Mecanotransdução - Seminário
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MECANOTRANSDUÇÃO
Universidade Federal do Rio de JaneiroInstituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Pólo Avançado de Xerém
Bruno Rech; Filipe Esteves; João Vitor Belizario; Marcus Aguiar; Tadeu Diniz
PROFESSORA: LEANDRA BAPTISTA
MECANOTRANSDUÇÃO: INTRODUÇÃO
Mecanotransdução:
• Forças mecânicas influenciam o crescimento e aforma de praticamente todos os tecidos e órgãos donosso corpo.
• Sinais mecânicos transduzidos em alterações nabioquímica celular e na expressão gênica.
Receptores de superfície:
• Integrinas e Caderinas
• Permitem a adesão do citoesqueleto à MatrizExtracelular (ECM)
• A partir dessas proteínas que um estímulomecânico aplicado à superfície da membrana serátransmitido para o interior da célula.
MECANOTRANSDUÇÃO: RECEPTORES DE SINAIS
Integrinas:
• Glicoproteínas transmembrana heterodiméricasde adesão celular compostas por subunidades α eβ.
• Estão presentes na constituição dohemidesmossomo, de modo que esta, une aplaca de ancoragem com a fibrinina (proteínapresente na lâmina basal).
MECANOTRANSDUÇÃO: INTEGRINAS E CADERINAS
Caderinas:
• Principais moléculas de adesão celular;
• Moléculas de adesão dependentes de cálcio quepermitem a ligação entre células vizinhas;
• Glicoproteínas transmembrana;
• Responsáveis pela adesão célula-célula nostecidos dos vertebrados.
MECANOTRANSDUÇÃO: INTEGRINAS E CADERINAS
MECANOTRANSDUÇÃO: INTEGRINAS E CADERINAS
Matriz Extracelular
MECANOTRANSDUÇÃO: CASCATA DE SINALIZAÇÕES
MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO
MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO
MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO
MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO
Tecido Ósseo
Osteócitos :manutenção da integridade da matriz óssea.
Osteoblastos: Sintetizam a parte orgânica da matriz óssea e origina os osteócitos.
Osteoclastos: participam dos processos de absorção e remodelação do tecido ósseo
ARTIGO: DISCUSSÃO
Medula Óssea:
• A Medula óssea preenche a cavidade interna deossos longos e é responsável pela produção dehemácias,leucócitos e plaquetas além de possuirreserva de células tronco.
ARTIGO: DISCUSSÃO – MEDULA ÓSSEA
ARTIGO: MECANOTRANSDUÇÃO MEDIADA POR FAK
ARTIGO: INTRODUÇÃO
Introdução:
• Células – tronco e sua capacidade dediferenciação;
• Pouca atenção aos estímulos físicos que as células-tronco sofrem ;
•Efeitos dos estímulos nas decisões dos destinosdestas células;
•Os mecanosensores;
•As questões dessa pesquisa estão voltadas para omicroambiente da cavidade da medula óssea e comoas células-tronco são recrutadas de lá sob efeito deum estímulo mecânico.
•As células-tronco da medula óssea permanecemquiescentes até que ocorra uma lesão ou umadoença afete o organismo. Dessa forma, através demúltiplas vias de sinalização elas são recrutadas prao local da lesão.
ARTIGO: INTRODUÇÃO
Materiais e Métodos: Procedimento da cirurgia e design do implante:
• Camundongos mantidos em um ambiente com luz etemperatura controladas , alimentados e hidratados;
• Camundongos anestesiados com injeçãointraperitoneal de Ketamina e Xylazina;
• Incisão na tíbia Antero-proximal mantendo asuperfície perióstea preservada;
• Dois buracos foram feitos em ambos córticos com umaferramenta de alta velocidade.
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCEDIMENTO DA CIRURGIA E DESIGN DO IMPLANTE
• Dispositivo de micromoção posicionado e fixado com dois Retopinos de Titânio;
• Buraco central do dispositivo como guia para a inserção do implante ;
• Um “cap” foi amarrado no dispositivo para ter certeza da posição e proteger do deslocamento acidental por atividade do camundongo;
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCEDIMENTO DA CIRURGIA E DESIGN DO IMPLANTE
(A) Esquema do dispositivo do implante inserido. Uma placa
subcutânea de fixação seguradas por dois parafusos.
(B) O dispositivo de micromoção in vivo na tíbia de murino.
(C) Gráfico do trandutor diferencial linear variável (LVDT) querelaciona o tempo com o movimento em µm e a força em N
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCEDIMENTO DA CIRURGIA E DESIGN DO IMPLANTE
Micromoção:
• Gerada por um sistema ativado a mão conectado àcoluna central da placa óssea;
• Placa óssea constituída de um LVDT;
• Uma extremidade conecta com a célula carga e aoutra com uma ponta de 1 mm que passa pelo capda placa óssea;
• Produção da de micromoção axial de frequência 1.0Hz por 60 s em um intervalo de 24h por 3, 7 e 14dias;
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS - MICROMOÇÃO
• Camundongos dissecados, epiderme removida efixada em formaldeído 4% overnight;
• Descalcificação introduzindo as amostras emsolução 19% EDTA-2Na por duas semanas a 4°C;
• Dispositivo do implante gentilmente puxado doosso;
• Desidratação por etanol para parafinizar;
Processamento do tecido, histologia e imunohistoquímica:
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCESSAMENTO DO TECIDO, HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUÍMICA
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCESSAMENTO DO TECIDO, HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUÍMICA
• Secções longitudinais de todas as amostrascoletadas em lâminas de histologia;
• Imunohistoquímica para PCNA (proliferating cellnuclear antigen ) foi feita em lâminas adjacentesusando DAB como substrato;
• Hibridização foi feita usando sondas marcadascom digoxigenina de forma complementar aoscDNAs para sox9 e col1;
• Tecidos corados com corante acídico, vermelhode picrosirius;
• Corante discrimina moléculas de colágenomuito empacotadas das alinhadas;
• Sob luz polarizada as moléculas de colágenofibrilar apresentam cores de comprimentos deonda maior para alinhadas e menor paramenos organizadas;
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCESSAMENTO DO TECIDO, HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUÍMICA
Inativação da FAK:
• Camundongo nocaute da FAK gerado pelocruzamento do Crc com um carregando oalelo floxed fak;
• O genótipo CollCre +/+ ; FAK fl/fl foiconfirmado por PCR;
• Nocaute condicional definido pela ausênciado segundo domínio da FAK;
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – INATIVAÇÃO DA FAK
Medidas histomorfométricas:
• Tibias coletadas no dia 7 pós-cirurgia paradeterminar o volume do novo osso;
• Tecidos corados com azul de anilina após o“emblocamento”;
• A região do implante nas condiçõesestacionária controle, estimulada ; estacionáriaFAK mutada; estimulada foi representada porcortes de 8 µm de espessura;
ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – MEDIDAS HISTOMORFOMÉTRICAS
ARTIGO: RESULTADOS
• 72h do início dos estímulos. Células da medulaóssea adjacentes ao implante deslocadoexibiram um aumento sutil de proteoglicanosna MEC;
• 7º dia de estímulos mecânicos , células damedula óssea sujeitas a estímulos mecânicosdifereciaram em osteoblastos;
• As células não estimuladas reteram umaaparência fibroblastóide;
• Cortes histológicos do dia 3 e dia 7 mostrandoos efeitos dos estímulos e a falta deles.
ARTIGO: RESULTADOS
• 14 dias de estímulos mecânicos as células damedula óssea estimuladas diferenciaram emosteócitos;
• Encoberta em um corpo maduro de matrizóssea interlaçadas com vasos sanguíneos;
• Células de um ambiente não estimuladodiferenciaram em osteoblastos com um atrasoconsiderável;
ARTIGO: RESULTADOS
• Cortes histológicos do dia 14 de estímulos (esquerda) pelo implante (im) e estacionário (direita).
ARTIGO: RESULTADOS
• Hipótese inicial: osteogênese induzida porestímulos mecânicos é a proliferação celularaumentada na medula óssea;
• Análise de PCNA não confirmaram a hipótese;
• Número de células PCNA-positivas foram quaseequivalente na hora 72 do início dos estímulos.
ARTIGO: RESULTADOS
• Fatores de transcrição Sox9 e Runx2responsáveis pelo destino osteogênico dascélulas.
• Sox9 expresso em todas as célulasosteocondroprogenitoras;
• Runx2 “up” regulado em células que iniciaram adiferenciação em osteoblastos.
ARTIGO: RESULTADOS
• Sox9 foi largamente expresso nas cavidades damedula óssea estacionárias e estimuladas;
• Presença de células osteocondroprogenitoras emambos os sítios;
• Conjunto de células sox9-positivas expressaramrunx2;
• Runx2 expresso por poucas células adjacentes aoimplante estacionário;
• Runx2 expresso por células ao longo da cavidade damedula óssea estimulada;
ARTIGO: RESULTADOS
• Células localizadas distantes do estímulo doimplante expressaram runx2;
• Capacidade de sentir o estímulo a distância;
• Matriz extracelular deformada pelodeslocamento do implante;
• Maior deformação em torno das fendascircunferenciais e na base do implante
ARTIGO: RESULTADOS
• Respostas moleculares e celulares . (A,B) Nenhumadiferença na proliferação das células. Ambienteestimulado (C) e estacionário (D) expressam sox9 portoda a cavidade.
ARTIGO: RESULTADOS
(E) Runx2 é fortemente expresso na região do periimplante enquanto que (F) estímulos físicos induzem arestrição dos transcritos de runx2 às células adjacentesao implante.
ARTIGO: RESULTADOS
• Um estímulo breve é suficiente para induzir a reorganização da MEC da cavidade da medula óssea;
• Em resposta ao deslocamento do implante as células da medula óssea up regularam o runx2;
• Em poucos dias diferenciaram em osteoblastos
ARTIGO: RESULTADOS
• Feito um teste se o sinal da integrina foiessencial para a mecanotransdução das célulasda cavidade da medula óssea;
• Não houve deleção de integrina;
• Inativação da tirosina kinase (FAK) involvidana transdução do sinal de sítios ricos emintegrina
ARTIGO: RESULTADOS
• Camundongos mutantes de FAK formaram ossoem torno do implante tanto quanto oscamundongos controle;
• Foram submetidos ao protocolo do deslocamentodo implante;
• Camundongos controle tiveram respostaosteogênica alta;
• Camundongos mutados de FAK não tiveramnenhuma resposta osteogênica.
ARTIGO: RESULTADOS
• 93 % menos matriz de osso depositadas emcomparação com o controle;
• Deposição evidente na superfície periósteadistante do estímulo mecânico;
• Nenhuma evidência de matriz mineralizada nacavidade da medula óssea;
ARTIGO: RESULTADOS
• Marcadores de diferenciação de osteoblasto como colágeno I e osteocalcina expressos em mutantes FAK;
• Deleção de FAK não preveniu a diferenciação em osteoblasto;
• Bloqueio da sensação do estímulo das células da medula óssea;
• Repressão rápida da deposição de matriz mineralizada em osteoblastos;
ARTIGO: RESULTADOS
A
Inativação da FAK bloqueiaespecíficamente a osteogênesemecânicamente induzida in vivo.
(A) Marcas da expressão de Col1(colágeno I) nas células peri-impalnte.
(B) Incluindo as justaposicionadasao implante (im).
ARTIGO: RESULTADOS
C) Animais controle em 7 dias deestímulo resultaram formação de ossoabundante.
(D) Matriz óssea recém depositadacorada com azul de anilina interlaçadapor vasos sanguíneos
ARTIGO: RESULTADOS
(E) Estímulos mecânicos falharam em induzir a osteogênese nocamundongos FAK mutados. (F) O azul de Anilina mostra a completaausência de tecido mineralizado no sítio peri-implante. (G) Crescimentovascular interno não impediu a deleção da FAK. (H,I,J,K) Mutantes de FAKexpressam sox9 , runx2, col I e osteocalcina indicando que a perda da FAKnão acaba com o recrutamento de células osteocondroprogenitoras pra osítio peri-implante.
ARTIGO: RESULTADOS
(L) Ensaio quantitativo histomorfométrico da matriz recém depositadanas cavidades da medula óssea não estimuladado controle (wt) (branco),na estimulada (cinza claro) , medula óssea FAK mutada estacionária(cinza) e estimulada (preto)
ARTIGO: RESULTADOS
Discussão:
• Foi investigado a base genética paramecanotransdução usando como modelo acavidade da medula óssea por conter altasquantidades de células tronco.
• Forças físicas ativaram a expressão de doisfatores de transcrição(sox9 e runx2)requeridas para tornar células tronco em umalinhagem esquelética
ARTIGO: DISCUSSÃO
• Desativação da FAK(kinase de adesão focal)
– A resposta a estímulos físicos foi eliminada devido a falta de sinalização de integrinas com o ambiente intracelular .
• A falta da mecanotransdução teve como conseqüência:
– Falta de up-regulagem de genes esqueletogênicos;
– Fíbrilas de colágenos permaneciam; desorganizadas;
– Resposta osteogênica induzida mecanicamente foi perdida;
ARTIGO: DISCUSSÃO
• Micromoção:
O ambiente mecânico tem um papel críticono reparo do tecido ósseo e a micromoção évista como um estímulo oesteoindutivo;
A micrimoção descontrolada leva a umatraso no reparo de uma fratura, falhas noenxerto ósseos e perda de implante;
ARTIGO: DISCUSSÃO: MICROMOÇÃO
• A mecanosensibilidade do esqueleto é atribuído empartes a variedade das células do esqueleto e aresposta destas influenciadas por estímulos físicos;
• Diversas respostas em diversas células para omesmo estímulo mecânico;
• O estimulo físico é uma fonte de incertezas devido avariáveis de transmissão de força como: tipo emagnitude da tensão resultante e rigidez dosubstrato;
ARTIGO: DISCUSSÃO
• O modelo da regeneração óssea possui visõesde como as células progenitores do tecidoósseo sentem,interpretam e responde a umaforça mecânica alterando o seucomportamento
ARTIGO: DISCUSSÃO
• O deslocamento do implante faz com quecélulas migrem e se alinhem ao longo damatriz extracelular tensionada e fibras decolágenos secretadas por essas células tambémtornem-se orientadas paralelas às trajetóriasda tensão.
ARTIGO: DISCUSSÃO
• Parte dessas células são osteoprogenitoras eparecem explorar a matriz rica em colágenopara sentir seu ambiente mecânico.
• Se encaixam na MEC via integrinas desuperfície que são dependentes da FAK paratransduzir este estímulo em um sinal biológico
ARTIGO: DISCUSSÃO
OBRIGADO!!!