MELHORAMENTO DE COQUETÉIS ENZIMÁTICOS PARA A...

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BIANCA CONSORTI BUSSAMRA

MELHORAMENTO DE COQUETÉIS ENZIMÁTICOS PARA

A HIDRÓLISE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

CAMPINAS

2014

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS – UNICAMP

Faculdade de Engenharia Química – FEQ

Projeto desenvolvido em parceria com o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do

Bioetanol – CTBE

BIANCA CONSORTI BUSSAMRA

MELHORAMENTO DE COQUETÉIS ENZIMÁTICOS PARA A HIDRÓLISE

DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

Dissertação apresentada à Faculdade de

Engenharia Química da Universidade Estadual

de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para obtenção do título de Mestra em

Engenharia Química.

Orientadora: Profa. Dra. ALINE CARVALHO DA COSTA

Coorientadora: Dra. SINDELIA FREITAS AZZONI

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO

DEFENDIDA PELA ALUNA BIANCA

CONSORTI BUSSAMRA, E ORIENTADA

PELA PROFA. DRA. ALINE CARVALHO DA

COSTA.

CAMPINAS

2014

vii

RESUMO

O alto custo da hidrólise enzimática para a conversão de biomassa lignocelulósica é um problema

recorrente que limita a produção de bioetanol a partir desta fonte renovável e altamente

energética. Muitos fatores afetam a eficiência do processo de hidrólise, como a recalcitrância do

substrato lignocelulósico, eficiência do pré-tratamento, proporções e cargas das enzimas,

inibidores e perda de atividade devido à adsorção não específica. Somado a estes fatores, o alto

custo de produção de coquetéis enzimáticos limita a carga enzimática, o que contribui para a

inviabilização técnica e econômica do processo. Dentre as abordagens consideradas promissoras

para otimizar a reação de hidrólise, pode-se destacar o desenvolvimento de coquetéis artificiais

bem balanceados envolvendo diferentes classes de enzimas. Este projeto estuda coquetéis

enzimáticos otimizados para a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado, onde as

enzimas provieram tanto de fonte comercial quanto de cultivos microbianos (Trichoderma reesei

e Escherichia coli geneticamente modificada), seguidas de purificação. Planejamento

experimental de mistura lattice simplex, seguido de planejamento fatorial, foram utilizados para a

otimização da proporção enzimática. Em ambos os experimentos, a concentração de glicose

liberada (g/L) foi a resposta avaliada. A fim de se reduzir o consumo de reagente, as hidrólises

foram conduzidas em escala reduzida, cuja metodologia foi validada neste trabalho. A mistura

enzimática otimizada, compreendida da fração T. reesei (80%), endoglucanase (10%) e β-

glicosidase (10%), foi capaz de converter 68,36% ± 5,57 da celulose contida no bagaço

hidrotérmico, enquanto que os coquetéis comerciais Cellic CTec H2 e Celluclast converteram

70,43% ± 5,03 e 49,11% ± 0,49 do mesmo material, respectivamente, sob as mesmas condições

de operação. Desta forma, este trabalho contribuiu com a identificação de atividades necessárias e

de suas proporções ótimas para melhorar o coquetel enzimático de T. reesei, resultando no

aumento da conversão do bagaço hidrotérmico. As estratégias de purificação de proteínas e

análises de planejamento experimental e de sinergismo podem ser empregadas para a obtenção de

coquetéis melhorados feitos sob medida para a hidrólise de outros materiais.

Palavras-chave: Trichoderma reesei, purificação de proteínas, bagaço de cana-de-açúcar,

planejamento experimental, hidrólise enzimática.

ix

ABSTRACT

The high cost of converting lignocellulose by enzymatic hydrolysis is a recurring problem

that limits the production of bioethanol from a renewable and highly energetic source. Many

factors affect the efficiency of the hydrolysis process, such as lignocellulosic substrates

recalcitrance, pretreatment efficiency, enzyme ratios and loadings, inhibitors and non-productive

adsorption. Furthermore, the high production costs of enzyme cocktails limit the enzyme loads,

which contribute to technical and economic infeasibility of this process. Among the promising

approaches to optimize hydrolysis reaction, there is the development of well-balanced cocktails

involving different classes of enzymes. This project studies optimized enzyme cocktails for

hydrolysis of pretreated sugar cane bagasse, where the enzymes were provided from both

commercial source and microorganism cultivation (Trichoderma reesei and genetically modified

Escherichia coli), followed by purification. Experimental simplex lattice design, followed by

factorial design, were performed to optimize the enzymatic proportion. In both experiments,

released glucose concentration was the result evaluated. To reduce reagent consumption, the

hydrolysis was carried out in micro assays scale, which methodology was validated in this study.

The optimized enzyme mixture, comprised of T. reesei fraction (80%), endoglucanase (10%) and

β-glucosydase (10%), was capable of converting 68,36% ± 5,57 of the cellulose present in

hydrothermal pretreated bagasse, whereas commercial cocktails Cellic CTec H2 and Celluclast

converted 70,43% ± 5,03 e 49,11% ± 0,49 of the same material, respectively, under the same

conditions. Thus, the work reported here contributed to the identification of needed activities and

their optimal proportions to improve T. reesei enzymatic cocktail, enhancing hydrothermal

bagasse conversion. Protein purification strategies and analyses of experimental design and

synergism can be used to obtain improved cocktails to hydrolyze other materials.

Keywords: Trichoderma reesei, protein purification, sugar cane bagasse, experimental design,

enzymatic hydrolysis.

xi

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1

1. 1 JUSTIFICATIVA ................................................................................................................... 3

1.2 OBJETIVO .............................................................................................................................. 5

1.2.1 Objetivo Geral ................................................................................................................... 5

1.2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................................ 5

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 6

2.1 A estrutura da biomassa lignocelulósica ............................................................................... 6

2.2 O etanol lignocelulósico ........................................................................................................... 9

2.3 Pré-tratamentos ..................................................................................................................... 10

2.4 Hidrólise enzimática .............................................................................................................. 13

2.5 Otimização de coquetéis enzimáticos ................................................................................... 17

3 METODOLOGIA ................................................................................................................ 20

3.1 Bagaço de cana-de-açúcar .................................................................................................... 20

3.2 Enzimas .................................................................................................................................. 22

3.2.1 Enzimas comerciais ......................................................................................................... 22

3.2.2 Produção de coquetel enzimático fúngico ..................................................................... 22

3.2.3 Produção de enzimas recombinantes ............................................................................ 23

3.3 Precipitação com sulfato de amônio..................................................................................... 25

3.4 Diafiltração ............................................................................................................................. 25

xii

3.5 Purificações das enzimas recombinantes ............................................................................. 26

3.5.1 Ensaios cromatográficos em colunas de fluxo por gravidade ..................................... 27

3.5.2 Ensaios cromatográficos em sistema FPLC (“Fast Protein Liquid

Chromatography”) .................................................................................................................. 28

3.5.3 Concentração e troca de tampão ................................................................................... 28

3.6 Determinação das atividades enzimáticas ........................................................................... 29

3.6.1 “Filter paper unit” – FPAse ........................................................................................... 29

3.6.2 Determinação da atividade de endoglucanase e xilanase ............................................ 30

3.6.3 Determinação da atividade de β-glicosidase, β-xilosidase e celobiohidrolase ........... 31

3.7 Quantificação proteica e eletroforese SDS-PAGE .............................................................. 31

3.8 Hidrólises com bagaço de cana-de-açúcar .......................................................................... 32

3.8.1 Hidrólise em frascos de 125 mL ..................................................................................... 32

3.8.2 Hidrólise em escala reduzida para tubos de 2 mL (Mini-hidrólise) ........................... 34

3.8.3 Cálculo da conversão enzimática da celulose ............................................................... 34

3.9 Quantificação de açúcares e ácidos por HPLC (“High Performance Liquid

Chromatography”) ...................................................................................................................... 35

3.10 Avaliação do sinergismo ...................................................................................................... 35

3.11 Montagem dos coquetéis enzimáticos ................................................................................ 36

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 38

4.1 Expressão e purificação das enzimas recombinantes endoglucanase e xilanase e da

proteína recombinante expansina .............................................................................................. 38

4.2 Produção do coquetel fúngico ............................................................................................... 48

4.3 Validação do microensaio de hidrólise enzimática ............................................................. 59

4.4 Hidrólise enzimática utilizando coquetéis comerciais ........................................................ 61

xiii

4.5 Otimização dos coquetéis enzimáticos ................................................................................. 63

5 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 86

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 88

ANEXOS ................................................................................................................................. 94

xv

Dedico este trabalho a toda comunidade

científica que poderá, um dia, se beneficiar com

o mesmo. Também o dedico às pessoas mais

importantes da minha vida. Primeiramente, aos

meus pais Beto e Luzia, minha fonte geradora,

que me ouviram a cada dia, guiaram o meu

caminho, me encorajaram nos momentos

desafiadores e vibraram a cada conquista. Ao

meu irmão, melhor amigo, Renan. Aos meus

avós Narcizo, Maria Luiza e Neuza, por todas as

orações, ensinamentos e temperos.

xvii

AGRADECIMENTOS

Encontro neste espaço uma forma de transcrever a minha gratidão às pessoas e

instituições que contribuíram, de forma direta ou indireta, para o desenvolvimento e conclusão

deste trabalho.

Ao CTBE, pela excelente estrutura disponibilizada, pelo investimento em reagentes e

equipamentos, pelo suporte dado aos bolsistas e oportunidades de aprimoramento profissional.

À Faculdade de Engenharia Química e ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia

Química, UNICAMP, pela oportunidade de aperfeiçoamento profissional, pela excelente

estrutura acadêmica, pelos docentes e pelo apoio aos alunos.

À Dra. Sindelia Freitas Azzoni, meu exemplo profissional, pela sua dedicação a esse

trabalho, pelas horas de conversas e discussão, pela atenção no dia-a-dia, pelos ensinamentos

para uma vida toda, pela amizade. A quem tenho infinita admiração e a quem devo grande parte

da profissional que me tornei.

À Profa. Dra. Aline Carvalho da Costa, pela oportunidade de me formar Mestre ao me

aceitar como sua aluna, pelos conhecimentos transmitidos, pelas excelentes aulas, pelo exemplo

que se tornou para mim.

Aos membros da Banca Examinadora, pelo aceite do convite, pelo tempo dedicado a esse

trabalho e pela contribuição ao mesmo. Em especial à Dra. Daniela Ribeiro, por quem tenho um

carinho sem tamanho e muita admiração.

Ao Dr. José Geraldo da Cruz Pradella, por nos disponibilizar o Laboratório de Biossíntese

de Hidrolases Fúngicas para o cultivo do fungo Trichoderma reesei Rut C30, e a todos os

membros da sua equipe, em especial à Deise Juliana da Silva Lima.

Ao Dr. Roberto Ruller, pelos clones dos genes de endoglucanase, xilanase e expansina.

Ao Dr. George Jackson da Rocha, à Dra. Elenise Bannwart de Moraes Torres e à Dra.

Priscila Maziero, pelos pré-tratamentos do bagaço de cana-de-açúcar.

xviii

Aos técnicos, bolsistas, pesquisadores, colaboradores e eternos amigos do CTBE, em

especial a todos do Laboratório de Biossíntese de Hidrolases Bacterianas (LBHB) pelo apoio e

amizade, com os quais convivi, aprendi e evoluí. O meu agradecimento especial ao Danilo

Semedo Gomes, pela companhia e ajuda durante os cultivos, à Zaira Roffmam, pelo auxílio na

purificação de proteínas e à Patricia Costa, pelo companheirismo em alguns experimentos.

Ao CBMEG/UNICAMP, pelo know-how em purificação de proteínas, gentilmente cedido

a nós.

Aos meus pais, Beto e Luzia, pelo amor, apoio diário e por me orientarem sempre ao

melhor caminho.

Aos meus avós Narcizo, Maria Luiza e Neuza, por me oferecerem o aconchego de seus

lares e o coração sempre aberto, e ao meu avô Ênio, “in memoriam”, que me ilumina e me

protege em todos os momentos.

A toda minha família: irmão, tios, tias, primos e primas, por todo amor, carinho e

amizade.

Aos amigos, personagens preciosas em nossas vidas, pelo apoio, conselhos e convivência,

e pelas energias sempre renovadas. Em especial às antigas amizades de Tietê, às novas amizades

de Campinas e à minha Turma V de Engenharia Biotecnológica da Unesp-Assis.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela bolsa de

mestrado concedida (Nº Processo 2012/23223-2) e pela reserva técnica que me propiciou

apresentar este trabalho no 36th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, FL,

EUA.

A todos que, de alguma forma, contribuíram para que a obtenção deste título fosse

possível.

xix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática da cadeia de celulose. Adaptada de (PÉREZ; MAZEU,

2005) ................................................................................................................................................ 7

Figura 2: Isômeros cíclicos mais comuns nas hemiceluloses. Adaptada de (GRONDAHL;

GATENHOLM, 2005) .................................................................................................................... 8

Figura 3: Representação do complexo lignocelulósico. Adaptada de PÉREZ; MAZEU ( 2005). .. 9

Figura 4: Etapas do processo de obtenção do etanol de 1º e 2º gerações. As setas tracejadas

representam as etapas adicionais requeridas para a produção do etanol de 2º geração. ................ 10

Figura 5: Representação do mecanismo de ação das celulases (celobiohidrolases, β-glicosidase e

endoglucanase) e proteína acessória sobre a biomassa lignocelulósica. ....................................... 15

Figura 6: Estrutura da xilana e as regiões de catálise por quatro diferentes classes

hemicelulolíticas (endoxilanase, β-xilosidase, α-L-arabinofuranosidase e acetil xilana esterase). 16

Figura 7: Etapas para a obtenção das frações de T. reesei após o cultivo. .................................... 26

Figura 8: Perfil do consumo de glicose, síntese proteica e acompanhamento do crescimento

celular por massa seca no cultivo da E. coli recombinante para a expressão de xilanase. A seta

indica o momento da indução. ....................................................................................................... 39


celular por massa seca no cultivo da E. coli recombinante para a expressão de endoglucanase. A

seta indica o momento da indução. ................................................................................................ 39

Figura 10: Eletroforese SDS-PAGE da expressão das proteínas recombinantes em E. coli. Pista 1:

padrão protéico PageRuler prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100,

70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10); pistas 2 e 4: amostragens antes da indução dos sistemas de expressão

que codificam para a endoglucanase e xilanase, respectivamente; pistas 3 e 5: três horas após a

indução dos sistemas de expressão que codificam para a endoglucanase e xilanase,

respectivamente. As amostras foram diluídas para uma concentração protéica máxima de 0,5

mg/mL em cada pista. .................................................................................................................... 40


celular por massa seca no cultivo da E. coli recombinante para a expressão de expansina. A seta

indica o momento da indução. ....................................................................................................... 41

xx

Figura 12: Eletroforese SDS-PAGE evidenciando a expressão da proteína recombinante após

indução com IPTG. Pista 1: padrão PageRuler prestained protein ladder (de cima para baixo, em

kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10); pista 2: amostragem antes da indução do sistema

de expressão que codifica para a expansina; pista 3: três horas após a indução do sistema de

expressão que codifica para a expansina. As amostras foram diluídas para uma concentração

proteica máxima de 0,4 mg/mL em cada pista. ............................................................................. 41

Figura 13: Eletroforese SDS-PAGE das frações de purificação da enzima xilanase a partir de

lisado celular pela técnica IMAC em colunas de fluxo por gravidade. Pista1: padrão PageRuler

prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e

10); pista 2: lisado celular; pista 3: “flow-through”; pista 4: lavagem da coluna; pista 5: eluição a

20 mM; pista 6: eluição a 50 mM; pista 7: eluição a 75 mM; pista 8: eluição a 100 mM; pista 9:

eluição a 200 mM; pista10: eluição a 500 mM de imidazol. As amostras foram diluídas para uma

concentração proteica máxima de 0,5 mg/mL em cada pista. ....................................................... 42

Figura 14: Eletroforese SDS-PAGE das frações de purificação da enzima endoglucanase a partir

de lisado celular pela técnica IMAC em colunas de fluxo por gravidade. Pista 1: padrão

PageRuler prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35,

25, 15 e 10); pista 2: lisado celular; pista 3: “flow-through”; pista 4: lavagem da coluna; pista 5:

eluição a 20 mM; pista 6: eluição a 50 mM; pista 7: eluição a 75 mM; pista 8: eluição a 100 mM;

pista 9: eluição a 200 mM; pista 10: eluição a 500 mM. As amostras foram diluídas para uma

concentração proteica máxima de 0,5 mg/mL em cada pista. ....................................................... 43

Figura 15: Cromatograma da purificação da enzima xilanase a partir de lisado celular pela técnica

IMAC em sistema cromatográfico FPLC. A curva azul representa a UV a 280 nm, a curva verde

representa a concentração do tampão de eluição e os números em vermelho representam os

números das frações....................................................................................................................... 44

Figura 16: Eletroforese SDS-PAGE das frações de purificação da enzima xilanase a partir de

lisado celular pela técnica IMAC em sistema cromatográfico FPLC. Pista 1: padrão PageRuler

prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70 -em vermelho, 55, 40,

35, 25, 15 e 10 – em verde); pista 2: lisado celular; pista 3: fração 4; pista 4: fração 8; pista 5:

fração11 ; pista 6: fração 15; pista 7: fração 20; pista 8: fração 30; pista 9: fração 43; pista 10:

fração 49. ....................................................................................................................................... 45

xxi

Figura 17: Eletroforese SDS-PAGE das frações de purificação da proteína expansina a partir de

lisado celular pela técnica IMAC em colunas de fluxo por gravidade. Pista 1: padrão PageRuler

prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e

10); pista 2: lisado celular; pista 3: eluição a 50 mM; pista 4: eluição a 75 mM; pista 5: eluição a

100 mM; pista 6: eluição a 200 mM; pista 7: eluição a 500 mM. As amostras não foram diluídas.

....................................................................................................................................................... 46

Figura 18: Eletroforese SDS-PAGE da expressão (lisado clarificado) e purificação

cromatográfica das proteínas recombinantes. Pista 1: padrão protéico PageRuler prestained

protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10); pista 2:

lisado celular contendo endoglucanase; pista 3: endoglucanase purificada, após concentração e

troca de tampão; pista 4:lisado celular contendo xilanase; pista 5: xilanase purificada, após

concentração e troca de tampão; pista 6: lisado celular contendo expansina; pista 7: expansina

purificada, após concentração e troca de tampão. Todas as amostras estão diluídas 10 vezes. .... 47

Figura 19: Atividade celulásica total FPAse apresentada pelo coquetel fúngico T. reesei ao longo

do tempo de cultivo. Amostragens em 48, 72, 96, 120 e 144 horas. ............................................. 49

Figura 20: Eletroforese SDS-PAGE do sobrenadante fúngico de T. reesei das frações de

precipitação com sulfato de amônio a partir do mesmo. Pista1: padrão PageRuler prestained


sobrenadante de T. reesei; pista 3: precipitado a 40% de S.A.; pista 4: precipitado a 50% de S.A.;

pista 5: precipitado a 60% de S.A.; pista 6: precipitado a 70% de S.A.; pista 7: precipitado a 80%

de S.A. As amostras foram diluídas para uma concentração proteica máxima de 0,5 mg/mL em

cada pista. ...................................................................................................................................... 50

Figura 21: Gel SDS-PAGE dos permeados da diafiltração. Condições da corrida: TMP de 1,5;

fluxo de Retentado de 25 mL/mim e membrana de 30 kDa. Pista1: padrão PageRuler prestained


RDF; pista 3: RDF flush. As amostras estão diluídas 10 vezes. Replicata A da diafiltração. ....... 54

Figura 22: Gel SDS-PAGE da alimentação (ressuspensão do precipitado de T. reesei a 60% de

S.A.) e frações de saída da diafiltração (permeados e retentados). Condições da corrida: TMP de

1,5; fluxo de Retentado de 25 mL/mim e membrana de 30 kDa. Pista1: padrão PageRuler

prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25 e 15);

pista 2: alimentação; pista 3: PDF após recirculação de 36 mL de tampão pelo sistema; pista 4:

xxii

PDF após recirculação de 144 mL de tampão pelo sistema; pista 5 PDF após recirculação de 288

mL de tampão pelo sistema; pista 6: PDF após recirculação de 468 mL de tampão pelo sistema;

pista 7 RDF + RDF flush. Todas as pistas foram carregadas com as amostras diluídas 10 vezes.

Replicata A da diafiltração. ........................................................................................................... 55

Figura 23: Liberação de glicose (g/L) ao longo de 48 h de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar

hidrotérmico 190 pelo sobrenadante do extrato fúngico de T. reesei (fração 1), fração de

ressuspensão da precipitação de T. reesei a 60% de S.A (fração 2) e retentado de T. reesei (A)

(fração 3). Carga de 10 mg proteína/g de bagaço. ......................................................................... 57

Figura 24: Liberação de xilose (g/L) ao longo de 48 h de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar

hidrotérmico 190 pelo sobrenadante do extrato fúngico de T. reesei (fração 1), fração de



Figura 25: Liberação de celobiose (g/L) ao longo de 48 h de hidrólise do bagaço de cana-de-

açúcar hidrotérmico 190 pelo sobrenadante do extrato fúngico de T. reesei (fração 1), fração de



Figura 26: Conversão de celulose após hidrólise do bagaço hidrotérmico 190 por 48 h, 50 ºC e

1000 rpm para o sobrenadante do extrato fúngico de T. reesei (fração 1), ressuspensão da

precipitação de T. reesei a 60% de S.A (fração 2) e retentado de T. reesei (A) após diafiltração

(fração 3). Letras diferentes significam diferença estatística entre as médias pelo teste de Tukey a

0,05% de probabilidade. ................................................................................................................ 58

Figura 27: Efeito da adição de β-glicosidase na liberação de glicose em diferentes tempos de

hidrólise do BH 190, onde TR significa sobrenadante do Trichoderma reesei e TR+BGL

denomina o sobrenadante suplementado da enzima β-glicosidase. Experimento realizado em

Erlenmeyer de 125 mL (escala de 50 mL). Letras diferentes significam diferença estatística entre

as médias pelo teste de Tukey a 0,05% de probabilidade. ............................................................ 60

Figura 28: Efeito da adição de β-glicosidase na liberação de glicose em diferentes tempos de

hidrólise do BH 190, onde TR significa sobrenadante do Trichoderma reesei e TR+BGL

denomina o sobrenadante suplementado da enzima β-glicosidase. Experimento realizado em

tubos de 2,0 mL (escala de 1,5 mL). Letras diferentes significam diferença estatística entre as

médias pelo teste de Tukey a 0,05% de probabilidade. ................................................................. 60

xxiii

Figura 29: Comparação da conversão enzimática da celulose pelo extrato enzimático do T. reesei

com e sem adição da enzima β-glicosidase, em ambas as escalas. ............................................... 61

Figura 30: Padrão comparativo de hidrólise enzimática. Perfil de liberação de açúcares ao longo

de 48 h correspondente à hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar hidrotérmico 190 pelo coquetel

comercial Cellic CTec H2. Carga de 10 mg proteína/g de bagaço................................................ 62

Figura 31: Padrão comparativo de hidrólise enzimática. Perfil de liberação de açúcares ao longo

de 48 h correspondente à hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar hidrotérmico 190 pelo coquetel

comercial Celluclast 1.5 L. Carga de 10 mg proteína/g de bagaço. .............................................. 62

Figura 32: Eletroforese SDS-PAGE das proteínas utilizadas no planejamento de mistura (fatores).

As amostras foram diluídas para uma concentração proteica máxima de 0,5 mg/mL. Pista1:

padrão PageRuler prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55,

40, 35, 25 e 15); pista 2: T. reesei A; pista 3: endoglucanase; pista 4: β-glicosidase; pista 5:

endoxilanase; pista 6:acetilxilana esterase; pista 7: α-L-arabinofuranosidase; pista 8: expansina.64

Figura 33: Gráfico de Pareto para os efeitos. Análise feita com pseudocomponentes. Resposta

considerada: glicose (g/L). ............................................................................................................ 68

Figura 34: Superfície de resposta (glicose (g/L)) envolvendo os fatores presentes no coquetel

otimizado pelo planejamento de mistura. Os fatores são apresentados em pseudocomponentes.

Para gerar essa superfície, foi utilizado o modelo quadrático, ignorando os efeitos não

significativos. ................................................................................................................................. 72

Figura 35: Gráfico normal de probabilidade. Análise feita com erro puro e glicose (g/L) como

variável dependente. ...................................................................................................................... 76

xxv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Composição dos bagaços de cana-de-açúcar, em porcentagem na biomassa, submetidos

a três diferentes pré-tratamentos .................................................................................................... 21

Tabela 2: Concentração proteica e atividade enzimática das amostras geradas após concentração e

troca de tampão das frações de eluição contendo as proteínas purificadas (EX, EG e EXP) por

IMAC em colunas de fluxo por gravidade ou sistema cromatográfico FPLC. ............................. 47

Tabela 3: Recuperação proteica das frações da precipitação seriada do extrato fúngico de T.

reesei com sulfato de amônio. ....................................................................................................... 50

Tabela 4: Análise quantitativa do extrato bruto e das frações de precipitação a 40, 50 e 60% de

sulfato de amônio. ......................................................................................................................... 51

Tabela 5: Balanço de massa referente à precipitação do extrato fúngico de T. reesei com sulfato

de amônio. As frações de precipitação a 40 e 60% de sulfato de amônio, ressuspendidas em

volumes conhecidos, bem como o sobrenadante final desse processo, são comparados ao extrato

bruto incial. .................................................................................................................................... 52

Tabela 6: Atividades enzimáticas volumétricas e específicas do extrato fúngico de T. reesei e da

fração resultante da precipitação com sulfato de amônio. Fator de purificação e rendimento da

atividade também são apresentados. .............................................................................................. 52

Tabela 7: Balanço de massa da diafiltração. A alimentação é a fração de ressuspensão do

precipitado de T. reesei a 60% de S.A.. Após o procedimento, três frações são geradas na saída:

permeado (PDF), retentatdo (RDF) e retentado de lavagem/flush (RDF flush). Replicata A. ...... 53

Tabela 8: Balanço de massa da diafiltração. A alimentação é a fração de ressuspensão do

precipitado de T. reesei a 60% de S.A.. Após o procedimento, três frações são geradas na saída:

permeado (PDF), retentatdo (RDF) e retentado de lavagem/flush (RDF flush). Replicata B. ...... 53

Tabela 9: Comparações entre as amostras T. reesei obtidas através de ensaios de diafiltração e

utilizadas nas montagens de coquetéis enzimáticos otimizados. ................................................... 56

Tabela 10: Proporções máximas e mínimas dos sete fatores envolvidos no planejamento de

mistura. O valor entre parênteses corresponde à quantidade proteica em mg de proteína por g de

bagaço seco. A soma total das proporções entre os fatores, em cada corrida, deve ser 1. ............ 64

Tabela 11: Matriz experimental do planejamento de mistura com as composições de cada corrida

(valores reais). As respostas são representadas em g/L de açúcares liberados (celobiose, glicose e

xxvi

xilose), após 48 h de hidrólise. A primeira coluna representa a corrida (C) e a segunda representa

a replicata (R). A carga total de cada corrida é de 10 mg de proteína por g de bagaço seco. ....... 65

Tabela 12: Coeficientes do modelo matemático, erro residual, t-student e p-valor para os valores

não codificados (componentes originais). As demais interações de dois fatores (sem efeitos

significativos) foram consideradas para esta análise, porém não estão representadas na tabela. .. 69

Tabela 13: Tabela ANOVA para o modelo gerado através do planejamento de mistura. ............ 70

Tabela 14: Proporção dos fatores devido à maximização do modelo matemático proposto e

resposta gerada. ............................................................................................................................. 72

Tabela 15: Médias e desvios-padrão das concentrações de glicose após hidrólise do bagaço

hidrotérmico (BH 190) utilizando duas diferentes amostras como o fator “T. reesei“ na

composição do coquetel otimizado obtido através do Planejamento de Mistura. Letras diferentes

significam diferença estatística entre as médias pelo teste de Tukey a 0,05% de probabilidade. . 73

Tabela 16: Níveis máximos e mínimos dos fatores envolvidos no planejamento fatorial completo

23. Neste caso, o fator coquetel base é uma mistura de três componentes (T. reesei B, EG, BGL)

com proporção fixa entre eles. A unidade para todos os fatores são mg de proteína por g de

bagaço seco. ................................................................................................................................... 74

Tabela 17: Matriz experimental do planejamento fatorial com os níveis não-codificados dos

fatores de cada corrida, apresentados em mg de proteína por g de bagaço seco. As respostas são

representadas em g/L de açúcares liberados (celobiose, glicose e xilose), após 48 h de hidrólise.

....................................................................................................................................................... 74

Tabela 18: Coeficientes do modelo matemático, erro puro, t-student e p-valor para os valores

codificados dos fatores: coquetel base (BASE), endoxilanase (EX) e expansina (EXP). ............. 75

Tabela 19: Matriz experimental para as corridas contendo 4 mg de proteína do coquetel base por

grama de bagaço, variando apenas as concentrações de endoxilanase e expansina (mg de

proteína/g de bagaço seco). Resposta analisada em glicose (g/L) liberada após 48 h de hidrólise.

....................................................................................................................................................... 77

Tabela 20: Matriz experimental para as corridas contendo 8 mg de proteína do coquetel base por

grama de bagaço seco, variando apenas as concentrações de endoxilanase e expansina (mg de

proteína/g de bagaço seco). Resposta analisada em glicose (g/L) liberada após 48 h de hidrólise.

....................................................................................................................................................... 77

xxvii

Tabela 21: Quantidade média de glicose obtida após 48 h de hidrólise do bagaço hidrotérmico

(BH 190) sob ação única do coquetel base e do coquetel base suplementado de endoxilanase (EX)

ou expansina (EXP). Os valores entre parênteses representam a quantidade em mg de proteína

por grama de bagaço seco com que a reação foi carregada. Letras iguais indicam que a diferença

entre as médias não é significativa pelo teste de Tukey a 0,05% de probabilidade. ..................... 78

Tabela 22: Quantidade média de glicose obtida após 48 h de hidrólise do bagaço hidrotérmico

(BH 190) sob ação única do coquetel base e do coquetel base suplementado de endoxilanase (EX)

ou expansina (EXP). Os valores entre parênteses representam a quantidade em mg de proteína

por grama de bagaço seco com que a reação foi carregada. Letras iguais indicam que a diferença

entre as médias não é significativa pelo teste de Tukey a 0,05% de probabilidade. ..................... 78

Tabela 23: Matriz experimental dos ensaios de sinergismo. Os componentes são apresentados em

mg de proteína por g de bagaço seco. A resposta analisada é a concentração de glicose liberada,

em g/L, após 48 h de hidrólise do bagaço hidrotérmico 190. ........................................................ 80

Tabela 24: Sinergismo entre a fração de T. reesei e as proteínas EG, BGL, EX e EXP durante

hidrólise do bagaço de cana hidrotérmico 190, a 50ºC e pH 4,5. Experimento conduzido em

duplicata. ....................................................................................................................................... 81

Tabela 25: Atividades enzimáticas da fração T. reesei (ressuspensão do precipitado do coquetel

fúngico com 60% de S.A.)............................................................................................................. 82



em g/L, após 48 h de hidrólise do bagaço explodido à vapor. ...................................................... 83

Tabela 27: Sinergismo entre a fração de T. reesei e as proteínas EG, BGL, EX e EXP durante

hidrólise do bagaço de cana explodido à vapor, a 50ºC e pH 4,5. Experimento conduzido em

duplicata. ....................................................................................................................................... 84



em g/L, após 48 h de hidrólise do bagaço hidrotérmico 160. ........................................................ 84

Tabela 29: Sinergismo entre a fração de T. reesei e as proteínas BGL, EX e EXP durante

hidrólise do bagaço de cana hidrotérmico 160, a 50ºC e pH 4,5. Experimento conduzido em

duplicata. ....................................................................................................................................... 85

xxviii

xxix

LISTA DE SIGLAS

AFEX Explosão de fibra por amônia

ARF α-L-Arabinofuranosidase

AXE Acetilxilana esterase

BEX Bagaço de cana tratado por explosão à vapor

BGL β-glicosidase

BH 160 Bagaço de cana após tratamento hidrotérmico a 160 ºC e 10 min

BH 190 Bagaço de cana após tratamento hidrotérmico a 190 ºC e 60 min

BXL β-xilosidase

CBH Celobiohidrolase

CMC Carboximetil celulose

DNS Ácido dinitrosalicílico

EG Endoglucanase

EX Endoxilanase

EXP Expansina

FPase “Filter paper activity”

FPLC “Fast Protein Liquid Chromatography”

HPLC “High Performance Liquid Chromatography”

IMAC “Immobilized metal ion affinity chromatography”

p-NPC p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo

p-NPG p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo

xxx

p-NPX p-nitrofenil-β-D xilopiranosídeo

PDF Permeado da diafiltração

RDF Retentado da diafiltração

RDF flush Retentado da lavagem/ flush da diafiltração

S.A. Sulfato de amônio

VC Volume de coluna

WIS “Water-insoluble solids”

Y Rendimento

1

1 INTRODUÇÃO

A dependência energética de muitos países, assim como as mudanças da temperatura

global, devido à emissão de gases do efeito estufa, tem intensificado a busca por tecnologias que

permitam o uso de fontes energéticas renováveis e menos poluentes. Isso pode ser alcançado

através do uso de sistemas fixadores de gás carbônico, como, por exemplo, plantas e algas, e de

resíduos agroindustriais ricos em celulose e hemicelulose para a geração de combustíveis. Assim,

o balanço de CO2 (principal gás do efeito estufa) liberado devido à queima do combustível

renovável é muito menor quando comparado aos combustíveis fósseis, uma vez que aqueles já

fixaram grande parte de CO2 durante a fotossíntese (KHESHGI et al., 2000).

Na busca por alternativas aos combustíveis fósseis, o Brasil detém grande potencial de

matéria-prima, uma vez que é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo, apresentando como

previsão para 2014/15 um total de 671,69 milhões de toneladas para ser moída, com um aumento

de 2% em relação à safra de 2013/14. Essa cultura continua em expansão no nosso país, com uma

previsão de aumento de 3,6% na área plantada em relação à safra de 2013/14, totalizando

aproximadamente nove bilhões de hectares destinados à cana-de-açúcar. O estado de São Paulo

permanece como o maior produtor, com 51,7% da área plantada. O sucesso brasileiro na

produção de etanol de cana-de-açúcar, considerado um combustível sustentável uma vez que é

produzido a partir de uma fonte renovável, tem sido amplamente reconhecido como alternativa

importante e economicamente viável ao uso de combustíveis fósseis (MINISTÉRIO DE MINAS

E ENERGIA; EMPRESA DE PESQUISA ENERGÉTICA, 2007). Apenas para o Brasil, a

produção de etanol para 2014/15 é estimada em 28,37 bilhões de litros (COMPANHIA

NACIONAL DE ABASTECIMENTO, 2014). Contudo, a produção de etanol a partir de cana-de-

açúcar possui limitações no que diz respeito à utilização de grandes áreas cultiváveis, além da

impossibilidade de cultivo da cana-de-açúcar em variados tipos de clima e solo (SMEETS et al.,

2008). Além desses fatores, a soma da produção de etanol a partir do milho, nos EUA, e da cana-

de-açúcar, no Brasil, não é suficiente para suprir (ou substituir) uma considerável parcela da

demanda mundial de combustíveis fósseis. (BELL; ATTFIELD, 2006). A alternativa para o atual

cenário é o uso de biomassa, tais como resíduos agroindustriais, recursos florestais, lixos

municipais e industriais e outros materiais herbáceos (LIMAYEM; RICKE, 2012), como matéria-

prima para a produção de etanol. Esses tipos de biomassa apresentam uma vantagem adicional ao

2

serem destinados ao desenvolvimento energético, uma vez que não competem com a produção de

alimentos e, ainda, contribuem para a sustentabilidade ambiental. Adicionalmente a isso, há a

vantagem econômica de serem subprodutos de outros processos (BELL; ATTFIELD, 2006).

O bagaço de cana-de-açúcar é um resíduo da indústria sucroalcooleira brasileira

abundante e promissor para o desenvolvimento do etanol lignocelulósico. Atualmente, ele é

usado para gerar energia através de sua queima nas caldeiras das usinas. Entretanto, é possível

aumentar o seu valor agregado, pois é uma fonte de carbono que pode ser fermentada a etanol e

outras commodities. Com o desenvolvimento dessa tecnologia, o Brasil aumentará em

aproximadamente 40% a produção anual desse biocombustível, e consequentemente a

competitividade deste produto (DUARTE; MORI, 2012), além de ser uma das alternativas

potencialmente mais promissoras e ambientalmente sustentáveis para a substituição de

combustíveis fósseis (LYND et al., 2008).

Contudo, o etanol lignocelulósico, também chamado de etanol de segunda geração,

necessita de etapas adicionais ao etanol a partir do caldo da cana-de-açúcar, ou de primeira

geração, que são o pré-tratamento da biomassa e a hidrólise da biomassa pré-tratada. Isso se faz

necessário devido à complexa estrutura formada pelas fibras de celulose, hemicelulose e lignina,

tornando a biomassa recalcitrante e dificultando o acesso a estes polissacarídeos (celulose e

hemicelulose). Essa característica da biomassa lignocelulósica exige um trabalho mais intensivo e

custos mais elevados para o seu processamento e obtenção dos açúcares fermentescíveis

(HIMMEL et al., 2007). As eficiências das etapas de pré-tratamento e hidrólise se apresentam

como os maiores obstáculos para a competitividade e utilização em larga-escala desta fonte de

energia renovável (LYND et al., 2008).

O pré-tratamento do material lignocelulósico visa o desmantelamento do complexo

celulose-hemicelulose-lignina e maior exposição das fibras e cadeias de açúcares poliméricos

(celulose e hemicelulose). Em seguida, a conversão destes polímeros pode ser obtida através de

hidrólise ácida ou enzimática. A alternativa mais promissora consiste na hidrólise enzimática da

celulose e hemicelulose em açúcares fermentáveis, uma vez que as condições de operação são

mais brandas e não produzem os inibidores decorrentes das hidrólises ácidas. Porém, as enzimas

3

necessárias para a conversão, ou misturas delas, devem ser eficientes e vantajosamente

econômicas.

Dentre as enzimas necessárias para a conversão da biomassa em açúcares fermentescíveis,

encontram-se as celulases e hemicelulases. Essas enzimas agem de forma sinérgica, diferindo

entre si pela região que atuam e a maneira como hidrolisam o polissacarídeo. Sabe-se ainda que

outras moléculas, denominadas proteínas acessórias, têm sido recentemente reportadas como

facilitadoras da ação de celulases e importantes para a eficiência da reação de hidrólise. Dentre as

proteínas acessórias com atividade enzimática, destacam-se as galactanases, liases, pectinases e

diversos tipos de esterases, que atuam sobre as ligações químicas entre a celulose e os demais

polímeros componentes da parede celular (pectina, lignina, hemicelulase) (VAN DYK;

PLETSCHKE, 2012).

A atuação das enzimas sobre a biomassa ocorre de forma simultânea e sua eficiência é

dependente de alguns fatores, tais como o grau de cristalinidade das fibras e disponibilidade da

celulose (dificultada pela presença de lignina, pectina e hemicelulose). A variabilidade e

complexidade desse material têm levado ao desenvolvimento de coquetéis multienzimáticos

formulados racionalmente com base no conhecimento da biomassa, visando aumentar o

rendimento da reação de sacarificação de biomassa lignocelulósica (GUSAKOV et al., 2007;

ZHOU et al., 2009).

O emprego da montagem racional de coquetéis através de ferramentas estatísticas mostra-

se potencial tanto para a identificação da composição essencial mínima de enzimas quanto para a

predição da razão mássica entre estas. Pretende-se, com isso, obter coquetéis balanceados e feitos

sob medida para a biomassa a ser hidrolisada, com a possibilidade de redução de custos do

processo de hidrólise (MEYER et al., 2009).

1. 1 JUSTIFICATIVA

A viabilização da produção do etanol lignocelulósico apresenta gargalos que precisam ser

estudados e solucionados. Nesse aspecto, pode-se citar o entendimento detalhado da biomassa

lignocelulósica, desde sua formação até a maturação da parede celular vegetal, a escolha do pré-

tratamento e o domínio da hidrólise enzimática, no que diz respeito à caracterização e

conhecimento dos diversos tipos de sinergismo que ocorrem nessa reação.

4

A principal limitação da rota enzimática para conversão de biomassa em açúcares

fermentescíveis consiste no elevado custo de produção das enzimas e altas dosagens enzimáticas

necessárias para a sacarificação. (HESS, 2008; WYMAN, 2007). A produção de coquetéis

enzimáticos de baixo custo, a possibilidade de uso de altas cargas de sólidos nas reações e a

redução da carga enzimática necessária são soluções que individualmente ou em conjunto podem

alavancar a tecnologia do etanol de segunda geração. A redução de custo e aumento da atividade

das celulases são fatores que podem ser aprimorados com a melhoria da tecnologia da

fermentação e otimização de meios de cultivo. Aliada a isso, a aplicação de técnicas de

engenharia genética podem aumentar a capacidade secretora dos fungos filamentosos e a

produção de enzimas via micro-organismos geneticamente modificados (MENON; RAO, 2012).

Adicionalmente, uma melhoria da atividade e estabilidade de enzimas através de mutações sítio

dirigidas e a redução dos custos de fermentação através de indutores de expressão menos

onerosos também contribuem para a viabilização desse processo (PERCIVAL ZHANG et al.,

2006).

Além disso, se faz imprescindível a disponibilidade de enzimas celulolíticas e

hemicelulolíticas especialmente produzidas e formuladas para os substratos (biomassa) e

processos encontrados em cada planta industrial (PERCIVAL ZHANG et al., 2006). Desta

forma, conhecer a contribuição de cada enzima e identificar misturas eficazes que contém um

número mínimo de atividades enzimáticas essenciais, em uma combinação ótima, são fatores que

devem ser estudados e que podem contribuir para a viabilidade econômica da rota enzimática. O

desenvolvimento de micro-organismos eficientes e robustos e a integração das etapas do

processo para redução do número de estágios, da demanda de energia e reuso de vapor também

podem ser soluções para esse problema energético.

A eficiência hidrolítica de um complexo multienzimático tem sido atribuída a dois fatores

principais: as propriedades das enzimas que o constituem e as suas razões mássicas dentro do

coquetel (GUSAKOV et al., 2007). Sabe-se que a endoglucanase, celobiohidrolase I/II e β-

glicosidases são enzimas essenciais e formam a base do coquetel enzimático. A presença de

proteínas acessórias (hemicelulases, esterases, peroxidases, soleninas) tem sido reportada como

importante para o sucesso da hidrólise e, portanto, o conhecimento do efeito de concentração e

de sinergismo destas enzimas também deve ser considerado. Desta forma, o estudo de quais

5

enzimas são necessárias para uma hidrólise mais eficiente em termos de tempo, conversão e

custo, e a proporção entre estas contribuirá para o desenvolvimento de misturas enzimáticas com

formulação pré-definidas. Essas misturas que poderão ser inclusive reproduzidas através do uso

de sistemas recombinantes.

1.2 OBJETIVO

1.2.1 Objetivo Geral

Desenvolver coquetéis enzimáticos otimizados através da suplementação do extrato de

Trichoderma reesei, visando o aumento da eficiência de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar

pré-tratado.

1.2.2 Objetivos Específicos

- Produzir e purificar as proteínas recombinantes endoglucanase, xilanase e expansina.

- Através da fermentação do fungo Trichoderma reesei, obter uma fração enriquecida em

celulases, priorizando as celobiohidrolases.

- Definir, através de planejamentos de experimentos, uma composição de coquetel mínima

necessária para a hidrólise do bagaço de cana pré-tratado.

- Avaliar o sinergismo entre as enzimas a fim de identificar as misturas enzimáticas mais

promissoras.

- Avaliar a eficiência do coquetel otimizado para diferentes tipos de pré-tratamento do bagaço.

6

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 A estrutura da biomassa lignocelulósica

A biomassa lignocelulósica é composta, principalmente, de celulose, hemicelulose,

pectina e lignina. Os polissacarídeos (celulose e hemicelulose) estão ligados à lignina por

ligações covalentes e pontes de hidrogênio, tornando esse material recalcitrante e resistente a

diversos pré-tratamentos. Essas moléculas compõem a parede celular vegetal, que pode ser

dividida em três regiões: lamela média, primeiramente formada após a divisão celular, composta

essencialmente de pectina; parede primária, composta de pectina, celulose, hemicelulose e

proteínas; parede secundária, originada pela secreção de novos materiais devido ao

envelhecimento e diferenciação das células da parede primária. Nesta parede secundária, a

deposição de pectina é sessada, enquanto que há um notável aumento na síntese de lignina

(PÉREZ; MAZEU, 2005).

A celulose é o polímero orgânico mais abundante da natureza e o principal elemento

estrutural da parede celular na maior parte das plantas. Porém, a celulose pode ser subdividida de

acordo com sua forma, sendo sua forma natural, denominada celulose I ou nativa, a mais

abundante. As cadeias de celulose se constituem de monômeros de glicose unidos entre si

linearmente por ligações β (1→4) glicosídicas. Entretanto, enquanto uma extremidade da cadeia

possui um átomo de carbono anomérico envolvido em uma ligação glicosídica, o átomo de

carbono anomérico da outra extremidade está livre (Figura 1). Quando essas cadeias são

interligadas por ligações de hidrogênio, originam um polímero cristalino altamente insolúvel. A

união dessas cadeias originam as microfibrilas de celulose, dando à molécula mais força e

compactação (LIMAYEM; RICKE, 2012). Além disso, a orientação e disposição das

microfibrilas também estão relacionadas ao controle da capacidade de deformação da parede e a

direção em que essa deformação ocorrerá (PÉREZ; MAZEU, 2005).

7

Figura 1: Representação esquemática da cadeia de celulose. Adaptada de (PÉREZ; MAZEU, 2005)

As fibras de celulose são, por sua vez, unidas a outro tipo de heteropolímero ramificado, a

hemicelulose, através de ligações de hidrogênio e forças de van der Waals (PÉREZ; MAZEU,

2005). Esse polissacarídeo é formado principalmente por pentoses e hexoses (D-xilose, L-

arabinose, D-galactose, D-glicose, D-manose, ácido glucurônico e ácido manurônico), variando

de acordo com a espécie. A Figura 2 apresenta a estrutura desses monômeros em sua forma mais

predominante em solução: piranose para anéis com seis elementos (C5O) e furanose para anéis

com cinco elementos (C4O). Devido a essa variedade de açúcares que compõe a cadeia de

hemicelulose, várias enzimas são requeridas para a sua hidrólise (LIMAYEM; RICKE, 2012).

Sua estabilidade química e térmica é menor quando comparada à celulose. Isso ocorre

provavelmente pela falta de cristalinidade e baixo grau de polimerização da hemicelulose

(SPIRIDON, 2005). Essas características também oferecem mais acessibilidade às fibras, em

relação à celulose.

8

Figura 2: Isômeros cíclicos mais comuns nas hemiceluloses. Adaptada de (GRONDAHL; GATENHOLM, 2005)

Através de uma cadeia complexa de carboidratos α-D-galacturônico, intercalados por

unidades de α-L-(1-2) ramanose, são formadas as pectinas. Algumas partes da molécula ainda

contêm cadeias laterais compostas de monômeros do tipo arabinana e arabinoglucana. Essas

estruturas são responsáveis pela capacidade de troca iônica da parede celular e pelo pH interno

(PÉREZ; MAZEU, 2005).

A lignina inserida nos espaços ao redor dos polissacarídeos é uma rede polimérica

tridimensional formada por unidades fenólicas interligadas do álcool fenil propiônico (WYMAN,

2005). Esse polímero de parede constitui aproximadamente de 10% a 30% do peso seco da

madeira, fazendo com que seja a segunda molécula mais abundante da parede celular. Dentre as

vantagens decorrentes da presença da lignina, podemos citar: força mecânica, resistência a

patógenos, resistência a água e controle do transporte de solutos e de água (PÉREZ; MAZEU,

2005). A presença desse biopolímero aromático e rígido na reação de hidrólise faz com que seja

necessária uma alta carga enzimática, uma vez que pode ocorrer adsorção das enzimas a essas

moléculas. Além disso, a lignina também dificulta a acessibilidade das celulases à celulose

(CHEN et al., 2006).

9

Além das complexas interações dos polissacarídeos (celulose e hemicelulose) entre si e

destes com a lignina, a forma cristalina da fibra e a barreira física imposta pela lignina também

contribuem para a robustez e integralidade do material lignocelulósico. A Figura 3 ilustra o

complexo lignocelulósico.

Figura 3: Representação do complexo lignocelulósico. Adaptada de PÉREZ; MAZEU ( 2005).

A resistência ao acesso aos açúcares presentes na parede celular vegetal é uma resposta

evolutiva a forças mecânicas externas e ao ataque de micro-organismos. As propriedades

biomecânicas da parede celular vegetal são devidas, principalmente, à reticulação dos polímeros

constituintes (MCCANN; CARPITA, 2008). Assim, o desmantelamento desses componentes e a

conversão dos mesmos a açúcares fermentescíveis, de maneira eficiente e viável

economicamente, é um grande desafio à ciência e um dos gargalos para a tecnologia do etanol de

segunda geração.

2.2 O etanol lignocelulósico

A produção do etanol lignocelulósico requer etapas adicionais quando comparada com a

produção do etanol de primeira geração. Essas etapas são necessárias devido à forma como os

polissacarídeos estão dispostos e à recalcitrância da biomassa, e suas principais funções são gerar

monossacarídeos fermentescíveis. São elas: o pré-tratamento e a hidrólise.

10

Assim, o processo global que envolve a produção do biocombustível lignocelulósico

compreende, primeiramente, o preparo da biomassa através da peneiração, a fim de aumentar a

uniformidade e superfície de contato. Segue-se, então, para a etapa do pré-tratamento, rompendo

parcialmente a parede celular e expondo os polímeros de açúcar à fase líquida. Posteriormente,

ocorre a conversão dos polímeros de açúcar, disponibilizados pela etapa anterior, a

monossacarídeos através da ação de ácidos ou misturas enzimáticas. Assim, tem-se o material

necessário para a próxima etapa, a fermentação. Nesse estágio, as pentoses e hexoses são

convertidas a etanol por micro-organismos. Por último, é feita uma destilação para a recuperação

do etanol. Lignina e resíduo biológico, subprodutos gerados dessa produção, podem ser

reciclados pelo sistema para gerar calor e eletricidade (HESS, 2008). A Figura 4 mostra a

representação gráfica destas etapas.

Figura 4: Etapas do processo de obtenção do etanol de 1º e 2º gerações. As setas tracejadas representam as etapas

adicionais requeridas para a produção do etanol de 2º geração.

2.3 Pré-tratamentos

Os pré-tratamentos mais comumente utilizados são classificados em físicos, químicos,

físico-químicos e biológicos (ODEGA; PETRI, 2010). Os principais objetivos dessa etapa são a

redistribuição da lignina no material lignocelulósico, aumento da porosidade da parede celular,

redução da cristalinidade e do grau de polimerização da celulose, redução de tamanho e aumento

da área superficial dos polissacarídeos para uma maior acessibilidade das enzimas (LIMAYEM;

11

RICKE, 2012). Entretanto, a seleção do pré-tratamento tem um grande impacto no processo

subsequente de hidrólise enzimática e muitos fatores devem ser levados em consideração, como o

custo do processo, o grau de deslignificação da biomassa, o micro-organismo a ser usado para a

fermentação, a geração de produtos de degradação considerados inibidores da hidrólise ou da

fermentação e a recuperação da lignina (VANDYK; PLETSCHKE, 2012).

Os pré-tratamentos físicos objetivam, basicamente, a diminuição do tamanho das

partículas e, com isso, a redução da cristalinidade e o aumento da transferência de massa. Isso

pode ser feito através da moagem, irradiação (raios gama, radiação por micro-ondas, etc) e

extrusão (MENON; RAO, 2012).

Dentre os pré-tratamentos químicos, estão os ácidos, alcalinos, por líquidos iônicos e o

fracionamento por solventes. Esse tipo de pré-tratamento é o mais estudado dentre as categorias

de pré-tratamento (MENON; RAO, 2012). Nos pré-tratamentos ácidos, as moléculas de

hemicelulose e celulose são hidrolisadas a açúcares simples, como xilose e glicose,

respectivamente. Esta xilose pode ser degradada em furfural, que pode ter aplicação econômica

ou ser um componente tóxico às subsequentes etapas da produção do etanol. O ácido mais

utilizado por esta técnica é o ácido sulfúrico, seguido pelo ácido clorídrico, fosfórico e nítrico.

Após a hidrólise ácida, é necessária a recuperação dos ácidos, o que faz com que esse processo

seja desvantajoso, uma vez que este passo é oneroso e demanda energia. Já nos pré-tratamentos

alcalinos, parte da lignina é removida devido à degradação das ligações éster e das cadeias

laterais glicosídicas. As bases mais comuns são hidróxido de amônia, hidróxido de sódio,

hidróxido de potássio e hidróxido de cálcio. Após esse tipo de pré-tratamento, se faz necessário

um passo de neutralização a fim de remover a lignina e inibidores, como o furfural, ácidos

fenólicos, sais e aldeídos (MENON; RAO, 2012). Desta forma, a associação dos tratamentos

ácido (remoção da hemicelulose) e alcalino (remoção da lignina) resulta em celulose

relativamente pura. O uso de líquidos iônicos é um potencial pré-tratamento da celulose, levando

à redução da cristalinidade e aumento do rendimento nas etapas subsequentes. Eles são

caracterizados pela baixa pressão de vapor, estabilidade térmica e propriedades ajustáveis, como

polaridade, hidrofobicidade e miscibilidade em solventes. O fracionamento com solventes se

baseia na solubilização diferencial e no fracionamento dos componentes da parede celular. Entre

eles, o mais conhecido é o método organosolv (ODEGA; PETRI, 2010).

12

Os métodos de explosão a vapor, explosão de fibra por amônia (AFEX) e hidrotérmico,

dentre outros, são agrupados na categoria de pré-tratamentos físico-químicos. A explosão a vapor

opera com vapores saturados a alta pressão e altas temperaturas (160-260ºC) durante certo

período de tempo (de alguns segundos até vários minutos), até que a pressão é reduzida

repentinamente, fazendo com que o material sofra uma descompressão explosiva. Esse método

causa a hidrólise parcial e a solubilização da hemicelulose e a transformação da lignina, que é

redistribuída pela celulose e parcialmente removida do material insolúvel (MENON; RAO,

2012). Esse processo pode ser realizado na presença ou ausência (autohidrólise) de um

catalisador ácido. A autohidrólise é resultado da ação de ácidos orgânicos, formados a partir de

grupos acetil submetidos a altas temperaturas. Entretanto, essas condições de temperatura

promovem a degradação do açúcar e, consequentemente, a formação de produtos de degradação.

Quando um ácido é empregado nesse pré-tratamento como um catalisador, aumenta-se a

digestibilidade da celulose, melhora-se a hidrólise da hemicelulose e diminui-se a formação de

produtos de degradação a partir dos açúcares (OLSSON et al., 2005). Após o pré-tratamento por

explosão a vapor, é comum um passo adicional para a remoção da lignina presente na fração

insolúvel. Essa deslignificação pode ser conduzida pela lavagem alcalina do material, utilizando

NaOH, e posterior adição de H2O2. Já foi provado que baixas concentrações de lignina impactam

em um melhor desempenho das enzimas e a carga enzimática pode ser reduzida para se atingir a

mesma conversão de açúcares (YANG et al., 2002).

No pré-tratamento hidrotérmico, é utilizada pressão para que a água seja mantida líquida a

altas temperaturas. A maior vantagem desse método é presença mínima ou nula de inibidores da

fermentação (KIM et al., 2009). Estudos demonstram que até 80% da hemicelulose é removida

através desse pré-tratamento (MOSIER et al., 2005). Além disso, as partículas são

consequentemente reduzidas por este processo, não sendo necessárias etapas físicas de redução

do tamanho das mesmas. Isso faz com que o pré-tratamento seja atrativo em larga escala. Devido

a maior quantidade de água presente no pré-tratamento hidrotérmico em relação ao de explosão a

vapor, a maior diferença entre eles está na concentração dos produtos solúveis, sendo maior no

método de explosão a vapor (HENDRIKS; ZEEMAN, 2009).

A presença da lignina no material pré-tratado dificulta a hidrólise, pois reduz a

acessibilidade das enzimas e pode haver perda de enzimas devido à adsorção inespecífica. Por

13

outro lado, a não deslignificação da biomassa, como ocorre no caso do pré-tratamento

hidrotérmico, apresenta alguns importantes pontos positivos. Estudos mostram que a remoção

severa da lignina (resultando em proporção de lignina menor que 5% no material), juntamente

com a xilana, causa agregação das microfibrilas de celulose, resultando em uma diminuição da

acessibilidade das enzimas e, consequentemente, diminuindo a digestibilidade da celulose

(ISHIZAWA et al., 2009).

Quando se trata de pré-tratamentos biológicos, o foco está nas enzimas produzidas por

micro-organismos, fungos e bactérias. Elas são capazes de modificar a composição química e a

estrutura da biomassa lignocelulósica, tornando-a mais acessível à posterior digestão enzimática

durante a hidrólise. As vantagens dessa técnica estão na não utilização de químicos, baixos gastos

de energia, condições de operação brandas e ambientalmente amigáveis. Entretanto, a eficiência é

baixa, além da possibilidade dos micro-organismos consumirem não apenas a lignina, mas

também os polissacarídeos que seriam destinados à fermentação (MENON; RAO, 2012).

2.4 Hidrólise enzimática

Após a biomassa lignocelulósica ser pré-tratada, ela pode seguir para a próxima etapa, a

hidrólise, que pode ser ácida ou enzimática. A hidrólise ácida gera produtos de degradação e

aldeídos devido a significante desidratação química dos monossacarídeos formados (SUN;

CHENG, 2002). Assim, a maior ênfase da etapa de hidrólise está na utilização de enzimas. Esta

rota enzimática pode ser dividida em hidrólise e fermentação separadas, e sacarificação e

fermentação simultâneas. O bioprocesso consolidado é um tipo de sacarificação e fermentação

simultâneas, onde o micro-organismo responsável pela fermentação é capaz de produzir as

enzimas necessárias para converter o polissacarídeo. Todas as reações ocorrem no mesmo

biorreator. Alguns micro-organismos, no bioprocesso consolidado, conseguem converter a

biomassa lignocelulósica diretamente a etanol (OLSSON et al., 2005). Para os processos que

envolvem a etapa de hidrólise, as moléculas de celulose e hemicelulose são digeridas a

monômeros de glicose e xilose, respectivamente. Para que isso ocorra, são necessárias as ações

de diversas classes enzimáticas.

Na hidrólise enzimática, as enzimas atuam de forma sinérgica e diferem entre si pela

região em que hidrolisam as moléculas de celulose e hemicelulose. A desconstrução da cadeia

14

polimérica de celulose em açúcares simples é catalisada pela ação sinérgica de três classes de

enzimas: endoglucanases (EG) (EC 3.2.1.4), celobiohidrolases (CBHI e CBHII) e β-glicosidases

(BGL) (EC 3.2.1.21). A reação catalisada pela EG promove a clivagem aleatória e interna à

cadeia de celulose das ligações glicosídicas β-1,4 em regiões de baixa cristalinidade da superfície

da fibra. Essa clivagem faz com que novas extremidades, redutoras e não redutoras, fiquem

disponíveis para a ação das CBH. Estas clivam as fibras de celulose a partir de cadeias terminais

livres, sendo que as CBHI atacam em extremidades redutoras (EC 3.2.1.176) e as CBHII (EC

3.2.1.91) em extremidades não redutoras, liberando oligossacarídeos de glicose, em geral

celobiose. Estes dímeros são, então, hidrolisados através de suas regiões terminais e não

redutoras pela ação catalítica das BGL, gerando monômeros de glicose. Além disso, é muito

importante a catálise conjunta com enzimas hemicelulolíticas, como as endo-1,4-β-D-xilanases

(EX), glicosidases classificadas sob a forma EC 3.2.1.8, que hidrolisam as ligações xilosídicas β-

D-(1-4) em xilanas; as 1,4-β-D-xilosidases (BXL) (EC 3.2.1.37), que convertem as xilanas em

monossacarídeos de xilose, a partir dos terminais não redutores; as endo-1,4-β-D-mananase (EC

3.2.1.78), que clivam ligações internas; as 1,4-β-D-manosidase (EC 3.2.1.25), convertendo mano-

oligosacarídeos a manose; as acetil xilana esterases (AXE) (EC 3.1.1.72), clivando ligações éster

carboxílicas da cadeia e liberando álcool e acetato como produtos e as α-L-arabinofuranosidases

(ARF) (EC 3.2.1.55), que catalisam a hidrólise de ligações arabinofuranosídicas dos terminais

não redutores de polissacarídeos arabinofuranosídicos, como arabinoxilanos, arabinanas e outros

(GILEAD; SHOHAM, 1995). Tanto as enzimas acetil xilana esterase e α-L-arabinofuranosidase,

quanto as α-galactosidase (EC 3.2.1.22), α-glucuronidase (EC 3.2.1.139) e feruloil esterase (EC

3.1.1.73) atuam na remoção de grupos laterais às cadeias de hemicelulose.

Em relação à classificação das enzimas, as nomenclaturas de acordo com sistema IUBM

se baseiam na especificidade pelo substrato. Isso faz com que haja uma dificuldade de

classificação correta, uma vez que as enzimas podem apresentar especificidade a vários

substratos. Assim, surgiu uma classificação alternativa, baseada na homologia de sequência e

grupos hidrofóbicos, pois proteínas homólogas em relação a sequencia de aminoácidos devem ter

estrutura tridimensional e sítios ativos semelhantes e, consequentemente, mecanismo hidrolítico

também similar (HENRISSAT; DAVIES, 1997). Além disso, essa classificação coopera na

identificação de relações evolutivas entre as enzimas. Proposta por Henrissat, essa classificação

15

organiza as glicosil hidrolases em 133 famílias proteicas, disponíveis para consulta no endereço

eletrônico http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html (CANTAREL et al., 2009).

Entretanto, as enzimas classificadas em uma mesma família, apesar de apresentarem estruturas

tridimensionais similares, suas especificidades a substratos podem ser diferentes.

Dependendo da composição da biomassa a ser hidrolisada, enzimas acessórias também se

fazem necessárias para uma eficiente reação de hidrólise. São elas as lacases, peroxidases,

galactanase, mananases, liase e pectinase (BANERJEE et al., 2010). Proteínas acessórias também

podem aumentar a eficiência da reação de hidrólise, como as expansinas (EXP), por promoverem

o afrouxamento da parede celular em plantas através da quebra das pontes de hidrogênio entre as

microfibrilas de celulose e açúcares adjacente. Esse mecanismo de rompimento da biomassa

ocorre de forma não hidrolítica. Assim, apesar da expansina não apresentar atividade hidrolítica,

a presença dessa enzima acessória melhora a hidrólise da celulose, uma vez que torna a fibra mais

acessível ao ataque enzimático (COSGROVE, 2000). Há evidências de que as soleninas,

proteínas de rompimento da parede celular como as expansinas, promovem a dissolução da

hemicelulose e a degradação da celulose, a partir de palha de milho pré-tratada à vapor

(GOURLAY et al., 2013). A Figura 5 mostra a ação sinérgica das celulases e da expansina sobre

a biomassa lignocelulósica, enquanto que a Figura 6 apresenta os sítios de ação das hemicelulases

sobre a xilana.

Figura 5: Representação do mecanismo de ação das celulases (celobiohidrolases, β-glicosidase e endoglucanase) e

proteína acessória sobre a biomassa lignocelulósica.

16

Figura 6: Estrutura da xilana e as regiões de catálise por quatro diferentes classes hemicelulolíticas (endoxilanase, β-

xilosidase, α-L-arabinofuranosidase e acetil xilana esterase).

Durante a hidrólise, algumas enzimas têm seus domínios catalíticos enzimáticos

aproximados da superfície celulolítica através de um domínio de ligação à celulose (CBD),

aumentando, assim, o tempo de contato entre essas enzimas e a fibra. No caso das

celobiohidrolases, além de apresentarem o CBD, o substrato é posicionado interiormente à sua

estrutura durante a catálise, garantindo assim que a fibra permanecerá nesse túnel e que a mesma

será hidrolisada em um modo progressivo. Já nas endoglucanases, o sítio ativo é posicionado

mais externamente (OLSSON et al., 2005).

Outro ponto importante para a eficiência da hidrólise é a carga de sólidos empregada. O

uso de altas cargas implicaria em um aumento da inibição enzimática por produto. Em geral, as

reações são conduzidas com concentração de sólido inferior a 10-15% não apenas pelo fato da

inibição, mas também pela dificuldade de mistura do meio reacional a concentrações mais

elevadas. Em relação à carga enzimática, valores de até 15 FPU por grama de celulose são mais

condizentes com as necessidades industriais (OLSSON et al., 2005).

Ao decorrer da hidrólise, o açúcar (glicose) gerado pode causar inibição por produto da β-

glicosidase. A falta de atividade dessa enzima leva ao acúmulo de seu substrato, a celobiose.

Altas concentrações de celobiose no meio reacional podem causar a inibição por produto das

celobiohidrolases. Para reverter esse quadro, as alternativas são adição de mais enzimas à reação

17

ou remoção do açúcar formado. No caso dos processos de sacarificação e fermentação

simultâneas, o açúcar formado é removido através da sua fermentação a etanol pelo micro-

organismo. (OLSSON et al., 2005).

A busca por enzimas cada vez mais eficientes e que se adequam às condições necessárias

para cada etapa do processo de produção do etanol lignocelulósico tem se intensificado. Um

exemplo disso são as enzimas termofílicas, estáveis e ativas em pH ácido e altas temperaturas.

Algumas glicosil hidrolases com potencial industrial já foram identificadas a partir de organismos

termofílicos (HESS, 2008).

Atualmente, os principais coquetéis enzimáticos comerciais, como o Cellic CTec e a

Celluclast 1,5 da Novozymes, são produzidos a partir de fungos e suplementados com outras

atividades, produzidas em sistemas recombinantes, a fim de se obter formulações otimizadas cada

vez mais eficientes. Dentre os fungos usados para a produção de enzimas celulolíticas, o

Trichoderma reesei é um dos mais eficientes e produtivos já reportados (LIMAYEM; RICKE,

2012). Os fungos produzem uma gama muito grande de enzimas e as atividades são moduladas

dependendo do meio e das condições de cultivo. Entretanto, as celulases mais importantes podem

ser expressas a um nível insuficiente para uma hidrólise efetiva da celulose ou o complexo

celulolítico secretado pode não estar bem balanceado em nível de enzimas individuais

(GUSAKOV et al., 2007). Assim, determinadas atividades devem ser acrescentadas para

suplementar o coquetel fúngico. A escolha destas atividades depende das características da

biomassa e do processo, em maior ou menor extensão.

2.5 Otimização de coquetéis enzimáticos

Para se construir uma mistura enzimática que contenha as atividades mínimas essenciais e

que estas estejam presentes na proporção adequada, muitos estudos de otimização baseados

sinergismo têm sido relatados na literatura (VAN DYK; PLETSCHKE, 2012). A maneira

apropriada de se determinar a real contribuição de uma determinada proteína é através de ensaios

em que se possa controlar sua presença em uma mistura, podendo adicioná-la e retirá-la. Além

disso, deve-se usar um substrato lignocelulósico real, e não fontes de carbono sintéticas

(BANERJEE et al., 2010). O sinergismo entre celobiohidrolases e endoglucanase, quando atuam

sobre a fibra de celulose, pode ser atribuído à ação simultânea e complementar dessas duas

18

enzimas. Desta forma, a endoglucanase, ao clivar a cadeia em regiões aleatórias, libera novos

terminais celulolíticos que são substratos para as celobiohidrolases. Estas, por sua vez, clivam a

fibra de celulose de maneira sucessiva, devido à sua forte ligação à fibra e seu modo de ação,

removendo a camada de celulose mais externa à fibra e expondo a inferior para ação das

endoglucanases (VÄLJAMÄE et al., 1998). Quando se trata das β-glicosidases, estas também são

essenciais para um bom rendimento da reação de hidrólise, uma vez que a celobiose (substrato

para a β-glicosidase) é um inibidor de celobiohidrolases muito mais forte que a glicose (produto

liberado pela β-glicosidases) (HOLTZAPPLE et al., 1990). Assim, um coquetel enzimático

otimizado prevê a presença de, pelo menos, essas três classes enzimáticas.

O principal desafio experimental dos avanços na pesquisa de coquetéis artificiais

otimizados é a obtenção de enzimas purificadas em quantidades suficientes para os ensaios

(BANERJEE et al., 2010). A recorrência à expressão heteróloga dessas proteínas em micro-

organismos como a Escherichia coli e Pichia pastoris é interessante, uma vez que as demais

proteínas produzidas por eles durante o cultivo apresentam baixo potencial de interferência com

as atividades enzimáticas requeridas (SCHUTTER, DE et al., 2009). Além disso, através de

ferramentas de biologia molecular é possível a inserção de cauda de histidina nestas proteínas

heterólogas, permitindo que as mesmas sejam purificadas de forma específica e em apenas um

passo por técnicas de cromatografia envolvendo resinas carregadas positivamente com o íon

níquel. Esta técnica é denominada IMAC (Immobilized metal ion affinity chromatography).

Misturas otimizadas de celulases se apresentam como uma vertente viável e eficiente para

o aumento da glicose liberada após hidrólise de substratos lignocelulósico (ZHOU et al., 2009).

ZHOU et al. (2009) purificaram três celobiohidrolases (Cel7A, Cel6A e Cel6B), três

endoglucanase (Cel7B, Cel12A e Cel61A) e uma β-glicosidase a partir de Ttichoderma viride T

100-14. Através de planejamentos experimentais, reconstruíram a mistura de celulases de modo a

maximizar a liberação de glicose durante a hidrólise, que aumentou 2,1 vezes em relação ao

coquetel original. A mistura otimizada apresentou a seguinte composição: Cel7A (19,8%), Cel6A

(37,5%), Cel6B (4,7%), Cel7B (17,7%), Cel12A (15,2%), Cel61A (2,3%) e β-glicosidase (2,8%).

Após produzir e purificar seis glicosil hidrolases, GAO et al. (2010) encontraram as proporções

enzimáticas otimizadas correspondentes a conversões máximas da palha de milho pré-tratada pela

técnica AFEX. As análises foram feitas com auxílio de planejamento de experimentos para

19

misturas e a composição ótima foi 27 – 30% de CBHI, 17 – 20% de CBHII, 29 – 35% de EGI, 14

– 15% de endoxilanase, 2 – 6% de β-xilosidase e 1 – 5% de β-glicosidase. Vale ressaltar que

essas proporções são específicas para o referido substrato. As relações enzimáticas dos coquetéis

sintéticos dependem da carga total de proteína a ser empregada. Além disso, diferentes substratos

e pré-tratamentos requerem diferentes perfis enzimáticos para uma hidrólise máxima (MEYER et

al., 2009).

Dentre os mecanismos que limitam a acessibilidade das celulases à fibra de celulose, a

presença de xilana (ou hemicelulose) é um dos mais relevantes. A adição de xilanase às celulases

(Celluclast) aumenta a eficiência da hidrólise, uma vez que facilita o acesso das enzimas à

celulose. Além disso, para se obter a mesma conversão, o sistema que apresenta suplementação

de xilanase requer quantidades muito menores de celulases. Desta forma, cargas enzimáticas

reduzidas podem ser empregadas para a hidrólise quase completa de uma determinada biomassa,

nesse caso palha de milho pré-tratada à vapor, ao se fazer uso das interações sinérgicas entre as

proteínas (HU et al., 2011). DELABONA et al. (2013) suplementaram o extrato fúngico de

Trichoderma harzianum com as enzimas pectinase e α-L-arabinofuranosidase, aumentando a

eficiência de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado em até 116%.

Finalmente, a montagem racional de coquetéis sintéticos e a suplementação enzimática de

coquetéis fúngicos podem oferecer conversões máximas do substrato em questão. Possivelmente,

isto pode impactar na redução dos custos do processo de hidrólise, uma vez que quantidades

mínimas de enzimas seriam adicionadas à reação de hidrólise.

20

3 METODOLOGIA

Esse trabalho foi desenvolvido entre Janeiro de 2013 a Agosto de 2014 no Laboratório

Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE).

3.1 Bagaço de cana-de-açúcar

O bagaço de cana-de-açúcar hidrotérmico (BH 190) foi produzido e caracterizado no

Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE) pelo Dr. George Jackson da

Rocha e uma fração foi cedida para a realização deste projeto. O bagaço foi proveniente da Usina

da Pedra, safra 2012/2013, variedade SP81-3250, colhido mecanicamente. A reação de pré-

tratamento foi conduzida em reator com 350 L de capacidade, munido de agitação mecânica, com

aquecimento de vapor fluente e encamisado com óleo térmico. O reator foi primeiramente

carregado com aproximadamente 180 L de água e pré-aquecido através de fluído térmico entre

200°C e 270°C, até atingir a temperatura de 90°C. Após esse estágio, aproximadamente 20 kg

(base seca) de bagaço de cana foram transferidos ao reator. A relação sólido/líquido foi de 1:10

(m/v). O reator foi fechado, aquecido e mantido à temperatura de 190°C durante 10 min. Após

este tempo, foi gradativamente despressurizado até pressão atmosférica e resfriado

concomitantemente com fluido térmico à temperatura ambiente. Os gases produzidos durante o

processo de despressurização foram recolhidos através de um sistema de condensação refrigerado

com água gelada a 17°C. As frações líquidas e sólidas foram separadas através de filtração. A

fração sólida foi lavada com água até a isenção de compostos proveniente da hidrólise da

hemicelulose (açúcares, ácidos carboxílicos e produtos de degradação), bem como os fragmentos

de lignina. Dependendo da escala da reação, o bagaço foi empregado moído ou em sua forma

integral.

Outra variação do pré-tratamento hidrotérmico (BH 160) foi aplicada para bagaço

proveniente de colheita mecânica em agosto de 2010. Neste caso, as reações foram conduzidas

utilizando 30% da capacidade do reator (500 mL) e uma relação sólido/liquido de 1:5 (m/v). Os

reatores foram colocados em banho de glicerina à temperatura de 163oC, para que o material a ser

tratado permanecesse a 160ºC. Após o tempo total de reação de 60 minutos, os reatores foram

instantaneamente resfriados em banho de gelo por 20 minutos. As frações sólida e líquida foram

21

separadas por prensagem manual. Esse material foi produzido pela Dra. Priscila Maziero no

Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE).

O pré-tratamento por explosão à vapor (BEX) também foi aplicado ao bagaço de cana-de-

açúcar. A reação foi realizada a 190ºC por 10 minutos, no Laboratório Nacional de Ciência e

Tecnologia do Bioetanol (CTBE), e uma fração desse material nos foi cedida pela Dra.

Elenise Bannwart de Moraes Torres. Neste tipo de pré-tratamento, o bagaço é submetido a um

processo no qual é adicionado vapor ou água quente a altas pressões e temperaturas, visando

diminuir a recalcitrância do mesmo. Este experimento foi realizado em reator do tipo horizontal e

contínuo com capacidade de processamento de 0,6 m3/h (aproximadamente 50 kg/h de bagaço

base seca), temperatura máxima igual a 200°C e pressão máxima igual a 14,5 barg.

A diferença operacional entre os tratamentos hidrotérmico a 190ºC e por explosão à vapor

se baseia no fato de que no primeiro tratamento o produto é subresfriado através da adição de

água, enquanto que no segundo o produto é descarregado através de uma despressurização súbita.

As caracterizações dos bagaços pré-tratados (Tabela 1) foram realizadas através da

quantificação, por HPLC, dos componentes solúveis (carboidratos - celulose e hemicelulose-,

ácidos orgânicos, furfural e hidroximetilfurfural) após hidrólise do material com ácido sulfúrico a

72% v/v. A lignina solúvel é quantificada por absorbância a 280 nm, e as cinzas e a lignina

insolúvel por gravimetria (GOUVEIA et al., 2009). As biomassas BH 160 e BEX foram

empregadas nos ensaios de hidrólise sem lavagem após os pré-tratamentos. Nestes casos, foi feita

a caracterização dessas biomassas não lavadas e, posteriormente, as mesmas foram lavadas com

50 mL de água aquecida (50ºC). A água resultante dessa lavagem foi quantificada em relação às

concentrações de glicose e xilose, cujos valores foram descontados da composição do material

não-lavado para a obtenção da composição química final (Tabela 1).

Tabela 1: Composição dos bagaços de cana-de-açúcar, em porcentagem na biomassa, submetidos a três diferentes

pré-tratamentos.

Pré-tratamento Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%) Cinzas

(%)

BH 190 60,56 3,13 29,88 6,2

BH 160 54,25 14,05 26,92 4,02

BEX 37,01 21,1 28,66 11,06

22

3.2 Enzimas

3.2.1 Enzimas comerciais

As enzimas comerciais escolhidas para a realização deste trabalho foram: coquetel Cellic

CTec H2 Batch nº: VCPI 0006, Novozymes; Celluclast 1.5 L, Novozymes; β-glicosidase (BGL)

C6105 de Aspergillus niger, Sigma (Novozyme 188). As enzimas α-L-arabinofuranosidase

(ARF) e acetilxilana esterase (AXE) são da Megazyme e apresentam 12,1 U/mg, 500 U/mL e

estão dissolvidas em 3,2 mol/L de sulfato de amônio. Essas enzimas diferem entre si no tipo de

catálise e na região em que seus sítios ativos clivam o substrato.

3.2.2 Produção de coquetel enzimático fúngico

O sobrenadante fúngico foi obtido a partir do cultivo do micro-organismo Trichoderma

reesei Rut C30 (ATCC 56765), fornecido pelo Laboratório de Biossíntese de Hidrolases

Fúngicas, CTBE. O cultivo foi feito no biorreator New Brunswick - Bioflo Celligen EUA 115 de

capacidade de 6 L.

O inóculo foi obtido pela raspagem de quatro placas de petri contendo o fungo. Para cada

placa foram utilizados 20 mL de solução de Tween 80 0,1%. Esses 20 mL resultantes foram

transferidos igualmente para 4 frascos Erlenmeyer (2L) contendo 0,5 L de meio de cultivo em

cada. Esse meio continha, para cada Erlenmeyer (por 0,5 litro): 5 g de celulose celuflok; 5 g de

glicose; 0,5 mL de Tween 80; 0,5 g de peptona; 25 mL de solução de sais, representando no

volume final 1 g de KH2PO4, 0,7 g de (NH4)2SO4, 0,15 g de uréia, 0,15 g de MgSO4.7H2O, 0,15 g

de CaCl2, 2,5 mg de FeSO4.7H2O, 0,7 mg de ZnSO4.7H2O, 0,8 mg de MnSO4.H2O e 1 mg de

CoCl2, 20 mL de inóculo e 455 mL de água. Os inóculos foram mantidos em agitadores orbitais

(Inova 44, New Brunswick Scientific) por 72 horas a 29ºC e 200 rpm.

O biorreator utilizado para este processo foi autoclavado já contendo o meio SemiMIX30,

composto de celuflok celulose 30 g/L, peptona vegetal 1,5 g/L, Tween 80 1,5 mL/L, solução de

sais 150 mL/L, farelo de soja 3 g/L, 15%v/v de inóculo (900 mL) e 4,191 L de água para

completar o volume de reação de 6 L (PEREIRA, 2012). O cultivo foi mantido por 144 horas, a

29ºC, pH 5,0 e D.O de 20%, com uma faixa operacional de agitação entre 200 a 600 rpm e de

aeração de 0,3 a 3 L/min, controlados pelo sistema de cascata. No volume final do cultivo, os sais

23

estavam nas seguintes concentrações: 6 g/L de KH2PO4, 4,2 g/L de (NH4)2SO4, 0,9 g/L de uréia,

0,9/L g de MgSO4.7H2O, 0,9 g/L de CaCl2, 15 mg/L de FeSO4.7H2O, 4,2 mg/L de ZnSO4.7H2O,

4,8 mg/L de MnSO4.H2O e 6 mg/L de CoCl2.

Foi feita uma amostragem por dia para o acompanhamento das atividades de algumas

enzimas específicas e FPAse ao longo do cultivo. As amostras também foram analisadas em

microscópio óptico Nikon H550S para o acompanhamento do crescimento celular. Para as

análises de atividades, as amostras foram centrifugadas (10.000 rpm por 5 minutos a 2ºC,

Centrífuga 5810R, Eppendorf) e os sobrenadantes resultantes foram recolhidos.

3.2.3 Produção de enzimas recombinantes

A cepa utilizada para a produção das enzimas recombinantes foi a Escherichia coli BL21

(DE3) (Merck, USA) transformadas com o vetor de expressão pET28-a-c(+) (Novagen)

carregando, separadamente, os genes de codificação para a β-1,4-endoglucanase (EG) (ID:

938607), endo-β-1,4-xilanase A (EX) (ID: 939861) e uma expansina (EXP) (ID: 940108). Todos

os genes foram provenientes de Bacillus subtilis e os procedimentos de clonagem estão descritos

por SANTOS et al. (2012) para a endoglucanase, RULLER et al. (2006) para a xilanase e KERFF

et al. (2008) para a expansina. Esses clones, já transformados, estavam mantidos em nitrogênio

líquido. Assim, para a reativação das cepas contendo os genes para a codificação das enzimas

recombinantes endoglucanase e xilanase, 50 µL dessas células foram inoculados em 100 mL de

meio HDF (SILVA et al., 2013) e mantidos por 16 h em agitador orbital (Inova 44, New

Brunswick Scientific) a 250 rpm e 37ºC. O meio HDF era composto de 20 g/L de glicose, 13,3

g/L de KH2PO4, 4 g/L de (NH4)2HPO4, 1,2 g/L de MgSO4.7H2O, 1,7 g/L de ácido cítrico, 14,1

mg/L de EDTA, 1 mL/L de solução de elementos traços, 100,8 mg/L de citrato de Fe(III), 4,5

mg/L de tiamina HCl e 30 mg/L de kanamicina. A solução de elementos traços continha (por

litro): 2,5 g de CoCl2.6H2O, 15 g de MnCl2.4H2O, 1,5 g de CuCl2.2H2O, 3 g de H3BO3, 2,1 g de

Na2MoO4.2H2O e 33,8 g de Zn(CH3COO)2.2H2O. Já para a reativação da cepa a expressar a

proteína da classe das expansinas, 40 µL dessas células foram pré-inoculados em 10 mL de meio

HDF, conforme descrito anteriormente, e 10 µL de Kanamicina. Após cinco horas de

crescimento, 60 µL desse pré-inóculo foram inoculados em 100 mL de meio HDF e mantidos por

16 h em agitador orbital a 250 rpm e 37ºC.

24

Os biorreatores (New Brunswick – Bioflo 115), contendo 1 L de meio HDF da mesma

composição descrita acima, foram inoculados para a produção de endoglucanase e xilanase de

maneira que a densidade óptica a 600 nm, aferida em espectrofotômetro (Evolution 60S - Thermo

Scientific), fosse de 0,4 no início do cultivo (aproximadamente 10% do volume do cultivo). No

caso da produção da proteína da classe das expansinas, a inoculação em biorreatores, contendo 1

L de meio HDF, foi feita de forma que a densidade óptica fosse de 0,2 no início do cultivo. A

inoculação é feita por meio de uma bomba e o sistema garante a assepsia do processo. Os

parâmetros do processo foram estabelecidos da seguinte forma: D.O 20%; cascata para agitação

entre 200 a 1.200 rpm; pH 7,0, controlado pelo sistema de base (hidróxido de amônio 25%)

acoplado ao reator; temperatura de 37ºC e aeração de 1 L/mim (SILVA et al., 2013). A indução,

feita com isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, Sigma-Aldrich) para uma concentração

final no reator de 1 mM, se deu quando a densidade óptica estava a 7,4 e 5,7 para os cultivos a

expressarem endoglucanase e xilanase, respectivamente, e a 4,3 no cultivo a expressar a proteína

da classe das expansinas.

Ao longo de 10 h de cultivo, foram feitas amostragens (4 mL) em intervalos de tempo de

aproximadamente 1 h. Para acompanhar o crescimento celular e a produção enzimática, aferiu-se

a densidade óptica de cada amostra (diluindo a mesma em quantidades apropriadas de NaCl 150

mM) e posteriormente as mesmas foram centrifugadas a 10.000 rpm por 5 minutos a 2ºC

(centrífuga 5810R, Eppendorf). Os sobrenadantes foram analisados por cromatografia líquida de

alta performance (HPLC) para determinação das concentrações de glicose e dos ácidos acético,

fórmico, láctico e succínico. Os “pellets” (provenientes de 1 mL de amostra) resultantes foram

ressuspendidos em 1 mL de tampão de lise (1 mM PMSF, 150 Mm NaCl, 20 Mm Tris HCl, 0,3

mg/mL de lisozima), encubados em gelo por 30 min sob agitação branda no agitador Gyrotwister

– Labnet International e sonicados. A sonicação foi feita com auxílio do sonicador Vibracell

Mod. VCX-750, a uma amplitude de 40%, pulsando por 3 ciclos de 5 segundos cada, espaçados

por um intervalo de 40 segundos. Os sobrenadantes resultantes desse procedimento foram

analisados quanto às respectivas atividades enzimáticas, teor de proteína e eletroforese SDS-

PAGE. Para a medição da massa seca, os “pellets” (provenientes de 1 mL de amostra) foram

secos em estufa (Fanem, Mod. 515, Brasil) a 60ºC até massa constante, e dessecados para

eliminação de qualquer umidade ainda presente e pesados.

25

Os dados experimentais obtidos foram utilizados para estimar as taxas específicas

máximas de crescimento (µ𝑚á𝑥 = ln𝑋

𝑋0) e os coeficientes de rendimento em biomassa (𝑌𝑋 𝑆⁄ =

(𝑋 − 𝑋0) (𝑆0 − 𝑆))⁄ . Os termos 𝑋, 𝑋0, 𝑆 𝑒 𝑆0 representam, respectivamente, biomassa no instante

t, biomassa inicial, concentração de substrato no instante t e concentração de substrato inicial.

Para o cálculo do µ𝑚á𝑥 , a biomassa inicial é tida como a biomassa no começo da fase

exponencial.

3.3 Precipitação com sulfato de amônio

O sobrenadante proveniente do cultivo do T. reesei (3.2.2) foi sedimentado seriadamente

com concentrações crescentes do sal sulfato de amônio. Uma determinada massa de sal era

adicionada lentamente a 20 mL de sobrenadante fúngico, em banho de gelo. Após a solução ter

sido deixada em repouso de um dia para o outro, o sistema era centrifugado por 20 min a 32.000

g (centrífuga 5810R, Eppendorf), o pellet era ressuspendido em 2 mL de tampão citrato 50 mM

pH 4,8 e, ao sobrenadante, era adicionada mais uma determinada massa de sal de acordo com as

concentrações a serem estudadas. Esse processo era realizado até se atingir a concentração

desejada de sal. O ANEXO A apresenta a Tabela seguida neste trabalho com as massas de sal

necessárias para se atingir uma determinada porcentagem de saturação de sulfato de amônio,

partindo-se de diferentes porcentagens iniciais. Esse procedimento também foi aplicado para

volumes iniciais maiores (400 mL).

3.4 Diafiltração

A fração de ressuspensão da precipitação do extrato fúngicos de T. reesei a 60% de

sulfato de amônio foi diafiltrada através do sistema de filtração tangencial (AKTAcrossflow,

GE). Foi utilizada a membrana Kvick Start, GE, com tamanho de poro de 30 kDa. O sistema foi

preparado através de uma lavagem com NaOH 0,1M, seguida de condicionamento com o tampão

citrato de sódio 50 mM a pH 4,8. Esse mesmo tampão foi empregado para os ciclos de lavagens e

a estabilização das enzimas. A amostra é bombeada para o sistema através de uma bomba e é

armazenada no container. Como condições de corrida, o fluxo de retentado foi fixado em 25

mL/mim e a pressão transmembrana (TMP) em 1,5 bar. Após 10 ciclos de diafiltração, o

processo é finalizado, gerando duas frações de saída: o permeado e o retentado. A recuperação do

retentado foi feita manualmente, através do container e, em seguida, 25 mL de tampão foram

26

adicionados a esse compartimento e recirculados pelo sistema por 5 minutos. Novamente foi

recolhida a fração contida no container, denominada agora retentado de lavagem/flush.

Quantificação proteica (Bradford), atividades enzimáticas e eletroforese SDS-PAGE foram

procedidas com o permeado, retentado e retentado flush.

A Figura 7 apresenta um esquema dos procedimentos envolvendo o processamento do

sobrenadante fúngico de T. reesei e as respectivas frações geradas.

Figura 7: Etapas para a obtenção das frações de T. reesei após o cultivo.

3.5 Purificações das enzimas recombinantes

As enzimas recombinantes produzidas através do cultivo em batelada foram purificadas

pela técnica IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography), que se baseia na ligação

(adsorção pseudoespecífica) entre a histidina, inserida através de modificação genética na

proteína alvo, e o íon níquel imobilizado por quelação na matriz de agarose. A purificação foi

27

realizada em dois tipos de sistemas: colunas por gravidade ou em FPLC (Fast Protein Liquid

Chromatography).

Os pellets resultantes do fim dos cultivos de E. coli geneticamente modificada foram

usados nesta etapa. Antes da purificação, os pellets foram lisados. Para a lise celular, cada 1

grama de células congeladas era ressuspendido em 10 mL de tampão de lise contendo PMSF 1

mM e lisozima 1 mg/mL. Esses componentes devem ser diluídos no mesmo tampão utilizado

para equilíbrio e lavagem da coluna cromatográfica. A lise por sonicação neste caso é mais

severa do que a descrita no item 3.2.3, apresentando 10 ciclos com 10 segundos de pulso e 50

segundos de pausa em cada. O sobrenadante resultante da centrifugação, denominado lisado

clarificado, foi a amostra inicial para a purificação (alimentação da coluna cromatográfica).

3.5.1 Ensaios cromatográficos em colunas de fluxo por gravidade

As colunas utilizadas para a purificação por fluxo de gravidade apresentaram 1,5 mL de

volume de resina. Para a endoglucanase foi utilizado o tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,5

com 300 mM NaCl. Para a purificação da xilanase e da expansina, o tampão Tris HCl 50 mM pH

7,5 a 300 mM NaCl foi utilizado. A escolha do pH do tampão foi feita de acordo com o pI das

proteínas, respeitando uma diferença mínima de uma unidade a fim de garantir a não precipitação

das proteínas.

As colunas, já empacotadas com o adsorvente, foram regeneradas pela passagem de 10

volumes de coluna (VC) de água destilada e equilibradas com 10 VC do respectivo tampão de

corrida. Um volume de 10 mL da amostra (referente a 1 g de pellet) foi injetado na coluna e o

“flow-through” foi recolhido. A lavagem foi feita com 10 VC do tampão de corrida. A eluição foi

feita com imidazol a diferentes concentrações no tampão de corrida, uma vez que o objetivo

desse experimento foi avaliar a melhor condição de eluição das proteínas alvo. Para as

purificações envolvendo a xilanase e a endoglucanase, essas concentrações foram de 20, 50, 75,

100, 200 e 500 mM e 10 VC de cada uma das quatro primeiras concentrações foram utilizados

para a eluição em degraus, enquanto que apenas 5 VC foram utilizados das soluções de tampão

contendo as duas últimas concentrações de imidazol. Para a purificação da expansina, a

concentração inicial de imidazol no tampão de eluição foi de 50 mM, enquanto que os

procedimentos subsequentes foram similares às purificações das demais proteínas. A limpeza da

28

coluna foi feita com 20 VC de água destilada e 10 VC de etanol 20%, sendo armazenada com

esta solução.

3.5.2 Ensaios cromatográficos em sistema FPLC (“Fast Protein Liquid Chromatography”)

O tampão utilizado para esta purificação foi o fosfato 50 mM pH 7,4, independentemente

da amostra. Para o equilíbrio da coluna e corrida, esse tampão foi acrescido de 300 mM de NaCl

e 20 mM de imidazol. Já para a eluição, a concentração de NaCl permaneceu a mesma,

aumentando apenas a de imidazol para 500 mM. Ambos os tampões foram filtrados a vácuo com

membrana de 0,45 µm e desareados por 20 min.

A coluna utilizada foi a HisTrap HP de 5 mL de volume de gel, GE. Foi utilizada uma

taxa de fluxo de 2 mL/min e uma pressão máxima de 0,3 mPa. A amostra a ser injetada foi

previamente filtrada com uso de seringa e filtros 0,45µm. Assim, o volume de 35 mL foi injetado

ao longo da coluna com o auxílio de um loop de 50 mL. Para a eluição, foi utilizado gradiente

linear. As frações coletadas foram de 1,5 mL.

3.5.3 Concentração e troca de tampão

As reações de hidrólise ocorrem em tampão citrato 50 mM pH4,8. Assim, as enzimas a

serem adicionadas nessas reações devem estar diluídas no mesmo tipo de solução, a fim de

manter o pH e a molaridade constantes durante a hidrólise. De acordo com isso, devemos fazer a

troca de tampão das amostras purificadas e, juntamente com isso, a sua concentração. Nessa etapa

também é eliminado o imidazol proveniente da eluição.

Esses procedimentos foram feitos com o auxílio de tubos de concentração por

centrifugação de 20 mL (Vivaspin 20, GE Healthcare). Como as soluções continham,

individualmente, proteínas de massas molar de 22,7 kDa (xilanase), 57,75 kDa (endoglucanase) e

25,37 kDa (expansina), a membrana utilizada era de 10 MWCO (“Molecular Weight Cut off”).

A capacidade de amostra por tubo é de 14 mL. Assim, cada vez que se completava esse volume

(com amostra ou tampão de interesse), o tubo era centrifugado por 17 min a uma velocidade de

8.000 g. O filtrado resultante era coletado para quantificação de proteína total. Ao concentrado

(aproximadamente 3-4 mL) era adicionado o tampão de interesse (citrato 50 mM pH 4,8) até

completar o volume de 14 mL e, então, o tubo era centrifugado novamente. Para uma eficiente

29

troca de tampão, três ciclos foram suficientes. O concentrado final é recolhido, contendo a

enzima concentrada e dissolvida no tampão de interesse.

3.6 Determinação das atividades enzimáticas

A atividade enzimática (U) é definida como a quantidade de enzima requerida para

produzir 1 µmol de produto por minuto a uma determinada temperatura, como apresentado a

seguir:

𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 =[𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜] ∙ 𝑉𝑟𝑒𝑎çã𝑜

𝑇𝑒𝑚𝑝𝑜 ∙ 𝑉𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 (µ𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑚𝑖𝑛−1 ∙ 𝑚𝐿−1)

As atividades enzimáticas também são expressas como unidades internacionais por

volume (UI/mL). A atividade específica se baseia na concentração proteica da amostra, sendo

expressa como unidades internacionais de atividade por massa proteica (UI/mg).

A medida de atividade enzimática também pode ser utilizada para avaliar a purificação de

determinada enzima. Sendo assim, o fator de purificação é definido como a atividade específica

da fração pela atividade específica da amostra inicial a ser purificada (ou da etapa de purificação

anterior). Já a recuperação de atividade é representada (em porcentagem) pelas unidades

internacionais da fração sobre as unidades internacionais da amostra inicial (ou da etapa de

purificação anterior).

A seguir estão descritos os métodos utilizados para a determinação das atividades

enzimáticas utilizadas neste trabalho.

3.6.1 “Filter paper unit” – FPAse

A atividade enzimática celulolítica total, também denominada FPAse (filter paper unit),

foi determinada pelo método descrito por Ghose (1987) em escala reduzida de 10 vezes. Assim,

em cada tudo de ensaio foram adicionados 5 mg de papel de filtro (3 discos pequenos), 100 µL de

tampão citrato 50mM pH 4,8 e 50 µL de extrato enzimático ou enzima comercial (amostra). Essa

reação deve ocorrer por 60 min à 50ºC. Após este período, a reação foi parada com a adição de

300 µL do reagente DNS. Os açúcares redutores liberados na reação foram determinados pelo

método descrito por Miller (1959). Para a medição da absorbância a 540 nm foram adicionados

30

mais 2 mL de água na mistura reacional. Aos valores encontrados, duas medidas de absorbâncias

foram descontadas, uma representando o branco para as enzimas e outra o branco para o

substrato. O procedimento para a detecção do branco para as enzimas ocorreu da mesma forma

que as reações descritas acima, porém na ausência de substrato (papel de filtro). Na reação

envolvendo o branco para o substrato, 150 mL de tampão citrato 50mM pH 4,8 foram

adicionados a 5 mg de papel de filtro (ausência de enzima). Os procedimentos foram conduzidos

sob as mesmas condições. Para que a reação ocorresse à temperatura desejada foi utilizado o

banho de aquecimento (modelo ED, Julabo), e as amostras foram lidas em cubetas através do

espectrofotômetro (Evolution 60S, Thermo Scientific).

É necessário utilizar, no mínimo, duas diluições de enzimas de forma que liberem um

pouco mais de 4 mg de glicose em uma delas e um pouco menos de 4 mg em outra, pois é preciso

calcular a diluição de enzima para a liberação de exatamente 4 mg de glicose. Assim, quanto

mais próximo desse valor as diluições estiverem, mais precisa será a interpolação.

Nota: o termo diluição da enzima refere-se à proporção da solução enzimática original presente,

ou seja, o volume da solução original da enzima (mL) no volume total da diluição (mL).

O cálculo de FPA foi feito da seguinte forma:

𝐹𝑃𝐴 =0,37

[𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎] µ𝑚𝑜𝑙/(𝑚𝑖𝑛 ∙ 𝑚𝐿)𝑜𝑢 𝐹𝑃𝑈/𝑚𝐿

onde o fator 0,37 representa a conversão de mg para µmol, dividida pelo tempo da reação e pelo

volume de enzima.

3.6.2 Determinação da atividade de endoglucanase e xilanase

Todas as reações feitas em microplacas utilizam o termociclador Vapo protect, Eppendorf,

para garantir a temperatura e os tempos requeridos. As medições de absorbância são feitas em

placas de 96 poços (Greiner Clear) no espectrofotômetro Spectra Max M3 (Molecular Devices).

Essas atividades são determinadas através da reação da enzima com os substratos:

carboximetilcelulose ou β-glucana no caso da atividade endoglucanásica, e beech wood xilana no

caso da atividade xilanásica. Ambos devem estar a uma concentração de 0,5%.

31

A reação ocorre com 40 µL de tampão citrato 50 mM pH 4,8, 10 µL da amostra e 50 µL

do respectivo substrato, em microplacas de 96 poços. Essa mistura foi mantida a 50ºC por 30 min

ou 10 min, para determinação da atividade endoglucanásica ou xilanásica, respectivamente. Os

açúcares redutores liberados foram determinados pelo método de DNS (MILLER, 1959),

utilizando glicose como açúcar para a curva padrão da atividade endoglucanásica, e xilose para a

curva padrão da atividade xilanásica. Foi feito um branco para cada amostra, onde a única

diferença na reação foi a adição da enzima somente após o DNS, impedindo qualquer tipo de

hidrólise. A determinação da absorbância foi feita a 540 nm em espectrofotômetro de placas

(Spectra Max M3, Molecular Devices).

3.6.3 Determinação da atividade de β-glicosidase, β-xilosidase e celobiohidrolase

As atividades de β-glicosidase, β-xilosidase e celobiohidrolase são determinadas

utilizando-se os substratos sintéticos p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (p-NPG), p-nitrofenil-β-D

xilopiranosídeo (p-NPX) e p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo (p-NPC) (Sigma–Aldrich, St. Louis,

EUA), a 1 mM, 1 mM e 4 mM, respectivamente. A reação se dá com a adição de 80 µL do

substrato e 20 µL da amostra, a 50 ºC, mantida por 10 min para a atividade da β-glicosidase e

por 30 min para a da celobiohidrolase. A revelação dessas reações, ou seja, a quantificação do

produto liberado (p-NP) após a hidrólise enzimática, foi feita pela adição de 100 µL de carbonato

de sódio ou cálcio a 1 mol/L. A absorbância foi lida em espectrofotômetro de placas a um

comprimento de onda de 400 nm. A curva padrão para essas atividades foi feita com p-NP em

uma faixa de 0,03 a 1,5 mM.

3.7 Quantificação proteica e eletroforese SDS-PAGE

A quantificação proteica foi determinada através do reagente Bio-Rad Protein Assay (Bio-

Rad, CA, USA). Esse reagente é diluído na proporção de 1 parte do mesmo para 4 partes de água.

Um volume de 10 µL de amostra foi misturado com 200 µL do reagente diluído, em placas

ELISA. Após 5 min, a absorbância foi medida a 595 nm. Albumina sérica bovina (BSA) foi

utilizada como padrão protéico (BRADFORD, 1976). A faixa linear para leitura da absorbância

neste procedimento foi de 0,05 a 0,5 mg/mL. A concentração das proteínas purificadas foi aferida

através da absorbância a comprimento de onda de 280 nm em spectrofotômetro (Thermo

Scientific, Nanodrop 2000c), uma vez que as suas massas moleculares são conhecidas e os

32

coeficientes de extinção foram estimados através do programa ProtParam (GASTEIGER et al.,

2005).

A eletroforese SDS-PAGE é uma técnica para separar proteínas, baseada na diferença de

peso molecular. Esta foi utilizada para a verificação da produção das enzimas recombinantes e

para a avaliação da eficiência das técnicas de purificação empregadas. Os géis de poliacrilamida

(12%) foram carregados com 10 µL de amostra a uma concentração de 0,5 mg/mL e 20 µL de

tampão de corrida loading buffer. Essa mistura foi previamente fervida por 5 min a 99ºC no

Thermomixer confort - Eppendorf para a desnaturação das proteínas. O marcador de massa

molecular utilizado foi o PageRuler Prestained Protein Ladder, Pierce Biotechnology. A corrida

ocorreu em cubas verticais de eletroforese a uma voltagem fixa de 120 v. Os géis foram corados

com Comassie Blue, descorados e fotografados.

3.8 Hidrólises com bagaço de cana-de-açúcar

A hidrólise do bagaço de cana foi realizada em duas diferentes escalas: em frascos

Erlenmeyer de 125 mL e em tubos de 2,0 mL. Esses experimentos nos permite avaliar a

eficiência da enzima, ou da mistura enzimática, através da determinação da conversão da celulose

(presente no bagaço) em glicose. A partir dos resultados obtidos pela hidrólise, também é

possível estudar o sinergismo entre as enzimas.

3.8.1 Hidrólise em frascos de 125 mL

Os frascos Erlenmeyer de 125 mL foram utilizados para as reações de hidrólise a um

volume final de 50 mL. A matéria-prima a ser degradada foi o bagaço hidrotérmico 190 úmido

(umidade = 77,73%, aferida usando a termobalança Sartorius Mod. MA35). A porcentagem de

sólido utilizada foi de 5% (WIS). Assim, para este caso, 2,5g de bagaço seco foram necessários

para a reação. A equação a seguir demostra o cálculo feito para se obter a massa de bagaço úmido

necessária:

𝑚ú𝑚𝑖𝑑𝑜 =𝑚𝑏𝑎𝑔𝑎ç𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 ∙ 100

100 − 𝑈

onde 𝑚ú𝑚𝑖𝑑𝑜 é a massa de bagaço úmido necessária, de umidade 𝑈, que contém a massa de

bagaço seco desejada (𝑚𝑏𝑎𝑔𝑎ç𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜).

33

Para este caso, tem-se que 𝑚ú𝑚𝑖𝑑𝑜 = 11,22. A massa de água presente neste bagaço é

encontrada da seguinte maneira:

𝑚á𝑔𝑢𝑎 = 𝑚ú𝑚𝑖𝑑𝑜 − 𝑚𝑏𝑎𝑔𝑎ç𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜

Como a densidade da água é 1 g/mL, consideramos que 𝑚á𝑔𝑢𝑎 = 𝑉á𝑔𝑢𝑎 para o desconto

do volume de água do bagaço úmido no volume final da reação.

Para as reações de hidrólise envolvendo coquetéis enzimáticos, 10FPU/gmassa seca

foi a

quantidade definida a ser adicionada na reação. Assim, o volume da mistura enzimática foi

calculado como mostra a equação abaixo:

𝑉𝑐𝑜𝑞𝑢𝑒𝑡𝑒𝑙 =10 ∙ 𝑚𝑏𝑎𝑔𝑎ç𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜

𝐹𝑃𝐴𝑐𝑜𝑞𝑢𝑒𝑡𝑒𝑙

Quando foi utilizada a enzima β-glicosidase para suplementar o coquetel, a quantidade

adicionada da mesma foi de 20 UI/ gmassa seca. O cálculo do volume a ser adicionado na reação se

faz de forma semelhante a da mistura enzimática medida em FPU/mL:

𝑉𝛽−𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒 =20 ∙ 𝑚𝑏𝑎𝑔𝑎ç𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜

𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝛽−𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒

É importante garantir a esterilidade desse sistema, se não completa pelo menos a níveis

que não interfiram na reação de hidrólise. Isso é alcançado com a adição de azida sódica para

uma concentração de 0,02% no meio final, já que a autoclavagem poderia modificar a estrutura

do bagaço hidrotérmico e desnaturar as enzimas.

O volume da reação (50mL) é completado com tampão citrato 50 mM pH 4,8. Sob a

forma de equação, esse volume pode ser representado da seguinte maneira:

𝑉𝑡𝑎𝑚𝑝ã𝑜 = 50𝑚𝐿 − 𝑉á𝑔𝑢𝑎 − 𝑉𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎𝑠 − 𝑉𝑎𝑧𝑖𝑑𝑎

onde o 𝑉𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎𝑠 representa o volume de todas as enzimas adicionadas na reação.

A hidrólise é mantida a 50ºC por 72 h sob agitação de 200 rpm (Agitador orbital Inova 44,

New Brunswick Scientific, EUA). As amostragens (2 mL) foram feitas nos tempos de 6, 24, 48 e

72 h. Essas amostras foram centrifugadas na centrífuga 5810R, Eppendorf, a 14.000 rpm por 6

34

min e os sobrenadantes foram coletados, fervidos a 99ºC por 5 min (ThermoMixer confort,

Eppendorf) para a desativação completa das enzimas e encaminhados para análise em HPLC a

fim de se determinar as concentrações (em g/L) de glicose, xilose, arabinose e celobiose. Os

experimentos foram feitos em duplicatas.

3.8.2 Hidrólise em escala reduzida para tubos de 2 mL (Mini-hidrólise)

Os microensaios de hidrólise em tubos, ou mini-hidrólise, ocorreram de forma semelhante

à descrita acima. O bagaço usado para esta reação foi seco à temperatura ambiente por 5 dias, até

atingir umidade constante (aferida por meio da termobalança Sartorius Mod. MA35). Então, esse

material foi pulverizado pelo equipamento Fritsch pulverisette 14 a uma velocidade de 1x104

rpm

e com faca de 0,08 mm. Assim, o volume ocupado pelo bagaço no tubo é menor quando o mesmo

está pulverizado, tornando possível esse microensaio.

Uma placa térmica e temporizada (Eppendorf ThermoMixer) foi utilizada para garantir as

condições da reação: 50ºC a 1000 rpm. O número de tubos ao início do ensaio era proporcional

ao número de amostras que seriam retiradas, uma vez que a amostragem era feita por

“sacrifícios”. Em outras palavras, a cada ponto de retirada de amostra (6, 24, 48 e 72h) os

respectivos tubos, em duplicata, eram retirados do equipamento e fervidos a 99ºC por 5 min para

a desativação completa das enzimas. As análises das concentrações (em g/L) dos açúcares

(glicose, xilose, arabinose e celobiose) nas amostras foram feitas através de cromatografia líquida

(HPLC).

As análises estatísticas utilizadas para se comprovar a diferença entre os pontos de

hidrólise e os tratamentos foram feitas através do software OriginPro 8, utilizando os testes de

Tukey e Levene a 0,5% de intervalo de confiança. Os experimentos foram feitos em duplicatas.

3.8.3 Cálculo da conversão enzimática da celulose

A conversão enzimática da celulose, que representa a capacidade da enzima, ou mistura

de enzimas, em degradar a biomassa, é representada a seguir:

𝐶𝐶 =𝑚𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 ∙ 𝑓ℎ

𝑚𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 ∙ 𝑦𝑖∙ 100

35

onde 𝐶𝐶 é a conversão a ser calculada, 𝑚𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 é a massa de glicose presente no hidrolisado

obtida através das análises por HPLC, 𝑓ℎ é o fator de hidrólise da celulose e vale 0,9, 𝑚𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 é a

massa de material lignocelulósico pré-tratado (em base seca) antes da hidrólise enzimática e 𝑦𝑖 é

o teor de celulose nesse mesmo material.

3.9 Quantificação de açúcares e ácidos por HPLC (“High Performance Liquid

Chromatography”)

Os sobrenadantes provenientes dos cultivos destinados à produção das proteínas

recombinantes foram analisados por cromatografia líquida (HPLC) para determinação das

concentrações de glicose e dos ácidos acético, fórmico, láctico e succínico. Essas amostras foram

diluídas 10 vezes com ácido sulfúrico 5 mM, tratadas com Sep-Pack C18 e injetadas em colunas

HPX-87H 300 mm x 7,8 mm (Bio-Rad). A fase móvel usada foi ácido sulfúrico 5 mM a uma taxa

de fluxo de 0,5 mL/min a 50 ºC.

As amostras provenientes da hidrólise enzimática foram encaminhadas para análise em

HPLC a fim de se determinar as concentrações (em g/L) de glicose, xilose, arabinose, celobiose e

ácido acético. A cromatografia líquida empregada foi acoplada a um detector de RID. As

amostras foram filtradas em filtros Millex – HV com membrana de PVDF 0,45 µm e injetadas,

sem diluição, em colunas HPX-87H 300 mm x 7,8 mm (Bio Rad). A fase móvel usada foi o ácido

sulfúrico 5 mM com uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min, a 35ºC.

3.10 Avaliação do sinergismo

O sinergismo é a interação positiva de duas ou mais enzimas em uma reação enzimática.

Isso pode ser traduzido em um número, conhecido como grau de sinergismo. Abaixo é

representada a equação para o seu cálculo:

𝑆 =[𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒]𝑚𝑖𝑠𝑡𝑢𝑟𝑎

∑ [𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒]𝑚𝑚𝑖=1

sendo 𝑆 o sinergismo, [𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒]𝑚𝑖𝑠𝑡𝑢𝑟𝑎 a concentração de glicose liberada na mistura e

∑ [𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒]𝑚𝑚𝑖=1 o somatório da concentração de glicose liberada pela ação das enzimas

individualmente. Neste experimento, a quantidade proteica a ser adicionada na mistura é a soma

das quantidades que são adicionadas em cada ensaio individual.

36

Também é possível avaliar o sinergismo entre uma mistura enzimática e uma enzima

acessória. Neste caso, a mistura é tratada como um pseudo-componente, ou seja, na equação ela

representa uma única enzima. Para este caso em especial, a equação acima pode assumir a

seguinte forma:

𝑆 =[𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒]𝑚𝑖𝑠𝑡𝑢𝑟𝑎

[𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒]𝑐𝑜𝑞𝑢𝑒𝑡𝑒𝑙 𝑏𝑎𝑠𝑒 + [𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒]𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎

Os testes de sinergismo entre as proteínas estudadas e a fração T. reesei foram realizados

para os diferentes bagaços pré-tratados (BH 190, BH 160 e BEX). Os ensaios foram realizados

em duplicata. As reações foram realizadas em micro-escala conforme descrito no item 3.8.2.

3.11 Montagem dos coquetéis enzimáticos

A otimização dos coquetéis enzimáticos foi realizada através de técnicas de planejamento

de experimentos para microensaios de hidrólise. O estudo das proporções das proteínas que leva a

uma conversão maximizada do bagaço de cana-de-açúcar foi realizado através de um

planejamento experimental simplex- lattice com pontos internos e centroide global, com grau de

polinômio 2 para misturas. Nesta etapa inicial, sete diferentes proteínas, ou classes enzimáticas,

atuaram como fatores para o planejamento de misturas. Foram elas: fração de T. reesei, EG,

BGL, EX, AXE, ARF e EXP. Os fatores T. reesei, EG e BGL tiverem suas proporções mínimas

diferentes de zero. Assim, os fatores são denominados pseudocomponentes, uma vez que, ao

serem tratados como substâncias puras no planejamento, constituem uma mistura dos

componentes que estão sendo estudados. Para a codificação das proporções a

pseudocomponentes, devem-se levar em consideração os limites inferiores dos componentes

puros (𝑎𝑛). Para um caso geral de 𝑞 componentes, tem-se:

∑ 𝑎𝑛 ≤ 1, 𝑖 = 1,2, … , 𝑞

𝑞

𝑛=1

Assim, os teores da mistura em pseudocomponentes (𝑥𝑛) são calculados pela expressão:

𝑥𝑛 =𝑐𝑛 − 𝑎𝑛

(1 − ∑ 𝑎𝑛𝑞𝑛=1 )

37

onde 𝑐𝑛 é proporção original do componente 𝑛 na mistura.

A carga enzimática total usada nos experimentos foi de 10 mgproteína/gbagaço. As respostas

consideradas foram as quantidades de glicose, xilose e celobiose após 48 horas de hidrólise. Os

experimentos foram realizados em duplicata para medida do erro experimental e o planejamento

foi avaliado com o Software Statistica 10.0 (Statsoft. Inc.). A vantagem do uso de planejamento

para misturas é a possibilidade de avaliar os efeitos sinérgicos dos diferentes componentes.

Após definidos os efeitos com maior significância estatística, um novo

planejamento foi realizado para avaliar as proporções enzimáticas onde as variáveis e seus níveis

são independentes. Esse é o planejamento fatorial 2k, onde k representa o número de fatores. Para

a codificação das variáveis originais a uma faixa de -1 a +1, basta subtrair de cada uma delas o

valor médio de sua variação e dividir o resultado pela metade da amplitude dessa variação, da

seguinte forma:

𝑥𝑛 =(𝑉 − 𝑃𝑜𝑛𝑡𝑜𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑙)

∆⁄

Onde 𝑥𝑛 é o valor codificado da variável original 𝑉, o 𝑃𝑜𝑛𝑡𝑜𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑙 é o valor médio da

faixa em que essa variável original está sendo estudada e ∆ é o incremento desde o nível inferior

até o ponto central.

Neste caso, a carga enzimática total de cada corrida variou entre 4 a 10 mgproteína/gbagaço.

As respostas consideradas também foram as quantidades de glicose, xilose e celobiose após 48

horas de hidrólise.

Os modelos gerados pelos planejamentos foram analisados mediante análise de variância

(ANOVA) e teste F de Fisher.

38

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Expressão e purificação das enzimas recombinantes endoglucanase e xilanase e da

proteína recombinante expansina

Os cultivos de E. coli recombinante contendo os genes para produção de endoglucanase

ou xilanase foram satisfatórios, uma vez que as enzimas apresentaram-se ativas e aptas para

serem usadas no estudo da montagem dos coquetéis enzimáticos.

O µ𝑚á𝑥 do cultivo para a produção da xilanase foi de 0,48 h-1

e o rendimento de

conversão de substrato em biomassa foi de 𝑌𝑥 𝑠⁄ = 0,32 gcélulas/gsubstrato. Em relação ao cultivo

visando a expressão da endoglucanase, os dados cinéticos foram de µ𝑚á𝑥 = 0,45 h-1

e 𝑌𝑥 𝑠⁄ =

0,327 gcélulas/gsubstrato. Estes dados de cultivo corroboram com os resultados reportados por SILVA

et al. (2013) para o cultivo desses mesmos clones, tendo sido µ𝑚á𝑥 da ordem de 0,5 h-1

e 𝑌𝑥 𝑠⁄

0,55 e 0,5 gcélulas/gsubstrato para os cultivos visando a expressão de xilanase e endoglucanase,

respectivamente.

Os acompanhamentos dos cultivos em relação a glicose, proteína e massa seca estão

representados nas Figuras 8 e 9. No cultivo para expressão de xilanase, os ácidos orgânicos,

denominados acético, fórmico e láctico, atingiram uma concentração final de 0,062, 0,056 e

0,108 g/L, respectivamente. Já no cultivo para a expressão da endoglucanase, a concentração

final para o ácido láctico atingiu o valor de 0,093 g/L, sendo que não foi detectada a presença dos

demais ácidos orgânicos. A indução da expressão das enzimas recombinantes se deu 6 h após o

início do cultivo para a endoglucanase e 5 horas para a xilanase. A eletroforese SDS-PAGE antes

e após a indução comprova o sucesso da expressão proteica pelas bactérias geneticamente

modificadas (Figura 10).

39

Figura 8: Perfil do consumo de glicose, síntese proteica e acompanhamento do crescimento celular por massa seca

no cultivo da E. coli recombinante para a expressão de xilanase. A seta indica o momento da indução.


no cultivo da E. coli recombinante para a expressão de endoglucanase. A seta indica o momento da indução.

0 2 4 6 8 10

0

4

8

12

16

20

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

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0

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4

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(g/l

)

Tempo (horas)

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Proteína

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0 2 4 6 8 10

0

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8

12

16

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0,0

0,5

1,0

1,5

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2,5

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3,5

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2

4

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8

Gli

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(g/l

)

Tempo (horas)

Glicose

Proteína

Massa seca

Pro

teín

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/L)

Mas

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eca

(g)

40

Figura 10: Eletroforese SDS-PAGE da expressão das proteínas recombinantes em E. coli. Pista 1: padrão protéico

PageRuler prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10); pistas 2

e 4: amostragens antes da indução dos sistemas de expressão que codificam para a endoglucanase e xilanase,

respectivamente; pistas 3 e 5: três horas após a indução dos sistemas de expressão que codificam para a

endoglucanase e xilanase, respectivamente. As amostras foram diluídas para uma concentração protéica máxima de

0,5 mg/mL em cada pista.

Para o cultivo visando à produção de expansina, o rendimento de conversão de substrato

em biomassa foi de 𝑌𝑥 𝑠⁄ = 0,28 gcélulas/gsubstrato. O único ácido orgânico presente no fim do

cultivo foi o ácido fórmico, a uma concentação de 0,15 g/L. O acompanhamento em relação a

glicose, proteína e massa seca está representado na Figura 11. O rendimento em biomassa foi

sensivelmente mais baixo quando comparado aos demais cultivos para uma mesma concentração

de fonte de carbono inicial. Isto pode estar relacionado, em partes, pelo encurtamento da fase

exponencial (período aproximado de 3 horas) e pelo desvio do metabolismo para o acúmulo de

ácido fórmico. Ainda assim, este cultivo foi suficiente para o objetivo de se obter uma massa de

proteína para os ensaios de hidrólise. A indução da expressão da expansina ocorreu 5 h após o

início do cultivo. A banda de proteína que representa a expansina pode ser notada através da

eletroforese SDS-PAGE antes e após a indução do cultivo (Figura 12).

Pad

rão

Pro

téic

o

2 3 4 5

70 kDa

55 kda Endoglucanase

25 kDa

Xilanase

41


no cultivo da E. coli recombinante para a expressão de expansina. A seta indica o momento da indução.

Figura 12: Eletroforese SDS-PAGE evidenciando a expressão da proteína recombinante após indução com IPTG.

Pista 1: padrão PageRuler prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25,

15 e 10); pista 2: amostragem antes da indução do sistema de expressão que codifica para a expansina; pista 3: três

horas após a indução do sistema de expressão que codifica para a expansina. As amostras foram diluídas para uma

concentração proteica máxima de 0,4 mg/mL em cada pista.

0 2 4 6 8 10

0

4

8

12

16

20

0,0

0,5

1,0

1,5

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2

4

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pro

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/L)

Mas

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(g/L

)

Pad

rão

Pro

téic

o

2 3

25 kDa

Expansina

15 kDa

42

O estudo da purificação de xilanase (22,7 kDa e pI 9,25) pela técnica IMAC a partir do

sobrenadante do lisado celular mostrou que uma eluição a 50 mM de imidazol, visando à

eliminação de proteínas adsorvidas juntamente com a proteína alvo, seguida de outra a 100 mM

de imidazol para a recuperação da proteína alvo são suficientes para se obter uma fração proteica

de pureza elevada (uma só banda no gel de acrilamida pela eletroforese SDS-PAGE). Assim,

padronizamos uma técnica satisfatória e prática de purificação para volumes de amostra pequenos

(até 10 mL) considerando a amostra e a proteína alvo em questão. O gel de eletroforese SDS-

PAGE contendo as frações cromatográficas dessa técnica está representado na Figura 13.

Figura 13: Eletroforese SDS-PAGE das frações de purificação da enzima xilanase a partir de lisado celular pela

técnica IMAC em colunas de fluxo por gravidade. Pista1: padrão PageRuler prestained protein ladder (de cima para

baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10); pista 2: lisado celular; pista 3: “flow-through”; pista 4:

lavagem da coluna; pista 5: eluição a 20 mM; pista 6: eluição a 50 mM; pista 7: eluição a 75 mM; pista 8: eluição a

100 mM; pista 9: eluição a 200 mM; pista10: eluição a 500 mM de imidazol. As amostras foram diluídas para uma


Para a técnica de purificação do sobrenadante do lisado celular contendo a enzima

endoglucanase (pI 7,7), uma eluição a 50 mM de imidazol, visando eluir proteínas contaminantes,

seguida de eluição a 200 mM de imidazol foram padronizadas para a recuperação da enzima

purificada. Essa fração de eluição a 200 mM, contendo a EG, foi coletada para os tratamentos de

concentração e troca de tampão da amostra.

Pad

rão

Pro

téic

o

Lis

ad

o c

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o

Flo

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00

mM

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00

mM

Elu

ição

a 5

00

mM

25 kDa

Xilanase

15 kDa

43

O gel de eletroforese SDS-PAGE dessa técnica de purificação, mostrado na Figura 14,

apresenta duas bandas para as frações de eluição da proteína alvo. Através de uma análise

comparativa e qualitativa, podemos concluir que a endoglucanase está a uma concentração

proteica muito mais alta do que a proteína contaminante (observa-se que houve um

enriquecimento da fração de eluição a 200 mM na proteína de interesse). Além disso, a enzima

continua ativa, uma vez que sua atividade passou de 2,76 UI/mL na fração de alimentação para

2,35 UI/mL na eluição a 200 mM de imidazol, mostrando que a presença de outras proteínas

contaminantes não prejudica a sua atividade. Acima disso ainda devemos considerar que as

demais frações de eluição também apresentaram atividade enzimática, porém menor que a da

fração de 200 mM de imidazol.

Figura 14: Eletroforese SDS-PAGE das frações de purificação da enzima endoglucanase a partir de lisado celular

pela técnica IMAC em colunas de fluxo por gravidade. Pista 1: padrão PageRuler prestained protein ladder (de cima

para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10); pista 2: lisado celular; pista 3: “flow-through”; pista

4: lavagem da coluna; pista 5: eluição a 20 mM; pista 6: eluição a 50 mM; pista 7: eluição a 75 mM; pista 8: eluição

a 100 mM; pista 9: eluição a 200 mM; pista 10: eluição a 500 mM. As amostras foram diluídas para uma


Para a purificação de volumes maiores de 10 mL, o procedimento foi feito em sistema de

cromatografia FPLC. Este procedimento foi realizado apenas para a purificação parcial da

xilanase. O acompanhamento da purificação está representado pela Figura 15, onde se pode notar

um pico proeminente dessa enzima (pico 2). Para a identificação das proteínas presentes no pico

e validação de sua pureza, foi feito uma eletroforese SDS-PAGE (Figura 16). No gel foram

Pad

rão

Pro

téic

o

Lis

ad

o c

lari

ficad

o

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hro

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Lav

ag

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Elu

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20

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Elu

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Elu

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Elu

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ição

20

0 m

M

Elu

ição

50

0 m

M

70 kDa

55 kDa Endoglucanase

44

analisados o pico 1, através das frações 4 e 8, o pico 2, pelas frações 11 a 43, a fim de abranger o

início, meio e fim do mesmo, e o pico 3, através da fração 49. Por essa análise, as frações 24 a 43

e 48 a 51 foram reunidas, uma vez que seus graus de pureza são adequados para sua finalidade,

constituindo a amostra de endoxilanase submetida à concentração e troca de tampão para os

ensaios subsequentes de otimização de coquetéis enzimáticos.

Figura 15: Cromatograma da purificação da enzima xilanase a partir de lisado celular pela técnica IMAC em sistema

cromatográfico FPLC. A curva azul representa a UV a 280 nm, a curva verde representa a concentração do tampão

de eluição e os números em vermelho representam os números das frações.

Pico 2

Pico 1

Pico 3 Pico 4

45

Figura 16: Eletroforese SDS-PAGE das frações de purificação da enzima xilanase a partir de lisado celular pela

técnica IMAC em sistema cromatográfico FPLC. Pista 1: padrão PageRuler prestained protein ladder (de cima para

baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70 -em vermelho, 55, 40, 35, 25, 15 e 10 – em verde); pista 2: lisado celular; pista 3:

fração 4; pista 4: fração 8; pista 5: fração11 ; pista 6: fração 15; pista 7: fração 20; pista 8: fração 30; pista 9: fração

43; pista 10: fração 49.

Para a purificação do lisado clarificado contendo a expansina (25,4 kDa e pI 9,16) como

proteína de interesse, uma eluição a 50 mM de imidazol é suficiente para eliminar as proteínas

contaminantes, de forma que as frações das eluições subsequentes apresentam a expansina com

alto grau de pureza (Figura 17). Para aplicação neste projeto, foram reunidas as frações de eluição

a 75 e 100 mM de imidazol.

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ção

4 (

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8 (

Pic

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2)

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2)

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30

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2)

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43

(P

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2)

Fra

ção

49

(P

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3)

25 kDa Xilanase

15 kDa

46

Figura 17: Eletroforese SDS-PAGE das frações de purificação da proteína expansina a partir de lisado celular pela

técnica IMAC em colunas de fluxo por gravidade. Pista 1: padrão PageRuler prestained protein ladder (de cima para

baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10); pista 2: lisado celular; pista 3: eluição a 50 mM; pista 4:

eluição a 75 mM; pista 5: eluição a 100 mM; pista 6: eluição a 200 mM; pista 7: eluição a 500 mM. As amostras não

foram diluídas.

Tendo em vista que o objetivo do trabalho é o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos

otimizados e, para isto, se faz necessário o uso de enzimas isoladas ou frações que contenham

apenas aquela atividade independentemente de ter outras proteínas desde que não atue sobre a

biomassa ou não afetem positiva ou negativamente a reação, a otimização das técnicas de

purificação não está dentro do escopo deste trabalho. Dessa forma, o uso da técnica de IMAC foi

adequado, uma vez que a mesma já está bem estabelecida na literatura, e apenas algumas

adaptações em relação às condições cromatográficas foram estudas para se obter um processo

mais adequado para as enzimas específicas deste trabalho.

O processo de concentração e troca de tampão das frações de eluição contendo as

proteínas alvo é satisfatório para a obtenção de amostras livres de imidazol e condicionadas em

tampão citrato 50 mM pH 4,8. As frações geradas a partir das lavagens das amostras não

possuem proteínas (Abs280 ≈ 0), enquanto que a amostras finais apresentam uma concentração

proteica tal que nos permite usar pouco volume das mesmas nos ensaios de mini-hidrólise

subsequentes.

47

Os coeficientes de extinção molar e massa molar de cada proteína foram usados para a

quantificação proteica das amostras por absorbância a 280 nm (Nanodrop), comprimento de onda

que quantifica as ligações peptídicas. As leituras foram feitas em triplicata. Os dados estão

representados na Tabela 2.

Tabela 2: Concentração proteica e atividade enzimática das amostras geradas após concentração e troca de tampão

das frações de eluição contendo as proteínas purificadas (EX, EG e EXP) por IMAC em colunas de fluxo por

gravidade ou sistema cromatográfico FPLC.

Amostra Coeficiente de

extinção (M-1

cm-1

)

Massa molar

(kDa)

Concentração

proteica média

(mg/mL)

Atividade

(UI/mL)

EX 82.850 22,70 2,75 71,24

EG 106.925 57,75 2,83 1,48

EXP 41.370 25,37 1,64 -

A Figura 18 apresenta, de forma resumida, os lisados clarificados produzidos in house e

as amostras contendo as proteínas purificadas e quantificadas a serem utilizadas nos ensaios

subsequentes de hidrólises.

Figura 18: Eletroforese SDS-PAGE da expressão (lisado clarificado) e purificação cromatográfica das proteínas

recombinantes. Pista 1: padrão protéico PageRuler prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130,

100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10); pista 2: lisado celular contendo endoglucanase; pista 3: endoglucanase purificada,

após concentração e troca de tampão; pista 4:lisado celular contendo xilanase; pista 5: xilanase purificada, após

concentração e troca de tampão; pista 6: lisado celular contendo expansina; pista 7: expansina purificada, após

concentração e troca de tampão. Todas as amostras estão diluídas 10 vezes.

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XP

P

PP

EX

P p

uri

ficad

a

55 kDa

25 kDa

15 kDa

48

Esses concentrados finais contendo xilanase, endoglucanase ou expansina foram

congelados a -20ºC até serem usados nos experimentos de montagem do coquetel enzimático

otimizado.

4.2 Produção do coquetel fúngico

As enzimas celobiohidrolases apresentam a capacidade de clivar as ligações β1-4,

abundantes nas fibras de celulose. Como a celulose é o polissacarídeo mais abundante na

natureza, essa enzima constitui a maior parte dos coquetéis fúngicos (MIETTINEN-OINONEN et

al., 2005).

Para o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos otimizados, as celobiohidrolases são

essenciais, uma vez que a matéria-prima a ser degradada é constituída de aproximadamente 60%

de celulose. A primeira tentativa de obtenção de celobiohidrolase (CBH I) foi através do cultivo

de Escherichia coli geneticamente modificada, contendo a proteína recombinante isolada do

micro-organismo Humicola grisea. Células da linhagem Origami 2 foram transformadas por

eletroporação para a inserção do plasmídeo contendo o gene de interesse. A indução foi feita a

20ºC durante 16 h. Através de eletroforese SDS-PAGE, pode-se notar a expressão da proteína,

presente no lisado celular clarificado, após a indução. Entretanto, esse lisado não apresentou

atividade enzimática contra o substrato específico p-NPC (dados não apresentados). Assim,

partiu-se para a outra tentativa de obtenção de CBH.

A segunda tentativa de produção e isolamento dessa enzima foi através do cultivo de

Pichia pastoris geneticamente modificada, expressando o gene codificador da proteína de

interesse, isolada do micro-organismo Humicola grisea (OLIVEIRA et al., 2013). Através desse

sistema de expressão, a proteína de interesse é secretada para o meio extracelular. A expressão da

enzima foi confirmada através de eletroforese SDS-PAGE. Contudo, o sobrenadante gerado não

apresentou atividade enzimática contra o substrato específico de ação das CBHs, o p-NPC (dados

não apresentados).

O fungo T. reesei expressa enzimas direcionadas para a conversão de biomassa em

açúcares fermentescíveis. Além disso, o coquetel enzimático provindo desse micro-organismo

apresenta as duas classes de CBH: I e II (FOREMAN et al., 2003). Sabe-se que ambas as classes

são essenciais para a conversão dos polissacarídeos em oligossacarídeos, uma vez que atuam em

49

regiões distintas das moléculas. Desse modo, o objetivo do cultivo de T. reesei foi isolar uma

fração rica em celobiohidrolases. O cultivo para a produção de enzimas teve a medida de FPAse

como principal parâmetro, tendo sido esta a atividade celulolítica total (FPase) monitorada ao

longo de 144 h (Figura 19).

Figura 19: Atividade celulásica total FPAse apresentada pelo coquetel fúngico T. reesei ao longo do tempo de

cultivo. Amostragens em 48, 72, 96, 120 e 144 horas.

Uma vez obtido o sobrenadante fúngico, fez-se um estudo de precipitação seriada com o

sal sulfato de amônio visando obter uma fração concentrada nesta classe enzimática (CBH). Duas

frações de precipitação, a 50 e 60% de sal, pareceram ser mais promissoras quanto à presença de

celobiohidrolases. A fração de ressuspensão da precipitação a 60% de sal foi diafiltrada para a

separação das proteínas em função de sua massa molar.

A precipitação com sulfato de amônio induz a neutralização das cargas superficiais da

proteína e a redução da camada de hidratação, favorecendo a agregação dos resíduos

hidrofóbicos. Em uma precipitação seriada atingindo as porcentagens de saturação de sulfato de

amônio de 40, 50, 60, 70 e 80%, as frações de 50 e 60% apresentaram, respectivamente, 36,1% e

44,5% do total de proteínas precipitadas. Esse estudo foi realizado a um volume inicial de

amostra de 20 mL. A Tabela 3 mostra a recuperação de proteínas, em porcentagem, dos

precipitados referentes às diferentes concentrações de sal. As frações de precipitação a 40, 70 e

80% apresentaram uma recuperação baixa em relação às frações a 50 e 60% de sal. O gel de

48 72 96 120 144

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

FPAse

FP

ase

(F

PU

/mL

)

Tempo (horas)

50

eletroforese SDS-PAGE da Figura 20 mostra que a maior parte das proteínas presentes nas

frações de 50 e 60% de sal na precipitação estão entre 70 e 40 kDa. As celobiohidrolases,

proteínas alvo a serem concentradas por este método, apresentam massa molecular de 54,1 kDa

(CBHI, GH 7) e 49,7 kDa (CBHII, GH 6) (STÅHLBERG et al., 1993).

Tabela 3: Recuperação proteica das frações da precipitação seriada do extrato fúngico de T. reesei com sulfato de

amônio.

Precipitados do fracionamento com S.A.

Extrato

bruto 40% S.A. 50% S.A. 60% S.A. 70% S.A. 80% S.A.

Proteína

(mg/mL) 1,67 1,13 3,9 4,8 0,72 0,24

Volume (mL) 20 2 2 2 2 2

Massa de

proteína (mg) 33,4 2,26 7,8 9,6 1,44 0,48

Recuperação

(%) 100 6,77 23,35 28,74 4,31 1,44

Figura 20: Eletroforese SDS-PAGE do sobrenadante fúngico de T. reesei das frações de precipitação com sulfato de

amônio a partir do mesmo. Pista1: padrão PageRuler prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa: 170,

130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10); pista 2: sobrenadante de T. reesei; pista 3: precipitado a 40% de S.A.; pista 4:

precipitado a 50% de S.A.; pista 5: precipitado a 60% de S.A.; pista 6: precipitado a 70% de S.A.; pista 7:

precipitado a 80% de S.A. As amostras foram diluídas para uma concentração proteica máxima de 0,5 mg/mL em

cada pista.

Pad

rão

Pro

téic

o

Ex

trato

fú

ng

ico

Pre

cip

itad

o a

40

% S

.A.

Pre

cip

itad

o a

50

% S

.A.

Pre

cip

itad

o a

60

% S

.A.

Pre

cip

itad

o a

70

% S

.A.

Pre

cip

itad

o a

80

% S

.A.

130 kDa

70 kDa

55 kDa

35 kDa

25 kDa

51

A atividade enzimática contra o substrato específico é uma maneira de estimar a

estabilidade da enzima após o processo de purificação. Dessa forma, foram determinadas as

concentrações proteicas e as atividades enzimáticas (contra o substrato p-NPC) do extrato bruto e

das frações de precipitação a 40 (terceira com maior porcentagem de recuperação proteica), 50 e

60% de sulfato de amônio. Os dados estão representados na Tabela 4. A fração de ressuspensão

da precipitação do extrato de fúngico a 50 % de saturação apresentou a maior atividade específica

contra o substrato pNPC, quando comparado ao extrato bruto e às demais frações de precipitação.

O fator de purificação desta fração (50% de saturação) é de 2,4, representando que a atividade

específica foi aumentada em 2,4 vezes em relação ao extrato bruto, com uma recuperação de 56%

das unidades de atividade (UI) iniciais.

Tabela 4: Análise quantitativa do extrato bruto e das frações de precipitação a 40, 50 e 60% de sulfato de amônio.

Precipitados do

fracionamento com

sulfato de amônio

Atividade

volumétrica

(p-NPC)

UI/mL

Atividade

específica

(p-NPC)

UI/mg

Volume

(mL) Fator de

purificação

Recuperação

de atividade

%

Extrato Bruto 0,49 0,29 20 1,00 100,00

40% 0,41 0,36 2 1,24 8,4

50% 2,75 0,71 2 2,40 56,1

60% 1,75 0,36 2 1,24 35,7

As frações de precipitação a 50 e 60% de saturação com sulfato de amônio se

apresentaram como as mais promissoras em relação à presença de celobiohidrolases. A fração de

50 % S.A. possui atividade específica contra o substrato de 0,71 UI/mg e o maior fator de

purificação em relação às outras frações de precipitação (Tabela 4). Em relação à fração de

precipitação a 60 % de S.A., esta apresenta menos bandas de proteínas com menos de 35 kDa em

relação à fração de 50 % de S.A. (Figura 20). As celobiohidrolases possuem massa molar maior

que 35 kDa, indicando que as proteínas com essa faixa de massa ou menores não são

interessantes para a fração a ser isolada deste extrato fúngico. Desta forma, a fim de se recuperar

a maior massa possível de proteínas com a atividade de interesse (celobiohidrolásica), e também

devido ao fato de que haveria uma etapa posterior de separação em relação à massa molar

(diafiltração), as proteínas precipitadas a 50 e 60% de sal foram reunidas em um único passo de

precipitação.

52

As precipitações subsequentes, em volumes maiores, foram realizadas a uma saturação

inicial de 40% de sal sulfato de amônio, visando à eliminação das proteínas precipitadas. Ao

sobrenadante resultante foi adicionado o sal até atingir a saturação de 60%. Essa fração foi

empregada para os experimentos seguintes de diafiltração, sendo que a amostra resultante do

experimento exemplificado abaixo foi utilizada para a segunda replicata da diafiltração (B). O

balanço de massa dessa técnica apresenta rendimento global de 104,6% (Tabela 5).

Tabela 5: Balanço de massa referente à precipitação do extrato fúngico de T. reesei com sulfato de amônio. As

frações de precipitação a 40 e 60% de sulfato de amônio, ressuspendidas em volumes conhecidos, bem como o

sobrenadante final desse processo, são comparados ao extrato bruto incial.

Precipitados do

fracionamento com

S.A.

Extrato bruto 40% 60% Sobrenadante

Concentração (mg/mL) 1,45 0,75 9,6 0,23

Volume (mL) 400 34 50 440

Massa de proteína (mg) 580 25,5 480 101,2

Recuperação (%) - 4,40 82,76 17,4

As atividades enzimáticas específicas do extrato bruto fúngico e da fração de

precipitação a 60% de saturação, contendo as proteínas precipitadas desde 41% de saturação, são

similares. Isso também pode ser notado pelo fator de purificação, que é próximo de 1 (Tabela 6).

Assim, não houve purificação desta fração de precipitação em relação à atividade

celobiohidrolásica.

Tabela 6: Atividades enzimáticas volumétricas e específicas do extrato fúngico de T. reesei e da fração resultante da

precipitação com sulfato de amônio. Fator de purificação e rendimento da atividade também são apresentados.

Amostras do

fracionamento com

sulfato de amônio

Atividade

volumétrica

(p-NPC)

UI/mL

Atividade

específica

(p-NPC)

UI/mg

Volume

(mL) Fator de

purificação

Recuperação

de atividade

%

Extrato Bruto 0,95 0,65 400 1,00 100,00

60% 5,99 0,62 50 0,96 78,80

A fração de ressuspensão a 60% S.A. em escala de 400 mL foi submetida à filtração

tangencial em modo de diafiltração, utilizando uma membrana com o tamanho de poros de 30

kDa, com o objetivo de eliminar as proteínas de baixa massa molar ainda presentes nessa fração.

Nesta técnica, o permeado é a fração que contém proteínas com massa molar menor que a da

53

membrana empregada e, assim, permeia pela mesma. O retentado é a fração contendo proteínas

com massa molar maior que a da membrana e de interesse nesse estudo, uma vez que o corte do

filtro é de 30 kDa. A relação de tamanho (massa molar) entre as proteínas presentes na fração a

ser diafiltrada não era alta o suficiente para uma separação eficaz. Além disso, o tamanho de

corte da membrana de 30 kDa é definido em relação a proteínas globulares. Assim, proteínas com

outras conformações estruturais podem apresentar comportamento diferente do esperado nesse

processo de separação. Entretanto, este passo de purificação da amostra foi feito mesmo se

conhecendo as limitações do processo. Para estes ensaios, conduzidos em duplicata, a pressão

transmembrana (TMP) e o fluxo de retentado empregados foram de 1,5 e 25 mL/mim,

respectivamente. Na primeira replicata (A), o rendimento global foi de 85%, enquanto que na

segunda (B), esse rendimento foi de 93,41%. Balanços de massa (Tabelas 7 e 8) e testes de

atividades dos retentados comprovam a reprodutibilidade da diafiltração.

Tabela 7: Balanço de massa da diafiltração. A alimentação é a fração de ressuspensão do precipitado de T. reesei a

60% de S.A.. Após o procedimento, três frações são geradas na saída: permeado (PDF), retentatdo (RDF) e retentado

de lavagem/flush (RDF flush). Replicata A.

Alimentação* PDF RDF RDF flush Yglobal (%)

Concentração

(mg/mL) 7,72 0,39 0,93 0,4

85,0 Volume (mL) 36 468 30 23

Massa de proteína

(mg) 277,92 196,56 29,7 9,89

Recuperação (%) - 70,73 10,69 3,56

* A amostra Alimentação é obtida após a sucção da fração de ressuspensão a 60% S.A. pelo

sistema, através da abertura do container.

Tabela 8: Balanço de massa da diafiltração. A alimentação é a fração de ressuspensão do precipitado de T. reesei a

60% de S.A.. Após o procedimento, três frações são geradas na saída: permeado (PDF), retentatdo (RDF) e retentado

de lavagem/flush (RDF flush). Replicata B.

Alimentação* PDF RDF RDF flush Yglobal (%)

Concentração

(mg/mL) 5,8 0,41 0,38 0,18

93,41 Volume (mL) 36 435 33 23

Massa de proteína

(mg) 208,8 178,35 12,54 4,14

Recuperação (%) - 85,42 6,01 1,98

* A amostra Alimentação é obtida após a sucção da fração de ressuspensão a 60% S.A. pelo

sistema, através da abertura do container.

54

O retentado (RDF) e o retentado flush (RDF flush) referentes à replicata A foram unidos,

uma vez que seus padrões proteicos são semelhantes. Isso pode ser notado através da eletroforese

SDS-PAGE, na Figura 21. Assim, essa fração RDF + RDF flush, de massa proteica igual a 0,77

mg/mL, será tratada como um único fator para o planejamento de mistura visando a otimização

de coquetéis enzimáticos, denominado fator T. reesei. A Figura 22 apresenta a eletroforese SDS-

PAGE da alimentação e das frações de saída da replicata A da diafiltração. Pode-se notar que a

fração T. reesei (RDF + RDF flush) possui menos proteínas com massas molares inferiores a 40

kDa, em comparação com a alimentação, enquanto que as proteínas remanescentes apresentam

massa molar entre 40 e 70 kDa, mesma faixa prevista para as celobiohidrolases do fungo

Trichoderma reesei (STÅHLBERG et al., 1993).

Figura 21: Gel SDS-PAGE dos permeados da diafiltração. Condições da corrida: TMP de 1,5; fluxo de Retentado de

25 mL/mim e membrana de 30 kDa. Pista1: padrão PageRuler prestained protein ladder (de cima para baixo, em

kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 e 10); pista 2: RDF; pista 3: RDF flush. As amostras estão diluídas 10

vezes. Replicata A da diafiltração.

Pad

rão

pro

téic

o

RD

F

RD

F f

lush

100 kDa

70 kDa

55 kDa

40 kDa

35 kDa

25 kDa

15 kDa

55

Figura 22: Gel SDS-PAGE da alimentação (ressuspensão do precipitado de T. reesei a 60% de S.A.) e frações de

saída da diafiltração (permeados e retentados). Condições da corrida: TMP de 1,5; fluxo de Retentado de 25

mL/mim e membrana de 30 kDa. Pista1: padrão PageRuler prestained protein ladder (de cima para baixo, em kDa:

170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25 e 15); pista 2: alimentação; pista 3: PDF após recirculação de 36 mL de tampão pelo

sistema; pista 4: PDF após recirculação de 144 mL de tampão pelo sistema; pista 5 PDF após recirculação de 288 mL

de tampão pelo sistema; pista 6: PDF após recirculação de 468 mL de tampão pelo sistema; pista 7 RDF + RDF

flush. Todas as pistas foram carregadas com as amostras diluídas 10 vezes. Replicata A da diafiltração.

Em relação à replicata B, o RDF flush apresentou atividades volumétrica e específica

contra o p-NPC menores que as apresentadas pelo RDF. Assim, apenas o retentado final (RDF)

compõe a fração que será tratada como o fator T. reesei nos planejamentos de experimentos

subsequentes.

A denominação T. reesei A será utilizada para referenciar a mistura RDF + RDF flush

proveniente da replicata A da diafiltração, enquanto que T. reesei B refere-se ao RDF proveniente

da replicata B. A Tabela 9 apresenta dados de comparação e validação da equivalência entre

essas amostras.

Pad

rão

pro

téic

o

Ali

men

tação

PD

F V

ol.

36

mL

PD

F V

ol.

14

4 m

L

PD

F V

ol.

28

8 m

L

PD

F V

ol.

46

8 m

L

RD

F +

RD

F f

lush

100 kDa

70 kDa

55 kDa

40 kDa

35 kDa

25 kDa

15 kDa

56

Tabela 9: Comparações entre as amostras T. reesei obtidas através de ensaios de diafiltração e utilizadas nas

montagens de coquetéis enzimáticos otimizados.

T. reesei Atividade

pNPC (UI/mL)

Proteínas

(mg/mg)

Atividade

específica

(UI/mg)

FPU/mL FPU/mg

A 0,54 0,77 0,70 2,07 2,69

B 0,24 0,38 0,62 0,84 2,21

A cinética de liberação de açúcares ao longo de 48 h de hidrólise pela ação do

sobrenadante fúngico (fração 1), fração de ressuspensão da precipitação a 60% de S.A. (fração 2)

e fração proveniente da etapa de diafiltração - T. reesei A - (fração 3) apresentam perfis

semelhantes (Figuras 23, 24 e 25). As atividades FPAse específicas dessas frações são,

respectivamente, 2,55, 2,7 e 2,68 FPU/mg, o que contribui para a ação similar contra o substrato.

Ao se comparar as médias das conversões de celulose, essas três frações apresentam valores sem

diferenças estatísticas entre eles, a 95% de confiança (Figura 26). A semelhança dos resultados de

conversão de celulose da fração 1 (61,51% ± 0,056), fração 2 (58,81% % ± 0,71) e fração 3

(58,91% ± 2,02), e a similaridade das atividades específicas destas frações contra o substrato

pNPC provam que não houve ganhos em termos de enriquecimento das frações nas atividades

enzimáticas desejadas (celobiohidrolases). Portanto, o processamento do coquetel de T. reesei

após o cultivo poderia ser concluído na etapa de precipitação com sulfato de amônio. Embora as

frações do sobrenadante fúngico de T. reesei e de ressuspensão da precipitação a 60% de S.A.

também apresentem conversões similares, esta etapa de recuperação primária (precipitação com

sal) permite a concentração da amostra e condicionamento das enzimas precipitadas em tampão

para o seu armazenamento e uso direto na reação, uma vez que são ressuspendidas no tampão de

hidrólise. Assim, para os ensaios subsequentes de otimização de coquetéis, utilizou-se tanto a

fração de ressuspensão da precipitação de T. reesei a 60% de S.A. quanto as amostras obtidas

após diafiltração (T. reesei A e T. reesei B), uma vez que já haviam sido produzidas. As

atividades destas frações eram monitoradas antes de cada experimento.

57

Figura 23: Liberação de glicose (g/L) ao longo de 48 h de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar hidrotérmico 190

pelo sobrenadante do extrato fúngico de T. reesei (fração 1), fração de ressuspensão da precipitação de T. reesei a

60% de S.A (fração 2) e retentado de T. reesei (A) (fração 3). Carga de 10 mg proteína/g de bagaço.

Figura 24: Liberação de xilose (g/L) ao longo de 48 h de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar hidrotérmico 190

pelo sobrenadante do extrato fúngico de T. reesei (fração 1), fração de ressuspensão da precipitação de T. reesei a

60% de S.A (fração 2) e retentado de T. reesei (A) (fração 3). Carga de 10 mg proteína/g de bagaço.

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

0

4

8

12

16

20

24

Gli

cose

(g/L

)

Tempo (h)

fração 1

fração 2

fração 3

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Xil

ose

(g

/L)

Tempo (h)

fração 1

fração 2

fração 3

58

Figura 25: Liberação de celobiose (g/L) ao longo de 48 h de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar hidrotérmico

190 pelo sobrenadante do extrato fúngico de T. reesei (fração 1), fração de ressuspensão da precipitação de T. reesei

a 60% de S.A (fração 2) e retentado de T. reesei (A) (fração 3). Carga de 10 mg proteína/g de bagaço.

Figura 26: Conversão de celulose após hidrólise do bagaço hidrotérmico 190 por 48 h, 50 ºC e 1000 rpm para o

sobrenadante do extrato fúngico de T. reesei (fração 1), ressuspensão da precipitação de T. reesei a 60% de S.A

(fração 2) e retentado de T. reesei (A) após diafiltração (fração 3). Letras diferentes significam diferença estatística

entre as médias pelo teste de Tukey a 0,05% de probabilidade.

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

0

1

2

3

4

5

6

Cel

ob

iose

(g

/L)

Tempo (h)

fração 1

fração 2

fração 3

Fração 1 Fração 2 Fração 3

0

10

20

30

40

50

60

70

AA

Co

nv

ersã

o d

e ce

lulo

se (%

)

A

59

4.3 Validação do microensaio de hidrólise enzimática

Para o estudo da montagem dos coquetéis enzimáticos, quanto menor o volume usado de

enzimas para as hidrólises, mais barato e prático os experimentos se tornam. O bagaço

hidrotérmico (BH 190) apresenta 60,56% de celulose, 3,13% de hemicelulose, 29,88% de lignina

total e 6,2% de cinzas. Esse tratamento reduz a porcentagem de hemicelulose, aumentando a de

celulose.

O objetivo desse experimento foi avaliar se a hidrólise realizada em menor volume

apresenta resultados semelhantes aos obtidos em escala maior. O efeito da β-glicosidase na

validação do microensaio pôde ser percebido, uma vez que essa enzima cliva as moléculas de

celobiose provenientes da celulose, atuando sobre a ligação β -1,4 dos dímeros de glicose.

Foi realizado um experimento de validação do protocolo de microensaio de hidrólise

(Vfinal=1,5 mL), considerando o ensaio em frasco Erlenmeyer (Vfinal=50 mL) como referência.

Para tanto, avaliou-se o efeito da adição de β-glicosidase (20 UI de β-glicosidase/g de bagaço

seco = 2,1 mg proteína/g de bagaço seco) a uma reação contendo o coquetel fúngico de T. reesei

(10 FPU/g de bagaço seco = 4 mg proteína/g de bagaço seco), em escala de 1,5 mL e 50 ml,

sendo o ensaio sem adição de β-glicosidase, o ensaio controle. A liberação de glicose foi

estatisticamente diferente entre esses sistemas reacionais (com e sem β-glicosidase) para cada

tempo de amostragem, em ambas as escalas (Figuras 27 e 28).

60

Figura 27: Efeito da adição de β-glicosidase na liberação de glicose em diferentes tempos de hidrólise do BH 190,

onde TR significa sobrenadante do Trichoderma reesei e TR+BGL denomina o sobrenadante suplementado da

enzima β-glicosidase. Experimento realizado em Erlenmeyer de 125 mL (escala de 50 mL). Letras diferentes

significam diferença estatística entre as médias pelo teste de Tukey a 0,05% de probabilidade.

Figura 28: Efeito da adição de β-glicosidase na liberação de glicose em diferentes tempos de hidrólise do BH 190,

onde TR significa sobrenadante do Trichoderma reesei e TR+BGL denomina o sobrenadante suplementado da

enzima β-glicosidase. Experimento realizado em tubos de 2,0 mL (escala de 1,5 mL). Letras diferentes significam

diferença estatística entre as médias pelo teste de Tukey a 0,05% de probabilidade.

6 24 48 72

0

5

10

15

20

25

F

E E

D

C/D

B/C

B

Gli

cose

lib

erad

a (g

/L)

Tempo (h)

TR

TR + BGL

A

6 24 48 72

0

5

10

15

20

25

A

CC

B/C

B

A

A

Gli

cose

lib

erad

a (g

/L)

Tempo (h)

TR

TR + BGL

A

61

As diferenças estatísticas na conversão de celulose entre as reações com e sem enzima

adicional (β-glicosidase) se mantêm em ambas as escalas. A partir de análises estatísticas

(ANOVA e teste de Tukey, a 0,05% de probabilidade), as médias das conversões são iguais para

a escala de 50 mL e 1,5 mL nos tratamentos sem adição de β-glicosidase. Quando a β-glicosidase

é adicionada, as médias das conversões também são estatisticamente iguais para as hidrólises em

50 e 1,5 mL. Entretanto, as médias das conversões são estatisticamente diferentes quando se

compara os resultados com e sem a suplementação do coquetel com 20 UI de β-glicosidase/g de

bagaço seco. Isso valida a utilização dos microensaios de hidrólise, uma vez que o mesmo efeito

pôde ser percebido para ambas as escalas (Figura 29).

Figura 29: Comparação da conversão enzimática da celulose pelo extrato enzimático do T. reesei com e sem adição

da enzima β-glicosidase, em ambas as escalas.

4.4 Hidrólise enzimática utilizando coquetéis comerciais

Os coquetéis comerciais Cellic CTec H2 (Novozymes), de atividade celulolítica de 195

FPU/mL, e Celluclast 1.5 L (Novozymes), apresentando atividade celulolítica de 108 FPU/mL,

foram usados como padrões comparativos para os ensaios de otimização das misturas proteicas.

As conversões de celulose obtidas foram de 70,43% ± 5,03 e 49,11% ± 0,49, respectivamente,

quando se emprega uma carga enzimática de 10 mg de proteína por grama de bagaço. O coquetel

Cellic CTec apresenta concentração proteica de 85 mg/mL, enquanto que o Celluclast, de 42

0 20

0,0

40

50

60

70

Co

nv

ersã

o e

nzi

mát

ica

da

celu

lose

(%

)

glicosidase (UI/g bagaço seco)

50 mL

1,5 mL

62

mg/mL. As Figuras 30 e 31 apresentam os perfis de liberação de açúcares (glicose, xilose e

celobiose) ao longo do tempo de hidrólise.

Figura 30: Padrão comparativo de hidrólise enzimática. Perfil de liberação de açúcares ao longo de 48 h

correspondente à hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar hidrotérmico 190 pelo coquetel comercial Cellic CTec H2.

Carga de 10 mg proteína/g de bagaço.

Figura 31: Padrão comparativo de hidrólise enzimática. Perfil de liberação de açúcares ao longo de 48 h

correspondente à hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar hidrotérmico 190 pelo coquetel comercial Celluclast 1.5 L.

Carga de 10 mg proteína/g de bagaço.

-10 0 10 20 30 40 50

0

4

8

12

16

20

24

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

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0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Glic

ose

(g

/L)

Tempo (h)

Glicose

Xilose

Celobiose

Xilo

se

(g

/L)

Ce

lob

iose

(g

/L)

-10 0 10 20 30 40 50

0

4

8

12

16

20

24

0,0

0,2

0,4

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0,8

1,0

1,2

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1,6

1,8

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0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Glic

ose

(g

/L)

Tempo (h)

Glicose

Xilose

Celobiose

Xilo

se

(g

/L)

Ce

lob

iose

(g

/L)

63

Se, nessas reações de hidrólise, a carga enzimática empregada for de 10 PFU/g de bagaço,

as conversões celulolíticas, ao longo de 48 h, são de 51,51% ± 1,09 para o coquetel Cellic CTec e

de 31,71% ± 0,16 para o Celluclast.

Devido ao fato do coquetel Celluclast não apresentar BGL, é possível notar uma maior

concentração de celobiose e, consequentemente, menor acúmulo de glicose ao fim da hidrólise,

em relação ao perfil cinético da hidrólise com Cellic CTec. Além disso, as CBH I e II são as

proteínas mais abundantes no coquetel Celluclast e, juntamente com as EG presentes, essas

celulases constituem 35% de um total de 20 proteínas identificadas (SUWANNARANGSEE et

al., 2012).

4.5 Otimização dos coquetéis enzimáticos

A biomassa, bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado, necessita de diferentes classes

enzimáticas para que sua complexa estrutura de polissacarídeos seja convertida a monômeros de

açúcar. Assim, esse estudo avalia a capacidade do bagaço ser convertido sob ação de diferentes

enzimas, celulases e hemicelulases, e uma proteína acessória, e a melhor proporção entre elas

para que essa resposta seja maximizada.

Com o objetivo de avaliar o efeito de sete diferentes proteínas na liberação de glicose

durante a hidrólise do bagaço de cana hidrotérmico (BH 190), foi delineado um planejamento de

mistura simplex-lattice com pontos internos e centroide global com grau de polinômio 2, no qual

a carga proteica adicionada se manteve fixa em 10 mg por grama de bagaço seco. Os fatores

analisados foram T. reesei, cuja fração possui celobiohidrolases, as enzimas β-1,4-endoglucanase

(EG), β-glicosidase (BGL), β-1,4-endo-xilanase (EX), acetilxilana esterase (AXE) e α-L-

arabinofuranosidase (ARF) e uma proteína da classe das expansinas (EXP).

O bagaço hidrotérmico 190 é constituído, em sua maior parte, por celulose, fazendo com

que as celulases sejam essenciais para o processo de hidrólise enzimática. Por esse motivo, os

níveis mínimos dos fatores T. reesei A, EG e BGL, que constituem as celulases, foram mantidos

em 0,2, 0,1 e 0,1, que correspondem a 2, 1 e 1 mg de proteína por grama de bagaço,

respectivamente. Assim, não houve reações em que as celulases estavam ausentes, garantindo o

início da hidrólise e a análise da contribuição das hemicelulases e proteína acessória para a

reação. Através de eletroforese SDS-PAGE, é possível avaliar o perfil das bandas proteicas de

64

cada fator estudado no planejamento e, de forma comparativa, o estado de pureza dos mesmos

(Figura 32). A Tabela 10 apresenta os fatores avaliados e seus respectivos níveis.

Figura 32: Eletroforese SDS-PAGE das proteínas utilizadas no planejamento de mistura (fatores). As amostras

foram diluídas para uma concentração proteica máxima de 0,5 mg/mL. Pista1: padrão PageRuler prestained protein

ladder (de cima para baixo, em kDa: 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25 e 15); pista 2: T. reesei A; pista 3:

endoglucanase; pista 4: β-glicosidase; pista 5: endoxilanase; pista 6:acetilxilana esterase; pista 7: α-L-

arabinofuranosidase; pista 8: expansina.

Tabela 10: Proporções máximas e mínimas dos sete fatores envolvidos no planejamento de mistura. O valor entre

parênteses corresponde à quantidade proteica em mg de proteína por g de bagaço seco. A soma total das proporções

entre os fatores, em cada corrida, deve ser 1.

Fatores

T. reesei A EG BGL EX AXE ARF EXP

Proporção Mínima 0,2 (2) 0,1 (1) 0,1 (1) 0 0 0 0

Máxima 0,8 (8) 0,7 0,7 (7) 0,6 (6) 0,6 (6) 0,6 (6) 0,6 (6)

Na Tabela 11 são mostradas, para cada corrida, as proporções reais dos fatores e as

respostas geradas após 48 h de hidrólise.

Pad

rão

Pro

téic

o

T.

reese

i

EG

BG

L

EX

AX

E

AR

F

EX

P

70 kDa

55 kDa

40 kDa

35 kDa

25 kDa

15 kDa

65

Tabela 11: Matriz experimental do planejamento de mistura com as composições de cada corrida (valores reais). As

respostas são representadas em g/L de açúcares liberados (celobiose, glicose e xilose), após 48 h de hidrólise. A

primeira coluna representa a corrida (C) e a segunda representa a replicata (R). A carga total de cada corrida é de 10

mg de proteína por g de bagaço seco.

C R T. reesei A EG BGL EX AXE ARF EXP Celobiose Glicose Xilose

1 1 0,80 0,10 0,10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,49 22,86 1,43

2 1 0,20 0,70 0,10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,14 15,48 0,96

3 1 0,20 0,10 0,70 0,00 0,00 0,00 0,00 0,15 14,67 1,00

4 1 0,20 0,10 0,10 0,60 0,00 0,00 0,00 0,10 15,27 0,94

5 1 0,20 0,10 0,10 0,00 0,60 0,00 0,00 0,08 8,91 0,54

6 1 0,20 0,10 0,10 0,00 0,00 0,60 0,00 0,09 9,88 0,56

7 1 0,20 0,10 0,10 0,00 0,00 0,00 0,60 0,15 15,52 0,97

8 1 0,50 0,40 0,10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 20,82 1,26

9 1 0,50 0,10 0,40 0,00 0,00 0,00 0,00 0,20 20,63 1,44

10 1 0,50 0,10 0,10 0,30 0,00 0,00 0,00 0,23 22,40 1,44

11 1 0,50 0,10 0,10 0,00 0,30 0,00 0,00 0,22 18,08 1,10

12 1 0,50 0,10 0,10 0,00 0,00 0,30 0,00 0,24 19,36 1,11

13 1 0,50 0,10 0,10 0,00 0,00 0,00 0,30 0,23 20,79 1,38

14 1 0,20 0,40 0,40 0,00 0,00 0,00 0,00 0,22 15,51 1,00

15 1 0,20 0,40 0,10 0,30 0,00 0,00 0,00 0,27 15,59 0,84

16 1 0,20 0,40 0,10 0,00 0,30 0,00 0,00 0,08 11,81 0,67

17 1 0,20 0,40 0,10 0,00 0,00 0,30 0,00 0,10 11,59 0,60

18 1 0,20 0,40 0,10 0,00 0,00 0,00 0,30 0,13 15,44 0,94

19 1 0,20 0,10 0,40 0,30 0,00 0,00 0,00 0,13 15,67 1,07

20 1 0,20 0,10 0,40 0,00 0,30 0,00 0,00 0,07 11,72 0,77

21 1 0,20 0,10 0,40 0,00 0,00 0,30 0,00 0,07 11,33 0,75

22 1 0,20 0,10 0,40 0,00 0,00 0,00 0,30 0,13 14,93 0,97

23 1 0,20 0,10 0,10 0,30 0,30 0,00 0,00 0,11 12,45 0,71

24 1 0,20 0,10 0,10 0,30 0,00 0,30 0,00 0,12 12,00 0,68

66


25 1 0,20 0,10 0,10 0,30 0,00 0,00 0,30 0,13 15,46 0,89

26 1 0,20 0,10 0,10 0,00 0,30 0,30 0,00 0,08 10,07 0,56

27 1 0,20 0,10 0,10 0,00 0,30 0,00 0,30 0,10 11,91 0,63

28 1 0,20 0,10 0,10 0,00 0,00 0,30 0,30 0,13 12,43 0,64

29 1 0,54 0,14 0,14 0,04 0,04 0,04 0,04 0,16 22,50 1,37

30 1 0,24 0,44 0,14 0,04 0,04 0,04 0,04 0,15 15,14 0,93

31 1 0,24 0,14 0,44 0,04 0,04 0,04 0,04 0,14 16,15 1,04

32 1 0,24 0,14 0,14 0,34 0,04 0,04 0,04 0,12 15,34 0,93

33 1 0,24 0,14 0,14 0,04 0,34 0,04 0,04 0,10 12,48 0,74

34 1 0,24 0,14 0,14 0,04 0,04 0,34 0,04 0,09 12,23 0,67

35 1 0,24 0,14 0,14 0,04 0,04 0,04 0,34 0,13 16,81 1,04

36 1 0,29 0,19 0,19 0,09 0,09 0,09 0,09 0,19 16,43 1,01

37 2 0,80 0,10 0,10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,33 25,67 1,72

38 2 0,20 0,70 0,10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 16,17 0,99

39 2 0,20 0,10 0,70 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 14,66 1,04

40 2 0,20 0,10 0,10 0,60 0,00 0,00 0,00 0,13 15,35 0,95

41 2 0,20 0,10 0,10 0,00 0,60 0,00 0,00 0,09 10,27 0,55

42 2 0,20 0,10 0,10 0,00 0,00 0,60 0,00 0,10 10,34 0,56

43 2 0,20 0,10 0,10 0,00 0,00 0,00 0,60 0,16 15,71 0,97

44 2 0,50 0,40 0,10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,19 22,15 1,42

45 2 0,50 0,10 0,40 0,00 0,00 0,00 0,00 0,22 20,96 1,50

46 2 0,50 0,10 0,10 0,30 0,00 0,00 0,00 0,19 21,49 1,32

47 2 0,50 0,10 0,10 0,00 0,30 0,00 0,00 0,26 19,29 1,08

48 2 0,50 0,10 0,10 0,00 0,00 0,30 0,00 0,28 19,06 1,11

49 2 0,50 0,10 0,10 0,00 0,00 0,00 0,30 0,31 21,89 1,45

50 2 0,20 0,40 0,40 0,00 0,00 0,00 0,00 0,11 15,32 1,05

51 2 0,20 0,40 0,10 0,30 0,00 0,00 0,00 0,14 15,10 0,98

67


52 2 0,20 0,40 0,10 0,00 0,30 0,00 0,00 0,11 11,69 0,63

53 2 0,20 0,40 0,10 0,00 0,00 0,30 0,00 0,12 12,36 0,64

54 2 0,20 0,40 0,10 0,00 0,00 0,00 0,30 0,15 16,08 0,94

55 2 0,20 0,10 0,40 0,30 0,00 0,00 0,00 0,09 15,02 1,07

56 2 0,20 0,10 0,40 0,00 0,30 0,00 0,00 0,07 11,92 0,74

57 2 0,20 0,10 0,40 0,00 0,00 0,30 0,00 0,08 12,33 0,75

58 2 0,20 0,10 0,40 0,00 0,00 0,00 0,30 0,12 15,06 0,99

59 2 0,20 0,10 0,10 0,30 0,30 0,00 0,00 0,09 11,88 0,64

60 2 0,20 0,10 0,10 0,30 0,00 0,30 0,00 0,16 12,23 0,63

61 2 0,20 0,10 0,10 0,30 0,00 0,00 0,30 0,14 15,73 0,90

62 2 0,20 0,10 0,10 0,00 0,30 0,30 0,00 0,07 9,92 0,54

63 2 0,20 0,10 0,10 0,00 0,30 0,00 0,30 0,10 12,19 0,69

64 2 0,20 0,10 0,10 0,00 0,00 0,30 0,30 0,12 11,57 0,67

65 2 0,54 0,14 0,14 0,04 0,04 0,04 0,04 0,22 22,15 1,35

66 2 0,24 0,44 0,14 0,04 0,04 0,04 0,04 0,15 15,74 0,91

67 2 0,24 0,14 0,44 0,04 0,04 0,04 0,04 0,11 15,36 0,98

68 2 0,24 0,14 0,14 0,34 0,04 0,04 0,04 0,16 16,38 1,00

69 2 0,24 0,14 0,14 0,04 0,34 0,04 0,04 0,12 12,54 0,72

70 2 0,24 0,14 0,14 0,04 0,04 0,34 0,04 0,11 12,60 0,74

71 2 0,24 0,14 0,14 0,04 0,04 0,04 0,34 0,12 15,35 0,94

72 2 0,29 0,19 0,19 0,09 0,09 0,09 0,09 0,22 16,89 1,03

Através da análise dos dados a um intervalo de confiança de 95%, considerando o erro

residual e os fatores codificados a pseudocomponentes, e com o auxílio do programa Statistica,

chegou-se à conclusão de que todos os efeitos principais, bem como os de interação dois a dois

da fração de T. reesei com as demais proteínas, são significativos quando a resposta considerada

é a concentração de glicose. As concentrações de celobiose e xilose não foram consideradas por

terem valores muito baixos e por não serem os açúcares de interesse. A Figura 33 apresenta o

68

gráfico de Pareto contendo esse resultado. Para facilitar a visualização do gráfico e do modelo

matemático, os fatores T. reesei A, EG, BGL, EX, AXE, ARF e EXP foram recodificados para as

letras A, B, C, D, E, F e G, respectivamente.

Figura 33: Gráfico de Pareto para os efeitos. Análise feita com pseudocomponentes. Resposta considerada: glicose

(g/L).

Pode-se notar que o pseudocomponente com maior influência na concentração de glicose

é T. reesei, seguido de EG, EXP, EX, BGL, ARF e AXE, nesta ordem, o que faz parecer que a

adição de expansina seria mais importante do que a adição de β-glicosidase ao coquetel de T.

reesei (Figura 33). No entanto, ao se avaliar os dados em relação aos componentes originais,

obtemos a Tabela 12. Nesta tabela, o valor t(44) corresponde ao efeito dividido pelo erro padrão

de cada fator, equivalendo à estimativa dos efeitos padronizados do gráfico de Pareto (calculado

para pseudocomponentes na Figura 33). Neste caso, com os componentes originais, nota-se que a

ordem de importância dos fatores se altera. Assim, T. reesei continua sendo o fator mais

importante, seguido de EG, BGL, EXP e EX, e os fatores AXE e ARF apresentam efeito

principal não significativo.

69

Tabela 12: Coeficientes do modelo matemático, erro residual, t-student e p-valor para os valores não codificados

(componentes originais). As demais interações de dois fatores (sem efeitos significativos) foram consideradas para

esta análise, porém não estão representadas na tabela.

Efeito/Coeficiente Erro t(44) p-valor

(A)T. reesei 24,31 1,12 21,71 0,000

(B)EG 9,44 1,65 5,73 0,000

(C)BGL 7,79 1,65 4,73 0,000

(D)EX 6,76 2,08 3,25 0,002

(E)AXE -0,32 2,08 -0,15 0,878

(F)ARF 0,31 2,08 0,15 0,884

(G)EXP 9,21 2,08 4,43 0,000

AB 19,18 5,91 3,24 0,002

AC 18,48 5,91 3,13 0,003

AD 27,42 5,91 4,64 0,000

AE 22,85 5,91 3,86 0,000

AF 25,58 5,91 4,33 0,000

AG 19,19 5,91 3,25 0,002

Foi gerado um modelo matemático que descreve as misturas experimentais delineadas

pelo planejamento de mistura. Esse modelo quadrático não considera os efeitos não significativos

e está em função dos pseudocomponentes:

𝑦 = 24,23𝐴 + 15,46𝐵 + 14,82𝐶 + 15,37𝐷 + 9,26𝐸 + 9,5𝐹 + 15,53𝐺 + 7,18𝐴 ∙ 𝐵 + 6,1𝐴 ∙ 𝐶

+ 9,42𝐴 ∙ 𝐷 + 8,48𝐴 ∙ 𝐸 + 9,94𝐴 ∙ 𝐹 + 6,81𝐴 ∙ 𝐺

onde 𝐴 = ((𝑇. 𝑟𝑒𝑒𝑠𝑒𝑖 − 0,2) 0,6)⁄ , 𝐵 = ((𝐸𝐺 − 0,1) 0,6)⁄ , 𝐶 = ((𝐵𝐺𝐿 − 0,1) 0,6)⁄ , 𝐷 =

(𝐸𝑋 0,6)⁄ , 𝐸 = (𝐴𝑋𝐸 0,6)⁄ , 𝐹 = (𝐴𝑅𝐹 0,6)⁄ e 𝐺 = (𝐸𝑋𝑃 0,6)⁄ , uma vez que o somatório dos

limites inferiores dos componentes puro é 0,4. Os valores de T. reesei, EG, BGL, EX, AXE, ARF

e EXP correspondem à proporção original destes componentes na mistura, como dado na Tabela

11.

A validação do modelo matemático foi baseada na análise de variância (ANOVA) e teste

F de Fisher. O intervalo de confiança usado é de 95% (Tabela 13).

70

Tabela 13: Tabela ANOVA para o modelo gerado através do planejamento de mistura.

Fonte de Variação Soma quadrática Nº de G.L Média quadrática

Regressão 995,57 12 83

Resíduos 21,817 59 0,37

Falta de Ajuste 9,449 23 0,41

Erro Puro 12,368 36 0,34

Total 1017,93 71

% de variação explicada: 97,8%

A soma quadrática relativa aos resíduos se traduz como a soma quadrática da falta de

ajuste somada com a soma quadrática do erro puro. Da mesma forma, a soma quadrática total se

resume da adição entre as somas quadráticas dos resíduos e da regressão.

Admitindo que os erros sigam uma distribuição normal, pode-se usar as médias

quadráticas para verificar a significância do modelo empírico estatístico. Esta análise é

denominada teste F de Fisher. Para o modelo ser validado, 𝐹 =𝑀𝑄𝑅

𝑀𝑄𝑟⁄ > 𝐹𝑥,𝑦(𝑡𝑎𝑏𝑒𝑙𝑎𝑑𝑜), onde

𝑥 representa a número de graus de liberdade da regressão e 𝑦 o número de graus de liberdade dos

resíduos. O segundo teste de Fisher a ser aplicado para validar o modelo, segue a condição de

que 𝐹 =𝑀𝑄𝑓𝑎𝑗

𝑀𝑄𝑒𝑝⁄ < 𝐹𝑤,𝑧(𝑡𝑎𝑏𝑒𝑙𝑎𝑑𝑜). Neste caso, 𝑤 representa o número de graus de liberdade

da falta de ajuste e 𝑧 o número de graus de liberdade do erro puro.

O modelo gerado é significativo e prediz os dados experimentais, uma vez que, para o

primeiro teste F, apresenta valor de 224,32, enquanto que o 𝐹12,59(𝑡𝑎𝑏𝑒𝑙𝑎𝑑𝑜) = 1,92 . Para o

segundo teste F, este modelo apresenta valor de 1,2, enquanto que o 𝐹23,36(𝑡𝑎𝑏𝑒𝑙𝑎𝑑𝑜) = 1,83.

Uma vez que o modelo representa o espaço amostral para o qual ele foi direcionado, a

maximização da sua resposta fornece os valores otimizados para os respectivos fatores

envolvidos. Para esta operação matemática, foi utilizado o Solver (EXCEL), obedecendo às

restrições de que as proporções dos fatores deveriam somar a unidade (1) e elas deveriam variar

entre 0 e 1. Como resultado, 100% da mistura deveria ser constituída pelo pseudo-componente T.

reesei (𝑥𝐴=1), enquanto que a proporção para os demais fatores deveria ser nula. A decodificação

dos pseudocomponente para proporções originais são dados por:

71

1 = (𝑐𝐴 − 0,2) (1 − 0,4)⁄ ∴ 𝑐𝑛 = 0,8, para o fator T. reesei

0 = (𝑐𝐵,𝐶 − 0,1) (1 − 0,4)⁄ ∴ 𝑐𝑛 = 0,1, para os fatores EG e BGL

0 = (𝑐𝐷,𝐸,𝐹,𝐺 − 0) (1 − 0,4)⁄ ∴ 𝑐𝑛 = 0, para os fatores EX, AXE, ARF e EXP

A Tabela 14 apresenta a proporção entre os fatores que geram a resposta máxima de

glicose, para este espaço experimental. Em termos de conversão de celulose, essa liberação de

glicose representa 72%. Para a hidrólise do bagaço hidrotérmico, nessas mesmas condições de

reação, os coquetéis comerciais Celluclast e Celic CTec H2 apresentam, respectivamente, 49,11 ±

0,49 e 70,43% ± 5,03 de conversão. Através da superfície de resposta para os fatores T. reesei,

EG e BGL, fixando os demais em zero, também é possível concluir que a resposta máxima requer

o fator T. reesei em seu nível superior (Figura 34). Dessa forma, as proporções dos fatores EG e

BGL na mistura devem ser mantidas em seus níveis inferiores (10% para ambos em valores

decodificados).

O coquetel precipitado e concentrado produzido pelo fungo (fração 2) converte 58,81% ±

0,71 de celulose. Embora esta fração tenha diversas atividades enzimáticas (Tabela 25) e esteja

bem balanceada, pode ser melhorada. Para esta análise há que se considerar as características do

material a ser hidrolisado (Tabela 1). A composição química da biomassa BH 190 confirma a alta

demanda por celulases e a pouca necessidade de hemicelulases, muitas das quais já estão

presentes na fração T. reesei. A mistura otimizada contendo T. reesei (fração responsável pela

presença de celobiohidrolases na mistura), endoglucanase e β-glicosidase pode ser justificada

devido ao modo de ação suplementar entre as CBH e EG sobre a fibra de celulose (VÄLJAMÄE

et al., 1998) e ao fato da β-glicosidase converter o principal inibidor da CBH a glicose, unidade

sobre a qual é calculada a conversão de celulose na reação (HOLTZAPPLE et al., 1990).

Outra forma de otimizar a mistura enzimática seria variando as proporções entre as duas

celobiohidrolases produzidas pelo fungo T. reesei. Porém, tanto a CBHI quanto a CBHII estão

presentes simultaneamente na fração T. reesei, tornando inviável esse estudo.

72

Tabela 14: Proporção dos fatores devido à maximização do modelo matemático proposto e resposta gerada.

Proporção dos fatores Resposta

T. reesei A EG BGL EX AXE ARF EXP Glicose (g/L)

0,8 0,1 0,1 0 0 0 0 24,23

Figura 34: Superfície de resposta (glicose (g/L)) envolvendo os fatores presentes no coquetel otimizado pelo

planejamento de mistura. Os fatores são apresentados em pseudocomponentes. Para gerar essa superfície, foi

utilizado o modelo quadrático, ignorando os efeitos não significativos.

GAO et al. (2010) reportaram a otimização de coquetéis enzimáticos artificiais para

hidrólise de palha de milho pré-tratada pelo método AFEX. O planejamento de misturas contou

com 5 fatores, os quais são celobiohidrolase I (CBH I), celobiohidrolase II (CBH II),

endoglucanase (EG), endoxilanase (EX) e β-xilosidase (BXL). A concentração de β-glicosidase

(BGL) se manteve fixa em 10% do total de proteína, a fim de evitar a inibição por celobiose.

Estes autores determinaram que a composição ótima da mistura enzimática é influenciada e

dependente da carga proteica empregada. Assim, para cargas proteicas mais baixas (em torno de

7,5 mg de proteína/g de glucana), a EG apresentou um papel relativamente mais importante para

o rendimento de glicose. Finalmente, o estudo reportado concluiu que as proporções de 27–30%

CBH I, 17–20% CBH II, 29–35% EG, 14–15% EX, 2–6% BXL e 1–5% BGL, em massa de

proteína, garantem rendimentos ótimos de glicose, chegando a 80% para uma carga proteica de

30 mg de proteína/g de glucana. Em contrapartida, ZHOU et al. (2009) otimizaram uma mistura

enzimática composta apenas por celulases. Primeiramente, um planejamento fatorial fracionado

73

(26-1

) identificou as enzimas sem efeitos significativos para a liberação de glicose a partir de

palha de milho, que foram mantidas no nível cental (0). As demais enzimas seguiram para um

planejamento fatorial completo estrela. A maximização da equação gerou a composição ótima

para a maior liberação de açúcar durante a hidrólise. Neste caso, a carga proteica não pode ser

fixada, variando de acordo com os níveis de cada fator.

As amostras T. reesei A e T. reesei B, obtidas das replicatas da diafiltração, contribuem da

mesma forma para a conversão do bagaço de cana hidrotérmico 190 a açúcares fermentescíveis.

Isso foi comprovado através da substituição do fator T. reesei A pelo T. reesei B, nas mesmas

proporções, no coquetel otimizado através do planejamento de misturas (80% de T. reesei, 10%

de EG e 10% de BGL), gerando liberações médias de glicose sem diferenças estatísticas entre

elas (Tabela 15).

Tabela 15: Médias e desvios-padrão das concentrações de glicose após hidrólise do bagaço hidrotérmico (BH 190)

utilizando duas diferentes amostras como o fator “T. reesei“ na composição do coquetel otimizado obtido através do

Planejamento de Mistura. Letras diferentes significam diferença estatística entre as médias pelo teste de Tukey a

0,05% de probabilidade.

Glicose FPU/mL FPU/mg

Média (g/L) SD

T. reesei A 24,26a

1,986 2,45 2,75

T. reesei B 21,73a

0,433 1,29 2,74

Os resultados obtidos com o planejamento de mistura mostraram que, embora a influência

das proteínas acessórias (EX, AXE, ARF e EXP) seja significativa (Figura 33), o coquetel ótimo

é composto apenas da fração T. reesei, endoglucanase e β-glicosidase (0,8:0,1:0,1). Isso equivale

a manter o fator T. reesei no seu limite superior e os fatores EG e BGL nas suas proporções

mínimas definidas. Como no planejamento de mistura a quantidade total de enzimas foi fixada

em 10 mg/ bagaço seco, para se adicionar uma massa de proteína acessória seria necessário

retirar a mesma quantidade das enzimas consideradas mais significativas. Assim, resolveu-se

partir para um planejamento fatorial, onde os fatores são independentes, e modificar o valor de

um deles não implica, necessariamente, na variação de outro componente do sistema de variáveis.

A fim de compreender a contribuição das enzimas para uma conversão máxima de

celulose, foi delineado o planejamento fatorial de três componentes (23), sendo que um desses

componentes representa o coquetel base composto pelas celulases e de proporção já definida pelo

74

planejamento de misturas anterior. Nesse coquetel base, a fração de T. reesei B, EG e BGL estão

nas proporções de 0,8:0,1:0,1. Os outros dois componentes são a endoxilanase e a expansina, pois

apresentaram os maiores efeitos dentre as proteínas não celulolíticas. Desse modo, as enzimas

acetilxilana esterase e a arabinofuranosidase, por apresentarem menores efeitos, foram

descartadas dos estudos seguintes. A Tabela 16 apresenta os níveis máximos e mínimos definidos

para cada fator.

Na Tabela 17 constam, para cada corrida, as cargas proteicas de cada fator e as respectivas

respostas em g/L de açúcares após 48 h de reação. A concentração proteica do fator T. reesei B,

utilizada para o cálculo do volume a ser adicionado na reação, é de 0,38 mg/mL.

Tabela 16: Níveis máximos e mínimos dos fatores envolvidos no planejamento fatorial completo 23. Neste caso, o

fator coquetel base é uma mistura de três componentes (T. reesei B, EG, BGL) com proporção fixa entre eles. A

unidade para todos os fatores são mg de proteína por g de bagaço seco.

Fatores

Níveis Coquetel base EX EXP

-1 4 0 0

+1 8 1 1

Tabela 17: Matriz experimental do planejamento fatorial com os níveis não-codificados dos fatores de cada corrida,

apresentados em mg de proteína por g de bagaço seco. As respostas são representadas em g/L de açúcares liberados

(celobiose, glicose e xilose), após 48 h de hidrólise.

Corrida Replicata Base EX EXP Glicose Xilose Celobiose

1 1 4,0 0,0 0,0 16,06 0,76 0,67

2 1 8,0 0,0 0,0 19,90 1,10 nd

3 1 4,0 1,0 0,0 17,53 0,84 0,79

4 1 8,0 1,0 0,0 21,26 1,15 0,93

5 1 4,0 0,0 1,0 17,58 0,85 0,82

6 1 8,0 0,0 1,0 23,07 1,20 nd

7 1 4,0 1,0 1,0 17,50 0,86 0,81

8 1 8,0 1,0 1,0 20,24 1,11 0,80

9 1 6,0 0,5 0,5 21,26 1,05 1,04

10 2 4,0 0,0 0,0 17,56 0,80 0,79

11 2 8,0 0,0 0,0 22,02 1,19 0,98

12 2 4,0 1,0 0,0 16,51 0,81 0,71

13 2 8,0 1,0 0,0 20,54 1,21 nd

14 2 4,0 0,0 1,0 17,03 0,82 0,76

75

Corrida Replicata Base EX EXP Glicose Xilose Celobiose

15 2 8,0 0,0 1,0 21,43 1,17 0,92

16 2 4,0 1,0 1,0 17,28 0,85 0,78

17 2 8,0 1,0 1,0 20,63 1,13 nd

18 2 6,0 0,5 0,5 20,45 1,06 0,91

A um intervalo de confiança de 95%, o coquetel base é significativo para a resposta

analisada (liberação de glicose), enquanto que os fatores EX e EXP não apresentam efeitos

significativos, uma vez que o p-valor do efeito principal e das interações envolvendo esses fatores

são maiores que 0,05 (Tabela 18). Analisando os efeitos não significativos através do gráfico

normal, chega-se à mesma conclusão de quando a análise é feita levando em consideração o

intervalo de confiança de 95% (Figura 35). Assim, os efeitos principais e de interações que se

localizam na reta de inclinação 1 (Y=X) não são significativos, restando apenas o fator coquetel

base com influência significativa na liberação de glicose durante a hidrólise.

Tabela 18: Coeficientes do modelo matemático, erro puro, t-student e p-valor para os valores codificados dos

fatores: coquetel base (BASE), endoxilanase (EX) e expansina (EXP).

Efeito Erro puro t(9) p-valor

Mean/Interc. 19,32 0,19 99,56 0,000

(1)Base 4,01 0,41 9,73 0,000

(2)EX -0,40 0,41 -0,96 0,361

(3)EXP 0,43 0,41 1,03 0,329

1 by 2 -0,54 0,41 -1,31 0,221

1 by 3 -0,01 0,41 -0,03 0,978

2 by 3 -0,47 0,41 -1,14 0,282

76

Figura 35: Gráfico normal de probabilidade. Análise feita com erro puro e glicose (g/L) como variável dependente.

Segundo Suwannarangsee et al., (2012), a liberação de glicose no processo de hidrólise de

palha de arroz, utilizando expansina e celulases (Celluclast e extrato fúngico de Aspergillus), é

proporcional à quantidade de expansina presente. Porém, isso é válido apenas para baixas

concentrações desta proteína (≤ 0,5 mg/g de substrato), uma vez que a ligação susbstrato-EXP

pode dificultar o acesso das enzimas às fibras de celulose.

Contraditoriamente à resposta obtida pelo planejamento fatorial, os fatores EX e EXP

apresentaram efeitos significativos quando estudados no planejamento de mistura, uma vez que

houve acréscimos na liberação de glicose quando se aumentou suas proporções na mistura. Uma

possível causa dessas importantes proteínas para a reação enzimática não terem apresentado

significância no planejamento fatorial pode ser a fixação dos níveis. Desse modo, o fator pode

não ser significativo em uma determinada faixa, ocorrendo o oposto quando se encontra a região

onde o seu efeito implica em alterações na resposta estudada. Como o planejamento de misturas

variou a concentração de enzimas acessórias de 0 a 6 mg/g, foram realizados novos ensaios com

esta concentração de enzimas.

77

Neste trabalho, para todas as reações, foram adicionadas concentrações fixas do coquetel

base (80% de T. reesei, 10% de EG, 10% de BGL), ora em 4 mg de proteína por grama de

bagaço, ora em 8 mg de proteína por grama de bagaço, enquanto que as concentrações de EX e

EXP foram variadas em 3 ou 6 mg de proteína por grama de bagaço. Nestes ensaios, a parcela do

fator T. reesei do coquetel base foi substituída pela fração de ressuspensão da precipitação do

extrato fúngico a 60% de sulfato de amônio (concentração proteica de 10 mg/mL). Isso foi

possível uma vez que comprovamos que as conversões do bagaço de cana hidrotérmico (BH 190)

são semelhantes tanto quando se emprega a amostra de alimentação da diafiltração (fração de

ressuspensão da precipitação do extrato fúngico a 60% S.A.) ou os retentados da diafiltração (T.

reesei A). As Tabelas 19 e 20 mostram as matrizes experimentais e as respostas obtidas para o

estudo dos níveis de EX e EXP a 4 e a 8 mg de proteína do coquetel base por grama de bagaço

seco, respectivamente.

Tabela 19: Matriz experimental para as corridas contendo 4 mg de proteína do coquetel base por grama de bagaço,

variando apenas as concentrações de endoxilanase e expansina (mg de proteína/g de bagaço seco). Resposta

analisada em glicose (g/L) liberada após 48 h de hidrólise.

Corrida Replicata EX EXP Glicose (g/L)

1a 1 3,0 0,0 17,46

2a 1 6,0 0,0 17,44

3a 1 0,0 3,0 17,48

4a 1 0,0 6,0 17,57

1b 2 3,0 0,0 17,57

2b 2 6,0 0,0 16,94

3b 2 0,0 3,0 12,24

4b 2 0,0 6,0 18,11

Tabela 20: Matriz experimental para as corridas contendo 8 mg de proteína do coquetel base por grama de bagaço

seco, variando apenas as concentrações de endoxilanase e expansina (mg de proteína/g de bagaço seco). Resposta

analisada em glicose (g/L) liberada após 48 h de hidrólise.

Corrida Replicata EX EXP Glicose (g/L)

5a 1 3,0 0,0 20,73

6a 1 6,0 0,0 20,53

7a 1 0,0 3,0 20,82

8a 1 0,0 6,0 21,70

5b 2 3,0 0,0 21,21

6b 2 6,0 0,0 21,00

7b 2 0,0 3,0 21,78

8b 2 0,0 6,0 22,73

78

Comparando-se estatisticamente as quantidades de glicose obtidas apenas com o coquetel

base, ora fixado em 4 ora em 8 mg de proteína/g bagaço seco na reação, e após suplementação

deste com endoxilanase ou expansina, conclui-se que esses valores não apresentaram diferenças

significativas (Tabelas 21 e 22).

Tabela 21: Quantidade média de glicose obtida após 48 h de hidrólise do bagaço hidrotérmico (BH 190) sob ação

única do coquetel base e do coquetel base suplementado de endoxilanase (EX) ou expansina (EXP). Os valores entre

parênteses representam a quantidade em mg de proteína por grama de bagaço seco com que a reação foi carregada.

Letras iguais indicam que a diferença entre as médias não é significativa pelo teste de Tukey a 0,05% de

probabilidade.

Média D.P.

BASE (4) 16,81a 1,06

EX (3) 17,52 a 0,08

EX (6) 17,19 a 0,35

EXP (3) 14,86 a 3,71

EXP (6) 17,84 a 0,38

Tabela 22: Quantidade média de glicose obtida após 48 h de hidrólise do bagaço hidrotérmico (BH 190) sob ação

única do coquetel base e do coquetel base suplementado de endoxilanase (EX) ou expansina (EXP). Os valores entre

parênteses representam a quantidade em mg de proteína por grama de bagaço seco com que a reação foi carregada.

Letras iguais indicam que a diferença entre as médias não é significativa pelo teste de Tukey a 0,05% de

probabilidade.

Média D.P.

BASE (8) 20,96 a 1,50

EX (3) 20,97 a 0,34

EX (6) 20,77 a 0,33

EXP (3) 21,30 a 0,68

EXP (6) 22,22 a 0,73

Assim, a adição de até 6 mg de proteína (EX ou EXP) por grama de bagaço seco, na

reação de hidrólise contendo o coquetel base, não causa efeito na conversão de celulose. Isso

pode ser explicado, em parte, devido ao fato do coquetel base já estar a uma concentração e

proporção de enzimas ótima, mesmo quando a reação é carregada com 4 mg dessa mistura por

grama de bagaço seco, e assim não necessitar de suplementação. Outra justificativa pode ser

atrelada ao não sinergismo entre as proteínas acessórias e o coquetel base. Entretanto, isso

contradiz a análise (com fatores codificados) obtida pelo planejamento de mistura. Nesta análise,

há sinergismo entre a fração de T. reesei e cada uma das proteínas envolvidas (fatores), uma vez

que os valores dos efeitos de interação dois a dois, envolvendo o fator T. reesei, foram

estatisticamente significativos e positivos. Sendo 80% do coquetel base composto pela fração T.

79

reesei, era de se esperar que o mesmo também apresentasse sinergismo com as proteínas

acessórias estudadas.

Nos experimentos de mistura, sempre estavam presentes ao menos três classes

enzimáticas celulolíticas: T. reesei, EG e BGL. Desta forma, quando uma parte de uma dessas

classes era substituída por outra proteína (EX, ARF, AXE e/ou EXP), a liberação de glicose

permanecia constante ou a variação desta liberação era pequena quando comparada à liberação

proveniente da hidrólise contendo apenas essas três classes, pois ainda estavam presentes os três

fatores mais importantes para a reação. Assim, as proteínas acessórias pareciam causar efeito

positivo na liberação de glicose, quando, na verdade, o açúcar obtido ainda era consequência da

presença dos fatores T. reesei, EG e BGL. Isso pode justificar os efeitos de interação positivos e a

interpretação de sinergismo entre a fração de T. reesei e os demais fatores.

Além disso, o planejamento de mistura mostrou significância de todas as enzimas como

efeito principal. Analisando a Tabela 11, pode-se concluir que todos os ensaios com pelo menos

50% de T. reesei já apresentaram concentração alta de glicose. No planejamento de mistura, a

soma de todos os fatores deve totalizar 100%. Assim, quando a proporção de T. reesei variava de

80% (nível máximo) para 50%, outro fator era adicionado para completar a carga da reação.

Entretanto, a concentração de glicose no meio reacional não diminuía proporcionalmente. Isso

pode ter acontecido devido ao fato de 50% de T. reesei já ser uma quantidade suficiente de

enzima para a hidrólise da biomassa. Entretanto, o planejamento de mistura interpretou a adição

dos demais fatores como responsável por parte da concentração de glicose no meio e,

consequentemente, os determinou significativos.

Nos planejamentos fatoriais, como todos os fatores são independentes, o efeito principal

de cada fator em relação à sua significância é mais confiável. Isso se deve ao fato da variação de

um deles não estar atrelada à variação de outro. Assim, podemos concluir que o coquetel

otimizado não leva em sua composição os fatores endoxilanase (EX) e expansina (EXP), que,

segundo o planejamento fatorial, não são proteínas significativas para a liberação de glicose.

A fração de T. reesei sozinha é capaz de converter até 58,8% ± 0,71 da celulose presente

na reação. Com a adição da EG e BGL, nas proporções encontradas pelo planejamento de

mistura, a conversão é de 68,36% ± 5,57. Essa melhoria em relação ao extrato fúngico pode ser

80

justificada pelo fato das celulases mais ativas não serem expressas a um nível suficiente para uma

alta e efetiva conversão de celulose durante a hidrólise, ou esse complexo enzimático secretado

pode não estar bem balanceado em relação às enzimas individuais (GUSAKOV et al., 2007). Para

entender a contribuição de cada proteína adicional no aumento dessa conversão, foram feitos

ensaios de sinergismo entre cada uma destas e a fração de T. reesei (fração de ressuspensão da

precipitação do extrato fúngico a 60% S.A). Neste caso, o sinergismo foi avaliado em reações de

hidrólises, as quais eram carregadas, com a mesma massa proteica, ou com T. reesei ou com a

proteína a ser avaliada a interação. Simultaneamente, a terceira reação, contendo T. reseei e a

proteína de interesse, era carregada com a soma das cargas adicionadas nas hidrólises individuais.

A matriz experimental e as respostas geradas para esse estudo em relação ao bagaço BH 190 é

apresentada na Tabela 23.

Tabela 23: Matriz experimental dos ensaios de sinergismo. Os componentes são apresentados em mg de proteína por

g de bagaço seco. A resposta analisada é a concentração de glicose liberada, em g/L, após 48 h de hidrólise do

bagaço hidrotérmico 190.

Corrida Replicata T. reesei EG BGL EX EXP Glicose

(g/L)

1 1 4,0 4,0 0,0 0,0 0,0 12,85

2 1 4,0 0,0 4,0 0,0 0,0 19,22

3 1 4,0 0,0 0,0 4,0 0,0 13,60

4 1 4,0 0,0 0,0 0,0 4,0 13,54

5 1 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 12,08

6 1 0,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,64

7 1 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 0,50

8 1 0,0 0,0 0,0 4,0 0,0 nd

9 1 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 nd

10 2 4,0 4,0 0,0 0,0 0,0 14,41

11 2 4,0 0,0 4,0 0,0 0,0 19,16

12 2 4,0 0,0 0,0 4,0 0,0 13,23

13 2 4,0 0,0 0,0 0,0 4,0 13,95

14 2 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 12,93

15 2 0,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,61

16 2 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 0,48

27 2 0,0 0,0 0,0 4,0 0,0 nd

18 2 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 nd

Quando há sinergismo entre as proteínas, a resposta obtida (glicose após 48 h de reação)

na reação onde ambas estavam presentes é maior do que a soma da glicose liberada nas reações

81

pela ação individual de cada uma. Essa soma da glicose liberada pela ação das proteínas

individuais pode ser chamada de concentração teórica de glicose. Os cálculos de sinergismo,

apresentados na Tabela 24, apontam uma baixa contribuição das enzimas para a liberação de

glicose ao suplementar o coquetel T. reesei. O fato de essa fração fúngica apresentar diversas

atividades enzimáticas pode ser uma causa para o fraco sinergismo entre a mesma e as demais

enzimas estudadas nesse trabalho. Dessa forma, as atividades enzimáticas necessárias para a

hidrólise do bagaço de cana hidrotérmico 190 já estão presentes, em grande parte, no coquetel

fúngico. Através da especificidade enzima-substrato, a Tabela 25 sugere, dentre as enzimas

estudadas neste projeto, a presença de endoglucanase, β-glicosidase, endoxilanases e

arabinofuranosidase no coquetel de T. reesei. Apesar da precipitação com sulfato de amônio

concentrar proteínas na faixa de 40 a 70 kDa, o fungo T. reesei possui nessa faixa de massa

molecular, além das celobiohidrolases I e II, endoglucanase (GH 7 com 48,2 kDa) e β-

glicosidases (GH 1 com 52,2 kDa) (STÅHLBERG et al., 1993). Ou seja, essa fração de T. reesei

já apresenta parte das atividades presentes nas enzimas isoladas, de forma que a adição destas não

implica em grande melhoria para a conversão da biomassa. Além disso, os micro-organismos

produzem uma variedade de enzimas com atividades similares (formas isoméricas), a fim de

maximizar a ação contra um dado substrato (DUFF; MURRAYH, 1996). Neste projeto, apenas

uma forma isomérica de cada enzima foi estudada, o que pode ter limitado a verificação de

sinergismo entre essas e a fração de T. reesei.

Tabela 24: Sinergismo entre a fração de T. reesei e as proteínas EG, BGL, EX e EXP durante hidrólise do bagaço de

cana hidrotérmico 190, a 50ºC e pH 4,5. Experimento conduzido em duplicata.

Enzimas

Concentração média

de glicose (g/L) após

48 h

Concentração teórica


48 h

Ksinergismo

T. reesei 12,50 ± 0,602 - -

EG 0,63 ± 0,019 - -

BGL 0,49 ± 0,015 - -

EX nd - -

EXP nd - -

T. reesei + EG 13,63 ± 1,103 13,13 1,04

T. reesei + BGL 19,19 ± 0,045 12,99 1,48

T. reesei + EX 13,41 ± 0,267 12,50 1,07

T. reesei + EXP 13,74 ± 0,289 12,50 1,10

82

Tabela 25: Atividades enzimáticas da fração T. reesei (ressuspensão do precipitado do coquetel fúngico com 60% de

S.A.).

Substratos Atividade volumétrica

(UI/mL)

Atividade específica

(UI/mg)

p-NPC 4 mM 5,99 0,60

p-NPG 1 mM 1,78 0,18

p-NPX 1 mM 0,18 0,02

Beech wood Xilana 0,5% 968 96,80

CMC 0,5% 37,57 3,76

1,4-β-D-manana 0,5% 9,96 1,00

Lichenana 0,5% 27,81 2,78

Wheat arabinoxilan 0,5% 30,76 3,08

A otimização de coquetéis está estritamente relacionada às enzimas empregadas, à

biomassa e ao pré-tratamento da mesma (SUWANNARANGSEE et al., 2012). Assim, com a

mesma gama de enzimas, foi analisado o sinergismo entre elas ao atuarem sobre bagaços de

cana-de-açúcar pré-tratados por explosão a vapor (BEX) e hidrotermicamente a 160 ºC (BH 160).

Estes materiais têm composição diferente do bagaço empregado nos estudos anteriores (BH 190).

As matrizes experimentais e as respostas geradas desse estudo estão apresentadas nas Tabelas 26

e 28. Inesperadamente, não houve sinergismo entre a fração T. reesei e as hemicelulases para a

biomassa BEX, embora esse bagaço apresente 21,1% de hemicelulose, contra 3,13% presente no

bagaço hidrotérmico 190 (Tabela 27). A falta de sinergismo entre a fração T. reesei e as

hemicelulases também pode ser notado para a reação envolvendo o BH 160 (Tabela 29).

Entretanto, o T. reesei apresenta 96,8 UI/mg de atividade específica xilanásica, o que deve ser

suficiente para as reações de hidrólise, independentemente da biomassa a ser hidrolisada. HU et

al. (2011), ao estudarem a interação entre uma preparação de xilanase e celulases (Celluclast),

chegaram à conclusão de que quanto menor a proporção de celulases na mistura,

consequentemente maior a de xilanase e, com isso, maior o efeito sinérgico entre elas, resultando

em um aumento da celulose e xilana hidrolisadas. Quando diferentes cargas de xilanase eram

adicionadas a uma quantidade fixa de celulase, requerida para hidrolisar 70% da celulose, o grau

de sinergismo foi aproximadamente 1 (HU et al., 2011). Da mesma forma, a carga proteica da

fração T. reesei no sistema reacional pode ter influenciado o seu grau de sinergismo com as

demais proteínas.

83

Segundo GOURLAY et al. (2013), as soleninas, proteínas de rompimento assim como as

expansinas, não apresentaram sinergismo com enzimas hidrolíticas purificadas (exoglucanase

Cel7A, endoglucanase Cel5A, xilanase GH10 e GH11) quando a resposta avaliada foi a glicose

liberada após incubação das proteínas com o substrato (palha de milho pré-tratada à vapor).

Entretanto, as soleninas exibiram forte sinergismo com as xilanases (GH10 e GH11), quando a

resposta considerada foi a concentração de xilose liberada. O fato da cadeia de hemicelulose ser

menos ordenada que a de celulose pode ter facilitado a ação da solenina sobre àquela fibra.

Assim, essa maior acessibilidade das xilanases à fração hemicelulolítica, promovida pela

solenina, é fundamental para a influência positiva desta proteína à mistura enzimática, uma vez

que a hemicelulose limita o acesso das celulases à cadeia de celulose (GOURLAY et al., 2013).

No trabalho apresentado aqui, a expansina e a fração de T. reesei, que contém xilanase (Tabela

25), não apresentaram sinergismo, independente da resposta avaliada ser a concentração de

glicose ou xilose liberada (dados de sinergismo não apresentados quando a resposta foi a

concentração de xilose liberada). Esta incoerência com a literatura pode estar relacionada ao fato

de que as biomassas utilizadas (bagaço de cana-de-açúcar pré-tratados) apresentaram composição

máxima de hemicelulose de 21%, dispensando a necessidade das expansinas.



bagaço explodido à vapor.


(g/L)

1 1 4,0 4,0 0,0 0,0 0,0 9,46

2 1 4,0 0,0 4,0 0,0 0,0 12,18

3 1 4,0 0,0 0,0 4,0 0,0 2,81

4 1 4,0 0,0 0,0 0,0 4,0 9,67

5 1 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 9,18

6 1 0,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,17

7 1 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 0,81

8 1 0,0 0,0 0,0 4,0 0,0 0,00

9 1 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 0,00

10 2 4,0 4,0 0,0 0,0 0,0 9,56

11 2 4,0 0,0 4,0 0,0 0,0 11,78

12 2 4,0 0,0 0,0 4,0 0,0 9,59

13 2 4,0 0,0 0,0 0,0 4,0 9,87

14 2 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 9,28

84


(g/L)

15 2 0,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,18

16 2 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 0,84

27 2 0,0 0,0 0,0 4,0 0,0 0,08

18 2 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 0,10

Tabela 27: Sinergismo entre a fração de T. reesei e as proteínas EG, BGL, EX e EXP durante hidrólise do bagaço de

cana explodido à vapor, a 50ºC e pH 4,5. Experimento conduzido em duplicata.

Enzimas



48 h



48 h

Ksinergismo

T. reesei 9,23 ± 0,071 - -

EG 0,18 ± 0,007 - -

BGL 0,83 ± 0,021 - -

EX 0,04 ± 0,057 - -

EXP 0,05 ± 0,071 - -

T. reesei + EG 9,51 ± 0,071 9,40 1,01

T. reesei + BGL 11,98 ± 0,283 10,05 1,19

T. reesei + EX 9,59 9,27 1,03

T. reesei + EXP 9,77 ± 0,141 9,28 1,05



bagaço hidrotérmico 160.

Corrida Replicata T. reesei BGL EX EXP Glicose

(g/L)

1 1 4,0 4,0 0,0 0,0 12,36

2 1 4,0 0,0 4,0 0,0 9,87

3 1 4,0 0,0 0,0 4,0 10,95

4 1 4,0 0,0 0,0 0,0 9,78

5 1 0,0 4,0 0,0 0,0 0,95

6 1 0,0 0,0 4,0 0,0 0,21

7 1 0,0 0,0 0,0 4,0 0,26

8 2 4,0 4,0 0,0 0,0 12,54

9 2 4,0 0,0 4,0 0,0 10,39

10 2 4,0 0,0 0,0 4,0 10,35

11 2 4,0 0,0 0,0 0,0 10,15

12 2 0,0 4,0 0,0 0,0 0,27

13 2 0,0 0,0 4,0 0,0 0,28

14 2 0,0 0,0 0,0 4,0 0,24

85

Tabela 29: Sinergismo entre a fração de T. reesei e as proteínas BGL, EX e EXP durante hidrólise do bagaço de

cana hidrotérmico 160, a 50ºC e pH 4,5. Experimento conduzido em duplicata.

Enzimas



48 h



48 h

Ksinergismo

T. reesei 9,97 ± 0,266 - -

BGL 0,61 ± 0,480 - -

EX 0,25 ± 0,049 - -

EXP 0,25 ± 0,010 - -

T. reesei + BGL 12,45 ± 0,124 10,57 1,18

T. reesei + EX 10,13 ± 0,365 10,21 0,99

T. reesei + EXP 10,65 ± 0,419 10,22 1,04

86

5 CONCLUSÃO

A produção e purificação das proteínas endoglucanase, xilanase e expansina a partir de

expressão heteróloga por Escherichia coli foram realizadas com sucesso, e as frações obtidas

apresentam pureza adequada para os ensaios de montagem dos coquetéis enzimáticos. A enzima

celobiohidrolase, presente no coquetel fúngico de Trichoderma reesei, foi concentrada através da

precipitação com sulfato de amônio. Entretanto, outras atividades enzimáticas que favorecem a

sacarificação do bagaço também permaneceram nessa fração, que foi utilizada como um dos

fatores para os planejamentos experimentais na montagem dos coquetéis otimizados.

O protocolo de microensaio de hidrólise foi validado e pode ser usado para a avaliação

quantitativa de sinergismo e ganhos em conversões enzimáticas visando à suplementação de

coquetéis fúngicos ou a montagem de misturas enzimáticas.

Através do planejamento de mistura envolvendo as sete frações proteicas estudadas neste

trabalho (T. reesei, EG, BGL, EX, ARF, AXE, EXP), a composição de coquetel mínima

necessária para a hidrólise do bagaço de cana pré-tratado é a seguinte: 80% de T. reesei, 10% de

EG e 10% de BGL. Embora a análise do planejamento de mistura tenha identificado todos os

efeitos principais como significativos, o planejamento fatorial mostra que o coquetel otimizado

não necessita ser suplementado com endoxilanase (EX) ou expansina (EXP). Assim, o

planejamento fatorial, por tratar os fatores de forma independente, tornou a identificação de

fatores significativos mais confiável para este caso.

A composição otimizada apresentou uma conversão de celulose elevada e próxima da

obtida pela ação do coquetel comercial Cellic CTec H2, e maior que a obtida pelo coquetel

Celluclast. Entretanto, o sinergismo apresentado pela análise estatística do planejamento de

mistura não foi confirmado através de experimentos. Essa contradição sugere que os efeitos

positivos referentes às interações do T. reesei com os demais fatores do modelo matemático não

implica, obrigatoriamente, em uma relação sinérgica entre eles. A falta de sinergismo entre as

proteínas pode estar relacionada com a composição da biomassa e ao fato da fração T. reesei já

conter as atividades enzimáticas estudadas nessas reações, o que a torna um mistura enzimática

bastante completa.

87

Assim, esse trabalho, ao apresentar conhecimento sobre obtenção e purificação de

importantes proteínas para a sacarificação de biomassa lignocelulósica e, aliando isto aos

planejamentos experimentais e análises descritas, constitui uma importante ferramenta para a

obtenção de coquetéis otimizados para a hidrólise de diferentes substratos e com diversas

aplicações.

88

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94

ANEXOS

ANEXO A - Massas de sal a ser adicionada à solução para atingir uma determinada

porcentagem de saturação de sulfato de amônio, partindo de diferentes porcentagens

iniciais.

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