntese exacerbada de componentes da MEC (64). Fibroblastos
derivados de queloides apresentam um padrão de migração para o centro da lesão mais
intenso do que aquele apresentado por fibroblastos normais (6), este aumento na capacidade
de migração e o desequilíbrio entre a atividade das MMP e seus inibidores TIMPs são
decisivos no desenvolvimento da formação de desordens fibróticas, entretanto o
conhecimento exato da patofisiologia destas lesões é uma questão ainda aberta na literatura
(2–4,65).
O TGF-β, VEGF e a IL-6 são descritos por desempenhar papel importante na
patologia do queloide (66–68). Estes fatores aceleram a migração celular através da
estimulação da produção de colágeno e da proliferação de fibroblastos derivados de queloides.
Muitos grupos de pesquisa estudam a relação potencial entre a expressão anormal de fatores
de crescimento, citocinas e a migração celular estimulando a formação de cicatrizes
queloideanas (5–7).
As terapias atuais utilizadas no tratamento de cicatrizes queloideanas se
baseiam na redução da resposta inflamatória local atuando em diferentes parâmetros
importantes no processo inflamatório durante o reparo do tecido. Dentre as técnicas utilizadas
para a redução do excesso de tecido de cicatrização temos a crioterapia, a qual é pouco
utilizada por poder induzir dano vascular, estase circulatória, formação de trombose, anóxia e
eventual necrose, além da hipopigmentação e dor pós-operatória (1,69). Da mesma forma, a
incisão cirúrgica, por estar associada à radioterapia, apresenta resultados duvidosos quanto à
indução carcinogênica (47). O uso de laser tipo PDL (pulsed-dye laser) apresenta custo
elevado, além do risco considerável de recidivas (1,70).
Introdução 29
Outra prática terapêutica consiste em intervenções farmacológicas em níveis
sub-celular e celular, com o objetivo de corrigir o metabolismo anormal do colágeno e a
produção de citocinas, entre elas o TGF-β, e modular tanto as respostas imunológicas e
inflamatórias como as propriedades mecânicas do reparo tecidual. Apesar de ser uma
aproximação metodológica mais promissora, os compostos disponíveis para este tipo de
tratamento também apresentam efeitos indesejáveis. Os corticosteróides constituem os
fármacos mais utilizados e os seus efeitos adversos consistem principalmente em discromia
cutânea, atrofia dérmica, telangectasias e dor durante a injeção (1). Antineoplásicos, como o
5-fluorouracil e a bleomicina, além da conhecida toxicidade sistêmica, levam também à dor
local intensa, hiperpigmentação, atrofia dérmica e formação de gangrena (1,71). A aplicação
intralesional de interferon (IFN) também é acompanhada de sintomatologia de gripe, além da
produção de dor e do alto custo deste tratamento (1). Outros ativos, incluindo tacrolimus,
imiquimode, tamoxifeno, toxina botulínica, extrato de Allium cepa e curcumin, vêm sendo
descritos, porém a ausência de estudos específicos inviabilizam suas aplicações (1,9–14).
Apesar do número de tratamentos existentes para o manejo das cicatrizes
queloideanas, os resultados apresentados têm sido inconsistentes e muitas vezes frustrantes.
Não há dados conclusivos na maioria dos estudos sobre eficácia terapêutica e segurança dos
métodos empregados, devido principalmente à falta de grupos-controle específicos, ao
tamanho e qualidade inadequados da amostra utilizada, e ao tempo de avaliação. Além disso,
o próprio mecanismo de ação e os efeitos colaterais da maioria dessas terapias são
controversos e podem prejudicar o estado geral do paciente, particularmente no pós-cirúrgico
(1,8–15,71,72).
Considerando a alta taxa de reincidência das lesões e o alto custo dos
tratamentos atuais disponíveis para o tratamento das cicatrizes queloideanas, o
desenvolvimento de uma linha de pesquisa que trabalhe com o conceito de prevenção destas
cicatrizes é inovador e de grande relevância para o segmento dermatológico. Neste contexto,
avaliamos em nosso trabalho o potencial de modulação da resposta biológica da pele da alga
Chlorella e pelo extrato da raiz de Rhodiola rosea.
Introdução 30
1.4. Chlorella
Chlorella, anteriormente identificada como Chlorella vulgaris, é uma alga
verde unicelular microscópica de água doce, da família Oocystacae, com capacidade de auto-
reprodução (Figura 3). Reconhecida principalmente pela sua rica composição de nutrientes
essenciais para a manutenção da autodefesa natural do indivíduo, esta alga possui clorofila,
beta caroteno, vitaminas, proteínas, minerais, enzimas, entre outros (73–76). Sua atividade
adaptativa ou modificadora da resposta biológica é definida pela capacidade de reduzir no
organismo os níveis de hormônios relacionados com o estresse. Resultados produzidos pelo
nosso grupo demonstram que em presença de condições adversas, o hospedeiro que vem
recebendo Chlorella como complemento alimentar é capaz de reagir mais prontamente e com
maior vigor na indução de mecanismos essenciais da defesa imunológica (19–
23,25,26,28,30).
Figura 3. Diferentes formas da alga Chlorella. A. Visualização em microscópio óptico – Aumento de 20x (77). B.
Tanques de cultivo da alga (78). C. Alga em formato pulverizado e comprimido (79).
Em estudos anteriores, com o auxílio de modelos experimentais in vivo, nos
quais a hematopoese tem um papel fundamental, investigamos os efeitos da alga sobre os
mecanismos reguladores do sistema imunohematopoético, visando aumentar ou restabelecer
as defesas do próprio hospedeiro, capazes de inibir processos malignos e infecciosos (20–
22,24–28,30). Nossos resultados demonstram o efeito da alga na restauração da
mielossupressão produzida pela evolução destas doenças através da normalização do número
reduzido de precursores hematopoéticos para granulócitos e macrófagos na medula óssea.
Estes resultados são importantes, uma vez que a redução no número de progenitores
hematopoéticos na medula óssea representa um efeito agudo decorrente do rápido crescimento
de certos tumores e da evolução de certos quadros infecciosos. Uma observação importante
A B C
Introdução 31
nestes estudos é que a reversão pela alga da mielossupressão induzida pelo agente agressor é
acompanhada de aumento no tempo ou na taxa de sobrevida (20–28,30).
O aumento na taxa ou duração da sobrevida e a prevenção da mielossupressão
ocorreram paralelamente a um aumento significativo nos níveis in vitro de diferentes citocinas
pró-inflamatórias e hematopoéticas, IFN-, IL-2, TNF-α, IL-12, IL-1, fator estimulador do
crescimento de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), as quais são essenciais na recuperação
do hospedeiro (23,25,30,73,80). Estes achados corroboram trabalhos da literatura que
demonstram a capacidade da Chlorella em aumentar a expressão gênica de citocinas ativas no
sistema hematopoético (73,80). A atividade das células natural killer (NK), potentes indutoras
da produção de INF-, também está aumentada na presença de Chlorella (23,28,30).
A presença de radicais sulfidrila é outro atributo desta alga, fato que justifica
seu uso in vitro na remoção de metais tóxicos. Em estudos recentes sobre o efeito quelante de
Chlorella em animais expostos ao chumbo (Pb), observamos reduções significativas nos
níveis do metal no sangue e em órgãos alvo, como ossos e rins em animais expostos ao metal
e tratados com a alga. Além disso, a alga restaurou as concentrações elevadas de ácido 5-
aminolevulinico (ALA) no fígado e plasma, assim como a taxa de síntese de heme e de seus
precursores em animais expostos ao metal (20,24,30).
Em animais expostos ao Pb foram também analisados os efeitos do tratamento
com Chlorella sobre a interação entre as células do estroma da medula óssea e as células
hematopoéticas, utilizando a cultura líquida de longa duração de células da medula óssea
(LTBMC). A atividade funcional foi avaliada pela capacidade das células estromais não
aderentes de promoverem in vitro o crescimento e diferenciação de células progenitoras
comprometidas com a linhagem granulócito-macrófago (CFU-GM). Os resultados
demonstraram que o tratamento com Chlorella de camundongos expostos ao Pb restaura tanto
a reduzida capacidade das células estromais de produzirem CFU-GM, quanto os níveis
reduzidos de IL-6, induzidos pelo metal (30). Estes resultados sugerem que a capacidade de
Chlorella em reduzir o conteúdo de Pb nos tecidos do corpo, em associação com seu efeito
modulador sobre a atividade de citocinas hematopoéticas, pode inibir os efeitos
imunossupressores do Pb sobre a atividade hematopoética na medula óssea e desta forma
potencializar a vigilância imunológica.
Outro aspecto relevante dos efeitos de Chlorella consiste na modulação da
resposta ao estresse físico e psicogênico (21,22). O estresse ativa o eixo hipotálamo-hipófise-
adrenal (HHA) para produção de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e liberação de
glicocorticóides. Nesse sentido, Hasegawa e colaboradores (2000) demonstraram que a
Introdução 32
Chlorella pode prevenir os efeitos imunossupressores do estresse psicológico induzido em
camundongos que observam outros animais recebendo choque na pata (foot-shock), através da
inibição da produção de corticosteróides endógenos. O fato desta alga estimular a produção de
citocinas como IL-1 e TNF-, as quais deprimem a síntese de glicocorticóides, dão suporte a
estes achados (73,80).
Em outro trabalho, avaliamos o crescimento e diferenciação de granulócitos e
macrófagos na medula óssea de ratos tratados com Chlorella, infectados com a bactéria
Lysteria monocytogenes (LM) e expostos a estressores físicos e psicogênicos. Nossos
resultados demonstraram que o impacto das duas modalidades de estresse aumentou de forma
similar tanto a severidade quanto a duração da mielossupressão produzida pela infecção,
sendo que este efeito foi completamente revertido no grupo estressado/infectado tratado com
a alga. A investigação dos mecanismos subjacentes à proteção produzida pela Chlorella
demonstrou aumentos significativos na atividade estimuladora hematopoética do soro,
paralelamente à normalização dos níveis reduzidos de IFN-γ e dos níveis aumentados de IL-
10, observados após exposição aos dois tipos de estressores. A avaliação da sobrevida frente a
uma dose letal de LM revelou cura de 50% no grupo apenas infectado e de 20% no grupo
estressado/infectado. Estes resultados sugerem que o tratamento com Chlorella constitui
ferramenta eficaz na profilaxia da mielossupressão pós-estresse, mesmo com o agravamento
do quadro clínico decorrente da presença de um estresse adicional, no caso, a infecção (21).
Em um estudo desenvolvido recentemente em nosso laboratório avaliou-se a ação
profilática da Chlorella na modulação imunohematopoética, metabólica e de sinalização da
insulina em animais obesos por administração de dieta hiperlipídica (DH). A administração de
Chlorella restaurou a redução da hematopoese medular e o aumento na hematopoese extramedular
promovidos pela DH. A Chlorella aumentou os níveis de atividade estimuladora de colônias
(CSA) em todos os grupos estudados, sendo que o grupo DH+Chlorella produziu um aumento
adicional de 2 vezes em todos os períodos avaliados. O grupo DH apresentou diminuição no
número de progenitores de granulócitos-monocítico na medula, a Chlorella reverteu tal alteração.
Em relação ao metabolismo e sinalização de insulina, o grupo DH demonstrou glicemia
significativamente elevada em relação ao grupo controle, o tratamento com Chlorella foi capaz de
reduzi-la neste grupo. Além disso, o grupo DH+Chlorella mostrou maior tolerância à glicose e
insulina, paralelamente a melhora na fosforilação do receptor de insulina beta (IRβ), do substrato
para o receptor de insulina 1 (IRS-1) e das proteínas quinases serina/treonina (AKT) no fígado,
músculo esquelético e tecido adiposo. Como esperado, o grupo DH apresentava níveis elevados
de citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6, TNF-α, TGF-β e INFγ) confirmando a presença de
Introdução 33
inflamação subclínica nesses animais. A Chlorella reduziu significativamente os níveis séricos
dessas citocinas. Além disso, o grupo DH apresentou diminuição dos níveis de IL-10, sendo que a
Chlorella reverteu tais valores (16,18).
Outros achados da literatura revelaram que a Chlorella apresenta um efeito
inibitório na produção de MMP-1 e MCP-1 induzida por ultravioleta (UV) B em cultura de
fibroblastos da pele (81), provavelmente devido ao seu potencial anti-oxidativo, que reduz o
estresse tecidual que poderia acarretar a um processo inflamatório.
1.5. Rhodiola rosea
Rhodiola rosea L., também conhecida como “golden root”, “rose root” ou
“arctic root” pertence à família Crassulaceae e caracteriza-se por seu crescimento em solo
arenoso e seco das regiões árticas de altitudes elevadas da Europa e Ásia (Figura 4). Atinge
em média 70 cm, produz flores amarelas e possui uma raiz fina, onde encontram-se presentes
seus principais constituintes químicos (82). É uma planta popular na medicina tradicional da
Europa e Ásia, onde é conhecida por suas atividades estimulantes sobre o sistema nervoso
central, anti-depressiva, indutora de melhora da performance física, anti-fadiga e profilática
contra afecções respiratórias comuns em regiões de altitudes elevadas (83,84). Além de R.
rosea, mais de 200 espécies de Rhodiola já foram identificadas, sendo que 20 delas são
utilizadas na prática médica tradicional asiática, incluindo R. alterna, R. brevipetiolata, R.
crenulata, R. kirilowii, R. quadrifida, R. sachalinensis e R. sacra (84,85).
Figura 4. Rhodiola rosea. A. Rodhiola rosea em solo arenoso e seco (86). B. Raiz da planta Rhodiola rosea (87). C.
Extrato de Rhodiola rosea (88).
R. rosea tem sido categorizada como uma planta adaptógena por pesquisadores
russos que observaram a sua habilidade em aumentar a resistência do hospedeiro frente uma
variedade de insultos químicos, físicos e biológicos (84). A origem do termo adaptógeno é
A B C
Introdução 34
datada de 1947 e creditada ao cientista russo Lazarev, que considera esta classificação para
qualquer substância que, de forma não-específica, aumenta a resistência do organismo sem
causar distúrbios em parâmetros biológicos normais (82,84,89). Inerente a esta definição está
o conceito de que a administração de um agente adaptógeno prepara o organismo de forma a
torná-lo mais capaz de responder apropriadamente frente a futuros insultos (84). Em
contrapartida, (89) propuseram um critério que precisa ser levado em consideração para
considerar uma substância adaptógena; são eles: 1- produzir uma resposta não-específica no
organismo, por exemplo, um aumento da resistência contra múltiplos agentes agressores, 2-
apresentar uma influência que conduza à normalização da resposta fisiológica, e 3- ser
incapaz de influenciar as funções normais do organismo mais do que aquela requerida para a
promoção de uma resistência não específica (82,84,89).
De maneira similar a outras plantas adaptógenas, como Eleutherococcus
senticosus (Siberian ginseng) e Panax ginseng (Korean ginseng), estudos demonstram que
extratos de R. rosea promoveram favoráveis mudanças neuroendocrinológicas relacionadas ao
estresse e à depressão, incluindo aumento no nível de neurotransmissores, melhora da
atividade central e da função cardiovascular (90).
Estudos em cultura de células, animais e humanos têm revelado importantes
atividades de R. rosea, tais como: anti-fadiga (91), anti-estresse (92,93), anti-hipóxica,
cardioprotetora (90), anti-câncer (94), antioxidante (95) e imunoestimulante (96).
Extratos padronizados de R. rosea têm sido encontrados em importantes
preparações comerciais utilizadas na Europa, Ásia e, mais recentemente, nos Estados Unidos,
com ações biológicas que incluem atividade antialérgica, antiinflamatória, aumento da
capacidade mental, dentre uma variedade de outras ações terapêuticas (85,97).
A esfera de aplicação terapêutica dos extratos de R. rosea é facilmente
compreensível e depende exclusivamente da sua vasta composição química (98). Estudos
fitoquímicos das raízes de R. rosea têm revelado a presença de flavonóides, proantocianidina
tirosol e seu glicosídeo salirosídeo, glicosídeos fenilpropanóides derivados do ácido cinâmico
– rosavin, rosin e rosarin, - sitosterol, antraglicosídeos, bem como outros glicosídeos, ácidos
orgânicos, óleos etéricos, açúcares, ácidos graxos, álcoois específicos e proteínas. Dentre esta
vasta composição, acredita-se que os principais compostos responsáveis pelas ações
farmacológicas conhecidas dos extratos de R. rosea são o fenilpropanóide tirosol, seu
glicosídeo salirosídeo (p-hydroxyphenylethyl-O-b-D-glucopyranoside) (aproximadamente 1%
massa seca) e os fenilpropanóides (aproximadamente 3% da massa seca) rosin (cinnamyl-O-
b-D-glucopyranoside), rosarin (cinnamyl- (6-O-a-L-arabinofuranosyl) -O-b-D-
Introdução 35
glucopyranoside) e rosavin (cinnamyl- (6-O-a L-arabinopyranosyl) -O-b-D-glucopyranoside),
aos quais são atribuídas as ações antioxidantes e neuroestimulantes (99). A figura 5 ilustra a
estrutura química dos principais constituintes fitoquímicos de R. rosea.
Figura 5. Estrutura química dos principais constituintes fitoquímicos de Rhodiola rosea. A. Rosavin. B. Rosin. C.
Rosarin. D. Salirosídeo (100).
Estudos realizados com diferentes extratos de raízes de R. rosea, padronizados
em rosavins totais e salirosídeo, caracterizaram-nos por sua ação antidepressiva e estresse-
protetora, aliviando desordens emocionais, mentais e físicas (92,93,98,101), reduzindo a
severidade da exaustão após atividade física intensa (102,103), elevando as concentrações de
norepinefrina, dopamina e serotonina no cérebro, e atuando como um agonista nicotínico
colinérgico no sistema nervoso central SNC (98). Atletas profissionais que utilizaram estes
A
B
C
D
Introdução 36
extratos para incremento da atividade física apresentaram estimulação dos processos
anabólicos na musculatura esquelética, aumento da resistência durante exercício físico
máximo e obtiveram uma subseqüente proteção do sistema cardiovascular (102,103). Além
disso, R. rosea é também um estimulante do sistema imunológico e muitas investigações tem
apontado seu papel anti-câncer (84) e sua ação citotóxica seletiva sobre diferentes tipos de
células tumorais (98).
Em um estudo conduzido por nosso laboratório avaliou-se a ação in vitro e in
vivo do extrato de Rhodiola rosea em associação com o dipeptídeo L-carnosina sobre a
reversão ou controle dos efeitos deletérios da radiação ultra-violeta sobre a pele. Nossos
resultados demonstram que durante a foto-exposição, culturas celulares in vitro apresentaram
importantes alterações nos parâmetros avaliados, especialmente após a exposição crônica,
dentre elas: redução na produção de IL-1a, TNF-α e IFN-y, redução nos níveis de β-endorfina
e encefalina, aumento na atividade de MMPs, inibição na atividade de TIMP-1, redução nos
níveis de colágeno e elastina e redução na atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD)
e catalase (CAT). No perfil de resposta das células tratadas com ERR, pudemos observar uma
importante função adaptógena do extrato, onde na maioria dos parâmetros, constatamos uma
modulação da resposta celular de forma dose dependente (104).
Introdução 37
1.6. Uso de pele ex vivo como modelo alternativo ao uso de animais em
pesquisa
No presente estudo conduzimos uma série de ensaios pré-clínicos para confirmar
a eficácia destes dois agentes naturais anteriormente descritos, a escolha dos modelos
experimentais para conduzir as avaliações foi direcionada pelo importante momento científico
brasileiro de incentivo a implantação e desenvolvimento de metodologias alternativas ao uso
de animais em pesquisa, seguindo a tendência mundial dos 3R’s (Substituição, Redução e
Refinamento - Replacement, Reduction and Refinement).
O princípio dos 3R’s foi desenvolvido há mais de 50 anos como um marco para
a pesquisa animal, sendo gradativamente incorporado na legislação mundial que regulamenta
o uso de animais em procedimentos científicos. Hoje, os 3R’s são cada vez mais vistos como
uma base para a realização de ciência de alta qualidade nos setores acadêmico e industrial
com foco no desenvolvimento de abordagens alternativas que evitem o uso de animais,
incluindo a necessidade de desenvolvimento de melhores modelos e ferramentas que reflitam
mais de perto a biologia humana e predigam a eficácia e a segurança de novos medicamentos
e, principalmente, cosméticos.
O compromisso brasileiro, com a validação de métodos alternativos, resultou na
criação da Rede Nacional de Métodos Alternativos (RENAMA) em julho de 2012 pelo
Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (MCTI) e em setembro de 2012 no Centro
Brasileiro de Validação de Métodos Alternativos (BraCVAM), uma parceria entre o Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS / Fiocruz) e a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA). Estas foram as primeiras parcerias na América Latina para
validar e coordenar uma substituição, redução, ou um refinamento do uso de animais em
testes laboratoriais.
Considerando que os fragmentos de pele sobressalentes das cirurgias plásticas
eletivas são rotineiramente descartados como resíduo infectante, a utilização destes constitui
uma alternativa experimental factível e sustentável para suprir a lacuna entre o in vitro e o
clínico, aproximando-se dos reais benefícios e segurança que um produto aplicado
topicamente pode exercer. Seguindo os 3R´s e buscando resultados que melhor mimetizem a
condição real da pele humana o presente estudo foi conduzido utilizando como sistema-teste
fragmentos de pele ex vivo, além de culturas celulares 2D. Vale ressaltar que nosso
laboratório possui ampla experiência na utilização de modelo de pele humana in vitro e ex
vivo para a avaliação de diferentes parâmetros envolvidos nas respostas biológicas
relacionadas a diversas desordens cutâneas (104–106).
Objetivo 38
2. Objetivos
Constituiu objetivo do presente trabalho a avaliação da habilidade moduladora
da planta Rhodiola rosea e da alga Chlorella nos mecanismos intracelulares associados com o
desenvolvimento de cicatrizes queloideanas. Os ensaios foram conduzidos utilizando modelos
experimentais in vitro com culturas de células primárias e com linhagem celulares adquiridas
comercialmente e modelos utilizando fragmentos de pele ex vivo. Para avaliar a capacidade
moduladora de ambas as espécies, analisamos os diversos parâmetros envolvidos no
desenvolvimento destas lesões associados com perfil inflamatório, cicatrização tecidual e
componentes da MEC. As quantificações foram realizadas nas culturas celulares e nas
culturas de pele ex vivo por meio de ensaio imunoenzimático para TGF-β, VEGF, IL-6,
MMP-1, TIMP-1, TIMP-2. A produção proteica de colágeno total foi quantificada utilizando
kit de Sircoll e a proliferação celular avaliada pela técnica de citometria de fluxo.
Material e Métodos 39
3. Material e Métodos
Essa pesquisa foi conduzida após aprovação pelo Comitê de Ética em 28 de
julho de 2012 sob CAAE nº 02915512.2.0000.5404, parecer 62382, para estudo com
fragmentos de pele proveniente de cirurgias plásticas eletivas (Anexo 1). O estudo somente
foi iniciado após autorização e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE) pelos voluntários (Anexo 2). O estudo está de acordo com a Resolução 466/12 –
CNS/MS e suas complementares e com a Declaração de Helsinque.
3.1 Sujeitos da pesquisa
Os fragmentos de pele humana foram obtidos de cirurgia plástica eletiva na
região abdominal (abdominoplastia) provenientes de 10 voluntários (n=10) que apresentavam
os seguintes critérios de inclusão e exclusão:
Critérios de inclusão:
1. Idade entre 30 a 50 anos;
2. Fototipo (Fitzpatrick) II, III e IV (71);
3. Presença de queloide na região abdominal.
Critérios de exclusão:
1. Marcas cutâneas, como estrias ou tatuagem, dermatoses ou outras que possam
interferir na resposta biológica da pele;
2. Utilização de qualquer medicamento ou cosmético que possa interferir no
resultado do estudo;
3. Exposição ao sol intensa ou a sessão de bronzeamento até 15 dias antes da
avaliação inicial e durante o estudo;
4. Tratamento estético e/ou dermatológico corporal até 3 semanas antes da
realização da cirurgia.
A tabela apresenta as características dos voluntários doadores dos fragmentos
de pele provenientes de cirurgia plástica eletiva.
Material e Métodos 40
Tabela 1. Características dos voluntários doadores dos fragmentos de pele provenientes de
abdominoplastia.
Voluntário Sexo Idade Tipo de Pele
(Fitzpatrick)
1 Feminino 38 II
2 Feminino 44 III
3 Feminino 42 III
3 Feminino 49 III
4 Masculino 46 II
5 Feminino 39 IV
6 Feminino 47 III
7 Feminino 42 III
8 Masculino 40 II
9 Feminino 46 III
10 Feminino 37 II
3.2 Processamento dos Fragmentos de pele
Após a realização da exérese eletiva pelo cirurgião responsável os fragmentos
de pele foram coletados em um frasco contendo soro fisiológico 0,9% e mantidos em
refrigeração até o início das análises experimentais (no máximo 3 horas). Na figura 6
apresentamos duas fotos com um dos fragmentos de pele provenientes de abdominoplastia
antes de iniciar o processo de assepsia. De todos os fragmentos foi coletada uma região de
tecido normal com uma distância mínima de dez (10) centímetros da cicatriz queloideana.
A hipoderme foi removida e a pele foi cortada com o auxílio de bisturi
cirúrgico em fragmentos de 1,0 cm2. Foram obtidos fragmentos da região do queloide e
fragmentos de uma região sem cicatriz de cada indivíduo.
Em seguida foi realizada a assepsia do fragmento utilizando DMEM high
glucose (Gibco, USA) suplementado com Penicilina (20000U/500mL - Gibco, USA),
Estreptomicina (20000µg/500mL - Gibco, USA), Gentamicina (200mg/500mL - Sigma,
USA) e Anfotericina B (50µg/500mL - Sigma, USA), por um período de 1 hora à 4ºC. Após a
assepsia os fragmentos foram incubados em placas de 24 poços (Corning, USA – Figura 7) e
tratados com Chlorella e ERR, conforme descrito no item 3.2, para posterior analise dos
Material e Métodos 41
parâmetros propostos. De todas as amostras de pele obtidas foram separados dez (10)
fragmentos que foram mantidos em condições de cultura (37ºC/ estufa úmida/ 5% CO2)
durante 5 dias para avaliação da viabilidade do tecido (item 3.2), as avaliações foram
realizadas nos dia 1, 2, 3, 4 e 5, em dois fragmentos por dia.
Figura 6. Fotos de um dos fragmentos de pele provenientes de abdominoplastia antes de iniciar o processo de
assepsia.
Figura 7. Fragmentos de pele normal plaqueados para posterior tratamento com Chlorella e ERR.
3.3 Avaliação da viabilidade dos fragmentos de pele em cultura
Para a avaliação da morte celular via atividade mitocondrial no tecido 1000μl
da solução de MTT (Sigma, USA - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de
difeniltetrazolium), na concentração de 0,3mg/mL em meio de cultura, foram adicionados aos
fragmentos de pele que foram cultivados por 1, 2, 3, 4 e 5 dias e em dois fragmentos logo
após o processo de assepsia (T0). Após 3 horas de incubação a solução de MTT foi removida
e foram adicionados 750µL de Isopropanol (Sigma, USA) em cada poço. A placa foi mantida
por 2 horas, em temperatura ambiente, sob leve agitação para a extração dos cristais de
formazan. Após o processo de extração foram coletadas duas alíquotas de 200µL de cada
Material e Métodos 42
fragmento que foram transferidas para placas de leitura de 96 poços (Cornig, USA). A
absorbância foi determinada a 570nm em monocromador. As porcentagens de viabilidade nos
diferentes tempos de avalição foram calculadas em comparação com a viabilidade de T0,
onde as médias dos valores de densidade óptica obtidas foram consideradas como 100% de
viabilidade.
3.4 Isolamento das culturas primárias
Para o isolamento das culturas primárias de fibroblastos normais e derivados de
queloides, os fragmentos, após o processo de assepsia descrito no item 3.1, foram cortados em
pequenas partes, com cerca de 3-4mm2, com auxílio de um bisturi. Os fragmentos foram então
incubados em garrafas de 25cm2 (Corning, USA) em DMEM com 20% de soro fetal bovino
(SBF – Sigma Aldrich, USA – Figura 8). O meio foi trocado a cada 3 dia e com 11 dias de
cultura, os fragmentos foram removidos. As células foram tripsinizadas no 15º dia e
expandidas em garrafas de 75cm2 (Corning, USA). A figura 9 demonstra a avaliação
microscópica dos fibroblastos isolados. As células foram utilizadas na segunda passagem para
a realização dos experimentos.
Figura 8. Isolamento de fibroblastos normais e derivados de queloides em garrafas de cultura.
Figura 9. Análise microscópica das culturas primárias de fibroblastos humanos. Cultura de fragmento de queloide
após 3 (A), 7 (B) e 11 (C) dias de incubação.
Material e Métodos 43
3.5 Caracterização das culturas primárias
As células isoladas, fibroblastos normais (FB) e fibroblastos derivados de
queloides (FBK), foram caracterizadas biologicamente através de estudos comparativos com
linhagens adquiridas comercialmente. As células HFF-1 (Human fibroblast foreskin – ATCC
SCRC-1041) e KEL FIB (Skin Keloid Fibroblast – ATCC CRL-1762) foram adquiridas do
Banco de células do Rio de Janeiro (BCRJ, Brasil). Os fibroblastos isolados e as linhagens
foram submetidos ao tratamento com Chlorella e ERR e, posteriormente, foram realizadas as
quantificações dos principais mediadores envolvidos na formação de cicatrizes queloideanas.
Os resultados obtidos foram comparados entre si com o objetivo de comprovar que o perfil
biológico das células isoladas correspondia ao perfil das linhagens comerciais.
3.6 Cultivo celular
As células FB, FBK, HFF-1 e KEL FIB, foram cultivadas e expandidas em
garrafa de cultura com 75cm2, em incubadora úmida a 37ºC em presença de 5% de CO2,
utilizando DMEM high glucose com 10% de SBF suplementado com antibióticos. O meio de
cultura foi substituído duas vezes por semana e ao atingiram aproximadamente 80-90% de
confluência, as células foram tripsinizadas (Tryple Express, Gibco, USA), neutralizadas com
o próprio meio de cultura, centrifugadas a 1500rpm por 10 minutos, contadas em câmera de
Newbauer, utilizando o corante vital azul de Trypan, e semeadas em placas de 96 poços
(Corning, USA) na densidade de 1x103 células/poço para avaliação de citotoxicidade (Item
3.7). Paralelamente, foram semeadas em placas de 6 e 24 poços (Corning, USA) na densidade
de 1x105 e células/poço por 24 horas, para posterior incubação com Chlorella e ERR.
3.7 Tratamento das Culturas Celulares
A alga seca Chlorella (Parachlorell beyerinckii CK-5), foi gentilmente cedida
pelo laboratório de pesquisa Chlorella Industry Co., Ltd. (Fukuoka, Japão).
O extrato seco de Rhodiola rosea (ERR) padronizado em rosavins totais
(1,5%) e salidroside (0,5%) foi obtido da indústria Chemyunion Química Ltda.
Ambos foram suspensos separadamente em DMEM e submetidos ao processo
de sonicação realizado 5 vezes com duração de 40 segundos cada etapa e intervalo de 20
segundos entre elas.
As culturas de células e de pele foram incubadas por um período de 72 horas
com as concentrações de 0,60; 0,30; 0,15 e 0,07mg/mL para Chlorella e 0,30; 0,15 e
Material e Métodos 44
0,07mg/mL para ERR preparadas em DMEM. Estas concentrações foram definidas pelo
ensaio de viabilidade celular/citotoxicidade descrito no item 3.7. Após o período de incubação
o sobrenadante foi coletado para posterior quantificação dos mediadores propostos.
3.8 Determinação da viabilidade celular/citotoxicidade
A viabilidade celular foi determinada por um método colorimétrico que utiliza
o corante MTT (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.). Esse ensaio é baseado na conversão do
brometo de tetrazolium amarelo (MTT) para formazan azul pela enzima succinato
desidrogenase mitocondrial nas células viáveis. Chlorella e ERR foram adicionados à placa
de 96 poços, já com as células cultivadas, em uma diluição seriada na faixa de 10,0 a
0,002mg/mL, utilizando o fator de diluição 2,0. A cultura foi incubada por um período de 48
horas. O MTT foi então adicionado na cultura na concentração de 5mg/mL (30µL/poço) e
incubado por mais 4 horas. O conteúdo do poço foi removido e 100μl de isopropanol foi
adicionado com o propósito de solubilizar os cristais de formazan formados. A absorbância de
cada poço foi determinada a 570 nm em um leitor de Elisa. A viabilidade celular foi expressa
em porcentagem e calculada conforme a equação abaixo:
% células viáveis = absorbância da amostra incubada com as amostras
absorbância do controle x 100
Adicionalmente, para garantir que os agentes naturais aqui estudados não
influenciavam na formação de cor do experimento, foram realizados controles experimentais
apenas com Chlorella e Rhodiola rósea sem a presença de células.
3.9 Quantificação das citocinas e fatores de crescimento IL-6, TGF-β1 e
VEGF
As citocinas e fatores de crescimento IL-6, TGF-β e VEGF foram quantificadas
em sobrenadante das culturas de células e pele humana utilizando kits de ensaios
imunoenzimáticos (ELISA sanduíche) disponíveis comercialmente (R&D Systems,
Minneapolis, MN). 100µL do anticorpo de captura monoclonal anti-IL-6, anti-TGF-β1 e anti-
VEGF foram adicionados à placa de 96 poços (Nunc) para incubação prévia por 18 horas em
temperatura ambiente (TA). Após este período os poços foram lavados com uma solução de
Material e Métodos 45
tampão de lavagem (PBS com 0,05% de Tween 20) e incubados com 300µL de uma solução
de bloqueio contendo PBS e 0,1% de albumina sérica bovina (BSA – Sigma Aldrich, USA)
durante 1 hora em TA. Os sobrenadantes provenientes das culturas e os padrões
recombinantes (IL-6, TGF-β e VEGF) foram adicionados e a placa foi incubada por 2 horas
em TA. O anticorpo monoclonal de detecção apropriado para cada parâmetro foi então
preparado e incubado por mais 2 horas em TA. Adicionou-se uma solução de estreptavidina-
peroxidase e incubou-se por 1 hora em TA. Finalmente, a solução de substrato (H2O2 e TMB
– tetrametilbenzidina) foi adicionada à placa e uma coloração azul se desenvolveu dentro de
um período de 20 minutos. A reação de coloração foi interrompida adicionando-se H2SO4 2N
e a leitura foi realizada em leitor de microplacas a 450nm. Os níveis de IL-6, TGF-β e VEGF
foram calculados a partir dos valores de referência obtidos com uma curva padrão construída
com concentrações conhecidas das citocinas recombinantes.
3.10 Quantificação de Colágeno Total
O colágeno total solúvel (tipo I a IV) foi mensurado utilizando Sircol Kit
(Biocolor, Belfast, Irland). Em tubos plásticos próprios para microcentrífuga, 1mL do corante
Sircol (vermelho sirius em ácido pícrico) foi adicionado em 100µl da amostra teste e agitado
durante 30 minutos em TA. O complexo colágeno-corante formado foi precipitado por
centrifugação (10.000 x g) por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o botão re-
suspendido em 1mL de reagente álcali (NaOH 0,5M) . Alíquotas de 200µL foram transferidas
para uma placa de 96 poços e as absorbâncias determinadas em 540nm. A concentração de
colágeno foi realizada com base na curva de calibração utilizando colágeno padrão fornecido
pelo fabricante do kit.
3.11 Mensuração da produção de MMP-1, TIMP-1 e TIMP-2
As concentrações de MMP-1, TIMP-1 e TIMP-2 foram mensuradas no
sobrenadante das culturas por meio de ensaio de ELISA sanduíche, utilizando kits disponíveis
comercialmente (R&D Systems, Minneapolis, MN). O ensaio de ELISA foi realizado
conforme descrito no item 3.8, utilizando anticorpos monoclonais apropriados para cada
parâmetro. Os níveis de MMP-1, TIMP-1 e TIMP-2 foram calculados a partir dos valores de
Material e Métodos 46
referência obtidos com uma curva padrão construída com concentrações conhecidas das
citocinas recombinantes.
3.12 Ensaio de Proliferação celular por Citometria de Fluxo
Para determinar o perfil proliferativo induzido pelo ERR e pela Chlorella,
utilizamos marcação com anti-BrdU e Iodeto de Propídeo (PI), a analise foi realizada por
citometria de fluxo (FACS Aria II).
Após o tratamento as células foram tripsinizadas com o uso de Tryple express,
contadas em câmara de Newbauer com o auxílio do corante vital azul de Trypan (Sigma
Aldrich, USA) e distribuídas em distribuídas em tubos cônicos de 15mL na densidade de
5x106 células/tubo. As células foram lavadas com 1mL de PBS e centrifugas a 1500rpm por 5
minutos. Em seguida foi adicionado 5mL de meio de cultura e as células foram incubadas por
1 hora à 37°C. Em seguida, foram adicionados 10 µL/mL de BrdU 1mM e as células foram
novamente incubadas por 1h à 37°C. Após incubação foi realizada a centrifugação das células
à 1500 rpm/5 minutos. As células foram ressupensas em 1 mL PBS + 0,5 mg/mL RNAse A e
incubadas por 30 minutos à 37°C. As células foram lavadas com 5 mL PBS e centrifugadas as
1000 rpm/5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em vortex. Em
seguida adicionou-se 1 mL de HCl 0,1N com 0,7% de Triton X-100 e os tubos foram
mantidos em gelo por 10 minutos. Novamente as células foram lavadas com 5 mL PBS e
centrifugadas as 1000 rpm/5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em
vortex. Em seguida adicionou-se 0,5 mL água ultra pura e as amostras foram mantidas por 2
minutos à 97°C. Em seguida adicionou-se 5 mL PBS com 0,5% de Tween 20. As células
foram centrifugadas à 1000 rpm/8 minutos sem aceleração e sem brake. O sobrenadante foi
descartado e o pellet ressuspenso em vortex. Em seguida adicionou-se 4 mL de PBS com
0,5% de Tween 20 e 5% de SBF. Desta suspensão de células 150 µL foi transferido para o
tubo de citometria e 1 µL de anti-BrdU foi adicionado, os tubos foram mantidos por 30
minutos no escuro. Em seguida foi adicionado 1 mL de PBS com 0,5% de Tween 20 e 5% de
SBF, as células foram centrifugadas à 3200 rpm por 2 minutos e o sobrenadante foi
descartado. Por fim as células foram ressuspensas em 200 µL de PBS contendo 10 µg/mL de
PI. Imediatamente os tubos foram avaliados por citometria de fluxo.
Material e Métodos 47
3.13 Análise estatística
De acordo com a distribuição normal dos dados um método paramétrico de
análise de variância (ANOVA) foi utilizado para a realização da análise estatística seguido do
teste Tukey de comparação múltipla. Em todos os grupos estudados, foram considerados
estatisticamente significativos aqueles cujos valores de P foram menor que 0,05.
Resultados 48
4. Resultados
Os resultados obtidos neste estudo serão apresentados de forma sub-dividida
em 3 itens:
Padronização das Concentrações de Tratamento e Avaliação da
Viabilidade Tecidual em Cultura: neste item são apresentados os
resultados obtidos nos ensaios de viabilidade celular/tecidual com a
utilização do corante vital MTT;
Chlorella: neste item os resultados são apresentados no formato de
artigo, considerando que estes dados já foram submetidos a uma revista
internacional para publicação. Além dos resultados obtidos após o
tratamento com Chlorella, constam também os resultados comparativos
entre as culturas primárias isoladas e as linhagens adquiridas
comercialmente;
Rhodiola rosea: Neste item os resultados são apresentados no modo
tradicional, com os gráficos e descrição de cada resultado.
Uma importante característica observada nos tratamentos com Chlorella e ERR
é a manutenção dos níveis basais de cada mediador avaliado na ausência de queloide, tanto
para as células como para a pele normal. Estes resultados são observados devido à capacidade
adaptogênica de ambas as espécies, não alterando parâmetros normais de um organismo.
Resultados 49
4.1. Padronização das Concentrações de Tratamento e Avaliação da
Viabilidade Tecidual em Cultura
4.1.1. Padronização das Concentrações de Tratamento – Ensaio de
Citotoxicidade
A possível ação citotóxica de Chlorella e ERR foi avaliada utilizando o método
de MTT em cultura de fibroblastos humanos incubados com diferentes concentrações de
ambos, obedecendo uma faixa de concentração de 10 a 0,002mg/mL.
Conforme podemos observar na figura 10, ambos apresentaram moderada
citotoxicidade quando utilizados na concentração de 20 mg/mL, sendo observada a morte de
aproximadamente 40% do total de células na cultura. Para Chlorella observamos
concentrações não citotóxicas à partir da diluição de 0,625mg/mL. Para ERR observamos
concentrações não citotóxicas à partir da diluição de 0,313mg/mL. Com base nos resultados
obtidos neste experimento, selecionamos para a realização dos ensaios as concentrações de
0,60; 0,30, 0,150 e 0,007mg/mL para os tratamentos com Chlorella, e 0,30, 0,150 e
0,007mg/mL para os tratamentos com ERR.
Resultados 50
A
B
Figura 10. Efeitos da Chlorella e do extrato de Rhodiola rosea (ERR) sobre a viabilidade celular de fibroblastos
humanos. Fibroblastos foram incubados com diferentes concentrações (10-0,002mg/mL) de Chlorella e ERR,
separadamente, durante 48 horas e a viabilidade celular foi avaliada pelo método de MTT. A. Chlorella. B. Extrato de
Rhodiola rosea. Os dados representam a média da porcentagem de células viáveis em relação ao controle obtidos de 3
experimentos independentes.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Chlorella (mg/mL)
Via
bili
dad
e C
elu
lar
(%)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Extrato de Rhodiola Rosea (mg/mL)
Via
bili
dad
e C
elu
lar
(%)
Resultados 51
4.1.2. Avaliação da Viabilidade Tecidual em Cultura – MTT das
culturas de pele ex vivo
Na figura 11 apresentamos os resultados da viabilidade tecidual dos fragmentos
de pele obtidos de cirurgia plástica eletiva em condições de cultura (37ºC, 5%CO2, estufa
úmida) durante cinco dias.
Este ensaio foi realizado para assegurar a viabilidade da pele durante o período
experimental. Para a realização dos cálculos das porcentagens de viabilidade utilizamos como
parâmetro o resultado da densidade ótica, após exposição ao MTT, dos fragmentos de pele
que foram submetidos apenas ao processo de assepsia. A média destes valores foi considerada
como 100% de viabilidade do tecido e foi utilizado como base para os cálculos experimentais.
A escolha do período de avaliação foi feita considerando uma margem segura em relação ao
tempo que os fragmentos de pele foram mantidos em cultura para realização tratamento com
Chlorella e ERR e, posteriormente, as quantificações dos mediadores.
Conforme podemos observar no gráfico abaixo não há alteração significativa
na viabilidade celular do tecido durante o período avaliado.
Figura 11. Avaliação da viabilidade tecidual de fragmentos de pele humana mantidos em condições de cultura.
Fragmentos de pele humana foram mantidos em incubadora úmida à 37°C com 5% de CO2 por 5 dias. A
avaliação da viabilidade do tecido foi realizada em intervalos de 24 horas utilizando o corante vital MTT.
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5
Via
bili
dad
e C
elu
lar
(%)
Fragmentos de Pele em Condições de Cultura (dias de cultura)
Resultados 52
4.2. Chlorella
As avaliações de TIMP-1, TIPM-2 e proliferação celular demonstraram que o
tratamento com as diferentes concentrações de Chlorella não altera o perfil de resposta destes
mediadores nos modelos experimentais de queloide (FBK, KS), por este motivo não constam
no artigo abaixo que foi submetido para publicação. Porém estes resultados podem ser
consultados nos Anexo 3 e 4 deste documento.
Comprovante de Submissão.
Resultados 53
Adaptogenic ability of Chlorella involves in vitro and ex vivo modulation of
keloid formation
Michelle S Silva, BSc1,2
Samara Eberlin, PhD2
Cristiane Okuda Torello, PhD1
Sueli Cristeina de Oliveira, BSc1
Fabiana Gomes Ferreira, BSc3
Camilla Biancalana de Aquino, BSc4
Mary Luci de Souza Queiroz, PhD1
1Department of Pharmacology/Hemocenter, University of Campinas, Campinas, SP, Brazil; 2Departament of
SkinVitro, Kosmoscience Group, Campinas, SP, Brazil; 3Departament of Science and Tecnology, Federal
University of São Paulo, São José dos Campos, São Paulo, Brazil; 4Department of Planitox Line, Planitox.The
Science Based Toxicologic Company, Campinas, São Paulo, Brazil.
Corresponding author: Mary LS Queiroz, Department of Pharmacology and Hemocenter, Faculty of Medical
Sciences, University of Campinas - UNICAMP, Rua Carlos Chagas 480, CEP 13083-878, Campinas, SP, Brazil,
Phone: +551935218751; Fax: +551932892968; E-mail: [email protected]
Author to requests for reprints: Michelle Sabrina da Silva, Department of Pharmacology and Hemocenter,
Faculty of Medical Sciences, University of Campinas - UNICAMP, Rua Carlos Chagas 480, CEP 13083-878,
Campinas, SP, Brazil, Phone: +551935218752; Fax: +551932892968; E-mail: [email protected]
Short running title: Chlorella modulating of keloid formation.
Keys words: keloid, Chlorella, fibroblast, adaptogenic.
Resultados 54
ABSTRACT: Keloid scars are defined as the end product of a chronic inflammatory process
that culminates in tissue overgrowth and hardening as a result of excessive collagen
deposition. Studies in the literature show that cytokines and growth factors increase the
metabolic activity of fibroblasts, thus activating intracellular signaling pathways leading to
exacerbated production of extracellular matrix components and consequent formation of these
keloid scars. In spite of the large number of treatments available, the results have been
inconsistent and unsuccessful. In this context, the search for alternative therapies has aroused
the interest of the pharmaceutical and cosmetic industries. In this study, we evaluate the in
vitro and ex vivo modulating ability of the alga Chlorella in the intracellular mechanisms of
the inflammatory response in the skin, aiming to prevent or minimize the clinical
manifestations of keloids scars. Previous results from our laboratory have demonstrated the
adaptogenic ability of this alga, which encouraged such investigation. Our results showed that
Chlorella modulates immunological and fibroproliferative parameters involved in keloid
formation. This activity demonstrated by the alga might be considered an important tool in the
attempt to restore the normal cellular metabolic activity, thus contributing to the reduction in
the appearance of keloids.
Resultados 55
INTRODUCTION
Keloids scars are fibrotic disorders that can be disfiguring and adversely affect the
quality of life causing physical and psychological stress [1]. Unlike hypertrophic scar, that do
not extend beyond the original wound, keloids can reach large areas of the body even when
derived from small tissue damage, especially following surgical procedures. Keloids can grow
for months and cause significant discomfort due to pain and local itching. Although there are
important prognostic factors to be evaluated, it is often difficult to predict the development of
unwanted scar [2]. In daily practice, treatment and prevention of these disorders are a
common challenge involving several medical specialties.
The repair and tissue regeneration constitute a dynamic and orchestrated process
characterized by inflammatory events, cell proliferation and tissue remodeling that
immediately starts after disruption of the epidermal barrier, involving various cell types,
soluble mediators, and extracellular matrix components (ECM) [3]. The natural evolution of
this process is the formation of a normotrofic scar resulting in skin texture and consistency
similar to the previous trauma. However, imbalance in the steps of wound healing process can
lead to pathological conditions such as hypertrophic and keloid scars [4].
It is stated that the unregulated proliferation and migration of fibroblasts derived from
keloids are intimately involved in the formation of these scars through the exacerbated
synthesis of ECM components. These cells also exhibit more intense migration to the center
of the lesions compared to normal fibroblasts [5]. The increase in migration capacity, the
imbalance between the activity of matrix metalloproteinases (MMPs) and their tissue
inhibitors (TIMPs) are decisive in development of fibrotic disorders formation, however the
knowledge of the pathophysiology of these lesions is not fully elucidated [6].
Among the techniques used to reduce excessive scar tissue, the cryotherapy induces
vascular damage [7], the surgical incision has equivocal results regarding carcinogenic
Resultados 56
induction [4] the use of laser type PDL (pulsed-dye laser) is expensive and presents
considerable risk of recurrence. [7]. Another therapeutic practice consists of pharmacological
interventions at subcellular and cellular levels, with the aim of correcting the abnormal
metabolism of collagen and excessive production of cytokines, such as TGF-β1. Although a
more promising methodological approach, the compounds available for this type of treatment
also have undesirable effects. Corticosteroids are the most widely used drugs and their
adverse effects consist mainly of cutaneous dyschromia, dermal atrophy, telangiectasia and
pain during injection [7]. Antineoplastic agents such as 5-fluorouracil and bleomycin, in
addition to the known systemic toxicity also lead to intense local pain, hyperpigmentation,
dermal atrophy and formation of gangrene [7-8]. The application of intralesional interferon
(IFN) is also accompanied by flu symptoms, besides the production of pain and the high cost
of this treatment [7]. Other approaches, including tacrolimus, imiquimod, tamoxifen,
botulinum toxin, Allium cepa extract and curcumin, have also been described, but the lack of
specific studies prevented their applications [7].
Chlorella, an unicellular green algae is recognized as a rich source of amino acids,
vitamins, minerals and dietary fiber, being considered a complete functional food with
antioxidant properties [9]. An important aspect of such specie consists in its adaptogenic
capacity, which implies the ability to restore the biological response, increasing
nonspecifically host resistance against different types of chemical, physical, biological and
psychogenic stress [10-24]. These properties have been demonstrated through the use of a
variety of representative experimental models of chronic inflammation [11-12],
immunosuppression [13-17], infection [18-22] and tumor [23-24].
Based on these findings, in the present study we evaluated the in vitro and ex vivo
modulating ability of the alga Chlorella in the intracellular mechanisms of the inflammatory
Resultados 57
response in the skin, aiming to prevent or minimize the clinical manifestations of keloids
scars.
Resultados 58
METHODOLOGY
Skin explants
The use of normal skin fragments and keloids explants from elective surgery was
conducted after approval by the Research Ethics Committee of the State University of
Campinas - SP, Brazil. Fragments of normal skin and keloids explants (10 subjects in each
group) obtained from patients undergoing elective plastic surgery (abdominoplasty) were
included in the study. The criteria for inclusion were skin type I to IV according to Fitzpatrick
[25] and aged between 18 and 55. The non-inclusion criteria were: use of corticosteroids,
immunosuppressive drugs, pregnancy or breastfeeding.
Human Fibroblasts Isolation
After the surgical procedure, normal and keloid fragments were maintained in 0.9%
NaCl during transport to the laboratory. For isolation of the cells the hypodermis was
removed and fragments were washed in DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Sigma
Aldrich, USA) serum free and maintained at 4°C in medium with penicillin/streptomycin 2%
(Gibco, USA) for one hour. The samples were fragmented in small pieces (2-3mm2) with
scalpel. Fragments were incubated in 25cm2 bottles with DMEM supplemented with 20%
FBS (Fetal Bovine Serum, Sigma Aldrich). Within 3 days of culture was possible to observe
fibroblast migrating from small pieces of skin to the bottle. Fragments were removed after 7
days of culture, after approximately 11 days incubation the bottle was trypsinized and
expanded into a 75cm2 bottle. Figure 1 demonstrates the microscopic evaluation of fibroblast
isolation. The isolated fibroblasts in the experiments were used in the second passage.
Resultados 59
Figure 01. Microscopic analysis of cultured human skin fibroblasts. Culture of keloid explant (20x) after 3 (A), 7 (B) and 11 (C) days of
incubation.
Characterization of the isolated cells
To characterize the isolated cells, normal human fibroblast (FB) and fibroblasts
derived from keloid (FBK), we performed comparative studies with cell lines commercially
available. HFF-1 (normal fibroblast foreskin - ATCC SCRC-1041) and KEL FIB (skin keloid
- ATCC CRL-1762) were purchased from the Rio de Janeiro Cell Bank (Brazil). The isolated
cells and the line cells were subjected to treatment with Chlorella for further analysis of the
mediators involved in keloid scar formation.
Chlorella and Treatment
The dried alga Chlorella (Parachlorell beyerinckii CK-5), previously identified
as Chlorella vulgaris CK-5 was kindly provided by Research Laboratories, Chlorella Industry
Co., Ltd. (Fukuoka, Japan). Chlorella was resuspended in culture medium and non-cytotoxic
concentrations were selected based on previous results of cytotoxicity assays (data not
shown).
Treatment Protocol
Cell lines, isolated cells and skin fragments (measuring 1cm2) were incubated with
concentrations of 0.60, 0.30, 0.15 and 0.07mg/mL of Chlorella. After 72 hours of incubation
Resultados 60
at 37°C in 5%CO2 in a humidified incubator the supernatants were collected for further
quantification of the proposed mediators. It is important to mention that our laboratory has
extensive experience in the use of human skin model in vitro and ex vivo to evaluate different
parameters involved in biological responses related to several skin disorders [26-28].
Quantification of growth factors, cytokine and ECM components
ECM components (collagen and MMP-1), growth factors (TGF-β1 and VEGF) and
interleucin 6 (IL-6) were quantified using a colorimetric method and an enzyme-linked
immunosorbent assay, respectively, according to the manufacturer’s instructions (Biocolor
Ltd, Belfast, N. Ireland; R&D Systems, Minneapolis, MN;). Three independent experiments
were conducted in triplicate.
Statistical analysis
For statistical analysis, a parametric method, the one-way analysis of variance (Anova)
followed by the Tukey test, was used to compare data among all groups. The level of
statistical significance was considered as P<0.05.
Resultados 61
RESULTS
Skin fragments (normal and keloid) and fibroblasts isolated from normal and keloid
human tissues obtained from plastic surgery were incubated with different concentrations
(0.60, 0.30, 0.15 and 0.07mg/mL) of Chlorella to evaluate its possible modulating effects on
the synthesis of mediators involved in tissue healing. For the purpose of better characterizing
the isolated cells and bringing more accuracy to the results, a comparative test was initially
performed using commercially available cell lines. As shown in figure 2, no differences were
observed between the metabolic profile of the isolated cells when compared to the normal and
keloid fibroblasts lineages.
Figure 02. Metabolic profile for collagen, TGF-β1, MMP-1, IL-6 and VEGF in isolated fibroblasts from
normal (FB) and keloid (FBK) tissues compared to cell lines HFF-1 and KelFib, respectively. A. Collagen
Resultados 62
production. B. TGF-β1 production. C. MMP-1 production. D. IL-6 production. E. VEGF production. P<0.01
and P<0.001 compared to respectively control (Anova, Tukey).
The effects of Chlorella treatment on the synthesis of mediators involved in tissue
healing using isolated fibroblasts derived from normal (FB) and keloid (FBK) skin, as well as
fragments obtained from normal (NS) and keloid (KS) tissue are presented in figures 3 to 7.
As we can see, the presence of the alga regulated the metabolism of cells originated from
keloid tissue by modulating the production of the following mediators, important in the tissue
healing process: collagen, TGF-β1, MMP-1 protease, IL-6 and VEGF.
In relation to collagen production (Figure 3A and 3B), a sharp increase (P <0.001) in
protein synthesis was observed in both FBK and KS, compared to normal controls. In FBK,
treatment with the three higher concentrations of Chlorella used restored to control levels the
synthesis of this mediator, and there was no differences in the response to these
concentrations. Conversely, the observed tendency to modulate the synthesis of this mediator
at the lower concentration (0.07mg/mL) was not statistically significant. In KS, treatment
with the four concentrations used partially reversed the accentuated increased collagen
synthesis, the effect being more significant at the three higher concentrations.
Figure 03. Effects of Chlorella in the production of collagen in fibroblasts and human skin explants. Cells
or skin fragments were incubated for 72 hours in the presence of different concentrations of Chlorella. The
Resultados 63
production of collagen was measured in the supernatant of cultures. A. Fibroblasts isolated from normal (FB)
and keloid (FBK) skin. B. Normal (NS) and keloid (KS) skin fragments. #P<0.001 compared to respective
normal control; **P<0.01 compared to keloid control; ***P<0.001 compared to keloid control (Anova, Tukey).
Increased TGF-β1production was observed in the supernatant of both FBK and KS
cultures (P <0.001), compared to respectively controls. Treatment with the three higher
concentrations of Chlorella restored to normal levels the production of this mediator, and no
differences were observed in these responses. Conversely, the observed tendency of the alga
to modulate the synthesis of this mediator at the lower concentration (0.07mg/mL) in FBK
culture was not statistically significant (Figures 4A and 4B).
Figure 04. Effects of Chlorella in the production of TGF-β1 in fibroblasts and human skin explants. Cells
or skin fragments were incubated for 72 hours in the presence of different concentrations of Chlorella. The
production of TGF-β1 was measured in the supernatant of cultures. A. Fibroblasts isolated from normal (FB) and
keloid (FBK) skin. B. Normal (NS) and keloid (KS) skin fragments. #P<0.001 compared to respective normal
control; **P<0.01 compared to FBK control; *P<0.05 compared to keloid control; ***P<0.001 compared to
keloid control (Anova, Tukey).
Increased MMP-1 protease production was observed in the supernatant of both FBK
and KS cultures, compared to controls (P <0.001). In FBK cultures, treatment with the four
Resultados 64
concentrations of Chlorella partially restored the production of this mediator, and no
differences were observed in these responses. In KS cultures, the four concentrations of
Chlorella used partially reduced the production of MMP-1 protease. However, the effect
produced by the higher concentration (0.6mg/mL) was lower than that observed in the other
concentrations (Figures 5A and 5B).
Figure 05. Effects of Chlorella in the production of MMP-1 in fibroblasts and human skin explants. Cells
or skin fragments were incubated for 72 hours in the presence of different concentrations of Chlorella. The
production of MMP-1 was measured in the supernatant of cultures. A. Fibroblasts isolated from normal (FB) and
keloid (FBK) skin. B. Normal (NS) and keloid (KS) skin fragments. #P<0.001 compared to respective normal
control; *P<0.05 compared to keloid control; ***P<0.001 compared to keloid control (Anova, Tukey).
In relation to IL-6 production, a sharp increase (P <0.001) in protein synthesis was
observed in both FBK and KS cultures, compared to normal controls. Treatment with the four
concentrations of Chlorella used partially, but significantly, reduced the synthesis of this
mediator, and no differences were observed in these responses (Figures 6A and 6B).
Resultados 65
Figure 06. Effects of Chlorella in the production of IL-6 in fibroblasts and human skin explants. Cells or
skin fragments were incubated for 72 hours in the presence of different concentrations of Chlorella. The
production of IL-6 was measured in the supernatant of cultures. A. Fibroblasts isolated from normal (FB) and
keloid (FBK) skin. B. Normal (NS) and keloid (KS) skin fragments. #P<0.05 compared to respective normal
control; ***P<0.001 compared to keloid control (Anova, Tukey).
VEGF production was also increased in both keloid experimental models when
compared to controls (P<0.001). Treatment with Chlorella restored to normal values VEGF
overexpression in all concentrations evaluated, and no differences were observed among the
concentrations used (Figures 7A and B).
Figure 07. Effects of Chlorella in the production of VEGF in fibroblasts and human skin explants. Cells or
skin fragments were incubated for 72 hours in the presence of different concentrations of Chlorella. The
production of VEGF was measured in the supernatant of cultures. A. Fibroblasts isolated from normal (FB) and
keloid (FBK) skin. B. Normal (NS) and keloid (KS) skin fragments. *P<0.05 compared to respective normal
control; ***P<0.001 compared to normal control (Anova, Tukey).
Resultados 66
DISCUSSION
The pathogenesis of keloid scar formation has not yet been fully elucidated, and
treatment and prevention of these disorders are a common challenge involving several
medical specialties. In daily practice, treatment and prevention of these disorders are a
common challenge involving several medical specialties.
There is increasing evidence that many key molecules produced by fibroblasts and
keratinocytes play crucial roles during keloid scar development. In the present work we
demonstrate the ability of the alga Chlorella to restore the balance in the increased network
production of mediators involved in tissue healing.
In the literature, several hypotheses regarding the pathogenesis of keloid formation are
discussed, including changes in regulation of growth factors, immune dysfunction, and
exacerbated production of collagen, among others [5]. The results presented in this work
showed that Chlorella act in different immunological and fibroproliferative parameters, which
are involved in the formation of keloids.
Importantly, similarly to that observed in our in vivo studies [10-24], the treatment
with Chlorella of cells and fragments obtained from normal tissue did not interfere in the
normal profile of the synthesis, thus reinforcing its activity as a biological modulator.
In keloid experimental models, we observed an increase production of TGF-β1 and
collagen, which are directly related to the proliferation and differentiation of dermal
fibroblasts, besides promoting the accumulation of proteins in ECM that culminating in tissue
hardening [29-30]. The results obtained in our study showed that treatment with Chlorella is
able to completely reverse the overproduction of collagen and partially reverse the excess of
TGF-β1.
In relation to metalloproteinases production, Chlorella partially reverses the
exaggerated increase in production of MMP-1, which is crucial, considering that this excess
Resultados 67
of enzymatic production contributes to the unregulated fibroblast migration and increase
invasiveness of keloid. This result is in agreement with those presented by Allen et al and
Fujiwara et al. [31-32]. Both studies showed that overproduction of MMP-1 contributed to the
higher migratory and invasive activity of keloid fibroblasts. The modulation of MMP-1
production observed in our evaluations corroborate the results obtained by Chen et al. (2012)
which demonstrate the ability of Chlorella to reduce MMP-1 production induced by UVB
irradiation in human fibroblast culture [33].
Regulation of angiogenesis in keloids is complex and is controlled by a variety of pro-
angiogenic factors. VEGF is the most potent angiogenic factor due to its high specificity to
endothelial cells [34] and it is closely associated with keloid pathogenesis. Previous studies
have demonstrated that VEGF production is abundant in the underlying of keloids and that the
expression of VEGF is higher in keloid-derived fibroblasts compared with normal skin
fibroblasts [35]. In the present study we observed the same pattern of VEGF production in
both keloid models. Our results highlight the efficiency of the treatment with Chlorella in the
regulation of VEGF production at the same levels observed in normal fibroblast and skin. Our
findings showing increased VEGF production in keloid tissues corroborate other findings in
the literature [36], thus indicating the relevance of this mediator as an angiogenic factor
contributing to the invasive capacity of the keloid.
The inflammatory response in keloid lesions is also shown to be active through intense
IL-6 production at the inflammatory site, culminating in an exacerbated proliferation of
fibroblasts. The cytokine IL-6 is an important marker of inflammatory response in the tissue
healing process due to its role in adjustment healing time [37]. IL-6 deficiency results in a
delay in the processes of angiogenesis, re-epithelialization and macrophage infiltration [38-
39]. On the other hand, overexpression of IL-6 culminates in increased keratinization and is a
key factor in the proliferation of fibroblasts [40]. Our results demonstrate that Chorella is able
Resultados 68
to control the excessive production of IL-6 observed in keloid models, reflecting the
importance of the alga in modulation of excessive proliferation of fibroblast, a characteristic
of keloid scars. These results are in agreement with a study conducted by our research group
demonstrating a pivotal role of Chlorella in the balance of IL-6 production [12] in an
experimental model of chronic inflammation due to obesity.
Taken together, these pioneer findings showing the ability of Chlorella to modulate the
key factors involved in the formation of keloid scars by optimizing the process of tissue repair
and regeneration are encouraging. The observed ability of the alga to modulate fibroblast
proliferation induced by IL-6, to control excessive production of collagen by modulation of
TGF-β1 and to decrease the invasive and proliferative capacity of keloid scars by reducing the
production of MMP-1 and VEGF strongly suggest significant biological, diagnostic, and
therapeutic implications in the prevention of keloid scar formation.
SOURCES OF FUNDING: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) (Proc. 301006/2015-6).
CONFLICT OF INTEREST: No conflict of interest to declare.
Resultados 69
LIST OF ABREVIATIONS
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's medium
ECM: extracellular matrix
FB: normal human fibroblast
FBK: fibroblast derived from keloid
FBS: fetal bovine serum
HFF: Human fibroblast foreskin
IFN: interferon
IL: interleukin
KelFib: skin keloid fibroblast
KS: keloid skin
MMP: metalloproteinase
NS: normal skin
PDL: pulsed-dye laser
TGF-β1: tissue growth factor beta 1
TIMP: tissue inhibitor of metalloproteinase
UVB: ultraviolet B
VEGF: vascular endothelial growth factor
Resultados 70
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Resultados 73
4.3. Rhodiola rosea.
Os efeitos do tratamento com ERR na síntese dos mediadores envolvidos na
cicatrização tecidual utilizando fibroblastos isolados de pele normal (FB) e queloide (FBK),
bem como fragmentos obtidos de tecido normal (NS) e queloide (KS) são apresentados nas
figuras 12 a 19. Como podemos ver, a presença do extrato de Rhodiola rosea regulou o
metabolismo das células originadas do tecido queloideano modulando a produção dos
seguintes mediadores, importantes no processo de cicatrização do tecido: colágeno, TGF-β1,
MMP-1, IL-6 e VEGF. Além disso, foi capaz de modular o perfil de proliferação dos
fibroblastos derivados de queloide.
4.3.1 Quantificação de Colágeno Total.
Na figura 12 (A e B) apresentamos os resultados referentes à produção de
colágeno total nos fibroblastos derivados de kelóide (FBK) e na cicatriz queloideana (KS). Os
resultados foram comparados com os respectivos controles normais (FB e NS). Como
podemos observar a produção de colágeno total, tanto em FBK quanto em KS, apresentou um
aumento estatístico acentuado (P<0,001), em relação aos controles normais.
Nas células FBK, o tratamento com as três concentrações de ERR utilizadas
restaurou os níveis normais de síntese desse mediador e não houve diferença de resposta entre
as concentrações avaliadas (P<0,001). Em KS, o tratamento com as duas concentrações mais
baixas de ERR (0,150 e 0,07mg/mL) reverteu o aumento excessivo da produção de colágeno
observado no tecido queloideano, quando comparado a pele normal (P<0,001). A maior
concentração de ERR (0,3mg/mL) reverteu parcialmente este aumento (P<0,01).
Resultados 74
Figura 12. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de colágeno em fibroblastos e fragmentos de pele
humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes
concentrações de ERR. A produção de colágeno foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados
da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em
comparação com o respectivo controle normal; ** P <0,01 comparado ao controle queloide; *** P <0,001 em
comparação com o controle queloide (Anova, Tukey).
Resultados 75
4.3.2 Quantificação de TGF-β1.
Os resultados da produção de TGF-β1 obtidos após ensaio de quantificação nos
sobrenadante das culturas de FB, FBK, NS e KS tratadas com diferentes concentrações de
ERR estão apresentados na figura 13 (A e B).
Foi observado um aumento estatisticamente significativo na produção deste
mediador (P <0,001) nas culturas de FBK e KS, em comparação com os controles normais.
Nas culturas de FBK o tratamento com as duas concentrações mais baixas (0,150 e
0,07mg/mL) de ERR demonstrou uma habilidade em reverter totalmente o a produção
excessiva de TGF-β1, quando comparado com FB (P<0,001).
Na cultura de KS observamos uma redução parcial da produção excessiva de
TGF-β1 com a concentração mais alta de ERR (0,3mg/mL – P<0,01) e uma reversão total
com as duas concentrações mais baixas (0,150 e 0,07mg/mL – P<0,001).
Resultados 76
Figura 13. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TGF-β1 em fibroblastos e fragmentos de pele
humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes
concentrações de ERR. A produção de TGF-β1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados
da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em
comparação com o respectivo controle normal; *** P <0,001 em comparação com o controle queloide (Anova,
Tukey).
Resultados 77
4.3.3 Quantificação de MMP-1.
Na figura 14 (A e B) apresentamos os resultados referentes à produção de
MMP-1 nas culturas de células (FB e FBK) e de pele (NS e KS) após o tratamento com as
diferentes concentrações de ERR. Conforme podemos observar a produção da protease MMP-
1 encontra-se aumentada nos modelos experimentais que mimetizam o ambiente queloideano
(FBK e KS), em relação aos controles normais (FB e NS, respectivamente – P<0,001).
Nas culturas de FBK observamos uma reversão parcial da produção excessiva
de MMP-1 quando tratadas com as duas concentrações mais altas de ERR (P<0,001, em
relação à FB). Já nas culturas de KS todas as concentrações de ERR avaliadas foram capazes
de reduzir parcialmente a produção de MMP-1 (P<0,001), quando comprado a NS.
Resultados 78
Figura 14. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de MMP-1 em fibroblastos e fragmentos de pele
humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes
concentrações de ERR. A produção de MMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados
da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em
comparação com o respectivo controle normal; *** P <0,001 em comparação com o controle queloide (Anova,
Tukey).
Resultados 79
4.3.4 Quantificação de IL-6.
Na figura 15 (A e B) apresentamos os resultados obtidos da quantificação de
IL-6 nas culturas de células (FB e FBK) e pele (NS e KS). Conforme podemos observar esta
citocina apresenta um perfil significativamente aumentado (P<0,001) nos modelos
experimentais que mimetizam o ambiente queloideano.
O tratamento das culturas de FBK e KS com ERR reverteu totalmente a
produção excessiva de IL-6 em todas as concentrações avaliadas (P<0,001), quando
comparado com os controles normais (FB e NS, respectivamente). Não foi observado
diferenças de respostas entre as concentrações avaliadas.
Resultados 80
Figura 15. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de IL-6 em fibroblastos e fragmentos de pele
humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes
concentrações de ERR. A produção de IL-6 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da
pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em comparação
com o respectivo controle normal; *** P <0,001 em comparação com o controle queloide (Anova, Tukey).
Resultados 81
4.3.5 Avaliação da Proliferação Celular.
A proliferação celular foi avaliada nas culturas de FB e FBK tratadas com as
concentrações de 0,150 e 0,70mg/mL, através da técnica de citometria de fluxo, utilizando
anticorpo anti-BrdU e iodeto de propídeo. Na figura 16 apresentamos os resultados obtidos, as
imagens A e B são representativas, correspondendo aos dot plots de um dos ensaios. Na
imagem C podemos observar o gráfico obtido após a analise dos resultados de citometria de
fluxo utilizando o software FlowJo.
Conforme podemos observar o tratamento com ambas as concentrações de
ERR foi capaz de reduzir as taxas excessivas de proliferação dos fibroblastos derivados de
queloide (FBK) quando comparados ao FB (P<0,001).
Resultados 82
Figura 16. Efeitos de Rhodiola rosea na proliferação de fibroblastos de pele humana. As células foram incubadas
por 72 horas na presença ou ausência de Rhodiolla rosea em diferentes concentrações. A produção de proliferação
celular foi mensurada através da marcação com anti-BrdU e Iodeto de propídeos (PI) e analisada por citometria de
fluxo (FacsCalibur). A e B. Dot plots representativos de pele normal. C. Fibroblastos obtidos de queloide, tratados
com ERR. . #P<0,001 em relação ao normal. ***P<0,001 em relação ao queloide (Anova, Tukey).
Resultados 83
4.3.6 Quantificação de VEGF.
A figura 17 representa a produção de VEGF em culturas de fibroblastos (FB e
FBK) e pele humana. A produção de VEGF, semelhante aos outros mediadores avaliados,
também foi aumentada nos dois modelos experimentais que mimetizam o ambiente
queloideano (FBK e KS), quando comparados aos controles normais (P <0,001).
Conforme podemos observar o tratamento com ERR reverteu aos níveis do
controle a produção excessiva de VEGF nas culturas de FBK e KS em todas as concentrações
avaliadas (P<0,001, quando com parado a FB e NS, respectivamente). Não foram observadas
diferenças significativas nos resultados das diferentes concentrações utilizadas.
Resultados 84
Figura 17. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de VEGF em fibroblastos e fragmentos de pele
humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes
concentrações de ERR. A produção de VEGF foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados
da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em
comparação com o respectivo controle normal; *** P <0,001 em comparação com o controle queloide (Anova,
Tukey).
Resultados 85
4.3.7 Quantificação de TIMP-1 e TIMP-2.
Nas figuras 18 e 19 (A e B) apresentamos os resultados referentes à produção
de TIMP-1 e TIMP-2, respectivamente, nos fibroblastos derivados de kelóide (FBK) e na
cicatriz queloideana (KS). Os resultados foram comparados com os respectivos controles
normais (FB e NS). Como podemos observar ambos inibidores de metaloproteinase
apresentaram um aumento estatístico acentuado tanto em FBK quanto em KS (P<0,001), em
relação aos controles normais. Entretanto não houve alteração na produção de TIMP-1 e
TIMP-2 após o tratamento com as diferentes concentrações de ERR.
Resultados 86
Figura 18. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TIMP-1 em fibroblastos e fragmentos de pele
humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes
concentrações de ERR. A produção de TIMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados
da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em
comparação com o respectivo controle normal (Anova, Tukey).
Resultados 87
Figura 19. Efeitos do extrato de Rhodiola rosea na produção de TIMP-2 em fibroblastos e fragmentos de pele
humana. As células ou fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes
concentrações de ERR. A produção de TIMP-2 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados
da pele normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em
comparação com o respectivo controle normal (Anova, Tukey).
Discussão 88
5. Discussão
A patogênese da formação de cicatrizes queloideanas ainda não foi totalmente
elucidada, e o tratamento e a prevenção desses distúrbios são um desafio comum envolvendo
várias especialidades médicas. Os queloides não só afetam a aparência da pele, mas também
afetam a saúde física e psicológica dos pacientes. Atualmente, há vários métodos de
tratamento queloide relatados, incluindo cirurgia, drogas, radioterapia, terapia a laser e
crioterapia, bem como terapia combinada que consiste associações dos métodos mencionados
acima (107).
Há evidências crescentes de que muitas moléculas-chave produzidas por
fibroblastos e queratinócitos desempenham papéis cruciais durante o desenvolvimento de
cicatrizes queloideanas (108). Na literatura, são discutidas várias hipóteses quanto à
patogênese dos queloides, incluindo mudanças na regulação de fatores de crescimento,
disfunção imune e produção exacerbada de colágeno, entre outros (3).
No presente trabalho, demonstramos a capacidade da alga Chlorella e do
extrato da planta Rhodiola rosea de restaurar o equilíbrio na produção dos mediadores
associados ao processo de cicatrização de tecidos e formação do queloide. Os resultados
apresentados neste trabalho mostraram que Chlorella e ERR atuam em diferentes parâmetros
imunológicos e fibroproliferativos, envolvidos na formação de queloides.
Corroborando os estudos realizados por nosso grupo (16–30), tanto a Chlorella
como o ERR atuaram como moduladores biológicos adaptogênicos. O tratamento das culturas
primárias de fibroblasto e fragmentos obtidos de tecido normal com ambas as espécies não
interferiu no perfil normal da síntese dos mediadores, tais como: TGF-β1, colágeno total,
MMP-1, VEGF, IL-6, TIMP-1 e TIMP-2
Numerosas vias de sinalização estão associadas a fisiopatologia da cicatriz
queloideana, incluindo a via de sinalização de TGF-β1. TGF-β é uma citocina pleiotrópica
envolvida em múltiplos aspectos do reparo de feridas e um importante regulador da fibrose
que estimula a proliferação e produção de colágeno em fibroblastos derivados de queloides
(109). Além disso, sabe-se que o TGF-β1 regula a expressão genética anormal em
queratinócitos derivados queloides, contribuindo para um perfil de expressão gênica que leva
a alterações no processo de adesão da epiderme e produção de proteínas responsáveis pela
junção celular (110).
Discussão 89
Os tipos mais frequentes de colágenos presentes na derme são colágeno tipo I
(cerca de 80%) e tipo III (aproximadamente 20%) (111). Na pele, a síntese de colágeno é
realizada por fibroblastos e os genes responsáveis pela produção de colágeno tipo I são
COL1A1, localizado no cromossomo 17, que codifica a cadeia α1 (I) e COL1A2, localizada
no cromossomo 7, que codifica a cadeia α2 (I) (112). O colágeno tipo III é produzido pelo
gene COL3A1, localizado no cromossomo 2 (113). Várias vias de sinalização, como MAP
kinase e NF-kB, induzem síntese de colágeno por transcrição de mRNA, sendo traduzidas no
retículo endoplasmático rugoso (RER), hidroxiladas e glicosiladas em procolágeno (114).
Posteriormente, são excretadas no meio extracelular por exocitose, onde as enzimas
proteolíticas clivam seus propeptídeos C e N, transformando-os em tropocolágeno. Então,
tropocolágenos se unem para formar fibrilas de colágeno, que dão origem a fibras de colágeno
(115). O colágeno de tipo I é considerado o colágeno maduro (116) por ser um heterotrímero
composto por duas cadeias idênticas α1 (I) e uma α2 (I) (117), responsável pela força e tensão
dos tecidos (116). O colágeno tipo III é um colágeno imaturo; É um homotrímero, composto
por três cadeias α1 (III) (118), sintetizadas durante os primeiros estágios do reparo tecidual
(116).
A síntese de colágeno pode ser induzida por TGF-β, que se liga ao receptor
ubíquo de serina tirosina quinase (TβRII), e então o receptor de TGF-βI (TβRI) é recrutado e
fosforilado por TβRII. O sinal se propaga através de proteínas do tipo SMADs, uma família
de proteínas intracelulares que por sua vez transportam informações para o núcleo,
estimulando a transcrição de genes (COL1A1, COL1A2 e COL3A1) e induzindo a produção
de colágenos tipo I e tipo III (119). A superexpressão de TβRI e TβRII e a fosforilação
aumentada de proteínas SMAD foram encontradas em fibroblastos derivados de queloides e
parecem induzir produção excessiva de colágeno (120). Estudos indicam que uma falha na
eliminação da super-expressão desses receptores durante a fase de remodelação pode levar ao
efeito autócrino persistente de TGF-β em fibroblastos de queloides, causando aumento da
síntese de colágeno.
Em modelos experimentais de queloides descritos na literatura foram
observados um aumento da produção de TGF-β1 e colágeno, que estão diretamente
relacionados à proliferação e diferenciação de fibroblastos dérmicos, além de promover o
acúmulo de proteínas no ECM que culminou no enrijecimento do tecido (121–124). Os
resultados obtidos em nosso estudo mostraram que o tratamento com Chlorella é capaz de
reverter completamente a excessiva produção de colágeno e reverter parcialmente o excesso
Discussão 90
de TGF-β1. Já o tratamento com ERR é capaz de reveter completamente a produção
exacerbada tanto de colágeno como de TGF-β1.
Em relação à produção de metaloproteinases, Chlorella e ERR revertem
parcialmente o aumento exagerado da produção de MMP-1, o que é crucial, considerando que
esse excesso de produção enzimática contribui para a migração de fibroblastos não regulada e
aumenta a invasividade do queloide. Este resultado está de acordo com os apresentados por
Allen et al e Fujiwara et al. (125,126), os quais mostraram que a superprodução de MMP-1
contribuiu para a maior atividade migratória e invasiva de fibroblastos queloides.
A MMP-1 é uma colagenase intersticial que faz parte de uma subfamília de
MMPs que podem degradar especificamente a tripla hélice de colágeno (112), tornando-a
termicamente estável e suscetível à proteólise adicional por gelatinases. Consequentemente, a
MMP-1 desempenha um papel central na patogênese da renovação anormal no processo de
cicatrização (127).
Pilcher e colaboradores mostraram que a clivagem do colágeno tipo 1 pela
MMP-1 é essencial para a migração de queratinócitos (128). Daniels e colaboradores
mostraram que a MMP-1 é necessária para a contração da matriz em um estudo usando um
inibidor de MMP de amplo espectro (129). Usando mioblastos de camundongo, Allen e
colaboradores mostraram que a produção excessiva de MMP-1 ou MMP-2 aumentou
significativamente a migração e invasão celular (125). Consequentemente, sugere-se que a
MMP-1 possa desempenhar um papel fundamental na migração e invasão de fibroblastos
derivados de queloides, acentuando a característica invasiva do queloide que culmina em uma
cicatriz que pode ir muito além das bordas da lesão inicial.
A modulação da produção de MMP-1 observada em nossas avaliações
corrobora os resultados obtidos por Chen e colaboradores (81) que demonstram a capacidade
da alga Chlorella em reduzir a produção de MMP-1 induzida pela irradiação UVB na cultura
de fibroblastos humanos.
A regulação da angiogênese em queloides é controlado por uma variedade de
fatores pró-angiogênicos. O VEGF é o fator angiogênico mais potente devido à sua alta
especificidade para as células endoteliais (130) e está intimamente associado à patogênese
queloidena. Estudos anteriores demonstraram que a produção de VEGF é abundante em
células e tecidos de queloides e que a expressão de VEGF é maior nos fibroblastos derivados
de queloides em comparação com os fibroblastos normais da pele (130,131). No presente
estudo observamos o mesmo padrão de produção de VEGF em ambos os modelos
experimentais que mimetizam o ambiente queloideano. Nossos resultados destacam a
Discussão 91
eficiência do tratamento com Chlorella e ERR na regulação da produção de VEGF nos
mesmos níveis observados nos fibroblastos e na pele normal. Nossos achados que
demonstram o aumento da produção de VEGF em tecidos de queloide corroboram os da
literatura (126,132), indicando a relevância desse mediador como um fator angiogênico que
contribui para a capacidade invasiva do queloide.
A resposta inflamatória nas lesões queloidenas também se mostra ativa através
da produção intensa de IL-6 no local inflamatório, culminando em uma proliferação
exacerbada de fibroblastos (110). A IL-6 é uma citocina multifuncional que regula a resposta
imune e tem sido intensamente estudada nos últimos anos (133). É secretada por células T e
macrófagos e também fibroblasto, que são capazes de induzir respostas imunes, incluindo
respostas ao trauma (134).
A citocina IL-6 é um marcador importante de resposta inflamatória no processo
de cicatrização do tecido devido ao seu papel no ajuste do tempo de cura (46). A deficiência
de IL-6 resulta em atraso nos processos de angiogênese, re-epitelização e infiltração de
macrófagos (49,135). Por outro lado, a super-expressão da IL-6 culmina no aumento da
queratinização e é um fator chave na proliferação de fibroblastos (136). Nossos resultados
demonstram que a alga Chorella e o ERR são capazes de controlar a produção excessiva de
IL-6 observada nos modelos de queloides, refletindo a importância da alga na modulação da
proliferação excessiva de fibroblastos, característica das cicatrizes queloideanas. Os
resultados referentes ao tratamento com Chorella estão de acordo com um estudo realizado
por nosso grupo de pesquisa que demonstrou um papel fundamental da Chlorella no
equilíbrio da produção de IL-6 (16) em um modelo experimental de inflamação crônica
devido à obesidade.
Paralelamente, o tratamento com ERR demonstrou uma habilidade em reduzir
a proliferação excessiva dos fibroblastos derivados de queloides, porém está capacidade não
foi observada no tratamento com Chlorella.
Em conjunto, esses achados pioneiros são encorajadores, pois mostram a
capacidade da alga Chlorella e do extrato da planta Rhodiola rosea em modular os principais
fatores envolvidos na formação de cicatrizes queloideanas, otimizando o processo de
reparação e regeneração de tecidos. A habilidade de modular a proliferação de fibroblastos
induzida pela IL-6, para controlar a produção excessiva de colágeno por modulação de TGF-
β1 e para diminuir a capacidade invasiva e proliferativa de cicatrizes queloideanas, reduzindo
fortemente a produção de MMP-1 e VEGF sugerem implicações biológicas e terapêuticas
significativas na prevenção da formação destas cicatrizes.
Discussão 92
Considerando o quão satisfatórios foram os resultados obtidos no presente
trabalho, as próximas etapas do estudo envolvem a avaliação da permeação cutânea de
Chlorella e Rhodiola rosea incorporados em diferentes formulações cosméticas e,
posteriormente, o estudo clínico da eficácia destas formulações.
Conclusão 93
6. Conclusão
Os resultados apresentados neste estudo nos permite concluir que:
O tratamento com Chlorella e ERR reverte totalmente a produção
excessiva de Colágeno total, IL-6 e VEGF nas culturas de fibroblastos e
pele derivados de queloides em todas as concentrações avaliadas.
O tratamento com Chlorella reverte parcialmente a produção excessiva
de TGF-β1 nas culturas de fibroblastos (nas concentrações de 0,6; 0,3 e
0,15mg/mL) e pele derivados de queloides (em todas as concentrações
avaliadas).
O tratamento com ERR reverte completamente a produção excessiva de
TGF-β1 nas culturas de fibroblastos e pele derivados de queloides nas
concentrações de 0,3 e 0,15mg/mL.
O tratamento com Chlorella e ERR reverte parcialmente a produção
excessiva de MMP-1 nas culturas de fibroblastos e pele derivados de
queloides em todas as concentrações avaliadas.
O tratamento com ERR reverte completamente a alta taxa proliferativa
observada em fibroblastos derivados de queloide em todas as
concentrações avaliadas.
O tratamento com Chlorella não altera a proliferação de fibroblastos
derivados de queloide.
O tratamento com Chlorella e ERR não altera o perfil de produção de
TIMP-1 e TIMP-2 em fibroblastos derivados de queloide.
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Apêndices e Anexos 111
8. Apêndices e Anexos
Apêndice 1 – Quantificação de TIMP-1 e TIMP-2 após o tratamento com Chlorella
Nas figuras 20 e 21 (A e B) apresentamos os resultados referentes à produção
de TIMP-1 e TIMP-2, respectivamente, nos fibroblastos derivados de queloide (FBK) e na
cicatriz queloideana (KS). Os resultados foram comparados com os respectivos controles
normais (FB e NS, respectivamente). Como podemos observar ambos inibidores de
metaloproteinase apresentaram um aumento estatístico acentuado tanto em FBK quanto em
KS (P<0,001), em relação aos controles normais. Entretanto não houve alteração na produção
de TIMP-1 e TIMP-2 após o tratamento com as diferentes concentrações de Chlorella.
Apêndices e Anexos 112
Figura 20. Efeitos de Chlorella na produção de TIMP-1 em fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou
fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de Chlorella. A
produção de TIMP-1 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da pele normal (FB) e queloide
(FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal
(Anova, Tukey).
Apêndices e Anexos 113
Figura 21. Efeitos de Chlorella na produção de TIMP-2 em fibroblastos e fragmentos de pele humana. As células ou
fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de Chlorella. A
produção de TIMP-2 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da pele normal (FB) e queloide
(FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em comparação com o respectivo controle normal
(Anova, Tukey).
Apêndices e Anexos 114
Apêndice 2 – Avaliação da proliferação celular após o tratamento com Chlorella.
A proliferação celular foi avaliada nas culturas de FB e FBK tratadas com as
concentrações de 0,600 e 0,150mg/mL, através da técnica de citometria de fluxo, utilizando
anticorpo anti-BrdU e iodeto de propídeo. Na figura 22 apresentamos os resultados obtidos,
após a analise dos dados de citometria de fluxo utilizando o software FlowJo.
Conforme podemos observar o tratamento com ambas as concentrações de
Chlorella não foi capaz de reduzir as taxas excessivas de proliferação dos fibroblastos
derivados de queloide (FBK) quando comparados ao FB.
Figura 22. Efeitos de Chlorella na produção de TIMP-2 em fibroblastos e fragmentos de pele humana. As
células ou fragmentos de pele foram incubadas durante 72 horas na presença de diferentes concentrações de
Chlorella. A produção de TIMP-2 foi mensurada no sobrenadante das culturas. A. Fibroblastos isolados da pele
normal (FB) e queloide (FBK). B. Fragmentos de pele normal (NS) e queloide (KS). #P <0,001 em comparação com
o respectivo controle normal (Anova, Tukey).
Apêndices e Anexos 115
Anexo 1 – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa para execução do projeto.
Apêndices e Anexos 116
Apêndices e Anexos 117
Anexo 2 – Termo de Consentimento livre e esclarecido - TCLE
Apêndices e Anexos 118