métodos de avaliação da qualidade do sêmen criopreservado de ...

Ciência Animal, 22(1): 269-283, 2012 – Edição Especial

Ciência Animal, 22(1), 2012

Palestra apresentada no VI Congresso Norte Nordeste de Reprodução Animal, Fortaleza, CE, Brasil,

27 a 29 de junho de 2012. 269

MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO SÊMEN

CRIOPRESERVADO DE CHARACIFORMES BRASILEIROS

(Methods for evaluating the quality of cryopreserved sperm from brasilian

Characiforms)

Mônica Aline Parente MELO-MACIEL*1

, Carminda Sandra Brito SALMITO-

VANDERLEY1, Liliane Veras LEITE

1, Cassia Evangelista de OLIVEIRA

1,

Mayara Setúbal OLIVEIRA1, Júlia Trugilio LOPES

1, José Ferreira NUNES

1

1. Núcleo Integrado de Biotecnologia, Faculdade de Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do

Ceará, Fortaleza, Ce, Brasil.

Autor para correspondência: [email protected]

RESUMO

A criopreservação de gametas traz inúmeras vantagens para a produção e a reprodução

de diversas espécies, porém esta técnica promove danos estruturais às células que

prejudicam os resultados de fertilização. Vários métodos são empregados para avaliar a

conservação seminal entre elas motilidade, morfopatologias, morfometria e fertilização.

O primeiro método é mais comumente utilizado, pois é uma técnica rápida de avaliar a

qualidade seminal, o segundo e o terceiro permitem avaliar os danos morfológicos

causados pelo processo de criopreservação, porém o último é a técnica mais segura para

garantir que a metodologia de conservação gamética foi satisfatória.

Palavras-Chave: congelação, motilidade, morfologia, fertilização.

ABSTRACT

The cryopreservation of gametes brings many advantages for the production and

reproduction of many species, but this technique promotes structural damage to the cells

that affect the results of fertilization. Various methods are employed to assess the

conservation seminal including motility, morfophatology, mophorlogy and fertilization.

mailto:[email protected]




27 a 29 de junho de 2012. 270

The first method is more, commonly used because it is a rapid technique to assess

sperm quality, the second and third to assess morphological damage caused by the

cryopreservation process, but the latter is the safest technique to ensure that the

methodology of conservation gametic was satisfactory.

Keywords: freezing, motility, morphology, fertilization.

INTRODUÇÃO

A capacidade técnica de preservação de gametas e embriões de peixes e de

invertebrados aquáticos tem se expandido rapidamente nos últimos anos, impulsionada,

primariamente, pela indústria aquícola e pela exigência social (Miliorini, 2006). A busca

por técnicas cada vez mais apuradas de preservação de sêmen de peixes vem ao

encontro às questões econômicas e ecológicas atuais, sejam elas em programas de

melhoramento genético ou de conservação da biodiversidade (Streit Jr et al., 2009),

dessa forma, a aplicação dessa técnica em peixes está em amplo desenvolvimento

(Murgas et al., 2007).

A criopreservação constitui uma biotécnica importante na rotina da reprodução

induzida por, sobretudo, acelerar a melhoria genética de espécies de peixe, sendo ainda

indicada para minimizar a assincronia na maturação dos gametas, no uso seletivo de

reprodutores ou mesmo no transporte de gametas (Godinho, 2000). No entanto, os

processos de congelamento e descongelamento levam a uma redução do número de

espermatozoides normais, além de reduzir a taxa de motilidade e vigor, dificultando a

fertilização (Salmito-Vanderley, 2010). Diante disso, vários métodos são utilizados para

avaliar a qualidade seminal pós-descongelamento, uma vez que a avaliação das

características seminais são imprescindíveis na rotina de reprodução artificial em

qualquer espécie (Murgas et al., 2011).

Na presente revisão são abordados os principais métodos utilizados para avaliar

a qualidade do sêmen de Characiformes após o processo de criopreservação na última

década.




27 a 29 de junho de 2012. 271

Motilidade Espermática

A taxa de espermatozoides móveis é o critério mais utilizado para avaliar a

qualidade seminal após o descongelamento (Tab 1) (Murgas et al., 2011). Além da taxa

de espermatozoides móveis, outro critério importante para o sucesso da reprodução é a

duração da motilidade, pois normalmente os espermatozoides de teleósteos permanecem

móveis por um curto período de tempo, sendo inferior a um minuto (Melo e Godinho,

2006). Essa duração da motilidade espermática tem grande importância para a

fertilização, pois os espermatozoides precisam encontrar e penetrar a micrópila do

ovócito antes desta fechar-se pela hidratação (Morales, 1986).

Muitos fatores podem influenciar o tempo de motilidade dos espermatozoides de

peixes como a solução ativadora e sua osmolaridade (Alavi et al., 2009) e temperatura

(Billard et al., 1995), estado nutricional e sanitário dos animais, condições de análise e

espécie estudada (Murgas et al., 2011).

Entre as soluções ativadoras empregadas para avaliar a motilidade do sêmen

descongelado de Characiformes, a solução de bicarbonato de sódio 1% (NaHCO3) é a

mais comum. A solução de cloreto de sódio (NaCl) em diferentes concentrações

também é utilizada com sucesso para ativar sêmen descongelado de Characiformes. As

concentrações mais comuns são NaCl 0,15% (Melo e Godinho, 2006) e 0,29% (Orfão,

2010).

Tabela 1: Motilidade como método de avaliação da qualidade do sêmen criopreservado

de Characiformes brasileiros.

Espécie Motilidade Referência

Método de

avaliação Solução Ativadora

P. lineatus1 Subjetiva

Água destilada

NaHCO3119 mM Miliorini et al., 2006


Água destilada

NaHCO3 60 mM

NaHCO3 119 mM

Murgas et al., 2007




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1 Família Prochilodontidae;

2 Família Anostomidae;

3 Família Characidae.


Água destilada

NaCl 25 mM

NaCl 50 mM

NaHCO3 119mM

Viveiros et al., 2009b

P. lineatus1

Subjetiva

Objetiva-

(CASA-SCA®)

NaCl 50 mM Viveiros et al., 2010

L. obtusidens2 Subjetiva

NaCl 50mM

NaHCO3 119 mM Taitson et al, 2008

L. macrocephalus2 Subjetiva

NaCl 25mM

NaHCO3 119 mM

Água destilada

Ribeiro e Godinho,

2003

S. brasiliensis3 Subjetiva NaCl 50mM Viveiros et al., 2009a

P. brachypomus3

Subjetiva

Objetiva-

(CASA-SCA®)

NaCl 50 Mm Nascimento et al.,

2010

P. mesopotamicus3 Subjetivo Água destilada Streit Jr et al., 2006

P. brachypomus3

Objetiva-

(CASA-SCA®)

NaCl 50 mM Melo 2010

B. orbignyanus3 Subjetiva NaHCO3 119 mM Murgas et al., 2003

B. orbignyanus3 Subjetiva NaCl 50 mM Maria et al., 2006

B. amazonicus3 Subjetiva NaHCO3 119 mM

Velasco-Santamaria et

al., 2006

B. nattereri3 Subjetiva NaCl 50 mM Oliveira et al., 2007

B. opalinus3 Subjetiva NaCl 50 mM Orfão et al., 2010

B. insignis3 Subjetiva

NaCl 50mM

NaHCO3 119 mM Viveiros et al., 2011

C. macropomun3 Subjetiva NaHCO3 119 mM Menezes et al., 2008

C. macrompomun3

Objetiva

(CASA-SCA®)

NaCl 50mM Vieira, 2010




27 a 29 de junho de 2012. 273

Apesar dos métodos subjetivos serem utilizados rotineiramente, os métodos

objetivos de avaliação da motilidade seminal têm sido considerados mais relevantes na

pesquisa em reprodução (Oliveira et al., 2007). O sistema de análise seminal auxiliado

por computador (CASA) é formado por um microscópio de contraste de fase conectado

à uma câmera de vídeo que reproduz imagens para um computador com o software

Sperm Class Analyzer (SCA

®). Esse programa fornece os meios para uma classificação

objetiva e rápida de uma determinada população de espermatozoides. Com a utilização

do CASA é possível obter dados com altos níveis de confiança e repetibilidade

permitindo a comparação de estudos realizados em diversas partes do mundo.

Utilizando imagens digitais da trajetória de cada célula espermática, o CASA analisa,

além das taxas de motilidade, as propriedades de trajetória e velocidade dos

espermatozoides (Verstegen, Iguer-Ouada e Onelin, 2002).

Apesar das inúmeras vantagens da utilização de um sistema computadorizado,

seu uso não é rotineiro devido aos altos custos de aquisição do equipamento.

Morfopatologias Espermáticas

A integridade das estruturas espermáticas (cabeça, peça intermediária e cauda)

são essenciais para o bom desempenho dos espermatozoides (Kavamoto et al., 1999). A

avaliação da morfologia espermática auxilia, portanto, na definição da qualidade

seminal, pois está relacionada ao potencial fertilizante dos espermatozoides. A análise

da morfologia espermática, muitas vezes, poderá explicar a redução da motilidade do

espermatozoide e, por consequência, perda da capacidade fertilizante dos ovócitos

(Streit Jr, 2008).

Patologias como flagelo dobrado, cabeça isolada, gotas citoplasmáticas proximal

e distal são geradas durante a espermatogênese em decorrência de causas que acometem

os reprodutores, tais como enfermidades, consanguinidade, restrição alimentar e estresse

ambiental, sendo conhecidas como patologias primárias ou maiores. Por outro lado,

patologias como flagelo quebrado, enrolado, degenerado, macrocefalia e microcefalia

são, geralmente, associadas à coleta e manipulação do sêmen, e são classificados como

patologias secundárias ou menores (Herman, Mitchell e Doak, 1994). Esse método de




27 a 29 de junho de 2012. 274

análise é realizado por meio da observação dos espermatozoides em microscopia óptica,

e a classificação da patologia é feita de forma subjetiva.

Em estudos de criopreservação de sêmen de Characiformes, poucos trabalhos

avaliam a morfologia espermática como critério de definição da qualidade seminal pós-

descongelamento (Tab 2).

Tabela 2: Morfopatologias e morfometria como métodos de avaliação da qualidade do

sêmen criopreservado de Characiformes brasileiros.

1 Família Prochilodontidae;


3 Família Characidae; -- Parâmetro não

avaliado

Em procedimento de avaliação de sêmen de mamíferos, a morfopatologia dos

espermatozoides é considerada um parâmetro importante, e o Colégio Brasileiro de

Reprodução Animal (1998) recomenda não utilizar, na inseminação artificial ou monta

natural de mamíferos, sêmen com índices de espermatozoides com anormalidade acima

de 30%, em bovinos e equinos e de 20%, em ovinos e suínos. Para peixes essas

referências ainda não foram estabelecidas.

Apesar dos processos de criopreservação do sêmen provocarem danos à

morfologia espermática, esse método de avaliação dos espermatozoides é pouco

observado em estudos de criopreservação do sêmen de peixes. Sugere-se, portanto, que

os exames morfopatológicos dos espermatozoides de peixes devem ser incorporados à

rotina de avaliação do sêmen após a criopreservação (Taddei et al., 2001).

Morfometria espermática

Espécie Morfopatologias Morfometria Referência

Método

histológico Coloração

Método de

avalição

P. lineatus1

Lâmina-

lamínula

Sem

coloração --

Miliorini et al.,

2006

P. mesopotamicus3

Esfregaço

Corante Rosa

Bengala --

Streit Jr et al.,

2006

P. brachypomus3 -- -- ASMA-SCA

® Melo 2010




27 a 29 de junho de 2012. 275

Estudos têm descrito a ultraestrutura de espermatozoides de peixe e examinando

sua morfologia através da microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica

de transmissão (Cabrita et al., 2010), no entanto a microscopia eletrônica requer

reagentes e equipamentos caros e um maior tempo é necessário para realização das

análises (Marco-Jiménez et al., 2008). Dessa forma, uma boa alternativa é a utilização

de sistemas computadorizados desenvolvidos para análise da morfometria da cabeça de

espermatozoides. Um desses sistemas é o ASMA (Assisted Sperm Morphometry

Analyser), que permite a avaliação de um grande número de espermatozoides de forma

rápida e objetiva, sem qualquer interferência do avaliador. O ASMA já foi utilizado

para mensurar as medidas morfometricas da cabeça dos espermatozoides de tambaqui,

C. Macropomum (Leite et al., 2011) e espermatozoides frescos e após criopreservação

de pirapitinga, P. brachypomus (Melo, 2010) (Tab 2).

Apesar de diversos estudos utilizarem a morfologia espermática como forma de

avaliação da qualidade espermática, está é uma análise subjetiva que vem sendo

substituída gradativamente por métodos objetivos, como o ASMA, que permitem saber

exatamente as medidas da cabeça dos espermatozoides (Asturiano et al., 2007; Marco-

Jimenez et al., 2008).

Fertilidade

Embora os métodos de avaliação descritos nos tópicos anteriores possam ser

utilizados como critério de qualidade espermática após o descongelamento, eles não

garantem a capacidade fertilizante do sêmen. Portanto, o teste de fertilização é, sem

dúvida, o método mais apropriado e seguro para garantir a qualidade do sêmen.

Para avaliar a capacidade fertilizante do sêmen descongelado é utilizado o

método conhecido como fertilização a seco, no qual o sêmen é depositado sobre os

ovócitos e, após a homogeneização dos gametas, é acrescentada uma solução

hiposmótica para ativação dos espermatozoides e hidratação dos ovos, que

posteriormente são transferidos para incubadoras. Esse método otimiza a utilização do

sêmen criopreservado pela aproximação prévia dos gametas.




27 a 29 de junho de 2012. 276

A solução de bicarbonato de sódio 1% (NaHCO3) é utilizada com frequência

para a hidratação dos ovos e ativação espermática após a homogeneização dos gametas

em testes de capacidade fertilizante do sêmen criopreservado de Characiformes

(Carolsfeld et al., 2003; Ribeiro e Godinho, 2003; Velasco-Santamaria, Medina-Robles,

Cruz-Casallas, 2006). Outra solução também utilizada para hidratação dos ovos é a de

Cloreto de Sódio 50 mM (NaCl) (Taitson, Chami e Godinho, 2008). Alguns

pesquisadores utilizaram também água do tanque (Maria et al., 2006; Viveiros et al.,

2010) ou água destilada (Miliorini, 2006).

Outro critério que deve ser levado em consideração nos testes de capacidade

fertilizante do sêmen criopreservado é a proporção ideal de espermatozoides por

ovócito. Essa proporção é muito variável dependendo da espécie e da qualidade do

sêmen utilizado. Vale a pena ressaltar que, no caso de sêmen criopreservado, a

proporção de espermatozoides por ovócito é geralmente superior à utilizada para o

sêmen fresco devido a diminuição da qualidade espermática após o descongelamento.

De fato, nosso grupo de pesquisa também tem trabalhado na determinação da dose

espermática ótima (dados não publicados) e tem observado que, para a fertilização com

sêmen descongelado, há a necessidade de uma proporção espermatozoide/ovócito mais

alta que aquela utilizada com sêmen fresco, na espécie tambaqui.

Viveiros et al. (2009) observaram que a proporção ideal de espermatozoides pós-

descongelamento por ovócito foi 20,5 vezes superior à proporção ideal para sêmen

fresco em Salminus brasiliensis. Maria (2005) utilizou uma proporção 10 vezes maior

em relação ao sêmen fresco de Brycon. Por outro lado, alguns pesquisadores afirmam

que o excesso de espermatozoides para fertilização encobre a qualidade dos

espermatozoides criopreservados, dificultando as comparações entre protocolos

(Viveiros, So e Komen, 2000), e utilizam a mesma proporção de espermatozoides:

ovócito tanto para o sêmen fresco quanto para o descongelado (Viveiros et al., 2010)

(Tab 3).

Além da taxa de fertilização, a eclodibilidade e a taxa de sobrevivência de larvas

oriundas da fertilização de oócitos por células espermáticas criopreservadas é uma

variável que deve ser observada em protocolos reprodutivos em peixes. Apesar de sua

importância, a eclodibilidade e a taxa de sobrevivência larval são pouco observados em




27 a 29 de junho de 2012. 277

trabalhos com Characiformes (Fresneda et al. 2004; Maria, 2005; Viveiros e Godinho,

2009).

Tabela 3: Fertilização como método de avaliação da qualidade do sêmen

criopreservado de Characiformes brasileiros.

*Espermatozoides:ovócito; 1 Família Prochilodontidae;


3

Família Characidae; -- Parâmetro não avaliado

CONCLUSÕES

As técnicas subjetivas vêm sendo substituídas pelas objetivas no intuito de

diminuir as variáveis entre análises, principalmente em relação à motilidade

espermática. A análise da morfologia dos espermatozoides, apesar de ser pouco

utilizada entre os pesquisadores, é de suma importância para a determinação da

qualidade seminal. Em peixes, há uma grande necessidade de se desenvolver técnicas

Espécie Fertilização Referência

Meio de

hidratação

Dose

inseminante*

P. lineatus1

Água destilada

NaHCO3 119mM 43,6 x 10

5 Miliorini et al., 2006

P. lineatus1 Água do tanque 5 x 10

5 Viveiros et al., 2009b

P. lineatus1 Água do tanque 8 x 10

5 Viveiros et al., 2010

L. obtusidens2 NaCl 50mM 112456 Taitson et al, 2008

S. brasiliensis3 Água do tanque 28,7 x 10

5 Viveiros et al., 2009a

B. orbignyanus3 Água do tanque 46 10

5 Maria et al., 2006

B. amazonicus3 NaHCO3 119 mM 79000

Velasco-Santamaria et al.,

2006

B. opalinus3 Água do tanque 4,1 x 10

5 Órfão et al., 2010

C. macropomun3 NaHCO3 119 mM -- Menezes et al., 2008




27 a 29 de junho de 2012. 278

mais precisas de avaliação seminal, inclusive para se determinar parâmetros

direcionadores do que seria ou não um sêmen criopreservável ou criopreservado de boa

qualidade, como já existe para diversas espécies mamíferas.

Apesar da importância dos métodos citados, a fertilização continua sendo a

técnica mais confiável para avaliar a eficácia da criopreservação de sêmen de

Characiformes.

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