MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO

IMUNOLÓGICO DE PARASITOSES

AMOSTRA

• A amostra a ser colhida para o teste imunológico dependerá do sítio de infecção do parasita e do tipo de teste utilizado.

• Ex.: soro, líquor, urina, fezes, tecidos etc.

• Na maioria dos testes, trabalha-se com diluições (seriadas ou não) das amostras títulos

Formação de agregados visíveis como resultado da interação de Ac específicos e partículas insolúveis que contenham determinantes Ag em sua superfície.

Pode ocorrer em: partículas que apresentem Ag naturais de superfície (hemácias, bactérias, protozoários) – aglutinação direta partículas inertes (látex) ou com células antigenicamente não relacionadas, às quais se adsorvem ou se fixam Ag solúveis – aglutinação indireta

Hemaglutinação Aglutinação do látex

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO

TESTE DE HEMAGLUTINAÇÃO• Testa Ac IgG e IgM • Hemácias de carneiro ou humanas do grupo O, fixadas com

formaldeído ou glutaraldeído, sensibilizadas com o Ag (polissacarídicos ou protéicos)

• Suspensão das hemácias em solução estabilizadora para evitar reações inespecíficas

• Adição do soro em diluições progressivas

Teste positivo: formação de tapeteTeste negativo: formação de botão

TESTE DE AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX• Usado na detecção de Ag ou Ac

• Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser usadas como suportes na adsorção de proteína solúvel a Ag polissacarídeos polissacarídeos

A ligação Ag-Ac promove a fixação do complemento, cujo consumo (in vitro) pode ser empregado para detecção de Ac, Ag ou ambos. O teste é realizado em duas etapas:

fixação do complemento: Ag incubado com Ac na presença de uma quantidade definida de complemento. Se Ag e Ac correspondentes estiverem presentes, há ativação da cascata do complemento e haverá consumo do complemento adição do revelador da reação: hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (Ac anti-hemácia de carneiro obtido em coelhos)

A medida da atividade hemolítica do complemento no sistema indicador permite detectar a presença de Ag ou Ac na mistura inicial e sua quantidade.

REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

1. fixação do complemento 2. revelação da reação

Baseia-se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem a Baseia-se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o Ag. fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o Ag.

Fluorocromos: substâncias que, quando excitadas com luz UV, absorvem luz de um comprimento de onda menor e, instantaneamente, emitem luz de comprimento de onda maior (fluorescência).

• Teste de Imunofluorescência Direto:: usado geralmente para usado geralmente para detectar a presença do Ag em uma amostra clínica. detectar a presença do Ag em uma amostra clínica. • Teste Imunofluorescência Indireto: usado para detectar a usado para detectar a presença, no soro, de Ac específicos. presença, no soro, de Ac específicos.

TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

Imunofluorescência Indireta (IFI)

IFI positivo para T. cruzi IFI para T. gondii: (A) positivo e (B) negativo

A

B

IF positivo para G. duodenalis

Ag

reação Ag-Ac monitorada por medida da atividade enzimática (peroxidase).

leitura visual ou fotométrica, com substratos coloridos, fluorescentes ou luminescentes.

para a peroxidase o substrato é o H2O2 e os cromógenos:

ortofenilenodiamina, ácido 5-amino salicílico, ortotoluidina etc , que serão oxidados originando um produto solúvel e colorido. originando um produto solúvel e colorido.

ELISA Direto: detecta Ag

ELISA Indireto: detecta Ac

TESTE DE ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ELISA indireto

ELISA direto (ELISA “sandwich”)

Interpretação dos resultados:

• leitura visual• espectrofotômetro

(absorbância)

PARÂMETROS SOROLÓGICOS

SENSIBILIDADE: porcentagem de resultados verdadeiramente positivos em indivíduos comprovadamente infectados

ESPECIFICIDADE: porcentagem de resultados verdadeiramente negativos em indivíduos comprovadamente sadios

EFICIÊNCIA: concordância dos resultados verdadeiros positivos e negativos em indivíduos com e sem infecção

VALOR PREDITIVO POSITIVO: probabilidade do resultado positivo ser verdadeiramente positivo

VALOR PREDITIVO NEGATIVO: probabilidade do resultado negativo ser verdadeiramente negativo

indivíduosresultado infectados não infectados total

positivoverdadeiro

positivo(VP)

falso positivo(FP) VP + FP

negativo falso negativo(FN)

verdadeiro negativo

(VN)FN + VN

total VP + FN FP + VN VP + FP+ FN + VN

SENSIBILIDADE (S) = VP / total infectados

ESPECIFICIDADE (E) = VN / total sadios

EFICIÊNCIA (Ef) = VP + VN / total indivíduos

VALOR PREDITIVO POSITIVO (VPP) = VP / total resultados positivos

VALOR PREDITIVO NEGATIVO (VPN) = VN / total resultados negativos

Variação da sensibilidade e especificidade do teste de acordo

com o cut-off

Influência da prevalência nos valores preditivos

Variação dos valores preditivos dependendo da

prevalência

exercícios