MÉTODO ORAC

1. PREPARAÇÃO DOS REAGENTES QUE PODEM SER CONSERVADOS

1.%2%. PREPARAÇÃO DO TAMPÃO PBS 0.075 M (pH 7.4)

Solução de K2HPO4 – 13,06 g de K2HPO4 para 1 L de água destilada (SOLUÇÃO A)

Solução de NaH2PO4.H2O – 2,59 g NaH2PO4.H2O em 250 mL de água destilada (SOLUÇÃO B)

Misturar 810 mL da SOLUÇÃO A com 190 mL da SOLUÇÃO B até pH 7.4

Conservar no frigorífico a 4º C

1.2. PREPARAÇÃO DA FLUORESCEÍNA DISODIO (1166,1 M)

Pesar 0,01097 g de FL e completar com tampão PBS até 25 mL

Conservar a 4º C durante um período máximo de 1 mês

2. PREPARAÇÃO DOS REAGENTES DIÁRIOS

2.1. PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE FLUORESCEÍNA

Adicionar a 100 L da solução stock preparada e completar com PBS até 10 mL

Da solução obtida anteriormente, retirar 250 L e completar com PBS até 25 mL (esta solução é a usada

para as análises diárias) (116,66 nM)

2.2. PREPARAÇÃO DO TROLOX

Pesar 0,0125 g de Trolox para um recipiente, adicionar 1 mL de metanol e completar com PBS até 50 mL

Da solução obtida anteriormente, retirar 1 mL e completar com PBS até 10 mL (Solução T0):

- 800 L T0 + 200 L PBS (T8)

- 700 L T0 + 300 L PBS (T7)

- 600 L T0 + 400 L PBS (T6)

- 500 L T0 + 500 L PBS (T5)

- 400 L T0 + 600 L PBS (T4)

- 300 L T0 + 700 L PBS (T3)

- 200 L T0 + 800 L PBS (T2)

- 100 L T0 + 900 L PBS (T1)

2.3. PREPARAÇÃO DO AAPH

Pesar 0,13018 g de AAPH e completar com 10 mL de PBS

1

3. DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE

Controlo: 80 L de PBS + 120 L de FL

Branco: 20 L de PBS + 120 L de FL + 60 L de AAPH

Trolox: 20 L de Trolox (≠ concentrações) + 120 L de FL + 60 L de AAPH (padrões)

Amostras: 20 L da Amostra (≠ concentrações) + 120 L de FL + 60 L de AAPH (amostras em duplicado,

seis diluições)

As amostras devem preparar-se em várias concentrações para que a sua curva de AUC esteja dentro do

intervalo de Trolox, aproximadamente entre 8 e 45

1. Trabalhar com o fluorímetro

a) Acender o fluorímetro

b) Abrir o programa. Programar a temperatura do método (40ºC)

c) Preparar a placa com PBS, Trolox ou amostra e o volume de FL, deixar incubar a placa 10 min, fazendo

correr o método. É necessário controlar a “ganância” (Gain adjustment), que deve estar entre 30 e 34.

(1750 quando novo)

d) Adicionar aos poços o AAPH e voltar a fazer correr o método, controlando igualmente a ganância da

mesma forma. O método dura 1:40 aproximadamente.

2

REAGENTES MÉTODO ORAC:

TAMPÃO PBS:

K2HPO4

NaH2PO4.H2O

Fluoresceína(sigma) – F-6377 100 g, Sodium Salt 376.3.

Trolox (Aldrich) – 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylbroman-2-carboxylic acid 97% C4H8O9 EC 258-422-8 PM:

250,29 g/mol, 5 g, 97 %.

metanol –

AAPH (Aldrich) – 2,2’-azo-bis-(2-methylpropionamidine)-dihydrochloride, 97%, 100 g, Cas 2997.92.4

Microplacas –

Aparelho – Fluostar Óptima BMG LABTECH

TRATAMENTO DE RESULTADOS:

3

Abrir página de resultados

Seleccionar só os valores, sem a linha da temperatura e copiar

Abrir uma pasta de Excel (modelo) nova e copiar os valores na primeira folha

Copiar a primeira coluna para a segunda folha e fazer com que todas as colunas dessa folha sejam iguais

Ver resultados folha 3

Em Madrid:

Copiar a segunda tabela da primeira folha para a folha do programa inicial

Copiar tudo, agora com a linha da temperatura também para o programa novo Fluorstar galaxy

Abrir programa

No símbolo Excel abrir e seleccionar …. Stat

Copiar a pag do programa anterior para esta página

Limitar o Cal Range State 1-104

Abrir página evaluation 96

Copiar a tabela 2 para a página 3 da folha de Excel (modelo)

Ajustar o branco

Tirar o declive das curvas padrão e das amostras

O valor da actividade antioxidante é a razão entre elas

Valores expressos em mol de Trolox / mg de proteína

4